ES2825080T3 - Anticuerpos humanizados contra CEACAM1 - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo monoclonal humanizado (mAb) o un fragmento del mismo, que reconoce específicamente CEACAM1 humano, que comprende: i. una secuencia de la región variable de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32, y ii. una secuencia de región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 35.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos humanizados contra CEACAM1

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención se refiere principalmente a anticuerpos humanizados, capaces de unión específica a moléculas de CEACAM humanas. Más específicamente, la presente invención se refiere a anticuerpos contra CEACAM1, que comprenden CDR derivadas de murino y regiones humanizadas pesadas y ligeras con mutaciones inversas específicas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] La molécula de adhesión celular 1 relacionada con el antígeno carcinoembrionario (CEACAM1), también conocida como grupo de diferenciación 66a (CD66a), es un miembro de la familia de genes del antígeno carcinoembrionario (CEA) y pertenece a la superfamilia de inmunoglobulina (Ig). CEACAM1 se regula al alza en las células T y NK tras la activación y sus interacciones homofílicas conducen a la inhibición del efecto citotóxico de los linfocitos. Los estudios de varios tipos de tumores humanos han sugerido que la explotación de la vía CEACAM1 puede permitir la evasión inmunitaria por parte de los tumores. Los modelos animales preclínicos de tumores han demostrado que el bloqueo de las interacciones de CEACAM 1 por anticuerpos monoclonales (mAb) puede mejorar la respuesta inmune a los tumores. Se estima que 1.660.290 nuevos casos de cáncer y 580.350 muertes relacionadas con el cáncer se observaron en los Estados Unidos en 2013.

[0003] El bloqueo de la inmunoterapia de punto de control ha demostrado ser un nuevo y emocionante lugar para el tratamiento del cáncer. Las vías de los puntos de control inmunológico consisten en una gama de moléculas coestimuladoras e inhibidoras que trabajan en conjunto para mantener la auto-tolerancia y proteger los tejidos del daño del sistema inmunológico en condiciones fisiológicas. Los tumores se aprovechan de ciertas vías de control para evadir el sistema inmunológico. Por tanto, la inhibición de tales vías ha surgido como una estrategia de tratamiento anticanceroso prometedora (Pardoll, DM, 2012, Nat Rev Cancer, 12, 252-264). La inmunoterapia antitumoral a través del bloqueo de CEACAM1 no se limita en principio a un solo tipo de tumor, pero puede tener actividad para aumentar la respuesta inmune terapéutica a varios tumores histológicamente distintos.

[0004] El anticuerpo de linfocito T anti-citotóxico 4 (CTLA-4) ipilimumab (aprobado en 2011) fue el primer agente inmunoterapéutico que mostró un beneficio para el tratamiento de pacientes con cáncer (Robert et al., 2011, N. Engl. J Med., Vol. 364, páginas 2517-2526). El anticuerpo interfiere con las señales inhibidoras durante la presentación del antígeno a las células T. Pembrolizumab (aprobado en 2014), el anticuerpo anti-muerte celular programado 1 (PD-1) bloquea la señalización reguladora inmunitaria negativa del receptor PD-1 expresado por las células T (Hamid, 2013, N. Engl. J. Med., Vol. 2, páginas 134-144). Los anticuerpos bloqueadores del eje PD-1/PL-L1 han mostrado resultados prometedores en varios ensayos clínicos en pacientes con varios tipos de tumores (Dolan y Gupta 2014, Cancer Control, Vol. 21, páginas 231-237). Para un agente anti-PD-1 adicional se solicitó la aprobación regulatoria en 2014 para el tratamiento del cáncer de pulmón de células microcíticas (NSCLC). Actualmente, la investigación activa está explorando muchos otros puntos de control inmunológico, entre ellos: el gen de activación de linfocitos 3 (LAG3), CD137, OX40 (también conocido como CD134) y los receptores similares a las inmunoglobulinas de células asesinas (KIR) (Gelao et al., 2014, Toxins, Vol.6, páginas 914-933).

[0005] Los anticuerpos humanizados son anticuerpos de especies no humanas (por ejemplo, anticuerpos murinos) cuyas secuencias de proteínas se han modificado para aumentar su similitud con variantes de anticuerpos producidas naturalmente en humanos. El proceso de "humanización" se aplica generalmente a anticuerpos monoclonales desarrollados para su administración a humanos y se realiza cuando el proceso de desarrollo de un anticuerpo específico implica la generación en un sistema inmunológico no humano (como en ratones). Las secuencias de proteínas de los anticuerpos producidos de esta manera son distintas de los anticuerpos que se encuentran naturalmente en los seres humanos y, por lo tanto, son inmunogénicos cuando se administran a pacientes humanos. Los anticuerpos humanizados se consideran distintos de los anticuerpos quiméricos, que tienen secuencias de proteínas similares a las de los anticuerpos humanos, pero llevan grandes extensiones de proteínas no humanas.

[0006] Es posible producir un anticuerpo humanizado sin crear un intermedio quimérico. La creación directa de un anticuerpo humanizado puede lograrse insertando los segmentos codificantes de CDR apropiados (responsables de las propiedades de unión deseadas) en un andamio de anticuerpo humano, un proceso conocido como "injerto de CDR". En general, después de que se desarrolle un anticuerpo para que tenga las propiedades deseadas en un ratón (u otro animal no humano), se puede secuenciar el ADN que codifica las CDR de ese anticuerpo. Una vez que se conocen las secuencias precisas de las CDR deseadas, estas secuencias se insertan en una construcción que contiene el ADN para un marco de anticuerpo humano.

[0007] El documento WO 2010/125571 de los presentes inventores describe un anticuerpo monoclonal murino (MRG-1) producido por una célula de hibridoma específica. El mAb es altamente selectivo para CEACAM1 y no reacciona de forma cruzada con otros miembros de la familia CEACAM. El documento WO 2013/054331 de los presentes inventores describe un anticuerpo quimérico (CM-10), también altamente selectivo para CEACAM1.

[0008] El documento WO2013054320 describe anticuerpos, así como moléculas que tienen al menos la parte de unión al antígeno de un anticuerpo, que reconocen la proteína CEACAM1 y otros subtipos de la familia de proteínas CEACAM. Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos descritos se caracterizan por comprender secuencias de CDR específicas. También se proporcionan métodos de producción y uso en terapia y diagnóstico de dichos anticuerpos y fragmentos de anticuerpos.

[0009] Aunque hay progreso en el campo de la inmunoterapia, sigue existiendo una necesidad constante de nuevos tratamientos que son más eficaces y de mayor duración y que implican nuevas dianas y puede trabajar ya sea como agentes de señal o en combinación con terapias conocidas para eventualmente generar respuestas duraderas en pacientes con cáncer. Existe una necesidad insatisfecha de proporcionar anticuerpos humanizados que reconozcan proteínas CEACAM específicas que sean más seguras y más potentes y que puedan usarse de forma diagnóstica y terapéutica en enfermedades que implican la expresión o activación de proteínas CEACAM.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

[0010] La presente invención proporciona anticuerpos humanizados que reconocen CEACAM1. Los anticuerpos humanizados seleccionados de acuerdo con la presente invención contienen numerosas "retromutaciones" específicas en sus secuencias de región variable, a saber, mutaciones de la secuencia humanizada a la secuencia de ratón. Estas mutaciones inversas se producen en residuos críticos para el mantenimiento de la conformación del anticuerpo original y la afinidad de unión, mientras que tienen la menor incidencia de epítopos potenciales de células T, minimizando así el riesgo de respuesta inmune adversa hacia los anticuerpos.

[0011] Con el fin de producir un mAb humanizado que reconoce CEACAM 1 que tiene secuencias específicas de CDR en deseada orientación y conformación y el marco humano, los inventores de la presente invención identificaron residuos clave en el marco humano (fuera de las secuencias de CDR) que afectan a la presentación de CDR y diseñaron una serie de mutaciones en estos residuos clave para restaurar la presentación correcta de las CDR, al tiempo que se minimiza la inmunogenicidad de los anticuerpos. Por tanto, la presente invención proporciona, por primera vez, un anticuerpo humanizado altamente específico, no inmunogénico y de alta afinidad contra CEACAM1.

[0012] La presente invención proporciona, según un aspecto, un anticuerpo monoclonal humanizado (mAb) que reconoce específicamente CEACAM1 humano, o un fragmento del mismo que comprende al menos el dominio antigénico de unión, que comprende al menos una región variable seleccionada del grupo que consiste de: i. una secuencia de la región variable de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32, y ii. una secuencia de región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 35.

[0013] El anticuerpo monoclonal comprende una secuencia de región variable de cadena pesada expuesta en una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32. Cada posibilidad representa una realización separada de la presente invención. En algunas realizaciones específicas, el anticuerpo monoclonal comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada establecida en SEQ ID NO: 32.

[0014] El anticuerpo monoclonal comprende la secuencia de región variable de cadena ligera expuesta en una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 35. Cada posibilidad representa una realización separada de la presente invención. En algunas realizaciones específicas, el anticuerpo monoclonal comprende la secuencia de la región variable de la cadena ligera establecida en SEQ ID NO: 34.

[0015] En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal comprende la secuencia de región variable de cadena pesada expuesta en la SEQ ID NO: 32, y la secuencia de región variable de cadena ligera expuesta en la SEQ ID NO: 34.

[0016] En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal comprende la secuencia de región variable de cadena pesada expuesta en la SEQ ID NO: 28, y la secuencia de región variable de cadena ligera expuesta en la SEQ ID NO: 33. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 29, y la secuencia de la región variable de la cadena ligera indicada en SEQ ID NO: 33. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 30, y la secuencia de la región variable de la cadena ligera indicada en SEQ ID NO: 33. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 31, y la secuencia de la región variable de la cadena ligera indicada en SEQ ID NO: 33. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 32, y la secuencia de la región variable de la cadena ligera indicada en SEQ ID NO:

[0017] En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal comprende la secuencia de región variable de cadena pesada expuesta en la SEQ ID NO: 28, y la secuencia de región variable de cadena ligera expuesta en la SEQ ID NO: 34. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 29, y la secuencia de la región variable de la cadena ligera indicada en SEQ ID NO: 34. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 30, y la secuencia de la región variable de la cadena ligera indicada en SEQ ID NO: 34. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 31, y la secuencia de la región variable de la cadena ligera indicada en SEQ ID NO: 34.

[0018] En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal comprende la secuencia de región variable de cadena pesada expuesta en la SEQ ID NO: 28, y la secuencia de región variable de cadena ligera expuesta en la SEQ ID NO: 35. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 29, y la secuencia de la región variable de la cadena ligera indicada en SEQ ID NO: 35. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 30, y la secuencia de la región variable de la cadena ligera indicada en SEQ ID NO: 35. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 31, y la secuencia de la región variable de la cadena ligera indicada en SEQ ID NO: 35. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 32, y la secuencia de la región variable de la cadena ligera indicada en SEQ ID NO: 35.

[0019] De acuerdo con algunas realizaciones, la cadena pesada de mAb humanizado se selecciona del isotipo IgG4 e IgG1. Según algunas realizaciones, la cadena pesada de mAb humanizado es el isotipo IgG4. Según algunas realizaciones, la cadena ligera de mAb humanizado es el isotipo kappa. Según algunas realizaciones específicas, el mAb humanizado comprende un isotipo kappa de cadena ligera y un isotipo IgG4 de cadena pesada. Según otras realizaciones específicas, el mAb humanizado comprende un isotipo kappa de cadena ligera y un isotipo IgG1 de cadena pesada.

[0020] De acuerdo con algunas realizaciones, el mAb comprende una cadena ligera expuesta en la SEQ ID NO: 52. Según algunas realizaciones, el mAb comprende una cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 59. De acuerdo con algunas realizaciones, el mAb comprende una cadena ligera establecida en SEQ ID NO: 52 y una cadena pesada establecida en SEQ ID NO: 53. Según algunas realizaciones, el mAb comprende una cadena ligera establecida en SEQ ID NO: 52 y una cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 59.

[0021] El mAb humanizado o fragmento de unión a antígeno del mismo puede ser capaz de unirse con una afinidad de al menos aproximadamente 10-8 M a una proteína de CEACAM1 humano. El mAb humanizado o su fragmento de unión a antígeno puede ser capaz de unirse con una afinidad de al menos aproximadamente 5x10-7 M a al menos una de una proteína CEACAM3 humana y CEACAM5 humana.

[0022] Los fragmentos de los presentes mAbs que reconocen CEACAM1, que comprenden al menos un dominio de unión a antígeno también se incluyen. La presente invención proporciona además, en otro aspecto, polinucleótidos aislados que codifican un anticuerpo monoclonal descrito anteriormente o un fragmento del mismo, que reconoce específicamente CEACAM1 humana.

[0023] En algunas realizaciones, la secuencia de polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ADN establecida en cualquiera de SEQ ID NOs: 44 a 51 que codifica una región variable de mAb humanizado, o análogos de la misma que tiene al menos 90% de secuencia de identidad con dichas secuencias. En algunas realizaciones, la secuencia de polinucleótidos aislada comprende una secuencia de ADN expuesta en SEQ ID NO: 54 o SEQ ID NO: 55 que codifica una cadena pesada de mAb humanizado, o análogos de la misma que tienen al menos 90% de identidad de secuencia con dichas secuencias. En algunas realizaciones, la secuencia de polinucleótidos aislada comprende una secuencia de ADN expuesta en SEQ ID NO: 56 que codifica una cadena ligera de mAb humanizado, o análogos de la misma que tienen al menos 90% de identidad de secuencia con dichas secuencias.

[0024] La presente invención proporciona además, en otro aspecto, un plásmido que comprende el polinucleótido aislado descrito anteriormente.

[0025] La presente invención proporciona además, en otro aspecto, una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo monoclonal descrito anteriormente, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, diluyente o excipiente.

[0026] De acuerdo con algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende 1-50 mg/ml de mAb humanizado a CEACAM1. Según algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un aminoácido básico. Según algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un azúcar. Según algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un tensioactivo. Según algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un aminoácido básico, un azúcar y un tensioactivo. Según algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende (i) 1-10 mg/ml de aminoácido básico; (ii) 10/100 mg/ml de un azúcar; (iii) 0,01 -1 mg/ml de un tensioactivo; (iv) 1-50 mg/ml de mAb humanizado para CEACAM1, 4-6 mg/ml de aminoácido básico, 70-100 mg/ml de un azúcar y 0,1-1 mg/ml de tensioactivo no aniónico; o (v) 10 mg/ml de mAb humanizado a CEACAM1,4,65 mg/ml de L-histidina, 82 mg/ml de sacarosa y 0,20 mg/ml de polisorbato 20.

[0027] De acuerdo con algunas realizaciones, el aminoácido básico es seleccionado del grupo que consiste en: Histidina, Arginina, Lisina y Ornitina. Cada posibilidad representa una realización separada de la presente invención. Según algunas realizaciones, la composición comprende 1-10, 2-9, 3-7 o 4-6 mg/ml de aminoácido básico. Cada posibilidad representa una realización separada de la presente invención.

[0028] De acuerdo con algunas realizaciones, el azúcar se selecciona del grupo que consiste de: sacarosa, trehalosa, glucosa, dextrosa y maltosa. Cada posibilidad representa una realización separada de la presente invención. Según algunas realizaciones, la composición comprende 10-200, 10-100, 50-150 o 70-100 mg/ml de azúcar. Cada posibilidad representa una realización separada de la presente invención.

[0029] De acuerdo con todavía otras realizaciones, la composición comprende poliol, incluyendo pero no limitado al manitol y sorbitol. Cada posibilidad representa una realización separada de la presente invención.

[0030] De acuerdo con algunas realizaciones, el tensioactivo es un no aniónico. Según algunas realizaciones, el tensioactivo se selecciona del grupo que consiste en: polisorbatos, ésteres de sorbitán y poloxámeros. Cada posibilidad representa una realización separada de la presente invención. Según algunas realizaciones, el tensioactivo se selecciona del grupo que consiste en: polisorbato 20, polisorbato 80. Cada posibilidad representa una realización separada de la presente invención. Según algunas realizaciones, la composición comprende 0,01-10, 0,01-1, 0,05-5 o 0,1-1 mg/ml de tensioactivo. Cada posibilidad representa una realización separada de la presente invención. Según algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende 4-6 mg/ml de aminoácido básico, 70-100 mg/ml de un azúcar y 0,1-1 mg/ml de tensioactivo.

[0031] Según algunas realizaciones, la composición farmacéutica está en una forma líquida y comprende 1-50 mg/ml de mAb humanizado a CEACAM1 comprende al menos una mutación inversa a una secuencia murina. Según otras realizaciones, la composición farmacéutica está liofilizada. Según algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende: 10 mg/ml de mAb humanizado para CEACAM1,4,65 mg/ml de L-Histidina, 82 mg/ml de sacarosa y 0,20 mg/ml de polisorbato 20.

[0032] De acuerdo con algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende al menos un mAb humanizado o fragmento definido anteriormente y un inmunomodulador adicional o un inhibidor de quinasa. Según algunas realizaciones, una composición farmacéutica que comprende al menos un mAb humanizado o un fragmento definido anteriormente, y una composición farmacéutica que comprende un inmunomodulador adicional o un inhibidor de quinasa, se utilizan en el tratamiento del cáncer mediante administración separada.

[0033] De acuerdo con algunas realizaciones específicas, el inmunomodulador adicional se selecciona del grupo que consiste de: una proteína de muerte celular programada anti-humana 1 (PD-1), el anticuerpo PD-L1 y PD-L2, un linfocito citotóxico activado celular, un agente activador de linfocitos y un inhibidor de la vía RAF/MEK. Cada posibilidad representa una realización separada de la presente invención. Según algunas realizaciones específicas, el inmunomodulador adicional se selecciona del grupo que consiste en: mAb a PD-1, mAb a PD-L1, mAb a PD-L2, Interleucina 2 (IL-2), célula asesina activada por linfocinas (LAK).

[0034] De acuerdo con algunas realizaciones, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un humanizado mAb como se definió anteriormente o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y una composición farmacéutica que comprende un mAb a al menos una de las proteínas de muerte celular programada humana 1 (PD-1), PD-L1 y PD-L2 o un fragmento de unión a antígeno de los mismos, para su uso en el tratamiento del cáncer mediante administración separada.

[0035] Según otras formas de realización se proporciona una composición farmacéutica que comprende un mAb humanizado a CEACAM definido anteriormente, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y una célula linfocitaria citotóxica activada. En determinadas realizaciones, la célula linfocitaria citotóxica activada se selecciona del grupo que consiste en una célula LAK, una célula CIK y cualquier combinación de las mismas. Cada posibilidad representa una realización separada de la invención. En determinadas realizaciones, la célula linfocitaria citotóxica activada es una célula asesina activada por linfocinas (LAK).

[0036] En otras realizaciones, la composición farmacéutica comprende un mAb humanizado a CEACAM1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y un agente de activación de linfocitos o una proteína de fragmento, análogo o fusión del mismo. En determinadas realizaciones, el agente de activación de linfocitos se selecciona del grupo que consiste en IL-2, IFNy, un anticuerpo anti-CD3 y fragmentos, análogos o proteínas de fusión de los mismos. En determinadas realizaciones, el agente de activación de linfocitos es IL-2 o un fragmento, análogo o proteína de fusión del mismo. Cada posibilidad representa una realización separada de la invención.

[0037] En aún otras realizaciones, la composición farmacéutica comprende un inhibidor de una quinasa seleccionada del grupo que consiste en un mutante de quinasa B-Raf, una quinasa MEK1 y una quinasa MEK2, y un mAb humanizado a CEACAM1 humano definido anteriormente o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0038] De acuerdo con algunas realizaciones específicas, el inhibidor de quinasa B-Raf atenúa o previene la fosforilación de MEK1 o MEK2 por el mutante de quinasa B-Raf. En determinadas realizaciones, el inhibidor de la quinasa B-Raf atenúa o previene la dimerización del mutante de la quinasa B-Raf. En determinadas realizaciones, el inhibidor de la quinasa MEK1 atenúa o previene la fosforilación de MAPK por la quinasa MEK1. En determinadas realizaciones, el inhibidor de la quinasa MEK2 atenúa o previene la fosforilación de MAPK por la quinasa MEK2.

[0039] La presente invención proporciona además, de acuerdo con otras realizaciones, un inhibidor de una quinasa seleccionada del grupo que consiste en un mutante de quinasa B-Raf, una quinasa MEK1 y una quinasa MEK2, y un mAb humanizado a CEACAM1 humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo, para su uso en el tratamiento del cáncer. Los dos ingredientes activos pueden ser parte de una o más composiciones farmacéuticas separadas que pueden administrarse simultáneamente o por administraciones separadas.

[0040] El mAb humanizado a CEACAM1 de acuerdo con la presente invención y el inmunomodulador adicional puede estar contenido en una composición farmacéutica o en composiciones separadas para la administración simultánea o separada.

[0041] En algunas realizaciones, la composición farmacéutica es para el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado con la expresión, la activación o la función de un miembro de la familia de proteínas CEACAM, incluyendo, pero no limitado a CEACAM1. Cada posibilidad representa una realización separada de la presente invención.

[0042] En algunas realizaciones, la composición farmacéutica es para el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado con expresión, activación o función de CEACAM1. En algunas realizaciones, la enfermedad o trastorno es una enfermedad o trastorno proliferativo celular. Cada posibilidad representa una realización separada de la presente invención. En algunas realizaciones, la enfermedad o trastorno proliferativo celular es un cáncer.

[0043] De acuerdo con algunas realizaciones, el cáncer se selecciona de entre el grupo que consiste en: melanoma, colorrectal, vejiga, pulmón, carcinoma de pulmón no microcítico (CPNM), adenocarcinoma de pulmón no microcítico (APNM), gastrointestinal, pancreático, de mama, cáncer de próstata, tiroides, estómago, ovario, mieloma y útero. Cada posibilidad representa una realización separada de la presente invención.

[0044] La presente invención proporciona además, en otro aspecto, una composición de diagnóstico que comprende al menos un mAb humanizado o un fragmento del mismo, que reconoce específicamente CEACAM 1 humano, como se describe anteriormente.

[0045] La presente divulgación proporciona además un método para prevenir, atenuar o tratar una enfermedad o trastorno asociado con la expresión, activación o función de una proteína CEACAM1, que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica descrita anteriormente.

[0046] La enfermedad o trastorno es un cáncer o una infección, por ejemplo, una infección viral.

[0047] En algunas realizaciones, el anticuerpo aislado contenido en la composición farmacéutica está unido a un resto citotóxico.

[0048] El método descrito anteriormente comprende la administración al sujeto de al menos una dosis de un mAb humanizado a CEACAM1 que van desde 0,01 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal. El método descrito anteriormente comprende administrar (i) dosis múltiples, idénticas o diferentes, de mAb humanizado; (ii) múltiples dosis crecientes; o (iii) la composición farmacéutica una vez a la semana, una cada 2 semanas, una vez cada 3 semanas, una vez cada 4 semanas o una vez cada 5 semanas. En determinadas realizaciones, el método descrito anteriormente comprende de 1 a 10 ciclos de administración, comprendiendo cada ciclo de 2 a 5 infusiones cada 1 a 4 semanas, con un mAb humanizado, seguido de 2 a 8 semanas entre cada ciclo.

[0049] El método descrito anteriormente comprende además administrar una célula de linfocitos o una pluralidad de células de linfocitos. El método descrito anteriormente comprende además administrar al sujeto linfocitos que expresan CEACAM1. En algunas realizaciones, los linfocitos comprenden células T, células NK o linfocitos infiltrantes de tumores (TIL). La célula de linfocitos expresa CEACAM1, PD-1 o ambos. La célula de linfocitos puede expresar CEACAM1 y PD-1. La célula de linfocito puede seleccionarse del grupo que consiste en una célula de linfocito infiltrante de tumor (TIL), una célula asesina activada por linfocitos (LAK), una célula asesina inducida por citocinas (CIK), una célula T, una célula B, una célula NK y cualquier combinación de los mismos. La célula de linfocito puede seleccionarse del grupo que consiste en una célula de linfocito infiltrante de tumor (TIL) y una célula asesina activada por linfocina (LAK). La célula de linfocito puede ser una célula de linfocito infiltrante de tumor (TIL) o una pluralidad de células TIL. La célula de linfocitos es una célula asesina activada por linfocinas (LAK) o una pluralidad de células LAK. Se puede activar la célula de linfocitos. En algunas realizaciones, la célula de linfocitos es citotóxica para una célula cancerosa. En algunas realizaciones, la célula cancerosa expresa CEACAM1, PD-L1, PD-L2 o cualquier combinación de los mismos. La célula cancerosa expresa CEACAM1, PD-L1 o ambos. La célula cancerosa expresa CEACAM1, PD-L2 o ambos. La célula cancerosa expresa CEACAM1 y PDL1 y PD-L2.

[0050] Los métodos descritos anteriormente comprenden además administrar al sujeto un agente de activación de linfocitos. El agente de activación de linfocitos puede seleccionarse del grupo que consiste en IL-2, IFNy y un anticuerpo anti-CD3. Los métodos descritos anteriormente comprenden además administrar al sujeto una composición anticancerígena adicional.

[0051] La presente divulgación proporciona además un método de inmunomodulación, comprendiendo el método poner en contacto un linfocito que expresa CEACAM1 con los anticuerpos o fragmentos de los mismos descritos anteriormente.

[0052] La presente divulgación proporciona además un método de inhibición de la migración de una célula tumoral de expresión de CEACAM1, comprendiendo el método poner en contacto dicha célula tumoral que expresa CEACAM1 con los anticuerpos o fragmentos de los mismos descritos anteriormente, inhibiendo de este modo la migración de dicha célula tumoral que expresa CEACAM.

[0053] La presente divulgación proporciona además un método de inhibición de interacción proteína-proteína homotípica o heterotípica de CEACAM1, comprendiendo el método poner en contacto un linfocito que expresa CEACAM1 con los anticuerpos o fragmentos de los mismos descritos anteriormente, inhibiendo de este modo interacción proteína-proteína homotípica o heterotípica de CEACAM1.

[0054] La presente divulgación proporciona además un método para aumentar la duración o progresión de la respuesta o la supervivencia de un sujeto que tiene cáncer, que comprende administrar al sujeto cantidades eficaces de una composición que comprende un anticuerpo monoclonal como se describe anteriormente, y una composición antineoplásica, en donde dicha composición antineoplásica comprende al menos un agente quimioterapéutico, por lo que la coadministración del anticuerpo y la composición antineoplásica aumenta eficazmente la duración o progresión de la supervivencia.

[0055] El método puede comprender la administración de una composición farmacéutica definida anteriormente junto con composición anti-cáncer adicional. Por consiguiente, la composición anticancerosa puede comprender al menos un agente quimioterapéutico. La composición anticancerosa comprende un agente inmunomodulador. El agente anticanceroso, que podría administrarse junto con el anticuerpo según la presente invención, o por separado, puede comprender cualquier agente conocido en la técnica que presente actividad anticancerosa.

[0056] Un método de tratamiento de cáncer se da a conocer que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo humanizado que reconoce CEACAM1 y comprende copias de mutaciones a una secuencia murina, y una composición farmacéutica que comprende un inmunomodulador adicional o un inhibidor de quinasa.

[0057] El inmunomodulador se selecciona del grupo que consiste en: mAb a PD-1, mAb a PD-L1, mAb a PD-L2, interleucina 2 (IL-2), célula asesina activadaa por linfoquinas (LAK) y el inhibidor de quinasa es un inhibidor de B-Raf/MEK.

[0058] El método comprende la administración de dos o más composiciones farmacéuticas. En algunas realizaciones, la administración de dos o más de las composiciones farmacéuticas se realiza simultáneamente. En algunas realizaciones del método, la administración de dos o más de las composiciones farmacéuticas se realiza de forma secuencial. En algunas realizaciones del método, el inmunomodulador adicional se administra antes del mAb humanizado a CEACAM1 humano o su fragmento de unión a antígeno. En algunas realizaciones del método, el inmunomodulador se administra simultáneamente con el mAb a CEACAM1 humano o su fragmento de unión a antígeno. En algunas realizaciones del método, el inmunomodulador se administra después del mAb humanizado a CEACAM1 humano o su fragmento de unión a antígeno.

[0059] El método comprende administrar a dicho paciente una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal de anticuerpos a CEACAM1 humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal de PD-1 humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Cada posibilidad representa una realización separada de la presente invención.

[0060] Los métodos descritos anteriormente de tratamiento de un paciente que tiene cáncer comprende la etapa de administrar al paciente una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de una quinasa seleccionada del grupo que consiste de mutante de quinasa B-Raf, una quinasa MEK1 y una quinasa MEK2 y una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal para CEACAM1 humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde las células cancerosas expresan un mutante de quinasa B-Raf, tratando así el cáncer.

[0061] Los métodos descritos anteriormente para el tratamiento del cáncer comprenden además la etapa de administrar a dicho paciente una composición farmacéutica que comprende una célula de linfocitos. En algunas realizaciones, la administración de la composición farmacéutica que comprende una célula de linfocito se realiza simultáneamente con al menos una de las composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos. En algunas realizaciones del método, la administración de las dos o más composiciones farmacéuticas se realiza de forma secuencial.

[0062] La célula de linfocitos se pre-incuba con un mAb humanizado a CEACAM1 humano, con un fragmento de unión a antígeno del mismo o con el inmunomodulador adicional. Cada posibilidad representa una realización separada de la presente invención.

[0063] Una composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención puede administrarse por cualquier medio adecuado, tal como por vía intranasal, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraarticular, intralesional por vía oral, o por vía tópica. Según algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra por vía parenteral. Según algunas realizaciones específicas, se utiliza la administración intravenosa (iv).

[0064] Un método de acuerdo con la presente descripción de tratar el cáncer u otra enfermedad o trastorno asociado a CEACAM1, comprende de acuerdo con algunas realizaciones, administrar a un sujeto que lo necesite al menos una dosis de un mAb humanizado para CEACAM1 en el intervalo de 0,01 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal.

[0065] La al menos una dosis se puede seleccionar del grupo que consiste en: 0,01-0,1 mg/kg; 0,1-1 mg/kg; 1-10 mg/kg; y 10-50 mg/kg.

[0066] El método comprende administrar de dosis múltiples de mAb humanizado, en donde las dosis múltiples son idénticas o diferentes. Según algunas realizaciones, el método comprende administrar múltiples dosis crecientes. Según algunas realizaciones, el método comprende al menos un ciclo de administración durante al menos 12 semanas.

[0067] La duración del tratamiento es 12-50 semanas. La duración del tratamiento puede seleccionarse del grupo que consta de: 12-20 semanas, 20-30 semanas y 30-50 semanas. Según otras realizaciones más, el régimen de tratamiento comprende varios ciclos de administración cada uno durante al menos 12 semanas.

[0068] El régimen de tratamiento comprende 1 -8 ciclos, comprendiendo cada ciclo 4 infusiones de mAb anti CEACAM humanizado para una duración de al menos 4 semanas. Según algunas realizaciones, el régimen de tratamiento comprende de 2 a 6 ciclos.

[0069] De acuerdo con algunas realizaciones, la administración puede ser una vez cada semana, una cada 2 semanas, una vez cada 3 semanas, una vez cada 4 semanas, o una vez cada 5 semanas. Cada posibilidad representa una realización separada de la presente invención.

[0070] De acuerdo con algunas formas de realización, un régimen de tratamiento comprende 1-10 ciclos, comprendiendo cada ciclo 2-5 infusiones cada 1-4 semanas, con un mAb humanizado de acuerdo con la invención, seguido de 2-8 semanas entre cada ciclo.

[0071] Según algunas realizaciones un régimen de aumento de la dosis está provisto que comprende la administración a partir de 0,01 mg/kg, y continuando a 0,03 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, y 10 mg/kg. Según aún otras realizaciones, el régimen de tratamiento comprende 6 ciclos de 4 infusiones cada una administrada cada 2 semanas.

[0072] La presente divulgación proporciona además un método para diagnosticar un cáncer en un sujeto en necesidad del mismo, comprendiendo el método poner en contacto una muestra biológica derivada u obtenida de dicho sujeto con la composición de diagnóstico descrita anteriormente, en donde una formación del complejo más allá de un umbral predeterminado es indicativo del cáncer en dicho sujeto.

[0073] La presente divulgación proporciona además un método para determinar la expresión de CEACAM1, comprendiendo el método poner en contacto una muestra biológica con los anticuerpos o fragmentos de los mismos descritos anteriormente, y midiendo el nivel de formación del complejo inmune. El procedimiento comprende comparar dicho nivel de complejo inmune con una curva patrón obtenida a partir de cantidades conocidas de CEACAM 1.

[0074] La presente divulgación proporciona además un método para diagnosticar una enfermedad o trastorno asociado con una expresión de la proteína CEACAM, que comprende las etapas de incubar una muestra biológica con un anticuerpo monoclonal como se describió anteriormente; detectar la proteína CEACAM unida usando una sonda detectable; comparar la cantidad de proteína CEACAM unida con una curva estándar obtenida de muestras de referencia que contienen cantidades conocidas de proteína CEACAM; calcular la cantidad de proteína CEACAM en la muestra biológica a partir de la curva estándar; y comparar la cantidad de proteína CEACAM con una cantidad de proteína CEACAM normal.

[0075] Un mAb humanizado de acuerdo con la invención se usa como un biomarcador predictivo asociado con tratamiento anti CEACAM1, basado en niveles de expresión de CEACAM1 en especímenes tumorales antes del tratamiento. La expresión de los niveles de CEACAM1 se determina usando métodos conocidos en la técnica utilizando un mAb humanizado de acuerdo con la invención.

[0076] La presente invención proporciona además, en un aspecto, el uso de un anticuerpo monoclonal como se describe anteriormente, para diagnóstico, prevención o tratamiento de una proliferación celular o una enfermedad o un trastorno o una infección relacionados con la angiogénesis.

[0077] La presente invención proporciona además, en un aspecto, el uso de un anticuerpo monoclonal como se describe anteriormente, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno o enfermedad asociada con la expresión o la activación de una proteína CEACAM.

[0078] La presente invención proporciona además, en un aspecto, el uso de un anticuerpo monoclonal como se describe anteriormente, para la preparación de una composición de diagnóstico para el diagnóstico de una enfermedad proliferativa celular o la angiogénesis relacionada o trastorno o una infección.

[0079] Otras formas de realización y el alcance completo de aplicabilidad de la presente invención resultarán evidentes a partir de la descripción detallada dada a continuación. Sin embargo, debe entenderse que la descripción detallada y los ejemplos específicos, si bien indican las realizaciones preferidas de la invención, se proporcionan únicamente a modo de ilustración, ya que varios cambios y modificaciones dentro del espíritu de la invención resultarán evidentes para los expertos en la técnica a partir de esta descripción detallada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0080]

La Figura 1 es un modelo estructural de las regiones V quiméricas del anticuerpo anti-CEACAM-1 (CM-10) en la vista superior (A) y en vistas laterales estéreo (B), producidas por el programa de modelado de homología de la estructura de la proteína Swiss PDB.

La Figura 2 es un gel de SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie de anticuerpos purificados con proteína A. Aproximadamente 2 pg de cada muestra se cargó en un gel al 4-12% Bis-Tris NuPage (Invitrogen cat. n° NP0322BOX) y ejecute a 200 V durante 40 min. (A) variantes injertadas con CDR de IgG 1; (B) variantes injertadas con CDR de IgG4 (S241P). Se utilizó Fermentas Pageruler Plus (SM1811) como patrón de peso molecular (que contiene bandas de referencia a 10, 25 y 70 kDa). Las muestras se numeraron como sigue:

La Figura 3 es una ilustración gráfica de los resultados de los ensayos ELISA de unión competitiva de CEACAM-1 humano recombinante. Se compitieron concentraciones variables de variantes de anticuerpo IgG humanizado purificado contra una concentración constante de IgG anti-CEACAM-1 biotinilada (CM-10 IgG1 quimérica): (A) Variantes de IgG1; y (B) Variantes de IgG4 (S241P). CM-10 enlazado biotinilado quimérico se detectó usando HRP estreptavidina y sustrato de TMB.

La Figura 4 representa los efectos sinérgicos de los anticuerpos anti-CEACAM1 y anti-PD-1 sobre la citotoxicidad de las células TIL humanas contra las células del melanoma humano. Las células TIL se incubaron con varias concentraciones de un mAb humanizado para CEACAM1 humano (línea negra discontinua, marcador de esfera), un mAb para PD-1 humano (línea gris sólida, marcador rectangular) o una combinación de ambos anticuerpos (línea negra sólida, triángulo marcador). Se añadieron células de melanoma tratadas con IFN-y para una incubación durante la noche. Los resultados representan un promedio de % de citotoxicidad ±DE según lo determinado por el ensayo clásico de liberación de LDH de pocillos triplicados por tratamiento. * P< 0,05 prueba T pareada en comparación con el anticuerpo monoclonal para CEACAM1 humano únicamente.

La Figura 5A-B Efectos sinérgicos de anticuerpos anti-CEACAM1 y anti-PD-1 sobre los niveles de Granzima B y la citotoxicidad de células TIL humanas contra células de melanoma humano cuando se añaden anticuerpos anti-PD-1 antes de la adición de anticuerpos anti-CEACAM1. Se cultivaron células de melanoma humano en presencia de IFN-a para inducir la expresión de PD-L1. Las células TIL humanas se incubaron con medio solo (negro), anticuerpo IgG no específico (blanco), varias concentraciones de un anticuerpo monoclonal para CEACAM1 humano (líneas verticales), un anticuerpo monoclonal para PD-1 humano (líneas horizontales) o una combinación de ambos anticuerpos (puntos). (A) Los resultados representan un promedio de % de citotoxicidad ±DE según lo determinado por el ensayo clásico de liberación de LDH de pocillos triplicados por tratamiento. * P < 0,05 prueba T pareada en comparación con a-PD-1 solamente. (B) Los resultados representan los niveles ±DE de Granzima B según lo determinado por el kit ELISA de Granzima B comercial a partir de pocilios triplicados por tratamiento.

La Figura 6. Efectos sinérgicos de anticuerpos anti-CEACAMI y anti-PD-1 sobre la citotoxicidad de células LAK humanas contra células de melanoma humano cuando se añaden anticuerpos anti-PD-1 antes de la adición de anticuerpos anti-CEACAM1. Se cultivaron células de melanoma humano en presencia de IFN-a para inducir la expresión de PD-L1. Las células LAK humanas generadas por la activación de PBMC de un donante humano sano con IL-2 se incubaron con medio solo (blanco), anticuerpo IgG no específico (negro), varias concentraciones de un anticuerpo monoclonal para CEACAM1 humano (líneas verticales), un anticuerpo monoclonal contra PD-L1 humano (líneas horizontales) o una combinación de ambos anticuerpos (puntos). Los resultados representan un promedio de % de citotoxicidad ±DE según lo determinado por el ensayo clásico de liberación de LDH de pocillos triplicados por tratamiento. * P < 0,05 prueba T pareada comparada con a-PD-L1 solamente. El índice de combinación se calculó como se describió anteriormente.

La Figura 7. El tratamiento con anticuerpos anti-CEACAM1 aumenta la expresión de PD-L1 en las células cancerosas diana. Se incubaron células NK (NK92MI) con o sin CM-24 (10 pg/ml), seguido de la adición de células de melanoma humano (SKMEL28). Las células se incubaron durante 24, 48 y 72 horas y se midieron los niveles de PD-L1 en cada punto de tiempo mediante análisis FACS. La relación media de anti-PD-Ll en comparación con un control de isotipo apropiado para los tratamientos indicados en los diferentes momentos.

La Figura 8. Efectos sinérgicos de anticuerpos anti-CEACAM1 y anti-PD-1 sobre la progresión tumoral en ratones inmunocompetentes. Se implantaron células de linfoma murino por vía subcutánea en el abdomen de ratones BALB/C (día 1). Los días 10, 15 y 20, a los ratones se les administró por vía intravenosa PBS (línea negra discontinua, círculos vacíos), un anticuerpo CEACAM1 anti-murino (línea gris continua, rectángulos grises), un anticuerpo PD-1 anti-murino (línea gris sólida, triángulos grises) o una combinación de ambos anticuerpos (línea negra sólida, esferas negras).

La Figura 9. Los anticuerpos anti-CEACAM1 aumentan la citotoxicidad de las células LAK humanas contra las células del melanoma humano. Las células LAK humanas se incubaron con CM-24 en diferentes concentraciones durante 30 minutos a 37°C. Se añadieron células de cáncer de melanoma humano (SKMEL28) durante una incubación de 24 horas. Los resultados representan un promedio de % de citotoxicidad ±DE según lo determinado por el ensayo clásico de liberación de LDH de pocillos triplicados por tratamiento. * P < 0,05 prueba T pareada en comparación con células efectoras diana con medio solamente.

La Figura 10. Los anticuerpos anti-CEACAM1 aumentan la citotoxicidad de las células LAK humanas frente a las células T3M4 de cáncer de páncreas humano. Las células LAK humanas se incubaron con CM-24 en diferentes concentraciones durante 30 minutos a 37°C. Se añadieron células de cáncer de páncreas humano T3M4 durante una incubación de 24 horas. Los resultados representan un promedio de % de citotoxicidad ±DE según lo determinado por el ensayo clásico de liberación de LDH de pocillos triplicados por tratamiento. * P< 0,05 prueba T pareada en comparación con células efectoras diana con medio solamente.

La Figura 11. Los anticuerpos anti-CEACAM1 potencian la secreción de IFN-y de células LAK humanas en presencia de células cancerosas humanas. Las células LAK humanas se incubaron con CM-24 en diferentes concentraciones durante 30 minutos a 37°C. Se añadieron células de cáncer de pulmón humano H358 (11A) o H460 (11B) durante una incubación de 24 horas. La secreción de IFN-y se midió mediante ELISA. Los resultados representan la media D.E. de los valores de liberación de Granzima B de 3 repeticiones por tratamiento. * P< 0,05 prueba T pareada, en comparación con células efectoras diana con medio solamente.

Las Figuras 12A y 12B presentan la correlación entre la expresión de los tipos CEACAM1 CEACAM1 largo (A) y CEACAM1 corto (B) y la resistencia a inhibidores de mutantes B-Raf en células cancerosas.

La Figura 13A presenta pictogramas de pulmones extraídos de ratones injertados con células de melanoma y tratados según los grupos de tratamiento indicados en la figura;

La Figura 13B presenta el peso tumoral medio de cada grupo de tratamiento; y la Figura 13C presenta el número de lesiones por ratón de cada grupo de tratamiento.

La Figura 14 es un histograma de barras que presenta el porcentaje de ocupación del receptor CEACAM1 en células TIL aisladas del modelo de lesiones pulmonares.

Las Figuras 15A y 15B representan las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera y pesada del mAb anti CEACAM1 humanizado retromutado, denominado CM-24, actualmente en ensayo clínico.

La Figura 15A contiene la secuencia de cadena ligera (SEQ ID NO: 52) en donde los residuos de aminoácidos 1-107 son la región variable que incluye las CDR y los residuos de aminoácidos 108-214 (en negrita) son la región constante de la cadena ligera kappa.

Figura 15B que representa la secuencia de la cadena pesada (SEQ ID NO: 53), los residuos de aminoácidos 1-120 son la región variable, los residuos de aminoácidos 121-447 (en negrita) son la región constante de la cadena pesada de IgG4 y el sitio de N-glicosilación predicho (Asparagina 297) está subrayado.

La Figura 15C que representa la secuencia de la cadena pesada (SEQ ID NO: 59), los residuos de aminoácidos 1­ 121 son la región variable, los residuos de aminoácidos 122-450 (en negrita) son la región constante de la cadena pesada de IgG 1 y el sitio de N-glicosilación predicho (Asparagina 300) está subrayado.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0081] La presente invención describe anticuerpos humanizados monoclonales que reconocen CEACAM1. Los anticuerpos de la invención están humanizados, evitando así el riesgo de una respuesta inmune adversa hacia los anticuerpos y son por lo tanto seguros para su uso in vivo en humanos. Los anticuerpos de la invención se caracterizan por tener una secuencia CDR única y un diseño y secuencias de marco no completamente humanizadas novedosas. Las propiedades únicas de los anticuerpos monoclonales de la presente invención amplían su utilidad terapéutica para el tratamiento y diagnóstico de tipos adicionales de neoplasias malignas y diversas infecciones. Más específicamente, los anticuerpos monoclonales proporcionados por la presente invención tienen combinaciones específicas de CDR y secuencias marco no completamente humanizadas, y poseen propiedades únicas y seguridad y potencia mejoradas sobre los anticuerpos anti-CEACAM1 no humanos conocidos.

[0082] Las propiedades únicas de los anticuerpos proporcionados por la presente invención confieren una serie de ventajas para el uso de estos anticuerpos en humanos, específicamente en aplicaciones que requieren a largo plazo o administración repetida, cuando otros anticuerpos no humanos no se pueden administrar en el temor de provocar una respuesta inmunogénica hacia los propios anticuerpos no humanos. Evitar dicha respuesta inmunitaria se vuelve más crucial cuando la persona tratada es un paciente afectado por una enfermedad, donde se debe evitar agravar aún más la salud del paciente. La presente invención proporciona además, en otro aspecto, un anticuerpo monoclonal no completamente humanizado, que comprende i. una secuencia de región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32, y ii. una secuencia de región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en: s Eq ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 35.

[0083] En aras de la claridad, es preciso señalar que las regiones variables de los anticuerpos proporcionados por la presente invención comprenden (a) las secuencias de CDR descritos anteriormente por los inventores de la presente invención, y (b) secuencias marco, también indicadas en el presente documento secuencias que no son CDR, al menos una de las cuales es diferente en al menos un residuo de una secuencia marco completamente humana correspondiente.

[0084] En ciertas realizaciones, la expresión "una secuencia que difiere de otra secuencia" como se usa en este documento significa una secuencia que contiene una sustitución de al menos un amino-ácido, una inserción de al menos un amino-ácido, una deleción de al menos un aminoácido, o cualquier combinación de los mismos, en comparación con una secuencia respectiva. En ciertas realizaciones, la frase "una secuencia que difiere de otra secuencia" como se usa en este documento significa una secuencia que contiene una sustitución de al menos un aminoácido en comparación con una secuencia respectiva. El término "secuencia no CDR", como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia marco, a saber, cualquier secuencia de aminoácidos comprendida en una región variable de un anticuerpo, que no es una secuencia CDR identificada por la presente invención. Los ejemplos de secuencias que no son CDR incluyen secuencias que preceden o son adyacentes a CDR1, secuencias entre CDR1 y CDR2, secuencias entre CDR2 y CDR3 y secuencias siguientes o adyacentes a CDR3.

[0085] Dado que las regiones variables de los anticuerpos proporcionados por la presente invención difieren en al menos un amino-ácido a partir de las regiones variables de anticuerpos completamente humanos, son también etiquetados anticuerpos "no totalmente humanizados" y "no completamente humanos".

[0086] El término "CEACAM1" se usa para referirse al producto de proteína del gen por ejemplo CEACAM1, NP_001020083.1, NP_001703.2. En humanos, hasta ahora se han detectado 11 variantes de empalme de CEACAM1 diferentes. Las isoformas de CEACAM1 individuales difieren con respecto al número de dominios extracelulares similares a inmunoglobulinas (por ejemplo, CEACAM1 con cuatro dominios extracelulares similares a inmunoglobulinas se conoce como CEACAM1-4), el anclaje de la membrana y/o la longitud de su cola citoplasmática (por ejemplo, CEACAM1-4 con una cola citoplásmica larga se conoce como CEACAM1-4L y CEACAM1-4 con una cola citoplásmica corta se conoce como CEACAM1-4S). El dominio N-terminal de CEACAM1 comienza inmediatamente después del péptido señal y su estructura se considera de tipo IgV. Por ejemplo, en la anotación CEACAM1 P13688, el dominio de tipo IgV N-terminal está compuesto por 108 aminoácidos, desde el aminoácido 35 al 142. Este dominio se identificó como responsable de la actividad de unión homofílica (Watt et al., 2001, Blood. 98, 1469-79). Todas las variantes, incluidas estas variantes de empalme, se incluyen dentro del término "CEACAM1".

[0087] Los términos "anticuerpo anti-CEACAMl", "un anticuerpo que reconoce CEACAM1", "un anticuerpo contra CEACAM1" y "un anticuerpo a CEACAM1" son intercambiables y se usa aquí para referirse a un anticuerpo que se une a la proteína CEACAM1 con suficiente afinidad y especificidad.

[0088] El término "antígeno" tal como se utiliza aquí se refiere a una molécula o una porción de una molécula capaz de provocar la formación de anticuerpos y estando unida por un anticuerpo. Un antígeno puede tener uno o más epítopos. La reacción específica mencionada anteriormente pretende indicar que el antígeno reaccionará, de una manera altamente selectiva, con su correspondiente anticuerpo y no con la multitud de otros anticuerpos que pueden ser provocados por otros antígenos. Un antígeno según la presente invención es una proteína CEACAM1 o un fragmento de la misma.

[0089] El término "determinante antigénico" o "epítopo", como se usa aquí se refiere a la región de una molécula de antígeno que específicamente reacciona con un anticuerpo particular. Pueden usarse secuencias de péptidos derivadas de un epítopo, solas o junto con un resto portador, aplicando métodos conocidos en la técnica, para inmunizar animales y producir anticuerpos policlonales o monoclonales adicionales. Los péptidos aislados derivados de un epítopo pueden usarse en métodos de diagnóstico para detectar anticuerpos y como agentes terapéuticos cuando se requiere la inhibición de dichos anticuerpos.

[0090] Los anticuerpos, o inmunoglobulinas, comprenden dos cadenas pesadas unidas entre sí por enlaces disulfuro y dos cadenas ligeras cadenas, cada cadena ligera está ligada a una cadena pesada respectiva por enlaces disulfuro en una configuración en forma de "Y". La digestión proteolítica de un anticuerpo produce dominios Fv (fragmento variable) y Fc (fragmento cristalino). Los dominios de unión al antígeno, Fab, incluyen regiones en las que varía la secuencia polipeptídica. El término F(ab^{’ )2} representa dos brazos Fab' unidos por enlaces disulfuro. El eje central del anticuerpo se denomina fragmento Fc. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (V^h) seguido de varios dominios constantes (C^h). Cada cadena ligera tiene un dominio variable (V^l) en un extremo y un dominio constante (C^l) en su otro extremo, el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada y el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada (CH1). Los dominios variables de cada par de cadenas ligeras y pesadas forman el sitio de unión al antígeno. Los dominios en las cadenas ligera y pesada tienen la misma estructura general y cada dominio comprende cuatro regiones marco, cuyas secuencias están relativamente conservadas, unidas por tres dominios hipervariables conocidos como regiones determinantes de complementariedad (CDR 1-3). Estos dominios contribuyen a la especificidad y afinidad del sitio de unión al antígeno. El isotipo de la cadena pesada (gamma, alfa, delta, épsilon o mu) determina la clase de inmunoglobulina (IgG, IgA, IgD, IgE o IgM, respectivamente). La cadena ligera es de dos isotipos (kappa, k o lambda, l ) que se encuentran en todas las clases de anticuerpos.

[0091] El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio e incluye anticuerpos monoclonales (incluyendo longitud completa o anticuerpos monoclonales intactos), anticuerpos policlonales, anticuerpos multivalentes, anticuerpos multi-específicos (por ejemplo, anticuerpos bi-específicos), y fragmentos de anticuerpos lo suficiente para exhibir la actividad biológica deseada.

[0092] El anticuerpo de acuerdo con la presente invención es una molécula que comprende al menos la porción de unión a antígeno de un anticuerpo. El anticuerpo o anticuerpos de acuerdo con la invención incluyen anticuerpos intactos, tales como anticuerpos policlonales o anticuerpos monoclonales (mAbs), así como fragmentos proteolíticos de los mismos, tales como los fragmentos Fab o F(ab’)². También se consideran anticuerpos de cadena única.

[0093] Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden sólo una porción de un anticuerpo intacto, generalmente incluyendo un sitio de unión a antígeno del anticuerpo intacto y reteniendo de este modo la capacidad de antígeno se unen. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos abarcados por la presente definición incluyen: (i) el fragmento Fab, que tiene dominios VL, CL, VH y CH1; (ii) el fragmento Fab’, que es un fragmento Fab que tiene uno o más residuos de cisteína en el extremo C-terminal del dominio CH1; (iii) el fragmento Fd que tiene dominios VH y CH1; (iv) el fragmento Fd’ que tiene dominios VH y CHI y uno o más residuos de cisteína en el extremo C-terminal del dominio CH1; (v) el fragmento Fv que tiene los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; (vi) el fragmento dAb (Ward et al., Nature 1989, 341,544-546) que consiste en un dominio VH; (vii) regiones CDR aisladas; (viii) fragmentos F(ab’)², un fragmento bivalente que incluye dos fragmentos Fab' unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (ix) moléculas de anticuerpos monocatenarias (por ejemplo, Fv monocatenario; scFv) (Bird y col., Science 1988, 242, 423-426; y Huston y col., PNAS (EE.UU.) 1988, 85,5879-5883); (x) "diacuerpos" con dos sitios de unión al antígeno, que comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (ver, por ejemplo, EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 6444-6448); (xi) "anticuerpos lineales" que comprenden un par de segmentos Fd en tándem (VH-CH1-VH-CH1) que, junto con polipéptidos de cadena ligera complementarios, forman un par de regiones de unión a antígeno (Zapata et al. Protein Eng., 1995, 8, 1057-1062; y Patente de Estados Unidos N° 5.641.870).

[0094] Los anticuerpos de cadena única pueden ser polipéptidos compuestos de cadena única que tienen capacidades de unión a antígeno y que comprenden secuencias de ácido amino homóloga o análoga a las regiones variables de una ligera de inmunoglobulina y la cadena pesada es decir, vinculadas V^h-V^l o Fv de cadena sencilla (scFv).

[0095] El término "anticuerpo neutralizante", como se usa aquí se refiere a una molécula que tiene un sitio de unión al antígeno a un determinado receptor o ligando diana capaz de reducir o inhibir (bloquear) la actividad o la señalización a través de un receptor, tal como se determina por ensayos in-vivo o in vitro, según la especificación.

[0096] El término "anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza aquí se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de sustancialmente anticuerpos homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos y se dirigen contra un solo antígeno. Además, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un único determinante del antígeno. El modificador "monoclonal" no debe interpretarse como que requiera la producción del anticuerpo por ningún método particular. Los Abs monoclonales se pueden obtener mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se usarán de acuerdo con la presente invención pueden prepararse mediante el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature 1975, 256, 495, o pueden prepararse mediante métodos de ADN recombinante (ver, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse de bibliotecas de anticuerpos de fagos usando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature 1991,352, 624-628 o Marks et al., J. Mol. Biol., 1991,222: 581 -597, por ejemplo.

[0097] Los mAbs de la presente invención pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, o IgA. Un hibridoma que produce un mAb puede cultivarse in vitro o in vivo. Pueden obtenerse títulos elevados de mAb mediante producción in vivo en donde se inyectan intraperitonealmente células de los hibridomas individuales en ratones Balb/c con cebado prístino para producir líquido ascítico que contiene altas concentraciones de los mAb deseados. Los Abs monoclonales de isotipo IgM o IgG se pueden purificar a partir de tales fluidos ascíticos, o de sobrenadantes de cultivo, usando métodos de cromatografía en columna bien conocidos por los expertos en la técnica.

[0098] El término "anticuerpo humano", como se usa aquí, se refiere a un anticuerpo que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un humano y/o usando cualquiera de las técnicas para hacer anticuerpos humanos como se describe aquí. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígenos no humanos. Los anticuerpos humanos se pueden producir usando diversas técnicas conocidas en la técnica.

[0099] Los términos "molécula que tiene la parte de unión a antígeno de un anticuerpo" y "unión a antígeno de fragmentos", como se usa aquí pretende incluir no sólo las moléculas de inmunoglobulina intactas de cualquier isotipo y generadas por cualquier línea celular animal o microorganismo, pero también su fracción reactiva de unión a antígeno, que incluye, pero no se limita al fragmento Fab, el fragmento Fab’, el fragmento F(ab’)² , la porción variable de las cadenas pesadas y/o ligeras de los mismos, minianticuerpos Fab (ver WO 93/15210, solicitud de patente de EE.UU. 08/256,790, WO 96/13583, solicitud de patente de EE.UU. 08/817,788, WO 96/37621, solicitud de patente de EE.UU. 08/999,554), minianticuerpos biespecíficos diméricos (ver Muller et al., 1998) y anticuerpos monocatenarios que incorporan dicha fracción reactiva, así como cualquier otro tipo de molécula en donde se haya insertado físicamente dicha fracción reactiva de anticuerpos. Dichas moléculas pueden proporcionarse mediante cualquier técnica conocida, que incluye, pero no se limita a, escisión enzimática, síntesis de péptidos o técnicas recombinantes.

[0100] Las sustituciones de aminoácidos, es decir, "sustituciones conservadoras", pueden estar hechas, por ejemplo, sobre la base de similitud de polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad, y/o la naturaleza anfipática de los residuos implicados. El término "análogo de anticuerpo" como se usa en este documento se refiere a un anticuerpo derivado de otro anticuerpo mediante una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos.

[0101] El término "variante de anticuerpo" como se usa en este documento se refiere a cualquier molécula que comprende el anticuerpo de la presente invención. Por ejemplo, las proteínas de fusión en las que el anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo está unido a otra entidad química se consideran una variante de anticuerpo.

[0102] El término "anticuerpo monoclonal no completamente humanizado" como se usa en este documento se refiere a un anticuerpo monoclonal, que tiene una cadena pesada y/o dominios variables de cadena ligera en los que las secuencias de aminoácidos flanquean y/o están inmediatamente adyacentes a las CDR no son completamente humanas, es decir, no son idénticas a ninguna secuencia homóloga conocida o correspondiente tomada de anticuerpos humanos naturales.

[0103] En las formulaciones de medicamento y farmacéuticas, el agente activo se utiliza preferiblemente junto con uno o más vehículo(s) farmacéuticamente aceptable(s) y opcionalmente cualquier otro ingrediente terapéutico. El (los) vehículo(s) deben ser farmacéuticamente aceptables en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de la formulación y no indebidamente perjudiciales para el receptor de los mismos. El agente activo se proporciona en una cantidad eficaz para lograr el efecto farmacológico deseado, como se describió anteriormente, y en una cantidad apropiada para lograr la dosis diaria deseada.

[0104] Típicamente, las moléculas de la presente invención que comprenden la porción de unión a antígeno de un anticuerpo o que comprende otro polipéptido que incluye un péptido-mimético que será suspendido en una solución salina estéril para usos terapéuticos. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular alternativamente para controlar la liberación del ingrediente activo (molécula que comprende la porción de unión al antígeno de un anticuerpo) o para prolongar su presencia en el sistema de un paciente. Se conocen numerosos sistemas de liberación de fármacos adecuados e incluyen, por ejemplo, sistemas de liberación de fármacos implantables, hidrogeles, hidroximetilcelulosa, microcápsulas, liposomas, microemulsiones, microesferas y similares. Pueden prepararse preparaciones de liberación controlada mediante el uso de polímeros para complejar o adsorber la molécula de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, los polímeros biocompatibles incluyen matrices de acetato de poli(etileno-co-vinilo) y matrices de un copolímero de polianhídrido de un dímero de ácido esteárico y ácido sebárico. La velocidad de liberación de la molécula de acuerdo con la presente invención, es decir, de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, de dicha matriz depende del peso molecular de la molécula, la cantidad de la molécula dentro de la matriz y el tamaño de las partículas dispersas.

[0105] La composición farmacéutica de esta invención puede administrarse por cualquier medio adecuado, tal como por vía oral, tópica, intranasal, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraarticular, intralesional o parenteral. Normalmente, se utiliza la administración intravenosa (iv).

[0106] Será evidente para los expertos ordinarios en la técnica que la cantidad terapéuticamente eficaz de la molécula de acuerdo con la presente invención dependerá, entre otras cosas en el programa de administración, la dosis unitaria de la molécula administrada, si se administra la molécula en combinación con otros agentes terapéuticos, el estado inmunológico y la salud del paciente, la actividad terapéutica de la molécula administrada y el criterio del médico tratante. Como se usa en este documento, una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de una molécula requerida para aliviar uno o más síntomas asociados con un trastorno que se está tratando durante un período de tiempo.

[0107] El término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un fármaco eficaz para tratar una enfermedad o trastorno en un mamífero. En el caso del cáncer, la cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco puede reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño del tumor; inhibir (es decir, ralentizar hasta cierto punto y preferiblemente detener) la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos; inhibir (es decir, ralentizar hasta cierto punto y preferiblemente detener) la metástasis tumoral; inhibir, hasta cierto punto, el crecimiento tumoral; y/o aliviar hasta cierto punto uno o más de los síntomas asociados con el trastorno. En la medida en que el fármaco pueda prevenir el crecimiento y/o destruir las células cancerosas existentes, puede ser citostático y/o citotóxico. Para la terapia del cáncer, la eficacia in vivo se puede medir, por ejemplo, evaluando la duración de la supervivencia, el tiempo hasta la progresión de la enfermedad (TTP), las tasas de respuesta (RR), la duración de la respuesta y/o la calidad de vida.

[0108] El término "azúcar" se refiere a monosacáridos, disacáridos y polisacáridos. Ejemplos de azúcares incluyen, pero no se limitan a, sacarosa, trehalosa, dextrosa y otros.

[0109] Las moléculas de la presente invención como ingredientes activos se disuelven, dispersan o mezclan en un excipiente que es farmacéuticamente aceptable y compatible con el ingrediente activo como es bien sabido. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato (PBS), dextrosa, glicerol, etanol o similares y combinaciones de los mismos. Los expertos en la técnica conocen bien otros vehículos adecuados. Además, si se desea, la composición puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponadores del pH.

[0110] La composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se puede administrar junto con una composición antineoplásica. Según una realización específica, la composición antineoplásica comprende al menos un agente quimioterapéutico. El agente quimioterapéutico, que podría administrarse junto con el anticuerpo de acuerdo con la presente invención, o por separado, puede comprender cualquier agente conocido en la técnica que muestre actividad anticancerosa, incluyendo pero no limitado a: mitoxantrona, inhibidores de topoisomerasa, veneno del huso vincas: vinblastina, vincristina, vinorelbina (taxol), paclitaxel, docetaxel; agentes alquilantes: mecloretamina, clorambucilo, ciclofosfamida, melfalán, ifosfamida; metotrexato; 6-mercaptopurina; 5-fluorouracilo, citarabina, gemcitabina; podofilotoxinas: etopósido, irinotecán, topotecán, dacarbazina; antibióticos: doxorrubicina (adriamicina), bleomicina, mitomicina; nitrosoureas: carmustina (BCNU), lomustina, epirrubicina, idarrubicina, daunorrubicina; iones inorgánicos: cisplatino, carboplatino; interferón, asparaginasa; hormonas: tamoxifeno, leuprolida, flutamida y acetato de megestrol.

[0111] De acuerdo con una realización específica, el agente quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste en agentes alquilantes, antimetabolitos, análogos de ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina e inhibidores relacionados, vinca alcaloides, epipodofilotoxinas, antibióticos, L-asparaginasa, inhibidor de la topoisomerasa, interferones, complejos de coordinación de platino, urea sustituida con antracenodiona, derivados de metilhidrazina, supresor de la corteza suprarrenal, adrenocorticosteroides, progestágenos, estrógenos, antiestrógenos, andrógenos, antiandrógenos y análogos de la hormona liberadora de gonadotropinas. Según otra realización, el agente quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste en 5-fluorouracilo (5-FU), leucovorina (LV), irenotecán, oxaliplatino, capecitabina, paclitaxel y doxetaxel. Se pueden usar dos o más agentes quimioterapéuticos en un cóctel para administrar en combinación con la administración del anticuerpo anti-CEACAM1.

[0112] El término "tratamiento" como se usa en este documento se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya padecen el trastorno, así como aquellos en los que se debe prevenir el trastorno.

[0113] Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren o describen la condición fisiológica en mamíferos que normalmente se caracteriza por un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Los ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen melanoma, pulmón, tiroides, mama, colon, próstata, hígado, vejiga, renal, cervical, pancreático, leucemia, linfoma, mieloide, ovario, útero, sarcoma, biliar o endometrial.

[0114] El término "composición anti-neoplásica" se refiere a una composición útil en el tratamiento de cáncer que comprende al menos un agente terapéutico activo capaz de inhibir o prevenir el crecimiento o la función de tumor, y/o causa la destrucción de células tumorales. Los agentes terapéuticos adecuados en una composición antineoplásica para tratar el cáncer incluyen, pero no se limitan a, agentes quimioterapéuticos, isótopos radiactivos, toxinas, citocinas tales como interferones y agentes antagonistas que se dirigen a citocinas, receptores de citocinas o antígenos asociados con células tumorales. Preferiblemente, el agente terapéutico es un agente quimioterapéutico.

[0115] El término "diagnosticar" como se usa en este documento se refiere a determinar la presencia o ausencia de una patología, clasificar una patología o un síntoma, determinar la gravedad de la patología, monitorear la progresión de la patología, pronosticar el resultado de una patología y/o perspectivas de recuperación.

[0116] El término "mutación de residuo de aminoácidos" como se usa aquí se refiere a una sustitución, una inserción, o una deleción de un único residuo de aminoácido. El término "retro-mutación de residuos de aminoácidos", como se usa en este documento, se refiere a una sustitución de un único residuo de aminoácido que se encuentra en una estructura de anticuerpo humano por un residuo de aminoácido correspondiente que se encuentra en una estructura de anticuerpo murino.

[0117] Los siguientes ejemplos se presentan con el fin de más plenamente ilustrar algunas realizaciones de la invención. Sin embargo, de ninguna manera deben interpretarse como limitantes del amplio alcance de la invención.

EJEMPLOS

[0118]

Tabla 1. Secuencias de CDR. Un mAb humanizado de acuerdo con la presente invención comprende las siguientes seis CDR:

Tabla 5. Secuencias no CDR de regiones variables humanizadas con mutación inversa.

[0119] La secuencia de cadena pesada completamente humanizada de referencia (SEQ ID NO: 57), en donde se introducen mutaciones inversas, está compuesta por:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS (SEQ ID NO: 7) - GYAFTNNLIE (SEQ ID NO: 1)-

WVRQAPGQGLEWMG (SEQ ID NO: 8) - VINPGSGDTNYNEKFKG (SEQ ID NO: 2)-RVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 9)-WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 10).

[0120] La secuencia de cadena ligera totalmente humanizada de referencia (SEQ ID NO: 58), a la que las copias de las mutaciones son introducidas se compone de:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 11) - RTSQDIGNYLN (SEQ ID NO: 4)-WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 12) - YTSRLHS (SEQ ID NO: 5)-

GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC (SEQ ID NO: 13) - QQGKSLPRT (SEQ ID NO: 6)-

FGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 14)

Ejemplo 1. Diseño de secuencias de región variable de anticuerpo injertado por CDR

[0121] Los modelos estructurales de las regiones quiméricos V del anticuerpo de anti-CEACAM 1 se produjeron usando Swiss PDB y analizaron con el fin de identificar los aminoácidos en los marcos de la región V que pueden ser importantes para las propiedades de unión de anticuerpo (Figura 1). Se observó que estos aminoácidos se incorporaron en uno o más anticuerpos injertados con CDR variantes. Las secuencias tanto V^h como Vk de CM-10 contienen residuos estructurales típicos y los motivos CDR 1, 2 y 3 son comparables a muchos anticuerpos murinos. Las CDR se tomaron directamente de la secuencia murina. A continuación, se analizaron los modelos suizos de PDB, junto con las homologías de ratón/humano en posiciones críticas, para resaltar las regiones marco y los residuos individuales que podrían tener un impacto potencial en la presentación de las CDR.

Diseño de variantes

[0122] La región V de cadena pesada y ligera de secuencia de aminoácidos se compararon contra una base de datos de secuencias de región V de la línea germinal humana con el fin de identificar las secuencias humanas de cadena pesada y ligera con el mayor grado de homología para su uso como estructuras de la región V. A continuación, se diseñó una serie de regiones V de cadena pesada y ligera injertando las CDR en los marcos y, si es necesario, mediante retromutación en la secuencia murina de residuos identificados anteriormente como potencialmente críticos para la restauración de la eficacia de unión del anticuerpo quimérico. Se consideró que era necesario retener una pequeña cantidad de residuos de ratón en cada variante. A continuación, se seleccionaron las secuencias variantes con la menor incidencia de epítopos de células T potenciales según lo determinado por la aplicación de las tecnologías patentadas en silico de Antitope, iTope™ y TCED™ (base de datos de epítopos de células T) (Perry et al 2008, Bryson et al 2010). El número de mutaciones inversas se determinó mediante la secuencia murina de partida. A partir del análisis estructural, se identificaron un máximo de 13 posiciones en el V^h y se identificaron 5 posiciones en el V^k como residuos que podrían ser estructuralmente importantes. Estos fueron priorizados y se diseñaron variantes que incorporaron un número variable de estos. Aunque no existe un límite teórico para el número de mutaciones inversas, cuantas más mutaciones inversas se incorporen, menos humana puede ser la secuencia. Se diseñaron cinco cadenas V^h y tres cadenas V^k con secuencias establecidas en SEQ ID NO: 28 a 35.

iTope™ y TCED™

[0123] El software iTope™ predice interacciones favorables entre las cadenas laterales de aminoácidos de un péptido y bolsillos de enlace específicos (en particular posiciones de bolsillo; p1, p4, p6, p7 y p9) dentro de los surcos de unión de 34 alelos humanos de MHC de clase II. La ubicación de los residuos de unión clave se logra mediante la generación in síIíco de péptidos de 9 meros que se superponen con un aminoácido que abarca la secuencia de la proteína de prueba. Las comparaciones internas con experimentos físicos de unión de MHC de clase II han demostrado que iTope™ puede usarse para discriminar con éxito con alta precisión entre péptidos que se unen o no se unen a moléculas de MHC de clase II. Sin embargo, los resultados deben evaluarse a la luz del hecho de que todos los métodos de predicción de la unión del MHC de clase II sobrepredicen de manera inherente el número de epítopos de células T, ya que no permiten otros procesos importantes durante la presentación de antígenos, como el procesamiento de proteínas/péptidos, reconocimiento por el receptor de células T o tolerancia de las células T al péptido.

[0124] El TCED™ contiene las secuencias de todos los péptidos previamente tamizados en epítopos de células T EpiScreen™ ensayos de mapeo. El TCED™ se usa para buscar cualquier secuencia de prueba contra una gran base de datos de péptidos (>10.000 péptidos) mediante búsqueda BLAST para seleccionar específicamente segmentos que previamente se había demostrado que no estimulan las respuestas de las células T. Además, se descartó cualquier región con homología significativa con los epítopos de células T en la base de datos.

Construcción de variantes injertadas con CDR

[0125] Todos los genes de región V^h y V^k injertados con CDR variante para CM-10 se sintetizaron utilizando una serie de oligonucleótidos superpuestos que fueron hibridados, ligados y amplificados por PCR para dar regiones sintética V de longitud completa. A continuación, las variantes ensambladas se clonaron directamente en un sistema de vector de expresión para las cadenas V^h y cadenas V^k de IgG1 e IgG4 (S241P). Todas las construcciones se confirmaron mediante secuenciación.

Construcción, expresión y purificación de anticuerpos

[0126] Los genes de anticuerpos quiméricos y todas las combinaciones de cadenas V^h y V^k injertadas con CDR (es decir, un total de 15 emparejamientos para cada uno de IgG1 e IgG4 (S241P)) se transfectaron transitoriamente en células HEK293-EBNA (ATCc cat. n° CRL-10852) que utilizan fosfato cálcico. Las transfecciones transitorias se incubaron durante hasta cinco días antes de recolectar los sobrenadantes.

[0127] Los anticuerpos quiméricos y variantes injertadas con CDR de CM-10 se purificaron a partir de sobrenadantes de cultivo de células transitorias en una columna sefarosa de Proteína A (GE Healthcare cat. n° 110034-93), se intercambió el tampón en IX PBS pH 7,4 y se cuantificó por OD²⁸⁰ nm usando un coeficiente de extinción basado en la secuencia de aminoácidos predicha (Ec(0,1%) = ~1,37-1,40 para el anticuerpo quimérico CM-10 y variantes). Los anticuerpos quiméricos y las variantes humanizadas de plomo se analizaron reduciendo SDS-PAGE. Se observaron bandas correspondientes a los tamaños previstos de las cadenas V^h y V^k sin evidencia de contaminación (Figura 2).

Ejemplo 2. Enlace de competencia de anticuerpos purificados a CEACAM-1 humano

[0128] La unión de anticuerpo quimérico purificado CM-10 junto con los anticuerpos quiméricos y cada una de las variantes injertadas por CDR para CEACAM-1 humano recombinante se evaluaron en un ELISA competitivo. Una serie de diluciones (tres veces) de anticuerpos quiméricos o humanizados de 20 pg/ml a 0,009 pg/ml se premezcla con una concentración constante de CM-10 quimérico biotinilado (0,005 pg/ml, concentración final) antes de incubar durante 1 hora a temperatura ambiente en una placa de microtitulación de fondo plano Nunc Immuno MaxiSorp de 96 pocillos (Fisher cat. n° DIS-971-030J) prerrevestida con 0,5 pg/ml de CEACAM-1 humano recombinante (R&D Systems n° cat. 2244-CM-050) diluido en IX PBS pH 7,4. La unión del anticuerpo biotinilado se detectó con estreptavidina-HRP (Sigma cat. n° S5512) y sustrato TMB (Invitrogen cat. n° 00-2023). La reacción se detuvo con 3M Hcl, se leyó la absorbancia a 450 nm en un lector de placas Dynex Technologies MRX TC II y se trazaron las curvas de unión.

[0129] Todas las variantes humanizadas dieron perfiles de unión similares a CM-10 quimérico con las curvas de unión se muestran en la Figura 3. Estos datos se utilizaron para calcular valores CI⁵⁰ para cada anticuerpo y se normalizaron a CI⁵⁰ de CM-10 quimérico como incluido en cada ELISA y como se muestra en las Tablas 6 y 7.

Tabla 6. Valores CI⁵⁰ para variantes humanizadas anti-CEACAM-1.

Tabla 7. Calculado en relación con valores CI⁵⁰ para variantes humanizadas anti-CEACAM-1.

[0130] Los datos CI⁵⁰ normalizados mostraron una gama de 0,84 a 1,56 para todas las variantes ensayadas que indica que las eficiencias de enlace de todos los anticuerpos injertados con CDR a CEACAM-1 humano eran comparables a los del CM-10 quimérico.

Ejemplo 3. Combinación de mAb humanizado a anticuerpos CEACAM1 y anti PD-1/PD-L

[0131]

A. Se demostraron efectos sinérgicos de los anticuerpos anti-CEACAMl y anti-PD-1 en la citotoxicidad de células TIL humanas contra células de melanoma humano. Se cultivaron células de cáncer de melanoma humano (MALME 3M) en presencia de IFN-a para inducir la expresión de PD-L1. Se incubaron células TIL humanas (TIL14) con un anticuerpo monoclonal para CEACAM1 humano (CM-24) (0,01 pg/ml, 0,05 pg/ml, 0,1 pg/ml, 0,5 pg/ml), un anticuerpo monoclonal para PD-1 humana (clon E12.2H7) o con una combinación de ambos anticuerpos (0,005, 0,025, 0,05 y 0,25 pg/ml de cada anticuerpo) durante 30 minutos a 37°C. Se añadieron células cancerosas de melanoma humano tratadas con IFN-a para incubación durante la noche, antes de la evaluación de la citotoxicidad. La Figura 4 demuestra que tanto los anticuerpos anti-CEACAM1 como los anticuerpos anti-PD-1 pudieron unirse a sus respectivas dianas en linfocitos humanos como las células TIL, y que esta unión aumentó significativamente la toxicidad de las células TIL humanas contra las células cancerosas humanas en cada monoterapia sola. Por lo tanto, se concluyó que proteger a los linfocitos de las señales inmunosupresoras de las células cancerosas diana da como resultado una citotoxicidad sustancial hacia estas células cancerosas.

B. También se mostraron los efectos sinérgicos de los anticuerpos anti-CEACAM1 y anti-PD-1 sobre los niveles de Granzima B y la citotoxicidad de las células TIL humanas contra las células de melanoma humano cuando se agregan anticuerpos anti-PD-1 antes de la adición de anticuerpos anti-CEACAM1: se cultivaron células de cáncer de melanoma humano (MALME 3M) en presencia de IFN-a para inducir la expresión de PD-L1. Se incubaron células TIL humanas (TIL14) con medio solo (negro), anticuerpo IgG no específico (0,8 qg/ml, blanco), varias concentraciones (0,05 qg/ml, 0,1 qg/ml, 0,2 qg/ml, 0,4 qg/ml, 0,8 qg/ml) de CM-24, un mAb para PD-1 humano (clon E12.2H7) o una combinación de ambos anticuerpos (0,05 qg/ml cada uno, 0,1 qg/ml cada uno, 0,2 qg/ml cada uno, 0,4 qg/ml cada uno, 0,8 qg/ml cada uno). El anticuerpo monoclonal de PD-1 humano se añadió primero durante 30 minutos a 37°C, seguido de la adición del mAb a CEACAM1 humano. Se añadieron células cancerosas de melanoma humano tratadas con IFN-a para incubación durante la noche, antes de la evaluación de la citotoxicidad. Se calculó que el índice de combinación (IC) era 0,15. En el mismo ensayo, el nivel de la proteína citotóxica granzima B que se secreta tras la activación de células citotóxicas se evaluó mediante el kit comercial de ELISA de granzima B. La Figura 5 demuestra que los anticuerpos anti-CEACAM1 y los anticuerpos anti-PD-1 pueden unirse a sus respectivas dianas en linfocitos humanos como las células TIL, y que esta unión aumenta la secreción de granzima B y la toxicidad de las células TIL humanas contra las células cancerosas humanas. La Figura 5 indica de nuevo que proteger a los linfocitos de las señales inmunosupresoras de las células cancerosas diana da como resultado una citotoxicidad sustancial hacia las células cancerosas diana y sugiere que el tiempo podría ser un factor crítico en la terapia combinada.

C. Efectos sinérgicos de los anticuerpos anti-CEACAM1 y anti-PD-Ll sobre los niveles de Granzima B y la citotoxicidad de las células TIL humanas contra las células de melanoma humano cuando se agregan anticuerpos anti-PD-Ll antes de la adición de anticuerpos antiCEACAM1 (datos no mostrados). Se cultivaron células de melanoma humano (MALME 3M) en presencia de IFNa para inducir la expresión de PD-L1. Se incubaron células TIL humanas (TIL14) con medio solo (negro), anticuerpo IgG no específico (0,8 qg/ml, blanco), varias concentraciones (0,05 qg/ml, 0,1 qg/ml, 0,2 qg/ml, 0,4 qg/ml, 0,8 qg/ml) de un anticuerpo monoclonal para CEACAM1 humano (CM-24), un anticuerpo monoclonal para PD-L1 humano (clon 29E.2A3) o una combinación de ambos anticuerpos (0,05 qg/ml cada uno, 0,1 qg/ml cada uno, 0,2 qg/ml cada uno, 0,4 qg/ml cada uno, 0,8 qg/ml cada uno). El anticuerpo anti-PD-Ll se añadió primero durante 30 minutos a 37°C, seguido de la adición del anticuerpo monoclonal a CEACAM1 humano. Se añadieron células de cáncer de melanoma humano tratadas con IFN-a para incubación durante la noche antes de la evaluación de citotoxicidad. El índice de combinación (IC) se calculó en 0,67. Los resultados representan un promedio de % de citotoxicidad ±DE según lo determinado por el ensayo clásico de liberación de LDH de pocillos triplicados por tratamiento. * P < 0,05 prueba T pareada en comparación con a-PD-L1 solamente. En el mismo ensayo, los niveles de la proteína citotóxica granzima B que se secreta tras la activación de células citotóxicas se evaluó mediante el kit de ELISA de granzima B comercial. Los resultados representan el nivel medio de granzima B de pocillos triplicados por tratamiento. Los resultados demuestran que los anticuerpos anti-CEACAM1 y los anticuerpos anti-PD-Ll pueden unirse a sus respectivas dianas en los linfocitos humanos (como las células TIL) y en las células cancerosas humanas (como las células del melanoma), y que esta unión aumenta la secreción y toxicidad de granzima B de las células TIL humanas contra las células cancerosas humanas. Se demostró además que el bloqueo de las interacciones PD-1/PD-L1 y CEACAM1/CEACAM1 puede resultar en un efecto sinérgico y que la protección de los linfocitos de la señal inmunosupresora de PD-1linfocito/ligando PDcélula cancerosa da como resultado una citotoxicidad sustancial hacia estos células cancerosas, independientemente del antígeno dirigido, ya sea PD-1, PD-L1 o PD-L2.

D. Efectos sinérgicos de anticuerpos anti-CEACAM1 y anti-PD-1 sobre la citotoxicidad de células LAK humanas contra células de melanoma humano cuando se añaden anticuerpos anti-PD-1 antes de la adición de anticuerpos anti-CEACAM1. Se cultivaron células de melanoma humano (SKMEL28, CEACAM1 positivas, PD-L1 positivas) en presencia de IFN-a para inducir la expresión de PD-L1. Células humanas LAK (asesinas activadas por linfocinas) generadas por activación de PBMC de un donante humano sano con IL-2 (500 unidades/ml) durante 7 días se incubaron solo con medio (blanco), anticuerpo IgG no específico (0,8 qg/ml, negro), varias concentraciones (0,1 qg/ml, 0,2 qg/ml, 0,4 qg/ml, 0,8 qg/ml) de un anticuerpo monoclonal para CEACAM1 humano (CM-24), un anticuerpo monoclonal para PD-1 humano (clon E12.2H7) o una combinación de ambos anticuerpos (0,1 qg/ml cada uno, 0,2 qg/ml cada uno, 0,4 qg/ml cada uno, 0,8 qg/ml cada uno). El anticuerpo monoclonal de PD-1 humano se añadió primero durante 30 minutos a 37°C, seguido de la adición del anticuerpo monoclonal de CEACAM1 humano. Se añadieron células de melanoma humano tratadas con IFN-a durante 24 horas de incubación, antes de la evaluación de la citotoxicidad. La Figura 6 demuestra que los anticuerpos anti-CEACAM1 y los anticuerpos anti-PD-1 pueden unirse a sus respectivas dianas en linfocitos humanos activados como las células LAK, y que esta unión aumenta la toxicidad de las células LAK humanas contra las células cancerosas humanas. Se calculó que el índice de combinación (IC) era <0,8. La Figura 6 demuestra además que la unión de estos anticuerpos a las células LAK está de alguna manera interrelacionada, lo que justifica un estudio adicional de su mecanismo de unión, y que este mecanismo está presente en una variedad de linfocitos activados.

E. El tratamiento con anticuerpos anti-CEACAM1 aumenta la expresión de PD-L1 en células cancerosas diana. Se incubaron células NK humanas (NK92MI) con o sin un anticuerpo monoclonal para CEACAM1 humano (10 qg/ml de CM-24), seguido de la adición de células cancerosas de melanoma humano (SKMEL28). Las células se incubaron durante 24, 48 y 72 horas y se midieron los niveles de PD-L1 en cada punto de tiempo mediante análisis FACS. Los niveles de proporción media de anti-PD-Ll en comparación con un control de isotipo apropiado para los tratamientos indicados en diferentes puntos de tiempo se muestran en la Figura 7, lo que demuestra que la expresión de CEACAM1 y PD-L1 en células cancerosas está de hecho interrelacionada. La adición de anticuerpos anti-CEACAM1 da como resultado un aumento de la expresión de PD-L1 en las células cancerosas supervivientes, proporcionando así un apoyo adicional para el tratamiento combinado con ambos agentes. Puede ser beneficioso tratar el cáncer administrando primero anticuerpos anti CEACAM1 y luego administrando anticuerpos anti-PD-L1 y/o anti-PD-L2, ya que el número de proteínas PD-L1 en las células cancerosas sigue siendo relativamente alto, lo que hace las células más sensibles al tratamiento con anticuerpos anti PD-1/PD-L1, lo que implica que la terapia combinatoria puede mejorar el resultado clínico. La administración de diferentes anticuerpos en momentos separados, en lugar de simultáneamente, maximiza el efecto citotóxico de los linfocitos contra las células cancerosas. Sin estar ligado a ninguna teoría o mecanismo, este hallazgo puede estar ligado a otro hallazgo sorprendente de la presente invención, según el cual el tratamiento con anticuerpos anti-CEACAM1 aumenta la expresión de PD-L1 en células cancerosas diana. Hipotéticamente, esto respaldaría la necesidad de una pluralidad de anticuerpos para obtener una eficacia mejorada para los linfocitos citotóxicos. Se puede prever que la administración de anticuerpos anti-PD-1 bloquea primero las moléculas de PD-1 en los linfocitos, la administración posterior de los anticuerpos anti-CEACAM1 bloquea las moléculas de CEACAM1 en los linfocitos y/o células cancerosas diana y aumenta la expresión de ligandos de PD-1 en células cancerosas diana. Sin embargo, dado que las moléculas de PD-1 en los linfocitos ya están bloqueadas, los niveles elevados de expresión de los ligandos de PD-1 en las células cancerosas diana no impiden que los linfocitos ejerzan eficazmente su potencial citotóxico completo.

F. Efectos sinérgicos de anticuerpos anti-CEACAM1 y anti-PD-1 sobre la progresión tumoral en ratones inmunocompetentes. Se injertaron células de linfoma murino (5*106, A20) en el abdomen de ratones Balb/C mediante inyección subcutánea el día 1. El día 10, los tumores alcanzaron un volumen medio de 45 mm3 y los ratones se aleatorizaron en 4 grupos separados (11-12 ratones por grupo) y administrados por vía intravenosa con PBS, CC-1 (anticuerpo anti CEACAM1 murino, 6 mg/kg, PRM-1 (anticuerpo anti PD-1 murino, 6 mg/kg) o una combinación de CC-1 y PRM-1 (6 mg/kg cada uno). Los tratamientos se repitieron los días 15 y 20. El efecto de un anticuerpo monoclonal contra CEACAM1 humano solo, un anticuerpo monoclonal contra PD-1 humano solo y una combinación de ambos anticuerpos en la inhibición del crecimiento tumoral se siguió. Se seleccionaron ratones Balb/C inmunocompetentes para este experimento para permitir la evaluación de la actividad biológica de los anticuerpos anti-CEACAM1 murino y anti-PD-1 murino en ratones con el sistema inmune intacto y para evaluar la totalidad del sistema inmune. reacción del sistema contra las células cancerosas murinas. En conjunto, este modelo simula terapias en humanos, en las que los pacientes con cáncer recibirían combinaciones de anticuerpos anti-CEACAM1 humano y anti-PD-1/PDL1/PD-L2 humano. Sin estar ligado a ninguna teoría o mecanismo, se hipotetiza que una combinación de anticuerpos anti-CEACAM1 y anti-PD-1/PD-L1/PD-L2 prohibiría a las células cancerosas eludir la activación y citotoxicidad del sistema inmunológico del paciente, produciendo así una respuesta anti-cáncer significativa. La Figura 8 demuestra que los anticuerpos anti-CEACAM1 y los anticuerpos anti-PD-1/PD-L1/PD-L2 pueden unirse a sus dianas respectivas en células tumorales y/o células inmunes in vivo, y que esta unión combinada atenúa significativamente la progresión del tumor en comparación con cada monoterapia. Este resultado es muy importante, ya que atestigua la eficacia y el potencial del uso de una combinación de anti-CEACAM1 y anti-PD-1/PD-L1/PD-L2 incluso en tumores establecidos de volúmenes considerables, que imitan el entorno clínico. donde se tratan pacientes con tumores establecidos.

Ejemplo 4. Tratamiento de combinación con mAb humanizado para células CEACAM1 y LAK.

[0132]

A. Los anticuerpos anti-CEACAMl aumentan la citotoxicidad de células LAK humanas contra células de melanoma humano: células PBMC fueron aisladas de un donante sano, seguido de la activación con IL-2 (500 o 1000 unidades/ml) durante 3 días para generar una población de células LAK humanas. Luego, las células LAK humanas se incubaron con 0,1 pg/ml, 0,5 pg/ml, 2,5 pg/ml, 5 pg/ml o 10 pg/ml de un anticuerpo anti-CEACAM1 (CM-24) para 30 minutos a 37°C. Se añadieron células de melanoma humano (SKMEL28) durante una incubación de 24 horas, tras lo cual se determinó la citotoxicidad. La Figura 9 demuestra que mientras que las células LAK humanas son citotóxicas para las células de cáncer de melanoma humano por sí mismas (compare, por ejemplo, dos barras de la izquierda), la adición de anticuerpos anti-CEACAM1 aumenta significativamente la citotoxicidad para estas células de cáncer de melanoma humano de una manera dependiente de la dosis.

B. Los anticuerpos anti-CEACAM1 aumentan la citotoxicidad de las células LAK humanas contra una variedad de células de cáncer de páncreas y pulmón humanas. Se aislaron células PBMC de un donante sano seguido de activación con IL-2 (500 unidades/ml) durante 7 días para generar una población de células LAK humanas. Luego, las células LAK humanas se incubaron con 0,1 pg/ml a 10 pg/ml de un anticuerpo anti-CEACAM1 (CM-24) como se indica, durante 30 minutos a 37°C. Se agregaron tres células de cáncer de páncreas humano diferentes, T3M4, SU8686 y PANC2, y dos células de cáncer de pulmón humano diferentes, H358 y H460, durante una incubación de 24 horas. La Figura 10 demuestra que aunque las células LAK humanas son citotóxicas para las células cancerosas pancreáticas T3M4 humanas por sí mismas, la adición de anticuerpos anti-CEACAM1 aumenta significativamente la citotoxicidad para estas células cancerosas humanas de una manera dependiente de la dosis. Se obtuvieron resultados similares para las otras células de cáncer de páncreas y pulmón.

C. Los anticuerpos anti-CEACAM1 mejoran la secreción de granzima B de células LAK humanas en presencia de células de cáncer de páncreas y pulmón humanas. Se incubaron células LAK humanas con un anticuerpo anti-CEACAM-1 (CM-24) en diferentes concentraciones durante 30 minutos a 37°C. A continuación, se añadieron células de cáncer de páncreas humano T3M4 (A) o células de cáncer de pulmón humano H358 (B) durante una incubación de 24 horas. La secreción de granzima B se midió mediante ELISA. Los resultados demuestran que mientras que las células LAK humanas producen altos niveles de Granzima B por sí mismas, la adición de anticuerpos anti-CEACAM1 aumenta significativamente los niveles de Granzima B de una manera dependiente de la dosis.

D. Los anticuerpos anti-CEACAM1 potencian la secreción de IFN-y de las células LAK humanas en presencia de células cancerosas humanas. Se incubaron células LAK humanas con un anticuerpo anti-CEACAM-1 (CM-24) en diferentes concentraciones durante 30 minutos a 37°C. A continuación, se añadieron células de cáncer de pulmón humano H358 o H460 durante una incubación de 24 horas. La secreción de IFN-y se midió mediante ELISA. La Figura 11 demuestra que mientras que las células LAK humanas producen altos niveles de IFN-y por sí mismas, la adición de anticuerpos anti-CEACAM1 aumenta significativamente los niveles de IFN-y de una manera dependiente de la dosis.

Ejemplo 5. La expresión de CEACAM1 se correlaciona con la presencia de mutaciones B-Raf en células cancerosas.

[0133]

A. La evaluación de muestras de biopsias de 24 pacientes de cáncer de melanoma para los niveles de expresión de CEACAM1 y para el genotipo BRAF reveló que hay una correlación estadísticamente significativa entre la mutación y expresión B-Raf V600E de CEACAM1. Más específicamente, mientras que solo el 50% (3/6) de las células de melanoma que tienen un B-Raf de tipo salvaje, es decir, una valina en la posición 600, expresaron niveles detectables de CEACAM1 (Ct de 36 y menos), el 100% (18/18) de las células de melanoma que tienen una B-Raf mutada, es decir, un ácido glutámico en la posición 600, expresaron niveles detectables de CEACAM1 (Ct de 36 y menos).

B. La tinción extracelular de CEACAM1 de células cancerosas tratadas con inhibidores de B-Raf o MEK.

1,0*106 células de una muestra de células WT B-Raf (076mel) y dos muestras de células V600E B-Raf (526mel, 624mel) se incubaron con diferentes concentraciones de vemurafenib o selumetinib (0,1 pM o 1 pM) durante 2 a 48 horas. En cada momento, la expresión de CEACAM1 en las células se determinó mediante FACS. Se utilizaron equivalentes de volumen de DMSO (vehículo) como control. Los resultados demostraron que mientras que 0,1 pM y 1 pM de vemurafenib no tuvo ningún efecto sobre los niveles de expresión de CEACAM1 en células que tienen WT B-Raf (076mel), 0,1 pM y 1 pM, vemurafenib tuvo un efecto dependiente de la dosis sobre los niveles de expresión de CEACAM1 en células que tienen B-Raf mutado (526mel, 624mel). Los resultados demuestran además que el selumetinib tuvo un efecto similar al vemurafenib en las células que tenían B-Raf mutado (526mel, 624mel), y que mientras selumetinib 1 pM significativamente disminuyó los niveles de expresión de CEACAM1 en las células que tienen WT B-Raf pero N-Ras mutado (skmel-2), 1 pM de vemurafenib no tuvo ningún efecto sobre los niveles de expresión de CEACAM1. Estos resultados apoyan aún más la regulación de CEACAM1 a través de la ruta MAPK activada constitutivamente, que en este caso es impulsada por N-Ras mutado, y no por B-Raf mutado.

C. Las células cancerosas resistentes a inhibidores muestran un aumento en la expresión de CEACAM1 y una actividad restaurada de la vía MAPK. Dos muestras de células B-Raf V600E sensibles a vemurafenib (526mel, 624mel) y líneas celulares resistentes a vemurafenib derivadas de ellas se incubaron durante 2 días con vemurafenib 1 pM. Después, las células se analizaron para determinar la expresión de la proteína CEACAM1 mediante FACS como se describió anteriormente. Las líneas celulares resistentes a vemurafenib se generaron mediante el aumento gradual de la concentración del inhibidor en cultivo, hasta 0,32 pM. Se demostró que las líneas celulares resistentes a vemurafenib expresaban niveles más altos de CEACAM1 que las líneas celulares sensibles a vemurafenib. La actividad de MAPK se midió en muestras de células B-Raf V600E (624mel) sensibles a vemurafenib y resistentes a vemurafenib mediante inmunotransferencia para ERK1/2 fosforilada (pERK, Thr202/Tyr204), ERK1/2 total y actina después de 24 horas de exposición a 160 nM vemurafenib. En células B-Raf V600E sensibles a vemurafenib, vemurafenib suprime casi por completo la fosforilación de ERK1/2, en donde la actividad MAPK fue prácticamente ininterrumpida por vemurafenib en células B-Raf V600E resistentes a vemurafenib.

D. Las células cancerosas resistentes a inhibidores regulan positivamente la expresión de CEACAM1. Células de melanoma B-Raf V600E 526mel se cultivaron en presencia de 1 pM vemurafenib. El cultivo se realizó en RPMI 1640 suplementado con piruvato de sodio 1 mM, Pen-Strep 1 mM, L-glutamina 1 mM, aminoácidos no esenciales 1 mM y suero de ternera fetal inactivado por calor al 10%. La concentración de vemurafenib inicial fue de 0,01 del CI⁵⁰ determinado (0,64 nM). Cada semana, la concentración se dobló hasta 5 veces el CI⁵⁰ (320 nM), para generar células de melanoma resistentes a vemurafenib. A continuación, se analizó la expresión de CEACAM1 en las células usando MRG1 (anticuerpo murino contra CEACAM1 humano) en citometría de flujo como se describió anteriormente. El ARN total se extrajo con TRIZOL y el ADNc se generó con una transcriptasa inversa, de acuerdo con los protocolos de rutina. Mientras que vemurafenib regula a la baja la expresión de CEACAM1 en las células de melanoma B-Raf V600E, estas células regulan al alza los niveles de expresión de CEACAM1 al adquirir resistencia a vemurafenib. Es importante tener en cuenta que los niveles de CEACAM1 en las células de melanoma B-Raf V600E después de adquirir resistencia a vemurafenib son más altos que los niveles de CEACAM 1 en células de melanoma B-Raf V600E sin tratar (sin tratamiento previo con vemurafenib).

E. Las células cancerosas resistentes a inhibidores regulan positivamente la expresión de ambos tipos de CEACAM1. Las células de melanoma B-Raf V600E 526mel sensibles a vemurafenib y resistentes a vemurafenib mencionadas anteriormente se analizaron para determinar el tipo de CEACAM1 sobreexpresado al adquirir resistencia a vemurafenib mediante qPCR. Los datos presentados en las Figuras 12A y 12B demuestran que la expresión de ambos tipos de CEACAM1, CEACAM1 largo (12A) y CEACAM1 corto (12B) está regulada al alza aproximadamente tres veces en células resistentes a vemurafenib en comparación con células sensibles a vemurafenib.

F. Los inhibidores de B-Raf/MEK aumentan la citotoxicidad inducida por células T. Se analizó la viabilidad de dos muestras de células B-Raf V600E sensibles a vemurafenib (526mel, 624mel) en presencia de células T citotóxicas, con o sin vemurafenib 1 gM. Las células de melanoma se preincubaron con vemurafenib 1 gM y luego se co-incubaron durante la noche con células T de antígeno emparejado con HLA-A2 en una relación efector-diana de 5:1. La muerte celular se determinó mediante la liberación de LDH. Se demostró que vemurafenib sensibiliza significativamente las células de melanoma a las células T citotóxicas. Los inhibidores de B-Raf/MEK y los anticuerpos contra CEACAM1 aumentan la citotoxicidad inducida por células T para las células cancerosas in vitro.

Ejemplo 6. El efecto anti-cáncer de CM-24 a diferentes dosis in vivo

[0134] Los ratones SCID-NOD fueron injertados IV con 5x106 células de melanoma (línea celular MEL526) y se trataron durante 44 días de acuerdo con los grupos de tratamiento indicado en la Figura 13. Los anticuerpos se administraron dos veces a la semana por inyección IV y 10x106 TIL se administraron IV cada 10 días. En el día 49 se sacrificaron los ratones y se extrajeron los pulmones, se fotografiaron (Figura 13A), se pesaron (Figura 13B) y se contaron las lesiones (Figura 13C). Figura 13A - Fotografías digitales de los pulmones de los ratones inmediatamente después de la recolección. Figura 13B - Se calculó el peso del tumor restando el peso pulmonar de los ratones sin tratamiento previo del peso pulmonar promedio de los diferentes grupos de tratamiento. Los resultados representan el promedio de peso tumoral ±DE de 7-8 ratones por grupo de tratamiento. Figura 13C - El número de lesiones pulmonares en ratones individuales en los diversos grupos; las líneas negras representan las medianas del grupo; los pulmones con incontables lesiones se puntuaron como 100. Se utilizó la prueba T pareada para calcular la significación estadística entre los grupos * P< 0,05, ** P< 0,025.

[0135] El tratamiento con CM-24 en presencia de TIL dio como resultado una fuerte inhibición del crecimiento tumoral, como puede apreciarse por la morfología pulmonar (Fig. 13A), el peso de los tumores (Fig. 13B) y el número de lesiones pulmonares (Fig. 13C), mientras que los ratones tratados con un control de IgG mostraron una carga tumoral masiva y numerosas lesiones de melanoma pulmonar. Solo se observó una inhibición moderada del crecimiento tumoral (TGI 47%) en el grupo administrado con linfocitos T humanos reactivos contra el melanoma con un anticuerpo de control (TIL IgG), pero cuando se añadió CM-24 una actividad anticancerígena sustancial y dependiente de la dosis en todas las dosis examinadas se demostró (TGI de 84%, 87%, 90% y 93% en dosis de 1,3, 6 y 10 mg/kg respectivamente) con significación estadística en las dosis de 6 y 10 mg/kg (Fig. 13B). Las grabaciones fotográficas digitales de los pulmones en el día de finalización del ensayo (Fig. 13A) mostraron una morfología pulmonar casi normal en ratones tratados con CM-24 en presencia de TIL, lo que indica que CM-24 en presencia de TIL elimina casi por completo las células malignas.

[0136] En el grupo administrado con TIL y el control IgG, algún efecto anti-tumor también se observó, como era de esperar. Sin embargo, al comparar el efecto con los ratones tratados con CM-24 en términos de TGI, número de lesiones pulmonares y morfología pulmonar, se observaron diferencias considerables.

[0137] La evaluación del número de lesiones pulmonares reveló un número muy bajo de lesiones pulmonares en todos los ratones tratados con TIL y las diversas dosis de CM-24 y ninguno de estos pulmones mostró más de 10 lesiones. Por otro lado, en los grupos IgG o TIL IgG, varios animales mostraron un alto número de lesiones (>100) y las medianas de los grupos fueron considerablemente más altas que los ratones tratados con CM-24 (Fig.13C) (100 y 45 en los grupos IgG y TIL IgG en comparación con 5, 6, 3 y 2, en los grupos tratados con CM-24; P< 0,025).

[0138] Estos efectos se observaron a concentraciones tan bajas como 1 mg/ml, pero fueron estadísticamente significativas en términos de peso del pulmón en concentraciones CM-24 de 6 y 10 mg/kg.

[0139] Notas especiales: 1 ratón del grupo de IgG mostró morbilidad grave que incluía parálisis de las extremidades y fue sacrificado el día 33 (se detectó una carga tumoral masiva en el pulmón); 1 ratón del grupo TIL IgG mostró signos de morbilidad y murió el día 49, día de finalización del ensayo (se detectaron varias lesiones); 1 ratón del grupo TIL CM-24 mostró morbilidad severa y peso corporal reducido y fue sacrificado el día 39 (no se detectó evidencia de lesiones); 3 ratones del grupo PBS mostraron morbilidad grave durante el experimento y fueron sacrificados el día 42 y los otros dos ratones el día 48 (se detectó una carga tumoral masiva que incluía un gran número de lesiones en el pulmón en todos los ratones).

[0140] En el día de terminación, un ensayo basado en citometría de flujo en combinación con un QuantiBrite KIT se utilizó con el fin de determinar la ocupación del receptor CEACAM1 por CM-24 en TIL humano aislado de los pulmones de los ratones tratados. Los valores de ocupación del receptor (RO) en ratones tratados con las diversas dosis de CM-24 demostraron (Figura 14) que el RO del 50% podría atribuirse a concentraciones de 1 mg/kg (nivel sérico de CM-24 en la sangre) y >90% RO se demostró en dosis de 3, 6 y 10 mg/kg (niveles séricos de CM-240,3, 48,5 y 111 pg/ml, respectivamente). El examen de los valores de RO de CEACAM1 se realizó usando un ensayo basado en citometría de flujo usando anticuerpo CM-24 conjugado con PE y un kit QuantiBrite (BD). Los resultados representan valores promedio de ±DE de RO en TIL aislado del pulmón de 8-9 ratones por grupo de tratamiento. Los datos se analizaron utilizando el software Kaluza.

[0141] De los datos anteriores es evidente que la inhibición del crecimiento tumoral sustancial se observó en los ratones tratados con CM- 24 en presencia de TIL, lo que lleva a la eliminación casi completa de las células malignas. Aunque todas las dosis de CM-24 demostraron respuestas eficaces contra el cáncer, las dosis crecientes mostraron correlación con valores más altos de inhibición del crecimiento tumoral (TGI de 84, 87, 90 y 93 correspondientes a dosis de 1,3,6 y 10 mg/kg respectivamente), que también fueron estadísticamente significativos. Los resultados de RO ex vivo demuestran una RO >90% en dosis de 3, 6 y 10 mg/kg (niveles séricos de CM-24 0,3, 48,5 y 111 pg/ml respectivamente) mientras que se detectó una RO del 50% en las dosis de 1 mg/kg dosis. Al evaluar los datos de RO de ratones tratados con CM-24 a una dosis de 1 mg/kg, aunque las concentraciones séricas de CM-24 son muy bajas, los datos de RO demuestran que CM-24 todavía está unido al TIL en los pulmones, lo que implica que CM-24 puede mediar un efecto duradero in vivo en el microambiente tumoral.

[0142] Estos resultados apoyan el modo de acción de CM-24 como un potenciador de la actividad citotóxica de las células efectoras contra células malignas y muestran que CM-24 es un agente anti-cáncer potente.

Ejemplo 7. Resumen de datos preclínicos

[0143] CM-24 es un anticuerpo monoclonal de CEACAM1 anti humano de IgG4 humanizado que se une al dominio N terminal de CEACAM1 y bloquea la interacción CEACAM1 intercelular entre linfocitos activados y células tumorales; por lo tanto, se propone el bloqueo de las interacciones CEACAM1 por CM-24 para mejorar la actividad destructora de los linfocitos y es una vía prometedora a seguir para la inmunoterapia del cáncer.

[0144] El CM-24 muestra una alta afinidad y unión selectiva a CEACAM1 humano, que se expresa por linfocitos activados o células tumorales. Los datos en modelos inmunomoduladores in vitro demostraron que CM-24 es un potente bloqueador de las interacciones intercelulares CEACAM1-CEACAM1 y puede mejorar la destrucción citotóxica de varias células tumorales humanas CEACAM1 positivas por NK positivo por CEACAM1 y células asesinas activadas por linfocinas (LAK) y linfocitos infiltrantes de tumores (TIL). La actividad de destrucción mejorada inducida por CM-24 puede estar mediada por la secreción de granzima B e IFNy como se demuestra en varios modelos.

[0145] El CM-24 potencia la actividad citotóxica de las células efectoras en presencia de células tumorales positivas a CEACAM1 y en el contexto de una reacción específica de células T restringidas por antígeno leucocitario humano (HLA). CM-24 no potencia la actividad citotóxica de los linfocitos efectores contra las células no diana positivas a CEACAM1 (células humanas normales). Además, los datos muestran que CM-24 no tiene efectos agonistas de tipo ligando, funciones efectoras relacionadas con Fc o efectos directos. La unión de CM-24 a CEACAM1 no induce actividad agonista y no se pudo observar ningún efecto de CM-24 sobre las células efectoras en ausencia de células diana, como se demostró en ensayos funcionales in vitro. Tampoco se espera que el CM-24 induzca la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC) o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) porque es una IgG4 es incapaz de unirse al componente del complemento - C1q y al mediador de ADCC -FcY-RIIIa y no tiene un efecto directo sobre la tasa de proliferación o la viabilidad de las células primarias positivas a CEACAM1 (linfocitos, células epiteliales y endoteliales).

[0146] Varios modelos de xenoinjerto de tumores in vivo demuestran que CM-24 tiene una clara actividad anticancerosa, que se acompaña de un aumento de la actividad inmunológica de las células T dentro del tumor.

[0147] El bloqueo de CEACAM1 aliviaría la inhibición mediada por CEACAM1 de linfocitos infiltrantes de tumores positivos a CEACAM1 que se encuentran con células cancerosas positivas a CEACAM1 dentro del microambiente tumoral. Se espera que el efecto inmunológico sea una mejora de la respuesta inmune local contra las células tumorales, que se espera que dé como resultado su eliminación y posterior regresión clínica.

[0148] La evaluación preclínica de la seguridad de CM-24 incluyó la evaluación del efecto de CM-24 sobre la proliferación de células T y la secreción de citocinas proinflamatorias. Se evaluaron las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) y la sangre completa de 10 donantes sanos y el anticuerpo se presentó tanto en forma soluble como inmovilizada. No hubo proliferación aparente inducida por CM-24 ni secreción significativa de citocinas proinflamatorias en formatos de estimulación inmovilizados solubles o recubiertos en seco.

[0149] Un estudio de dosis repetidas de 6 semanas se realizó en monos rhesus para evaluar la toxicidad y la toxicocinética de CM-24. CM-24 se administró por infusión intravenosa (IV) (la vía de administración clínica prevista) una vez cada dos semanas hasta un total de 4 dosis (imitando el ciclo de tratamiento previsto en pacientes oncológicos) a dosis que representan 2,5 veces (25 mg/kg) y 10 veces (100 mg/kg) la dosis máxima proyectada en humanos (10 mg/kg). No se observaron reacciones adversas obvias relacionadas con el tratamiento, hallazgos patológicos macroscópicos o microscópicos ni mortalidad. La oftalmoscopia y el electrocardiograma no indicaron hallazgos relacionados con el tratamiento. Además, se encontró que todos los análisis de sangre y orina estaban dentro de los rangos normales para los monos Rhesus. En conjunto, el estudio pivotal de toxicología de dosis repetidas de GLP en monos Rhesus no mostró toxicidades relacionadas con el tratamiento en ningún nivel de dosis, y se determinó que el nivel sin efecto observado (NOEL) era de 100 mg/kg. La evaluación toxicocinética mostró un aumento proporcional a la dosis en la exposición a CM-24. (Cmax, AUC) cuando se administra mediante perfusión intravenosa. Un ligero aumento en la Cmáx y el AUC el día 42 en comparación con el día 0 podría sugerir la posibilidad de cierta acumulación de CM-24 cuando el mAb se administra mediante este ROA y el régimen de dosificación a estos niveles de dosis. Solo un animal en el Grupo 2 (25 mg/kg) mostró una respuesta de anticuerpos anti-CM-24 positiva, lo que sugiere que la respuesta de ADA probablemente no tuvo ningún efecto sobre la farmacocinética o el estudio de toxicidad. Este resultado no representa una fuerte respuesta de inmunogenicidad a dosis repetidas con resultados de CM-24.

[0150] La dosis segura de inicio clínico para CM-24 basado en el MABEL, determinado a partir de los experimentos in vivo en los resultados de modelos de xenoinjerto de tumores de ratón, está en el intervalo de 0,2-1 mg/kg, que comprende un factor de seguridad de 10 veces. El estudio pivotal de toxicología de dosis repetidas de GLP en monos Rhesus no mostró toxicidades relacionadas con el tratamiento en ningún nivel de dosis, y se determinó que el nivel sin efecto observado (NOEL) era de 100 mg/kg (dosis equivalente humana (HED) de 100 mg/kg sobre una base de peso a peso), que claramente apoya el rango determinado por la evaluación MABEL. Los resultados del ensayo de producción de citocinas proinflamatorias y proliferación de PBMC in vitro/ex vivo no demostraron una inducción sustancial relacionada con CM-24 de la proliferación de células T y producción de citocinas proinflamatorias.

Ejemplo 8. Un estudio de escalación de multidosis, multicentro, de etiqueta abierta de fase 1, de CM-24 en sujetos con malignidades avanzadas o recurrentes seleccionadas

[0151] Seis tipos tumorales - melanoma, adenocarcinoma de cáncer de pulmón de células microcíticas, cáncer gástrico, colorrectal, de vejiga y ovárico: se han seleccionado para el estudio actual, ya que son representativos de tumores para los que existe una gran necesidad médica de nuevas terapias; aquellos para los que existe un precedente de respuestas clínicas a otras inmunoterapias; y aquellos para los que hay datos patológicos correlativos de apoyo que sugieren que la vía CEACAM1 es importante para la progresión del tumor.

[0152] El estudio incluye 2 fases: la porción de escalada de dosis y la porción de cohorte de expansión. La porción de aumento de dosis dura al menos 12 semanas comenzando con 4 infusiones (ciclo 1) para cada sujeto. Los sujetos sin toxicidad limitante de la dosis (TLD) y que muestran evidencia de beneficio clínico (respuesta completa - RC, respuesta parcial - RP, enfermedad estable - EE), así como los sujetos con enfermedad progresiva - ERP en la evaluación de imágenes que por lo demás son clínicamente estables son tratados durante hasta un total de 5 ciclos adicionales (período de tratamiento continuo) que duran hasta 38 semanas de tratamiento adicionales y al menos 25 semanas de seguimiento (75 semanas en total/aproximadamente 15 meses). La porción de expansión dura hasta 46 semanas de tratamiento y al menos 25 semanas de seguimiento (71 semanas en total/aproximadamente 14 meses) en sujetos con melanoma cutáneo.

Objetivos principales:

[0153]

1. Evaluar la seguridad y tolerabilidad de dosis múltiples crecientes de CM-24 (administradas por vía intravenosa) y

2. Determinar la dosis recomendada de Fase 2 de CM-24, en sujetos con neoplasias malignas avanzadas o recurrentes que incluyen melanoma, adenocarcinoma de pulmón de células microcíticas y cánceres gástrico, colorrectal, de vejiga y de ovario.

Los objetivos secundarios incluyen:

[0154]

1. Caracterizar el perfil farmacocinético de múltiples dosis de CM-24.

2. Caracterizar la inmunogenicidad de CM-24.

3. Evaluar la eficacia preliminar sobre la base de la respuesta tumoral objetiva y la duración de la respuesta en sujetos tratados con CM-24.

Objetivos de exploración incluyen:

[0155]

1. Explora un potencial biomarcador predictivo asociado con la actividad clínica CM-24 sobre la base de los niveles de expresión de CEACAM1 en especímenes tumorales antes del tratamiento.

2. Investigar la actividad inmunomoduladora de CM-24 en poblaciones de células inmunitarias seleccionadas y factores solubles en tumores y sangre periférica.

3. Evaluar la supervivencia global en sujetos tratados con CM-24.

[0156] La porción de dosis de escalación: está prevista la dosificación del fármaco de estudio para ser administrado de una manera escalonada comenzando con 0,01 mg/kg, y continuando a 0,03 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg y 10 mg/kg. Los sujetos serán asignados a un nivel de dosis en el orden de entrada al estudio. Para los dos primeros niveles de dosis (0,1 mg/kg y 0,03 mg/kg), se inscribe 1 paciente en cada cohorte en un diseño acelerado en donde una toxicidad relacionada con un fármaco de grado 2 único da como resultado la expansión a un diseño 3 3 en la dosis y todas las dosis posteriores. Para los sujetos de las dos cohortes inferiores (0,1 mg/kg y 0,03 mg/kg) Aumento de la dosis desde la primera cohorte de dosis baja de un solo paciente (0,1 mg/kg) hasta la siguiente cohorte (0,03 mg/kg), y la segunda cohorte de dosis única (0,03 mg/kg) a la siguiente cohorte (0,1 mg/kg) comienza después de una ventana de TLD de 6 semanas, si no se ha producido toxicidad de Grado 2 o mayor. Para niveles de dosis de 0,1 mg/kg y superiores, se inscriben al menos 3 pacientes por cohorte en un diseño estándar 3 3 a menos que se produzca una TLD, en cuyo caso la cohorte se amplía a 6 pacientes. La escalada a la siguiente cohorte solo comienza después de una ventana de TLD de 8 semanas, comenzando desde la primera administración del fármaco del estudio del primer sujeto de cada cohorte.

[0157] El período de dosificación incluye tres períodos: selección, dosificación y seguimiento: 1) 4 dosis repetidas que comprenden el primer ciclo seguido de un período de observación de 6 semanas), 2) un período de tratamiento continuo (ciclos 2-6) y 3), un período de seguimiento que incluye la evaluación de la supervivencia general. Cada ciclo de tratamiento consta de 4 dosis de administración del fármaco del estudio cada 2 semanas. Al menos 3 sujetos por cohorte están inscritos en un diseño estándar 3 3. El número mínimo planificado de sujetos inscritos en esta parte es 17, pero puede aumentar si se producen toxicidades limitantes de la dosis (TLD). Si un TLD se produce en un nivel de dosis dado, este nivel de dosis se amplió para 6 sujetos, por lo tanto el número máximo de los sujetos en la porción de escalada de dosis es 42.

[0158] Sujetos inscritos reciben 4 tratamientos, una vez cada 2 semanas (ciclo 1) seguido de una ventana de observación de 6 semanas; cuando los sujetos apropiados ingresan al período de Tratamiento Continuado durante el cual reciben ciclos adicionales (2-6). Durante este período de tratamiento continuo, los sujetos se someten a evaluaciones clínicas y de laboratorio que incluyen examen físico (peso corporal, signos vitales y saturación de oxígeno), farmacocinética y farmacodinamia, recolección de citocinas, así como pruebas de laboratorio de seguridad y ensayos de seguridad inmunológica y se registra el ECG. Todos los sujetos se someten a una evaluación de la respuesta una semana y cinco semanas después del ciclo 1, según las evaluaciones clínicas y de imágenes. Una vez que sea elegible para continuar en el estudio, se realizan evaluaciones de respuesta adicionales inmediatamente antes del comienzo del siguiente ciclo. Después del último ciclo de tratamiento continuado, se realiza un seguimiento de los sujetos por seguridad, eficacia y supervivencia.

[0159] La parte de expansión: Hasta 20 sujetos con melanoma cutáneo metastásico están inscritos y son tratados a la dosis de Fase 2 recomendada (RP2D). Incluye 3 periodos: Cribado, Dosificación y Seguimiento. El período de dosificación consta de 6 ciclos de 4 tratamientos cada uno administrado cada 2 semanas. El período de seguimiento incluye la evaluación de la supervivencia general.

[0160] Los sujetos inscritos reciben la dosis recomendada de la Fase 2 cada 2 semanas en cada ciclo. Se administran cuatro tratamientos y los sujetos continúan el tratamiento hasta 6 ciclos. Durante el período de dosificación, los sujetos se someten a evaluaciones clínicas y de laboratorio como se detalla anteriormente.

[0161] Los sujetos deben tener un período de "lavado" de al menos 4 semanas antes de la primera administración del fármaco del estudio de todos los agentes experimentales y de quimioterapia anteriores, excepto los inmunomoduladores (por ejemplo, pero no limitado a: anticuerpos anti-CTLA4, anti-PD-Ll, anti-PD-1, IL-2) que deben tener un período de "lavado" de al menos 6 semanas antes de la administración de fármacos del primer estudio, y todos los eventos adversos han vuelto a los valores iniciales o se han estabilizado en el Grado 1 o menos.

[0162] Los sujetos de melanoma con melanoma con mutación positiva de B-Raf V600E o V600K deben haber progresado o eran intolerantes a la terapia previa con inhibidores de B-Raf y/o MEK.

Porción de escalada de dosis

[0163] El ciclo 1 consistirá en un periodo de dosificación de repetición de 6 semanas (4 dosis, cada 2 semanas de diferencia); y un período de observación de 6 semanas.

[0164] Un mínimo de 1 semana debe transcurrir entre el primer tratamiento de cualquier sujeto en una cohorte de dosis y el primer tratamiento para el sujeto posterior en esa cohorte de dosis.

[0165] Los sujetos son seguidos de cerca durante el periodo de estudio inicial de 12 semanas. Todos los sujetos se someten a una evaluación de respuesta una semana y cinco semanas después del final del Ciclo 1 para evidencia y confirmación del beneficio clínico, definido como enfermedad estable (EE), respuesta parcial (RP) o respuesta completa (RC) en la Semana 12. Sujetos con evidencia de Enfermedad Progresiva (ERP) en las imágenes de la Semana 7 u 11 después de reconsentirse en el Formulario de Consentimiento Informado (FCI), puede continuar la participación en el estudio y continuar el tratamiento con CM-24, si el investigador considera que está clínicamente justificado de acuerdo con las Reglas de Detención de la Sección de Deterioro Clínico y evaluación adicional en la semana 15. Si las imágenes de seguimiento en la semana 15 confirman ERP, el sujeto no continúa el tratamiento debido a la progresión confirmada de la enfermedad.

[0166] Todos los sujetos con TLD, incluyendo TLDs retrasados, dejarán de realizar ulterior dosificación con CM-24, pero no son retirados del estudio.

[0167] Se sustituyen los sujetos que se retiraron del estudio antes de la terminación de las 3 primeras administraciones del fármaco de estudio en el Período Inicial de Estudio (Ciclo 1). Los sujetos que se retiran por cualquier otro motivo que no sea el retiro del consentimiento son seguidos durante 4 visitas de seguimiento durante un período de seis meses.

[0168] Los ciclos 2-6 se denominan período de tratamiento continuo. Después del período de estudio inicial, los sujetos con evidencia de beneficio clínico, definido como SD, PR o CR de acuerdo con los criterios RECIST 1.1 modificados y sin evidencia de toxicidad limitante de dosis (TLD) en la semana 12, pueden continuar el tratamiento con CM-24 al mismo tiempo. El nivel de dosis recibido durante el período de estudio inicial durante 5 ciclos de tratamiento adicionales. Los sujetos con ERP que se ha confirmado pero que no está empeorando y con un estado clínico estable o mejorado de otro modo deben seguir siendo tratados con el fármaco del estudio hasta que haya una mayor progresión o deterioro clínico.

[0169] Cada ciclo de tratamiento completo del período de tratamiento continuo comprende 4 dosis del fármaco del estudio administradas con 2 semanas de diferencia, en los Días 1, 15, 29, y 43. Se lleva a cabo una evaluación de la respuesta entre los días 52 y 56 de cada ciclo de tratamiento. La evaluación de la respuesta debe completarse antes de que se administre la primera dosis del siguiente ciclo.

[0170] Durante el período de tratamiento continuo, los sujetos con ERP que ha sido confirmado, pero no está empeorando y con el estado clínico de otro modo estable o mejorado, deberían seguir siendo tratados con el fármaco del estudio hasta que no haya más progresión o deterioro clínico.

[0171] Después de la última administración de CM-24 en el período de tratamiento continuo, cada sujeto se siguió más de 4 visitas de seguimiento durante un período de seis meses.

[0172] Todos los sujetos con TLD, incluyendo TLDs retrasados, discontinúan la dosificación ulterior con CM-24, pero no son retirados del estudio.

[0173] Todos los sujetos son seguidos de manera indefinida por supervivencia.

Expansión de la cohorte

[0174] Para los dos primeros niveles de dosis (0,1 mg/kg y 0,03 mg/kg), se inscribe 1 paciente en cada cohorte en un diseño acelerado en donde una toxicidad relacionada con un fármaco de grado 2 único da como resultado una expansión al diseño 3 3 en la dosis y todas las dosis posteriores. Para los sujetos de las dos cohortes inferiores (0,01 mg/kg y 0,03 mg/kg) El aumento de la dosis desde la primera cohorte de dosis baja de un solo paciente (0,1 mg/kg) hasta la siguiente cohorte (0,03 mg/kg), y la segunda cohorte de dosis única (0,03 mg/kg) a la siguiente cohorte (0,1 mg/kg) se inician después de una ventana de TLD de 6 semanas, si no se ha producido toxicidad de Grado 2 o superior. Para niveles de dosis de 0,1 mg/kg y superiores, se inscribirán al menos 3 pacientes por cohorte en un diseño estándar 3 3 a menos que se produzca una TLD, en cuyo caso la cohorte se amplía a 6 pacientes. La escalada a la siguiente cohorte solo comenzará después de una ventana de TLD de 8 semanas, comenzando desde la primera administración del fármaco del estudio del primer sujeto de cada cohorte.

[0175] Si ningún sujeto adicional en la cohorte de 6 sujetos tiene un TLD, luego de la revisión de los datos de seguridad para todos los sujetos por parte del Comité de Seguridad, se puede proceder al aumento de la dosis.

[0176] Si 2 o más sujetos en una cohorte de dosis de 3 o 6 sujetos desarrollan TLD, se detiene el aumento de la dosis, y:

Si la cohorte de nivel de dosis anterior no se había expandido ya a 6 sujetos, se expandirá a 6 sujetos.

[0177] Si la cohorte de niveles de dosis anterior ya se expandió a 6 sujetos, el Comité de Seguridad, después de revisar todos los datos de seguridad hasta la fecha, puede:

Considerar que el nivel de dosis (anterior) debe ser la dosis recomendada de Fase 2 (RP2D), o

Recomendar la evaluación de una nueva cohorte a una dosis intermedia.

[0178] La dosis recomendada de Fase 2 (RP2D) se define como el nivel de dosis alta a la que no más de 1 de cada 6 sujetos experimenta una TLD.

Escalada de dosis

[0179] Si no se encuentran TLD en la ventana de TLD de 6 semanas para dos cohortes más bajas, y para las cohortes restantes, una ventana TLD de 8 semanas, entonces la próxima cohorte se inicia y se repite el mismo patrón. Hay un período de espera de una semana entre las inscripciones de sujetos dentro de cada nivel de dosis de cohorte. Antes del aumento gradual de la dosis, el Comité de Seguridad evalúa los datos de seguridad disponibles para todos los sujetos tratados en el estudio hasta la fecha, incluida la cohorte actual.

[0180] La dosificación (ciclo 1) de la siguiente cohorte de dosis se inicia sólo después de completarse la dosificación repetida (ciclo 1) para todos los sujetos en la cohorte de dosis anterior. El momento de la revisión del Comité de Seguridad se basa en datos que sugieren que los irAE en pacientes tratados con otros inmunomoduladores ocurren dentro de las 5-10 semanas posteriores a la administración. Si se produce una TLD, que requiere la expansión de la cohorte de dosis de tratamiento a seis sujetos, la ventana de TLD se amplía para abarcar la dosificación repetida completa (ciclo 1) de los seis sujetos.

[0181] Si, después de aumentar la dosis, si se encuentran 2 o más TLD retardados en una dosis más baja, y ese EA podría ser un posible TLD retardado relacionado con CM-24, la acumulación se suspende temporalmente y el Comité de Seguridad notificó dentro de 24 horas. El Comité de Seguridad evaluará de inmediato el evento y la información relevante, incluidos los datos farmacocinéticos, y realizará los ajustes necesarios en la dosis y/o el esquema de aumento de dosis. Se deben realizar los mismos pasos. Se producen 2 o más TLD retardados en una cohorte expandida de 6 sujetos previamente probada.

[0182] Los TLD retrasados serán revisados por el Comité de Seguridad siguiendo las directrices y las decisiones se toman caso por caso. Tales acciones podrían incluir la aplicación de las reglas estándar de escalada de TLD, volver a una dosis más baja o intermedia, o no tomar ninguna acción si el evento relacionado con la dosis que se está examinando no es lo suficientemente grave como para detener el escalado de dosis y la dosis actual no se considera un riesgo para los sujetos.

Porción de expansión

[0183] La parte de expansión de este estudio permite la inscripción de hasta 20 sujetos con melanoma cutáneo avanzado. Se pueden abrir otros brazos de expansión de hasta 20 sujetos, sujetos a enmienda del protocolo, en las indicaciones previamente estudiadas durante la porción de aumento de dosis del ensayo, si las señales tempranas de eficacia lo justifican. Los sujetos inscritos se tratan en el RP2D durante un máximo de seis ciclos, con el tratamiento administrado los días 1, 15, 29 y 43. Se realiza una evaluación de la respuesta entre los días 52 y 56. La evaluación de la respuesta debe completarse antes de la administración de la primera dosis en el próximo ciclo.

[0184] La inscripción puede realizarse en la porción de expansión si la tasa de TLD es > 33%. A los sujetos que toleran el fármaco del estudio no se les impide automáticamente continuar con la dosificación hasta la revisión del Comité de Seguridad, y se les permite continuar con la dosificación durante el tiempo que lo toleren, a menos que se indique lo contrario como resultado de la revisión de seguridad. Después del análisis de seguridad, se toma la decisión de reanudar el reclutamiento y continuar con la dosis actual o continuar con el reclutamiento de más sujetos con una dosis más baja. Para los t Ld , la inscripción se retiene y/o reinicia después de la revisión del Comité de Seguridad.

Directrices de decisión de tratamiento

[0185] La respuesta tumoral se evalúa usando criterios de evaluación de respuesta en tumores sólidos (RECIST 1.1). Las evaluaciones de la respuesta tumoral al final del ciclo para todos los sujetos ocurren dentro de los días 52 a 56 de cada ciclo de tratamiento (los resultados de las evaluaciones deben revisarse y documentarse antes de la primera dosis del siguiente ciclo). Después de cada ciclo de tratamiento (continuo o de expansión), la decisión de tratar a un sujeto con un ciclo adicional de CM-24 se basa en la evaluación del tumor, a menos que el sujeto desarrolle un evento adverso de grado > 3 (CTCAE) u otro evento adverso relacionado con la CM-24 que excluye un tratamiento posterior.

Los sujetos se tratan hasta que se confirma la respuesta completa (RC) o la enfermedad progresiva (ERP) que se confirma y luego progresa como se describe a continuación. Los sujetos con ERP que se ha confirmado pero que no empeora y con un estado clínico estable o mejorado (es decir, sin reducción en el estado funcional ECOG) deben continuar siendo tratados con el fármaco del estudio hasta que haya una mayor progresión o deterioro clínico, como se detalla a continuación.

[0186] Los sujetos con una mejor respuesta global (BOR) de CR, PR o SD continúan recibiendo el tratamiento con CM-24 hasta la primera aparición de:

Consecución de una RC confirmada;

Deterioro clínico que sugiere que no es probable que se obtengan más beneficios del tratamiento;

Cumple los criterios para la interrupción de la terapia del estudio (TLD) u otra intolerancia a la terapia; o Recepción del número máximo de ciclos.

Período de seguimiento

[0187] Los sujetos son seguidos por un período de al menos seis meses a partir del último tratamiento de infusión. La primera visita de seguimiento se llevará a cabo dentro de los 7 días posteriores a la última exploración por imágenes. Las visitas de seguimiento 2-4 se realizarán a intervalos de 56 días. Además, el estado de supervivencia se evalúa aproximadamente cada 3 meses, de manera indefinida, ya sea mediante una llamada telefónica o contacto en persona, luego de la finalización o interrupción del tratamiento y el seguimiento del estudio. Se informan las fechas de fallecimiento de todos los sujetos fallecidos. Las evaluaciones de supervivencia general se realizan hasta que el patrocinador complete o finalice el estudio. Durante estas llamadas o visitas no se recopilan otros datos (por ejemplo, terapias posteriores, estado de desempeño, etc.) además de la supervivencia.

[0188] Cuando un sujeto interrumpe el tratamiento con el fármaco del estudio, la fecha y el motivo de la interrupción del fármaco del estudio deben documentarse en los documentos fuente y el sujeto debe ingresar al período de seguimiento. Cuando un sujeto se retira del estudio (durante el tratamiento o el período de seguimiento), se deben hacer todos los esfuerzos posibles para garantizar que se realicen todas las evaluaciones asociadas con esa visita del estudio y que la fecha y el motivo de la interrupción del estudio estén documentados en los documentos fuente.

[0189] Tras la finalización de los períodos de tratamiento y de seguimiento, todos los sujetos que sobreviven son seguidos por la supervivencia de estado cada 3 meses, de forma indefinida.

Descripción física del fármaco del estudio

[0190] CM-24 se suministra en un vial de 10 ml de un solo uso. Cada vial contiene una solución concentrada con el equivalente a 100 mg de CM-24 (10 mg/ml).

[0191] El CM-24 se administra como una infusión intravenosa, con un filtro en línea de 0,2 micrómetros en las dosis especificadas por el protocolo.

Instrucciones para la preparación de las diferentes dosis:

[0192] Para los sujetos que recibieron dosis de 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg y 1,0 mg/kg, una bolsa de cloruro de sodio al 0,9% IV 50 ml es utilizado para la preparación. La infusión debe realizarse a una velocidad de 1,0 ml/minuto. El redondeo durante la preparación de la dosis debe realizarse solo cuando sea absolutamente necesario y solo debe hacerse de manera que permita mantener la concentración mínima de 0,25 mg/ml.

[0193] Para los sujetos que recibieron dosis de 3 mg/kg, una bolsa de cloruro de sodio al 0,9% IV 100 ml se utiliza para la preparación. La infusión debe realizarse a una velocidad de 2,0 ml/minuto. El redondeo durante la preparación de la dosis debe realizarse solo cuando sea absolutamente necesario.

[0194] Para los sujetos que recibieron dosis de 10 mg/kg, una bolsa de cloruro de sodio al 0,9% IV 250 ml se utiliza para la preparación. La infusión debe realizarse a una velocidad de 3,0 ml/minuto. El redondeo durante la preparación de la dosis debe realizarse solo cuando sea absolutamente necesario.

Marcadores farmacodinámicos (PD)

[0195] Las muestras de sangre se recogen y se prueban para los ensayos inmunológicos y otras evaluaciones en los siguientes puntos de tiempo: predosis de 1a administración del fármaco de estudio, 48 horas después de la 1a y 4a dosis de ciclo 1 de la administración del fármaco del estudio y predosis de la 4a dosis (última) de cada ciclo completo (ciclos 2-6 de aumento de la dosis, y todos los ciclos de la cohorte de expansión), las visitas de seguimiento 2-4, e incluyen:

• subtipos de linfocitos (CD4, CD8 y CD56) en combinación con marcadores de activación (CD69, CD107a y HLA-DR), células T reguladoras por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS)

• Expresión de CEACAM1 en subtipos de linfocitos

CEACAM1 soluble y Granzima B en suero

porcentaje de ocupación del receptor CEACAM1 por CM-24

células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) (CD14+, HLADR bajo, CD11b+)

proteínas de puntos de control inmunitarios, por ejemplo, PD-1, TIM-3, LAG, Vista

Farmacocinética (PK)

[0196] La farmacocinética se estudia inicialmente durante la porción de escalada de dosis durante la primera infusión (primera dosis del ciclo 1) y durante la cuarta infusión (última dosis del ciclo 1). Los niveles previos a la dosis también se toman antes de cada tratamiento en el 1er ciclo. Los sujetos de expansión de dosis adicionales (hasta 6) pueden ser evaluados para la evaluación PK en el RP2D preliminar si se considera justificada una caracterización PK más robusta de CM-24.

[0197] El perfil de PK de CM-24 se evaluó en plasma hasta 15 días después de la dosis para la primera dosis y 36 días postinfusión para la cuarta dosis. Los siguientes parámetros farmacocinéticos se derivan de los perfiles de concentración plasmática frente al tiempo: Cmax. t i/² , Tmax, AUCo-t y AUCo-°c‘.

[0198] Se toman muestras en las infusiones primera y cuarta en los siguientes puntos de tiempo: pre-infusión (línea de base); al final de la infusión y 1,4, 8, 24 horas después de la infusión. Solo para la 1a y 4a dosis: los días 3, 5, 8, 15 (o antes de la dosis del siguiente tratamiento) y para 4a dosis también los días 22 y 36 después de la infusión. Los niveles previos a la dosis se tomarán antes de cada tratamiento en el primer ciclo. Consulte el programa de eventos y el manual de laboratorio para obtener más información sobre la recolección de muestras y el envío de muestras.

Biopsias tumorales frescas

[0199] Las muestras de tumor se evalúan por lo siguiente: CD4, CD8, CD56, FoxP3, CEACAM1, granzima B, CM-24, % de ocupación del receptor de CEACAM1 por CM-24.

[0200] Porción de escalada de dosis: se pidió a los sujetos proporcionar una muestra reciente de tejido de biopsia opcional (o una archivada si se tomó dentro de los últimos seis meses) al inicio del estudio y una semana después del segundo tratamiento del 1er ciclo.

[0201] Porción de expansión: se toman muestras de tumor fresco dos, en el cribado y una semana después de la 2a dosificación administración del 1er ciclo. Además, se anima a los sujetos, pero no se les exige, que proporcionen una biopsia adicional una semana después del cuarto tratamiento del 1er ciclo.

Criterios de valoración de la eficacia

[0202] Los siguientes criterios de valoración se utilizan para evaluar la eficacia preliminar, y se derivan de los criterios modificados de RECIST 1.1:

Tasa de respuesta objetiva (ORR)

Duración de la respuesta (DOR)

Estado de respuesta de tumor

Tasa de control de enfermedades (DCR)

Respuesta duradera (DR)

Mejor respuesta general (BOR) - Respuesta completa (RC), Respuesta parcial (RP), Enfermedad estable (EE) y Enfermedad progresiva (ERP).

Supervivencia libre de progresión (PFS)

Tiempo de respuesta (TTR)

Supervivencia general (SG)

Cambio porcentual en la carga tumoral (PCTB), evaluado por CT o MRI.

0203] El punto final de eficacia enumerado anteriormente se evaluará en:

Cohortes de aumento de dosis:

• Semana 7, una semana después de que se administró la cuarta dosis del primer ciclo.

• Semana 11, cinco semanas después de la administración de la cuarta dosis del primer ciclo

• Semana 18-19, Semana 26-27, Semana 34-35, Semana 42-43, Semana 48-49 y Semana 50-51, después de los cinco ciclos adicionales, más visitas de seguimiento 2-4.

Claims (22)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal humanizado (mAb) o un fragmento del mismo, que reconoce específicamente CEACAM1 humano, que comprende:

i. una secuencia de la región variable de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32, y

ii. una secuencia de región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 35.

2. El mAb humanizado de la reivindicación 1, que comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada establecida en SEQ ID NO: 32, y el conjunto de secuencias de la región variable de la cadena ligera adelante en SEQ ID NO: 34.

3. El mAb humanizado según la reivindicación 1, que comprende un isotipo kappa de cadena ligera y una cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en el isotipo IgG4 y el isotipo IgG1.

4. El mAb humanizado de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende una cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 52.

5. El mAb humanizado de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende una secuencia de cadena pesada seleccionada de la secuencia establecida en SEQ ID NO: 53 y la secuencia establecida en SEQ ID NO: 59 y una cadena ligera establecida en SEQ ID NO: 52.

6. El mAb humanizado según la reivindicación 3, que comprende un conjunto de la cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 52, y una cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 53.

7. Un polinucleótido aislado que codifica un mAb o fragmento del mismo de acuerdo humanizado a cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

8. La secuencia de polinucleótidos aislada de la reivindicación 7, que comprende una secuencia de ADN expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 44 a 51 que codifica una región variable de mAb, o análogos de la misma que tienen al menos un 90% de identidad de secuencia con dichas secuencias.

9. La secuencia de polinucleótidos aislada de la reivindicación 7, que comprende una secuencia de ADN establecida en cualquiera de SEQ ID NO: 54 o SEQ ID NO: 55 que codifica una cadena pesada de mAb humanizado, o una secuencia de ADN establecida en SEQ ID NO: 56 que codifica una cadena ligera de mAb humanizado.

10. Un plásmido que comprende el polinucleótido aislado de la reivindicación 7.

11. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un mAb humanizado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o un fragmento del mismo, que reconoce específicamente CEACAM1 humano, y un vehículo farmacéuticamente aceptable., diluyente o excipiente.

12. La composición farmacéutica de la reivindicación 11, para su uso en el tratamiento del cáncer asociado con la expresión, activación o función de una proteína CEACAM.

13. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en: melanoma, colorrectal, vejiga, pulmón, carcinoma de pulmón de células microcíticas (CPCM), adenocarcinoma de pulmón de células microcíticas (APCM), cáncer gastrointestinal, pancreático, mama, próstata, tiroides, estómago, ovario, mieloma y útero.

14. Composición farmacéutica según la reivindicación 11, que comprende

(i) 1 -10 mg/ml de aminoácido básico;

(ii) 10/100 mg/ml de un azúcar;

(iii) 0,01-1 mg/ml de un tensioactivo;

(iv) 1-50 mg/ml de mAb humanizado para CEACAM1,4-6 mg/ml de aminoácido básico, 70-100 mg/ml de un azúcar y 0,1-1 mg/ml de tensioactivo no aniónico; o

(v) 10 mg/ml de mAb humanizado para CEACAM1,4,65 mg/ml de L-Histidina, 82 mg/ml de sacarosa y 0,20 mg/ml de polisorbato 20.

15. Composición farmacéutica según la reivindicación 11, que comprende además al menos un inmunomodulador adicional.

16. Una composición farmacéutica que comprende un mAb humanizado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o un fragmento del mismo, que reconoce específicamente CEACAM1 humana, y una composición farmacéutica que comprende un inmunomodulador adicional, para uso en el tratamiento del cáncer por administración separada.

17. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 11 o 16, en donde el inmunomodulador adicional se selecciona del grupo que consiste en: una proteína anti-muerte celular programada humana 1 (PD-1), anticuerpo anti-PD-L1 y anti-PD-L2, una célula linfocitaria citotóxica activada, un agente activador de linfocitos y un inhibidor de la vía RAF/MEK.

18. Una composición de diagnóstico que comprende al menos un mAb humanizado o un fragmento del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

19. La composición farmacéutica para uso de la reivindicación 12, que comprende administrar al sujeto al menos una dosis de un mAb humanizado a CEACAM1 en el intervalo de 0,01 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal.

20. La composición farmacéutica para uso de la reivindicación 19, que comprende administrar

(i) dosis múltiples, idénticas o diferentes de mAb humanizado;

(ii) múltiples dosis crecientes; o

(iii) la composición farmacéutica una vez a la semana, una cada 2 semanas, una vez cada 3 semanas, una vez cada 4 semanas o una vez cada 5 semanas.

21. La composición farmacéutica para uso de la reivindicación 20, que comprende de 1 a 10 ciclos de administración, comprendiendo cada ciclo de 2 a 5 infusiones cada 1 a 4 semanas, con un mAb humanizado, seguido de 2 a 8 semanas entre cada ciclo.

22. Un método para diagnosticar un cáncer en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método poner en contacto una muestra biológica derivada u obtenida de dicho sujeto con la composición de diagnóstico de la reivindicación 18, en donde una formación de complejo más allá de un umbral predeterminado es indicativo del cáncer en dicho sujeto.