RU2754876C2

RU2754876C2 - Анти-ceacam1 антитело и его применение

Info

Publication number: RU2754876C2
Application number: RU2019133656A
Authority: RU
Inventors: Со-Янг ЕУН; Миянг ОХ; Хие-Янг ПАРК; Мидзунг ЛИ; Аерин ЙООН; Хие Ин ЮМ; Хиеми НАМ; Еунхи ЛИ; Дзонгвха ВОН
Original assignee: Могам Инститьют Фор Байомедикал Рисерч; Грин Кросс Корпорейшн
Priority date: 2017-03-24
Filing date: 2018-03-23
Publication date: 2021-09-08
Also published as: MX2019011124A; RU2019133656A3; CA3057280C; JP2020510082A; US11332528B2; ZA201906248B; CA3057280A1; TWI682940B; EP3601361A1; AU2018237024A1; BR112019019745A2; RU2019133656A; WO2018174629A1; EP3601361A4; JP6931072B2; NZ756585A; US20200109196A1; CN110475788A; PH12019550194A1; TW201841938A

Abstract

Изобретение относится к области биохимии, в частности к анти–CEACAM1 антителу или его фрагменту. Способ лечения рака, способ ингибирования пролиферации CEACAM1–экспрессирующих опухолевых клеток, с помощью указанного антитела; и применение указанного антитела для предупреждения или лечения рака Изобретение позволяет эффективно лечить рак, ассоциированный с сверхэкспрессией CEACAM1. 10 н. и 18 з.п. ф-лы, 29 ил., 3 табл., 6 пр.

Description

Область техники

Настоящее изобретение относится к анти–CEACAM1 антителу, которое специфически связывается с CEACAM1, и его применению.

Уровень техники

Связанная с раково–эмбриональным антигеном молекула клеточной адгезии 1 (далее называемая CEACAM1), трансмембранный гликопротеин, принадлежит к семейству раково–эмбриональных антигенов (CEA). Из членов семейства CEA у людей экспрессируются CEACAM1, CEACAM3, CEACAM4, CEACAM5, CEACAM6, CEACAM7 и CEACAM8. Что еще более важно, CEACAM1 является единственным членом семейства CEA, экспрессируемым в популяциях лимфоцитов, включая активированные T–клетки и естественные клетки–киллеры. Сообщалось, что CEACAM1 является высокоэкспрессируемой в раковых клетках. Кроме того, низкие уровни экспрессии CEACAM1 также наблюдали в эпителиальных клетках, эндотелиальных клетках и миелоидных клетках. На поверхности лимфоцитов CEACAM1 играет роль в регуляции иммунных реакций. В частности, CEACAM1 оказалась ингибирующим рецептором для активированных T–клеток, включая содержащиеся в эпителии кишечника человека (Gray–Owen & Bloomberg, Nat. Rev. Immunol. 2006; 6:433–446; Morales et al., J. Immunol, 1999; 163: 1363–1370).

В частности, CEACAM1 оказалась молекулой иммунной контрольной точки, аналогичной PD–1 и CTLA–4, играя решающую роль в модулировании активации T–клеток. Пути иммунных контрольных точек защищают ткани от иммуноопосредованных повреждений в невоспалительных физиологических условиях. Когда CEACAM1 активирована на T–лимфоцитах, главным образом при трансгомофильном связывании CEACAM1–CEACAM1, CEACAM1 подает сигналы ингибирования TCR–опосредованных воспалительных путей путем рекрутирования фосфатаз в собственный цитоплазматический мотив ITIM (Chen et al., J. Immunol. 2008; 180: 6085–6093). Таким образом, подавление путей иммунных контрольных точек в контексте рака стало перспективной стратегией противоракового лечения.

Исследования нескольких типов опухолей человека показали, что опухоли могут избегать иммунитета, индуцируя CEACAM1. Кроме того, в доклинических моделях опухолей животных было показано, что блокирование взаимодействий CEACAM1 с использованием моноклональных антител (mAb) может усиливать иммунные ответы против опухолей, способствуя подавлению опухолей (Ortenberg et al., Mol. Cancer Ther. 2012; 11(6):1300–1310).

Одна из самых больших проблем с обычными противораковыми препаратами заключается в том, что лечение оказывает слишком вредные побочные эффекты по сравнению с их ограниченной противораковой эффективностью при высокой частоте рецидивов. С другой стороны, недавно оказавшийся в центре внимания подход, так называемая блокада иммунных контрольных точек, устраняет рак путем реактивации опухолево–реактивных истощенных T–клеток вместо непосредственного уничтожения раковых клеток. Такой подход кажется относительно безопасным и эффективным, потому что он использует иммунные функции хозяина для устранения рака, причем имеется возможность сохранять нерелевантные нормальные клетки нетронутыми. В случае нацеленного на PD–1 ниволумаба от Bristol–Myers Squibb профиль токсичности находится в управляемом диапазоне по сравнению с обычными противораковыми препаратами, тогда как его противораковые эффекты значительно выше, чем у обычных препаратов. В исследовании фазы III непосредственного сравнения между ниволумабом и дакарбазином, стандартным химиотерапевтическим средством, при лечении пациентов с метастатической меланомой, опубликованном в 2015 году, например, ниволумаб продемонстрировал частоту объективных ответов 40% (CI 95%, 33,3–47,0) по сравнению с ЧОО 13,9% (CI 95%, 9,5–19,4) у дакарбазина. Медианная выживаемость без прогрессирования составила 5,1 месяца в группе ниволумаба по сравнению с 2,2 месяца в группе дакарбазина. Профилирование токсичности также подтвердило превосходство ниволумаба над дакарбазином (Robert et al., New Engl. J. Med. 2015; 372:320–330).

Между тем, CEACAM1–блокирующее антитело действует на CEACAM1, экспрессируемую на поверхности цитотоксических T–клеток и естественных клеток–киллеров, взаимодействуя с молекулами CEACAM1, сверхэкспрессируемыми на опухолевых клетках. Поэтому в случае CEACAM1–сверхэкспрессирующих опухолей ожидается, что нацеленное на CEACAM1 антитело будет блокировать гомофильное супрессивное взаимодействие CEACAM1–CEACAM1 между T/NK–клеткой и опухолевой клеткой, тем самым реактивируя противоопухолевые T/NK–клеточные реакции. Нацеленное на CEACAM1 антитело, находящееся в стадии разработки (клиническое исследование фазы 1 было преждевременно прекращено в феврале 2017 года), распознает CEACAM3 и CEACAM5 в дополнение к CEACAM1. Такое свойство нецелевого распознавания этого клона BMS может быть связано с его эпитопными последовательностями в N–домене, которые высоко гомологичны у CEACAM1, CEACAM3 и CEACAM5 человека.

Раскрытие изобретения

Техническая проблема

Таким образом, для разработки анти–CEACAM1 антитела, которое специфически связывается с CEACAM1, авторы настоящего изобретения приложили усилия к обнаружению того, что анти–CEACAM1 антитело связывается с N–доменом CEACAM1 и не реагирует перекрестно с CEACAM3, CEACAM5, CEACAM6 или CEACAM8, и завершили настоящее изобретение.

Решение проблемы

В соответствии с одной целью настоящего изобретения предлагается анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент, содержащие: CDR1 легкой цепи, содержащую одну из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1–8; CDR2 легкой цепи, содержащую одну из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 9–16; CDR3 легкой цепи, содержащую одну из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 17–29; CDR1 тяжелой цепи, содержащую одну из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 30–38; CDR2 тяжелой цепи, содержащую одну из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 39–46; и CDR3 тяжелой цепи, содержащую одну из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 47–55.

в соответствии с другой целью настоящего изобретения предлагается анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент, содержащие: CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1, CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 9, CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 23, CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 39, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 47.

Кроме того, в соответствии с другой целью настоящего изобретения предлагается противораковое средство, содержащее анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент, описанные выше, в качестве активного ингредиента.

Кроме того, в соответствии с другой целью настоящего изобретения предлагается противораковый адъювант, содержащий анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент, описанные выше, в качестве активного ингредиента.

Кроме того, в соответствии с другой целью настоящего изобретения предлагается композиция для лечения рака, содержащая противораковый адъювант, описанный выше, и средство для клеточной терапии.

Кроме того, в соответствии с другой целью настоящего изобретения предлагается способ лечения рака, содержащий введение субъекту лимфоцитов, приведенных в контакт с анти–CEACAM1 антителом или его фрагментом, описанными выше.

Кроме того, в соответствии с другой целью настоящего изобретения предлагается способ ингибирования пролиферации CEACAM1–экспрессирующих опухолевых клеток, который содержит приведение CEACAM1–экспрессирующих опухолевых клеток в контакт с анти–CEACAM1 антителом или его фрагментом.

Полезные эффекты изобретения

Анти–CEACAM1 антитело в соответствии с настоящим изобретением специфически связывается с CEACAM1 и тем самым активирует противораковые иммунные функции цитотоксических T–клеток и естественных клеток–киллеров, и поэтому его можно эффективно использовать в качестве противоракового средства и композиции для лечения рака.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 представляет собой схему структуры рекомбинантной CEACAMl, полученной в соответствии с одним вариантом осуществления.

Фиг. 2 показывает способность к связыванию анти–CEACAM1 антител в зависимости от конститутивных доменов рекомбинантной CEACAM1.

Фиг. 3 иллюстрирует сравнительные результаты связывания C25 с рекомбинантной CEACAMl в зависимости от концентраций C25.

Фиг. 4 демонстрирует связывание анти–CEACAM1 антител с CEACAM1 в зависимости от концентраций анти–CEACAM1 антител.

Фиг. 5 изображает способность к связыванию CEACAM1, экспрессируемой на поверхности T–клеток линии CEACAM1–Jurkat, в зависимости от концентраций C25 и клонов, полученных от C25 антител:

(a) представляет способность к связыванию с CEACAM1, экспрессируемой на поверхности T–клеток линии CEACAM1–Jurkat, в зависимости от концентраций C25; и (b) представляет способность к связыванию с CEACAM1, экспрессируемой на поверхности T–клеток линии CEACAM1–Jurkat, в зависимости от концентраций клонов, полученных от C25 антител.

Фиг. 6 представляет собой таблицу, показывающую аффинность анти–CEACAM1 антител к CEACAM1. Аффинность получали по кинетическим константам скорости K_on и K_off и равновесной константе диссоциации KD.

Фиг. 7 представляет собой фотографию, показывающую изоэлектрическую точку C25. Первая, вторая и третья дорожки являются результатами с IEF Markers 3–10, huIgG4 и C25, соответственно.

Фиг. 8 показывает активацию линии T–клеток Jurkat E6.1 с помощью C25 и анти–CD3 (OKT3; 0,1 мкг/мл) антителом по экспрессии маркеров CD69, CD25 и Ki67. Концентрации C25 и huIgG4 составляли 10 мкг/мл.

Фиг. 9 представляет собой график, показывающий количество T–клеток Jurkat E6.1, активированных C25 и OKT3 (0,1 мкг/мл), и уровни секреции IL–2. Концентрации C25 и huIgG4 составляли 10 мкг/мл:

(a) представляет количество T–клеток Jurkat E6.1, пролиферированных C25 и OKT3; (b) показывает количество активированных T–клеток, экспрессирующих маркеры CD69 и Ki67; и (c) показывает уровень секреции IL–2 T–клеток Jurkat E6.1, активированных C25.

Фиг. 10 иллюстрирует активацию линии T–клеток Jurkat E6.1 с помощью C25 и OKT3 (0,1 мкг/мл) по экспрессии маркеров CD69, CD25 и Ki67. Концентрации C25 и huIgG4 составляли 25 мкг/мл.

Фиг. 11 представляет собой график, показывающий количество T–клеток Jurkat E6.1, активированных C25 и OKT3 (0,1 мкг/мл), и уровни секреции IL–2. Концентрации C25 и huIgG4 составляли 25 мкг/мл:

(a) представляет количество T–клеток Jurkat E6.1, пролиферированных C25 и OKT3; (b) показывает количество активированных T–клеток, экспрессирующих маркеры CD69 и Ki67; и (c) показывает уровень секреции IL–2 T–клеток Jurkat E6.1, активированных C25 и OKT3. Концентрация OKT3 составляла 0,1 мкг/мл.

Фиг. 12 демонстрирует активацию линии CEACAM1–сверхэкспрессирующих T–клеток Jurkat E6.1 с помощью C25 и OKT3 по экспрессии маркеров CD69, CD25 и Ki67. Концентрация OKT3 составляла 0,1 мкг/мл.

Фиг. 13 представляет собой график, показывающий количество CEACAM1–сверхэкспрессирующих T–клеток Jurkat E6.1, активированных C25, и уровни секреции IL–2. Концентрации OKT3 и C25 или контрольного Ab составляли 0,1 мкг/мл и 10 мкг/мл, соответственно:

(a) представляет количество CEACAM1–сверхэкспрессирующих T–клеток Jurkat E6.1, пролиферированных C25 и OKT3; (b) показывает количество активированных T–клеток, экспрессирующих маркеры CD69 и Ki67; и (c) показывает уровень секреции IL–2 CEACAM1–сверхэкспрессирующих T–клеток Jurkat E6.1, активированных C25 и OKT3.

Фиг. 14 представляет собой график, показывающий количество CEACAM1–сверхэкспрессирующих T–клеток Jurkat E6.1, активированных C25 и OKT3, и уровни секреции IL–2. Концентрации OKT3 и C25 или контрольного Ab составляли 0,1 мкг/мл и 25 мкг/мл, соответственно:

Фиг. 15 изображает активацию линии CEACAM1–сверхэкспрессирующих T–клеток Jurkat E6.1 с помощью C25 и OKT3 по экспрессии маркеров CD69, CD25 и Ki67. Концентрация OKT3 составляла 1 мкг/мл.

Фиг. 16 представляет собой график, показывающий количество CEACAM1–сверхэкспрессирующих T–клеток Jurkat E6.1, активированных C25 и OKT3, и уровни секреции IL–2. Концентрации OKT3 и C25 или контрольного Ab составляли 0,1 мкг/мл и 10 мкг/мл, соответственно:

Фиг. 17 представляет собой график, показывающий количество CEACAM1–сверхэкспрессирующих T–клеток Jurkat E6.1, активированных C25 и OKT3, и уровни секреции IL–2. Концентрации OKT3 и C25 или контрольного Ab составляли 1 мкг/мл и 25 мкг/мл, соответственно:

Фиг. 18 представляет собой график, показывающий активацию T–клеток обработкой C25 с помощью TCR–индуцированной активации NFAT. Концентрации OKT3 и C25 или контрольного Ab составляли 0,05 мкг/мл и 10 мкг/мл, соответственно:

(a) показывает результаты измерения TCR–индуцированной активации NFAT путем обработки клеток Jurkat–GFP/NFAT–luc, которые не экспрессируют CEACAM1, C25; и (b) представляет собой результаты измерения TCR–индуцированной активации NFAT путем обработки клеток Jurkat–CCM1/NFAT–luc, сверхэкспрессирующих CEACAM1, C25.

Фиг. 19 представляет собой результат активации T–клеток обработкой C25 с помощью TCR–индуцированной активации NFAT. Концентрации OKT3 и C25 или контрольного Ab составляли 0,1 мкг/мл и 10 мкг/мл, соответственно:

Фиг. 20 представляет собой график, показывающий увеличение активности NFAT–люциферазы у T–клеток с помощью анти–CEACAM1 антител, включая C25, по сравнению с контролем. Концентрации OKT3 и анти–CEACAM или контрольного Ab составляли 0,1 мкг/мл и 10 мкг/мл, соответственно:

Фиг. 21 представляет фотографии, показывающие результаты окрашивания с помощью C25 для оценки степени экспрессии CEACAM1 в.

Фиг. 22 представляет фотографии, показывающие результаты окрашивания с помощью huIgG4 в нормальных тканях человека и обезьяны.

Фиг. 23 демонстрирует перекрестную реактивность анти–CEACAM1 антител с белками семейства CEACAM.

Фиг. 24 показывает перекрестную реактивность анти–CEACAM1 антител с белками семейства CEACAM.

Фиг. 25 показывает, что C25 (a) и клоны полученных от C25 анти–CEACAM1 антител (b) не реагируют перекрестно с CEACAM3, CEACAM5, CEACAM6 или CEACAM8, экспрессируемыми на клеточной поверхности.

Фиг. 26 показывает, что C25 (a) и клоны полученных от C25 анти–CEACAM1 антител (b) связываются не только с CEACAM1 человека, но также с CEACAM1 обезьяны, путем изучения способности к связыванию с белком, экспрессируемым на клеточной поверхности.

Фиг. 27 иллюстрирует эффект C25–опосредованного усиления противораковой активности CEACAM1⁺ TALL–104 T–клеток в отношении CEACAM1⁺ раковых клеток:

(a) показывает коэффициенты выживаемости раковых клеток при совместном культивировании TALL–104 T–клеток и CEACAM1⁺ MNK45 раковых клеток в присутствии C25 при различных соотношениях эффектор:мишень (E:T); и (b) показывает коэффициенты выживаемости раковых клеток при совместном культивировании TALL–104 T–клеток и CEACAM1^– MNK1 раковых клеток в присутствии C25 при различных соотношениях эффектор:мишень.

Фиг. 28 представляет собой график, показывающий эффект C25–опосредованного усиления противораковой активности CEACAM1⁺ NK92MI NK клеток в отношении CEACAM1⁺ раковых клеток:

(a) показывает коэффициенты выживаемости раковых клеток при совместном культивировании CEACAM1⁺ NK92MI NK–клеток и CEACAM1⁺ MNK45 раковых клеток в присутствии C25 при различных соотношениях эффектор:мишень; и (b) показывает коэффициенты выживаемости раковых клеток при совместном культивировании CEACAM1⁺ NK92MI NK–клеток и CEACAM1⁺ MNK1 раковых клеток в присутствии C25 при различных соотношениях эффектор:мишень.

Фиг. 29 представляет собой график, показывающий уровни усиления противораковой активности CEACAM1⁺ TALL–104 клеток, активированных C25 и клонами полученных от C25 антител, в отношении CEACAM1⁺ раковых клеток:

Гибель раковых клеток по воздействием TALL–104 клеток, вызванная C25 и клонами полученных от C25 антител, была показана в виде коэффициентов выживаемости раковых клеток по сравнению с контрольным антителом при совместном культивировании CEACAM1⁺ TALL–104 T–клеток с CEACAM1⁺ раковыми клетками (MKN45) при соотношении E:T равном 1:1.

Лучший способ осуществления изобретения

Далее настоящее изобретение описано подробно.

Настоящее изобретение предлагает анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент, содержащие: CDR1 легкой цепи, содержащую одну из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1–8; CDR2 легкой цепи, содержащую одну из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 9–16; CDR3 легкой цепи, содержащую одну из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 17–29; CDR1 тяжелой цепи, содержащую одну из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 30–38; CDR2 тяжелой цепи, содержащую одну из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 39–46; и CDR3 тяжелой цепи, содержащую одну из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 47–55.

В частности, анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1, CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 9, CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 17, CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 39, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 47.

Кроме того, антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 56, и вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 86. В настоящем документе, если CDR1, CDR2, и CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи идентичны, каркасная часть может быть модифицирована. В частности, аминокислотные последовательности некоторых каркасных частей могут быть модифицированы для получения гуманизированных антител.

Кроме того, антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 106, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 121.

В частности, анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1, CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 9, CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 18, CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 39, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 47.

Кроме того, антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 58, и вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 86. В настоящем документе, если CDR1, CDR2, и CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи идентичны, каркасная часть может быть модифицирована. В частности, аминокислотные последовательности некоторых каркасных частей могут быть модифицированы для получения гуманизированных антител.

Кроме того, антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 107, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 121.

В частности, анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1, CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 9, CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 19, CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 39, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 47.

Кроме того, антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 60, и вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 86. В настоящем документе, если CDR1, CDR2, и CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи идентичны, каркасная часть может быть модифицирована. В частности, аминокислотные последовательности некоторых каркасных частей могут быть модифицированы для получения гуманизированных антител.

Кроме того, антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 108, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 121.

В частности, анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1, CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 9, CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 20, CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 39, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 47.

Кроме того, антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 62, и вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 86. В настоящем документе, если CDR1, CDR2, и CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи идентичны, каркасная часть может быть модифицирована. В частности, аминокислотные последовательности некоторых каркасных частей могут быть модифицированы для получения гуманизированных антител.

Кроме того, антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 109, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 121.

В частности, анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1, CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 10, CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 17, CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 39, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 47.

Кроме того, антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 64, и вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 86. В настоящем документе, если CDR1, CDR2, и CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи идентичны, каркасная часть может быть модифицирована. В частности, аминокислотные последовательности некоторых каркасных частей могут быть модифицированы для получения гуманизированных антител.

Антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 110, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 121.

В частности, анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1, CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 10, CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 21, CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 39, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 47.

Кроме того, антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 66, и вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 86. В настоящем документе, если CDR1, CDR2, и CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи идентичны, каркасная часть может быть модифицирована. В частности, аминокислотные последовательности некоторых каркасных частей могут быть модифицированы для получения гуманизированных антител.

Кроме того, антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 111, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 121.

В частности, анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1, CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 11, CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 22, CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 39, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 47.

Кроме того, антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 68, и вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 86. В настоящем документе, если CDR1, CDR2, и CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи идентичны, каркасная часть может быть модифицирована. В частности, аминокислотные последовательности некоторых каркасных частей могут быть модифицированы для получения гуманизированных антител.

Кроме того, антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 112, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 121.

В частности, анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1, CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 10, CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 17, CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 39, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 48.

Кроме того, антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 64, и вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 88. В настоящем документе, если CDR1, CDR2, и CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи идентичны, каркасная часть может быть модифицирована. В частности, аминокислотные последовательности некоторых каркасных частей могут быть модифицированы для получения гуманизированных антител.

Кроме того, антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 110, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 122.

В частности, анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1, CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 10, CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 17, CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 31, CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 39, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 47.

Антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 64, и вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 90. В настоящем документе, если CDR1, CDR2, и CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи идентичны, каркасная часть может быть модифицирована. В частности, аминокислотные последовательности некоторых каркасных частей могут быть модифицированы для получения гуманизированных антител.

Кроме того, антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 110, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 123.

В частности, анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 2, CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 12, CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 24, CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 32, CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 40, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 49.

Кроме того, антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 72, и вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 92. В настоящем документе, если CDR1, CDR2, и CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи идентичны, каркасная часть может быть модифицирована. В частности, аминокислотные последовательности некоторых каркасных частей могут быть модифицированы для получения гуманизированных антител.

Кроме того, антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 114, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 124.

В частности, анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 3, CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 13, CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 25, CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33, CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 41, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 50.

Кроме того, антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 74, и вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 94. В настоящем документе, если CDR1, CDR2, и CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи идентичны, каркасная часть может быть модифицирована. В частности, аминокислотные последовательности некоторых каркасных частей могут быть модифицированы для получения гуманизированных антител.

Антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 115, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 125.

В частности, анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 4, CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 14, CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 23, CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 34, CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 42, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 51.

Кроме того, антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 76, и вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 96. В настоящем документе, если CDR1, CDR2, и CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи идентичны, каркасная часть может быть модифицирована. В частности, аминокислотные последовательности некоторых каркасных частей могут быть модифицированы для получения гуманизированных антител.

Кроме того, антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 116, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 126.

В частности, анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 5, CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 15, CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 26, CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 35, CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 43, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 52.

Кроме того, антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 78, и вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 98. В настоящем документе, если CDR1, CDR2, и CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи идентичны, каркасная часть может быть модифицирована. В частности, аминокислотные последовательности некоторых каркасных частей могут быть модифицированы для получения гуманизированных антител.

Кроме того, антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 117, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 127.

В частности, анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 6, CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 16, CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 27, CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 36, CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 44, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 53.

Антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 80, и вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 100. В настоящем документе, если CDR1, CDR2, и CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи идентичны, каркасная часть может быть модифицирована. В частности, аминокислотные последовательности некоторых каркасных частей могут быть модифицированы для получения гуманизированных антител.

Кроме того, антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 118, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 128.

В частности, анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 7, CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 14, CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 28, CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 37, CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 45, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 54.

Кроме того, антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 82, и вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 102. В настоящем документе, если CDR1, CDR2, и CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи идентичны, каркасная часть может быть модифицирована. В частности, аминокислотные последовательности некоторых каркасных частей могут быть модифицированы для получения гуманизированных антител.

Кроме того, антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 119, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 129.

В частности, анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 8, CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 15, CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 29, CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 38, CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 46, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 55.

Кроме того, антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 84, и вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 104. В настоящем документе, если CDR1, CDR2, и CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи идентичны, каркасная часть может быть модифицирована. В частности, аминокислотные последовательности некоторых каркасных частей могут быть модифицированы для получения гуманизированных антител.

Антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 120, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 130.

В частности, анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1, CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 9, CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 23, CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 39, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 47.

Кроме того, антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 70, и вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 86. В настоящем документе, если CDR1, CDR2, и CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи идентичны, каркасная часть может быть модифицирована. В частности, аминокислотные последовательности некоторых каркасных частей могут быть модифицированы для получения гуманизированных антител.

Кроме того, антитело или его фрагмент, описанные выше, могут содержать легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 113, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 121.

Термин "антитело", как используется в настоящем документе, относится к иммунному белку, который связывается с антигеном и затрудняет действие антигена или устраняет антиген. Существует пять типов антител, IgM, IgD, IgG, IgA и IgE, каждый из которых содержит тяжелую цепь, полученную из генов константной области тяжелой цепи μ, δ, γ, α и ε. В технологии антител в основном используют IgG. Четырьмя видами изотипов IgG являются IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, и их структура и функциональные характеристики могут быть различными.

Кроме того, IgG имеет Y–образную высокостабильную структуру (молекулярный вес приблизительно 150 кДа), состоящую из двух белков тяжелой цепи (приблизительно 50 кДа) и двух белков легкой цепи (приблизительно 25 кДа). Легкая и тяжелая цепи антитела разделены на константные области, в которых аминокислотные последовательности среди антител идентичны, и вариабельные области, в которых аминокислотные последовательности среди антител различны. Константная область тяжелой цепи содержит домены CH1, H (шарнирный), CH2 и CH3. Каждый домен состоит из двух β–листов и связан в молекуле дисульфидной связью. Две вариабельные области тяжелой и легкой цепей объединяются с образованием антигенсвязывающего сайта. Антигенсвязывающий сайт присутствует на двух плечах антитела, по одному на каждом плече, и та часть, которая может связываться с антигеном, называется Fab (антителосвязывающий фрагмент), а часть, которая не может связываться с антигеном, называется Fc (кристаллизующийся фрагмент). Fab и Fc связаны гибкой шарнирной областью.

Кроме того, термин "CDR", как используется в настоящем документе, относится к гипервариабельной области, которая представляет собой участок, имеющий для каждого антитела различную аминокислотную последовательность в вариабельных областях тяжелой цепи и легкой цепи антитела, и относится к антигенсвязывающему сайту. Что касается стереоструктуры антитела, CDR имеет форму петли на поверхности антитела, а каркасная область (FR) находится под петлей для структурной поддержки CDR. В каждой из тяжелой цепи и легкой цепи имеется три петлевые структуры, и эти шесть петлевых структур объединяются друг с другом для непосредственного контакта с антигеном.

Кроме того, фрагмент антитела может быть выбран из группы, состоящей из Fab, scFv, F(ab)₂ и Fv. Фрагмент антитела относится к антигенсвязывающим доменам, что исключает область Fc, которая выполняет эффекторную функцию по передаче стимулов связывания с антигеном на клетки или комплементы и т.д., и может включать фрагменты антител 3–го поколения, такие как однодоменное антитело или минибоди, и т.д.

Кроме того, фрагменты антител обладают хорошей проницаемостью в ткани и опухоли, поскольку они имеют небольшие размеры по сравнению с полной структурой IgG. У них есть преимущество низкой себестоимости, поскольку они могут быть получены в бактериях, и их можно использовать, когда нежелательна функция передачи стимулов связывания с антигеном на клетки или комплементы, поскольку у них нет Fc. Фрагменты антител из–за их короткого периода полужизни в организме человека подходят для диагностики in vivo. Однако при замене друг на друга некоторых основных, кислых или нейтральных аминокислот из аминокислот, составляющих антитело, может измениться изоэлектрическая точка (pI). Изменение изоэлектрической точки антитела может вызывать такие изменения, как уменьшение токсических побочных эффектов in vivo или увеличение растворимости антитела в воде, и поэтому в случае терапевтического антитела может быть использована полная структура IgG с учетом его аффинности и структурной формы.

Кроме того, вариабельный домен легкой цепи анти–CEACAM1 антитела или его фрагмента настоящего изобретения может иметь последовательность вариабельного домена легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82 или 84, или он может иметь гомологию 97%, 98% или 99% с вышеуказанной последовательностью вариабельного домена легкой цепи.

Кроме того, вариабельный домен тяжелой цепи анти–CEACAM1 антитела или его фрагмента настоящего изобретения может иметь последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 102 или 104, или он может иметь гомологию 97%, 98% или 99% с вышеуказанной последовательностью вариабельного домена тяжелой цепи.

Кроме того, анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент настоящего изобретения может иметь гомологию 97%, 98% или 99% с последовательностью вариабельного домена легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82 или 84, и последовательностью вариабельного домена тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 102 или 104.

Кроме того, анти–CEACAM1 антитело относится к антителу, которое связывается с CEACAM1. Как используется в настоящем документе, термин "C25" представляет собой вариант осуществления анти–CEACAM1 антитела. C25 может содержать CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1, CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 9, CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 23, CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 39, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 47.

CD25, описанный выше, может содержать легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 113, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 121.

Вариант C25 может содержать CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1, CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 9, 10 или 11, CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 17, 18, 19, 20, 21 или 22, CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30 или 31, CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 39, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 47 или 48. В частности, в одном варианте осуществления настоящего изобретения варианты C25 показаны в таблице 1 как 1–19, 1–23, 3–07, 3–27, 4R9, 4R20, 4R26, 4R9_H2–2 и 4R9_H4–n20.

Кроме того, анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент, описанные выше, распознают N–домен и B–домен CEACAM1 как эпитоп. Кроме того, антитело не реагирует перекрестно с CEACAM3, CEACAM5, CEACAM6 или CAECAM8.

Кроме того, анти–CEACAM1 антитело настоящего изобретения может быть легко получено с помощью известного метода получения моноклональных антител. Способы получения моноклональных антител могут быть реализованы путем получения гибридом с использованием B–лимфоцитов от иммунизированных животных или с использованием методов фагового отображения, но без ограничения ими.

Настоящее изобретение предлагает также противораковое средство, содержащее анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент в качестве активного ингредиента.

Противораковое средство настоящего изобретения, содержащее анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент в качестве активного ингредиента, можно использовать для лечения рака или опухолей, сверхэкспрессирующих CEACAM1. В частности, когда T–клеточный рецептор (TCR) цитотоксической T–клетки, который играет роль в удалении раковых клеток, распознает эпитоп рака или опухолевой клетки, белок LCK (лимфоцит–специфическая протеинтирозинкиназа), связанный с CD4 (кластер дифференцировки 4), одним компонентом TCR, фосфорилирует CD3ζ (кластер дифференцировки 3ζ), другой компонент TCR. Когда белок ZAP70 (связанная с дзета–цепью протеинкиназа 70) связывается с фосфорилированным CD3ζ, концевая часть белка ZAP70 снова фосфорилируется белком LCK, что активирует T–клеточные воспалительные пути, включая передачу сигнала RAS–MAPK (киназа Ras–MAP), и, таким образом, T–клетки активируются.

Однако в случае раковых клеток или опухолевых клеток, сверхэкспрессирующих CEACAM1, белок SHP1 (фосфатаза–1, содержащая домен области гомологии–2 Src) связывается с частью CEACAM1 ITIM (иммунорецепторный ингибиторный мотив, основанный на тирозине), которую фосфорилирует белок LCK, связанный с концом CD4 TCR благодаря взаимодействию CEACAM1–CEACAM1. Кроме того, конец CD3ζ, а также ZAP70 дефосфорилируются белком SHP1, и поэтому нисходящие сигнальные пути TCR включая путь RAS–MAPK, не активируются, и в результате не активируются T–клетки.

Таким образом, анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент можно использовать в качестве противоракового средства, действующего путем упреждающего блокирования взаимодействия CEACAM1–CEACAM1 посредством связывания с CEACAM1, экспрессируемой в цитотоксических T–клетках, естественных клетках–киллерах и раковых клетках.

Кроме того, термин "противораковый", как используется в настоящем документе, охватывает "предупреждение" и "лечение". В настоящем документе "предупреждение" относится ко всем действиям по предотвращению пролиферации рака и замедлению прогрессирования рака путем введения противоракового средства, а "лечение" относится ко всем действиям по улучшению или ослаблению симптомов рака путем введения антитела настоящего изобретения.

Кроме того, термин "рак", как используется в настоящем документе, может быть выбран из группы, состоящей из рака желудка, рака щитовидной железы, рака поджелудочной железы, меланомы, рака легкого и миеломы, но без ограничения ими. Он может включать солидный рак и рак крови и не имеет особых ограничений, если он имеет CEACAM1 в качестве рецептора и ее путь иммунной контрольной точки является аномальным. Кроме того, настоящее изобретение предлагает противораковый адъювант, содержащий анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент в качестве активного ингредиента.

Кроме того, настоящее изобретение предлагает композицию для лечения рака, содержащую противораковый адъювант, описанный выше, и средство для клеточной терапии. Средство для клеточной терапии может включать цитотоксические T–клетки или естественные клетки–киллеры.

Кроме того, термин "средство для клеточной терапии", как используется в настоящем документе, относится к лекарственному средству, используемому с целью предупреждения или лечения посредством ряда действий, которые изменяют биологические характеристики путем пролиферации и отбора живых аутологичных, аллогенных и ксеногенных клеток in vitro для восстановления функций клеток и тканей. В частности, оно может представлять собой цитотоксические T–клетки или естественные клетки–киллеры.

Кроме того, предлагается способ лечения рака с использованием анти–CEACAM1 антитела или его фрагмента настоящего изобретения. В частности, данный способ может содержать введение субъекту лимфоцитов, приведенных в контакт с анти–CEACAM1 антителом или его фрагментом. Лимфоциты представляют собой разновидность лейкоцитов, которые составляют приблизительно 25% всех лейкоцитов, и могут представлять собой естественные клетки–киллеры, T–клетки и B–клетки. Кроме того, лимфоциты могут быть получены от субъекта. Предпочтительно, лимфоциты могут включать по меньшей мере одно из цитотоксических T–клеток и естественных клеток–киллеров. Рак описан выше.

Кроме того, термин "субъект", как используется в настоящем документе, относится к человеку, который находится в состоянии, когда заболевание можно облегчать, подавлять или лечить путем введения противоракового адъюванта настоящего изобретения, или страдает от заболевания.

Кроме того, термин "приведение в контакт", как используется в настоящем документе, также относится к смешиванию анти–CEACAM1 антитела или его фрагмента с клетками, экспрессирующими CEACAM1.

Термин "введение", как используется в настоящем документе, относится к введению эффективного количества вещества субъекту подходящим способом, и введение композиции, содержащей анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент настоящего изобретения, можно осуществлять через обычный путь введения, который позволяет веществу достигать тканей–мишеней. В частности, введение может представлять собой парентеральное введение (т.е. внутривенное, подкожное, внутрибрюшинное или местное введение и т.д.) в зависимости от предполагаемого применения, и, предпочтительно, оно может представлять собой внутривенное введение. В некоторых случаях введения в солидные опухоли местное введение может быть предпочтительным с точки зрения быстрого и легкого доступа антител. Дозировку варьируют в зависимости от веса, возраста, пола, состояния здоровья, диеты пациента, времени введения, способа введения, скорости выведения и тяжести заболевания. Разовая доза может составлять приблизительно от 0,001 до 10 мг/кг, и ее можно вводить ежедневно или еженедельно. Эффективное количество может быть скорректировано по усмотрению врача, который лечит пациента.

Композицию для лечения рака в соответствии с настоящим изобретением можно вводить в фармацевтически эффективном количестве для лечения раковых клеток или их метастазирования или для ингибирования роста рака. Дозировку можно варьировать в зависимости от типа рака, возраста и веса пациента, характера и тяжести симптомов, типа текущего лечения, количества видов лечения, типа и пути введения и т.д., и она может быть легко определена специалистами в данной области техники.

Что касается композиции настоящего изобретения, фармакологические или физиологические компоненты, описанные выше, можно вводить одновременно или последовательно, или их можно вводить в комбинации с дополнительным обычным терапевтическим средством последовательно или одновременно. Такое введение может быть единичным или множественным. Важно принимать во внимание все вышеперечисленные факторы и вводить количество, которое приводит к максимальному эффекту при минимальном количестве без побочных эффектов, что может быть легко определено специалистами в данной области техники.

Кроме того, настоящее изобретение предлагает способ ингибирования пролиферации CEACAM1–экспрессирующих опухолевых клеток с использованием анти–CEACAM1 антитела или его фрагмента. В частности, он может содержать приведение CEACAM1–экспрессирующих опухолевых клеток в контакт с анти–CEACAM1 антителом или его фрагментом.

Способ осуществления изобретения

Далее настоящее изобретение подробно поясняется примерами. Следующие примеры предназначены для дополнительной иллюстрации настоящего изобретения без ограничения его объема.

Пример 1. Анти–CEACAM1 антитело (C25)

Пример 1.1 Получение анти–CEACAM1 антитела

Гены фрагмента антитела, вставленные в вектор pComb3X (Addgene; кат. № 63891) в форме одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv), подвергали ПЦР для получения генов вариабельной области легкой цепи, представленной SEQ ID NO: 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83 или 85, и гена вариабельной области тяжелой цепи, представленной SEQ ID NO: 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103 или 105, которые включают последовательности, распознаваемые каждым ферментом рестрикции. Гены тяжелой цепи обрабатывали ферментами рестрикции NotI и ApaI, и гены легкой цепи обрабатывали ферментами рестрикции NotI и BamHI.

Гены тяжелой и легкой цепей вставляли в вектор pcIW (Promega; кат. № E1731), расщепленный теми же ферментами рестрикции, что и гены тяжелой или легкой цепей. Затем векторы, содержащие как единицу транскрипции тяжелой цепи, так и единицу транскрипции легкой цепи, отбирали с использованием ферментов рестрикции. Отобранные векторы экстрагировали с использованием QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (QIAGEN; кат. № 12943), и последовательности оснований антител окончательно идентифицировали путем анализа последовательности оснований с использованием некоторой части экстрагированной ДНК. Аминокислотные последовательности антител анализировали на основании вышеуказанных последовательностей оснований. Аминокислотные последовательности и последовательности оснований анализируемых антител показаны в таблице 1 и таблице 2.

[Таблица 1]

[Таблица 2]

Тридцать миллилитров клеток ExpiHEK293F (ThermoFisher scientific; кат. № A14527) в концентрации 2,5×10⁶ клеток на мл обрабатывали и трансфицировали 30 мкг экстрагированной ДНК антитела. На следующий день после трансфекции к трансфицированным клеткам ExpiHEK293F добавляли энхансер (ThermoFisher; кат. № A14524) и культивировали во встряхиваемом инкубаторе в течение 7 дней в условиях 37°C, 8% CO₂ и 125 об/мин для получения анти–CEACAM1 антитела.

После культивирования супернатант, отделенный от культуральной среды центрифугированием, инкубировали с 100 мкл гранул с белком A (Repligen; кат. № CA–PRI–0100) в течение 2 часов. Затем гранулы промывали 10 мл буфера для связывания (ThermoFisher Scientific; кат. № 21019). После этого к гранулам добавляли 200 мкл элюирующего буфера (ThermoFisher Scientific; кат. № 21004) для отделения антител конъюгированных с гранулами. Отделенные антитела нейтрализовали добавлением 10 мкл 1,5 M раствора Tris–HCl pH 8,8 (Bio–Rad; кат. № 210005897).

Экспериментальный пример 1. Оценка способности анти–CEACAM1 антитела к связыванию

Экспериментальный пример 1.1. Оценка способности анти–CEACAM1 антитела к связыванию в зависимости от домена CEACAM1

Тридцать миллилитров клеток ExpiHEK293F (ThermoFisher scientific; кат. № A14527) в концентрации 2,5×10⁶ клеток на мл обрабатывали и трансфицировали 30 мкг ДНК CEACAM1–мутантных белков, конъюгированных с каппа–доменом человеческого иммуноглобулина C. Кроме того, к трансфицированным клеткам ExpiHEK293F добавляли энхансер (ThermoFisher; кат. № A14524) и культивировали в инкубаторе со встряхиванием в течение 7 дней в условиях 37°C, 8% CO₂ и 125 об/мин.

Затем супернатант отделяли от культуральной среды и проводили реакцию с гарнулами для отбора каппа (GE Healthcare; кат. № 17–5458–01) в течение 2 часов. После этого гранулы промывали 10 мл буфера для связывания и добавляли 200 мкл элюирующего буфера для отделения и очистки CEACAM1–мутантного белка от гранул (фиг. 1).

Каждый из очищенных CEACAM1–мутантных белков (2,5 мкг) растворяли в 1000 мкл ФСБ и распределяли в каждую лунку по 20 мкл на лунку, и затем проводили реакцию при 4°C в течение 16 часов. Кроме того, 1 мкл C25 разводили в 1000 мкл ФСБ и распределяли в каждую лунку по 25 мкл на лунку, и затем проводили реакцию при 37°C в течение 1 часа. Затем каждую лунку промывали 3 раза буфером для промывания, полученным разведением 10 мкл Tween 20 (Sigma–Aldrich; кат. № P9146) в 990 мкл ФСБ. После этого человеческий IgG, конъюгированный с 1 мкл пероксидазы хрена (HRP) (HRP–конъюгированный античеловеческий IgG: Sigma; кат. № A0170) разводили в 5000 мкл ФСБ, который затем распределяли в каждую лунку по 25 мкл на лунку и инкубировали при 37°C в течение 1 часа.

После завершения реакции лунки промывали три раза буфером для промывания и в каждую лунку добавляли 25 мкл раствора TMB (KPL; кат. № 52–00–03) для индуцирования проявления цвета. Затем в каждую лунку добавляли 25 мкл 2 M H₂SO₄ для остановки реакции и измеряли поглощение на длине волны 450 нм.

В результате в случае C25 N–домен и B–домен оказались существенными сайтами для связывания с полной аффинностью. Было обнаружено, что A1 и A2 не являются необходимыми для непосредственного связывания. Таким образом, C25 в основном связывается с N–доменом CEACAM1, и для связывания с полной аффинностью дополнительно требуется B–домен. Напротив, некоторые из полученных от C25 мутантных клонов связываются с N–доменом CEACAM1 с минимальной или остаточной зависимостью связывания со своей полной аффинностью от B–домена по сравнению с C25 (фиг. 2).

Экспериментальный пример 1.2. Оценка способности анти–CEACAM1 антитела к связыванию с белком CEACAM1

Два микрограмма рекомбинантного белка CEACAM1 растворяли в 1000 мкл ФСБ, который распределяли по 96–луночному планшету (Nunc; кат. № 467679) по 50 мкл на лунку и инкубировали при 4°C в течение 16 часов. После этого 300 мкл 3% (об/об) бычьего сывороточного альбумина добавляли в каждую лунку и инкубировали при 37°C в течение 1 часа. Антитело C25 (0,75 мкг) растворяли в 1000 мкл ФСБ. Разведенный раствор C25 подвергали серийным разведениям в ФСБ при объемном соотношении 1:1 14 раз. Каждое из 15 различных разведенных растворов C25 распределяли в каждую лунку по 50 мкл на лунку и инкубировали при 37°C в течение 1 часа. Затем каждую лунку промывали 3 раза буфером для промывания, полученным разведением 10 мкл Tween 20 (Sigma–Aldrich; кат. № P9146) в 990 мкл ФСБ. После этого человеческий IgG, конъюгированный с 1 мкл HRP, разводили в 5000 мкл ФСБ, а затем распределяли в каждую лунку по 50 мкл на лунку и инкубировали в течение 1 часа. Лунки промывали три раза буфером для промывания, и в каждую лунку добавляли 50 мкл раствора TMB для индуцирования проявления цвета, и затем 50 мкл 2 M H₂SO₄ добавляли в каждую лунку для остановки реакции. Измеряли поглощение на длине волны 450 нм.

В результате было измерено значение EC₅₀ (половина максимальной эффективной концентрации) 0,35 нМ (фиг. 3).

Кроме того, 2,5 мкг рекомбинантного белка CEACAM–1/CD66a (R&D Systems; кат. № 2244–CM) растворяли в 10 мл ФСБ и распределяли по 96–луночному планшету (Nunc; кат. № 467679) по 100 мкл на лунку и инкубировали в течение ночи при 4°C. После этого в каждую лунку добавляли 300 мкл 1% (об/об) бычьего сывороточного альбумина и инкубировали при 37°C в течение 1 часа.

Каждое из антител C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C25 и C26 (3 мкг) растворяли в 1000 мкл ФСБ. Каждое из разведенных антител подвергали серийным разведениям в ФСБ при объемном соотношении 1:1 6 раз. Каждое из антител, разведенных до 7 концентраций, распределяли в каждую лунку по 100 мкл на лунку и инкубировали при 37°C в течение 1 часа. Затем каждую лунку промывали 3 раза буфером для промывания, полученным разведением 10 мкл Tween 20 (Sigma–Aldrich; кат. № P9146) в 990 мкл ФСБ. После этого 2 мкл человеческого IgG, конъюгированного с HRP, разводили в 10 мл ФСБ, а затем распределяли в каждую лунку по 100 мкл на лунку и инкубировали в течение 1 часа.

После завершения реакции лунки промывали три раза буфером для промывания, и в каждую лунку добавляли 100 мкл раствора TMB для индуцирования проявления цвета. Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл 2M H₂SO₄ для остановки реакции, и измеряли поглощение на длине волны 450 нм.

В результате, было обнаружено, что антитела C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C25 и C26 связываются с белком CEACAM1 (фиг. 4).

Экспериментальный пример 1.3. Оценка способности анти–CEACAM1 антител к связыванию с белком CEACAM1, экспрессируемым на клеточной поверхности

T–клетки Jurkat (Jurkat E6.1 (ATCC; TIB–152TM)) трансфицировали кДНК CEACAM1 и обрабатывали 700 мкг/мл антибиотика G418 для отбора. Отобранные линии T–клеток CEACAM1–Jurkat ресуспендировали в DPBS, дополненным 2% (об/об) FBS (далее называемым буфером для FACS), центрифугировали на 1500 об/мин, а затем ресуспендировали в буфере для FACS, так что количество клеток составило 3×10⁶/мл. Клетки распределяли в каждую лунку 96–луночного планшета с U–образным дном по 100 мкл на лунку. Затем клетки центрифугировали на 1500 об/мин и удаляли супернатант. После ресуспендирования извлеченных клеток в 50 мкл буфера для FACS, к которому добавляли 0,5 мкл раствора Human Fc Block (BD Pharmingen; кат. № 564220), клетки инкубировали при 4°C в течение 15 минут (фиг. 5).

Анти–CEACAM1 антитело или человеческий IgG4 (Sigma; кат. № I4639) разводили в 50 мкл буфера для FACS для получения концентраций 20 мкг/мл, 10 мкг/мл, 5 мкг/мл, 2,5 мкг/мл, 1,25 мкг/мл, 0,625 мкг/мл, 0,3125 мкг/мл и 0,15625 мкг/мл. К клеткам добавляли пятьдесят микролитров анти–CEACAM1 антитела или человеческого IgG4, разведенных выше, и инкубировали при 4°C в течение 1,5 часа.

Клетки, инкубированые с антителами, несколько раз подвергали процедуре промывания путем ресуспендирования клеток в буфере для FACS и центрифугирования раствора на 1500 об/мин. Козий античеловеческий F(ab)₂, меченый фикоэритрином (далее называемый PE) (конъюгированный с фикоэритрином козий античеловеческий F(ab)₂; (Sigma; кат. № P8047)), разводили в буфере для FACS в объемном соотношении 1:200, и затем 100 мкл каждого раствора добавляли в каждую лунку и инкубировали при 4°C в течение 30 минут в условиях темноты.

Клетки несколько раз подвергали процедуре промывания путем ресуспендирования клеток в буфере для FACS, центрифугирования раствора на 1500 об/мин и удаления супернатанта. Клетки затем ресуспендировали в 100 мкл буфера для фиксации (BD Cytofix^TM; кат. № 554655) и инкубировали при 4°C в течение 30 минут в темном месте.

Клетки, инкубированные с буфером для фиксации, несколько раз подвергали процедуре промывания путем ресуспендирования клеток в буфере для FACS, центрифугирования раствора на 1500 об/мин и удаления супернатанта. Промытые клетки ресуспендировали в 200 мкл буфера для FACS, и средние интенсивности флуоресценции (MFI) PE–меченых клеток сравнивали в FACS LSR–Fortessa. Все анализы FACS проводили с использованием программного обеспечения FlowJo.

Наблюдали, что максимальный уровень связывания C25 с мишенью (MFI 1800 или более) достигался при концентрации 5 мкг/мл, но его способность к связыванию быстро снижалась ниже концентрации 5 мкг/мл (фиг. 5a).

T–клетки CEACAM1–Jurkat, полученные выше, обрабатывали раствором Fc Block и инкубировали в течение 15 минут. Затем C25 и полученные от C25 клоны, включая 4R9, 4R9_H2–2, 4R9_H4–n20 и 4R26, а также человеческий IgG4 разводили, соответственно, в 50 мкл буфера для FACS до концентраций 25 мкг/мл, 5 мкг/мл, 1 мкг/мл, 0,2 мкг/мл, 0,04 мкг/мл, 0,008 мкг/мл, 0,0016 мкг/мл и 0,00032 мкг, а затем вносили в клетки, которые инкубировали при 4°C в течение 1,5 часа. В настоящем документе следует отметить, что количество клеток доводили до 1×10⁵. Клетки, инкубированные с антителами, несколько раз подвергали процедуре промывания путем ресуспендирования клеток в буфере для FACS и центрифугирования раствора на 1500 об/мин.

PE–конъюгированный козий античеловеческий F(ab)₂; (Sigma; кат. № P8047)) разводили в буфере для FACS в объемном соотношении 1:200 и затем добавляли к клеткам по 100 мкл на лунку. Клетки хорошо ресуспендировали и инкубировали при 4°C в течение 30 минут в условиях темноты.

Клетки, инкубированные с буфером для фиксации, несколько раз подвергали процедуре промывания путем ресуспендирования клеток в буфере для FACS, центрифугирования раствора на 1500 об/мин и удаления супернатанта. Промытые клетки ресуспендировали в 200 мкл буфера для FACS, и средние интенсивности флуоресценции (MFI) PE–меченых клеток контролировали с помощью FACS LSR–Fortessa. Все FACS анализы проводили с использованием программного обеспечения FlowJo.

В соответствии с результатами, приведенными на фигуре 5a, C25 показал максимальные уровни своего связывания с мишенью (MFI 8008 или более) при концентрации 5 мкг/мл, но способность к связыванию быстро снижалась ниже концентрации 5 мкг/ мл. С другой стороны, способность к связыванию с мишенью полученных от C25 клонов 4R9, 4R26, и 4R9_H2–2 оставалась равной вплоть до 80% или выше от их максимальных уровней даже при концентрации 0,2 мкг/мл. Кроме того, значение MFI клона 4R9_H4–n20 достигало вплоть до 12000 или более, демонстрируя в 1,5 раза более высокие значения MFI, чем у других клонов (12000 по сравнению с 8000), но способность к связыванию быстро снижалась ниже концентрации 5 мкг/мл аналогично C25 (фиг. 5b).

Экспериментальный пример 1.4. Измерение аффинности связывания каждого анти–CEACAM1 антитела с мишенью

Количественную способность C25, 4R9, 4R26, 4R9_H2–2, 4R9_H4–n20 и 4R9_H4–n20HC+4R26LC к связыванию с CEACAM1 измеряли с использованием Octet QK^e (Pall ForteBio). Антитела, выделенные и очищенные в примере 1, в концентрации 400 нМ последовательно разводили в соотношении 1:1 6 раз, и полученные растворы антител в концентрациях 400 нМ, 200 нМ, 100 нМ, 50 нМ, 25 нМ, 12,5 нМ и 6,25 нМ распределяли по 96–луночному планшету Greiner (Greiner; кат. № 655209) в ряд. Последняя лунка в каждом ряду была с образцом с концентрацией антител 0 нМ. Рекомбинантный белок CEACAM1 человека (R&D Systems; кат. № 2244–CM) разводили для получения концентрации 6,25 мкг/мкл и распределяли в каждую лунку другой колонки по 200 мкл на лунку.

Как и в случае промывочного буфера, буфера нейтрализации и базового буфера, буфер Reagent/Kinetics (10X) (Fortebio; кат. № 18–1092) разводили 1:10 и распределяли в каждую лунку колонки в ряд по 200 мкл на лунку, и регенерационный буфер распределяли в каждую лунку по 200 мкл на лунку. Отдельно подготавливали 96–луночный планшет Greiner, распределяли буфер Reagent/Kinetics (1X) в каждую лунку по количеству используемых биосенсоров в ряд по 200 мкл на лунку, и устанавливали кассету Biosensors/Anti–His (His1K) (Fortebio; кат. № 18–5120). Периоды ассоциации и диссоциации были установлены на 300 секунд и 600 секунд, соответственно, и были измерены значения K_D.

В результате их аффинность к CEACAM1 определили как значения аффинности (K_D) от 1,82 нМ до 39,0 нМ (фиг. 6).

Экспериментальный пример 2. Оценка физических свойств анти–CEACAM1 антитела

Экспериментальный пример 2.1. Определение изоэлектрической точки анти–CEACAM1 антитела

Двадцать миллилитров анодного буфера для IEF (50x) смешивали с 980 мл деионизированной воды (далее называемой DW) для получения анодного буфера для IEF 1X, и 20 мл катодного буфера для IEF pH 3–10 (10X) смешивали с 180 мл DW для получения катодного буфера для IEF 1X. Анодный буфер для IEF 1X и катодный буфер для IEF 1x охлаждали до 4°C и использовали.

Используя гель для IEF (гель для IEF Invitrogen/pH 3–10; 1,0 мм × 10 лунок/EC6655BOX), верхнюю камеру заполняли 200 мл катодного буфера для IEF 1X, а нижнюю камеру заполняли 600 мл анодного буфера для IEF 1X. Загружали пятнадцать микролитров из 20 мкл раствора, содержащего 10 мкл C25 в концентрации 1,12 мг/мл, смешанного с 10 мкл буфера для образцов IEF (pH 3–10, 2X), и 5 мкл IEF Markers 3–10 (SERVA/10 мг/мл/SERVA Liquid Mix; 39212.01) использовали для маркера.

Электрофорез проводили с изменением напряжения в три этапа: 100 В: 1 час, 200 В: 1 час и 500 В: 30 минут, а фиксацию проводили с использованием 12% раствора TCA в течение 30 минут. После фиксации оценивали изоэлектрическую точку с использованием Coomassie Blue R–250 Intron Biotechnology (IBS–BC006).

В результате фактическое значение изоэлектрической точки C25 оказалось 8,0, что немного выше ее теоретического значения 7,76 (фиг. 7).

Экспериментальный пример 3. Измерение влияния анти–CEACAM1 антитела на активацию T–клеток

Экспериментальный пример 3.1. Оценка активации T–клеток анти–CEACAM1 антителом

Клетки Jurkat E6.1 (ATCC; TIB–152TM) ресуспендировали по 1×10⁵ на 200 мкл в полной среде Дульбекко в модификации Искова (IMDM; Invitrogen; кат. № 12440053), дополненной 10% (об/об) фетальной бычьей сыворотки (Gibco; кат. № 16000044) и пенициллином/стрептомицином 1X (100X; Gibco; кат. № 15140122), и инкубировали с покрывающим планшет анти–CD3 (OKT3; 0,1 мкг/мл; eBioscience; кат. № 16–0037) в присутствии 10 мкг/мл или 25 мкг/мл при 37°C в течение 96 часов с 5% CO₂. В качестве контроля использовали HuIgG4.

Через 96 часов клетки и культуральную среду извлекали и центрифугировали на 1500 об/мин. Супернатант оставляли для измерения IL–2, а оставшиеся клетки извлекали, заменяли на буфер для FACS и подвергали этапу блокирования Fc–рецепторов при 4°C в течение 15 минут.

Клетки инкубировали с анти–CD25–PE–Cy7 антителом или анти–CD69–APC антителом (eBioscience; anti–CD25–PE–Cy7: кат. № 25–0259; anti–CD69–APC: кат. № 17–0699) при 4°C в течение 15 минут.

Клетки заливали буфером для FACS вплоть до 200 мкл и центрифугировали на 1200 об/мин в течение 5 минут с удалением супернатанта. После ресуспендирования клеток в свежем буфере для FACS эту процедуру повторяли три раза для полного удаления несвязанных антител. Клетки ресуспендировали в DPBS, дополненном 1% (об/об) параформальдегида, и фиксировали при 4°C в течение 30 минут.

Клетки ресуспендировали в буфере для окрашивания FoxP3 lX (eBioscience; кат. № 00–5523–00) и центрифугировали. После повторения этой процедуры дважды анти–Ki67 антитело (eBioscience; кат. № 350520), меченое другим красителем, разводили в объемном соотношении 1:100 в буфере для окрашивания FoxP3 lX, и добавляли его к клеткам для получения общего объема 50 мкл, и затем смесь инкубировали при 4°C в течение 30 минут. Клетки заливали буфером для окрашивания FoxP3 lX и центрифугировали. После трех повторных промываний клетки подвергали проточной цитометрии для подсчета активированных клеток CD25⁺ CD69⁺ и других пролиферирующих популяций Ki67⁺ в устройстве FACS LSR–Fortessa и анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo (фиг. 8 и 10).

В результате, когда T–клетки Jurkat обрабатывали C25 при концентрации антитела 10 мкг/мл и 25 мкг/мл в условиях индукции CCM1 (OKT3: 0,1 мкг/мл, культивирование в cIMDM в течение 4 дней), для T–клеток Jurkat E6.1 наблюдали высокие уровни активации. Более конкретно, процент и количество активированных CD25⁺ CD69⁺ популяций T–клеток Jurkat возрастали в два раза или больше, и процент и количество пролиферирующих Ki67⁺ клеток также возрастали в два раза или больше по сравнению с контролем, который обрабатывали huIgG4 (фиг. 9b и 11b).

Экспериментальный пример 3.2. Оценка секреции IL–2 T–клетками под действием анти–CEACAM1 антитела

Для оценки изменений секреции IL–2 из T–клеток под действием анти–CEACAM1 антитела вначале в буфере для покрытия (карбонатный/бикарбонатный буфер 50 мМ, pH 9,6) разводили анти–IL–2 антитела (capture Ab: eBioscience; кат. № 14–7029–85). Затем разведенный раствор анти–IL–2 антитела распределяли в каждую лунку 96–луночного планшета по 200 мкл на лунку и инкубировали при 4°C в течение 16–18 часов. Затем 96–луночный планшет промывали DPBS и добавляли в каждую лунку 200 мкл блокирующего буфера (SuperBlock™ Blocking Buffer: ThermoFisher Scientific; кат. № 37515) и затем инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут.

Для получения стандартной кривой рекомбинантный белок IL–2 (R&D Systems; кат. № P60568) разводили в блокирующем буфере для получения концентрации 20 мкг/мл. Разведенный раствор рекомбинантного белка IL–2 серийно разводили в объемном соотношении 1:1 11 раз. Двенадцать образцов рекомбинантного белка IL–2 и супернатанты из культуры клеток Jurkat E6.1, сохраненные при –80°C в примере 3.1, распределяли в каждую лунку 96–луночного планшета, покрытого анти–IL–2 антителом, по 100 мкл на лунку, и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов.

После промывания 96–луночного планшета 4 раза буфером для промывания, полученным разведением 10 мкл Tween 20 (Sigma–Aldrich; кат. № P9146) в 990 мкл ФСБ, раствор, полученный разведением конъюгированных с биотином анти–IL–2 антител (антитело для детектирования: eBioscience; кат. № 13–7028) в блокирующем буфере в объемном соотношении 1:1000, распределяли в каждую лунку по 100 мкл на лунку и затем инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов.

После промывания 96–луночного планшета буфером для промывания 4 раза раствор, полученный разведением меченного пероксидазой стрептавидина (Sigma; кат. № S5512) в блокирующем буфере в объемном соотношении 1:1000, распределяли в каждую лунку по 100 мкл на лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов.

После промывания 96–луночного планшета еще 4 раза буфером для промывания, раствор субстрата пероксидазы TMB (KPL; кат. № 52–00–02) распределяли в каждую лунку по 100 мкл на лунку и инкубировали в течение 10 минут. Затем добавляли в лунки останавливающий раствор (KPL; кат. № 50–85–05) по 100 мкл на лунку для остановки реакции. Значения OD измеряли на длине волны 450 нм с использованием устройства для считывания Molecular Dynamics. Измеренные значения анализировали с использованием SoftMax Pro 5.4.1.

В результате, когда клетки обрабатывали C25 при концентрации антитела 10 мкг/мл и 25 мкг/мл в условиях индукции CEACAM1 (OKT3 0,1 мкг/мл, культивирование в течение 4 дней), для Jurkat E6.1 измеренные с использованием супернатантов уровни секретируемого IL–2 были приблизительно в три раза выше, чем у контроля (фиг. 9c и 11c).

Экспериментальный пример 3.3. Оценка активации T–клеток, сверхэкспрессирующих CEACAM1, анти–CEACAM–1 антителом

Вектор промотор EF1–CEACAM1–GFP трансфицировали в T–клетки Jurkat E6.1, а затем обрабатывали раствором дисульфатной соли G418 (Sigma; G8168) в концентрации 700 мкг/мл для отбора. GFP⁺ CEACAM1⁺ клетки отделяли с использованием сортировщика клеток с активированной флуоресценцией для конструирования клеток Jurkat, сверхэкспрессирующих CEACAM1 (T–клетки CEACAM1–Jurkat).

T–клетки CEACAM1–Jurkat, полученные из клеток Jurkat E6.1 (ATCC; TIB–152TM), ресуспендировали в 200 мкл IMDM, дополненной 10% FBS и пенициллином/стрептомицином 1X, для получения числа клеток 1×10⁵, а затем стимулировали покрывающим планшет OKT3 (0,1 или 1 мкг/мл; eBioscience; 16–0037) в присутствии 10 мкг/мл или 25 мкг/мл C25 в течение 48 часов. В качестве контроля использовали HuIgG4.

Через 48 часов клетки и культуральную среду извлекали и центрифугировали на 1500 об/мин. Супернатант сохраняли при –80°C для ELISA IL–2, а оставшиеся клетки извлекали, заменяли на буфер для FACS и подвергали блокированию Fc–рецептора при 4°C в течение 15 минут. Клетки обрабатывали CD25–PE–Cy7 антителом или анти–CD69–APC антителом и инкубировали при 4°C в течение 15 минут.

Клетки извлекали и заливали буфером для FACS вплоть до 200 мкл и центрифугировали на 1200 об/мин в течение 5 минут. После ресуспендирования клетки в свежем буфере для FACS эту процедуру повторяли три раза для полного удаления несвязанных антител. Клетки ресуспендировали в DPBS, дополненным 1% (об/об) параформальдегида и фиксировали при 4°C в течение 30 минут.

Клетки заливали буфером для окрашивания FoxP3 lX вплоть до 200 мкл и центрифугировали на 1200 об/мин в течение 5 минут для удаления супернатанта. После двух повторений этой процедуры анти–Ki67 антитело, меченое другим красителем, разводили в объемном соотношении 1:100 и добавляли к клеткам для получения общего объема 50 мкл, и затем смесь инкубировали при 4°C в течение 30 минут.

Клетки заливали буфером для окрашивания FoxP3 lX вплоть до 200 мкл и центрифугировали на 1200 об/мин в течение 5 минут для удаления супернатанта. После трех повторения этой процедуры и, наконец, замены на буфер для FACS, активированные CD25⁺ CD69⁺ клетки и пролиферирующие Ki67⁺ клетки из их числа идентифицировали в устройстве FACS LSR–Fortessa и анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo (фиг. 12 и 15).

В результате T–клетки CEACAM1–Jurkat под действием низкой концентрация OKT3 (0,1 мкг/мл) в присутствии анти–CEACAM1 продемонстрировали высокие уровни активации. Более конкретно, CD25⁺ CD69⁺ популяции T–клеток CEACAM1–Jurkat выросли в 1,5 раза (C25 25 мкг/мл) или в 4 раза или выше (C25 10 мкг/мл) по сравнению с обработанной huIgG4 группой (фиг. 13b и 14b).

Кроме того, T–клетки CEACAM1–Jurkat под действием высокой концентрации OKT3 (1 мкг/мл) в присутствии анти–CEACAM1 продемонстрировали высокие уровни активации. Более конкретно, CD25⁺ CD69⁺ популяции T–клеток CEACAM1–Jurkat выросли в 2 раза (C25 25 мкг/мл) или в 6 раза или выше (C25 10 мкг/мл) по сравнению с обработанной huIgG4 группой (фиг. 16b и 17b).

Экспериментальный пример 3.4. Оценка секреции IL–2 CEACAM1–сверхэкспрессирующими T–клетками по действием анти–CEACAM1 антитела

Для оценки индуцированных анти–CEACAM1 антителом изменений уровней секретируемого IL–2 у CEACAM1–сверхэкспрессирующих T–клеток супернатант, отделенный от T–клеток CEACAM1–Jurkat E6.1, сохраненный при –80°C в экспериментальном примере 3.3, подвергали ELISA тем же способом, что и в экспериментальном примере 3.2.

В результате, когда T–клетки CEACAM1–Jurkat, сверхэкспрессирующие CEACAM1, обрабатывали C25 при концентрациях антитела 10 мкг/мл и 25 мкг/мл в условиях культивирования (OKT3 в концентрации 0,1 мкг/мл, культивирование в течение 2 дней), уровни секреции IL–2, измеренные с использованием супернатантов, оказались в 20 раз или более выше, чем в контроле (фиг. 13c и 14c).

Кроме того, когда T–клетки CEACAM1–Jurkat, сверхэкспрессирующие CEACAM1, обрабатывали C25 при концентрациях антитела 10 мкг/мл и 25 мкг/мл в других условиях культивирования (OKT3 в концентрации 1 мкг/мл, культивирование в течение 2 дней), уровни секреции IL–2, измеренные с использованием супернатантов, оказались в 1,5 раза или более выше, чем в контроле (фиг. 16c и 17c).

Экспериментальный пример 3.5. Оценка активации T–клеток анти–CEACAM1 антителом с использованием NFAT–люциферазного анализа

Клетки Jurkat–GFP/NFAT–luc (клетки, не экспрессирующие CEACAM1, сверхэкспрессирующие репортер NFAT–люциферазу клетки) или клетки Jurkat–CCM1/NFAT–luc (CEACAM1–сверхэкспрессирующие клетки, сверхэкспрессирующие репортер NFAT–люциферазу клетки) ресуспендировали в каждой лунке при количестве клеток 6×10⁵ и распределяли по 96–луночному планшету, покрытому 0,05 или 0,1 мкг/мл OKT3, и добавляли каждое антитело, полученное в примере 1, в концентрации 10 мкг/мл и анти–CD28 (28,2; eBioscience; кат. № 16–0289–85; 1 мкг/мл). В качестве отрицательного контроля использовали человеческий IgG4.

После инкубации в течение 6 часов клетки собирали, один раз промывали ФСБ и лизировали с помощью 80 мкл буфера для пассивного лизиса. Двадцать микролитров клеточного лизата распределяли в каждую лунку белого 96–луночного планшета для анализа, который затем помещали в устройство–люминометр. Буфер люциферазы загружали в инжектор люминометра, и в каждую лунку вводили 80 мкл буфера люциферазы для измерения активности люциферазы.

В результате ингибирующий эффект C25 на CCM1–зависимое ингибирование T–клеток не наблюдали в Jurkat–GFP/NFAT–luc, которые не экспрессируют CEACAM1, в условиях 6–часового культивирования, тогда как повышение уровней TCR–индуцированной активации NFAT под действием C25 в течение 6 часов было в 2 раза или более выше в клетках Jurkat–CCM1/NFAT–luc с OKT3 при концентрациях как 0,05, так и 0,1 мкг/мл (фиг. 18 и 19).

Кроме того, экспериментальная группа, обработанная полученными от C25 анти–CEACAM1 антителами, продемонстрировала в 1,5–2 раза более высокую NFAT–luc люциферазную активность, чем обработанная IgG4 группа при концентрации OKT3 0,1 мкг/мл, что является статистически значимым (фиг. 20).

Экспериментальный пример 4. Оценка экспрессии CEACAM1 в тканях человека и обезьяны

Получали 10 мМ раствор EZ–Link™ Sulfo–NHS–LC–LC–Biotin (ThermoFisher Scientific; кат. № 21338), и добавляли 13,3 мкл раствора на 1 мг C25 и биотинилировали при 4°C в течение 2 часов. Срезы TMA человека и обезьяны депарафинизировали в печи при 60°C в течение 1 часа. Гидратацию постепенно проводили в порядке ксилол (100%), спирт (90%), спирт (80%) и спирт (спирт–DW).

Для извлечения антигена предметные стекла с TMA обрабатывали в водяной бане с постоянной температурой, содержащей 1,5 л буфера Tris–ЭДТА pH 9,0, который инкубировали при 100°C в течение 20 минут. Для предупреждения внутриклеточной пероксидазной активности туда добавляли 100 мкл 3% пероксида водорода и инкубировали в течение 6 минут, и затем туда добавляли 100 мкл 5% (об/об) нормальной лошадиной сыворотки и инкубировали в течение 30 минут.

Первичные антитела (конъюгированные с биотином hIgG4 или C25; 1 мг/мл) разводили в 100 мкл буфера для окрашивания в объемном соотношении 1:1 или 1:5 и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов. Добавляли сто микролитров реагента ABC и инкубировали в течение 30 минут. Добавляли набор субстратов DAB (VECTOR LABORATORIES; кат. № SK–4100), за чем следовало проявление цвета в течение 2 минут и сравнительное окрашивание гематоксилином для анализа. Поскольку уровни экспрессии CEACAM1 в нормальных клетках были очень низкими, антитела использовали в относительно высоких концентрациях.

Интенсивность окрашивания C25 на нормальных тканях яванского макака была аналогична окрашиванию на нормальных человеческих тканях, а уровни экспрессии CEACAM1 в нормальных тканях были очень низкими. Поэтому экспрессию CEACAM1 детектировали, только когда обрабатывали ткани высокими концентрациями C25 (фиг. 21). Человеческий IgG4 использовали в той же концентрации, что и контроль для C25 (фиг. 22).

Экспериментальный пример 5. Оценка перекрестной реактивности анти–CEACAM1 антитела

Экспериментальный пример 5.1. Оценка перекрестной реактивности анти–CEACAM1 антитела с белками семейства CEACAM с использованием человеческого антитела Fab IgG

Рекомбинантный белок человеческий CEACAM–1/CD66a (R&D Systems; кат. № 2244–CM, HCCM1), рекомбинантный белок человеческий CEACAM–5/CD66e (R&D Systems; кат. № 4128–CM, HCCM5), рекомбинантный белок человеческий CEACAM–6/CD66c (R&D Systems; кат. № 3934–CM, HCCM6), рекомбинантный белок человеческий CEACAM–3/CD66d (Sino Biological; кат. № 11933–H08H, HCCM3), рекомбинантный химерный белок мышиный PD–1–Fc (R&D Systems; кат. № 1021–PD, mPD–1–Fc), рекомбинантный белок CEACAM1–Fc (IgG4) (Mogam, собственное производство, HCCM1–Fc), балк рекомбинантного белка человеческий CEACAM–1/CD66a (R&D Systems; кат. № 2244–CM, HCCM1 (балк)) и белок мышиный CEACAM1/CD66a (Sino Biological; кат. № 50571–M08H, mouse CCM1) (2,5 мкг каждого) растворяли в 10 мл ФСБ, соответственно, и распределяли по 96–луночному планшету (Nunc; кат. № 467679) по 100 мкл на лунку и инкубировали в течение ночи при 4°C. После этого каждую лунку обрабатывали 300 мкл 1% (об/об) бычьего сывороточного альбумина и инкубировали при 37°C в течение 1 часа.

Три микрограмма антител C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C25 и C26 растворяли в 1000 мкл ФСБ, соответственно. Разведенные антитела распределяли в каждую лунку, покрытую каждым белком по 100 мкл на лунку, и инкубировали при 37°C в течение 1 часа. Затем каждую лунку промывали 3 раза буфером для промывания, полученным разведением 10 мкл Tween 20 (Sigma–Aldrich; кат. № P9146) в 990 мкл ФСБ. После этого 2 мкл конъюгированного с HRP человеческого анти–IgG–Fab антитела (Fab античеловеческого IgG; Sigma; кат. № A0293) разводили в 10 мл ФСБ, добавляли в лунки по 100 мкл на лунку и инкубировали в течение 1 часа.

После завершения реакции лунки промывали три раза буфером для промывания, и в каждую лунку добавляли 100 мкл раствора TMB для индуцирования проявления цвета. Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл 2 M H₂SO₄ для остановки реакции, и измеряли поглощение на длине волны 450 нм.

В результате все антитела C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C25 и C26 показали высокие уровни способности к связыванию с HCCM1, HCCM1 (балк) и HCCM1–Fc. Антитела к CEACAM1, за исключением C17, C19, C22, продемонстрировали базальные уровни способности к связыванию с HCCM3, HCCM5 и HCCM6 (фиг. 23). Таким образом, был сделан вывод, что анти–CEACAM антитела настоящего изобретения специфически связываются только с CEACAM1.

Экспериментальный пример 5.2. Перекрестная реактивность белка семейства CEACAM с анти–CEACAM1 антителом с использованием человеческого антитела IgG Fc

Рекомбинантный белок человеческий CEACAM–1/CD66a (R&D Systems; кат. № 2244–CM, HCCM1), рекомбинантный белок человеческий CEACAM–5/CD66e (R&D Systems; кат. № 4128–CM, HCCM5), рекомбинантный белок человеческий CEACAM–6/CD66c (R&D Systems; кат. № 3934–CM, HCCM6), рекомбинантный белок человеческий CEACAM–3/CD66d (Sino Biological; кат. № 11933–H08H, HCCM3), белок человеческий B7–H5/Gi24/VISTA (Sino Biological; кат. № 13482–H08H, HVISTA), балк рекомбинантного белка человеческий CEACAM–1/CD66a (R&D Systems; кат. № 2244–CM, HCCM1 (балк)), рекомбинантный белок человеческий CEACAM1–N домен–каппа (Mogam, собственное производство, HCCM1–N domain–kappa) и белок БСА (2,5 мкг каждого) растворяли в 10 мл ФСБ, соответственно, и распределяли по 96–луночному планшету по 100 мкл на лунку и инкубировали при 4°C в течение ночи. После этого каждую лунку обрабатывали 300 мкл 1% (об/об) бычьего сывороточного альбумина и инкубировали при 37°C в течение 1 часа.

Каждое из антител C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C25 и C26 (3 мкг) растворяли в 1000 мкл ФСБ. Разведенные антитела распределяли в каждую лунку, покрытую каждым белком по 100 мкл на лунку, и инкубировали при 37°C в течение 1 часа. Затем каждую лунку промывали 3 раза буфером для промывания, полученным разведением 10 мкл Tween 20 (Sigma–Aldrich; кат. № P9146) в 990 мкл ФСБ. После этого 2 мкл конъюгированного с HRP человеческого анти–IgG–Fc антитела (Fc античеловеческого IgG, Sigma кат. № A0170) разводили в 10 мл ФСБ, добавляли в лунки по 100 мкл на лунку и инкубировали в течение 1 часа.

В результате все антитела C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C25 и C26 показали высокие уровни способности к связыванию с HCCM1, HCCM1 (балк) и HCCM1–N–домен–каппа, и антитела к CEACAM1, за исключением C17, C19, C22, продемонстрировали базальные уровни способности к связыванию с HCCM3, HCCM5 и HCCM6 (фиг. 24). Таким образом, было обнаружено, что анти–CEACAM1 антитела настоящего изобретения специфически связываются только с CEACAM1.

Экспериментальный пример 5.3. Оценка перекрестной реактивности белка семейства CEACAM, экспрессируемого на клеточной поверхности, с анти–CEACAM1 антителом

К клеткам HEK293 добавляли по 10 мкг каждого из вектора pEF1α–AcGFP–N1 (Clontech, кат. № 631973) в качестве контрольного вектора, векторов плазмид с CEACAM1, CEACAM3, CEACAM5, CEACAM6 и CEACAM8 с последующей трансфекцией в условиях напряжения импульса 1100 В, длительности импульса 20 мс и количества импульсов 2. После 48 часов трансфекции экспрессию GFP подтверждали с помощью флуоресцентной микроскопии. Клетки отделяли обработкой 1 мл TrypLE Express Solution (ThermoFisher Scientific; кат. № 12605010), ресуспендировали в 9 мл DMEM (Gibco, кат. № 11995–065), дополненной 10% (об/об) FBS, и центрифугировали на 1200 об/мин в течение 5 минут для удаления получившегося супернатанта.

После однократного промывания ФСБ клетки ресуспендировали в буфере для FACS для получения концентрации 5×10⁵ клеток на 100 мкл. Раствор Human Fc Block добавляли к образцам по 1 мкл на образец и инкубировали при 4°C в течение 10 минут. Клетки обрабатывали hulgG4 или одним из перечисленных анти–CEACAM1 клонов по 1 мкг на 5×10⁵ клеток и инкубировали при 4°C в течение 10 минут. После промывания буфером для FACS меченые PE козьи анти–huIgG4 антитела разводили в соотношении 1:200 в буфере для FACS и добавляли по 100 мкл на образец к образцам, которые инкубировали при 4°C в течение 30 минут. Образцы заливали буфером для FACS вплоть до 200 мкл, а затем центрифугировали на 1200 об/мин в течение 5 минут для удаления получившегося супернатанта. Для ресуспендирования клеток добавляли буфер для фиксации (300 мкл). Клетки, экспрессирующие GFP, отбирали в устройстве FACS LSR–Fortessa, и экспрессию членов CEACAM оценивали, соответственно, с использованием антител, специфичных к каждому члену CEACAM (Таблица 3). Кроме того, связывание анти–CEACAM1 антител оценивали по флуоресцентному каналу PE и анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo.

[Таблица 3]

Тип	Форма	Название вещества	Источник
CEACAM1	Клон кДНК	CEACAM1	R&D Systems, RDC0951
	Изотип	Мышиный изотип IgG1, контроль PE	R&D Systems, IC002P
	Анти–CEACAM1 антитело	Конъюгированное с PE антитело к CEACAM1 человека/CD66a	R&D Systems, FAB2244P
CEACAM3	Клон кДНК	CEACAM3–GFP	Origene, RG217469
	Изотип	IgG овец	R&D Systems, 5–001–A
	Анти–CEACAM3 антитело	Антитело к CEACAM–3 человека/CD66d	R&D Systems, AF4166P
	Вторичное антитело	Ослиный антиовечий IgG (H+L), фикоэритрин	R&D Systems, F0126
CEACAM5	Клон кДНК	CEACAM5–GFP	Origene, RG206434
	Изотип	Мышиный изотип IgG2a, контроль PE	R&D Systems, IC003P
	Анти–CEACAM5 антитело	Конъюгированное с PE антитело к CEACAM–5 человека/CD66e	R&D Systems, FAB41281P
CEACAM6	Клон кДНК	CEACAM6–GFP	Origene, RG202454
	Изотип	Мышиный изотип IgG1 K, контроль PE	eBioscience,12–4714–82
	Анти–CEACAM6 антитело	Человеческий CD66c–PE	eBioscience,12–0667–42
CEACAM8	Клон кДНК	CEACAM8	Origene/RG204740
	Изотип	Изотип MouseIgG1, контроль PE	R&D Systems, IC002P
	Анти–CEACAM8 антитело	Конъюгированное с PE антитело к CEACAM8 человека	R&D Systems/FAB4246P

В результате было обнаружено, что C25 и полученные от C25 клоны специфически связываются с CEACAM1 только из числа членов CEACAM, к которым принадлежит CEACAM1 (фиг. 25).

Кроме того, клетки HEK293 смешивали с 10 мкг каждого из контрольного вектора, плазмидного вектора с CEACAM1 яванского макака и плазмидного вектора с CEACAM1 человека с последующей трансфекцией с использованием системы трансфекции Neon в условиях напряжения импульса 1100 В, длительности импульса 20 мс и количества импульсов 2. После 48 часов трансфекции экспрессию GFP подтверждали с помощью флуоресцентного микроскопа, и клетки отделяли обработкой TrypLE Express Solution и переносили в буфер для FACS для остановки реакции.

После однократного промывания ФСБ клетки ресуспендировали в буфере для FACS для получения концентрации 5×10⁵ клеток на 100 мкл. Раствор Human Fc Block добавляли к образцам по 1 мкл на образец и инкубировали при 4°C в течение 10 минут. Образцы обрабатывали человеческим IgG4 или C25 в концентрации 1 мкг на 5×10⁵ клеток и инкубировали при 4°C в течение 1 часа. После промывания буфером для FACS меченые PE козьи анти–huIgG4 антитела разводили в соотношении 1:200 в буфере для FACS и добавляли по 100 мкл на образец к образцам, которые инкубировали при 4°C в течение 30 минут. Образцы заливали буфером для FACS вплоть до 200 мкл, а затем центрифугировали на 1200 об/мин в течение 5 минут для удаления получившегося супернатанта. Для ресуспендирования клеток добавляли буфер для фиксации (300 мкл). Клетки, экспрессирующие GFP, отбирали в устройстве FACS LSR–Fortessa, и экспрессию каждого из членов CEACAM оценивали с использованием антител, специфичных к каждому члену семейства CEA. Кроме того, связывание с C25 оценивали по флуоресцентному каналу PE и анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo software.

В результате было обнаружено, что C25 распознает не только CEACAM1 человека, но также CEACAM1 обезьяны (яванского макака) (фиг. 26a). Полученные от C25 клоны также распознают CEACAM1 яванского макака, а также человеческий белок (фиг. 26b).

Экспериментальный пример 6. Оценка противоракового эффекта анти–CEACAM1 антитела

Раковые клетки (MKN45: банк клеток JCRB; кат. № JCRB0254; MKN1: банк клеток JCRB; кат. № JCRB0252) ресуспендировали в среде RPMI 1640 (ThermoFisher Scientific; кат. № 11875093) в концентрации 1×10⁴ на 200 мкл и распределяли в каждую лунку 96–луночного планшета по 200 мкл на лунку и культивировали в течение ночи в условиях 37°C и 5% CO₂. Неконъюгированные клетки удаляли вместе со средой, и добавляли клетки TALL–104 (ATCC; кат. № CRL–11386TM) или NK92MI (ATCC; кат. № CRL–2408TM) в различных соотношениях по отношению к раковым клеткам (0:1, 0,1:1: 1:1, 10:1). Здесь также добавляли в лунки C25 в концентрации 10 мкг/мл. В качестве контроля обрабатывали таким же образом huIgG4.

После совместного культивирования в течение 6 часов неконъюгированные растворимые клетки удаляли вместе со средой, и раствор Cell Titer 96 Aqueous One (Promega; кат. № G3582), реагент для анализа MTS, разводили в соотношении 1:4 в среде RPMI 1640. Разведенный раствор добавляли в лунки по 200 мкл на лунку и дополнительно культивировали в темном месте в течение 3 часов. После этого измеряли значение OD каждого образца с помощью спектрофотометра на длине волны 490 нм, и измеренные значения анализировали с использованием программы SoftMax Pro 5.4.1.

В результате при оценке противоракового эффекта клеток CTL (фиг. 27: TALL–104) или NK (фиг. 28: NK–92MI) с помощью способа оценки эффективности C25 in vitro было обнаружено, что C25 усиливает противораковые иммунные реакции CTL и естественных клеток–киллеров в случае линии клеток рака желудка MKN45, в которых CEACAM1 экспрессируется на высоком уровне, тогда как в случае MKN1, линии клеток рака желудка, в которых не детектируется экспрессия CEACAM1, не наблюдали никакого противоракового эффекта C25 (фиг. 27 и 28).

Кроме того, при тестировании in vitro эффекта клонов полученных от C25 анти–CEACAM1 антител в линии CEACAM1⁺ MKN45 раковых клеток таким же образом, как указано выше, гибель раковых клеток под действием анти–CEACAM1 антител достигала уровня 40–50% по сравнению с контролем (фиг. 29).

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Mogam Institute for Biomedical Research

<120> АНТИ-CEACAM1 АНТИТЕЛО И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ

<130> PCB712073MOG

<150> KR 10-2017-0037613

<151> 2017-03-24

<150> KR 10-2017-0162785

<151> 2017-11-30

<160> 130

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CDR1 (VL) анти-CEACAM1 антитела

<400> 1

Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr

1 5

<210> 2

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 2

Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr

1 5

<210> 3

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 3

Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr

1 5

<210> 4

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 4

Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Ala

1 5

<210> 5

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 5

Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 6

Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr

1 5

<210> 7

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 7

Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Asn

1 5

<210> 8

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 8

Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

1 5

<210> 9

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CDR2 (VL) анти-CEACAM1 антитела

<400> 9

Ala Asp Ser Lys Arg Pro

1 5

<210> 10

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 10

Ala Asp Ser Arg Arg Pro

1 5

<210> 11

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 11

Ala Asp Ser Lys Arg Leu

1 5

<210> 12

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 12

Ala Asn Ser Asn Arg Pro

1 5

<210> 13

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 13

Ala Asp Asn Asn Arg Pro

1 5

<210> 14

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 14

Ala Asn Ser His Arg Pro

1 5

<210> 15

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 15

Ala Asn Ser His Arg Pro

1 5

<210> 16

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 16

Ser Asn Ser His Arg Pro

1 5

<210> 17

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CDR3 (VL) анти-CEACAM1 антитела

<400> 17

Gly Ala Trp Asp Leu Ser Leu Asn Gly Tyr Val

1 5 10

<210> 18

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 18

Gly Ala Trp Asp Val Ser His Asn Gly Tyr Val

1 5 10

<210> 19

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 19

Gly Ala Trp Asp Gln Ser Leu Asn Gly Tyr Val

1 5 10

<210> 20

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 20

Gly Ala Trp Asp Ser Met Gly Asn Gly Tyr Val

1 5 10

<210> 21

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 21

Gly Ala Trp Asp Ala Ser Tyr Asn Gly Tyr Val

1 5 10

<210> 22

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 22

Gly Ala Trp Asp Gly Arg Leu Asn Gly Tyr Val

1 5 10

<210> 23

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 23

Gly Ala Trp Asp Ala Ser Leu Asn Gly Tyr Val

1 5 10

<210> 24

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 24

Gly Thr Trp Asp Ala Ser Leu Ser Ala Tyr Val

1 5 10

<210> 25

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 25

Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu Ser Gly Tyr Val

1 5 10

<210> 26

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 26

Gly Ser Trp Asp Asp Ser Leu Asn Ala Tyr Val

1 5 10

<210> 27

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 27

Ala Ala Trp Asp Ser Ser Leu Asn Gly Tyr Val

1 5 10

<210> 28

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 28

Gly Ser Trp Asp Ser Ser Leu Asn Ala Tyr Val

1 5 10

<210> 29

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 29

Gly Ala Trp Asp Tyr Ser Leu Ser Gly Tyr Val

1 5 10

<210> 30

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CDR1 (VH) анти-CEACAM1 антитела

<400> 30

Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala

1 5

<210> 31

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 31

Gly Phe Asn Phe Ser Asn Tyr Ala

1 5

<210> 32

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 32

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser

1 5

<210> 33

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 33

Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ser

1 5

<210> 34

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 34

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Ser

1 5

<210> 35

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 35

Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Asp

1 5

<210> 36

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 36

Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Ala

1 5

<210> 37

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 37

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Asp

1 5

<210> 38

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 38

Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Asp

1 5

<210> 39

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CDR2 (VH) анти-CEACAM1 антитела

<400> 39

Ile Ser His Gly Gly Gly Ser Ile

1 5

<210> 40

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 40

Ile Ser Pro Asn Gly Gly Asn Lys

1 5

<210> 41

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 41

Ile Ser Ser Asp Gly Gly Ser Lys

1 5

<210> 42

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 42

Ile Tyr Pro Asp Asp Gly Asn Thr

1 5

<210> 43

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 43

Ile Ser His Ser Ser Gly Ser Lys

1 5

<210> 44

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 44

Ile Tyr His Asp Gly Gly Ser Thr

1 5

<210> 45

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 45

Ile Tyr Ser Gly Ser Ser Ser Lys

1 5

<210> 46

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 46

Ile Ser Tyr Gly Gly Gly Ser Ile

1 5

<210> 47

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CDR3 (VH) анти-CEACAM1 антитела

<400> 47

Ala Arg Asp Pro Thr Lys Gly Tyr Ala Pro Thr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 48

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 48

Ala Arg Asp Pro Thr Lys Gly Tyr Ala Pro Leu Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 49

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 49

Ala Lys Asp Pro Tyr Asn Ile Tyr Gln Pro Leu Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 50

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 50

Ala Arg Asp Pro Arg Lys His Val Asp Arg Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 51

<211> 20

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 51

Ala Arg Gly Ser Ile Trp Trp Leu Ser Leu Ile Pro Ser Ser Tyr Asn

1 5 10 15

Ala Met Asp Val

20

<210> 52

<211> 20

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 52

Ala Arg Asp Pro Leu Pro Cys Leu Ile Pro Lys Cys Ser Tyr Tyr Tyr

1 5 10 15

Ala Met Asp Val

20

<210> 53

<211> 20

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 53

Ala Arg Val Thr Val Leu Cys Thr Thr Tyr Gly Cys Ser Ser Tyr Asp

1 5 10 15

Gly Met Asp Val

20

<210> 54

<211> 20

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 54

Ala Lys Ala Pro Leu Pro Phe Tyr Phe Arg Pro Lys Ser Tyr Tyr Tyr

1 5 10 15

Ala Met Asp Val

20

<210> 55

<211> 20

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 55

Ala Lys Asp Arg Leu Pro Gln Lys Ala Val Arg His Ser Tyr Ala Asn

1 5 10 15

Gly Met Asp Val

20

<210> 56

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность вариабельной области анти-CEACAM1

антитела (VL)

<400> 56

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Leu Ser Leu

85 90 95

Asn Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 57

<211> 333

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность вариабельной области анти-CEACAM1

антитела (VL)

<400> 57

cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60

tcttgtagtg gctcttcatc caatattggc aataattatg tctcctggta ccagcagctc 120

ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gctgatagta agcggccaag cggggtccct 180

gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240

tccgaggatg aggctgatta ttactgtggt gcttgggatt tgagcctgaa tggttatgtc 300

ttcggcggag gcaccaagct gaccgtccta ggt 333

<210> 58

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

антитела (VL)

<400> 58

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Val Ser His

85 90 95

Asn Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 59

<211> 333

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

антитела (VL)

<400> 59

cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60

tcttgtagtg gctcttcatc caatattggc aataattatg tctcctggta ccagcagctc 120

ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gctgatagta agcggccaag cggggtccct 180

gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240

tccgaggatg aggctgatta ttactgtggt gcttgggatg ttagccataa tggttatgtc 300

ttcggcggag gcaccaagct gaccgtccta ggt 333

<210> 60

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

антитела (VL)

<400> 60

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Gln Ser Leu

85 90 95

Asn Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 61

<211> 333

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

антитела (VL)

<400> 61

cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60

tcttgtagtg gctcttcatc caatattggc aataattatg tctcctggta ccagcagctc 120

ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gctgatagta agcggccaag cggggtccct 180

gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240

tccgaggatg aggctgatta ttactgtggt gcttgggatc agagcctgaa tggttatgtc 300

ttcggcggag gcaccaagct gaccgtccta ggt 333

<210> 62

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

антитела (VL)

<400> 62

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Ser Met Gly

85 90 95

Asn Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 63

<211> 333

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

антитела (VL)

<400> 63

cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60

tcttgtagtg gctcttcatc caatattggc aataattatg tctcctggta ccagcagctc 120

ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gctgatagta agcggccaag cggggtccct 180

gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240

tccgaggatg aggctgatta ttactgtggt gcttgggatt cgatgggtaa tggttatgtc 300

ttcggcggag gcaccaagct gaccgtccta ggt 333

<210> 64

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

антитела (VL)

<400> 64

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Asp Ser Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Leu Ser Leu

85 90 95

Asn Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 65

<211> 333

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

антитела (VL)

<400> 65

cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60

tcttgtagtg gctcttcatc caatattggc aataattatg tctcctggta ccagcagctc 120

ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gctgatagta ggcggccaag cggggtccct 180

gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240

tccgaggatg aggctgatta ttactgtggt gcttgggatc tgagcctgaa tggttatgtc 300

ttcggcggag gcaccaagct gaccgtccta ggt 333

<210> 66

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

антитела (VL)

<400> 66

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Asp Ser Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Ala Ser Tyr

85 90 95

Asn Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 67

<211> 333

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

антитела (VL)

<400> 67

cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60

tcttgtagtg gctcttcatc caatattggc aataattatg tctcctggta ccagcagctc 120

ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gctgatagta ggcggccaag cggggtccct 180

gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccattag tgggctccgg 240

tccgaggatg aggctgatta ttactgtggt gcttgggatg ctagctataa tggttatgtc 300

ttcggcggag gcaccaagct gaccgtccta ggt 333

<210> 68

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

антитела (VL)

<400> 68

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Asp Ser Lys Arg Leu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Gly Arg Leu

85 90 95

Asn Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 69

<211> 333

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

антитела (VL)

<400> 69

cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60

tcttgtagtg gctcttcatc caatattggc aataattatg tctcctggta ccagcagctc 120

ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gctgatagta agcggctaag cggggtccct 180

gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240

tccgaggatg aggctgatta ttactgtggt gcttgggatg gtcgtctgaa tggttatgtc 300

ttcggcggag gcaccaagct gaccgtccta ggt 333

<210> 70

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

антитела (VL)

<400> 70

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Ala Ser Leu

85 90 95

Asn Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 71

<211> 333

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

антитела (VL)

<400> 71

cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60

tcttgtagtg gctcttcatc caatattggc aataattatg tctcctggta ccagcagctc 120

ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gctgatagta agcggccaag cggggtccct 180

gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240

tccgaggatg aggctgatta ttactgtggt gcttgggatg ctagcctgaa tggttatgtc 300

ttcggcggag gcaccaagct gaccgtccta ggt 333

<210> 72

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

антитела (VL)

<400> 72

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Leu Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Glu Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ala Ser Leu

85 90 95

Ser Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 73

<211> 333

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

антитела (VL)

<400> 73

cagtctgtgc tgactcagcc actctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60

tcttgtagtg gctcttcatc taatattggc aataattatg tcaactggta ccagcagctc 120

ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gctaatagta atcggccaag cggggtccct 180

gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240

tccgaggagg aggctgatta ttactgtggt acttgggatg ctagcctgag tgcttatgtc 300

ttcggcggag gcaccaagct gaccgtccta ggt 333

<210> 74

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

антитела (VL)

<400> 74

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn

20 25 30

Thr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Asp Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu

85 90 95

Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 75

<211> 333

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

антитела (VL)

<400> 75

cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60

tcttgtagtg gctcttcatc taatattggc agtaatactg tctcctggta ccagcagctc 120

ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gctgataata atcggccaag cggggtccct 180

gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240

tccgaggatg aggctgatta ttactgtggt acttgggatt atagcctgag tggttatgtc 300

ttaggcggag gcaccaagct gaccgtccta ggt 333

<210> 76

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

антитела (VL)

<400> 76

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Asn Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Ala Ser Leu

85 90 95

Asn Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 77

<211> 333

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

антитела (VL)

<400> 77

cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60

tcttgtagtg gctcttcatc taatattggc aataatgctg tcaactggta ccagcagctc 120

ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gctaatagtc atcggccaag cggggtccct 180

gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240

tccgaggatg aggctgatta ttactgtggt gcttgggatg ctagcctgaa tggttatgtc 300

ttcggcggag gcaccaagct gaccgtccta ggt 333

<210> 78

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

антитела (VL)

<400> 78

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Pro Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn

20 25 30

Ala Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp Asp Asp Ser Leu

85 90 95

Asn Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 79

<211> 333

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

антитела (VL)

<400> 79

cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg cctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60

tcttgtagtg gctcttcatc taatattggc agtaatgctg tcacctggta ccagcagctc 120

ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gctgatagtc atcggccaag cggggtccct 180

gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240

tccgaggatg aggctgatta ttactgtggt tcttgggatg atagcctgaa tgcttatgtc 300

ttcggcggag gcaccaagct gaccgtccta ggt 333

<210> 80

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

антитела (VL)

<400> 80

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn

20 25 30

Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Asn Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Ser Ser Leu

85 90 95

Asn Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 81

<211> 333

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

антитела (VL)

<400> 81

cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60

tcttgtactg gctcttcatc taatattggc agtaattatg tcaactggta ccagcagctc 120

ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat tctaatagtc atcggccaag cggggtccct 180

gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240

tccgaggatg aggctgatta ttactgtgct gcttgggatt ctagcctgaa tggttatgtc 300

ttcggcggag gcaccaagct gaccgtccta ggt 333

<210> 82

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

антитела (VL)

<400> 82

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn

20 25 30

Asn Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Asn Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp Asp Ser Ser Leu

85 90 95

Asn Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 83

<211> 333

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

антитела (VL)

<400> 83

cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60

tcttgtagtg gctcttcatc taatattggc agtaataatg tcacctggta ccagcagctc 120

ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gctaatagtc atcggccaag cggggtccct 180

gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240

tccgaggatg aggctgatta ttactgtggt tcttgggatt ctagcctgaa tgcttatgtc 300

ttcggcggag gcaccaagct gaccgtccta ggt 333

<210> 84

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

антитела (VL)

<400> 84

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Tyr Ser Leu

85 90 95

Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 85

<211> 333

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

антитела (VL)

<400> 85

cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60

tcttgtagtg gctcttcatc taatattggc aataattatg tcacctggta ccagcagctc 120

ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gctgatagtc atcggccaag cggggtccct 180

gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240

tccgaggacg aggctgatta ttactgtggt gcttgggatt atagcctgag tggttatgtc 300

ttcggcggag gcaccaagct gaccgtccta ggt 333

<210> 86

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

антитела (VH)

<400> 86

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Val Ile Ser His Gly Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Pro Thr Lys Gly Tyr Ala Pro Thr Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 87

<211> 363

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

антитела (VH)

<400> 87

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc aattatgcta tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtg atctctcatg gtggtggtag tatatattac 180

gctgattctg taaaaggtcg gctcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatcct 300

actaaggggt atgctcctac tttcgactac tggggccagg gtacactggt caccgtgagc 360

tca 363

<210> 88

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

антитела (VH)

<400> 88

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Val Ile Ser His Gly Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Pro Thr Lys Gly Tyr Ala Pro Leu Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 89

<211> 363

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

антитела (VH)

<400> 89

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc aattatgcta tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtg atctctcatg gtggtggtag tatatattac 180

gctgattctg taaaaggtcg gctcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatcct 300

actaaggggt atgctccttt gttcgactac tggggccagg gtacactggt caccgtgagc 360

tca 363

<210> 90

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

антитела (VH)

<400> 90

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Val Ile Ser His Gly Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Pro Thr Lys Gly Tyr Ala Pro Thr Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 91

<211> 363

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

антитела (VH)

<400> 91

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caactttagc aattatgcta tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtg atctctcatg gtggtggtag tatatattac 180

gctgattctg taaaaggtcg gctcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatcct 300

actaaggggt atgctcctac tttcgattac tggggccagg gtacactggt caccgtgagc 360

tca 363

<210> 92

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

антитела (VH)

<400> 92

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Pro Asn Gly Gly Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Gly Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Pro Tyr Asn Ile Tyr Gln Pro Leu Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 93

<211> 362

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

антитела (VH)

<400> 93

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag ctctggattc acctttagca gttattctat gagctgggtc cgccaggctc 120

cagggaaggg gctggagtgg gtctcatcga tctctcctaa tggtggtaat aaatattacg 180

ctgattctgt aaaaggtcgg ttcaccatct ccagagacaa ttccaagaac acgctgtatc 240

tgcaaatgaa cagcctggga gccgaggaca cggccgtgta ttactgtgcg aaagatcctt 300

ataatattta tcagcctttg ttcgactact ggggccaggg tacactggtc accgtgagct 360

ca 362

<210> 94

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

антитела (VH)

<400> 94

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Ser Asp Gly Gly Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Pro Arg Lys His Val Asp Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 95

<211> 363

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

антитела (VH)

<400> 95

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc aattattcta tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagcg atctcttctg atggtggtag taaatattac 180

gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatcct 300

cgtaagcatg tggatcgtta tttcgactac tggggccagg gtacactggt caccgtgagc 360

tca 363

<210> 96

<211> 127

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

антитела (VH)

<400> 96

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Val Ile Tyr Pro Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ser Ile Trp Trp Leu Ser Leu Ile Pro Ser Ser Tyr Asn

100 105 110

Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Ala Val Ser Ser

115 120 125

<210> 97

<211> 381

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

антитела (VH)

<400> 97

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc gattattcta tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtg atctatcctg atgatggtaa tacatattac 180

gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaggtagt 300

atttggtggc tgtctttgat tccttcttct tataatgcta tggacgtctg gggccagggt 360

acactggtca ccgtgagctc a 381

<210> 98

<211> 127

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

антитела (VH)

<400> 98

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser His Ser Ser Gly Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Pro Leu Pro Cys Leu Ile Pro Lys Cys Ser Tyr Tyr Tyr

100 105 110

Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 99

<211> 381

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

антитела (VH)

<400> 99

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc aattatgata tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggg atctctcata gtagtggtag taaatattac 180

gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatcct 300

cttccgtgtc ttattcctaa gtgttcttat tattatgcta tggacgtctg gggccagggt 360

acactggtca ccgtgagctc a 381

<210> 100

<211> 127

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

антитела (VH)

<400> 100

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Tyr His Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Thr Val Leu Cys Thr Thr Tyr Gly Cys Ser Ser Tyr Asp

100 105 110

Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 101

<211> 381

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

антитела (VH)

<400> 101

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc ggttatgcta tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggg atctatcatg atggtggtag tacatattac 180

gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagttact 300

gttctgtgta cgacgtatgg ttgttcttct tatgatggta tggacgtctg gggccagggt 360

acactggtca ccgtgagctc a 381

<210> 102

<211> 127

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

антитела (VH)

<400> 102

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Met Ile Tyr Ser Gly Ser Ser Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Ala Pro Leu Pro Phe Tyr Phe Arg Pro Lys Ser Tyr Tyr Tyr

100 105 110

Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 103

<211> 381

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

антитела (VH)

<400> 103

gaggtgcagc tgttggagtc cgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc gattatgata tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaatg atctattctg gtagtagtag taaatattac 180

gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaagctcct 300

cttccgtttt attttcggcc taagtcttat tattatgcta tggacgtctg gggccagggt 360

acactggtca ccgtgagctc a 381

<210> 104

<211> 127

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

антитела (VH)

<400> 104

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Trp Ile Ser Tyr Gly Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Arg Leu Pro Gln Lys Ala Val Arg His Ser Tyr Ala Asn

100 105 110

Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 105

<211> 381

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

антитела (VH)

<400> 105

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc ggttatgata tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatgg atctcttatg gtggtggtag tatatattac 180

gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaagatcgt 300

cttcctcaga aggctgtgcg gcattcttat gctaatggta tggacgtctg gggccagggt 360

acactggtca ccgtgagctc a 381

<210> 106

<211> 215

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность легкой цепи анти-CEACAM1 антитела

<400> 106

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Leu Ser Leu

85 90 95

Asn Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys

210 215

<210> 107

<211> 215

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 107

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Val Ser His

85 90 95

Asn Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys

210 215

<210> 108

<211> 215

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 108

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Gln Ser Leu

85 90 95

Asn Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys

210 215

<210> 109

<211> 215

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 109

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Ser Met Gly

85 90 95

Asn Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys

210 215

<210> 110

<211> 215

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 110

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Asp Ser Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Leu Ser Leu

85 90 95

Asn Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys

210 215

<210> 111

<211> 215

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 111

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Asp Ser Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Ala Ser Tyr

85 90 95

Asn Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys

210 215

<210> 112

<211> 216

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 112

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Asp Ser Lys Arg Leu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Gly Arg Leu

85 90 95

Asn Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Arg Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Glu His Arg Gly Lys

195 200 205

Arg Gln Trp Pro Pro Thr Glu Cys

210 215

<210> 113

<211> 216

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 113

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Ala Ser Leu

85 90 95

Asn Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Arg Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Glu His Arg Gly Lys

195 200 205

Arg Gln Trp Pro Pro Thr Glu Cys

210 215

<210> 114

<211> 215

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 114

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Leu Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Glu Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ala Ser Leu

85 90 95

Ser Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys

210 215

<210> 115

<211> 215

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 115

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn

20 25 30

Thr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Asp Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu

85 90 95

Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys

210 215

<210> 116

<211> 215

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 116

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Asn Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Ala Ser Leu

85 90 95

Asn Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys

210 215

<210> 117

<211> 215

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 117

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Pro Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn

20 25 30

Ala Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp Asp Asp Ser Leu

85 90 95

Asn Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys

210 215

<210> 118

<211> 215

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 118

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn

20 25 30

Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Asn Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Ser Ser Leu

85 90 95

Asn Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys

210 215

<210> 119

<211> 215

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 119

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn

20 25 30

Asn Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Asn Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp Asp Ser Ser Leu

85 90 95

Asn Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys

210 215

<210> 120

<211> 215

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 120

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Tyr Ser Leu

85 90 95

Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys

210 215

<210> 121

<211> 448

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность тяжелой цепи анти-CEACAM1 антитела

<400> 121

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Val Ile Ser His Gly Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Pro Thr Lys Gly Tyr Ala Pro Thr Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 122

<211> 448

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 122

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Val Ile Ser His Gly Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Pro Thr Lys Gly Tyr Ala Pro Leu Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 123

<211> 448

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 123

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Val Ile Ser His Gly Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Pro Thr Lys Gly Tyr Ala Pro Thr Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 124

<211> 448

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 124

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Pro Asn Gly Gly Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Gly Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Pro Tyr Asn Ile Tyr Gln Pro Leu Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 125

<211> 448

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 125

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Ser Asp Gly Gly Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Pro Arg Lys His Val Asp Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 126

<211> 454

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 126

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Val Ile Tyr Pro Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ser Ile Trp Trp Leu Ser Leu Ile Pro Ser Ser Tyr Asn

100 105 110

Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Ala Val Ser Ser Ala

115 120 125

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser

130 135 140

Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe

145 150 155 160

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly

165 170 175

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu

180 185 190

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr

195 200 205

Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg

210 215 220

Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

225 230 235 240

Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

245 250 255

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

260 265 270

Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

275 280 285

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

290 295 300

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

305 310 315 320

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

325 330 335

Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

340 345 350

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn

355 360 365

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

370 375 380

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

385 390 395 400

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg

405 410 415

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys

420 425 430

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

435 440 445

Ser Leu Ser Leu Gly Lys

450

<210> 127

<211> 454

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 127

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser His Ser Ser Gly Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Pro Leu Pro Cys Leu Ile Pro Lys Cys Ser Tyr Tyr Tyr

100 105 110

Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120 125

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser

130 135 140

Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe

145 150 155 160

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly

165 170 175

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu

180 185 190

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr

195 200 205

Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg

210 215 220

Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

225 230 235 240

Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

245 250 255

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

260 265 270

Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

275 280 285

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

290 295 300

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

305 310 315 320

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

325 330 335

Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

340 345 350

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn

355 360 365

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

370 375 380

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

385 390 395 400

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg

405 410 415

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys

420 425 430

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

435 440 445

Ser Leu Ser Leu Gly Lys

450

<210> 128

<211> 454

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 128

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Tyr His Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Thr Val Leu Cys Thr Thr Tyr Gly Cys Ser Ser Tyr Asp

100 105 110

Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120 125

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser

130 135 140

Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe

145 150 155 160

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly

165 170 175

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu

180 185 190

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr

195 200 205

Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg

210 215 220

Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

225 230 235 240

Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

245 250 255

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

260 265 270

Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

275 280 285

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

290 295 300

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

305 310 315 320

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

325 330 335

Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

340 345 350

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn

355 360 365

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

370 375 380

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

385 390 395 400

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg

405 410 415

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys

420 425 430

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

435 440 445

Ser Leu Ser Leu Gly Lys

450

<210> 129

<211> 454

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 129

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Met Ile Tyr Ser Gly Ser Ser Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Ala Pro Leu Pro Phe Tyr Phe Arg Pro Lys Ser Tyr Tyr Tyr

100 105 110

Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120 125

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser

130 135 140

Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe

145 150 155 160

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly

165 170 175

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu

180 185 190

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr

195 200 205

Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg

210 215 220

Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

225 230 235 240

Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

245 250 255

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

260 265 270

Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

275 280 285

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

290 295 300

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

305 310 315 320

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

325 330 335

Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

340 345 350

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn

355 360 365

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

370 375 380

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

385 390 395 400

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg

405 410 415

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys

420 425 430

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

435 440 445

Ser Leu Ser Leu Gly Lys

450

<210> 130

<211> 454

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 130

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Trp Ile Ser Tyr Gly Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Arg Leu Pro Gln Lys Ala Val Arg His Ser Tyr Ala Asn

100 105 110

Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120 125

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser

130 135 140

Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe

145 150 155 160

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly

165 170 175

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu

180 185 190

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr

195 200 205

Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg

210 215 220

Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

225 230 235 240

Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

245 250 255

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

260 265 270

Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

275 280 285

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

290 295 300

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

305 310 315 320

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

325 330 335

Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

340 345 350

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn

355 360 365

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

370 375 380

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

385 390 395 400

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg

405 410 415

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys

420 425 430

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

435 440 445

Ser Leu Ser Leu Gly Lys

450

<---

Claims

1. Анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент, содержащие CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1, CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 9, CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 17, CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 39, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 47.

2. Анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент по п. 1, причем антитело содержит вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 56, и вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 86.

3. Анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент, содержащие CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1, CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 9, CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 18, CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 39, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 47.

4. Анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент по п. 3, причем антитело содержит вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 58, и вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 86.

5. Анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент, содержащие CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1, CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 9, CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 19, CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 39, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 47.

6. Анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент по п. 5, причем антитело содержит вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 60, и вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 86.

7. Анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент, содержащие CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1, CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 9, CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 20, CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 39, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 47.

8. Анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент по п. 7, причем антитело содержит вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 62, и вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 86.

9. Анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент, содержащие CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1, CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 10, CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 17, CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 39, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 47.

10. Анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент по п. 9, причем антитело содержит вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 64, и вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 86.

11. Анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент, содержащие CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1, CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 10, CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 21, CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 39, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 47.

12. Анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент по п. 11, причем антитело содержит вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 66, и вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 86.

13. Анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент, содержащие CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1, CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 11, CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 22, CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 39, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 47.

14. Анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент по п. 13, причем антитело содержит вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 68, и вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 86.

15. Анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент, содержащие CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1, CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 10, CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 17, CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 39, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 48.

16. Анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент по п. 15, причем антитело содержит вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 64, и вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 88.

17. Анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент, содержащие CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1, CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 10, CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 17, CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 31, CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 39, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 47.

18. Анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент по п. 17, причем антитело содержит вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 64, и вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 90.

19. Анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент, содержащие CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1, CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 9, CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 23, CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 39, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 47.

20. Анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент по п. 19, причем антитело содержит вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 70, и вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 86.

21. Анти–CEACAM1 антитело или его фрагмент по любому из пп. 1–20, причем фрагмент антитела выбирают из группы, состоящей из Fab, scFv, F(ab)² и Fv.

22. Способ лечения рака, содержащий введение субъекту лимфоцитов, приведенных в контакт с анти–CEACAM1 антителом или его фрагментом по любому из пп. 1–21, где рак представляет собой рак, ассоциированный с CEACAM1.

23. Способ лечения рака по п. 22, в котором лимфоциты содержат по меньшей мере одно из цитотоксических T–клеток и естественных клеток–киллеров.

24. Способ лечения рака по п. 22, в котором лимфоциты получают от субъекта.

25. Способ лечения рака по п. 22, в котором рак выбирают из группы, состоящей из рака желудка, рака поджелудочной железы, меланомы, рака легкого, рака щитовидной железы и миеломы.

26. Способ ингибирования пролиферации CEACAM1–экспрессирующих опухолевых клеток, содержащий приведение CEACAM1–экспрессирующих опухолевых клеток в контакт с анти–CEACAM1 антителом или его фрагментом по п. 1.

27. Применение антитела или его фрагмента по п. 1 для предупреждения или лечения рака, где рак представляет собой рак, ассоциированный с CEACAM1.

28. Применение антитела или его фрагмента по п. 1 для получения лекарственного средства для предупреждения или лечения рака, где рак представляет собой рак, ассоциированный с CEACAM1.