ES2942314T3 - Anticuerpos contra la molécula de adhesión celular relacionada con antígeno carcinoembrionario - Google Patents

Anticuerpos contra la molécula de adhesión celular relacionada con antígeno carcinoembrionario Download PDF

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Abstract

La presente descripción proporciona anticuerpos, así como moléculas que tienen al menos la porción de unión a antígeno de un anticuerpo, que reconoce la proteína CEACAM1 y otros subtipos de la familia de proteínas CEACAM. Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos descritos se caracterizan por comprender secuencias de CDR específicas. También se proporcionan métodos de producción y uso en terapia y diagnóstico de dichos anticuerpos y fragmentos de anticuerpos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos contra la molécula de adhesión celular relacionada con antígeno carcinoembrionario
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a anticuerpos terapéuticos y de diagnóstico, útiles en enfermedades que implican la expresión, activación o función de la Molécula de Adhesión Celular Relacionada con el Antígeno Carcinoembrionario (CEACAM). En particular, la presente invención proporciona anticuerpos que tienen regiones determinantes de la complementariedad (CDR) específicas y propiedades mejoradas sobre otros anticuerpos que reconocen CEACAM1.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La proteína transmembrana Molécula de Adhesión Celular Relacionada con el Antígeno Carcinoembrionario 1 (CEACAM1, también conocida como glicoproteína biliar (BGP), CD66a y C-CAM1), es un miembro de la familia de antígenos carcinoembrionarios (CEA) que también pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas. La CEACAM1 interactúa con otras proteínas CEACAM conocidas, incluyendo las proteínas CD66a (CEACAM1), CD66e (CEACAM6) y CD66e (CEACAM5, CEA). Se expresa en un amplio espectro de células, que van desde las células epiteliales hasta las de origen hematopoyético (por ejemplo, células inmunitarias).
Se han atribuido muchas funciones diferentes a la proteína CEACAM1. Se ha demostrado que la proteína CEACAM1 se sobreexpresa en algunos carcinomas de colon, próstata, así como en otros tipos de cáncer. Datos adicionales respaldan la participación central de CEACAM1 en la angiogénesis y la metástasis. La CEACAM1 también desempeña un papel en la modulación de las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas. Por ejemplo, se ha demostrado que CEACAM1 es un receptor inhibitorio para las células T activadas contenidas en el epitelio intestinal humano (WO99/52552 y Morales et al. J. Immunol. 1999, 163, 1363-1370). Informes adicionales han indicado que la participación de CEACAM1 ya sea por la reticulación del receptor de células T con anticuerpos monoclonales (mAb) o por las proteínas Opa de Neisseria gonorrhoeae inhibe la activación y proliferación de células T.
El melanoma es una enfermedad maligna de las células productoras de pigmento (melanocitos), responsable del 75% de la mortalidad relacionada con el cáncer de piel en todo el mundo, principalmente debido a metástasis extensas. El melanoma metastásico (MM) responde débilmente a la mayoría de los regímenes anticancerígenos, y la media de supervivencia global media para los pacientes con m M es de 8,5 meses. Hay evidencias de que la sobreexpresión de CEACAM1 puede correlacionarse con un mal pronóstico y se detecta en la mayoría de los casos de melanoma metastásico. CEACAM1 rara vez se expresa en melanocitos normales, pero se encuentra con frecuencia en células de melanoma. La expresión de CEACAM1 en lesiones primarias de melanoma cutáneo predice fuertemente el desarrollo de enfermedad metastásica con mal pronóstico. Además, se observó una expresión de CEACAM1 aumentada en células NK derivadas de algunos pacientes con melanoma metastásico en comparación con donantes sanos.
La evidencia indica que CEACAM1 puede tener un papel importante en las infecciones por virus. Por ejemplo, Markel et al. (J. Clinical Investigation 2002, 110, 943-953) demostraron que los linfocitos aislados de la decidua de pacientes infectados con CMV expresan la proteína CEACAM1 a niveles aumentados. La expresión de CEACAM1 aumentada en los linfocitos deciduales podría disminuir la respuesta inmunitaria local y servir como otro mecanismo desarrollado por el virus para evitar el reconocimiento y la depuración principalmente por linfocitos deciduales activados. Albarran-Somoza et al. (Journal of Histochemistry & Cytochemistry 2006, 54, 1393), que estudiaron el patrón de expresión de la proteína CEACAM1 en el cáncer de cuello uterino y lesiones precursoras en el contexto de la infección por el virus del papiloma humano (HPV), demostraron que la inmunotinción de CEACAM1 aumenta significativamente en las lesiones intraepiteliales escamosas (SIL) de grado alto en comparación con las SIL de bajo grado y tejidos cervicales normales. Los autores sugirieron que la regulación por incremento de CEACAM1 puede estar relacionada con la integración del ADN del HPV en SIL de grado alto y que CEACAM1 puede ser un marcador biológico importante en SIL y la progresión del cáncer de cuello uterino. En conjunto, estas evidencias indican que CEACAM1 desempeña un papel importante en varias infecciones víricas. Además, la sobreexpresión de CEACAM1 puede servir como marcador de diversas infecciones víricas.
La WO2007/063424 y la US2007/0110668 A1 divulgan métodos para regular el sistema inmunitario y, en particular, métodos para la regulación de una respuesta inmunitaria específica, incluyendo la regulación de la actividad de los linfocitos. Estos métodos comprenden tanto la modulación negativa como la positiva de la función de la proteína CEACAM1.
La US 2007/0071758 A1 enseña métodos y composiciones para mejorar la eficacia de la terapia con linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) en el tratamiento del cáncer mediante la modulación negativa de la actividad de la proteína CEACAM1 como, por ejemplo, mediante el uso de una inmunoglobulina específica para CEACAM1.
La US 2008/0108140 A1 divulga métodos para modular respuestas inmunitarias específicas para crear una inmunidad protectora en el tratamiento de enfermedades autoinmunes y enfermedades que requieren el trasplante de tejido. En particular, se refiere a la supresión de las respuestas inmunitarias de manera dirigida, aumentando la concentración funcional de la proteína CEACAM1 en el tejido objetivo.
La US 2004/0047858 A1 divulga anticuerpos específicos que son capaces de modular la actividad de las células T a través de CEACAM1 y los usos de los mismos en el tratamiento de enfermedades relacionadas con la respuesta inmunitaria (por ejemplo, enfermedad de injerto contra huésped, enfermedades autoinmunes, cánceres, etc.).
La US 2002/0028203 A1, la US 2005/0169922 A1 y la US 2008/0102071 A1 divulgan composiciones que se unen a moléculas inhibidoras de receptores de células T y modulan (es decir, mejoran o suprimen) la actividad de células T (por ejemplo, citotoxicidad y proliferación), como agentes de unión a glicoproteínas biliares, y métodos para usar tales composiciones, como para el tratamiento de enfermedades (por ejemplo, una inmunodeficiencia, cáncer, etc.).
La WO 2010/125571 del presente inventor divulga un anticuerpo monoclonal murino producido por una célula de hibridoma específica. El mAb es altamente selectivo para CEACAM1 y no presenta reacciones cruzadas con otros miembros de la familia CEACAM.
Ninguno de los anticuerpos conocidos que reconocen CEACAM1 tiene el espectro de especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales de la presente invención. Por tanto, hay una necesidad insatisfecha de proporcionar anticuerpos que reconozcan subconjuntos específicos de proteínas CEACAM que puedan usarse de manera diagnóstica y terapéutica en enfermedades que implican la expresión o activación de CEACAM.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente divulgación se refiere a anticuerpos monoclonales que reconocen un conjunto específico de subtipos de CEACAM. Ventajosamente, los anticuerpos de la invención muestran unión a CEACAM1. Los anticuerpos de la invención se caracterizan por tener combinaciones de marco y secuencia de CDR únicas y por unirse a epítopos recién identificados dentro de la molécula de CEACAM1. La especificidad única de los anticuerpos monoclonales de la presente invención amplía su utilidad terapéutica para el tratamiento y diagnóstico de tipos adicionales de enfermedades malignas e infecciones virales. La presente invención también proporciona polinucleótidos aislados, plásmidos y composiciones farmacéuticas que comprenden dichos anticuerpos.
Los anticuerpos monoclonales quiméricos de acuerdo con la presente invención tienen combinaciones específicas de CDR y poseen propiedades únicas y especificidad y potencia mejoradas sobre los anticuerpos anti CEACAM1 conocidos.
De acuerdo con la presente invención, se proporciona un anticuerpo monoclonal quimérico que reconoce CEACAM1 humana que comprende una región constante de cadena pesada humana seleccionada del grupo que consiste en: IgG1 humana, IgG2 humana e IgG3 humana; región kappa constante de cadena ligera humana; y un conjunto de seis secuencias de CDR seleccionadas del conjunto de las SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17 y 18, y el conjunto de las SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11 y 12.
De acuerdo con una realización, el anticuerpo monoclonal quimérico tiene secuencias de CDR expuestas en las SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17 y 18.
De acuerdo con otra realización, el anticuerpo monoclonal quimérico tiene secuencias de CDR expuestas en las SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11 y 12.
La presente divulgación se refiere a anticuerpos monoclonales aislados de células de hibridoma u otros sistemas biológicos, así como con anticuerpos monoclonales producidos de manera recombinante o sintética. Un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la presente divulgación puede contener una región constante de cualquier especie de mamífero incluyendo, pero no limitadas a, ratones, ratas y humanos. Un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la presente invención incluye un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo completamente humano, un anticuerpo xenogénico.
De acuerdo con algunas realizaciones particulares, la presente divulgación se refiere a un anticuerpo monoclonal que comprende:
i. una secuencia marco seleccionada del grupo que consiste en: IgG2a de ratón, IgG2b de ratón, IgG3 de ratón, IgG1 humana, IgG2 humana, IgG3 humana; y
ii. un conjunto de seis CDR que tienen secuencias expuestas en las SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17 y 18; o un conjunto de seis CDR que tienen secuencias expuestas en las SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11 y 12.
El anticuerpo monoclonal puede unirse con una afinidad de por lo menos aproximadamente 10-8 M a CEACAM1.
Los anticuerpos monoclonales de la presente divulgación pueden mostrar una unión específica a más de un subtipo de CEACAM1. Por tanto, un anticuerpo monoclonal de esta divulgación puede unirse a por lo menos dos subtipos diferentes de CEACAM, es decir, el anticuerpo monoclonal puede unirse a CEACAM1 y por lo menos uno de CEACAM3 y CEACAM5.
Un anticuerpo monoclonal puede unirse al mismo epítopo al que se une el anticuerpo quimérico anterior que tiene las secuencias de CDR expuestas en las SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17 y 18 o que tiene las secuencias de CDR expuestas en las SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11 y 12.
La presente invención también son moléculas de ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo de acuerdo con la invención, que tienen afinidad y especificidad por CEACAM1.
También se divulgan plásmidos que comprenden por lo menos una secuencia de polinucleótidos que codifica un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la invención.
De acuerdo con algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo monoclonal capaz de unirse a CEACAM1 con una afinidad de unión de por lo menos 10-8 kD.
La composición farmacéutica puede comprender un anticuerpo monoclonal capaz de unirse con una afinidad de por lo menos aproximadamente 10-8 kD a CEACAM1 y con una afinidad de por lo menos aproximadamente 5x10-7 M a por lo menos uno de CEACAM3 y CEACAM5.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la enfermedad o trastorno asociado con la expresión, activación o función de CEACAM1, CEACAM3 y/o CEACAM5 es una enfermedad o trastorno de proliferación celular. La enfermedad o trastorno de proliferación celular puede ser cáncer.
De acuerdo con algunas realizaciones, el cáncer puede seleccionarse del grupo que consiste en: gastrointestinal, colorrectal (CRC), pancreático, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCL), mama, tiroides, estómago, ovario y útero.
Los cánceres asociados con la sobreexpresión de CEACAM1 pueden ser melanoma, cáncer de páncreas, todos los tipos de cáncer de pulmón y mieloma.
La composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención puede administrarse como un tratamiento independiente o además de un tratamiento con cualquier otro agente terapéutico. Los anticuerpos de acuerdo con la presente invención pueden administrarse a un sujeto que los necesite como parte de un régimen de tratamiento junto con por lo menos un agente anticancerígeno. La composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención puede administrarse junto con el otro agente o por separado.
La presente divulgación también proporciona composiciones de diagnóstico útiles para detectar por lo menos un subtipo de CEACAM seleccionado del grupo que consiste en: CEACAM1, CEACAM3 y CEACAM5, en un sujeto. Una composición de diagnóstico puede comprender un anticuerpo monoclonal de la invención que tiene una afinidad de por lo menos aproximadamente 5 x 10-7 M por CEACAM1, CEACAM3 o CEACAM5.
De acuerdo con algunas realizaciones, la enfermedad o trastorno es una enfermedad o trastorno de proliferación celular. De acuerdo con ciertas realizaciones, la enfermedad o trastorno de proliferación celular es cáncer. De acuerdo con una realización específica, el anticuerpo monoclonal, o fragmento del mismo, tiene una afinidad de por lo menos aproximadamente 10-8 M por CEACAM1 y el cáncer es melanoma.
El anticuerpo monoclonal, o fragmento del mismo, puede tener una afinidad de por lo menos aproximadamente 5 x 10-7M por CEACAM5 y el cáncer se selecciona del grupo que consiste en: cáncer gastrointestinal, colorrectal (CRC), pancreático, de pulmón de células no pequeñas (NSCL), mama, tiroides, estómago, ovario, mieloma y útero.
La enfermedad o trastorno asociado con la sobreexpresión de CEACAM1 puede ser una infección viral. La infección viral puede estar provocada por un virus seleccionado del grupo que consiste en: virus de ADN como, pero no limitado a, citomegalovirus (CMV), adenovirus, virus de la hepatitis y virus del papiloma humano (HPV); y virus de ARN como, pero no limitado a, virus de la gripe y virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).
De acuerdo con la presente invención, la migración de una célula tumoral que expresa CEACAM puede inhibirse poniendo en contacto la célula tumoral que expresa CEACAM con el anticuerpo
La célula tumoral comprende una célula tumoral de melanoma.
La presente invención puede proporcionar un medio para inhibir la interacción proteína-proteína homotípica o heterotípica de CEACAM, que comprende poner en contacto un linfocito que expresa CEACAM1 con el anticuerpo o fragmento de anticuerpo, inhibiendo de este modo la interacción proteína-proteína homotípica o heterotípica de CEACAM1.
El anticuerpo monoclonal puede unirse a una fracción citotóxica.
La fracción citotóxica puede comprender una citotoxina, una quimiocina, una composición quimioterapéutica, un proapoptótico, un interferón, una fracción radiactiva o combinaciones de los mismos.
El anticuerpo puede unirse a una fracción identificable.
Las células del cáncer pueden caracterizarse por la sobreexpresión de CEACAM1 en comparación con las células no afectadas.
Los linfocitos pueden comprender células T o células NK. Los linfocitos pueden expresar CEACAM1. El linfocito que expresa CEACAM1 puede ser un linfocito infiltrante de tumores (TIL). El linfocito que expresa CEACAM1 puede ser una célula T citotóxica.
El anticuerpo de la presente invención puede usarse para bloquear CEACAM en una o ambas células efectoras inmunitarias (linfocitos que expresan CEACAM, por ejemplo, células infiltrantes de tumores, células T o células NK) y células objetivo (por ejemplo, células patológicas que expresan CEACAM, como células cancerosas). Los ejemplos de células cancerosas que son candidatas para esta terapia incluyen, pero no se limitan a, células de melanoma, pulmón, tiroides, mama, colon, próstata, hígado, vejiga, riñón, cuello uterino, páncreas, leucemia, linfoma, mieloide, ovario, útero, sarcoma, biliar o endometrio.
La presente invención puede proporcionar medios para hacer que una célula tumoral que expresa CEACAM sea susceptible a la inmunomodulación, que comprende poner en contacto la célula tumoral que expresa CEACAM (por ejemplo, célula de melanoma, pulmón, tiroides, mama, colon, próstata, hígado, vejiga, riñón, cuello uterino, páncreas, leucemia, linfoma, mieloide, ovario, útero, sarcoma, biliar o endometrial) con el anticuerpo descrito anteriormente, haciendo de este modo que la célula tumoral que expresa CEACAM sea susceptible a la inmunomodulación.
Adicional o alternativamente, la presente divulgación también prevé un método de inmunomodulación (por ejemplo, inhibición de la interacción proteína-proteína homotípica o heterotípica de CEACAM1), poniendo en contacto un linfocito que expresa CEACAM1 con el anticuerpo descrito en la presente.
Los anticuerpos de algunas realizaciones de la invención pueden tener actividad anticancerígena que es independiente de su actividad inmunomoduladora descrita anteriormente.
La presente divulgación también proporciona un método para aumentar la duración o la progresión de la respuesta o la supervivencia de un sujeto que tiene cáncer, que comprende administrar al sujeto cantidades eficaces de una composición que comprende un anticuerpo que reconoce CEACAM y una composición antineoplásica, en donde dicha composición antineoplásica comprende por lo menos un agente quimioterapéutico, por lo que la coadministración del anticuerpo y la composición antineoplásica aumenta eficazmente la duración o progresión de la respuesta o la supervivencia.
Aparte de las aplicaciones terapéuticas, los anticuerpos de la presente invención también pueden usarse en aplicaciones de diagnóstico.
Por tanto, de acuerdo con otro aspecto, se proporciona un método para diagnosticar un cáncer en un sujeto con necesidad de ello, el método comprendiendo poner en contacto una muestra biológica derivada del sujeto (in vitro o ex vivo) con el anticuerpo descrito en la presente, en donde una formación de complejos más allá de un umbral predeterminado es indicativa de cáncer en el sujeto. Las células del cáncer pueden caracterizarse por una sobreexpresión de CEACAM en comparación con las células no afectadas.
De acuerdo con una realización particular el cáncer diagnosticado se selecciona del grupo que consiste en: melanoma, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón y mieloma.
Como se ha mencionado, el método de la invención se lleva a cabo en condiciones suficientes para formar un inmunocomplejo; tales condiciones (por ejemplo, concentraciones, tampones, temperaturas, tiempos de reacción apropiados) así como los métodos para optimizar tales condiciones son conocidos por los expertos en la técnica, y los ejemplos se divulgan en la presente. Como se usa en la presente, la frase "inmunocomplejo" se refiere a un complejo que comprende el anticuerpo de la invención y la CEACAM. La determinación de una presencia o nivel del inmunocomplejo de la invención puede ser directa o mediante la detección de una fracción identificable (detectable) que puede unirse al anticuerpo.
El nivel del inmunocomplejo en la célula analizada (por ejemplo, una célula de un sujeto con necesidad del mismo) se compara con un umbral predeterminado. Se apreciará que el anticuerpo de la presente invención también puede usarse para medir la cantidad de CEACAM soluble en suero. Independientemente, el umbral puede determinarse sobre la base de un nivel de referencia conocido y/o un nivel en una célula o suero de control. La célula de control puede obtenerse de un sujeto sano de control (por ejemplo, un sujeto que no padece cáncer) o del mismo sujeto antes del inicio de la enfermedad o después del tratamiento. El sujeto de control es de la misma especie, por ejemplo, humano, puede coincidir con la misma edad, peso, sexo, etc. que el sujeto con necesidad del mismo.
Para facilitar el diagnóstico, las enseñanzas anteriores pueden combinarse con otros métodos de diagnóstico de cáncer que son bien conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, imagenología, pruebas moleculares y biopsias quirúrgicas.
De acuerdo con otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona un método para detectar o cuantificar la presencia de CEACAM. Por tanto, la presente divulgación también se refiere a métodos para diagnosticar afecciones asociadas con la expresión de CEACAM usando los presentes anticuerpos. Los anticuerpos de acuerdo con la presente invención también pueden usarse para configurar métodos de selección. Por ejemplo, puede construirse un ensayo ELISA para medir los niveles de polipéptido secretado o asociado a la célula usando los anticuerpos monoclonales mediante métodos estándar conocidos en la técnica.
Los anticuerpos de la presente invención también pueden usarse en ensayos de selección para evaluar los niveles de CEACAM en pacientes y para predecir la eficacia del tratamiento. Los ensayos de selección con los anticuerpos de la presente invención pueden permitir la determinación de los niveles de CEACAM y, por lo tanto, la predicción del resultado del tratamiento y la planificación de un régimen de tratamiento adecuado.
Se apreciará que dicha unión de anticuerpos y fracción identificable puede efectuarse usando conjugación química o mediante tecnología de ADN recombinante de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica.
La fracción identificable puede ser un miembro de una pareja de unión, que es identificable a través de su interacción con un miembro adicional de la pareja de unión y una marca que se visualiza directamente. En un ejemplo, el miembro de la pareja de unión es un antígeno que se identifica mediante un anticuerpo marcado correspondiente. En un ejemplo, el marcador es una proteína fluorescente o una enzima que produce una reacción colorimétrica.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de los presentes anticuerpos contra CEACAM1 para el diagnóstico o tratamiento de una enfermedad o trastorno proliferativo celular o relacionado con la angiogénesis o una infección viral.
De acuerdo con una realización, la enfermedad de proliferación celular es el melanoma.
De acuerdo con otras realizaciones, la enfermedad o trastorno de proliferación celular es un cáncer seleccionado del grupo que consiste en: gastrointestinal, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCL), colorrectal (CRC), pancreático, de mama, de tiroides, de estómago, de ovario, de útero y mieloma.
Esencialmente, todos los usos conocidos o previstos en la técnica anterior para los anticuerpos CEACAM1 pueden lograrse con los anticuerpos de la presente invención que han mostrado poseer una afinidad mejorada hacia estas proteínas y efectos inhibidores superiores e inmunomoduladores indirectos sobre las células portadoras de CEACAM1. Estos usos incluyen técnicas de diagnóstico, profilácticas y terapéuticas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 es una imagen de SDS-PAGE que muestra las cadenas ligera y pesada del anticuerpo quimérico CM10.
La Figura 2 muestra la curva de unión específica de CM10 a hCEACAM1 purificada.
La Figura 3 demuestra la unión específica de CM10 a CEACAM1 detectada mediante análisis de citometría de flujo.
La Figura 4 confirma que CM10 bloquea la interacción CEACAM1-CEACAM1 entre células.
Se midió mediante ELISA la secreción de IL-2 de ratón de células efectoras (células BW/221 que expresan CEACAM1) incubadas en presencia de varias concentraciones de CM10.
La Figura 5 muestra la mejora de CM10 de la actividad de eliminación específica de células de melanoma positivas para CEACAM1.
La Figura 6 demuestra que CM10 estimula la actividad de eliminación de los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL).
La Figura 7 demuestra que CM10 potencia la actividad de eliminación de células NK en líneas celulares de melanoma positivas para CEACAM1.
La Figura 8 el efecto inmunomodulador de CM10 inhibe el crecimiento tumoral in vivo. Las flechas indican el tiempo de administración (círculos CM10, triángulos TIL, cuadrados abiertos CM10 y TIL).
La Figura 9 es una presentación esquemática del modo de acción inmunomodulador de CM10.
La Figura 10 representa el nivel de intensidad de unión de CEACAM1 en tumores determinado por el anticuerpo anti CEACAM1.
La Figura 11 muestra la cuantificación de moléculas CM10 unidas por célula.
La Figura 12 confirma que CM10 no tiene efecto sobre la proliferación de PBMC. Los resultados representan tasas de proliferación medias de tres donantes para cada tratamiento.
La Figura 13 presenta el análisis FACS de la unión entre CM10 y las proteínas de la familia CEACAM.
CEACAM1,5, 6 y 8 fueron expresados por células 721.221 y CEACAM3 y 4 por células HEK293T.
La Figura 14 representa los resultados del ensayo de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) en líneas celulares de melanoma.
La Figura 15 demuestra que CM10 aumenta la secreción de granzima B de TIL en presencia de células de melanoma positivas para CEACAM1 y HLA-A2.
La Figura 16 muestra que CM10 bloquea las interacciones de CEACAM1-CEACAM5.
La Figura 17 presenta la mejora de CM10 de la eliminación de células T restringida por HLA.
La Figura 18 demuestra que la actividad inmunomoduladora de CM10 inhibe el crecimiento tumoral in vivo. La Figura 19: indica que CM10 mejora la actividad de eliminación de las células NK en las líneas celulares de cáncer de páncreas positivas para CEACAM1 COLO-357 y BXPC3.
La Figura 20: demuestra que CM10 mejora la secreción de granzima B de las células NK en presencia de líneas celulares de cáncer de páncreas positivas para CEACAM1.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona anticuerpos que reconocen CEACAM1 que comprenden conjuntos específicos de secuencias de CDR que poseen especificidad, selectividad, afinidad y/o actividad únicas y mejoradas.
Los anticuerpos de acuerdo con la presente invención se unen a CEACAM1 con mayor afinidad que otros anticuerpos anti-CEACAM1, bloquean la función de CEACAM1, mientras que no todos los anticuerpos anti-CEACAM lo hacen, y más eficientemente que los anticuerpos anti-CEACAM policlonales. Además, los anticuerpos de acuerdo con la presente invención son eficaces contra las células cancerígenas, en particular las células de melanoma: los anticuerpos hacen que las células de melanoma sean más susceptibles a los linfocitos, inhiben la tasa de crecimiento del melanoma in vivo, un efecto que se potencia cuando el anticuerpo se combina con transferencia de células T adoptivas in vivo.
Aquí se muestra por primera vez que el efecto antimelanoma in vivo de los anticuerpos anti-CEACAM1 de acuerdo con la invención es un efecto antitumoral directo combinado así como un efecto inmunomodulador que hace que las células sean más susceptibles a los linfocitos reactivos.
Un anticuerpo de acuerdo con la presente invención puede usarse como una herramienta eficaz para el diagnóstico, la inmunomodulación y el tratamiento del cáncer.
El anticuerpo inhibe las interacciones homófilas de CEACAM1, según se determina por coincubación de células efectoras inmunitarias y células objetivo que expresan CEACAM1 y analizando la secreción de IL-2 y mediante ensayos de eliminación in vitro.
Se muestra que el anticuerpo de la presente invención mejora CM10, mejora la eliminación de células T restringidas por HLA y mejora la secreción de granzima B (una proteasa de serina que interviene en la mediación de la apoptosis de las células objetivo) de las células T y NK efectoras en presencia de células objetivo específicas, permitiendo de este modo la eliminación mejorada observada de las células objetivo por el anticuerpo. También inhibe la unión entre CEACAM1 y CEACAM5 de manera dependiente de la dosis, por lo que puede usarse para tratar tumores malignos que expresan un alto nivel de CEACAM5 y explotan el eje CEACAM1-CEACAM5 para suprimir las células inmunitarias.
Además, en la presente se muestra que un anticuerpo de acuerdo con la invención es eficaz para inhibir la invasión de células de melanoma. Además, la administración in vivo de un anticuerpo de acuerdo con la invención, ya sea solo o en combinación con linfocitos reactivos, demostró ser eficaz para inhibir el crecimiento de tumores de melanoma. La combinación de transferencia adoptiva de células T humanas con inyecciones de anticuerpos monoclonales mostró un sinergismo significativo e inhibió fuertemente el crecimiento del xenoinjerto en comparación con el grupo de control de isotipo.
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un anticuerpo monoclonal que tiene la misma especificidad de unión y selectividad para un anticuerpo definido en la presente que comprende un dominio de reconocimiento de antígeno que tiene los segmentos de CDR específicos descritos anteriormente. El anticuerpo monoclonal es capaz de unirse al mismo determinante de epítopo de la proteína CEACAM1 que el anticuerpo quimérico descrito anteriormente por sus secuencias de segmentos de CDR específicas.
La secuencia propuesta de un epítopo al que se une un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la invención se divulga en la presente al mismo tiempo, junto con los péptidos aislados propuestos derivados de este epítopo que pueden usarse para producir anticuerpos monoclonales adicionales.
Los anticuerpos monoclonales (mAb) pueden diseñarse para dirigirse selectivamente a las células tumorales y provocar una variedad de respuestas una vez que se han unido. Estos agentes pueden destruir las células tumorales de diferentes maneras, como bloqueando la proliferación de células tumorales o activando el sistema inmunitario. Los anticuerpos monoclonales quiméricos de acuerdo con la presente invención se diseñaron para unirse y neutralizar específicamente varias funciones de la proteína CEACAM1 y otras proteínas del subtipo CEACAM, y para inducir la muerte específica de las células tumorales. Sin desear estar limitado por ninguna teoría, se sugiere que los anticuerpos monoclonales de acuerdo con la presente invención actúan también a través de la activación del sistema inmunitario contra las células cancerosas.
Tanto la evidencia clínica como la biológica destacan a CEACAM1 como un objetivo prometedor para el desarrollo de inmunoterapia dirigida. CEACAM1 no se encuentra en los melanocitos normales, pero experimenta una neoexpresión y se expresa ampliamente en la gran mayoría de los especímenes de melanoma metastásico. Se ha demostrado con anterioridad mecánicamente que CEACAM1 protege a las células de melanoma inhibiendo las funciones efectoras de las células NK y las células T.
En la presente se demuestra por primera vez que CM10 es un anticuerpo monoclonal quimérico que se une con gran afinidad a CEACAM1 humana. in vitro, CM10 bloqueó eficazmente las interacciones CEACAM1-homófilas de una manera dependiente de la dosis y mejora la eliminación de las células de melanoma positivas para CEACAM1 por células T y células NK. Además, CM10 inhibió significativamente el crecimiento in vivo de xenoinjertos de melanoma cuando se administró sistémicamente junto con linfocitos T humanos reactivos con melanoma (linfocitos infiltrantes de tumores, TIL). Sin querer estar limitados a ninguna teoría, esto está en línea con el mecanismo de acción sugerido; la anulación de las interacciones inmunoprotectoras de las células tumorales con los linfocitos activados.
Varias evidencias informaron que CEACAM1 se expresa en una amplia variedad de células epiteliales, incluyendo las de colon, próstata, mama, riñón, etc. Se realizó un examen exhaustivo del perfil de expresión de CEACAM1 en tejidos normales y malignos mediante IHC. El análisis de expresión mostró una fuerte tinción de las células de melanoma, en comparación con la ausencia de tinción de la gran mayoría de los tejidos probados en un tejido humano normal. Sin embargo, se observó alguna tinción selectiva en sitios restringidos de varios órganos. Cuando se usó un método más cuantitativo para cuantificar el número de moléculas de mAb CM10 unidas a células primarias malignas y normales, se pudieron detectar moléculas CM10 muy bajas en células normales, lo que puede indicar que CM10 se une principalmente a las células tumorales del paciente. Además se demostró que CM10 no tiene efecto sobre la proliferación de células primarias y es completamiento o casi completamente incapaz de inducir CDC o ADCC lo que indica la potencial seguridad del anticuerpo monoclonal en sujetos humanos.
Como CM10 tiene una actividad de inmunomodulación, se evalúan los posibles efectos secundarios relacionados con el sistema inmunitario. Después de la activación de PBMC, CEACAM1 se regula por incremento en los linfocitos activados (Gray-Owen y Blumberg 2006, Nat Rev Immunol 6, 433-46). El ensayo de proliferación de PBMC humanas ex vivo reveló que CM10 no tiene ningún efecto sobre la respuesta proliferativa de PBMC vírgenes y activadas.
La principal ventaja del bloqueo de CEACAM1 sobre la anulación de los mecanismos inhibidores generalizados es la selectividad esperada en la vecindad del tumor y, por lo tanto, menos eventos adversos en comparación con otros agentes de inmunotoxicidad general.
Como se demuestra en la presente invención, CM10 muestra un perfil de actividad y seguridad alentador y es un candidato prometedor para la inmunoterapia contra el cáncer y puede usarse como una estrategia para mejorar selectivamente las propiedades antitumorales de la respuesta inmunitaria endógena en varias enfermedades malignas, como melanoma y cáncer de pulmón de células no pequeñas.
La unión a subtipos de CEACAM adicionales aumenta el perfil terapéutico del anticuerpo, por lo que puede usarse para el diagnóstico y tratamiento de otros tipos de enfermedades malignas que no expresan CEACAM1 de forma extensiva pero expresan CEACAM5, por ejemplo.
Se ha descubierto que CEACAM5 se sobreexpresa en un alto porcentaje de muchos tumores humanos, incluyendo el 90% de los cánceres gastrointestinales, colorrectales (CRC) y pancreáticos, el 70% de las células de cáncer de pulmón de células no pequeñas y el 50% de los cánceres de mama. También se sobreexpresa en cánceres de tiroides, estómago, ovario y útero (Thompson, Grunert et al. 1991, J Clin Lab Anal 5, 344-66). CEACAM5 incluso sirve como marcador clínico para la metástasis hepática en CRC y la vigilancia posquirúrgica del cáncer de colon (Duffy 2001, Clin Chem 47, 624-30). La evidencia de que CM10 es capaz de unirse a CEACA5 es muy importante y puede ampliar las posibles indicaciones que puede tratar CM10 de 4-5 tipos de enfermedades malignas a más de 10. Los agentes anti-CEACAM5 que han entrado en ensayos clínicos incluyen anticuerpos anti-CEACAM5 conjugados con sustancias tóxicas como sustancias radiactivas tanto para propósitos de diagnóstico como para el tratamiento de varias enfermedades malignas. Parece que incluso estas formas conjugadas tóxicas no muestran problemas de seguridad, lo que puede indicar que CEACAM5 es un objetivo seguro.
Las contrapartidas humanas de las subclases de IgG murina se basan en similitudes en las actividades biológicas y funcionales. IgG2a e IgG2b murinas e IgG 1 e IgG3 humanas comparten la capacidad de fijar el complemento y unirse a antígenos de proteínas (Hussain et al., 1995, Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 726-732). Se considera que la IgG1 murina y la IgG4 humana son similares debido a su propiedad de unirse a los mastocitos. La IgG4 humana es la única subclase de IgG humana que no activa el complemento y las subclases IgG1 y 3 son las más eficaces para activar complementos. Para ratón, son las subclases IgG2a e IgG2b las que están activas con IgG1 y posiblemente IgG3 estando inactiva (Clark MR., Chem Immunol. 1997;65:88-110).
Varios anticuerpos monoclonales conocidos que reconocen CEACAM1 son del subtipo IgG 1 de ratón. Como el equivalente humano de la IgG1 de ratón es la IgG4, sería de esperar que se creara un anticuerpo quimérico que comprendiera el marco constante de la IgG4 humana. Inesperadamente, de acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, los anticuerpos monoclonales quiméricos comprenden un marco constante de IgG1 humana.
El sitio de unión del anticuerpo puede consistir en las seis CDR de las SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17 y 18. El sitio de unión del anticuerpo puede consistir en las seis CDR de las SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11 y 12. Las secuencias de CDR de acuerdo con la invención se identificaron usando dos métodos de algoritmos diferentes: algoritmo IMGT (Lefranc et al., 1999, Nucleic Acids Research, 27, 209-212); y algoritmo KABAT (Wu TT y Kabat E.A., 1970, J. Exp. Med. 132, 211-250). Se divulgan las secuencias reveladas por ambos métodos.
La presente divulgación también se refiere a un anticuerpo monoclonal que comprende un conjunto de seis CDR seleccionadas de i. las SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17 y 18 y ii. las SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11 y 12; y una secuencia marco seleccionada de IgG2a de ratón, IgG2b de ratón, IgG3 de ratón, IgG1 humana, IgG2 humana, IgG3 humana, en donde el anticuerpo monoclonal se une con una afinidad de por lo menos aproximadamente 5x10-7 M a por lo menos dos subtipos de CEACAM.
De acuerdo con una realización particular, se proporciona un anticuerpo monoclonal quimérico o humanizado que reconoce CEACAM1 que comprende un conjunto de seis CDR seleccionadas de i. las SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17 y 18 y ii. las SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11 y 12 y una subclase de región constante seleccionada de IgG 1 humana, IgG2 humana e IgG3 humana, en donde el anticuerpo monoclonal se une con una afinidad de por lo menos aproximadamente 5 x 10-7 M a por lo menos dos subtipos de CEACAM.
Definiciones
El término "CEACAM1" se usa para referirse al producto proteico del gen de CEACAM1, por ejemplo, NP_001020083.1, NP_001703.2. En humanos, hasta ahora se han detectado 11 variantes de corte y empalme de CEACAM1 diferentes. Las isoformas individuales de CEACAM1 difieren con respecto al número de dominios similares a inmunoglobulinas extracelulares (por ejemplo, CEACAM1 con cuatro dominios similares a inmunoglobulinas extracelulares se conoce como CEACAM1-4), anclaje a la membrana y/o la longitud de su cola citoplásmica (por ejemplo, CEACAM1-4 con una cola citoplasmática larga se conoce como CEACAM1-4L y CEACAM1-4 con una cola citoplasmática corta se conoce como CEACAM1-4S). El dominio N-terminal de CEACAM1 comienza inmediatamente después del péptido señal y su estructura se considera de tipo IgV. Por ejemplo, en la anotación P13688 de CEACAM1, el dominio de tipo IgV N-terminal se compone de 108 aminoácidos, del aminoácido 35 al 142. Este dominio se identificó como responsable de la actividad de unión homófila (Watt et al., 2001, Blood.
98, 1469-79). Todas las variantes, incluyendo estas variantes de corte y empalme, están incluidas dentro del término "CEACAM1".
Un "anticuerpo anti-CEACAM1", "un anticuerpo que reconoce CEACAM1", "un anticuerpo contra CEACAM1" o "un anticuerpo para CEACAM1" es un anticuerpo que se une a la proteína CEACAM1 con suficiente afinidad y especificidad. Típicamente, un anticuerpo de acuerdo con las presentes enseñanzas es capaz de unirse a CEACAM1 con una afinidad mínima de aproximadamente 10-8 o 10-9 M. Algunos de los anticuerpos monoclonales de la presente invención son capaces de unirse a CEACAM3, 5 y/u 8 con una afinidad mínima de aproximadamente 5x10-7 M.
Preferiblemente, el anticuerpo anti-CEACAM1 de la invención puede usarse como un agente de diagnóstico o terapéutico para dirigirse e interferir con enfermedades o afecciones en las que está implicada la expresión o actividad de CEACAM1.
Un "antígeno" es una molécula o una porción de una molécula capaz de provocar la formación de anticuerpos y unirse a un anticuerpo. Un antígeno puede tener uno o más de un epítopo. Se pretende que la reacción específica a la que se hace referencia anteriormente indica que el antígeno reaccionará, de manera altamente selectiva, con su anticuerpo correspondiente y no con la multitud de otros anticuerpos que pueden ser provocados por otros antígenos. Un antígeno de acuerdo con la presente invención es una proteína CEACAM1 o un fragmento de la misma.
El término "determinante antigénico" o "epítopo" de acuerdo con la invención se refiere a la región de una molécula de antígeno que reacciona específicamente con un anticuerpo particular. Las secuencias de péptidos derivadas de un epítopo pueden usarse, solas o junto con una fracción portadora, aplicando métodos conocidos en la técnica, para inmunizar animales y producir anticuerpos policlonales o monoclonales adicionales. Los péptidos aislados derivados de un epítopo pueden usarse en métodos de diagnóstico para detectar anticuerpos y como agentes terapéuticos cuando se requiere la inhibición de dichos anticuerpos.
Los anticuerpos, o inmunoglobulinas, comprenden dos cadenas pesadas enlazadas entre sí por enlaces disulfuro y dos cadenas ligeras, cada cadena ligera estando enlazada a una cadena pesada respectiva por enlaces disulfuro en una configuración con forma de "Y". La digestión proteolítica de un anticuerpo produce dominios Fv (fragmento variable) y Fc (fragmento cristalino). Los dominios de unión a antígeno, Fab, incluyen regiones en las que varía la secuencia polipeptídica. El término F(ab')2 representa dos brazos Fab' enlazados entre sí por enlaces disulfuro. El eje central del anticuerpo se denomina fragmento Fc. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (Vh) seguido de una serie de dominios constantes (Ch). Cada cadena ligera tiene un dominio variable (Vl) en un extremo y un dominio constante (Cl) en su otro extremo, el dominio variable de la cadena ligera estando alineado con el dominio variable de la cadena pesada y el dominio constante de la cadena ligera estando alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada (CH1). Los dominios variables de cada par de cadenas ligeras y pesadas forman el sitio de unión al antígeno. Los dominios de las cadenas ligera y pesada tienen la misma estructura general y cada dominio comprende cuatro regiones marco, cuyas secuencias están relativamente conservadas, unidas por tres dominios hipervariables conocidos como regiones determinantes de la complementariedad (CDR1-3). Estos dominios contribuyen a la especificidad y afinidad del sitio de unión al antígeno. El isotipo de la cadena pesada (gamma, alfa, delta, épsilon o mu) determina la clase de inmunoglobulina (IgG, IgA, IgD, IgE o IgM, respectivamente). La cadena ligera es de dos isotipos (kappa, k o lambda, A) encontrados en todas las clases de anticuerpos.
El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio e incluye anticuerpos monoclonales (incluyendo los anticuerpos monoclonales intactos o de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multivalentes, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpos siempre que muestren la actividad biológica deseada.
El anticuerpo o anticuerpos de acuerdo con la divulgación incluyen anticuerpos intactos, como anticuerpos monoclonales (mAb). Además, dentro del alcance de la invención se incluyen anticuerpos quiméricos; anticuerpos humanos y humanizados; anticuerpos recombinantes y manipulados. Además, el ADN que codifica la región variable del anticuerpo puede insertarse en el ADN que codifica otros anticuerpos para producir anticuerpos quiméricos.
Un "anticuerpo neutralizante", como se usa en la presente, se refiere a una molécula que tiene un sitio de unión a antígeno para un receptor específico o ligando objetivo capaz de reducir o inhibir (bloquear) la actividad o la señalización a través de un receptor, como se determina mediante ensayos in vivo o in vitro, según la memoria descriptiva.
El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que componen la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos y se dirigen contra un único antígeno. Además, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un único determinante en el antígeno. No debe interpretarse que el modificador "monoclonal" requiere la producción del anticuerpo mediante ningún método particular. Los mAb pueden obtenerse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, Kohler et al., Nature 1975, 256, 495, o pueden elaborarse mediante métodos de ADN recombinante (ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 4.816.567). Los “anticuerpos monoclonales” también pueden aislarse de bibliotecas de anticuerpos de fagos usando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature 1991,352, 624-628 o Marks et al., J. Mol. Biol., 1991,222:581-597, por ejemplo.
Los mAbs divulgados pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA. Un hibridoma que produce un mAb puede cultivarse in vitro o in vivo. Pueden obtenerse títulos elevados de mAbs en la producción in vivo donde las células de los hibridomas individuales se inyectan por vía intraperitoneal en ratones Balb/c cebados con prístina para producir líquido de ascitis que contiene altas concentraciones de los mAbs deseados. Los mAb de isotipo IgM o IgG pueden purificarse a partir de tales fluidos ascíticos, o a partir de sobrenadantes de cultivo, usando métodos de cromatografía en columna bien conocidos por los expertos en la técnica.
Los anticuerpos monoclonales de la presente incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpos particular, mientras que el resto de la cadena o cadenas son idénticas u homólogas a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de tales anticuerpos, siempre que muestren la actividad biológica deseada (Patente de Estados Unidos N° 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). Además, puede realizarse el injerto de la región determinante de la complementariedad (CDR) para alterar ciertas propiedades de la molécula de anticuerpo, incluyendo la afinidad o la especificidad. Un ejemplo no limitativo de injerto de CDR se divulga en la Patente de Estados Unidos 5.225.539.
Los anticuerpos quiméricos son moléculas cuyas diferentes porciones se derivan de diferentes especies animales, como las que tienen una región variable derivada de un mAb murino y una región constante de inmunoglobulina humana. A los anticuerpos que tienen residuos marco de la región variable sustancialmente de un anticuerpo humano (denominado anticuerpo aceptor) y regiones determinantes de la complementariedad sustancialmente de un anticuerpo de ratón (denominado anticuerpo donante) también se hace referencia como anticuerpos humanizados. Los anticuerpos quiméricos se usan principalmente para reducir la inmunogenicidad en la aplicación y aumentar los rendimientos en la producción, por ejemplo, cuando los mAbs murinos tienen rendimientos de hibridomas más altos pero inmunogenicidad más alta en humanos, de tal manera que se usan mAbs quiméricos humanos/murinos. Los anticuerpos quiméricos y los métodos para su producción son conocidos en la técnica (por ejemplo, Solicitudes de patente de PCT WO 86/01533, WO 97/02671, WO 90/07861, WO 92/22653 y Patentes de Estados Unidos 5.693.762, 5.693.761,5.585.089, 5.530.101 y 5.225.539).
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región hipervariable del receptor se reemplazan por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región marco (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo del receptor o en el anticuerpo del donante. Estas modificaciones se realizan para perfeccionar aún más el rendimiento de los anticuerpos. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de por lo menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los giros hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, consultar, Jones et al., Nature 1986, 321, 522­ 525; Riechmann et al., Nature 1988, 332, 323-329; y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 19922, 593-596.
Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un humano y/o se ha elaborado usando cualquiera de las técnicas para elaborar anticuerpos humanos como se divulga en la presente. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígenos no humanos. Los anticuerpos humanos pueden producirse usando varias técnicas conocidas en la técnica. En una realización, el anticuerpo humano se selecciona de una biblioteca de fagos, donde esa biblioteca de fagos expresa anticuerpos humanos (Vaughan et al. Nature Biotechnology 1996 14,309-314; Sheets et al. PNAS (USA), 1998, 95, 6157-6162); Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 1991, 227, 381; Marks et al., J. Mol. Biol., 1991, 222, 581). Los anticuerpos humanos también pueden elaborarse introduciendo loci de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, por ejemplo, ratones en los que los genes de inmunoglobulina endógena se han inactivado parcial o completamente. Tras el desafío, se observa la producción de anticuerpos humanos, que se asemeja mucho a la observada en humanos en todos los aspectos, incluyendo el reordenamiento de genes, el ensamblaje y el repertorio de anticuerpos. Este enfoque se describe, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos N° 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016, y en las siguientes publicaciones científicas: Marks et al, Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995). Alternativamente, el anticuerpo humano puede prepararse mediante la inmortalización de linfocitos B humanos que producen un anticuerpo dirigido contra un antígeno objetivo (tales linfocitos B pueden recuperarse de un individuo o se pueden haber inmunizado in vitro). Consultar, por ejemplo, Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)); Boerner et al., J. Immunol., 147 (1): 86-95 (1991); y Patente de Estados Unidos N° 5.750.373.
Los anticuerpos de acuerdo con la invención pueden obtenerse administrando CEACAM1, o fragmentos portadores de epítopos, análogos o células que expresan, a un animal, preferiblemente no humano, usando protocolos de rutina. Para la preparación de anticuerpos monoclonales, puede usarse cualquier técnica conocida en la técnica que proporcione anticuerpos producidos por cultivos continuos de líneas celulares. Los ejemplos incluyen diversas técnicas, como las de Kohler, G. y Milstein, C., Nature 256: 495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al., pág. 77-96 en MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc. (1985).
Además del método convencional de generar anticuerpos in vivo, los anticuerpos pueden generarse in vitro usando la tecnología de presentación en fagos. Tal producción de anticuerpos recombinantes es mucho más rápida en comparación con la producción de anticuerpos convencional y pueden generarse contra una enorme cantidad de antígenos. Además, cuando se usa el método convencional, muchos antígenos resultan no inmunogénicos o extremadamente tóxicos y, por lo tanto, no pueden usarse para generar anticuerpos en animales. Además, la maduración de la afinidad (es decir, el aumento de la afinidad y la especificidad) de los anticuerpos recombinantes es muy sencilla y relativamente rápida. Finalmente, pueden generarse grandes cantidades de anticuerpos diferentes contra un antígeno específico en un procedimiento de selección. Para generar anticuerpos monoclonales recombinantes pueden usarse varios métodos, todos ellos basados en bibliotecas de presentación para generar un gran conjunto de anticuerpos con diferentes sitios de reconocimiento de antígenos. Tal biblioteca puede elaborarse de varias maneras: puede generarse un repertorio sintético mediante la clonación de regiones de CDR3 sintéticas en un grupo de genes de línea germinal de cadena pesada y generar de este modo un repertorio de anticuerpos grande a partir del cual pueden seleccionarse fragmentos de anticuerpos recombinantes con varias especificidades. Puede usarse la agrupación de linfocitos humanos como material de partida para la construcción de una biblioteca de anticuerpos. Es posible construir repertorios vírgenes de anticuerpos de IgM humanos y crear por tanto una biblioteca humana de gran diversidad. Este método ha sido ampliamente usado con éxito para seleccionar un gran número de anticuerpos frente a diferentes antígenos. Los protocolos para la construcción de bibliotecas de bacteriófagos y la selección de anticuerpos recombinantes se proporcionan en el texto de referencia bien conocido Current Protocols in Immunology, Colligan et al (Eds.), John Wiley & Sons, Inc. (1992-2000), Capítulo 17, Sección 17.1.
Los anticuerpos no humanos pueden humanizarse mediante cualquier método conocido en la técnica. En un método, se insertan regiones determinantes de la complementariedad (CDR) no humanas en una secuencia marco de un anticuerpo humano o de un anticuerpo de consenso. Luego pueden introducirse cambios adicionales en el marco del anticuerpo para modular la afinidad o la inmunogenicidad.
Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos 5.585.089 de Queen et al. divulga una inmunoglobulina humanizada y métodos para preparar la misma, en donde la inmunoglobulina humanizada comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de una inmunoglobulina donante y marcos de región variable de cadena pesada y ligera de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina aceptora humana, en donde dicha inmunoglobulina humanizada comprende aminoácidos del marco de la inmunoglobulina donante fuera de las CDR de Kabat y Chothia, en donde los aminoácidos del donante reemplazan a los aminoácidos correspondientes en los marcos de la cadena ligera o pesada de la inmunoglobulina aceptora.
La Patente de Estados Unidos 5.225.539, de Winter, también divulga un anticuerpo alterado o un fragmento de unión a antígeno del mismo y métodos para prepararlo, en donde un dominio variable del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno tiene las regiones marco de un primer dominio variable de cadena ligera o pesada de inmunoglobulina y las regiones determinantes de la complementariedad de un segundo dominio variable de cadena pesada o ligera de inmunoglobulina, en donde dicho segundo dominio variable de cadena pesada o ligera de inmunoglobulina es diferente de dicho primer dominio variable de cadena pesada o ligera de inmunoglobulina en especificidad de unión a antígeno, afinidad de unión a antígeno, especie, clase o subclase.
También se incluyen anticuerpos anti-idiotipo específicamente inmunorreactivos con un anticuerpo de la invención.
Alternativamente, la tecnología de presentación en fagos puede utilizarse para seleccionar genes de anticuerpos con actividades de unión hacia un polipéptido de la invención, ya sea a partir de repertorios de genes v amplificados por PCR de linfocitos de humanos seleccionados para que posean anti-CEACAM1 o de bibliotecas (McCafferty, et al., 1990, Nature 348, 552-554; Marks, et al., 1992, Biotechnology 10, 779-783). La afinidad de estos anticuerpos también puede mejorarse, por ejemplo, mediante transposiciones de cadenas (Clackson et al., 1991, Nature 352:628).
Los anticuerpos descritos anteriormente pueden emplearse para aislar o identificar clones que expresan los polipéptidos para purificar los polipéptidos, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad.
Un "trastorno" es cualquier condición que se beneficiaría del tratamiento con el anticuerpo. Esto incluye trastornos o enfermedades crónicas y agudas que incluyen aquellas afecciones patológicas que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión. Los ejemplos no limitativos de trastornos a tratar en la presente incluyen tumores benignos y malignos; leucemias y enfermedades malignas linfoides; trastornos neuronales, gliales, astrocitos, hipotalámicos y otros glandulares, macrofágicos, epiteliales, estromales y blastocélicos; y trastornos inflamatorios, angiogénicos, inmunológicos o estados de hiperpermeabilidad.
El término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un fármaco eficaz para tratar una enfermedad o trastorno en un mamífero. En el caso del cáncer, la cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco puede reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño del tumor; inhibir (es decir, ralentizar hasta cierto punto y preferiblemente detener) la infiltración de células cancerosas en los órganos periféricos; inhibir (es decir, ralentizar hasta cierto punto y preferiblemente detener) la metástasis tumoral; inhibir, hasta cierto punto, el crecimiento tumoral; y/o aliviar hasta cierto punto uno o más de los síntomas asociados con el trastorno. En la medida en que el fármaco pueda prevenir el crecimiento y/o eliminar las células cancerosas existentes, puede ser citostático y/o citotóxico. Para la terapia del cáncer, la eficacia in vivo puede medirse, por ejemplo, evaluando la duración de la supervivencia, el tiempo hasta la progresión de la enfermedad (TTP), las tasas de respuesta (RR), la duración de la respuesta y/o la calidad de vida.
"Tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya padecen el trastorno, así como aquellos en los que se debe prevenir el trastorno.
Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren o describen la condición fisiológica en mamíferos que típicamente se caracteriza por un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen melanoma, cáncer de pulmón, tiroides, mama, colon, próstata, hígado, vejiga, riñón, cuello uterino, páncreas, leucemia, linfoma, mieloide, ovario, útero, sarcoma, biliar o endometrio.
El anticuerpo de la presente invención puede unirse a una fracción citotóxica o terapéutica. La fracción citotóxica o terapéutica puede ser, por ejemplo, una fracción citotóxica, una fracción tóxica, una fracción de citoquina, una fracción de anticuerpo biespecífico, una citotoxina, una quimiocina, una quimioterapia, un proapoptótico, interferón, una fracción radiactiva, o combinaciones de los mismos, ejemplos de los cuales se proporcionan a continuación.
El término "composición antineoplásica" se refiere a una composición útil en el tratamiento del cáncer que comprende por lo menos un agente terapéutico activo capaz de inhibir o prevenir el crecimiento o la función tumoral y/o provocar la eliminación de las células tumorales. Los agentes terapéuticos adecuados en una composición antineoplásica para tratar el cáncer incluyen, pero no se limitan a, agentes quimioterapéuticos, isótopos radiactivos, toxinas, citoquinas como interferones, y agentes antagonistas dirigidos a citoquinas, receptores de citoquinas o antígenos asociados con células tumorales. El agente terapéutico puede ser un agente quimioterapéutico.
Como se usa en la presente, el término "diagnosticar" se refiere a determinar la presencia o ausencia de una patología, clasificar una patología o un síntoma, determinar la gravedad de la patología, monitorizar la progresión de la patología, pronosticar el resultado de una patología y/o las perspectivas de recuperación.
Farmacología
La presente invención también contempla formulaciones farmacéuticas para uso médico humano, que comprenden como agente activo por lo menos un anticuerpo que reconoce CEACAM1, para la fabricación de una composición terapéutica o de diagnóstico para el tratamiento, diagnóstico o profilaxis de las varias afecciones descritas en la presente.
En tales formulaciones farmacéuticas y de medicamentos, el principio activo se utiliza preferiblemente junto con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables. El portador o portadores deben ser farmacéuticamente aceptables en el sentido de ser compatibles con los demás ingredientes de la formulación y no indebidamente perjudiciales para el receptor de la misma. El agente activo se proporciona en una cantidad eficaz para lograr el efecto farmacológico deseado, como se ha descrito anteriormente, y en una cantidad adecuada para lograr la dosis diaria deseada.
Típicamente, las moléculas de la presente invención que comprenden la porción de unión a antígeno de un anticuerpo o que comprenden otro polipéptido que incluye un peptidomimético se suspenderán en una solución salina estéril para usos terapéuticos. Las composiciones farmacéuticas pueden formularse alternativamente para controlar la liberación del ingrediente activo (molécula que comprende la porción de un anticuerpo que se une al antígeno) o para prolongar su presencia en el sistema de un paciente. Se conocen numerosos sistemas adecuados de administración de fármacos e incluyen, por ejemplo, sistemas implantables de liberación de fármacos, hidrogeles, hidroximetilcelulosa, microcápsulas, liposomas, microemulsiones, microesferas y similares. Las preparaciones de liberación controlada pueden prepararse mediante el uso de polímeros para formar complejos o adsorber la molécula de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, los polímeros biocompatibles incluyen matrices de poli(etilen-coacetato de vinilo) y matrices de un copolímero de polianhídrido de un dímero de ácido esteárico y ácido sebárico. La velocidad de liberación de la molécula de acuerdo con la presente invención, es decir, de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, de dicha matriz depende del peso molecular de la molécula, la cantidad de la molécula dentro de la matriz y el tamaño de las partículas dispersadas.
La composición farmacéutica de esta invención puede administrarse por cualquier medio adecuado, como por vía oral, tópica, intranasal, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraarticular, intralesional o parenteral. Normalmente, se preferirá la administración intravenosa (i.v.), intraarticular, tópica o parenteral.
Será evidente para los expertos en la técnica que la cantidad terapéuticamente eficaz de la molécula de acuerdo con la presente invención dependerá, entre otras cosas, del programa de administración, la dosis unitaria de molécula administrada, si la molécula se administra en combinación con otros agentes terapéuticos, el estado inmunitario y de salud del paciente, la actividad terapéutica de la molécula administrada y el criterio del médico tratante. Como se usa en la presente, una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de una molécula requerida para aliviar uno o más síntomas asociados con un trastorno que se está tratando durante un período de tiempo.
Aunque una dosificación apropiada de una molécula de la invención varía dependiendo de la vía de administración, el tipo de molécula (polipéptido, polinucleótido, molécula orgánica, etc.), la edad, el peso corporal, el sexo o las condiciones del paciente, y debe ser determinada por el médico al final, en el caso de la administración oral, la dosificación diaria puede estar generalmente entre aproximadamente 0,01 mg y aproximadamente 500 mg, preferiblemente entre aproximadamente 0,01 mg y aproximadamente 50 mg, más preferiblemente entre aproximadamente 0,1 mg y aproximadamente 10 mg, por kg de peso corporal. En el caso de la administración parenteral, la dosificación diaria puede estar generalmente entre aproximadamente 0,001 mg y aproximadamente 100 mg, preferiblemente entre aproximadamente 0,001 mg y aproximadamente 10 mg, más preferiblemente entre aproximadamente 0,01 mg y aproximadamente 1 mg, por kg de peso corporal. La dosificación diaria puede administrarse, por ejemplo, en regímenes típicos de 1-4 administraciones individuales diarias. Otros métodos preferidos de administración incluyen la administración intraarticular de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 100 mg por kg de peso corporal. Se describen varias consideraciones para llegar a una cantidad eficaz, por ejemplo, en Goodman y Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8a ed., Pergamon Press, 1990; y Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a ed., Mack Publishing Co., Easton, Pensilvania, 1990.
Los regímenes de dosificación adecuados de quimioterapias combinadas se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en Saltz et al. Proc ASCO 1999, 18, 233a y Douillard et al., Lancet 2000, 355, 1041 -7.
Las moléculas de la presente invención como ingredientes activos se disuelven, dispersan o mezclan en un excipiente que sea farmacéuticamente aceptable y compatible con el ingrediente activo como es bien conocido. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato (PBS), dextrosa, glicerol, etanol o similares y combinaciones de los mismos. Otros portadores adecuados son bien conocidos por los expertos en la técnica. Además, si se desea, la composición puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponadores del pH.
La composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención puede administrarse junto con una composición antineoplásica. De acuerdo con una realización específica, la composición antineoplásica comprende por lo menos un agente quimioterapéutico. El agente de quimioterapia, que podría administrarse junto con el anticuerpo de acuerdo con la presente invención, o por separado, puede comprender cualquier agente conocido en la técnica que muestre actividad anticancerígena, incluyendo pero no limitados a: mitoxantrona, inhibidores de la topoisomerasa, vinca venenosa de huso: vinblastina, vincristina, vinorelbina (taxol), paclitaxel, docetaxel; agentes alquilantes: mecloretamina, clorambucilo, ciclofosfamida, melfalán, ifosfamida; metotrexato; 6-mercaptopurina; 5-fluorouracilo, citarabina, gemcitabina; podofilotoxinas: etopósido, irinotecán, topotecán, dacarbazina; antibióticos: doxorrubicina (adriamicina), bleomicina, mitomicina; nitrosoureas: carmustina (BCNU), lomustina, epirrubicina, idarrubicina, daunorrubicina; iones inorgánicos: cisplatino, carboplatino; interferón, asparaginasa; hormonas: tamoxifeno, leuprolida, flutamida y acetato de megestrol.
El agente quimioterapéutico puede seleccionarse del grupo que consiste en agentes alquilantes, antimetabolitos, análogos de ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina e inhibidores relacionados, alcaloides de la vinca, epipodofilotoxinas, antibióticos, L-asparaginasa, inhibidor de topoisomerasa, interferones, complejos de coordinación de platino, urea sustituida con antracenodiona, derivados de metilhidrazina, supresores adrenocorticales, adrenocorticosteroides, progestinas, estrógenos, antiestrógenos, andrógenos, antiandrógenos y análogos de la hormona liberadora de gonadotropina. El agente quimioterapéutico puede seleccionarse además del grupo que consiste en 5-fluorouracilo (5-FU), leucovorina (LV), irenotecán, oxaliplatino, capecitabina, paclitaxel y doxetaxel. Pueden usarse dos o más agentes quimioterapéuticos en un cóctel para ser administrados en combinación con la administración del anticuerpo anti-CEACAM1.
Se pretende que los siguientes ejemplos ilustren cómo elaborar y usar los compuestos y métodos de esta invención y de ninguna manera deben interpretarse como una limitación. Aunque ahora se describirá la invención junto con realizaciones específicas de la misma, es evidente que para los expertos en la técnica serán evidentes muchas modificaciones y variaciones.
EJEMPLOS
Los medios para preparar y caracterizar anticuerpos son bien conocidos en la técnica. Sigue una descripción para ejemplificar técnicas para la producción, caracterización y uso de anticuerpos anti-CEACAM1 de acuerdo con la presente invención.
Generalmente, la nomenclatura usada en la presente y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invención incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de ADN recombinante. Tales técnicas están explicadas detalladamente en la bibliografía. Consultar, por ejemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., 1989; "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. 1994; Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland 1989; Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York 1988; Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York 1998; metodologías como las expuestas en las Patentes de Estados Unidos N2 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 y 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volúmenes I-III Cellis, J. E., ed. 1994; "Current Protocols in Immunology" Volúmenes I-III Coligan J. E., ed. 1994; Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8a Edición), Appleton & Lange, Norwalk, CT 1994; Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York 1980; los inmunoensayos disponibles están descritos ampliamente en la bibliografía de patentes y científica, consultar, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N2. 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 y 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds.
1985; "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. 1984; "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. 1986; "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., 1984 y "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA 1990; Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press 1996. Se cree que los procedimientos descritos en la misma son bien conocidos en la técnica.
Ejemplo 1: Generación y caracterización de anticuerpos monoclonales que reconocieron CEACAM
Se generaron anticuerpos monoclonales que bloquean eficazmente las interacciones homófilas de CEACAM1 in vitro a concentraciones nanomolares inmunizando ratones con proteína CEACAM1 humana recombinante. Se produjeron hibridomas que producían los anticuerpos bloqueantes de CEACAM1 y se volvieron a clonar varias veces para producir un clon estable.
La secuencia de aminoácidos y ADN de un anticuerpo monoclonal ejemplar que reconoce CEACAM1 fue determinada por Fusion Antibodies Ltd. El ARNm se extrajo de los sedimentos de células de hibridoma y el ARN total se extrajo de los sedimentos usando el protocolo de extracción de ARN. Se creó RT-PCR-ADNc a partir del ARN mediante transcripción inversa con un cebador oligo(dT). Se usaron reacciones de PCR usando cebadores de dominio variable para amplificar las regiones de VH y VL del ADN del anticuerpo monoclonal.
Los productos de VH y VL se clonaron en el vector de secuenciación pCR2.1 de Invitrogen y se transformaron en TOP10 para transformantes positivos. Las colonias seleccionadas se recogieron y analizaron mediante secuenciación. Las secuencias de ADN y aminoácidos resultantes determinadas son:
Cadena pesada variable (VH)
Secuencia de ADN del dominio VH:
ATGGGATGGACCTTGGTCTTTCTCTTTCTCCTGTCAGTAACTGCAGGTGTTCACTC CCAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGTAAGGCCTGGGACTTCAGT GAAGGTGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACGCCTTCACTAATAACTTGATAGAGTGG GTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGCCTTGAGTGGATTGGAGTGATTAATCCTGGA AGT GGT G AT AC T A ACT AC A AT GAGA AGTTC A AGGGC A AGGC A AC AC T GAC T GC A GACAAATCCTCCAACACTGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGATGACT CTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAGGGGATTACTACGGTGGCTTTGCTGTGGACTA CTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCC GTTTATCCCTTGGCCCCTGGAAGCTTGGG (SEQ ID NO: 25).
Secuencia de aminoácidos del dominio VH:
QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNNLIEWVKQRPGQGLEWIGVINPGSG DTN YNEKFKGK ATLT ADK S SNT A YMQL S SLT SDD S A VYF C ARGD Y Y GGF A VD YW G QGTSVTYSS (SEQ ID NO: 26).
Cadena ligera variable (VL)
Secuencia de ADN del dominio VL:
ATGGTGTCCTCAGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGAACCAG ATGTGATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGAC AGAGTCACCATCAGTTGCAGGACAAGTCAGGACATTGGCAATTATTTAAACTGG T AT C AGC AGA A AC C AGAT GGA ACT GTT A A AC T C CTGAT C T AC T AC AC AT C A AGAT TACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTC TCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAG GGTAAAAGCCTTCCTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGTTGGAAATCAAACGG GCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACAT CTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAGAGA (SEQ ID NO: 27).
Secuencia de aminoácidos del dominio VL:
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRTSQDIGNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGV PSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGKSLPRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 28).
Se usaron la secuenciación de aminoácidos N-terminal y el análisis de espectros de masas para confirmar las identidades de VL y VH.
Ejemplo 2: Verificación de la secuencia de aminoácidos N-terminal
El análisis de la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera se realizó mediante el método de degradación de Edman para verificar la secuencia N-terminal de la cadena ligera de uno de los anticuerpos monoclonales. La secuencia N-terminal obtenida fue: DIQMTQTTSS (SEQ ID NO: 29), que está de acuerdo con la secuencia N-terminal esperada basada en la secuencia de ADN.
Ejemplo 3: Secuencias de regiones determinantes de la complementariedad (CDR)
Los segmentos de CDR se identificaron usando dos métodos de algoritmo diferentes:
1. Algoritmo IMGT (Lefranc et al., 1999, Nucleic Acids Research, 27, 209-212);
2. Algoritmo KABAT (Wu TT y Kabat EA, 1970, J. Exp. Med. 132, 211-250).
La Tabla 1 resume las secuencias de CDR determinadas usando los dos métodos así como la secuencia de consenso mínima y la secuencia combinada de secuencias identificadas usando ambos métodos.
Figure imgf000018_0001
Ejemplo 4: Diseño y producción de un anticuerpo monoclonal quimérico
Se usó la secuencia de ADN de las cadenas pesada y ligera variables (SEQ ID NO 25 y 27) para construir un anticuerpo quimérico, que comprende los dominios constantes del isotipo IgG1 humano y el dominio IgKappa humano ligero constante (CL). Aunque el anticuerpo monoclonal original es IgG1 de ratón y su equivalente humano es IgG4, se usó un marco de IgG1 humano para construir algunos de los anticuerpos quiméricos de la presente invención. Las secuencias de ADN para la cadena ligera y la cadena pesada se sintetizaron y clonaron en el vector de expresión pFUSION-DHFR1 bajo promotores separados.
Transfección transitoria de células CHO
Se cultivaron células CHO en suspensión (Invitrogen, Reino Unido) a 130 rpm, CO2 al 8%, 37° C en medio libre de suero Pro CHO 5 (Lonza, Reino Unido) en matraces Erlenmeyer ventilados de 250 y 500 ml (Corning, Países Bajos). El día de la transfección, las células se sembraron a una densidad de 2,0 x 106 células/ml, se transfectaron 2,5 g/ml de ADN plasmídico (Geneart, Alemania) en las células usando polietilenimina (Polysciences Inc, PA, US). Los cultivos transfectados se incubaron a 130 rpm, CO2 al 8%, 37° C durante 9-10 días. Antes de la recogida del cultivo, los sobrenadantes se centrifugaron a 4000 rpm durante 40 minutos.
El medio se recogió y purificó en dos lotes separados. El medio se filtró a través de un filtro girodisco de 0,8 gm y se purificó usando una columna de Proteína A de 1 ml. El anticuerpo se purificó por FPLC. Se cargaron 320 ml de muestra a 0,2 ml/min durante la noche y se aumentó a 0,5 ml/min después de 17 horas. La columna se lavó/equilibró con PBS a 0,5 ml/min antes de la elución con tampón de elución de pH 3,0 Gly/HCL. Se observó un buen pico y las fracciones 1 a 5 se cuantificaron mediante ensayo de Bradford. El ensayo de Bradford mostró proteína presente en las fracciones 1-4 que se agruparon y dializaron para intercambio de tampón durante la noche en 1 litro de PBS (4° C, 120 RPM). Se observó una concentración de 1,823 mg/ml para la muestra de 4 ml, por lo que se purificó un rendimiento total de aproximadamente 7,32 mg. En el segundo lote, los resultados del ensayo de Bradford mostraron proteína presente en las fracciones 1-3 que se agruparon y dializaron. A partir de los 320 ml de medio acondicionado se purificó un rendimiento total de aproximadamente 7,32 mg (lote A). A partir de un cultivo de 910 ml se purificó un rendimiento total de aproximadamente 15,74 mg (lote B). La expresión transitoria total produjo aproximadamente 23 mg de proteína purificada. Después de las determinaciones de concentración y el análisis SDS/PAGE, se produjeron 19,65 mg del anticuerpo quimérico. Las muestras de anticuerpos purificados se analizaron mediante SDS-PAGE para evaluar la pureza. La Figura 1 representa la imagen del gel SDS-PAGE que muestra las cadenas ligera y pesada del anticuerpo quimérico. El análisis de MS reveló que el peso molecular de la cadena pesada de CM10 es de 48,6 KDa y el de la cadena ligera es de 23,3 KDa.
El anticuerpo resultante, denominado CM10, tiene la siguiente secuencia de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera:
Secuencia de aminoácidos de cadena pesada (sin péptido señal):
OVOLOOSGAELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNNLIEWVKORPGOGLEWIGVINPGSG DTNYNEKFKGKATLTADKSSNTAYMOLSSLTSDDSAVYFCARGDYYGGFAVDYWG QGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFP AVLQS SGLY SLS S VYTVPS S SLGTQT YICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT CP PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRW S YLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSRDELTKNQV SLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 30).
El dominio variable está en negrita, las CDR de acuerdo con IMGT están subrayadas.
Secuencia de aminoácidos de cadena ligera (sin péptido señal):
DIOMTOTTSSLSASLGDRVTISCRTSODIGNYLNWYOOKPDGTVKLLIYYTSRLHSG VPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEOEDIATYFCOOGKSLPRTFGGGTKLEIKRTVAAPSV FIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:31)
El dominio variable está en negrita, las CDR de acuerdo con IMGT están subrayadas.
El 28 de septiembre de 2011 se depositó un plásmido que contiene las secuencias de ADN de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo monoclonal quimérico ejemplar denominado CM10 con el número de acceso de la ATCC PTA-12130.
Ejemplo 5: Caracterización de la afinidad del anticuerpo monoclonal quimérico CM10
Unión de CM10 a CEACAM1 humano purificado
La especificidad de unión de CM10 a CEACAM1 humana se analizó en un ensayo ELISA usando CEACAM1 humana purificada. Se usó ELISA indirecto usando 23 diluciones dobles de CM10 para generar la curva de unión específica. Los resultados mostrados en la Figura 2 representan la DO media por triplicado ± SE. Se obtuvieron resultados similares de otros diez experimentos independientes.
Para comprobar si el proceso de quimerización afectaba a la afinidad de unión del anticuerpo, se evaluó la unión de CEACAM1 al anticuerpo quimérico CM10 mediante ELISA competitivo y mediante análisis BIAcore.
Para el ELISA, se unió a la placa CEACAM1 humano recombinante purificado. El CM10 químicamente biotinilado se usó como trazador a una concentración constante y se hizo competir con concentraciones crecientes de CM10 sin marcar. Después de la incubación y el lavado, la placa se desarrolló con un conjugado de estrepavidina-HRP y la reacción de color se desarrolló con TMB como sustrato de HRP.
Usando 50 ng/ml de trazador, los valores de afinidad aparente detectados por CM10 fueron de 1,2-1,6 nM. Análisis BIAcore
Cada anticuerpo se inmovilizó en un único canal de un chip sensor CM5 del instrumento Biacore3000 mediante química de acoplamiento NHS-EDC.
Se hizo fluir CEACAM1 recombinante a 50 pl/min sobre el chip a varias concentraciones (0,19, 0,39, 0,78, 1,56, 3,12, 6,25, 12,5 y 25 nM). El tampón de funcionamiento fue PBS-ET (tampón p 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3,4 mM y 0,005% de tween 20). Los datos se analizaron usando el software BIAEvaluation 3.0 y los valores KD de afinidad CM10-CEACAM1, calculados a partir de tres experimentos independientes fueron (KD): 4,07-5,05 nM (promedio 4,56 nM).
Especificidad de unión de CM10 a CEACAM1 endógeno unido a la membrana
Para probar la unión de CM10 a CEACAM1 endógeno unido a la membrana, se realizó un análisis FACS. Se seleccionaron varias líneas celulares de melanoma humano para determinar la expresión de hCEACAM1 mientras que como control positivo se usó la línea celular 526mel y 003mel como línea de control negativo. Las líneas celulares 526mel, 003mel, Malme 3M, Skmel 5 y A375 se tiñeron con CM10. Los histogramas vacíos representan la tinción de mAb, mientras que los histogramas más oscuros representan la tinción de fondo. Se usaron por lo menos 5000 células para analizar la expresión de CEACAM1 en cada histograma.
Como puede apreciarse en la Figura 3, CM10 detecta CEACAM1 endógeno unido a la membrana. Las líneas celulares Malme3M y Skmel5 mostraron una alta expresión de CEACAM1 mientras que no se pudo detectar expresión en la línea celular de melanoma A375.
Conclusión
El proceso de quimerización se llevó a cabo con éxito. El anticuerpo quimérico se une a CEACAM1 con una afinidad de 1,4 nM según se validó mediante dos enfoques diferentes. El análisis FACS que prueba la especificidad de unión de CM10 a varias líneas celulares de melanoma demuestra que el anticuerpo conserva su capacidad de unión biológica.
Ejemplo 6. Evaluación de la actividad de CM10
Ensayo de interacción célula-célula de bloqueo
El ensayo que determina la capacidad del mAb anti CEACAM1 para bloquear la interacción célula-célula de CEACAM1 usa células T murinas (células BW) que se transfectan de manera estable con una molécula quimérica compuesta por la porción extracelular de CEACMA1 humana fusionada con la cadena z de ratón (BW/ CEACAM1). El acoplamiento de CEACAM1 mediante la coincubación de células BW/CEACAM1 con células B transfectadas de manera estable con CEACAM1 (221/CEACAM1) lleva a la secreción de IL-2 de ratón, mediada por la cadena z.
Las células efectoras (BW, que expresan CEACAM1) se incubaron en presencia de CM10 o PBS durante 30 minutos en hielo. Después de la incubación, las células efectoras se cocultivaron durante la noche con células objetivo que expresan CEACAM1 (221+) o negativas para CEACAM1 (221-). La secreción de IL-2 de ratón se midió mediante ELISA comercial. Los resultados mostrados en la Figura 4 representan la secreción media de IL-2 de pocillos duplicados. Como se muestra en la figura, tras la adición de CM10, las interacciones célula-célula mediadas por CEACAM1 entre las células T y B se abolieron de una manera dependiente de la dosis, como lo indica el bloqueo de la secreción de IL-2.
Ensayos de eliminación inmunomoduladora in vitro
Ensayo de eliminación de células T: las células T reactivas al melanoma TIL (Linfocitos infiltrantes de tumores, derivados de pacientes con melanoma) pueden destruir células de melanoma con HLA coincidente. Los TIL se adquirieron del Instituto ELLA en el centro médico Shiba y se cultivaron de acuerdo con los protocolos del laboratorio clínico. Se preincubaron células de melanoma marcadas con CFSE (SKmel5) con CM10 (10 pg/ml) durante 30 minutos en hielo. Se añadieron TIL durante 10 horas adicionales de incubación a 37° C. El porcentaje de eliminación se determinó mediante tinción con PI de las células de melanoma marcadas con CFSE. La relación efector-objetivo fue de 5:1. En otro ensayo, se preincubaron células de melanoma marcadas con CFSE con CM10 durante 30 minutos en hielo. Se añadieron TIL para una incubación adicional de 5 horas a 37° C. El porcentaje de eliminación se determinó mediante tinción con PI de las células de melanoma marcadas con CFSE. Los resultados representan la media del % de eliminación específica de pocillos por triplicado ± SE por tratamiento. La relación efector-objetivo fue de 5:1.
Los resultados descritos en la Figura 5 muestran que la actividad de eliminación de las células T se potencia en presencia del mAb anti CEACAM1, CM10. Además, en las condiciones de ensayo en las que los TIL no pudieron eliminar ninguna célula de melanoma (breve incubación o relación baja de TIL), la adición de CM10 estimuló la actividad de eliminación de las TIL mientras que no se pudo detectar ninguna eliminación con el control de isotipo IgG1 (Figura 6).
Ensayo de eliminación de células NK
Las células asesinas naturales (células NK) son un tipo de linfocito citotóxico que puede destruir células malignas mediante la liberación de pequeñas proteínas llamadas perforina y granzima que hacen que la célula objetivo muera por apoptosis. Las células NK pueden, al activarse, lanzar varias vías diferentes, entre ellas citoquinas, receptor FC y ausencia de MHC clase 1 en las células objetivo. Varios receptores de activación e inhibición de varios ligandos en las células objetivo regulan la actividad de citotoxicidad final de las células NK. Las células NK 92MI son una línea de células NK independientes de IL-2 que se adquirieron de la ATCC.
Las NK 92MI se incubaron con CM10 (0,2 pg/ml, 1 pg/ml o 5 pg/ml) o control de coincidencia de isotipo Ab (5 pg/ml) durante 30 minutos a 37° C, se añadieron células objetivo que expresan CEACAM1 durante 5 horas adicionales. El porcentaje de eliminación se determinó mediante el ensayo de liberación de LDH clásico. Los resultados representan la media del % de citotoxicidad de pocillos por triplicado ± SE por tratamiento. La relación efector-objetivo fue de 2,5:1.
El ensayo descrito en la Figura 7 muestra que CM10 mejoró fuertemente la actividad de eliminación de células NK en dos líneas celulares de melanoma que expresan CEACAM1 (SKMel 5 y G361), en comparación con PBS o IgG de coincidencia de isotipo. Se han demostrado resultados similares en otras dos líneas celulares de melanoma CEACAM1+ y en varias relaciones efector-objetivo (E:T).
Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos
La citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) es un mecanismo de inmunidad mediada por células mediante el cual una célula efectora del sistema inmunitario (en su mayoría células NK) lisa activamente las células objetivo que se han unido a un anticuerpo específico. Para acceder al perfil de seguridad de CM10, realizamos un ensayo ADCC preliminar en el que se examinó la capacidad de CM10 para inducir ADCC en tres líneas celulares de melanoma (líneas celulares positivas para CEACAM1: G361 y SKmel5 y línea celular negativa para CEACAM1: SKmel28).
Se examinó la capacidad de CM10 para inducir ADCC en comparación con un anticuerpo de control positivo (Polyclonal Ab anti CEACAM1 que mostró actividad ADCC en el experimento preliminar). El anticuerpo de isotipo coincidente sirvió como control negativo (hIgG 1 K). Los resultados indican que CM10 no desencadena ADCC en el entorno probado.
Citotoxicidad dependiente del complemento
Las proteínas del complemento se encuentran en la sangre y su acción "complementa" el trabajo de los anticuerpos. La citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) es un mecanismo de eliminación de células en el que el anticuerpo unido a la superficie de la célula objetivo fija el complemento, da como resultado el ensamblaje del complejo de ataque a la membrana que crea poros en la membrana de la célula objetivo y finalmente lleva a la lisis celular.
Para acceder al perfil de seguridad de CM10, se examinó la capacidad de CM10 para inducir CDC en dos líneas celulares de melanoma (SKmel28 y SKmel5) que expresan CEACAM1. Se usó suero humano agrupado comercial como fuente de proteínas del complemento. Se usó el anticuerpo monoclonal comercial Rituximab incubado con células Daudi como control positivo del ensayo e IgGIK comercial como control de coincidencia de isotipo con CM10. Se incubaron líneas celulares de melanoma-SKMEL5 y SKMEL28 o células Daudi de control positivo con CM10 o Rituxiamab respectivamente durante 1 hora a temperatura ambiente seguido de la adición de suero humano normal a una concentración final del 50% durante 2 horas adicionales en una incubadora humidificada (37° C, 5% de CO2). El porcentaje de células lisadas se determinó mediante tinción con yodo de propidio (PI). Los resultados (Figura 14) representan la media SE de 2 experimentos individuales realizados por duplicado, lo que indica que CM10 no indujo la lisis de CDC en el entorno probado.
Experimento de eficacia in vivo
El propósito de este experimento es probar el efecto directo de CM10 sobre las células de melanoma in vivo, así como evaluar el efecto inmunomodulador, que falta en el entorno del xenoinjerto.
Calibración de experimentos de xenoinjerto
Se usaron la línea celular de melanoma humano positiva para CEACAM1 adquirida de "ATCC" (SKMel5) y NOD-SCID, ratones de edad coincidente de "Harlan Laboratories". El ensayo de calibración se realizó para monitorizar el crecimiento de los tumores y encontrar el régimen óptimo de TIL. Se inyectaron células de melanoma SKMel5 SC (subcutáneas) a ratones SCID-NOD y se monitorizó el volumen tumoral mediante mediciones físicas. Cuando el volumen del tumor alcanzó los 100 mmA3, los ratones se dividieron en 5 grupos aleatorios. Los TIL se inyectaron IT (Intra Tumoral) a dos concentraciones diferentes o IV (Intra Venoso) a una concentración (20X10A6 por ratón), mientras que un grupo recibió solo una inyección y el segundo grupo recibió 2 inyecciones de TIL. Cada inyección de TIL fue seguida por 5 días de administración de hIL-2. El experimento de calibración demostró que la inyección de TIL IV tiene un mayor efecto sobre el tamaño del tumor que la administración TI. Además, el régimen TIL repetitivo proporciona una mejor inhibición del crecimiento tumoral en comparación con una única inyección, como podría predecirse a partir de la vida media de las células T. Sobre la base de estos datos, TIL se administrará cada 10 días mediante inyecciones IV, en futuros experimentos con xenoinjertos.
Actividad anticancerígena inmunomoduladora in vivo de CM10
Se inyectaron SC Células de melanoma SKmel5 positivas para CEACAM1 humano a ratones SCID-NOD. Cuando los tumores alcanzaron un volumen de aproximadamente 100 mm3, los ratones se distribuyeron aleatoriamente en uno de los siguientes grupos de tratamiento: a) inyecciones IV semanales de PBS; b) Inyecciones IV semanales de 0,45 mg de CM10; c) tres inyecciones IV de 20 x 106 células T humanas reactivas antitumorales (TIL) e inyecciones IV semanales de PBS; d) Tres inyecciones IV de 20 x 106 células T humanas reactivas antitumorales e inyecciones IV semanales de 0,45 mg de CM10. Una persona ciega al entorno experimental midió el volumen de los tumores 2-3 veces a la semana. Los resultados de la Figura 8 representan el volumen tumoral medio ± SE de 6-10 ratones por grupo. Las flechas indican el tiempo de administración (círculo CM10, triángulos TIL, cuadrados abiertos CM10 y TIL). Como se muestra, se observó una inhibición moderada del crecimiento tumoral con CM10 solo o solo con TIL, pero las diferencias no alcanzaron significancia estadística en comparación con el tratamiento de control. Sorprendentemente, la combinación de transferencia adoptiva de células T humanas con inyecciones de CM10 mostró una sinergia significativa e inhibió fuertemente el crecimiento del xenoinjerto. Esta observación concuerda con los datos in vitro que muestran el efecto potenciador de CM10 en la eliminación de células T (Figuras 5 y 6).
Se observó una inhibición significativa del crecimiento en el grupo tratado con CM10 en presencia de TIL. Estos resultados refuerzan el efecto inmunoestimulador del mAb anti CEACAM1 en diferentes líneas celulares e indican que CM10 puede usarse como un anticuerpo inmunomodulador prometedor. Esta observación concuerda con los datos in vitro que muestran el efecto estimulador de CM10 sobre la eliminación de células de melanoma por parte de las células T.
Conclusiones
CEACAM1 es conocido como un regulador de la activación de los linfocitos. CM10 es un anticuerpo que bloquea las interacciones entre dos moléculas CEACAM1 (Figura 4) y por lo tanto elimina las señales inhibidoras mediadas por CEACAM1, resulta en una activación más fuerte de los linfocitos citotóxicos contra las células tumorales (Figuras 6 y 7). El resultado del xenoinjerto in vivo (Figura 8) refuerza la naturaleza inmunoestimuladora de CM10 y demuestran una inhibición significativa del crecimiento de tumores en ratones tratados con CM10 en presencia de TIL. El esquema presentado en la Figura 9 demuestra una teoría no limitativa del modo de acción de CM10 que previene la interacción CEACAM1-CEACAM1 que permite la activación de señales de eliminación por células del sistema inmunitario.
Ejemplo 7: Evaluación de seguridad in vitro de CM10
El efecto de CM10 sobre células humanas normales
Para evadir del sistema inmunitario, las células cancerígenas alteran la expresión de muchas moléculas. Varias evidencias han demostrado que la expresión de CEACAM1 aumenta durante la transformación maligna de las células de melanoma. De acuerdo con la bibliografía, CEACAM1 también se expresa en células normales, por lo que es importante mapear los posibles sitios de unión de CM10 en el cuerpo e identificar si la unión de CM10 a células normales puede llevar a algún resultado no deseado.
Reactividad cruzada de tejidos humanos normales
En este estudio, se examinó la intensidad de unión del mAb anti-CEACAM1 en una micromatriz de tejido humano que contenía muestras de melanoma normal y maligno. La intensidad de la unión se evaluó usando un sistema de puntuación patológica estándar. Se analizó la intensidad de unión de anti CEACAM1 mediante un procedimiento IHC estándar con micromatriz de tejido (TMA) que contenía 100 casos de melanoma maligno (primario, metástasis) y de nevus benignos. Cada núcleo de tumor se calificó de 0 a 3. Como se muestra en la Figura 10, la intensidad de unión del mAb anti-CEACAM1 se observó en más del 50% de las muestras de melanoma y en el 65% de las muestras de melanoma metastásico.
La micromatriz de tejido de órganos humanos (TMA) multinormal incluía 33 tipos de órganos normales, cada tipo tomado de 3 individuos humanos normales. La edad variaba de 2 a 67 años, 43 especímenes se derivaban de hembras y 57 especímenes de machos. Los siguientes tejidos fueron negativos para la unión de mAb anti-CEACAM1: cerebro, cerebelo, ovario, páncreas, glándula paratiroidea, hipófisis, glándula tiroides, amígdala, médula ósea, bazo, timo, pulmón, músculo cardíaco, estómago, músculo esquelético, piel, nervios periféricos, mesotelio y retina. Se detectó una tinción celular específica en algunos órganos, principalmente en el lado luminal de las células epiteliales que forman conductos o glándulas en órganos viscerales huecos como: borde ciliado del intestino delgado; algunas glándulas colónicas apicales; epitelio ductal mamario; canalículos biliares hepáticos; superficie interna de los túbulos renales; pocas glándulas endometriales; parte luminal de la glándula salival. Además, se observó una tinción celular baja en la corteza de la glándula suprarrenal, la superficie apical de las glándulas prostáticas, las células de Leidig de los testículos y las células individuales dispersas en el páncreas. Las únicas células del sistema inmunitario que dieron positivo fueron los neutrófilos dentro de los capilares. No se encontró tinción de linfocitos en tejidos y órganos linfáticos. Finalmente, se encontró una tinción positiva de débil a moderada en células endoteliales de vasos sanguíneos pequeños en sitios selectivos, que incluyen: ovario, glándula suprarrenal, riñón y, rara vez, en páncreas, próstata, hipófisis y endometrio.
El análisis IHC mostró una fuerte tinción anti CEACAM1 de las células de melanoma, en comparación con la ausencia de tinción de la gran mayoría de los tejidos probados en un tejido humano normal. Sin embargo, se observó alguna tinción selectiva en el aspecto luminal de células epiteliales de conductos o glándulas en vísceras huecas. Este aspecto celular es generalmente menos accesible para un anticuerpo administrado a través de la sangre periférica.
Cuantificación de moléculas CM10 unidas por célula
Para cuantificar el número exacto de moléculas CM10 unidas a cada tipo de célula, se usó el kit QuantiBRITE. Usando el kit, la MFI (intensidad de fluorescencia media) se tradujo directamente al número de moléculas unidas por célula. Se adquirieron de la ATCC tres células primarias humanas de tejidos, que resultaron ser positivas para la unión anti-CEACAM1. Las células HUVEC para representar la tinción positiva que se encuentra en las células endoteliales; células epiteliales prostáticas primarias, ya que la superficie apical de las glándulas prostáticas mostró tinción positiva, y células epiteliales primarias del túbulo proximal renal, ya que la superficie interna de los túbulos mostró tinción positiva. Con más detalles, se cultivaron SkMel 5, G361, Malme 3M, NK 92MI, HUVEC, células primarias renales y células primarias de próstata de acuerdo con los protocolos de la ATCC. CM10 se conjugó con una molécula de PE (RPE LYNX Rapid Conjugation Kits Serotec) de acuerdo con el protocolo del fabricante y se usó (1 pg/ml) con el kit de perlas de PE QuantiBRITE (BD) para determinar los ABC (anticuerpos unidos por célula) mediante citometría de flujo. El número de moléculas de CM10 unidas por célula se analizó usando citometría de flujo en las células primarias indicadas en comparación con las líneas celulares de melanoma. Se contaron por lo menos 10000 células para cada línea celular.
El análisis cuantitativo (Figura 11, los resultados representan la media de 2-3 experimentos independientes ± SE) mostró que las células de melanoma positivas para CEACAM1 unen entre 20.000 y 50.000 moléculas CM10, mientras que las células endoteliales y epiteliales normales (por ejemplo, HUVEC, riñón y próstata) que se ha informado que ejercen alguna expresión de CEACAM1, unen hasta 2000 moléculas CM10 solamente. Además, se unieron grandes cantidades de anticuerpos CM10 a las células NK (~ 20000), lo que se correlaciona con los datos publicados que muestran una alta expresión de CEACAM1 en linfocitos activados. Estos resultados refuerzan el perfil de seguridad de CM10 (baja expresión en células primarias) y su actividad (resultados NK) como actor en la lisis celular mediada por linfocitos activados.
Proliferación de células primarias humanas en presencia de CM10
Como se encontró algo de tinción positiva en tejidos normales, se examinó el efecto de CM10 sobre el crecimiento de células primarias. Se cultivaron HUVEC y células prostáticas primarias de acuerdo con los protocolos de la ATCC y se monitorizó la proliferación celular usando el ensayo estándar XTT. No se pudo detectar ningún efecto sobre la proliferación celular.
Resumen
Se identificó el perfil de unión de mAb anti CEACAM1 a tejidos normales y células de melanoma. CEACAM1 está ausente en los melanocitos normales, pero experimenta una neoexpresión y se expresa ampliamente en la gran mayoría de los especímenes de melanoma metastásico (Figura 10), en otro órgano normal hay una expresión restringida de CEACAM1 en células específicas dentro de varios tejidos. Un análisis cuantitativo, que midió el número de moléculas de CM10 que están unidas a las células, reveló un número muy bajo de CM10 unido en células primarias humanas normales (Figura 11). Estos resultados implican que la mayoría de la molécula CM10 inyectada a los pacientes se dirigirá principalmente a las células cancerosas y no a los tejidos normales debido a las diferencias de expresión. Además, CM10 no tiene efecto sobre la proliferación celular, la actividad de CDC y la actividad de ADCC insignificante o baja, lo que sugiere que la unión de CM10 a células no objetivo no daría como resultado un resultado celular no deseado.
El efecto de CM10 sobre el sistema inmunitario
CM10 es un anticuerpo inmunoestimulador que bloquea la interacción entre dos moléculas de CEACAM1 y, al hacerlo, media la estimulación de los linfocitos contra las células malignas. Es importante verificar que el anticuerpo no provocará una estimulación desatada del sistema inmunitario que pueda provocar efectos adversos graves. En los linfocitos normales hay una expresión insignificante de CEACAM1 en la membrana celular, solo después de la activación celular CEACAM1 se moviliza a la membrana, donde se regula rápida y fuertemente por incremento en los linfocitos activados (Gray-Owen y Blumberg 2006, Nat Rev Immunol 6, 433-46). Como se ha demostrado con anterioridad, no se observó reactividad cruzada con los tejidos linfáticos normales (bazo, timo, médula ósea) o con los linfocitos; sin embargo se realizaron varios análisis in-vitro y ex-vivo de inmunotoxicidad para ayudar a predecir posibles efectos secundarios.
El efecto de CM10 sobre la proliferación de linfocitos humanos
Una de las formas más comunes y aceptables para evaluar la seguridad de los anticuerpos inmunomoduladores in vitro es examinando sus efectos sobre la proliferación y la secreción de citoquinas de PBMC (células mononucleares de sangre periférica) humanas normales. Se aislaron PBMC humanas de 3 donantes no emparentados y se incubaron con CM10 usando 3 concentraciones diferentes (2 pg/ml, 20 pg/ml o 200 pg/ml) o con un control de mAb IgG 1K (200 pg/ml) durante 60 minutos y con ocho pocillos replicados. Se añadió PHA (1 pg/ml) a 4 de los pocillos replicados del ensayo y las células se incubaron durante 96 horas. Se uso incorporación de 3H-timidina para ensayar la proliferación celular. Se usaron células estimuladas de manera simulada y células estimuladas únicamente con PHA como controles negativo y positivo del ensayo, respectivamente. La proliferación se evaluó en linfocitos en reposo así como en linfocitos activados (tratados con PHA). Se usaron células estimuladas de manera simulada y células estimuladas únicamente con PHA como controles negativo y positivo del ensayo, respectivamente. Los resultados (Figura 12) muestran claramente que CM10 no tiene ningún efecto sobre la proliferación de linfocitos humanos vírgenes o activados. Además del estudio de proliferación de PBMC, se evalúa el efecto de CM10 sobre la secreción de citoquinas de PBMC humanas. Los estudios de secreción de citoquinas definen el efecto inmunomodulador de CM10 y ayudan a predecir posibles efectos secundarios.
Ejemplo 8. Panel de selectividad CM10.
La caracterización del perfil de unión se realizó usando líneas celulares que sobreexpresan las diferentes proteínas de la familia CEACAM y análisis de citometría de flujo.
En humanos, la familia CEA está codificada por 18 genes y 11 pseudogenes en el cromosoma 19q13.2. Varios miembros estrechamente relacionados pertenecen a la familia CEACAM (CEACAM1,3,4,5,6,7,8) y se expresan diferencialmente en varios tipos de células humanas. Las proteínas CEACAM se han implicado en varios efectos mediados por la adhesión que regulan el crecimiento y la diferenciación de células normales y cancerosas (Gray-Owen y Blumberg 2006, Nat Rev Immunol 6, 433-46). Las proteínas estrechamente relacionadas en la familia comparten una gran similitud de aminoácidos que varía desde un 45% hasta un 90% de similitud entre ciertos miembros.
Se usó un protocolo FACS estándar con CM10 conjugado con una molécula de biotina y estreptavidina APC como agente secundario. Se tiñeron células 721.221 que expresan CEACAM 1,5,6,8 o HEK 293 T transitorio que expresan CEACAM 3, 4 con CM10 biotinilado (1 pg/ml) y estreptavidina APC como agente secundario. Los histogramas vacíos representan la tinción de mAb, mientras que los histogramas rojos representan la tinción de fondo. Se usaron por lo menos 10000 células para analizar la unión de CM10 en cada histograma. FAB se calculó dividiendo el MFI de las células teñidas en el MFI de la tinción de fondo. Los resultados demostrados en la Figura 13, indican claramente que CM10 se une fuertemente a las células que expresan CEACAM1. Se observó una tinción moderada en las células que expresaban CEACAM3 y 5. Se demostró una unión débil o insignificante en las células que expresaban CEACAM 4, 6, 8.
Conclusiones
CM10 es un mAb desarrollado para reconocer la CEACAM1 humana, una proteína que se descubrió que estaba asociada con el cáncer en general y con el melanoma en particular. La sobreexpresión de CEACAM1 se ha identificado en algunos tumores malignos, entre ellos melanoma, NSCLC, cáncer de tiroides y cáncer gástrico. La evidencia indica que la sobreexpresión de CEACAM1 puede correlacionarse con un mal pronóstico en pacientes con melanoma y NSCLC. Se ha descubierto que CEACAMS se sobreexpresa en un alto porcentaje de muchos tumores humanos, incluyendo el 90% de los cánceres gastrointestinales, colorrectales (CRC) y pancreáticos, el 70% de las células de cáncer de pulmón de células no pequeñas y el 50% de los cánceres de mama. También se sobreexpresa en los cánceres de tiroides, estómago, ovario y útero (Thompson, Grunert et al. 1991, J Clin Lab Anal 5, 344-66). CEACAM5 incluso sirve como marcador clínico para la metástasis hepática en el CCR y la vigilancia posquirúrgica del cáncer de colon (Duffy 2001, Clin Chem 47, 624-30). La evidencia de que CM10 es capaz de unirse a CEACA5 es muy importante y puede ampliar las posibles indicaciones que puede tratar CM10 de 4-5 tipos de enfermedades malignas a más de 10. Los agentes anti-CEACAM5 que han entrado en ensayos clínicos incluyen anticuerpos anti-CEACAM5 conjugado con sustancias tóxicas como sustancias radiactivas tanto con propósitos de diagnóstico como para el tratamiento de varias enfermedades malignas. Parece que incluso estas formas conjugadas tóxicas no muestran problemas de seguridad, lo que puede indicar que CEACAM5 es un objetivo seguro (Liersch, et al. 2005, J Clin Oncol 23(27), 6763-70;Ychou, et al. 2008, Clin Cancer Res 14(11), 3487-93). Por otro lado, ninguno de estos agentes se dirige a la regulación inmunitaria de los tumores, que pueden ser el objetivo de un anticuerpo que puede unirse tanto a CEACAM1 como a CEACAM5, como CM10.
Ejemplo 9: Mapeo de epítopos de CM10
Para reconstruir epítopos discontinuos de la molécula objetivo, se sintetizó una biblioteca de péptidos estructurados. La molécula objetivo era el dominio N de la molécula CEACAM1 humana que tenía la secuencia:
1 QLTTESMPFN VAEGKEVLLL VHNLPQQLFG YSWYKGERVD GNRQIVGYAI50
51 GTQQATPGPA NSGRETIYPN ASLLIQNVTQ NDTGFYTLQV IKSDLVNEEA100
101 TGQFHVYP108 (SEQ ID NO:35).
La biblioteca se sintetizó usando la tecnología de péptidos químicamente enlazados en andamiajes (CLIPS) de Pepscan que permite estructurar péptidos en giros simples, giros dobles, giros triples, pliegues en forma de lámina, pliegues en forma de hélice y combinaciones de los mismos (Timmerman et al. 2007, J. Mol. Recognit.
20:283-99 y Slootstra et al. 1996, Molecular Diversity 1: 87-96). Las plantillas CLIPS se acoplan a residuos de cisteína. Las cadenas laterales de múltiples cisteínas en los péptidos se acoplan a una o dos plantillas CLIPS. Por ejemplo, una solución 0,5 mM de la plantilla T2 CLIPS 1,3-bis (bromometil) benceno se disuelve en bicarbonato de amonio (20 mM, pH 7,9)/acetonitrilo (1:1 (v/v). Esta solución se añade a las matrices peptídicas. La plantilla de CLIPS se unirá a las cadenas laterales de dos cisteínas presentes en los péptidos unidos en fase sólida de las matrices peptídicas (placa de 455 pocillos con pocillos de 3 pl). Las matrices peptídicas se agitan suavemente en la solución durante de 30 a 60 minutos mientras está completamente cubierto en solución. Finalmente, las matrices de péptidos se lavan extensamente con exceso de H2O y se sonican en tampón de ruptura que contiene SDS al 1 por ciento/mercaptoetanol al 0,1 por ciento en PBS (pH 7,2) a 70° C durante 30 minutos, seguido de sonicación en H2O durante otros 45 minutos. Los péptidos portadores de T3 CLIPS se prepararon de manera similar pero con tres cisteínas.
Se sintetizó un número total de 3002 péptidos que incluye: conjunto de matriz CLIPS que combina dos áreas diferentes de la proteína completa en donde las cisteínas nativas se reemplazan por alaninas; conjuntos de péptidos lineales de 6, 10, 15, 20, 25 y 33 de longitud; conjuntos de péptidos lineales de longitud 15, donde el residuo medio se reemplaza por alanina; conjunto de giros conformacionales de CLIPS de longitud 15 en donde las cisteínas nativas se sustituyen por alaninas; y un conjunto de giros conformacionales de CLIPS de longitud 15 con el residuo central reemplazado por alanina en donde las cisteínas nativas se reemplazan por alaninas.
La unión del anticuerpo a cada uno de los péptidos sintetizados se probó en un ELISA basado en PEPSCAN. Las matrices de péptidos se incubaron con una solución de anticuerpo primario (CM10) (durante la noche a 4° C). Después del lavado, las matrices de péptidos se incubaron con una dilución 1/1000 de un conjugado de anticuerpo y peroxidasa durante una hora a 25° C. Después del lavado, se añadieron el sustrato de peroxidasa 2,2'-azino-di-3-etilbenzotiazolina sulfonato (ABTS) y 2 microlitros/mililitro de H2O2 al 3 por ciento. Después de una hora, se midió el desarrollo del color. El desarrollo del color se cuantificó con un dispositivo acoplado de carga (CCD)-cámara y un sistema de procesamiento de imágenes.
Los valores obtenidos de la cámara CCD varían entre 0 y 3000 mAU, similar a un lector de ELISA de placa de 96 pocillos estándar. Los resultados se cuantifican y almacenan en la base de datos de Peplab. Los valores de unión se extraen para el análisis mediante la representación gráfica de datos donde los valores tomados por una variable en un mapa bidimensional se representan como colores.
Sobre la base de los patrones de unión observados, el núcleo del epítopo de CM10.S91 consiste en residuos 17VLLLVHNLPQQLF29. Se observó una región de unión secundaria en la secuencia aproximadamente 68YPNASLLIQNVT79. Cuando los patrones de unión observados se comparan con la estructura cristalina disponible de la proteína objetivo, se propone que el epítopo discontinuo para CM10.S91 consiste en 17VLLLVHNLPQQLF29 (núcleo) junto con 68PNASLLI75 (soporte).
Ejemplo 10: Experimentos adicionales que evalúan la actividad de CM10
Secreción de granzima B por células efectoras como marcador potencial de EP
El desarrollo de marcadores farmacodinámicos (PD) robustos es fundamental para mejorar el éxito de los fármacos en los ensayos clínicos y ayuda en la selección de una dosis óptima del fármaco para equilibrar la eficacia y la toxicidad. Los marcadores de PD a menudo están proximales en una vía molecular al objetivo del fármaco y se usan para medir el efecto de un fármaco independientemente del efecto terapéutico. La granzima B es una serina proteasa que se libera a través de los gránulos citoplasmáticos de las células T citotóxicas (CTL) y las células NK tras el reconocimiento de objetivos específicos. Esto a su vez media la apoptosis de las células objetivo. Intentamos determinar si CM10 aumenta la secreción de granzima B de las células NK y T efectoras en presencia de células objetivo específicas, lo que permite la eliminación mejorada observada de las células objetivo por parte del anticuerpo.
Los TIL se incubaron con CM10 (0,2 pg/ml, 1 pg/ml, 5 pg/ml o 10 pg/ml) o un Ab de control de isotipo coincidente (IPI-Ipilimumab 10 pg/ml) durante 30 minutos a 37° C; se añadieron células de melanoma positivas objetivo que expresan CEACAM1 y HLA-A2-SKMEL5 para una incubación durante la noche a una relación efectorobjetivo de 2,5:1. La secreción de granzima B se midió por ELISA. Los resultados representan la media ± SE de los valores de liberación de granzima B de 6 repeticiones por tratamiento. Se observaron resultados similares en otro experimento independiente.
Un TIL representado en la Figura 15 secreta niveles iniciales bajos de granzima B que permanecieron bajos en presencia de CM10 solo. Solo cuando las células objetivo se añadieron al TIL, la granzima B se elevó drásticamente. Sin embargo, CM10 pudo aumentar significativamente la secreción de granzima B por encima de los niveles iniciales altos. Se observaron resultados similares cuando se usaron células NK92MI como células efectoras, lo que demuestra que CM10 puede mejorar la secreción de granzima B de las células NK de manera similar. El uso de granzima B como marcador de PD para el tratamiento con CM10 también se examina en un conjunto complementario de experimentos que incluyen modelos in vivo y muestras de pacientes.
CM10 bloquea las interacciones CEACAM1-CEACAM5
Se ha descubierto que el antígeno carcinoembrionario (CEA, CEACAM5 y CD66e) está asociado con varios tipos de cáncer, particularmente el carcinoma colorrectal, así como con el cáncer gastrointestinal, pancreático, de pulmón de células no pequeñas, cáncer de mama, tiroides, estómago y cáncer de ovario. La molécula se ha desarrollado para ser un objetivo para el diagnóstico y la terapia del cáncer.
Las interacciones homófilas de CEACAM1 entre una línea celular de melanoma deficiente en MHC-I y las células NK inhibieron significativamente la eliminación de las células cancerosas por parte de las células NK (Markel et al J Immunol. 2002; 168:2803-2810). De manera similar, la expresión forzada de CEACAM5 en células 721.221 defectuosas de HLA clase I también suprimió la citotoxicidad mediada por NK (Stern et al J Immunol. 2005; 174: 6692-6701), lo que indica que las interacciones heterófilas de CEACAM5-CEACAM1 también pueden desencadenar la señalización inhibidora de CEACAM1 en células inmunitarias.
La línea celular positiva para CEACAM1 (SKMel 5) se incubó con un control de isotipo o CM10 a varias concentraciones, el CM10 no unido se lavó dos veces, seguido de incubación con o sin CEACAM5 biotinilado soluble. La unión de la CEACAM5 biotinilada a las células se detectó mediante un análisis secundario de estreptavidina-APC y FACS. Los resultados representan la media de pocillos duplicados ± SE. Se obtuvieron resultados similares en otros dos experimentos independientes.
Los resultados de la Figura 16 demuestran que CM10 inhibe la unión entre CEACAM1 y CEACAM5 de manera dependiente de la dosis. Por lo tanto, CM10 puede usarse para tratar tumores malignos que expresan un nivel alto de CEACAM5 y explotan el eje CEACAM1-CEACAM5 para suprimir las células inmunitarias.
CM10 mejora la eliminación de células T restringida por HLA
Las células T citotóxicas destruyen células infectadas por virus y células tumorales, y también están implicadas en el rechazo de trasplantes. Estas células reconocen sus objetivos uniéndose a antígenos asociados con moléculas HLA, que están presentes en la superficie de casi todas las células del cuerpo. La eliminación de células infectadas o malignas requiere el reclutamiento de varias vías para generar una respuesta apropiada.
Se buscó este conjunto de ensayos para determinar si CM10 aumenta la actividad CTL "natural" que está restringida por HLA o, alternativamente, provoca una estimulación general del sistema inmunitario.
Los TIL se incubaron con CM10 (0,2 pg/ml, 1 pg/ml, 5 pg/ml o 10 pg/ml) o un anticuerpo de control de isotipo coincidente durante 30 minutos a 37° C. Las células de melanoma objetivo SKMEL5, que expresan CEACAM1 y HLA-A2, se preincubaron con o sin anticuerpo monoclonal bloqueante de HLA-A2 durante 1 hora y se añadieron para una incubación durante la noche con una relación efector-objetivo de 2,5:1. La eliminación se determinó mediante un ensayo de liberación de LDH estándar. Los resultados representan la media ± SE de los valores de liberación de LDH de 3 repeticiones por tratamiento.
Los resultados en la Figura 17 demuestran que en presencia de anticuerpos bloqueantes de HLA-A2, CM10 no pudo aumentar la eliminación de células de melanoma por parte de TIL y que la actividad de CM10 está restringida por HLA. Se observó un resultado similar en otro experimento independiente. Por tanto, se sugiere que, de acuerdo con estos resultados, CM10 mejorará la actividad de los CTL contra células malignas in vivo y no facilitará la activación no específica del sistema inmunitario.
La actividad inmunomoduladora de CM10 inhibe el crecimiento tumoral in vivo
Uno de los modelos más utilizados para evaluar la acción in vivo de nuevos agentes anticancerígenos es el modelo de xenoinjerto tumoral humano. En este modelo, las células tumorales humanas se trasplantan debajo de la piel en ratones inmunocomprometidos que no rechazan las células humanas. Dependiendo del número de células inyectadas y la tasa de crecimiento de las células, el tumor se desarrolla durante varias semanas y la respuesta a los regímenes terapéuticos apropiados puede estudiarse in vivo. La ventaja de un modelo que implica el tratamiento en las primeras etapas de la formación del tumor es la oportunidad de examinar la influencia del agente en un entorno que puede ser más similar a la propagación de la metástasis en los pacientes e identificar el efecto del tratamiento sobre la implantación inicial del tumor.
Por lo tanto, se examinó la actividad inmunomoduladora de CM10 in vivo en ratones SCID-NOD injertados con células de melanoma humano bajo un régimen de tratamiento profiláctico. Los ratones SCID-NOD se aleatorizaron de acuerdo con los cinco grupos de tratamiento indicados en la Figura 18. Se inyectaron 6x106 células SKmel5 (línea celular de melanoma) SC en el día 0. Los ratones se trataron con anticuerpos/TII, como se indica en la figura. Las flechas indican el momento de administración; Las flechas finas representan anticuerpos: 0,25 mg/ratón/inyección (CM10, control de IgG y control de Ipilimumab) y las flechas anchas para TIL (20 x 10A6 células por ratón por inyección). El volumen de los tumores se midió a ciegas 2-3 veces por semana. Los resultados representan volúmenes tumorales medios ± SE de 8-9 ratones por grupo.
La Figura 18 muestra que la combinación de transferencia de células T humanas adoptivas con inyecciones de CM10 mostró un sinergismo significativo e inhibió fuertemente el crecimiento del xenoinjerto en comparación con el grupo de control de isotipo (69% de TGI). Los resultados demuestran que CM10 también tiene un efecto como agente único (45% de TGI en el día 32) y probablemente actuó directamente sobre las células tumorales o las inmediaciones de los tumores mediante la inhibición de la proliferación, la angiogénesis o a través de otras vías biológicas.
En el mismo conjunto de experimentos, se determinó el peso total de los tumores el día de finalización del experimento. Los resultados obtenidos respaldan las mediciones de volumen y muestran una disminución espectacular en la carga tumoral del grupo tratado con TIL+ CM10 y también una reducción estadísticamente significativa en el peso de los tumores en el grupo tratado con CM10.
CM10 mejora la actividad de eliminación inmunomoduladora de las células NK en líneas celulares de cáncer de páncreas positivas para CEACAM1
La selección preliminar mostró que las líneas celulares de cáncer de páncreas y las muestras de pacientes expresan altos niveles de CEACAM1 (el 94% de las muestras de cáncer de páncreas dieron positivo para CEACAM1). Por lo tanto, se realizó un experimento para examinar si CM10 puede mejorar la actividad de las células inmunitarias contra las líneas celulares de cáncer de páncreas. Los ensayos de eliminación se realizaron mediante el cocultivo de células NK92MI que se habían tratado previamente con varias concentraciones de CM10 con diferentes líneas celulares de cáncer de páncreas objetivo positivas para CEACAM1. Las NK 92MI se incubaron con CM10 (0,2 pg/ml, 1 pg/ml o 10 pg/ml) o un Ab de control de isotipo coincidente (10 pg/ml) durante 30 minutos a 37° C; A. Se añadieron células objetivo que expresaban CEACAM1 durante 5 horas adicionales a una relación efector-objetivo de 2,5:1 (COLO-357) o durante la noche a una relación efector-objetivo de 5:1 (BXPC3). Los resultados representan una media de % de citotoxicidad ± SE según se determina por el ensayo de liberación de LDH clásico de pocillos por triplicado por tratamiento.
Los resultados representados en la figura 19 muestran que aunque la eliminación de las células de cáncer de páncreas por las células NK fue relativamente baja, CM10 mejoró esta actividad hasta 2 veces más que la citotoxicidad inicial (PBS o Ab de control). Se observaron resultados similares en dos líneas adicionales.
CM10 mejora la secreción de granzima B de las células NK en presencia de líneas celulares de cáncer de páncreas positivas para CEACAM1
El experimento se diseñó para determinar si, de manera similar a las células de melanoma, CM10 puede mejorar la secreción de granzima B de las células NK en presencia de células de cáncer de páncreas. En un entorno similar al ensayo de eliminación, las células NK se pretrataron con varias concentraciones de CM10 y luego se cocultivaron con cuatro líneas celulares de cáncer de páncreas objetivo diferentes. Se analizó el contenido de granzima B de los sobrenadantes mediante un ELISA específico. Las NK 92MI se incubaron con CM10 (0,2 pg/ml, 1 pg/ml o 10 pg/ml) o un anticuerpo de control de isotipo coincidente (10 pg/ml) durante 30 minutos a 37° C. Se añadieron células pancreáticas objetivo que expresaban CEACAM1 durante 5 horas adicionales en una relación efector: objetivo de 2,5:1 A. (COLO-357 y ASpC-1) y B. (SU8686) o E:T de 10:1 C.(BXPC3). La secreción de granzima B se midió por ELISA. Los resultados representan la media SE de los valores de liberación de granzima B de 2 a 6 repeticiones por tratamiento.
La Figura 20 demuestra claramente que CM10 aumenta la secreción de granzima B de las células NK en presencia de células de cáncer de páncreas.
Ejemplo 11: Anticuerpos humanos y humanizados
Un anticuerpo humanizado típicamente tiene una estructura humana injertada con CDR no humanas. Por lo tanto, un anticuerpo humanizado tiene una o más secuencias de aminoácidos introducidas desde una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos a menudo se denominan residuos "importados", que típicamente se toman de un dominio variable "importado". La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986; Riechmann et al., Nature, 332:323-327, 1988; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988), sustituyendo las CDR de roedor o secuencias de CDR por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente de Estados Unidos N° 4.816.567) en donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores.
La elección de los dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, que se usarán para elaborar los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el denominado método de "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se analiza frente a la biblioteca completa de secuencias de dominio variable humanas conocidas. La secuencia humana que es más cercana a la del roedor se acepta entonces como marco humano (FR) para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J.
Immunol., 151:2296, 1993; Chothia et al., J. Mol Biol., 196:901, 1987). Otro método usa un marco particular derivado de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. El mismo marco puede usarse para varios anticuerpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285, 1992; Presta et al., J. Immunol., 151:2623, 1993).
Es además importante que los anticuerpos se humanicen con retención de alta afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para conseguir este objetivo, de acuerdo con un método preferido, se preparan anticuerpos humanizados mediante un proceso de análisis de las secuencias originales y varios productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias originales y humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulina están comúnmente disponibles y son familiares para los expertos en la técnica. Hay programas informáticos disponibles que ilustran y muestran estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estas presentaciones permite el análisis de la función probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De esta forma, los residuos de FR pueden seleccionarse y combinarse a partir de las secuencias receptoras e importadas para lograr la característica de anticuerpo deseada, como una mayor afinidad por los antígenos objetivo. En general, los residuos de CDR están directa y sustancialmente implicados en la influencia de la unión al antígeno.
Alternativamente, ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que sean capaces, tras la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigota del gen de la región de unión a la cadena pesada (JH) del anticuerpo en ratones quiméricos y mutantes de línea germinal da como resultado una inhibición completa de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia de la matriz de genes de inmunoglobulina de línea germinal humana en dichos ratones mutantes de línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos tras la exposición al antígeno (por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551, 1993; Jakobovits et al., Nature, 362:255-258, 1993; Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33, 1993; y Duchosal et al. Nature 355:258, 1992. Los anticuerpos humanos también pueden derivarse de bibliotecas de presentación de fagos (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597, 1991; Vaughan et al., Nature Biotech 14:309, 1996).
Ejemplo 12. Fragmentos de anticuerpos
Se han desarrollado varias técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaban mediante digestión proteolítica de anticuerpos intactos (por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117, 1992 y Brennan et al., Science, 229:81, 1985). Sin embargo, estos fragmentos ahora pueden producirse directamente por células huésped recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos pueden aislarse de las bibliotecas de fagos de anticuerpos analizadas anteriormente. Alternativamente, los fragmentos Fab'-SH pueden recuperarse directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167, 1992). De acuerdo con otro enfoque, los fragmentos F(ab')2 pueden aislarse directamente del cultivo de células huésped recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán evidentes para los expertos en la técnica. En otras realizaciones, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv).
Ejemplo 13. Potencia del anticuerpo anti CEACAM contra infecciones víricas
Los siguientes experimentos se usan para determinar el potencial de CM10 contra la infección vírica. Los experimentos incluyen diferentes células objetivo, varios virus y varios modelos in vivo e in vitro.
Detección/diagnóstico: Examen del nivel de expresión de CEACAM en líneas celulares y células primarias infectadas con diferentes tipos de virus, mediante análisis FACS, RT PCR e inmunohistoquímica.
Prevención: preincubación de células objetivo con anticuerpo anti CEACAM y determinación de la carga viral o replicación viral post infección viral.
Tratamiento: después de la infección viral, las células infectadas se incuban con células del sistema inmunitario y se examina la capacidad de eliminación de las células efectoras y la carga viral. Además, la carga viral y la replicación y la supervivencia global se determinan in vivo después de la infección por el virus y el tratamiento con anticuerpos anti CEACAM.

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo monoclonal quimérico que reconoce CEACAM1 humana que comprende:
una región constante de cadena pesada humana seleccionada del grupo que consiste en: IgG1 humana, IgG2 humana e IgG3 humana;
una región kappa constante de la cadena ligera humana; y
un conjunto de seis secuencias CDR seleccionadas del conjunto de las SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, y 18, y el conjunto de las SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11 y 12.
2. Un polinucleótido aislado que codifica un anticuerpo monoclonal quimérico de acuerdo con la reivindicación 1.
3. Un plásmido que comprende por lo menos una secuencia de polinucleótidos aislada de acuerdo con la reivindicación 2.
4. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo monoclonal quimérico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2; y un portador farmacéuticamente aceptable.
5. El uso de la composición farmacéutica de la reivindicación 4 en el diagnóstico de una enfermedad o trastorno seleccionado de una enfermedad o trastorno de proliferación celular, una enfermedad o trastorno relacionado con la angiogénesis y una infección vírica.
6. La composición farmacéutica de la reivindicación 4, para su uso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad o trastorno seleccionado de una enfermedad o trastorno de proliferación celular, una enfermedad o trastorno relacionado con la angiogénesis y una infección vírica.
7. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 6, en donde la enfermedad o trastorno de proliferación celular es un cáncer.
8. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 7, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en: gastrointestinal, colorrectal, pancreático, de pulmón de células no pequeñas, mama, tiroides, estómago, ovario, útero, melanoma, pulmón y mieloma.
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