KR20140069206A - 암배아성 항원-관련 세포 부착 분자 (ｃｅａｃａｍ)에 대한 항체 - Google Patents

암배아성 항원-관련 세포 부착 분자 (ｃｅａｃａｍ)에 대한 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단백질 CEACAM1의 특이적인 에피토프를 인식하고, 임의적으로 CEACAM 단백질 패밀리 중 다른 서브타입에도 결합하는 항체 뿐만 아니라, 적어도 항체의 항원 결합부를 가지는 분자를 제공한다. 특이적 CDR 서열을 특징으로 하는 항체 및 항체 단편을 개시한다. 상기 항체 및 항체 단편의 제조 방법, 및 요법 및 진단에서의 용도도 또한 제공한다.

Description

암배아성 항원-관련 세포 부착 분자 (ＣＥＡＣＡＭ)에 대한 항체 {ANTIBODIES TO CARCINOEMBRYONIC ANTIGEN-RELATED CELL ADHESION MOLECULE (CEACAM)}
본 발명은 암배아성 항원-관련 세포 부착 분자 (CEACAM), 발현, 활성화 또는 기능에 관여하는 질환에서 유용한, 치료학적 및 진단학적 항체에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 특이적 상보성 결정 영역 (CDR), 및 CEACAM1을 인식하는 다른 항체에 비하여 개선된 특성을 가지는 항체를 제공한다.
막횡단 단백질 암배아성 항원-관련 세포 부착 분자 1 (CEACAM1, 이는 또한 담관 당단백질 (BGP), CD66a 및 C-CAM1로도 알려져 있다)은 면역글로불린 슈퍼패밀리에 속하는 암배아성 항원 패밀리 (CEA)의 멤버이다. CEACAM1은 CD66a (CEACAM1), CD66e (CEACAM6) 및 CD66e (CEACAM5, CEA) 단백질을 비롯한, 다른 공지된 CEACAM 단백질과 상호작용한다. 이는 상피 세포에서부터 조형계 기원의 것 (예컨대, 면역 세포)에 이르기까지, 매우 광범위한 범위의 세포에서 발현된다.
다수의 상이한 기능들은 CEACAM1 단백질에 기인하였다. CEACAM1 단백질은 결장암종, 전립샘암종과 같은 일부 암종 뿐만 아니라, 다른 종류의 암에서도 과다발현되는 것으로 나타났다. 추가 데이터는 혈관신생 및 전이된 CEACAM1의 중심적 관여를 뒷받침하고 있다. CEACAM1은 또한 선천적 및 적응성 면역 반응의 조절에 역할을 하고 있다. 예를 들어, CEACAM1은 인간 장 상피 내에 포함되어 있는 활성화 T 세포에 대한 억제성 수용체인 것으로 나타났다 (W099/52552 및 [Morales et al. J. Immunol. 1999, 163, 1363-1370]을 참조). 추가 보고에 따르면, 단일클론 항체 (mAb)와 T 세포 수용체 가교 결합에, 또는 네이세리아 고노호에아에(Neisseria gonorrhoeae) Opa 단백질의 어느 것에 의한 CEACAM1 진입이 T 세포 활성화 및 증식을 억제시키는 것으로 나타났다.
흑색종은 주로 광범위한 전이 때문에, 전세계에서 75 %의 피부암 관련 사망 원인이 되는 색소-생산 세포 (멜라닌 세포)의 악성 종양이다. 전이성 흑색종 (MM)은 대부분의 항암 요법에 약하게 반응하며, MM을 가진 환자에 대한 평균 전체 생존기간 평균은 8.5개월이다. CEACAM1의 과다발현이 불량한 예후와 상관관계가 있을 수 있고, 이는 대다수의 전이성 흑색종 사례에서 검출된다는 증거가 있다. CEACAM1은 정상적인 멜라닌 세포에 의해서는 거의 발현되지 않지만, 흑색종 세포에서는 빈번하게 발견된다. 원발성 피부 흑색종 병변에서의 CEACAM1 발현은 예후가 불량한 전이성 질환의 진행을 강력하게 예측한다. 또한, 건강한 기증자와 비교하여, 전이성 흑색종을 갖는 일부 환자로부터 유래된 NK 세포에서 CEACAM1 발현의 증가가 관찰되었다.
CEACAM1이 바이러스 감염에서 중요한 역할을 할 수 있다는 것이 증거를 통해 밝혀졌다. 예를 들어, 마켈(Markel) 등 (J. Clinical Investigation 2002, 110, 943-953)은 CMV로 감염된 환자의 탈락막으로부터 단리된 림프구가 CEACAM1 단백질을 증가된 수준으로 발현한다는 것을 입증하였다. 탈락막 림프구 상의 CEACAM1 발현 증가는 국소 면역 반응을 감소시킬 수 있고, 주로 활성화된 탈락막 림프구에 의해 이루어지는 인식 및 제거를 회피하도록 하는, 바이러스에 의해 발생된 또 다른 기전으로서의 역할을 할 수 있다. 자궁경부암 및 인유두종 (HPV) 감염과 관련된 전구체 병변에서 CEACAM1의 단백질 발현 패턴을 연구한, 알바란-소모자(Albarran-Somoza) 등 (Journal of Histochemistry & Cytochemistry 2006, 54, 1393)은 CEACAM1 면역염색이 저등급 편평 상피내 병변 (SIL) 및 정상적인 자궁경부 조직과 비교하였을 때, 고등급 SIL에서 유의적으로 증가된다는 것을 보여주었다. 저자들은 CEACAM1 상향조절이 고등급 SIL에서의 HPV DNA의 통합과 관련이 있을 수 있고, 또한 CEACAM1이 SIL 및 자궁경부암 진행에서 중요한 생물학적 마커일 수 있다고 제안하였다. 이러한 증거들은 모두 CEACAM1이 각종 바이러스 감염에서 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다. 추가적으로, CEACAM1 과다발현은 각종 바이러스 감염의 마커로서의 역할을 할 수 있다.
WO2007/063424 및 미국 특허 출원 번호 제20070110668호는 림프구 활성의 조절을 포함한 면역계를 조절하는 방법, 특히, 특정의 면역 반응을 조절하는 방법을 개시하고 있다. 이들 방법은 CEACAM1 단백질 기능의 음성 및 양성 조절을 둘 다 포함한다.
미국 특허 출원 번호 제20070071758호는 CEACAM1 단백질의 활성을 음성적으로 조절함으로써, 예컨대, CEACAM1에 대해 특이적인 면역글로불린을 사용함으로써 암의 치료에 있어서 종양-침윤 림프구 (TIL) 요법의 효능을 증진시키는 방법 및 조성물을 교시하고 있다.
미국 특허 출원 번호 제20080108140호는 자가면역 질환 및 조직 이식을 필요로 하는 질환의 치료에 있어서 특정의 면역 반응을 조절하여 방어 면역을 일으키는 방법을 개시하고 있다. 특히, 이 출원은 표적 조직에서 CEACAM1 단백질의 기능적 농도를 증가시킴으로써 표적화 방식으로 면역 반응의 억제에 관한 것이다.
미국 특허 출원 번호 제20040047858호는 CEACAM1을 통해 T 세포 활성을 조절할 수 있는 특이적 항체, 및 면역 반응 관련 질환 (예컨대, 이식편 대 숙주 질환, 자가면역 질환, 암 등) 치료에서의 그의 용도를 개시하고 있다.
미국 특허 출원 번호 제20020028203호, 제20050169922호 및 제20080102071호는 T 세포 억제성 수용체 분자에 결합하고, T 세포 활성 (예컨대, 세포 독성 및 증식)을 조절하는 (즉, 증진시키거나, 또는 억제시키는) 조성물, 예컨대, 담관 당단백질 결합제, 및 질환 (예컨대, 자가면역 질환, 면역결핍증, 암 등)의 치료 등을 위해 이러한 조성물을 사용하는 방법을 개시하고 있다.
본 발명자의 WO 2010/125571에는 특이적 하이브리도마 세포에 의해 제조되는 뮤린 단일클론 항체를 개시하고 있다. mAb는 CEACAM1에 대해 고도로 선택성이고, CEACAM 패밀리의 다른 멤버와는 교차 반응하지 않는다.
CEACAM1을 인식하는 공지된 항체 중 어느 것도 본 발명의 단일클론 항체의 결합 특이적성 범위를 가지는 것은 없다. 따라서, CEACAM 발현 또는 활성화와 관련하는 질환에서 진단학적으로 및 치료학적으로 사용될 수 있는 CEACAM 단백질의 특이적 서브세트를 인식하는 항체의 제공을 필요로 하는 요구는 충족되지 않은 상태 그대로 남아있다.
본 발명의 요약
본 발명은 CEACAM 서브타입의 특이적 세트를 인식하는 단일클론 항체를 개시한다. 유리하게, 본 발명의 항체는 CEACAM1, 및 CEACAM5 및 CEACAM3으로부터 선택되는 1개 이상의 추가의 서브타입에의 결합을 나타낸다. 본 발명의 항체는 독특한 CDR 서열 및 프레임워크 조합을 가지고, CEACAM1 분자 내의 새로 확인된 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 단일클론 항체의 독특한 특이적성은 추가 종류의 악성 종양 및 바이러스 감염의 치료 및 진단을 위한 그의 치료학적 유용성을 확장시킨다. 본 발명은 또한 이러한 항체를 확인 및 단리시키는 방법, 그의 제조 방법, 및 그의 치료학적 및 진단학적 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 단일클론 항체는 CDR의 특이적 조합을 갖고, 독특한 특성, 및 공지된 항CEACAM1 항체에 비하여 개선된 특이적성 및 효능을 가진다.
한 측면에 따르면, 본 발명은 서열 번호 1, 2 및 3에 기재된 서열을 포함하는 중쇄 CDR, 및 서열 번호 4, 5 및 6에 기재된 서열을 포함하는 경쇄 CDR을 가지는, CEACAM1을 인식하는 단일클론 항체, 또는 적어도 그의 항원 결합부를 포함하는 그의 항체 단편, 및 그의 유사체 및 유도체를 제공한다.
일부 실시양태에 따르면, 서열 번호 1에 기재된 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 2에 기재된 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 3에 기재된 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 4에 기재된 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 5에 기재된 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 6에 기재된 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 가지는, CEACAM1을 인식하는 단일클론 항체 또는 항체 단편, 및 그의 유사체 및 유도체를 제공한다.
일부 실시양태에 따르면, 서열 번호 7, 8 및 9에 기재된 서열을 가지는 중쇄 CDR을 포함하는, CEACAM1을 인식하는 단일클론 항체, 또는 적어도 항원 결합부를 포함하는 그의 단편을 제공한다.
일부 실시양태에 따르면, 서열 번호 13, 14 및 15에 기재된 서열을 가지는 중쇄 CDR을 포함하는, CEACAM1을 인식하는 단일클론 항체, 또는 적어도 항원 결합부를 포함하는 그의 단편을 제공한다.
일부 실시양태에 따르면, 서열 번호 10, 11 및 12에 기재된 서열을 가지는 경쇄 CDR을 포함하는, CEACAM1을 인식하는 단일클론 항체, 또는 적어도 항원 결합부를 포함하는 그의 단편을 제공한다.
일부 실시양태에 따르면, 서열 번호 16, 17 및 18에 기재된 서열을 가지는 경쇄 CDR을 포함하는, CEACAM1을 인식하는 단일클론 항체, 또는 적어도 항원 결합부를 포함하는 그의 단편을 제공한다.
다른 실시양태에 따르면, 서열 번호 13, 14, 15, 16, 17, 및 18에 기재된 CDR 서열을 가지는 단일클론 항체를 제공한다.
추가의 다른 실시양태에 따르면, 서열 번호 7, 8, 9, 10, 11, 및 12에 기재된 CDR 서열을 가지는 단일클론 항체를 제공한다.
참조 서열의 항원 결합부와 90% 이상의 서열 동일성을 가지는, 단일클론 항체 또는 그의 단편의 유사체 및 유도체도 또한 본 발명의 범주 내에 포함된다.
일부 실시양태에 따르면, 참조 서열의 항원 결합부와 95% 이상의 서열 동일성을 가지는, 단일클론 항체 또는 그의 단편의 유사체 및 유도체를 제공한다. 구체적인 실시양태에 따르면, 항체는 서열 번호 26에 기재된 서열:
Figure pct00001
를 가지는 중쇄 가변 도메인 서열, 또는 상기 중쇄 서열과 97% 이상의 서열 동일성을 가지는 그의 유사체 또는 유도체를 포함한다.
추가의 또 다른 실시양태에 따르면, 항체는 서열 번호 28에 기재된 서열:
Figure pct00002
를 가지는 경쇄 가변 도메인 서열, 또는 상기 경쇄 서열과 97% 이상의 서열 동일성을 가지는 그의 유사체 또는 유도체를 포함한다.
구체적인 실시양태에 따르면, 항체 또는 그의 단편은 서열 번호 26에 기재된 서열을 가지는 중쇄 가변 도메인, 및 서열 번호 28에 기재된 서열을 가지는 경쇄 가변 도메인, 또는 항체 또는 단편 서열과 97% 이상의 서열 동일성을 가지는 그의 유사체 또는 유도체를 포함한다.
본 발명은 하이브리도마 세포 또는 다른 생물학적 시스템으로부터 단리된 단일클론 항체 뿐만 아니라, 재조합적으로 또는 합성적으로 제조된 단일클론 항체를 포함한다. 본 발명에 따른 단일클론 항체는, 한정되지 않지만 마우스, 래트, 및 인간을 포함하는 임의의 포유동물 종으로부터의 불변 영역을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 단일클론 항체는 키메라 항체, 인간화된 항체, 완전 인간 항체, 이종 항체, 및 적어도 항체의 항원 결합부를 포함하는 항체 단편을 포함한다. 구체적인 실시양태에 따르면, 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fd', Fv, dAb, 단리된 CDR 영역, 단일 쇄 항체, "이중항체(diabody)" 및 "선형 항체"로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 특정 실시양태에 따르면, 본 발명은 하기 i) 및 ii)를 포함하는 단일클론 항체, 또는 항체 단편을 제공한다:
i). 마우스 IgG2a, 마우스 IgG2b, 마우스 IgG3, 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 프레임워크 서열; 및
ii). 서열 번호 13, 14, 15, 16, 17, 및 18에 기재된 서열을 가지는 6개의 CDR로 이루어진 한 세트; 또는 서열 번호 7, 8, 9, 10, 11, 및 12에 기재된 서열을 가지는 6개의 CDR로 이루어진 한 세트; 및 상기 CDR 서열과 97% 이상의 서열 동일성을 가지는 그의 유사체 및 유도체, 여기서 상기 단일클론 항체, 또는 항체 단편은 약 5x10-7 M 이상의 친화도로 2개 이상의 CEACAM 서브타입에 결합한다.
일부 실시양태에 따르면, 단일클론 항체 또는 그의 단편은 약 5x10-7 M 이상의 친화도로 2개 이상의 CEACAM 서브타입에 결합한다.
다른 실시양태에 따르면, 단일클론 항체 또는 그의 단편은 약 10-8 M 이상의 친화도로 CEACAM1에 결합한다.
일부 구체적인 실시양태에 따르면, 단일클론 항체는 키메라 단일클론 항체이다.
일부 실시양태에 따르면, 키메라 항체는 인간 유래 불변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에 따르면, 키메라 항체의 인간 불변 영역은 인간 IgG1, 인간 IgG2, 및 인간 IgG3으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에 따르면, CEACAM1을 인식하는 키메라 또는 인간화된 단일클론 항체에 있어서, 서열 번호 13, 14, 15, 16, 17, 및 18에 기재된 서열을 가지는 6개의 CDR; 또는 서열 번호 7, 8, 9, 10, 11, 및 12에 기재된 서열을 가지는 6개의 CDR; 및 상기 CDR 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 가지는 그의 유사체 및 유도체, 및 인간 IgG1, 인간 IgG2 및 인간 IgG3으로부터 선택되는 불변 영역 서브부류를 포함하고, 상기 단일클론 항체가 약 5x10-7 M 이상의 친화도로 2개 이상의 CEACAM 서브타입에 결합하는 것인, 키메라 또는 인간화된 단일클론 항체를 제공한다.
구체적인 실시양태에 따르면, 키메라 또는 인간화된 단일클론 항체 또는 그의 단편은 인간 IgG1 서브타입의 불변 영역 서브부류를 포함한다.
또 다른 실시양태에 따르면, 서열 번호 30에 기재된 중쇄 서열을 포함하는, 키메라 단일클론 항체 또는 적어도 항원 결합부를 포함하는 그의 단편을 제공한다.
추가의 또 다른 특정 실시양태에 따르면, 서열 번호 31에 기재된 경쇄 서열을 포함하는, 키메라 단일클론 항체 또는 적어도 항원 결합부를 포함하는 그의 단편을 제공한다.
추가의 또 다른 특정 실시양태에 따르면, 서열 번호 30에 기재된 중쇄 서열 및 서열 번호 31에 기재된 경쇄 서열을 포함하는, 키메라 단일클론 항체 또는 적어도 항원 결합부를 포함하는 그의 단편을 제공한다.
특정 실시양태에 따르면, ATCC 수탁 번호 PTA-12130으로 2011년 9월 28일 기탁된 플라스미드 중에 포함된 중쇄 및 경쇄의 DNA 서열로부터 제조된, CEACAM1을 인식하는 단일클론 항체를 제공한다.
일부 실시양태에 따르면, 본 발명의 단일클론 항체는 1개 초과의 CEACAM 서브타입에의 특이적인 결합을 나타낸다. 일부 실시양태에 따르면, 단일클론 항체는 2개 이상의 상이한 CEACAM 서브타입에 결합한다. 일부 구체적인 실시양태에 따르면, 단일클론 항체는 CEACAM1, 및 CEACAM3 및 CEACAM5 중 적어도 하나에 결합한다. 특정 실시양태에 따르면, 단일클론 항체는 CEACAM1 및 CEACAM5에 결합한다. 또 다른 실시양태에 따르면, 단일클론 항체는 CEACAM1 및 CEACAM3에 결합한다. 추가의 다른 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 단일클론 항체는 CEACAM 서브타입 1, 3 및 5에 결합한다.
특정 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 단일클론 항체는 CEACAM4 및 CEACAM6에 결합하지 않는다.
추가의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 서열 번호 26 또는 서열 번호 30에 기재된 중쇄 서열 및 서열 번호 28 또는 서열 번호 31에 기재된 경쇄 서열을 가지는, CEACAM1에 대한 단일클론 항체가 결합하는 CEACAM1 분자 상의 동일한 에피토프에 결합할 수 있는, CEACAM1을 인식하는 단일클론 항체, 또는 적어도 항원 결합부를 포함하는 그의 단편을 제공한다.
일부 실시양태에 따르면, 단일클론 항체는 각각 서열 VLLLVHNLPQQLF (서열 번호 32) 및 YPNASLLIQNVT (서열 번호 33)를 가지는 인간 CEACAM1의 잔기 17-29 및 68-79 내의 에피토프와 반응성이다.
일부 실시양태에 따르면, 단일클론 항체가 결합하는 CEACAM1 분자 상의 에피토프는 서열 VLLLVHNLPQQLF (서열 번호 32) 및 YPNASLLIQNVT (서열 번호 33) 내의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프이다.
다른 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 단일클론 항체는 서열 VLLLVHNLPQQLF (서열 번호 32) 중 4개 이상의 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합한다.
추가의 다른 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 단일클론 항체는 서열 VLLLVHNLPQQLF (서열 번호 32) 및 PNASLLI (서열 번호 34) 내의 에피토프에 결합한다.
일부 실시양태에 따르면, 단일클론 항체 또는 그의 단편은 서열 번호 7, 8, 9, 10, 11 및 12에 기재된 6개의 CDR 서열을 가지는 항체가 결합하는 것의 동일한 에피토프에 결합한다.
추가의 다른 실시양태에 따르면, 단일클론 항체 또는 그의 단편은 서열 번호 13, 14, 15, 16, 17 및 18에 기재된 CDR 서열을 가지는 항체가 결합하는 것의 동일한 에피토프에 결합한다.
특정 실시양태에 따르면, 단일클론 항체 또는 그의 단편은 ATCC 수탁 번호 PTA-12130하에 2011년 9월 28일 기탁된 DNA 서열로부터 제조된 항체가 결합하는 것과 동일한 에피토프에 결합한다.
추가의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 서열 VLLLVHNLPQQLF (서열 번호 32)로부터 3개 이상의 아미노산, 및 서열 YPNASLLIQNVT (서열 번호 33)로부터 3개 이상의 아미노산을 포함하는 6-20개의 아미노산으로 이루어진 단리된 펩티드 서열을 제공한다. 모체 서열과 85%, 90%, 95% 또는 98% 이상의 상동성을 가지는, 상기 펩티드의 유사체 및 유도체도 또한 본 발명의 범주 내에 포함된다.
일부 실시양태에 따르면, 단리된 펩티드는 서열 VLLLVHNLPQQLF (서열 번호 32)로부터 6개 이상의 아미노산을 포함한다.
추가의 다른 실시양태에 따르면, 단리된 펩티드는 서열 VLLLVHNLPQQLF (서열 번호 32) 및 PNASLLI (서열 번호 34)로 이루어진 아미노산을 포함한다.
단일클론 또는 다중클론 항체의 제조를 위한 단리된 펩티드의 용도 뿐만 아니라, 진단 또는 치료에서의 그의 용도도 또한 본 발명의 범주 내에 포함된다.
CEACAM1에 대해 친화성 및 특이적성을 가지는, 본 발명에 따른 항체 또는 항체 단편을 인코딩하는 핵산 분자도 또한 본 발명의 범주 내에 포함된다.
상기 측면에 따르면, CEACAM1을 인식하는 항체 또는 그의 항체 단편을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열을 개시한다.
일부 실시양태에 따르면, 단리된 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 25에 기재된 DNA 서열, 또는 상기 DNA 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 가지는 그의 유사체를 포함한다. 다른 실시양태에 따르면, 단리된 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 27에 기재된 DNA 서열, 또는 상기 DNA 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 가지는 그의 유사체를 포함한다.
본 발명에 따른 단일클론 항체 또는 그의 단편을 인코딩하는 1개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드 뿐만 아니라, 이들 플라스미드를 포함하는 숙주 세포 또한 개시한다.
특정 실시양태에 따르면, ATCC 수탁 번호 PTA-12130으로 2011년 9월 28일 기탁된, 서열 번호 25 및 27에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드를 개시한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 CEACAM1, CEACAM3 또는 CEACAM5 발현, 활성화 또는 기능과 관련된 질환 또는 장애를 예방, 약화, 또는 치료하는 데 유용한 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 치료학상 유효량의, CEACAM1, CEACAM3 또는 CEACAM5를 인식하는 단일클론 항체, 또는 적어도 항원 결합부를 포함하는 그의 단편; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
일부 실시양태에 따르면, 약학적 조성물은 10-8 kD 이상의 결합 친화도로 CEACAM1에 결합할 수 있는 단일클론 항체를 포함한다.
추가의 실시양태에 따르면, 약학적 조성물은 약 10-8 kD 이상의 친화도로 CEACAM1에 결합할 수 있고, 약 5x10-7 M 이상의 친화도로 CEACAM3 및 CEACAM5 중 적어도 하나에 결합할 수 있는 단일클론 항체를 포함한다.
특정 실시양태에 따르면, 약학적 조성물은 약 5x10-7 M 이상의 친화도로 CEACAM1, CEACAM3 및 CEACAM5에 결합할 수 있는 단일클론 항체를 포함한다.
특정 실시양태에 따르면, CEACAM1, CEACAM3 및/또는 CEACAM5 발현, 활성화 또는 기능과 관련된 질환 또는 장애는 세포 증식성 질환 또는 장애이다. 일부 실시양태에 따르면, 세포 증식성 질환 또는 장애는 암이다.
일부 실시양태에 따르면, CEACAM5의 과다발현과 관련된 암은 위장관암, 결장직장암 (CRC), 췌장암, 비-소세포 폐암 (NSCL), 유방암, 갑상샘암, 위암, 난소암 및 자궁암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
구체적인 실시양태에 따르면, CEACAM1의 과다발현과 관련된 암은 흑색종, 췌장암, 모든 종류의 폐암 및 골수종이다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 독립형 치료법으로서, 또는 임의의 다른 치료제를 사용하는 치료법과 함께 투여될 수 있다. 구체적인 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 항체는 치료 요법의 일부로서, 1개 이상의 항암제와 함께 항체 투여를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 다른 작용제와 함께, 또는 별개로 투여될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 CEACAM1, CEACAM3 및 CEACAM5로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 CEACAM 서브타입을 검출하는데 유용한 진단학적 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 진단학적 조성물은 치료학상 유효량의, CEACAM1, CEACAM3 또는 CEACAM5에 대해 약 5x10-7 M 이상의 친화도를 가지는 단일클론 항체, 또는 적어도 항원 결합부를 포함하는 그의 단편; 및 임의적인 담체 또는 부형제를 포함한다.
추가의 또 다른 측면에서, 본 발명은 CEACAM의 발현, 활성화 또는 기능과 관련된 질환 또는 장애의 예방, 약화, 또는 치료를 필요로 하는 대상체에게 CEACAM에 대한 항체; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물의 치료학상 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 질환 또는 장애를 예방, 약화, 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
일부 실시양태에 따르면, 상기 질환 또는 장애는 세포 증식성 질환 또는 장애이다. 특정 실시양태에 따르면, 세포 증식성 질환 또는 장애는 암이다. 구체적인 실시양태에 따르면, 단일클론 항체, 또는 그의 단편은 CEACAM1에 대하여 약 10-8 M 이상의 친화도를 가지며, 암은 흑색종이다.
다른 실시양태에 따르면, 단일클론 항체, 또는 그의 단편은 CEACAM5에 대하여 약 5x10-7 M 이상의 친화도를 가지며, 암은 위장관암, 결장직장암 (CRC), 췌장암, 비-소세포 폐암 (NSCL), 유방암, 갑상샘암, 위암, 난소암, 골수종 및 자궁암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가의 실시양태에 따르면, CEACAM1의 과다발현과 관련된 질환 또는 장애는 바이러스 감염이다.
일부 실시양태에 따르면, 바이러스 감염은 DNA 바이러스, 예컨대, 제한되는 것은 아니지만, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 아데노바이러스, 간염 바이러스 및 인유두종 (HPV); 및 RNA 바이러스, 예컨대, 제한되는 것은 아니지만, 인플루엔자 바이러스 및 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이로스에 의해 유발된다.
본 발명의 측면에 따르면, CEACAM 발현 림프구를 항체 또는 항체 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는, 면역조절 방법을 제공한다.
본 발명의 측면에 따르면, CEACAM 발현 종양 세포를 항체 또는 항체 단편과 접촉시켜 CEACAM 발현 종양 세포의 이동을 억제시키는 단계를 포함하는, CEACAM 발현 종양 세포의 이동을 억제시키는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에 따르면, 종양 세포는 흑색종 종양 세포를 포함한다.
본 발명의 측면에 따르면, 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료학상 유효량의 항체 또는 항체 단편을 투여함으로써 대상체에서 암을 치료하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 측면에 따르면, CEACAM1 발현 림프구를 항체 또는 항체 단편과 접촉시켜 동형 또는 이형 단백질-단백질 상호작용을 억제시키는 단계를 포함하는, CEACAM 동형 또는 이형 단백질-단백질 상호작용을 억제시키는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에 따르면, 단리된 항체 또는 항체 단편은 세포 독성 모이어티에 부착된다.
일부 실시양태에 따르면, 세포 독성 모이어티는 세포독소, 케모카인, 화학요법 조성물, 아포프토시스 유발제(pro-apoptotic), 인터페론, 방사성 모이어티, 또는 그의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에 따르면, 항체 또는 항체 단편은 확인가능한 모이어티에 부착된다.
일부 실시양태에 따르면, 암 세포는 감염되지 않은 세포와 비교하여 CEACAM1의 과다발현을 특징으로 한다.
일부 실시양태에 따르면, 암을 치료하는 방법은 대상체에게 림프구를 투여하는 단계를 추가적으로 포함한다.
일부 실시양태에 따르면, 림프구는 T 세포 또는 NK 세포를 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 림프구는 CEACAM1을 발현한다. 다른 실시양태에 따르면, CEACAM1 발현 림프구는 종양 침윤 림프구 (TIL)이다. 다른 실시양태에 따르면, CEACAM1 발현 림프구는 세포 독성 T 세포이다.
본 발명의 항체는 면역 효과기 세포 (CEACAM 발현 림프구, 예컨대, 종양 침윤 세포, T 세포 또는 NK 세포) 및 표적 세포 (예컨대, CEACAM 발현 병리학적 세포, 예컨대, 암 세포) 중 하나 또는 그 둘 모두의 세포 상의 CEACAM을 차단시키는 데 사용될 수 있다. 본 요법에 대한 후보가 되는 암 세포의 예로는 흑색종, 폐, 갑상샘, 유방, 결장, 전립샘, 간, 방광, 신장, 자궁경부, 췌장, 백혈병, 림프종, 골수성, 난소, 자궁, 육종, 담관, 또는 자궁내막 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 추가의 측면에 따르면, CEACAM 발현 종양 세포가 쉽게 면역조절될 수 있도록 하는 방법을 제공한다. 본 방법은 CEACAM 발현 종양 세포 (예컨대, 흑색종, 폐, 갑상샘, 유방, 결장, 전립샘, 간, 방광, 신장, 자궁경부, 췌장, 백혈병, 림프종, 골수성, 난소, 자궁, 육종, 담관 또는 자궁내막 세포)를 상기 기술된 항체 또는 항체 단편과 접촉시켜 CEACAM 발현 종양 세포가 쉽게 면역조절될 수 있도록 하는 단계를 포함한다.
추가적으로 또는 대안적으로, 본 발명은 또한 CEACAM1 발현 림프구를 본원에 기술된 항체 또는 항체 단편과 접촉시켜 면역조절하는 (예컨대, CEACAM1 동형 또는 이형 단백질-단백질 상호작용을 억제시키는) 방법을 구상한다.
본 교시의 치료 또는 예방 방법은 생체외 (예컨대, T 세포 기반 입양 면역요법에서 사용되는 경우), 또는 생체내에서 수행될 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태의 항체는 상기 기술된 그의 면역조절 활성과는 독립된 항암 활성을 가질 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 암을 앓는 대상체에게 CEACAM을 인식하는 항체를 포함하는 조성물 및 항신생물성 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 항신생물성 조성물은 1개 이상의 화학요법제를 포함하고, 상기 항체 및 항신생물성 조성물의 공동 투여는 반응 또는 생존의 지속 기간 또는 진행을 효과적으로 증가시키는 것인, 상기 대상체의 반응 또는 생존의 지속 기간 또는 진행을 증가시키는 방법을 제공한다.
추가적으로, 본 발명은 암을 앓는 대상체에게 CEACAM에 대한 항체를 포함하는 조성물, 및 항신생물성 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 CEACAM에 대한 항체 및 항신생물성 조성물의 공동 투여는 대상체 군에서의 반응 발생률을 효과적으로 증가시키는 것인, 상기 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
치료학적 적용과는 별도로, 본 발명의 항체는 또한 진단학적 적용에도 사용될 수 있다.
따라서, 추가의 측면에 따르면, (생체내, 시험관내, 또는 생체외에서) 암 진단을 필요로 하는 대상체로부터 유래된 생물학적 샘플을 본원에 기술된 항체 또는 항체 단편과 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서, 복합체가 사전결정된 임계치 이상으로 형성되었다면, 이는 대상체의 암을 시사하는 것인, 상기 대상체에서 암을 진단하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에 따르면, 암 세포는 감염되지 않은 세포와 비교하여 CEACAM의 과다발현을 특징으로 한다.
특정 실시양태에 따르면, 진단되는 암은 흑색종, 췌장암, 폐암 및 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 실시양태에 따르면, 측정되는 단백질은 CEACAM5이고, 진단되는 암은 위장관암, 결장직장암 (CRC), 췌장암, 비-소세포 폐암 (NSCL), 유방암, 갑상샘암, 위암, 난소암 및 자궁암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
언급한 바와 같이, 본 발명의 방법은 면역복합체를 형성하기에 충분한 조건하에서 수행되며; 상기 조건 (예컨대, 적절한 농도, 완충제, 온도, 반응 시간) 뿐만 아니라, 상기 조건을 최적화시키는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 예는 본원에 개시되어 있다. 본원에서 사용되는 "면역복합체"라는 어구는 본 발명의 항체 및 CEACAM을 포함하는 복합체를 언급한다. 본 발명의 면역복합체의 존재 또는 수준을 측정하는 것은 직접적일 수 있거나, 또는 항체에 부착될 수 있는 확인가능한 (검출가능한) 모이어티를 검출함으로써 이루어질 수 있다.
시험되는 세포 (예컨대, 그를 필요로 하는 대상체의 세포) 중 면역복합체의 수준을 사전결정된 임계치와 비교한다. 본 발명의 항체는 또한 혈청 가용성 CEACAM의 양을 측정하는 데에도 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 상관없이, 임계치는 공지된 참조 수준 및/또는 대조군 세포 또는 혈청 중의 수준에 기초하여 결정될 수 있다. 대조군 세포는 대조군, 건강한 대상체 (예컨대, 암을 앓지 않는 대상체)로부터, 또는 질환 개시 이전의, 또는 치료 이후의 동일한 대상체로부터 수득될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에 따르면, 대조군 대상체는 동일한 종, 예컨대, 인간, 바람직하게는 그를 필요로 하는 대상체와 동일한 연령, 체중, 성별 등을 가지는 매칭되는 대상체이다.
진단을 촉진시키기 위해, 상기 교시는 한정되지 않지만, 영상화, 분자 시험 및 외과적 생체 검사를 포함하는 당업계에 주지된 다른 암 진단 방법과 함께 병용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, CEACAM의 존재를 검출 또는 정량화하는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 또한 CEACAM을 인식하는 항체를 사용하여 CEACAM 발현과 관련된 병태를 진단하는 방법을 제공한다. 구체적인 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 진단 방법은 시험관내 또는 생체외에서 수행될 수 있다. 본 발명에 따른 항체는 또한 스크리닝 방법을 구성하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 당업계에 공지된 표준 방법에 의해 단일클론 및 다중클론 항체를 사용하여 폴리펩티드의 분비된 수준 또는 세포 관련 수준을 측정하기 위한 ELISA 검정법을 구축할 수 있다.
한 실시양태에 따르면,
i) 생물학적 샘플을 CEACAM에 대한 항체 또는 적어도 항원 결합부를 포함하는 그의 단편과 함께 인큐베이션시키는 단계;
ii) 검출가능한 프로브를 사용하여 결합된 CEACAM을 검출하는 단계;
iii) 공지된 양의 CEACAM을 함유하는 참조 샘플로부터 수득된 표준 곡선과 (ii)의 양을 비교하는 단계; 및
iv) 표준 곡선으로부터 샘플 중 CEACAM의 양을 계산하는 단계를 포함하는, CEACAM의 존재를 검출 또는 정량화하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에 따르면,
i) 생물학적 샘플을 CEACAM에 대한 항체 또는 적어도 항원 결합부를 포함하는 그의 단편과 함께 인큐베이션시키는 단계;
ii) 검출가능한 프로브를 사용하여 결합된 CEACAM을 검출하는 단계;
iii) 공지된 양의 CEACAM을 함유하는 참조 샘플로부터 수득된 표준 곡선과 (ii)의 양을 비교하는 단계;
iv) 표준 곡선으로부터 생물학적 샘플 중 CEACAM의 양을 계산하는 단계; 및
v) (iv)의 양을 정상적인 CEACAM 양과 비교하는 단계를 포함하는, CEACAM 발현과 관련된 질환 또는 장애를 진단하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에 따르면, 생물학적 샘플은 포유동물 대상체의 체액이다. 특정 실시양태에 따르면, 포유동물 대상체는 인간이다.
본 발명의 항체는 또한 환자에서 CEACAM 수준을 평가하기 위한, 및 치료 효능을 예측하기 위한 스크리닝 검정법에서 사용될 수 있다. 본 발명의 항체를 이용하는 스크리닝 검정법을 통해 CEACAM 수준을 측정할 수 있으며, 따라서, 치료 결과를 예측할 수 있고, 적절한 치료 요법을 계획할 수 있게 될 것이다.
다른 실시양태에 따르면, CEACAM1, CEACAM3 및 CEACAM5 중 1개 이상의 것의 수준을 평가한다. 특정 실시양태에 따르면, CEACAM1의 수준을 평가한다.
본 발명의 일부 실시양태에 따르면, 항체 또는 항체 단편은 확인가능한 모이어티에 부착된다.
항체, 또는 그의 단편과 확인가능한 모이어티의 상기와 같은 부착은 화학적 컨쥬게이션을 이용하여, 또는 당업자에게 주지된 방법에 따르면 재조합 DNA 기술에 의해 수행될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
확인가능한 모이어티는 결합쌍의 추가의 멤버, 및 직접적으로 시각화되는 표지와의 그의 상호작용을 통해 확인가능한, 결합쌍의 한 멤버일 수 있다. 일례에서, 결합쌍의 멤버는 상응하는 표지화된 항체에 의해 확인되는 항원이다. 일례에서, 표지는 비색 반응을 일으키는 효소 또는 형광성 단백질이다.
본 발명의 또 다른 측면은 세포 증식성 또는 혈관신생 관련 질환 또는 장애 또는 바이러스 감염을 진단 또는 치료하기 위한, CEACAM에 대한 항체 또는 그의 항체 단편의 용도에 관한 것이다.
한 실시양태에 따르면, 세포 증식성 질환은 흑색종이다.
다른 실시양태에 따르면, 세포 증식성 질환 또는 장애는 위장관암, 결장직장암 (CRC), 췌장암, 비소세포 폐암 (NSCL), 유방암, 갑상샘암, 위암, 난소암, 자궁암, 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암이다.
한 실시양태에 따르면, 본 발명은 암 및 바이러스 감염을 포함하나, 이에 한정되지 않는, CEACAM의 발현 또는 활성화와 관련된 장애 또는 질환 치료용 약제 제조를 위한, CEACAM에 대한 항체 또는 적어도 항원 결합부를 포함하는 그의 단편의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 세포 증식성 또는 혈관신생 관련 질환 또는 장애, 또는 바이러스 감염 진단용 진단학적 조성물 제조를 위한, CEACAM에 대한 항체 또는 그의 항체 단편의 용도에 관한 것이다.
본질적으로 CEACAM1, CEACAM3 및 CEACAM5 항체에 대하여 선행 기술에서 공지된 또는 구상된 용도들은 모두 상기 단백질에 대하여 개선된 친화성 및 우수한 억제성을 가지며, CEACAM1 보유 세포에 대해 간접적인 면역조절 효과를 미치는 것으로 밝혀진 본 발명의 항체로 달성될 수 있다. 상기 용도는 진단학적, 예방학적 및 치료학적 기법을 포함한다.
본 발명의 추가의 실시양태 및 적용가능성의 전범위는 하기 제공되는 상세한 설명으로부터 자명해질 것이다.
도 1은 키메라 항체 CM10의 경쇄 및 중쇄를 보여주는 SDS-PAGE 영상이다.
도 2는 정제된 hCEACAM1에 대한 CM10의 특이적 결합 곡선을 보여주는 것이다.
도 3은 유세포 측정 분석에 의해 검출되는 바, CM10의 CEACAM1에의 특이적 결합을 입증하는 것이다.
도 4는 CM10이 세포 사이의 CEACAM1-CEACAM1 상호작용을 차단한다는 것을 확인시켜 주는 것이다. 다양한 CM10 농도의 존재하에서 인큐베이션된 효과기 세포 (CEACAM1을 발현하는 BW/221 세포)의 마우스 IL-2 분비를 ELISA에 의해 측정하였다.
도 5는 CM10이 CEACAM1 양성 흑색종 세포의 비(specific) 사멸 활성을 증진시킨다는 것을 보여주는 것이다.
도 6은 CM10이 종양 침윤 림프구 (TIL)의 사멸 활성을 자극시킨다는 것을 입증하는 것이다.
도 7은 CM10이 CEACAM1 양성 흑색종 세포주 상에서의 NK 세포의 사멸 활성을 증진시키는 것을 입증하는 것이다.
도 8은 CM10의 면역조절 효과가 생체내 종양 성장을 억제시킨다는 것을 보여주는 것이다. 화살표 표시는 투여 시점을 나타내는 것이다 (CM10: 동그라미 표시, TIL: 삼각형 표시, CM10 및 TIL: 개방형 사각형 표시).
도 9는 CM10의 면역조절 작용 모드를 개략적으로 제시하는 것이다.
도 10은 항CEACAM1 항체에 의해 측정된, 종양에서의 CEACAM1 결합 강도 수준을 나타내는 것이다.
도 11은 세포 1개당 결합된 CM10 분자를 정량화한 것으로 보여주는 것이다.
도 12는 CM10은 PBMC 증식에는 어떤 영향도 미치지 않는다는 것을 확인시켜 주는 것이다. 결과는 각 처리당 3명의 기증자로부터의 평균 증식률을 나타낸다.
도 13은 CM10과 CEACAM 패밀리 단백질 사이의 결합에 대한 FACS 분석을 제시하는 것이다. CEACAM1, 5, 6 및 8은 721.221 세포에 의해 발현되었고, CEACAM3 및 4는 HEK293T 세포에 의해 발현되었다.
도 14는 흑색종 세포주에서 보체 의존성 세포 독성 (CDC) 검정법의 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 CEACAM1 및 HLA-A2 양성 흑색종 세포의 존재하에서 CM10이 TIL의 그랜자임 B 분비를 증진시킨다는 것을 입증하는 것이다.
도 16은 CM10이 CEACAM1-CEACAM5 상호작용을 차단한다는 것을 보여주는 것이다.
도 17은 CM10의 HLA 제한된 T 세포 사멸 증진을 제시하는 것이다.
도 18은 CM10의 면역조절 활성이 생체내 종양 성장을 억제시킨다는 것을 입증하는 것이다.
도 19는 CM10이 CEACAM1 양성 췌장암 세포주 COLO-357 및 BXPC3 상에서의 NK 세포의 사멸 활성을 증진시킨다는 것을 나타내는 것이다.
도 20은 CM10이 CEACAM1 양성 췌장암 세포주의 존재하에서 NK 세포의 그랜자임 B 분비를 증진시킨다는 것을 입증하는 것이다.
본 발명은 개선되고, 독특한 특이적성, 선택성, 친화성 및/또는 활성을 가지며, 특이적 CDR 서열 세트를 포함하는, CEACAM1을 인식하는 항체를 제공한다.
본 발명에 따른 항체는 다른 항CEACAM1 항체보다 더 높은 친화도로 CEACAM1에 결합하고, CEACAM1의 기능을 차단하며, 모든 항CEACAM 항체가 다 그러한 것은 아니지만, 다중클론 항CEACAM 항체보다 더 효율적으로 이를 수행한다. 추가적으로, 본 발명에 따른 항체는 암 세포, 특히, 흑색종 세포에 대하여 효과적인데: 항체는 흑색종 세포의 림프구에 대한 감응성을 증가시키고, 생체내에서 흑색종의 성장률을 억제시키며, 이 효과는 항체가 생체내에서 입양 T 세포 전달과 함께 조합되었을 때, 증진된다.
본 발명에 따른 항CEACAM1 항체의 생체내 항흑색종 효과는 항종양 효과 뿐만 아니라, 상기 세포의 반응성 림프구에 대한 감응성을 증가시키는 면역조절 효과의 조합된 직접적인 효과라는 것이 본원에서 최초로 밝혀졌다.
본 발명에 따른 항체, 단편 및 유도체는 진단, 면역조절, 및 암 치료에 효과적인 도구로서 사용될 수 있다.
항체는 면역 효과기 세포와, CEACAM1을 발현하는 표적 세포를 공동 인큐베이션시키고, IL-2 분비를 검정하고, 시험관내 사멸 검정법에 의해서 측정한 바, CEACAM1의 동종친화성 상호작용을 억제시킨다.
본 발명의 항체는 특이적 표적 세포의 존재하에서 HLA 제한된 T 세포 사멸을 증진시키고, 효과기 NK 및 T 세포로부터의 그랜자임 B (표적 세포의 아포프토시스 매개에 관여하는 세린 프로테아제) 분비를 증진시켜 항체에 의한 표적 세포 사멸 증진이 관찰될 수 있도록 하는 것으로 보인다. 이는 또한 용량에 의존하는 방식으로 CEACAM1과 CEACAM5 사이의 결합을 억제시키고, 이로써 이는 고수준으로 CEACAM5를 발현하고, 면역 세포를 억제시키기 위해 CEACAM1-CEACAM5 추축을 이용하는 악성 종양을 치료하는 데 사용될 수 있다.
추가적으로, 본원에서는 본 발명에 따른 항체가 흑색종 세포 침윤을 억제시키는 데 효과적인 것으로 나타났다. 추가적으로, 본 발명에 따른 항체를 단독으로, 또는 반응성 림프구와 함께 생체내 투여하였을 때, 흑색종 종양의 성장을 억제시키는 데 효과적인 것으로 나타났다. 이소타입 대조군과 비교하였을 때, 입양 인간 T 세포 전달과 단일클론 항체 주사의 조합으로 유의적인 시너지 작용이 나타났고, 이종이식편 성장은 강력하게 억제되었다.
본 발명의 추가의 측면에 따르면, 상기 기술된 특이적 CDR 세그먼트를 가지는 항원 인식 도메인을 포함하는 본원에 정의된 항체에 대하여 동일한 결합 특이적성 및 선택성을 가지는 단리된 항체 또는 항체 단편을 제공한다. 상기 측면에 따르면, 단리된 항체 또는 항체 단편은 상기 기술된 항체와 같이, 그의 특이적 CDR 세그먼트 서열에 의해 CEACAM1 단백질의 동일한 에피토프 결정기에 결합할 수 있다.
본 발명에 따른 단일클론 항체가 결합하는 에피토프에 대한 제안된 서열은 추가의 단일클론 항체가 생성되도록 유도하는 데 사용될 수 있는 상기 에피토프로부터 유도된 제안된 단리된 펩티드와 함께 동시에 본원에 개시된다.
단일클론 항체 (mAb)는 종양 세포를 선택적으로 표적화하고, 일단 결합하면, 다양한 반응을 유도하도록 디자인될 수 있다. 이러한 작용제는 상이한 방식으로, 에컨대, 종양 세포 증식을 차단시키거나, 면역계를 활성화시킴으로써 종양 세포를 파괴시킬 수 있다. CEACAM1 단백질 및 다른 CEACAM 서브타입 단백질에 특이적으로 결합하여 그의 다양한 기능들을 중화시키고, 종양 세포의 특이적인 사멸을 유도하도록 본 발명에 따른 키메라 단일클론 항체를 디자인하였다. 어느 이론으로도 제한하고자 하지 않으면서, 본 발명에 따른 단일클론 항체는 또한 암성 세포에 대한 면역계 활성화를 통해 작용한다는 것이 제안된다.
임상적 및 생물학적 증거, 2가지 모두 표적화된 면역요법 개발을 위한 유망한 표적으로서 CEACAM1을 강조한다. CEACAM1은 정상적인 멜라닌 세포에서는 발견되지는 않지만, 새로 발현되고, 대다수의 전이성 흑색종 표본에서 광범위하게 발현된다. CEACAM1은 NK 세포 및 T 세포의 효과기 기능을 억제시킴으로써 흑색종 세포를 보호한다는 것이 기계론적인 방식으로 앞서 입증된 바 있다.
본원에서는 CM10이 인간 CEACAM1에 대하여 고친화도로 결합하는 키메라 단일클론 항체라는 것이 최초로 입증된다. 시험관내에서 CM10은 용량에 의존하는 방식으로 CEACAM1-동종친화성 상호작용을 효율적으로 차단시켰고, T 세포 및 NK 세포에 의한 CEACAM1 양성 흑색종 세포 사멸을 개선시켰다. 또한, CM10은 흑색종 반응성 인간 T 림프구 (종양 침윤 림프구, TIL)와 함께 전신 투여되었을 때, 흑색종 이식편의 생체내 성장을 유의적으로 억제시켰다. 어느 이론으로도 제한하고자 하지 않으면서, 이는 활성화된 림프구를 이용하여 종양 세포의 면역-방어 상호작용을 저지시킨다는 제안된 작용 기전과 일치한다.
CEACAM1이 결장, 전립샘, 유방, 신장 등을 비롯한, 매우 다양한 상피 세포에서 발현된다는 것을 입증한 수개의 증거가 보고된 바 있다. IHC에 의해 정상 및 악성 조직 상의 CEACAM1 발현 프로파일에 대한 광범위한 조사가 수행되었다. 발현 분석 결과, 정상적인 인간 조직 중 시험된 조직의 대다수는 염색되지 않은 것과 비교하여, 흑색종 세포는 강력하게 염색된 것으로 나타났다. 그럼에도 불구하고, 여러 기관의 제한된 부위에서 일부 선택적인 염색이 관찰되었다. 더 많은 정량적 방법을 사용하여 악성 및 정상적인 1차 세포에 결합된 CM10 mAb 분자의 개수를 정량화하였을 때, 정상 세포에서는 극소수의 CM10 분자가 검출될 수 있었는데, 이는 CM10이 대개 환자의 종양 세포에 결합한다는 것을 시사하는 것일 수 있다. 추가적으로, CM10은 1차 세포 증식에는 어떤 영향도 미치지 못하고, 완전하게 또는 거의 완전하게 CDC 또는 ADCC를 유도하지 못하는 것으로 나타났으며, 이는 인간 대상체에서의 단일클론 항체의 잠재적 안전성을 시사하는 것이다.
CM10은 면역조절 활성을 가지고 있는 바, 가능한 면역 관련 부작용을 평가한다. PBMC 활성화 후, CEACAM1은 활성화된 림프구 상에서 상향조절된다 (Gray-Owen and Blumberg 2006, Nat Rev Immunol 6, 433-46). 생체외 인간 PBMC 증식 검정법을 통해 CM10은 나이브(naive) 및 활성화된 PBMC 증식성 반응에는 어떤 영향도 미치지 않는 것으로 밝혀졌다.
일반화된 억제 기전의 저지에 비하여 CEACAM1 차단이 가지는 주된 이점은 종양 인접부에의 예상되는 선택성과, 이로써, 다른 일반 면역 독성제와 비교하였을 때, 유해 사례가 더 적다는 점이다.
본 발명에서 입증된 바와 같이, CM10은 고무적 활성 및 안전성 프로파일을 나타내며, 암 면역요법을 위해 유망한 후보 물질이 되고, 이는 수개의 악성 종양, 예컨대, 흑색종 및 비-소세포 폐암에서 내인성 면역 반응의 항종양 특성을 선택적으로 증진시키는 전략법으로서 사용될 수 있다.
추가의 CEACAM 서브타입에 결합하게 되면, 항체의 치료학적 프로파일을 증가시킬 수 있고, 이로써, 예를 들어, CEACAM1은 광범위하게 발현하지는 않지만, CEACAM5는 발현하는 다른 악성 종양 종류의 진단 및 치료를 위해 상기 항체는 사용될 수 있다.
CEACAM5는 90%의 위장관암, 결장직장암 (CRC) 및 췌장암, 70%의 비-소세포 폐암 세포 및 50%의 유방암을 비롯한, 고비율의 다수의 인간 종양에서 과다발현되는 것으로 밝혀졌다. 이는 또한 갑상샘암, 위암, 난소암 및 자궁암에서도 과다발현된다 (Thompson, Grunert et al. 1991, J Clin Lab Anal 5, 344-66). CEACAM5는 심지어는 CRC에서 간 전이 및 결장암의 수술후 감시에 대한 임상적 마커로서의 역할을 하기도 한다 (Duffy 2001, Clin Chem 47, 624-30). CM10이 CEACA5에 결합할 수 있다는 증거는 매우 중요하며, 이를 통해 CM10으로 치료될 수 있는 가능한 적응증은 4-5개 종류의 악성 종양에서부터 10개 초과로 확장될 수 있다. 임상 시험에 진입한 항CEACAM5 작용제로는 독성 물질, 예컨대, 진단학적 목적, 및 다양한 악성 종양 치료를 위한 목적, 이 둘 모두를 위한 방사성 물질에 컨쥬게이트된 항CEACAM5 항체를 포함한다. 심지어 상기 독성의 컨쥬게이트된 형태는 안정성 문제를 나타내지 않는 것으로 보이며, 이는 CEACAM5이 안전한 표적이라는 것을 시사하는 것일 수 있다.
뮤린 IgG 서브부류의 인간 대응물은 생물학적 및 기능적 활성의 유사성에 기초한다. 뮤린 IgG2a 및 IgG2b, 및 인간 IgG1 및 IgG3은 보체를 고정시킬 수 있고, 단백질 항원에 결합할 수 있는 능력을 공유한다 (Hussain et al., 1995, Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 726-732). 뮤린 IgG1 및 인간 IgG4는 비만 세포에 결합하는 그의 특성 때문에 유사한 것으로 간주된다. 인간 IgG4는 보체를 활성화시키지 않는 유일의 인간 IgG 서브부류이고, 서브부류 IgG1 및 3은 보체를 활성화시키는 데 있어 가장 효과적이다. 마우스의 경우, 서브부류 IgG2a 및 IgG2b가 활성이고, IgG1, 및 가능하게는 IgG3이 불활성이다 (Clark MR., Chem Immunol. 1997;65:88-110).
CEACAM1을 인식하는 수개의 공지된 단일클론 항체는 서브타입 마우스 IgG1의 것이다. 마우스 IgG1의 인간 등가물은 IgG4인 바, 이는 인간 IgG4 불변 프레임워크를 포함하는 키메라 항체를 생성하는 것으로 기대될 것이다. 예상 밖으로, 본 발명의 일부 실시양태에 따르면, 키메라 단일클론 항체는 인간 IgG1 불변 프레임워크를 포함한다.
한 측면에 따르면, 본 발명은 서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 1개 이상의 중쇄 CDR, 및 서열 번호 4, 서열 번호 5 및 서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 1개 이상의 경쇄 CDR을 포함하는, CEACAM1을 인식하는 단일클론 항체, 또는 적어도 그의 항원 결합부를 포함하는 항체 단편, 및 그의 유사체 및 유도체를 제공한다.
일부 실시양태에 따르면, 참조 서열의 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 가지는, 단일클론 항체 또는 그의 단편의 유사체 및 유도체를 개시한다.
다른 실시양태에 따르면, 참조 서열의 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 가지는, 단일클론 항체 또는 그의 단편의 유사체 및 유도체를 개시한다.
추가의 다른 실시양태에 따르면, 참조 항체의 CDR 서열과 98% 이상의 서열 동일성을 가지는, 단일클론 항체 또는 그의 단편의 유사체 및 유도체를 개시한다.
한 실시양태에 따르면, 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 2개 이상의 중쇄 CDR, 및 서열 번호 4, 서열 번호 5 및 서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 1개 이상의 경쇄 CDR, 및 단일클론 항체 또는 그의 단편의 상기 서열과 97% 이상의 서열 동일성을 가지는 그의 유사체 및 유도체를 포함한다.
다른 실시양태에 따르면, 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 1개 이상의 중쇄 CDR, 및 서열 번호 4, 서열 번호 5 및 서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 2개 이상의 경쇄 CDR, 및 단일클론 항체 또는 그의 단편의 상기 서열과 97% 이상의 서열 동일성을 가지는 그의 유사체 및 유도체를 포함한다.
추가의 다른 실시양태에 따르면, 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 2개 이상의 중쇄 CDR, 및 서열 번호 4, 서열 번호 5 및 서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 2개 이상의 경쇄 CDR, 및 단일클론 항체 또는 그의 단편의 상기 서열과 97% 이상의 서열 동일성을 가지는 그의 유사체 및 유도체를 포함한다.
일부 실시양태에 따르면, 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 19, 서열 번호 20 및 서열 번호 21으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열로부터 유도된 5개 이상의 아미노산으로 이루어진 1개 이상의 중쇄 CDR 서열, 및 서열 번호 22, 서열 번호 23 및 서열 번호 24로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열로부터 유도된 5개 이상의 아미노산으로 이루어진 1개 이상의 경쇄 CDR 서열, 및 단일클론 항체 또는 그의 단편의 상기 서열과 97% 이상의 서열 동일성을 가지는 그의 유사체 및 유도체를 포함한다.
다른 실시양태에 따르면, 항체 또는 그의 단편의 항체 결합 부위는 서열 번호 7, 8, 9, 13, 14 및 15로 이루어진 군으로부터 선택되는 3개의 중쇄, 및 서열 번호 10, 11, 12, 16, 17, 18로 이루어진 군으로부터 선택되는 3개의 경쇄 CDR, 및 항체 결합 부위와 97% 이상의 서열 동일성을 가지는 그의 유사체 및 유도체로 구성된다.
추가의 다른 실시양태에 따르면, 항체 결합 부위는 서열 번호 13, 14, 15, 16, 17, 및 18의 6개의 CDR로 구성된다.
다른 실시양태에 따르면, 항체 결합 부위는 서열 번호 7, 8, 9, 10, 11, 및 12의 6개의 CDR로 구성된다.
본 발명에 따른 CDR 서열은 2개의 상이한 알고리즘: IMGT 알고리즘 (Lefranc et al., 1999, Nucleic Acids Research, 27, 209-212); 및 KABAT 알고리즘 (Wu TT and Kabat E.A., 1970, J. Exp. Med. 132, 211-250)을 사용하여 확인하였다. 상기 두 방법 모두에 의해 밝혀진 서열을 개시한다.
일부 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 단편의 중쇄 CDR1은 NNLIE (서열 번호 7) 및 GYAFTNNL (서열 번호 13)로부터 선택된다.
일부 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 단편의 중쇄 CDR2는 VINPGSGDTNYNEKFKG (서열 번호 8) 및 INPGSGDT (서열 번호 14)로부터 선택된다.
일부 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 단편의 중쇄 CDR3은 GDYYGGFAVDY (서열 번호 9) 및 ARGDYYGGFAVDY (서열 번호 15)로부터 선택된다.
일부 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 단편의 경쇄 CDR1은 RTSQDIGNYLN (서열 번호 10) 및 QDIGNY (서열 번호 16)로부터 선택된다.
일부 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 단편의 경쇄 CDR2는 YTSRLHS (서열 번호 11) 및 YTS (서열 번호 17)로부터 선택된다.
일부 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 단편의 경쇄 CDR3은 QQGKSLP (서열 번호 12) 및 QQGKSLPRT (서열 번호 18)로부터 선택된다.
일부 실시양태에 따르면, 중쇄 CDR이 서열 번호 7, 8 및 9의 서열로 구성된 것인, CEACAM1을 인식하는 단일클론 항체, 또는 적어도 항원 결합부를 포함하는 그의 단편을 제공한다.
일부 실시양태에 따르면, 중쇄 CDR이 서열 번호 13, 14 및 15의 서열로 구성된 것인, CEACAM1을 인식하는 단일클론 항체, 또는 적어도 항원 결합부를 포함하는 그의 단편을 제공한다.
일부 실시양태에 따르면, 경쇄 CDR이 서열 번호 10, 11 및 12의 서열로 구성된 것인, CEACAM1을 인식하는 단일클론 항체, 또는 적어도 항원 결합부를 포함하는 그의 단편을 제공한다.
일부 실시양태에 따르면, 경쇄 CDR이 서열 번호 16, 17 및 18의 서열로 구성된 것인, CEACAM1을 인식하는 단일클론 항체, 또는 적어도 항원 결합부를 포함하는 그의 단편을 제공한다.
구체적인 실시양태에 따르면, 항체는 중쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.
구체적인 실시양태에 따르면, 항체 또는 그의 단편은 서열 번호 26으로 구성된 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열 번호 28로 구성된 경쇄 가변 도메인 서열, 또는 항체 또는 단편 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 가지는 그의 유사체 또는 유도체를 포함한다.
일부 특정 실시양태에 따르면, 본 발명은 i. 서열 번호 13, 14, 15, 16, 17, 및 18 및 ii. 서열 번호 7, 8, 9, 10, 11, 및 12로부터 선택되는 6개의 CDR로 이루어진 한 세트; 및 상기 CDR 서열과 97% 이상의 서열 동일성을 가지는 그의 유사체 및 유도체, 및 마우스 IgG2a, 마우스 IgG2b, 마우스 IgG3, 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3으로부터 선택되는 프레임워크 서열을 포함하는 단일클론 항체, 또는 항체 단편으로서, 여기서, 단일클론 항체는 약 5x10-7 M 이상의 친화도로 2개 이상의 CEACAM 서브타입에 결합하는 것인, 단일클론 항체, 또는 항체 단편을 제공한다.
특정 실시양태에 따르면, 서열 번호 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 및 18로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 CDR 서열; 및 상기 CDR 서열과 97% 이상의 서열 동일성을 가지는 그의 유사체 및 유도체, 및 인간 IgG1, 인간 IgG2 및 인간 IgG3으로부터 선택되는 불변 영역 서열을 포함하는, CEACAM1을 인식하는 키메라 단일클론 항체로서, 여기서, 단일클론 항체는 약 5x10-7 M 이상의 친화도로 2개 이상의 CEACAM 서브타입에 결합하는 것인, 키메라 단일클론 항체를 제공한다.
특정 실시양태에 따르면, i. 서열 번호 13, 14, 15, 16, 17, 및 18 및 ii. 서열 번호 7, 8, 9, 10, 11, 및 12로부터 선택되는 6개의 CDR로 이루어진 한 세트; 및 상기 CDR 서열과 97% 이상의 서열 동일성을 가지는 그의 유사체 및 유도체, 및 인간 IgG1, 인간 IgG2 및 인간 IgG3으로부터 선택되는 불변 영역 서브부류를 포함하는 CEACAM1을 인식하는 키메라 또는 인간화된 단일클론 항체로서, 여기서, 단일클론 항체는 약 5x10-7 M 이상의 친화도로 2개 이상의 CEACAM 서브타입에 결합하는 것인, 키메라 또는 인간화된 단일클론 항체를 제공한다.
추가의 또 다른 특정 실시양태에 따르면, 서열 번호 30에 따른 중쇄 서열을 포함하는, 키메라 단일클론 항체 또는 적어도 항원 결합부를 포함하는 그의 단편을 제공한다.
추가의 또 다른 특정 실시양태에 따르면, 서열 번호 31에 따른 경쇄 서열을 포함하는, 키메라 단일클론 항체 또는 적어도 항원 결합부를 포함하는 그의 단편을 제공한다.
추가의 또 다른 특정 실시양태에 따르면, 서열 번호 30에 따른 중쇄 서열 및 서열 번호 31에 따른 경쇄 서열을 포함하는, 키메라 단일클론 항체 또는 적어도 항원 결합부를 포함하는 그의 단편을 제공한다.
정의
"CEACAM1"이라는 용어는 CEACAM1 유전자, 예컨대, NP_001020083.1, NP_001703.2의 단백질 생성물을 의미하는 것으로 사용된다. 현재까지 인간에서는 11개의 상이한 CEACAM1 스플라이스 변이체가 검출되었다. 개별 CEACAM1 이소폼은 세포외 면역글로불린 유사 도메인의 개수 (예를 들어, 4개의 세포외 면역글로불린 유사 도메인을 가지는 CEACAM1은 CEACAM1-4로 알려져 있다), 막 고정 및/또는 그의 세포질 테일의 길이 (예를 들어, 장쇄의 세포질 테일을 가지는 CEACAM1-4는 CEACAM1-4L로 알려져 있고, 단쇄의 세포질 테일을 가지는 CEACAM1-4는 CEACAM1-4S로 알려져 있다)와 관련하여 차이를 보인다. CEACAM1의 N-말단 도메인은 신호 펩티드 바로 다음에서 출발하며, 그의 구조는 IgV형인 것으로 간주된다. 예를 들어, CEACAM1 주석 P13688에서, N-말단 IgV형 도메인은 아미노산 35 내지 142의, 108개의 아미노산으로 구성된다. 상기 도메인은 동종친화성 결합 활성을 담당하는 것으로 확인되었다 (Watt et al., 2001, Blood. 98, 1469-79). 상기 스플라이스 변이체를 비롯한, 모든 변이체가 "CEACAM1"이라는 용어에 포함된다.
"항CEACAM1 항체," "CEACAM1을 인식하는 항체," "CEACAM1에 대한(against) 항체," 또는 "CEACAM1에 대한(to) 항체"는 충분한 친화도 및 특이적성으로 CEACAM1 단백질에 결합하는 항체이다. 전형적으로, 본 교시에 따른 항체는 약 10-8 또는 10-9 M인 최소 친화도로 CEACAM1에 결합할 수 있다. 본 발명에 따른 단일클론 항체 중 일부는 약 5x10-7 M인 최소 친화도로 CEACAM3, 5 및/또는 8에 결합할 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 항CEACAM1 항체는 CEACAM1 발현 또는 활성이 관여하는 질환 또는 병태를 표적화하고, 저해하는 데에서 진단제 또는 치료제로서 사용될 수 있다.
"항원"은 항체 형성을 유도하고, 항체가 결합할 수 있는 분자도 또는 분자의 일부이다. 항원은 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다. 상기 언급된 특이적 반응이란, 항원이 다른 항원에 의해 유발될 수 있는 다수의 다른 항체가 아닌, 상기 항원에 상응하는 항체와 고도로 선택적인 방식으로 반응하게 될 것이라는 것을 나타내는 것으로 한다. 본 발명에 따른 항원은 CEACAM1 단백질 또는 그의 단편이다.
본 발명에 따른 "항원 결정기" 또는 "에피토프"라는 용어는 특정 항체와 특이적으로 반응하는 항원 분자의 영역을 의미한다. 에피토프로부터 유도된 펩티드 서열은 동물을 면역화시키기 위해, 및 추가의 다중클론 또는 단일클론 항체를 제조하기 위해 당업계에 공지된 방법을 적용시킴으로써 단독으로 또는 캐리어 모이어티와 함께 사용될 수 있다. 에피토프로부터 유도된 단리된 펩티드는 항체를 검출하는 진단학적 방법에서, 및 상기 항체의 억제가 필요한 경우, 치료제로서 사용될 수 있다.
항체, 또는 면역글로불린은 이황화 결합에 의해 함께 연결된 2개의 중쇄, 및 2개의 경쇄를 포함하며, 상기 각각의 경쇄는 이황화 결합에 의해 각 중쇄에 "Y"자 형태로 연결되어 있다. 항체를 단백질분해 방식으로 분해시키면 Fv (단편 가변) 및 Fc (단편 결정질) 도메인이 생성된다. 항원 결합 도메인s, Fab는 폴리펩티드 서열이 다른 영역을 포함한다. F(ab')2라는 용어는 이황화 결합에 의해 함께 연결된 두 Fab' 아암을 나타낸다. 항체의 중심축을 Fc 단편이라 명명한다. 각 중쇄는 한쪽 단부에 가변 도메인 (VH)을 가지고, 이어서, 다수의 불변 도메인 (CH)을 가진다. 각 경쇄는 한쪽 단부에 가변 도메인 (VL), 및 그의 나머지 다른 한쪽 단부에 불변 도메인 (CL)을 가지며, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬되어 있고, 경쇄 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)과 정렬되어 있다. 각각의 경쇄와 중쇄 쌍의 가변 도메인이 항원 결합 부위를 형성한다. 경쇄 및 중쇄 상의 도메인은 동일한 일반 구조를 가지고, 각 도메인은 상보성 결정 영역 (CDR1-3)으로 알려져 있는 3개의 초가변 도메인에 의해 연결된 4개의 프레임워크 영역을 포함하며, 그의 서열은 상대적으로 보존적이다. 이들 도메인은 항원 결합 부위의 특이적성 및 친화성에 기여한다. 중쇄의 이소타입 (감마, 알파, 델타, 엡실론 또는 뮤)이 면역글로불린 부류 (각각 IgG, IgA, IgD, IgE 또는 IgM)를 결정짓는다. 경쇄는 모든 항체 부류에서 발견되는 2가지 이소타입 (카파 (κ) 또는 람다 (λ)) 중 하나이다.
"항체"라는 용어는 가장 괌범위한 의미로 사용되며, 이는 단일클론 항체 (전장의 항체 또는 무손상 단일클론 항체 포함), 다중클론 항체, 다가 항체, 다중특이적성 항체 (예컨대, 이중특이적성 항체), 및 원하는 생물학적 활성을 보이는 한, 항체 단편을 포함한다.
본 발명에 따른 항체는 적어도, 항체의 항원 결합부를 포함하는 분자이다. 본 발명에 따른 항체 또는 항체들은 무손상 항체, 예컨대, 다중클론 항체 또는 단일클론 항체 (mAb) 뿐만 아니라, 그의 단백질분해성 단편, 예컨대, Fab 또는 F(ab')2 단편을 포함한다. 키메라 항체; 인간 및 인간화된 항체; 재조합 및 공학처리된 항체, 및 그의 단편이 본 발명의 범주 내에 추가적으로 포함된다. 추가적으로, 항체의 가변 영역을 인코딩하는 DNA를 다른 항체를 인코딩하는 DNA 내로 삽입하여 키메라 항체를 제조할 수 있다. 단일 쇄 항체 또한 본 발명의 범주 내에 포함된다.
"항체 단편"은 일반적으로 무손상 항체의 항원 결합 부위를 포함하며, 이로써, 항원에 결합할 수 있는 능력은 보유하는, 무손상 항체의 오직 일부만을 포함한다. 본 정의에 포함되는 항체 단편의 예로는 (i) VL, CL, VH 및 CHI 도메인을 가지는 Fab 단편; (ii) CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 가지는 Fab 단편인, Fab' 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인을 가지는 Fd 단편; (iv) VH 및 CH1 도메인, CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 가지는 Fd' 단편; (v) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인을 가지는 Fv 단편; (vi) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편 (Ward et al., Nature 1989, 341, 544-546); (viii) 힌지 영역에서 이황화 브릿지에 의해 연결된 두 Fab' 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (ix) 단일 쇄 항체 분자 (예컨대, 단일 쇄 Fv; scFv) (Bird et al., Science 1988, 242, 423-426]; 및 [Huston et al., PNAS (USA) 1988, 85,5879-5883); (x) 동일 폴리펩티드 쇄내 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하는, 2개의 항원 결합 부위를 포함하는 "이중항체" (예컨대, EP 404,097; WO 93/11161; 및 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 6444-6448] 참조); (xi) 상보적인 경쇄 폴리펩티드와 함께 한쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한쌍의 탠덤 Fd 세그먼트 (VH-CH1-VH-CH1)를 포함하는 "선형 항체" (Zapata et al. Protein Eng., 1995, 8, 1057-1062]; 및 미국 특허 제5,641,870호)를 포함한다.
단일 쇄 항체는 항원 결합능을 가지며, 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 가변 영역과 상동성 또는 유사성인 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 복합 폴리펩티드, 즉, 연결된 VH-VL 또는 단일 쇄 Fv (scFv)일 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "중화 항체"란 본 명세서에 따르면, 생체내 또는 시험관내 검정법에 의해 측정된 바, 활성을 감소 또는 억제 (차단)시킬 수 있거나, 수용체를 통해 신호를 전달할 수 있는, 특이적 수용체 또는 리간드 표적에 대한 항원 결합 부위를 가지는 분자를 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "단일클론 항체"라는 용어는 실질적으로 동질성인 항체로 이루어진 집단으로부터 수득된 항체를 의미하고, 즉, 소량으로 존재할 수 있는, 가능한 천연적으로 발생된 돌연변이를 제외하면, 집단을 구성하는 개별 항체는 동일한 것이다. 단일클론 항체는 단일 항원에 대한 유도된 것으로, 고도로 특이적성이다. 추가적으로, 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대한 상이한 항체를 포함하는 다중클론 항체 제제와는 대조적으로, 각 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 유도된다. "단일클론"이라는 수식어는 항체가 임의의 특정 방법에 의해 제조되어야 한다는 것으로 해석되서는 안된다. mAb는 당업자에게 공지되어 있는 방법에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따르면 사용되는 단일클론 항체는 최초로 콜러(Kohler) 등 (Kohler et al., Nature 1975, 256, 495)에 의해 기술된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다 (예컨대, 미국 특허 제4,816,567호 참조). "단일클론 항체"는 또한 예를 들어, [Clackson et al., Nature 1991, 352, 624-628] 또는 [Marks et al., J. Mol. Biol, 1991, 222:581-597]에 기술되어 있는 기법을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
본 발명의 mAb는 IgG, IgM, IgE, IgA를 비롯한, 임의의 면역글로불린 부류의 것일 수 있다. mAb를 생산하는 하이브리도마를 시험관내에서 또는 생체내에서 배양할 수 있다. 프리스탄으로 프라이밍된 Balb/c 마우스 내로 개별 하이브리도마를 복강내로 주사하여 원하는 mAb를 고농도로 함유하는 복수액을 제조하는 생체내 제조법으로 고역가의 mAb를 수득할 수 있다. 당업자에게 주지되어 있는 칼럼 크로마토그래피 방법을 사용하여, 이소타입 IgM 또는 IgG인 mAb를 예컨대, 복수액으로부터, 또는 배양 상청액으로부터 정제할 수 있다.
본원의 단일클론 항체는 특별히, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 종으로부터 유래되거나, 또는 특정 항체 부류 또는 서브부류에 속하는 항체 중의 상응하는 서열과 동일하거나, 또는 상동성인 반면, 상기 쇄(들)의 나머지 부분은 또 다른 종으로부터 유래되거나, 또는 또 다른 항체 부류 또는 서브부류에 속하는 항체 중의 상응하는 서열과 동일하거나, 또는 상동성인 것인 "키메라" 항체 뿐만 아니라, 원하는 생물학적 활성을 보이는 한, 상기 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 제4,816,567호; 및 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 57:6851-6855 (1984)). 추가적으로, 친화성 또는 특이적성을 비롯한, 항체 분자의 특정의 특성을 변경시키기 위해 상보성 결정 영역 (CDR) 이식을 수행할 수 있다. CDR 이식에 대한 비제한적인 예는 미국 특허 제5,225,539호에 개시되어 있다.
키메라 항체는 그의 상이한 부분은 상이한 동물 종으로부터 유래된 것인 분자, 예컨대, 뮤린 mAb 및 인간 면역글로불린 불변 영역으로부터 유래된 가변 영역을 가지는 분자이다. 실질적으로 (수용체 항체로 명명되는) 인간 항체로부터의 가변 영역 프레임워크 잔기, 및 실질적으로 (공여체 항체로 명명되는) 마우스 항체로부터의 상보성 결정 영역을 가지는 항체 또한 인간화된 항체로 지칭된다. 예를 들어, 뮤린 mAb는 하이브리도마로부터의 수율은 더 높지만, 인간에서 면역원성이 더 높기 때문에, 인간/뮤린 키메라 mAb가 사용되는 경우와 같이, 키메라 항체는 주로 적용시 면역원성을 감소시키기 위해, 및 생산 수율을 증가시키기 위해 사용된다. 키메라 항체 및 그의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, PCT 특허 출원 WO 86/01533, WO 97/02671, WO 90/07861, WO 92/22653 및 미국 특허 제5,693,762호, 제5,693,761호, 제5,585,089호, 제5,530,101호, 및 제5,225,539호).
비인간 (예컨대, 뮤린) 항체의 "인간화된" 형태는 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 서열을 최소로 함유하는 키메라 항체이다. 대개, 인간화된 항체는 수용체 항체의 초가변 영역으로부터의 잔기가 원하는 특이적성, 친화성 및 능력을 가지는, 비인간 종 (공여체 항체), 예컨대, 마우스, 래트, 토끼, 또는 비인간 영장류의 초가변 영역으로부터의 잔기에 의해 대체된 것인 인간 면역글로불린 (수용체 항체)이다. 일부 경우에서, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비인간 잔기에 의해 대체된다. 추가적으로, 인간화된 항체는 수용체 항체에서, 또는 공여체 항체에서는 발현되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체의 성능을 추가적으로 개선시키기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화된 항체는 1개 이상의, 및 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서, 초가변 루프는 모두 또는 실질적으로 모두 비인간 면역글로불린의 것에 상응하고, FR은 모두 또는 실질적으로 모두 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화된 항체는 임의적으로 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부를, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 것 또한 포함할 것이다. 추가의 상세한 설명을 위해, [Jones et al., Nature 1986, 321, 522-525]; [Riechmann et al., Nature 1988, 332, 323-329]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol, 1992 2, 593-596]을 참조할 수 있다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 가지고/거나, 본원에 개시된 바와 같이, 인간 항체를 제조하는 기법 중 임의의 것을 사용하여 제조된 것이다. 인간 항체에 관한 상기 정의는 구체적으로 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체는 배제시킨다. 인간 항체는 당업계에 공지된 다양한 기법을 사용하여 제조될 수 있다. 한 실시양태에서, 인간 항체는, 인간 항체를 발현하는 파지 라이브러리로부터 선택된다 (Vaughan et al. Nature Biotechnology 1996 14,309-314]; [Sheets et al. PNAS (USA), 1998, 95, 6157-6162]; [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 1991, 227, 381]; [Marks et al., J. Mol. Biol, 1991, 222, 581). 인간 항체는 또한 인간 면역글로불린 유전자좌를 트랜스제닉 동물, 예컨대, 내인성 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전하게 불활성화된 것인 마우스 내로 도입함으로써 제조될 수 있다. 시험감염시, 유전자 재배열, 조립, 및 항체 레퍼토리를 비롯한, 모든 점에서 인간에서 관찰되는 것과 매우 유사한 인간 항체가 제조되는 것인 관찰된다. 이러한 접근법은 예를 들어, 미국 특허 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,661,016호, 및 하기 과학 공개 문헌 [Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992)]; [Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994)]; [Morrison, Nature 565:812-13 (1994)]; [Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51 (1996)]; [Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996)]; [Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 75:65-93 (1995)]에 기술되어 있다. 대안적으로, 인간 항체는 표적 항원에 대한 항체를 생산하는 인간 B 림프구의 불멸화를 통해 제조될 수 있다 (상기 B 림프구는 개체로부터 회수될 수 있거나, 또는 시험관내에서 면역화될 수 있다). 예컨대, [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)]; [Boerner et al, J. Immunol, 147 (1):86-95 (1991)]; 및 미국 특허 제5,750,373호를 참조한다.
"단일 쇄 가변 단편 (scFv)"이라는 용어는 단쇄 (보통 세린, 글리신) 링커와 함께 연결된, 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 융합물을 의미한다. 단일 쇄 항체는 항원 결합능을 가지며, 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 가변 영역과 상동성 또는 유사성인 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 복합 폴리펩티드 (연결된 VH-VL 또는 단일 쇄 Fv (scFv))일 수 있다. VH 및 VL 둘 모두 단일클론 항체 서열을 카피할 수 있거나, 또는 상기 쇄 중 하나, 또는 그 둘 모두는 미국 특허 제5,091,513호 (상기 특허는 그 전문이 본원에서 참고로 포함된다)에 기술된 종류의 CDR-FR 구축물을 포함할 수 있다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역과 유사한 별개의 폴리펩티드는 폴리펩티드 링커에 의해 결합된다. 이러한 단일 쇄 항체를 제조하는 방법은, 특히 VH 및 VL 쇄의 폴리펩티드 구조를 인코딩하는 DNA가 공지되어 있는 경우, 예를 들어, 미국 특허 제4,946,778호, 제5,091,513호 및 제5,096,815호 (상기 특허는 각각 그 전문이 본원에서 참고로 포함된다)에 기술된 방법에 따르면 수행할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "항체의 항원 결합부를 가지는 분자"는 임의의 동물 세포주 또는 미생물에 의해 생성된 임의의 이소타입의 무손상 면역글로불린 분자 뿐만 아니라, Fab 단편, Fab' 단편, the F(ab')2 단편, 그의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변부, Fab 미니 항체 (WO 93/15210호, 미국 특허 출원 08/256,790호, WO 96/13583호, 미국 특허 출원 08/817,788호, WO 96/37621호, 미국 특허 출원 08/999,554호 (상기 특허는 그 전문이 본원에서 참고로 포함된다) 참조), 이량체 이중특이적성 미니 항체 (Muller et al., 1998] 참조) 및 상기 반응성 분획을 혼입한 키메라 또는 단일 쇄 항체 뿐만 아니라, 상기 항체 반응성 분획이 물리적으로 삽입된 임의의 다른 종류의 분자도 또는 세포, 예컨대, 키메라 T 세포 수용체 또는 상기 수용체를 가지는 T 세포, 또는 상기 반응성 분획을 포함하는 분자의 일부에 의해 치료학적 모이어티를 전달하도록 발생된 분자를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 그의 항원 결합 반응성 분획도 포함하는 것으로 한다. 상기 분자는 효소적 절단, 펩티드 합성 또는 재조합 기법을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 임의의 공지된 기법에 의해 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 통상의 프로토콜에 따르면 CEACAM1, 또는 에피토프를 보유하는 단편, 유사체 또는 그를 발현하는 세포를 동물에게, 바람직하게는 비인간 동물에 투여함으로써 수득할 수 있다. 단일클론 항체를 제조하기 위해, 연속 세포주 배양물에 의해 제조되는 항체를 제공하는 당업계에 공지된 임의의 기법이 사용될 수 있다. 그 예로 예컨대, [Kohler, G. and Milstein, C, Nature 256: 495-497 (1975)]; [Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983)]; [Cole et al., pg. 77-96 in MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc. (1985)]에 기재되어 있는 것과 같은 각종 기법을 포함한다.
생체내에서 항체를 생성하는 종래 방법 이외에도, 항체는 파지 디스플레이 기술을 사용하여 시험관내에서 생성될 수 있다. 재조합 항체의 상기 제조법은 종래 항체의 제조법에 비하여 그 속도가 훨씬 더 빠르고, 엄청나게 많은 항원에 대해서도 상기 항체를 생성할 수 있다. 추가적으로, 종래 방법을 사용할 경우, 많은 항원들은 비면역원성이거나, 극도의 독성을 띠는 것으로 입증되어 있고, 따라서, 동물에서 항체를 생성하는 데에는 사용될 수 없다. 또한, 재조합 항체의 친화도 성숙 (즉, 친화도 및 특이적성을 증가시키는 것)은 매우 간단하고, 상대적으로 빠르다. 마지막으로, 특이적 항원에 대한 다수의 상이한 항체는 한 선택 방법으로 생성될 수 있다. 재조합 단일클론 항체를 생성하기 위해, 모두가 디스플레이 라이브러리에 기초하는 것인 다양한 방법을 사용함으로써 상이한 항원 인식 부위를 가지는 큰 항체 풀을 생성할 수 있다. 상기 라이브러리는 여러 가지 방식으로 제조될 수 있다: 중쇄 생식계열 유전자 풀에서 합성 CDR3 영역을 클로닝하여, 다양한 특이적성을 가지는 재조합 항체 단편이 그로부터 선택될 수 있는 것인 큰 항체 레퍼토리를 생성함으로써 합성 레퍼토리를 생성할 수 있다. 항체 라이브러리 구축을 위한 출발 물질로서 인간 림프구 풀을 사용할 수 있다. 인간 IgM 항체의 나이브 레퍼토리를 구축할 수 있고, 이로써 매우 다양한 인간 라이브러리를 생성할 수 있다. 상이한 항원에 대한 다수의 항체를 성공적으로 선택하는 데 상기 방법이 광범위하게 사용되어 왔다. 박테리오파지 라이브러리 구축 및 재조합 항체 선택에 관한 프로토콜은 주지된 참고 서적인 [Current Protocols in Immunology, Colligan et al (Eds.), John Wiley & Sons, Inc. (1992-2000), Chapter 17, Section 17.1]에 제공되어 있다.
비인간 항체는 당업계에 공지된 임의 방법에 의해 인간화될 수 있다. 한 방법에서, 비인간 상보성 결정 영역 (CDR)은 인간 항체 또는 공통(consensus) 항체 프레임워크 서열 내로 삽입된다. 이어서, 친화성 또는 면역원성을 조절하기 위해 추가의 변이를 항체 프레임워크에 도입할 수 있다.
예를 들어, 미국 특허 제5,585,089호 (퀸(Queen) 등)에는 공여체 면역글로불린으로부터의 상보성 결정 영역 (CDR), 및 인간 수용체 면역글로불린 중쇄 및 경쇄로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 프레임워크를 포함하며, 카바트(Kabat) 및 코티아(Chothia) CDR 바깥쪽 공여체 면역글로불린 프레임워크로부터의 아미노산을 포함하는 인간화된 면역글로불린으로서, 여기서, 공여체 아미노산이 수용체 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 프레임워크 중의 상응하는 아미노산을 대체하는 것인, 인간화된 면역글로불린, 및 그의 제조 방법을 개시하고 있다.
미국 특허 제5,225,539호 (윈터(Winter))에도 또한 항체 또는 항원 결합 단편의 가변 도메인이 제1 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인의 프레임워크 영역, 및 제2 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인의 상보성 결정 영역을 가지고, 여기서, 상기 제2 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인은 항원 결합 특이적성, 항원 결합 친화성, 종, 부류 또는 서브부류에 있어 상기 제1 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인과 상이한 것인, 변경된 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 그의 제조 방법을 개시하고 있다.
본 발명의 항체와 특이적인 면역반응성을 보이는 항이디오타입 항체 또한 이해된다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 대한 단일 쇄 항체를 제조할 수 있도록 단일 쇄 항체의 제조 기법 (미국 특허 제4,946,778호)을 적합화시킬 수 있다. 또한, 트랜스제닉 마우스, 또는 다른 유기체, 예컨대, 다른 포유동물을 사용하여 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 대해 면역특이적성인 인간화된 항체를 발현시킬 수 있다.
대안적으로, 파지 디스플레이 기술을 사용하여 항CEACAM1을 가지는 것에 대해 스크리닝된 인간으로부터의 림프구의 PCR 증폭된 v 유전자의 레퍼토리로부터, 또는 라이브러리로부터 본 발명의 폴리펩티드에 대해 결합 활성을 가지는 항체 유전자를 선택할 수 있다 (McCafferty, et al., 1990, Nature 348, 552-554]; [Marks, et al., 1992, Biotechnology 10, 779-783). 이들 항체의 친화도는 예를 들어, 쇄 셔플링에 의해 개선될 수 있다 (Clackson et al., 1991, Nature 352:628).
상기 기술된 항체를 사용하여 폴리펩티드를 발현하는 클론을 단리 시키거나, 확인함으로써 예를 들어, 친화성 크로마토그래피에 의해 폴리펩티드를 정제할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체 분자의 보존적 아미노산 변이체를 제공한다. 인코딩된 단백질의 전체 분자 구조를 보존하는 본 발명에 따른 변이체 또한 제조될 수 있다. 개시된 단백질 생성물을 구성하는 개별 아미노산의 특성을 고려해 볼 때, 일부 합리적인 치환은 당업자에 의해 인지될 것이다. 예를 들어, 포함된 잔기의 극성, 전하, 가용성, 소수성, 친수성, 및/또는 양친매성 성질에 기초하여 아미노산 치환, 즉, "보존적 치환"이 이루어질 수 있다.
"장애"란 항체를 이용한 치료로부터 이익을 얻을 수 있는 임의의 병태이다. 장애는 포유동물이 해당 장애에 쉽게 걸리게 하는 병리학적 병태를 비롯한, 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함한다. 본원에서 치료하고자 하는 장애의 비제한적인 예로는 양성 및 악성 종양; 백혈병 및 림프 악성 종양; 뉴런, 아교세포, 성상세포, 시상하부 및 다른 샘, 대식세포, 상피, 간질 및 블라스토코엘릭(blastocoelic) 장애; 및 염증성, 혈관형성, 면역 장애 또는 투과성 항진 상태를 포함한다.
"치료학상 유효량"이라는 용어는 포유동물에서 질환 또는 장애를 치료하는 데 효과적인 약물의 양을 의미한다. 암인 경우, 치료학상 유효량의 약물은 암 세포 개수를 감소시키고/거나; 종양 크기를 축소시키고/거나; 암 세포의 말초 기관으로의 침윤을 억제시키고/거나 (즉, 어느 정도까지 저속화시키고, 바람직하게는 중단시키거나); 종양 전이를 억제시키고/거나 (즉, 어느 정도까지 저속화시키고, 바람직하게는 중단시키고/거나); 종양 성장을 어느 정도까지 억제시키고/거나; 상기 장애와 관련된 증상들 중 하나 이상을 어느 정도까지 완화시킬 수 있다. 약물이 성장을 방해하고/거나, 현존하는 암 세포를 사멸시킬 수 있는 정도까지, 약물은 세포 증식 억제성 및/또는 세포 독성일 수 있다. 암 요법의 경우, 생체내 효능은 예를 들어, 생존기간, 질환이 진행되기까지의 기간 (TTP), 반응률 (RR), 반응 지속 기간, 및/또는 삶의 질을 평가함으로써 측정될 수 있다.
"치료"란 치료학적 치료, 및 예방적 또는 방지적 조치, 둘 모두를 의미한다. 치료를 필요로 하는 대상으로는 이미 장애를 앓고 있는 대상 뿐만 아니라, 장애에 예방하고자 하는 대상도 포함한다.
"암" 및 "암성"이라는 용어는 전형적으로 세포 성장이 조절되지 않는 것을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 병태를 의미하거나, 또는 기술한다. 암의 예로는 암종, 림프종, 아세포종, 육종, 및 백혈병을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 암의 보다 특별한 예로는 흑색종암, 폐암, 갑상샘암, 유방암, 결장암, 전립샘암, 간암, 방광암, 신장암, 자궁경부암, 췌장암, 백혈병암, 림프종암, 골수성암, 난소암, 자궁암, 육종암, 담관암, 또는 자궁내막암을 포함한다.
일부 실시양태에 따르면, 본 발명의 항체는 세포 독성 또는 치료학적 모이어티에 부착된다. 세포 독성 또는 치료학적 모이어티는 예를 들어, 세포 독성 모이어티, 독성 모이어티, 시토카인 모이어티, 이중특이적성 항체 모이어티, 세포독소, 케모카인, 화학요법, 아포프토시스 유발제, 인터페론, 방사성 모이어티, 또는 그의 조합일 수 있고, 그의 예는 하기에서 제공한다.
"항신생물성 조성물"이라는 용어는 종양 성장 또는 기능을 억제 또는 방해할 수 있고/거나, 종양 세포를 파괴시킬 수 있는 1개 이상의 활성 치료제를 포함하는, 암 치료에 유용한 조성물을 의미한다. 암 치료용 항신생물성 조성물에서 적합한 치료제는 화학요법제, 방사성 동위원소, 독소, 시토카인, 예컨대, 인터페론, 및 시토카인, 시토카인 수용체 또는 종양 세포 관련 항원을 표적화하는 길항제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게, 치료제는 화학요법제이다.
본원에서 사용되는 바, "진단하는"이라는 용어는 병상의 존부를 측정하고/거나, 병상 또는 증상을 분류하고/거나, 병상의 중증도를 측정하고/거나, 병상 진행을 모니터링하고/거나, 병상의 결과 및/또는 회복 가능성을 예측하는 것을 의미한다.
약리학적 성질
본 발명은 또한 본원에 다양한 기술된 병태의 치료, 진단, 또는 예방용 치료학적 또는 진단학적 조성물 제조를 위한, 활성제로서 CEACAM1을 인식하는 1개 이상의 항체를 포함하는 인간 의료용 제약 제제를 고려한다.
상기 제약 및 약제 제제에서, 활성제는 바람직하게는 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체(들) 및 임의적으로 임의의 다른 치료학적 성분과 함께 사용된다. 담체(들)는 제제의 다른 성분과 화합성이 있고, 그를 받은 수혜자에게 지나치게 유해하지 않다는 점에서 약제학적으로 허용되어야 한다. 활성제는 상기 기술된 바와 같이, 원하는 약리학적 효과를 달성하는 데 효과적인 양으로, 및 원하는 1일 용량을 달성하는 데 적절한 양으로 제공된다.
전형적으로, 항체의 항원 결합부를 포함하거나, 또는 펩티드 모방체를 비롯한, 또 다른 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 분자는 치료용 멸균 생리식염수 중에 현탁될 것이다. 대안적으로, 약학적 조성물은 활성 성분 (항체의 항원 결합부를 포함하는 분자)의 방출을 조절하도록, 또는 환자 시스템 내에서 장기간 동안 존재하도록 제제화될 수 있다. 다수의 적합한 약물 전달 시스템이 공지되어 있으며, 이는 예컨대, 삽입형 약물 방출 시스템, 하이드로겔, 히드록시메틸셀룰로스, 마이크로캡슐, 리포좀, 마이크로에멀젼, 미소구 등을 포함한다. 방출 조절형 제제는 본 발명에 따른 분자와 복합체를 형성하거나, 그에 부착될 수 있는 중합체를 사용함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 생체적합성 중합체로는 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트)의 매트릭스, 및 스테아르산 이량체 및 세바신산의 폴리안하이드라이드 공중합체의 매트릭스를 포함한다. 본 발명에 따른 분자, 즉, 항체 또는 항체 단편의 상기 매트릭스로부터의 방출 속도는 분자의 분자량, 매트릭스내 분자량, 및 분산된 입자의 크기에 따르면 달라진다.
본 발명의 약학적 조성물은 임의의 적합한 수단에 의해, 예컨대, 경구적으로 국소적으로, 비내로, 피하로, 근육내로, 정맥내로, 동맥내로, 관절내로, 병변내로 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 보통, 정맥내 (i.v.), 관절내, 국소 또는 비경구 투여가 바람직할 것이다.
본 발명에 따른 분자의 치료학상 유효량은 특히 투여 스케줄, 분자의 단위 투여 용량, 분자가 다른 치료제와 함께 병용하여 투여되는지 여부, 환자의 면역 상태 및 건강 상태, 투여되는 분자의 치료학적 활성, 및 치료하는 의사의 판단에 따르면 달라진다는 것은 당업자에게 자명할 것이다. 본원에서 사용되는 바, "치료학상 유효량"이란, 일정 기간 동안에 걸쳐 치료되는 장애와 관련된 하나 이상의 증상을 경감시키는 데 필요한 분자의 양을 의미한다.
비록 본 발명의 분자의 적절한 투여량은 투여 경로, 분자 종류 (폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 유기 분자 등), 환자의 연령, 체중, 성별 또는 상태에 따르면 달라지고, 결국 의사에 의해 결정되어야 하지만, 경구 투여하는 경우, 1일 투여량은 일반적으로 체중 1 kg당 약 0.01 mg 내지 약 500 mg, 바람직하게, 약 0.01 mg 내지 약 50 mg, 더욱 바람직하게, 약 0.1 mg 내지 약 10 mg일 수 있다. 비경구 투여하는 경우, 1일 투여량은 일반적으로 체중 1 kg당 약 0.001 mg 내지 약 100 mg, 바람직하게, 약 0.001 mg 내지 약 10 mg, 더욱 바람직하게, 약 0.01 mg 내지 약 1 mg일 수 있다. 1일 투여량은 예를 들어, 1일 1-4회 개별 투여가 전형적인 요법으로 투여될 수 있다. 다른 바람직한 투여 방법으로는 체중 1 kg당 약 0.01 mg 내지 약 100 mg을 관절내 투여하는 것을 포함한다. 유효량으로 전달하는 것과 관련하여 고려되어야 할 다양한 사항들이 예컨대, [Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th ed., Pergamon Press, 1990]; 및 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990]에 기술되어 있다.
병용 요법의 적합한 투약 요법은 당업계에 공지되어 있고, 이는 예를 들어, [Saltz et al. Proc ASCO 1999, 18, 233a] 및 [Douillard et al., Lancet 2000, 355, 1041-7]에 기술되어 있다.
주지되어 있는 바와 같이, 약제학적으로 허용되고, 활성 성분과 화합성인 부형제에 활성 성분으로서의 본 발명의 분자를 용해시키거나, 분산시키거나, 또는 혼합한다. 적합한 부형제는 예를 들어, 물, 염소, 인산염 완충처리된 염수 (PBS), 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등, 및 그의 조합이다. 다른 적합한 담체가 당업자에게 주지되어 있다. 추가적으로, 원하는 경우, 조성물은 소량의 보조 물질, 예컨대, 습윤화제 또는 유화제, pH 완충화제를 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 항신생물성 조성물과 함께 투여될 수 있다. 구체적인 실시양태에 따르면, 항신생물성 조성물은 1개 이상의 화학요법제를 포함한다. 본 발명에 따른 항체와 함께, 또는 별개로 투여될 수 있는 화학요법제로는 미토크산트론, 토포이소머라제 억제제, 방추체 독소 빈카: 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈 (탁솔), 파클리탁셀, 도세탁셀; 알킬화제: 메클로에타민, 클로람부실, 시클로포스파미드, 멜팔란, 이포스파미드; 메토트렉세이트; 6-머캅토퓨린; 5-플루오로우라실, 시타라빈, 겜시타빈; 포도필로톡신: 에토포시드, 이리노테칸, 토포테칸, 다카바진; 항생제: 독소루비신 (아드리아마이신), 블레오마이신, 미토마이신; 니트로소우레아: 카무스틴 (BCNU), 로무스틴, 에피루비신, 이다루비신, 다우노루비신; 무기 이온: 시스플라틴, 카보플라틴; 인터페론, 아스파라기나제; 호르몬; 타목시펜, 류프롤리드, 플루타미드, 및 메게스트롤 아세테이트를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 항암 활성을 보이는 당업계에 공지된 임의의 작용제를 포함할 수 있다.
구체적인 실시양태에 따르면, 화학요법제는 알킬화제, 항대사물질, 엽산 유사체, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체 및 관련 억제제, 빈카 알카로이드, 에피포도필로톡신, 항생제, L-아스파라기나제, 토포이소머라제 억제제, 인터페론, 백금 배위 착체, 안트라세네디온 치환된 우레아, 메틸 히드라진 유도체, 부신 피질 억제제, 부신 피질 스테로이드, 프로게스틴, 에스트로겐, 항에스트로겐, 안드로겐, 항안드로겐, 및 고나도트로핀 방출 호르몬 유사체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에 따르면, 화학요법제는 5-플루오로우라실 (5-FU), 류코보린 (LV), 이리노테칸, 옥살리플라틴, 카페시타빈, 파클리탁셀 및 도세탁셀로 이루어진 군으로부터 선택된다. 2종 이상의 화학요법제는 칵테일로 항CEACAM1 항체 투여와 함께 병용하여 사용될 수 있다.
하기 실시예는 본 발명의 화합물 및 방법을 제조 및 사용하는 방법을 예시하고자 하는 것이며, 어느 방식으로든 제한되는 것으로 해석되서는 안된다. 이하 본 발명이 그의 구체적인 실시양태와 함께 기술되지만, 다수의 수정 및 변형이 당업자에게 자명할 것이라는 것이 명백하다. 따라서, 첨부되는 특허청구범위의 정신 및 광범위한 범주 내에 포함되는 상기 수정 및 변형들 모두를 포함하는 것으로 한다.
실시예
항체를 제조하고, 그의 특징을 규명하는 수단은 당업계에 주지되어 있다. 본 발명에 따른 항CEACAM1 항체를 제조, 특징 규명 및 사용하기 위한 기법을 예시하기 위한 설명을 하기에 기술한다.
일반적으로, 본원에서 사용된 명명법 및 본 발명에서 사용된 실험 방법은 분자, 생화학, 미생물학 및 재조합 DNA 기법을 포함한다. 상기 기법은 문헌에 전체적으로 설명되어 있다. 예를 들어, ["Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., 1989]; ["Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. 1994]; [Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland 1989]; [Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York 1988]; [Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York]; [Birren et al. (eds) "Genome 분석: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York 1998]; 미국 특허 제4,666,828호; 제4,683,202호; 제4,801,531호; 제5,192,659호; 및 제5,272,057호에 기재된 방법; ["Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. 1994]; ["Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. 1994]; [Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT 1994]; [Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York 1980]을 참조할 수 있고; 이용가능한 면역검정법은 특허 및 과학 문헌에 광범위하게 기술되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 제3,791,932호; 제3,839,153호; 제3,850,752호; 제3,850,578호; 제3,853,987호; 제3,867,517호; 제3,879,262호; 제3,901,654호; 제3,935,074호; 제3,984,533호; 제3,996,345호; 제4,034,074호; 제4,098,876호; 제4,879,219호; 제5,011,771호; 및 제5,281,521호; ["Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984)]; ["Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. 1985]; ["Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. 1984]; ["Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. 1986]; ["Immobilized Cell and Enzymes" IRL Press, (1986)]; ["A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., 1984 and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA 1990]; [Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press 1996] 참조). 상기 문헌에 기재된 방법은 당업계에 주지되어 있는 것으로 간주된다.
실시예 1: CEACAM 을 인식하는 단일클론 항체 생성 및 특징 규명
마우스를 재조합 인간 CEACAM1 단백질로 면역화시킴으로써, 시험관내에서 나노몰 농도로 CEACAM1 동종친화성 상호작용을 효과적으로 차단시키는 단일클론 항체를 생성하였다. CEACAM1 차단 항체를 제조하는 하이브리도마를 제조하고, 수회에 걸쳐 재클로닝하여 안정한 클론을 수득하였다.
퓨전 안티바이즈 리미티드(Fusion Antibodies Ltd.)에 의해 CEACAM1을 인식하는 일례의 단일클론 항체의 DNA 및 아미노산 서열을 결정하였다. 하이브리도마 세포 펠릿으로부터 mRNA를 추출하고, RNA 추출 프로토콜을 사용하여 전체 RNA를 펠릿으로부터 추출하였다. 올리고(dT) 프라이머를 이용하는 역전사에 의해 RNA로부터 RT-PCR-cDNA를 생성하였다. 가변 도메인 프라이머를 이용하는 PCR 반응을 사용하여 단일클론 항체 DNA의 VH 및 VL 영역, 둘 모두를 증폭시켰다.
VH 및 VL 생성물을 인비트로겐(Invitrogen) 서열 분석 벡터 pCR2.1로 클로닝하고, 양성 형질전환체를 위해 TOP 10으로 형질전환시켰다. 선별된 콜로니를 채취하여 서열 분석을 통해 분석하였다. 생성된 DNA 및 아미노산의 결정된 서열은 하기와 같았다:
가변 중쇄 ( VH )
VH 도메인의 DNA 서열:
Figure pct00003
VH 도메인의 아미노산 서열:
Figure pct00004
가변 경쇄 ( VL )
VL 도메인의 DNA 서열:
Figure pct00005
VL 도메인의 아미노산 서열:
Figure pct00006
N-말단 아미노산 서열 분석 및 질량-스펙트럼 분석을 사용하여 VL 및 VH 아이덴티티를 확인하였다.
실시예 2: N-말단 아미노산 서열 확인
단일클론 항체 중 하나의 경쇄의 N-말단 서열을 확인하기 위해 에드먼(Edman) 분해 방법에 의해 경쇄의 아미노산 서열 분석을 수행하였다. 수득된 N-말단 서열은 DIQMTQTTSS (서열 번호 29)였고, DNA 서열에 기초하여 예상되는 N-말단 서열과 일치하였다.
실시예 3: 상보성 결정 영역 ( CDR ) 서열
2가지 상이한 알고리즘 방법을 사용하여 CDR 세그먼트를 확인하였다:
1. IMGT 알고리즘 (Lefranc et al., 1999, Nucleic Acids Research, 27, 209-212);
2. KABAT 알고리즘 (Wu TT and Kabat E.A., 1970, J. Exp. Med. 132, 211-250).
하기 표 1은 상기 두 방법을 사용하여 결정된 CDR 서열 뿐만 아니라, 최소 공통 서열 및 두 방법 모두를 사용하여 확인된 서열의 조합된 서열을 요약한 것이다.
［표 1］
Figure pct00007
실시예 4: 키메라 단일클론 항체 디자인 및 제조
가변 중쇄 및 경쇄의 DNA 서열 (서열 번호 25 및 27)을 사용하여 인간 IgG1 이소타입 불변 도메인 및 불변 경쇄 (CL) 인간 Ig카파 도메인을 포함하는 키메라 항체를 구축하였다. 비록 모체 단일클론 항체가 마우스 IgG1이고, 그의 인간 등가물은 IgG4이기는 하지만, 인간 IgG1 프레임워크를 사용하여 본 발명의 키메라 항체 중 일부를 구축하였다. 경쇄 및 중쇄의 DNA 서열을 합성하고, 별개의 프로모터를 사용하여 발현 벡터 pFUSION-DHFR1로 클로닝하였다.
CHO 세포의 일과성 형질감염
CHO 세포 현탁액 (인비트로겐: 영국)을 250 및 500 ml의 통기식 에를렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크 (코닝(Corning: 네덜란드)) 중 Pro CHO 5 무혈청 배지 (론자(Lonza: 영국))에서 130 rpm으로, 8% CO2하에, 37℃에서 배양하였다. 형질감염 당일, 세포를 2.0 X 106개의 세포/ml의 밀도로 시딩하고, 폴리에틸렌이민 (폴리사이언시즈 인코퍼레이티드(Polysciences Inc.: 미국 펜실베니아주))을 사용하여 2.5 g/ml의 플라스미드 DNA (진아트(Geneart: 독일))를 세포로 형질감염시켰다. 형질감염된 배양물을 130 rpm으로, 8% CO2하에, 37℃에서 9-10일 동안 인큐베이션시켰다. 배양물을 수거하기 전, 상청액을 4,000 rpm으로 40분 동안 회전시켰다.
배지를 수거하고, 별개의 두 배치에서 정제하였다. 배지를 0.8 ㎛ 자이로디스크 필터를 통해 여과하고, 1 ml 단백질 A 칼럼을 사용하여 정제하였다. 항체를 FPLC에 의해 정제하였다. 320 ml 샘플을 0.2 mls/min으로 밤새도록 로딩하고, 17시간 후, 0.5 mls/min으로까지 증가시켰다. 칼럼을 PBS를 이용하여 0.5 mls/min으로 세척/평형화시킨 후, pH 3.0 Gly/HCL 용리 완충제를 이용하여 용리시켰다. 우수한 피크를 관찰하고, 브래드포드(Bradford) 검정법을 이용하여 분획 1 내지 5를 정량화하였다. 브래드포드 검정법 결과, 분획 1-4 중에 단백질이 존재하는 것으로 나타났으며, 이를 풀링하고, 1 ℓ의 PBS 중에서 밤새도록 완충제 교환을 위해 투석시켰다 (4℃, 120 RPM). 4 ml 샘플의 농도는 1.823 mg/ml인 것으로 관찰되었고, 따라서, 대략 7.32 mg의 총 수율로 정제하였다. 두번째 배치에서, 브래드포드 검정법 결과, 단백질이 분획 1-4 중에 존재하는 것으로 나타났으며, 이를 풀링하고, 투석시켰다. 320 ml의 조절 배지로부터 대략 7.32 mg의 총 수율로 정제하였다 (배치 A). 910 ml의 배양물로부터 대략 15.74 mg의 총 수율로 정제하였다 (배치 B). 전체 일과성 발현을 통해 약 23 mg의 정제된 단백질을 수득하였다. 농도 측정 및 SDS/PAGE 분석 후, 19.65 mg의 키메라 항체를 수득하였다. 정제된 항체 샘플을 SDS-PAGE에 의해 분석하여 순도를 평가하였다. 도 1은 키메라 항체의 경쇄 및 중쇄를 보여주는 SDS-PAGE 겔 영상을 도시한 것이다. MS 분석 결과, CM10 중쇄의 분자량은 48.6 KDa이고, 경쇄는 23.3 KDa인 것으로 밝혀졌다.
CM10으로 표시되는 생성된 항체는 하기와 같은 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열을 가졌다:
중쇄 아미노산 서열 (신호 펩티드 비포함 ):
Figure pct00008
(가변 도메인은 굵은체로 표시, IMGT 에 따른 CDR 은 밑줄체로 표시).
경쇄 아미노산 서열 (신호 펩티드 비포함 ):
Figure pct00009
(가변 도메인은 굵은체로 표시, IMGT 에 따른 CDR 은 밑줄체로 표시).
CM10으로 표시된 예시적인 키메라 단일클론 항체의 중쇄 및 경쇄의 DNA 서열을 포함하는 플라스미드를 2011년 9월 28일자로 ATCC 수탁 번호 PTA-12130하에 기탁하였다.
실시예 5: 키메라 단일클론 항체 CM10 의 친화도 특징 규명
CM10 의 정제된 인간 CEACAM1 에의 결합
정제된 인간 CEACAM1을 사용하여 ELISA 검정법으로 CM10의 인간 CEACAM1에의 결합 특이적성을 시험하였다. 23개의 CM10 2배 희석액을 이용한 간접 ELISA를 사용함으로써 특이적 결합 곡선을 작성하였다. 도 2에 제시된 결과는 3중의 결과±SE로부터의 평균 O.D.를 나타낸다. 다른 10개의 독립 실험으로부터 유사한 결과를 얻었다.
키메라화 공정이 항체의 결합 친화도에 영향을 미치는지 여부를 시험하기 위해, 경쟁 ELISA에 의해 및 BIAcore 분석에 의해 키메라 항체 CM10을 CEACAM1 결합에 대하여 평가하였다.
ELISA의 경우, 재조합 정제된 인간 CEACAM1을 플레이트에 결합시켰다. 화학적으로 비오티닐화된 CM10을 불변 농도로 트레이서로서 사용하고, 농도가 증가하는 형태의 비표지화된 CM10과 비교하였다. 인큐베이션 및 세척 후, 스트렙아비딘(StrepAvidin)-HRP 컨쥬게이트로 플레이트를 발색시키고, HRP 기질로서 TMB를 이용하여 발색 반응을 전개시켰다.
50 ng/ml의 트레이서를 사용하여 CM10에 대하여 검출된 겉보기 친화도 값은 1.2-1.6 nM이었다.
BIA 코어 분석
NHS-EDC 커플링 화학법에 의해 비아코어3000(Biacore3000) 기구의 CM5 센서 칩의 단일 채널 상에 각 항체를 고정시켰다.
재조합 CEACAM1을 다양한 농도 (0.19, 0.39, 0.78, 1.56, 3.12, 6.25, 12.5 및 25 nM)로 칩 상에 50 ㎕/min으로 유동시켰다. 전개용 완충제는 PBS-ET (10 mM p-완충제 (pH 7.4), 150 mM NaCl, 3.4 mM EDTA 및 0.005% 트윈(tween) 20))였다. BIA이벨류에이션(BIAEvaluation) 소프트웨어 3.0을 이용하여 데이터를 분석하고, 3개의 독립 실험으로부터 계산된 CM10-CEACAM1 친화도의 KD 값은 (KD): 4.07-5.05 nM (평균 4.56 nM)이었다.
CM10 의 막 결합 내인성 CEACAM1 에의 결합 특이적성
CM10의 막 결합 내인성 CEACAM1에의 결합을 시험하기 위해, FACS 분석을 수행하였다. 526mel 세포주를 양성 대조군으로 사용하고, 003mel을 음성 대조군 세포주로 사용하면서, 수개의 인간 흑색종 세포주를 hCEACAM1 발현에 대하여 스크리닝하였다. 526mel, 003mel, Malme 3M, Skmel 5 및 A375 세포주를 CM10으로 염색하였다. 빈(empty) 히스토그램은 mAb 염색을 나타내고, 진한 히스토그램은 배경 염색을 나타낸다. 각 히스토그램에서 CEACAM1 발현을 분석하는 데 5,000개 이상의 세포를 사용하였다.
도 3으로부터 알 수 있는 바와 같이, CM10이 막 결합 내인성 CEACAM1을 검출한다. Malme3M 및 Skmel5 세포주는 CEACAM1의 고도한 발현을 보인 반면, A375 흑색종 세포주에서는 어떤 발현도 검출할 수 없었다.
결론
키메라 공정은 성공적으로 수행되었다. 키메라 항체는 2개의 상이한 접근법에 의해 입증된 바와 같이, 1.4 nM의 친화도로 CEACAM1에 결합한다. CM10의 각종 흑색종 세포주에의 결합 특이적성을 시험하는 FACS 분석을 통해 항체가 그의 생물학적 결합능을 보유한다는 것이 입증되었다.
실시예 6. CM10 의 활성 평가
세포-세포 상호작용 차단에 관한 검정법
CEACAM1 세포-세포 상호작용을 차단시킬 수 있는 항CEACAM1 mAb의 능력을 측정하는 검정법은 마우스 z-쇄에 융합된 인간 CEACMA1의 세포외 부분으로 구성된 키메라 분자 (BW/CEACAM1)로 안정하게 형질감염된 뮤린 T 세포 (BW 세포)를 사용하였다. BW/CEACAM1 세포와, CEACAM1로 안정하게 형질감염된 B 세포 (221/CEACAM1)와의 공인큐베이션에 의한 CEACAM1의 진입으로 z-쇄에 의해 매개되는 마우스 IL-2 분비가 일어났다.
효과기 세포 (BW, CEACAM1을 발현)를 CM10 또는 PBS의 존재하에 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 효과기 세포를 CEACAM1을 발현하는 표적 세포 (221+) 또는 CEACAM1에 음성인 표적 세포 (221-)와 함께 밤새도록 공동 배양시켰다. 시판용 ELISA에 의해 마우스 IL-2 분비를 측정하였다. 도 4에 제시된 결과는 2부의 웰로부터의 평균 IL-2 분비를 나타내는 것이다. 도면에 제시되어 있는 바와 같이, CM10 첨가시, T 세포와 B 세포 사이의 CEACAM1 매개 세포-세포 상호작용은 IL-2 분비 차단에 의해 나타나는 바와 같이, 용량에 의존하는 방식으로 폐기되었다.
시험관내 면역조절 사멸 검정법
T 세포 사멸 검정법: 흑색종 반응성 T 세포 TIL (Tumor Infiltrating Lymphocytes: 종양 침윤 림프구, 흑색종 환자로부터 유래)은 매칭되는 HLA를 가지는 흑색종 세포를 파괴시킬 수 있다. 시바 메디컬 센터의 ELLA 인스티튜트(ELLA Institute at Shiba medical center)로부터 TIL을 구입하고, 임상 랩 프로토콜에 따르면 성장시켰다. CFSE로 표지화된 흑색종 세포 (SKmel5)를 얼음 상에서 30분 동안 CM10 (10 ㎍/ml)과 함께 사전 인큐베이션시켰다. 37℃에서 추가의 10시간 동안 인큐베이션시키는 동안 TIL을 첨가하였다. CFSE로 표지화된 흑색종 세포의 Pi-염색에 의해 사멸률(%)을 측정하였다. 효과기 대 표적의 비는 5:1이었다. 또 다른 검정법에서, CFSE로 표지화된 흑색종 세포를 를 얼음 상에서 30분 동안 CM10과 함께 사전 인큐베이션시켰다. 37℃에서 추가의 5시간 동안 인큐베이션시키는 동안 TIL을 첨가하였다. CFSE로 표지화된 흑색종 세포의 Pi-염색에 의해 사멸률(%)을 측정하였다. 결과는 처리당 3부의 웰로부터의 비사멸률(%)의 평균±SE를 나타낸다. 효과기 대 표적의 비는 5:1이었다.
도 5에 기술된 결과는 T 세포의 사멸 활성이 항CEACAM1 mAb, CM10의 존재하에서 증진된다는 것을 보여준다. 추가적으로, TIL이 어느 흑색종 세포도 사멸시킬 수 있는 검정 조건하에서 (단시간의 인큐베이션, 또는 낮은 TIL 비), CM10 첨가는 TIL의 사멸 활성을 자극시킨 반면, IgG1 이소타입 대조군 이용시에는 어떤 사멸도 검출되지 못했다 (도 6).
NK 세포 사멸 검정법
자연살세포 (NK 세포)는 표적 세포를 아포프토시스에 의해 사멸시키는, 퍼포린 및 그랜자임이라고 불리는 소형 단백질을 방출함으로써 악성 세포를 파괴시킬 수 있는 세포 독성 림프구의 한 종류이다. NK 세포는 수개의 상이한 경로를 통해, 그중에서도 특히 시토카인, FC 수용체, 및 표적 세포에의 MHC 클래스 1 부재를 통해 활성화될 수 있다. 표적 세포 상의 다양한 리간드에 대한 수개의 활성화 및 억제 수용체가 NK 세포의 최종 세포 독성 활성을 조절한다. NK 92MI 세포는 ATCC로부터 구입한 IL-2 독립 NK 세포주이다.
NK 92MI를 37℃에서 30분 동안 CM10 (0.2 ㎍/ml, 1 ㎍/ml 또는 5 ㎍/ml) 또는 이소타입 매칭되는 대조군 Ab (5 ㎍/ml)와 함께 인큐베이션시키고, CEACAM1을 발현하는 표적 세포를 추가의 5시간 동안 첨가하였다. 고전전 LDH 방출 검정법에 의해 사멸률(%)을 측정하였다. 결과는 처리당 3부의 웰로부터의 세포 독성(%)의 평균±SE를 나타낸다. 효과기 대 표적의 비는 2.5:1이었다.
도 7에 기술된 검정법은 PBS 또는 이소타입 매칭되는 IgG와 비교하여 CM10이, CEACAM1을 발현하는 2가지 흑색종 세포주 (SKMel5 및 G361)에 대한 NK 세포의 사멸 활성을 강력하게 증진시켰다는 것을 보여준다. 다른 2가지 CEACAM1+ 흑색종 세포주에서 및 다양한 효과기 대 표적의 비 (E:T)에서도 유사한 결과가 입증되었다.
항체 의존성 세포 매개 세포 독성
항체 의존성 세포 매개 세포 독성 (ADCC)은 특이적 항체가 결합된 표적 세포를 면역계의 효과기 세포 (대개 NK 세포)가 활발하게 용해시키는 세포 매개 면역 기전이다. CM10의 안전성 프로파일을 평가하기 위해, 본 발명자는 3가지 흑색종 세포주 (CEACAM1 양성 세포주: G361 및 SKmel5 및 CEACAM1 음성 세포주: SKmel28)에서 ADCC를 유도할 수 있는 CM10의 능력을 조사하는 예비 ADCC 검정법을 수행하였다.
대조군 항체 (예비 실험에서 ADCC 활성을 보인 다중클론 Ab 항CEACAM1)와의 비교하여 ADCC를 유도할 수 있는 CM10의 능력을 조사하였다. 이소타입 매칭되는 항체 (hIgG1 K)가 음성 대조군으로서의 역할을 하였다. 본 결과를 통해 CM10은 시험된 환경하에서는 ADCC를 일으키지 않는 것으로 나타났다.
보체 의존성 세포 독성
보체 단백질은 혈액 중에서 발견되고, 그의 작용은 항체의 작용을 "보완하는" 것이다. 보체 의존성 세포 독성 (CDC)은 표적 세포 표면에 결합된 항체를 보체에 고정시킴으로써 표적 세포막에 포어를 형성하여 최종적으로 세포 용해를 유도하는, 막 고역 복합체 조립을 일으키는 사멸 세포의 기전이다.
CM10의 안전성 프로파일을 평가하기 위해, CEACAM1을 발현하는 2가지 흑색종 세포주 (SKmel28 및 SKmel5)에서 CDC를 유도할 수 있는 CM10의 능력을 조사하였다. 시판용의 풀링된 인간 혈청을 보체 단백질 공급원으로서 사용하였다. 다우디(Daudi) 세포와 함께 인큐베이션된 시판용 단일클론 항체인 리툭시맙을 검정 양성 대조군으로 사용하였고, 시판용 IgG1K를 CM10에 대한 이소타입 매칭되는 대조군으로서 사용하였다. 흑색종 세포주 - SKMEL5 및 SKMEL28, 또는 양성 대조군 다우디 세포를 실온에서 1시간 동안 각각 CM10 또는 리툭시맙과 함께 인큐베이션시킨 후, 습윤화된 인큐베이터 (37℃, 5% CO2)에서 추가의 2시간 동안 정상적인 인간 혈청을 최종 농도 50%로 첨가하였다. 프로피디움 요오드 (PI) 염색에 의해 용해된 세포 비율(%)을 측정하였다. 결과 (도 14)는 2중으로 수행된 2개의 개별 실험의 평균±S.E.를 나타내는 것이며, 이는 CM10이 시험된 환경하에서는 CDC 용해를 유도하지 않는다는 것을 시사한다.
생체내 효능 실험
본 실험의 목적은 CM10이 생체내에서 흑색종 세포에 미치는 직접적인 효과 뿐만 아니라, 이종이식 환경에서는 보이지 않는 면역조절 효과를 평가하고자 하는 것이다.
이종이식 실험 보정
"ATCC" (SKMel5)로부터 구입한 CEACAM1 양성 인간 흑색종 세포주 및 "할란 라보라토리즈(Harlan laboratories)"로부터의 연령이 매칭되는 마우스인 NOD-SCID를 사용하였다. 종양 성장을 모니터링하고, 최적의 TIL 요법을 찾기 위해 보정 검정법을 수행하였다. SKMel5 흑색종 세포를 SCID-NOD 마우스의 SC (피하)에 주사하고, 신체 측정에 의해 종양 부피를 모니터링하였다. 종양 부피가 100 ㎣에 도달하였을 때, 마우스를 5개의 무작위 군으로 나누었다. TIL을 2가지 상이한 농도로 IT (종양내)에, 또는 1가지 농도 (마우스당 20X106개)로 IV (정맥내)에 주사하는데, 이때 한 군에는 단 1회 주사하고, 두번째 군에는 2회에 걸쳐 TIL을 주사하였다. 각각의 TIL 주사 후, 5일간 hIL-2를 투여하였다. 보정 실험을 통해 종양 크기에 미치는 효과는 TIL IV 주사가 IT 투여보다 더 높다는 것이 입증되었다. 추가적으로, T 세포 반감기로부터 예측할 수 있는 바와 같이, 반복 TIL 요법은 단일 주사에 비하여 더 우수한 종양 성장 억제를 제공하였다. 이러한 데이터에 기초하여, 추후 이종이식 실험에서는 TIL을 IV 주사에 의해 매 10일마다 투여하는 것으로 하였다.
CM10 의 생체내 면역조절, 항암 활성
인간 CEACAM1 양성 SKmel5 흑색종 세포를 SCID-NOD 마우스 SC에 주사하였다. 종양 부피가 대략 100 ㎣에 도달하였을 때, 마우스를 하기 처리군 중 하나로 무작위화시켰다: a) 매주 PBS를 IV 주사; b) 매주 0.45 mg의 CM10을 IV 주사; c) 20 x 106개의 항종양 반응성 인간 T 세포 (TIL)를 3회에 걸쳐 IV 주사 및 매주 PBS를 IV 주사; d) 20 x 106개의 항종양 반응성 인간 T 세포를 3회에 걸쳐 IV 주사 및 매주 0.45 mg의 CM10을 IV 주사. 실험 환경에 대하여 알지 못하는 사람이 주당 2-3회에 걸쳐 종양 부피를 측정하였다. 도 8의 결과는 군당 6-10마리의 마우스로부터 얻은 평균 종양 부피±SE를 나타내는 것이다. 화살표 표시는 투여 시점을 나타내는 것이다 (CM10: 동그라미 표시, TIL: 삼각형 표시, CM10 및 TIL: 개방형 사각형 표시). 제시된 바와 같이, 오직 CM10만을 단독으로 사용하였을 때 또는 오직 TIL만을 단독으로 사용하였을 때, 종양 성장이 중간 정도로 억제되는 것이 관찰되었지만, 이러한 차이는 대조군 처리군과 비교하였을 때에는 통계적 유의도에는 도달하지 못했다. 놀랍게도, 입양 인간 T 세포 전달과 CM10 주사의 조합으로 유의적인 시너지 작용이 나타났고, 이종이식편 성장은 강력하게 억제되었다. 이러한 관찰 결과는 CM10이 T 세포 사멸에 미치는 증강 효과를 보이는 시험관내 데이터 (도 5 및 6)와 일치하는 결과였다.
TIL이 존재하에 CM10으로 처리된 군에서 유의적인 성장 억제가 관찰되었다. 이러한 결과는 상이한 세포주에서의 항CEACAM1 mAb의 면역자극 효과를 보강하는 것이었고, 이는 CM10이 유망한 면역조절 항체로서 사용될 수 있다는 것을 시사하는 것이다. 이러한 관찰 결과는 CM10이 T 세포에 의한 흑색종 세포 사멸에 미치는 자극 효과를 보이는 시험관내 데이터와 일치하는 결과였다.
결론
CEACAM1은 림프구 활성화의 조절인자인 것으로 알려져 있다. CM10은 두 CEACAM1 분자 사이의 상호작용을 차단함으로써 (도 4) CEACAM1에 의해 매개되는 억제성 신호를 제거하고, 그 결과로 종양 세포에 대한 세포 독성 림프구 활성화를 강력화시키는 (도 6 및 7) 항체이다. 생체내 이종이식 결과 (도 8)는 CM10의 면역자극 성질을 보강하는 것이며, TIL의 존재하에 CM10으로 처리된 마우스에서의 종양 성장에 대한 유의적인 억제를 입증하는 것이다. 도 9에 제시된 개략도는 면역계 세포에 의해 사멸 신호를 활성화시킬 수 있는 CEACAM1-CEACAM1 상호작용을 방해하는 CM10의 작용 모드에 관한 비제한적인 이론을 보여주는 것이다.
실시예 7: CM10 시험관내 안전성 평가
CM10 이 정상적인 인간 세포에 미치는 효과
암 세포는 면역계로부터 회피하기 위해 많은 분자의 발현을 변경시킨다. 수개의 증거를 통해 CEACAM1 발현은 흑색종 세포의 악성 형질전환 동안 증가한다는 것이 밝혀졌다. 문헌에 따르면, CEACAM1 또한 정상적인 세포에서도 발현되고, 따라서, 체내 CM10의 가능한 결합 부위를 지도화하고, CM10의 정상적인 세포에의 결합이 임의의 바람직하지 못한 결과를 일으킬 수 있는지 여부를 확인하는 것이 중요하다.
정상적인 인간 조직 교차 반응성
본 연구에서는 정상 및 악성 흑색종 샘플을 포함하는 인간 조직 마이크로어레이에서의 항CEACAM1 mAb의 결합 강도를 조사하였다. 표준 병리학적 점수화 체계를 이용하여 결합 강도를 평가하였다. 표준 IHC 방법에 의해 100건의, 악성 흑색종 사례 (원발성, 전이성) 및 양성 모반 사례를 포함하는 조직 마이크로어레이 (TMA)를 항CEACAM1 결합 강도에 대하여 분석하였다. 종양의 각 코어를 0 내지 +3으로 등급화하였다. 도 10에 제시되어 있는 바와 같이, 항CEACAM1 mAb의 결합 강도는 흑색종 샘플에서 50% 초과, 및 전이성 흑색종 샘플에서 65%인 것으로 관찰되었다.
다중의 정상적인 인간 기관 조직 마이크로어레이 (TMA)는 각 종류이 3명의 정상적인 인간 개체로부터 채취된 것인, 33가지 종류의 정상 기관을 포함하였다. 연령 범위는 2-67세였고, 43개의 표본은 여성으로부터, 57개의 표본은 남성으로부터 유래된 것이었다. 하기 조직은 항CEACAM1 mAb 결합에 대해 음성이었다: 대뇌, 소뇌, 난소, 췌장, 부갑상샘, 뇌하수체, 갑상샘, 편도선, 골수, 비장, 흉선, 폐, 심근, 위, 골격근, 피부, 말초 신경, 중피 및 망막. 세포 특이적 염색은 일부 기관에서는 주로 중공 내장 기관에서 관 또는 샘플을 형성하는 상피 세포의 내강측, 예컨대, 예컨대, 소장의 솔가장자리; 일부 정단 결장샘; 유관 상피; 간 담즙 소관계; 신장 세뇨관 내부 표면; 소수의 자궁내막샘; 침샘 내강부 상에서 검출되었다. 추가적으로, 부신 피질, 전립샘 정단부 표면, 고환의 레이디히(Leidig) 세포, 및 췌장 중의 단일 산재 세포에서 일부 낮은 세포 염색이 관찰되었다. 면역계 세포 중 양성인 것으로 관찰된 유일의 세포는 모세관내 호중구뿐이었다. 어떤 림프구 염색도 조직 및 림프 기관에서는 관찰되지 않았다. 마지막으로, 약한 정도 내지 중간 정도의 양성 염색이 난소, 부신, 신장, 및 드물게는 췌장, 전립샘, 뇌하수체 및 자궁내막을 비롯한, 선택적 부위의 소형 혈관의 내피 세포에서 관찰되었다.
IHC 분석 결과, 정상적인 인간 조직 중 시험된 조직의 대다수는 염색되지 않은 것과 비교하여, 흑색종 세포의 항CEACAM1 염색은 강력하게 나타났다. 그럼에도 불구하고, 중공 내장의 관 또는 샘의 상피 세포의 내강 측면에서 일부 선택적인 염색이 관찰되었다. 이러한 세포 측면은 일반적으로는 말초 혈액을 통해 투여되는 항체에의 접근 가능성은 낮다.
세포 1개당 결합된 CM10 분자의 정량화
각 세포 종류에 결합된 CM10 분자의 정확한 개수를 정량화하기 위해 콴티브라이트(QuantiBRITE) 키트를 사용하였다. 상기 키트를 사용하여 MFI (평균 형광 강도)를 직접 세포 1개당 결합된 분자 개수로 해석하였다. 항CEACAM1 결합에 대하여 양성인 것으로 관찰된 조직의 인간 1차 세포 3가지를 ATCC로부터 구입하였다. 내피 세포에서 발견되는 양성 염색을 보이는 HUVEC 세포; 전립샘 정단부 표면이 양성 염색을 보였는 바, 1차 전립샘 상피 세포, 및 1차 신장 근위 세뇨관의 내부 표면이 양성으로 염색되었는 바, 1차 신장 근위 세뇨관 상피 세포. 더욱 상세하게, SkMel 5, G361, Malme 3M, NK 92MI, HUVEC, 신장 1차 세포 및 전립샘 1차 세포를 ATCC 프로토콜에 따르면 성장시켰다. CM10을 제조사의 프로토콜에 따르면 PE 분자 (RPE LYNX 래피드 컨쥬게이션 키트 세로테크(RPE LYNX Rapid Conjugation Kits Serotec))에 컨쥬게이션시키고, 이 (1 ㎍/ml)를 이용하여 콴티브라이트 PE 비드 키트 (BD)를 사용함으로써 유세포 측정법에 의해 ABC (세포 1개당 결합된 항체수)를 측정하였다. 흑색종 세포주와의 비교로 명시된 1차 세포에서 유세포 측정법을 사용하여 세포 1개당 결합된 CM10 분자의 개수를 분석하였다. 각 세포주당 10,000개 이상의 세포가 계수되었다.
정량 분석 (도 11, 결과는 2-3개의 독립 실험의 평균±SE를 나타낸다)을 통해 CEACAM1 양성 흑색종 세포는 20,000-50,000개의 CM10 분자와 결합하는 반면, 일부 CEACAM1 발현을 보이는 정상적인 내피 및 상피 세포 (예컨대, HUVEC, 신장 및 전립샘)은 최대 단 2,000개의 CM10 분자에 결합하는 것으로 나타났다. 추가적으로, 다수의 CM10 항체가 NK 세포 (~20,000개)에 결합하였는데, 이는 CEACAM1이 활성화된 림프구에서 고로도 발현된다는 것을 밝힌 공개된 데이터와 상관관계가 있다. 상기 결과는 CM10의 안전성 프로파일 (1차 세포에서 낮은 발현) 및 활성화된 림프구-매개 세포 용해에서의 플레이어로서의 그의 활성 (NK 결과)을 보강한다.
CM10 존재하의 인간 1차 세포 증식
일부 양성 염색이 정상적인 조직에서 발견되었는 바, CM10이 1차 세포 성장에 미치는 효과를 조사하였다. HUVEC 및 1차 전립샘 세포를 ATCC 프로토콜에 따르면 성장시키고, XTT 표준 검정법을 이용하여 세포 증식에 대해 모니터링하였다. 세포-증식에 대해서는 어떤 효과도 검출되지 않았다.
요약
항CEACAM1 mAb의 정상적인 조직 및 흑색종 세포에의 결합 프로파일을 확인하였다. CEACAM1은 정상적인 멜라닌 세포에는 존재하지 않지만, 새로 발현될 수 있고, 대다수의 전이성 흑색종 표본에서 광범위하게 발현되고 (도 10), 다른 정상적인 기관에서 CEACAM1의 발현은 수개 조직 내의 특정 세포로 제한된다. 세포에 결합하는 CM10 분자이 개수를 측정하는 정량적 분석을 통해 정상적인 인간 1차 세포에서 극소수의 CM10이 결합하는 것으로 밝혀졌다 (도 11). 이러한 결과는 환자에게 주사된 CM10 분자 대다수는 발현 차이에 기인하여 정상적인 조직이 아닌, 암 세포를 주로 표적화하게 될 것이라는 것을 암시한다. 추가적으로, CM10은 세포 증식, CDC 활성에는 어떤 영향도 미치지 않았고, ADCC 활성에는 무시해도 될 정도로 또는 낮은 수준으로 영향을 미쳤는데, 이는 CM10의 비표적 세포에의 결합이 원치않는 세포 결과는 초래하지 않을 것이라는 것을 제안한다.
CM10 이 면역계에 미치는 효과
CM10은 두 CEACAM1 분자 사이의 상호작용을 차단하고, 그를 수행함으로써 악성 세포에 대한 림프구의 자극을 매개하는 면역자극성 항체이다. 항체는 중증 유해 사례를 유발할 수 있는 면역계의 촉발형 자극을 일으키지 않을 것이라는 것을 확인하는 것이 중요하다. 정상적인 림프구에서 세포막 상의 CEACAM1의 발현은 무시할 정도로 존재하지만, 세포 활성화 이후에 CEACAM1은 막으로 이동하여, 활성화된 림프구 상에서 빠르고 강력하게 상향조절된다 ([Gray-Owen and Blumberg 2006, Nat Rev Immunol 6, 433-46). 상기 입증된 바와 같이, 정상적인 림프 조직 (비장, 흉선, 골수) 또는 림프구와의 교차 반응성은 관찰되지 않았다; 그럼에도 불구하고, 잠재적인 부작용에 관한 예측을 지원하기 위해 다양한 시험관내 및 생체외 면역독성 분석을 수행하였다.
CM10 이 인간 림프구 증식에 미치는 효과
시험관내에서 면역조절성 항체의 안전성을 평가하는 데 있어 가장 일반적이고 허용되는 방법 중 하나는 상기 항체가 정상적인 인간 PBMC (말초 혈액 단핵 세포)의 증식 및 시토카인 분비에 미치는 효과를 조사하는 것이다. 3명의 비관련 기증자로부터의 인간 PBMC를 단리시키고, 3가지 상이한 농도 (2 ㎍/ml, 20 ㎍/ml 또는 200 ㎍/ml)를 이용한 CM10, 또는 대조군 mAb IgG1K (200 ㎍/ml)와 함께 60분 동안 인큐베이션시켰고, 8개의 복제 웰을 사용하였다. PHA (1 ㎍/ml)를 검정 복제 웰 중 4개에 첨가하고, 세포를 96시간 동안 인큐베이션시켰다. 3H-티미딘 혼입을 사용하여 세포 증식을 검정하였다. 모의 자극받은 세포 및 오직 PHA로만 자극받은 세포를 각각 검정용 음성 및 양성 대조군으로서 사용하였다. 휴지기 림프구 뿐만 아니라, (PHA 처리된) 활성화된 림프구에서 증식을 평가하였다. 모의 자극받은 세포 및 오직 PHA로만 자극받은 세포를 각각 검정용 음성 및 양성 대조군으로서 사용하였다. 그 결과 (도 12), CM10은 나이브 또는 활성화된 인간 림프구의 증식에는 어떤 영향도 미치지 않는 것으로 명백하게 밝혀졌다. PBMC 증식 연구 이외에도, CM10이 인간 PBMC로부터의 시토카인 분비에 미치는 효과를 평가하였다. 시토카인 분비 연구는 CM10의 면역조절 효과를 정의하고, 잠재적인 부작용 예측을 지원한다.
실시예 8. CM10 선택성 패널
상이한 CEACAM 패밀리 단백질을 과다발현하는 세포주 및 유세포 측정 분석을 사용하여 결합 프로파일의 특징 규명을 수행하였다. 인간에서, CEA 패닐리는 염색체 19ql3.2 상에서 18개의 유전자 및 11개의 슈도유전자에 의해 인코딩된다. 밀접한 관련이 있는 수개의 멤버가 CEACAM 패밀리 (CEACAM1,3, 4, 5, 6, 7, 8)에 속하고, 다양한 인간 세포 종류에 의해 차별적으로 발현된다. CEACAM 단백질은 정상 세포 및 암성 세포의 성장 분화를 지배하는 다양한 부착 매개 효과에 연루되었다 (Gray-Owen and Blumberg 2006, Nat Rev Immunol 6, 433-46). 패밀리 중의 밀접한 관련이 있는 단백질은 특정 멤버들 사이의 45% 내지 최대 90%의 다양한 유사성을 보이는 고도한 아미노산 유사성을 공유한다.
2차 작용제로서 비오틴 분자 및 스트렙아비딘 APC에 컨쥬게이트된 CM10을 이용하는 표준 FACS 프로토콜을 사용하였다. CEACAM1, 5, 6, 8을 발현하는 721.221 세포, 또는 CEACAM 3, 4를 일과적으로 발현하는 HEK 293 T를 2차 작용제로서 비오티닐화된 CM10 (1 ㎍/ml) 및 스트렙아비딘 APC로 염색하였다. 빈 히스토그램은 mAb 염색을 나타내고, 적색 히스토그램은 배경 염색을 나타낸다. 각 히스토그램에서 CM10 결합을 분석하는 데 10,000개 이상의 세포를 사용하였다. 염색된 세포의 MFI를 배경 염색의 MFI로 나눔으로써 FAB를 계산하였다. 도 13에 제시된 결과를 통해 CM10은 CEACAM1을 발현하는 세포에 강력하게 결합한다는 것이 명백하게 밝혀졌다. 중간 정도의 염색은 CEACAM3 및 5를 발현하는 세포에서 관찰되었다. 약하거나, 무시할 정도의 결합은 CEACAM 4, 6, 8을 발현하는 세포에서 나타났다.
결론
CM10은 일반적으로는 암, 및 특히 흑색종과 관련이 있는 것으로 밝혀진 단백질인 인간 CEACAM1을 인식하는 것으로 발생된 mAb이다. CEACAM1의 과다발현은 수개의 악성 종양, 그중에서도 특히, 흑색종, NSCLC, 갑상샘암 및 위암에서 확인되었다. 이는 CEACAM1의 과다발현은 흑색종 및 NSCLC 환자의 불량한 예후와 상관관계가 있을 수 있다는 것을 입증한다. CEACAM5는 90%의 위장관암, 결장직장암 (CRC) 및 췌장암, 70%의 비-소세포 폐암 세포 및 50%의 유방암을 비롯한, 고비율의 다수의 인간 종양에서 과다발현되는 것으로 밝혀졌다. 이는 또한 갑상샘암, 위암, 난소암 및 자궁암에서도 과다발현된다 (Thompson, Grunert et al. 1991, J Clin Lab Anal 5, 344-66). CEACAM5는 심지어는 CRC에서 간 전이 및 결장암의 수술후 감시에 대한 임상적 마커로서의 역할을 하기도 한다 (Duffy 2001, Clin Chem 47, 624-30). CM10이 CEACA5에 결합할 수 있다는 증거는 매우 중요하며, 이를 통해 CM10으로 치료될 수 있는 가능한 적응증은 4-5개 종류의 악성 종양에서부터 10개 초과로 확장될 수 있다. 임상 시험에 진입한 항CEACAM5 작용제로는 독성 물질, 예컨대, 진단학적 목적, 및 다양한 악성 종양 치료를 위한 목적, 이 둘 모두를 위한 방사성 물질에 컨쥬게이트된 항CEACAM5 항체를 포함한다. 심지어 상기 독성의 컨쥬게이트된 형태는 안정성 문제를 나타내지 않는 것으로 보이며, 이는 CEACAM5이 안전한 표적이라는 것을 시사하는 것일 수 있다 (Liersch, et al. 2005, J Clin Oncol 23(27), 6763-70]; [Ychou, et al. 2008, Clin Cancer Res 14(11), 3487-93). 한편, 상기 작용제들 중 어느 것도 종양의 면역학적 조절을 표적화하지 않는데, 이는 CEACAM1 및 CEACAM5, 둘 모두에 결합할 수 있는 항체, 예컨대, CM10에 의해 표적화될 수 있다.
실시예 9: CM10 의 에피토프 지도화
표적 분자의 불연속 에피토프를 재구축하기 위해, 구조화된 펩티드의 라이브러리를 합성하였다. 표적 분자는 하기 서열을 가지는 인간 CEACAM1 분자의 N-도메인이었다:
Figure pct00010
펩티드를 단일 루프, 이중 루프, 삼중 루프, 시트 유사 폴드, 나선 유사 폴드 및 그의 조합으로 구조화할 수 있는, 스캐폴드 상의 펩스캔의 화학적으로 연결된 펩티드(CLIPS: Pepscan's Chemically Linked Peptides on Scaffolds) 기술을 사용하여 라이브러리를 합성하였다 (Timmerman et al. 2007, J. Mol. Recognit. 20:283-99] 및 [Slootstra et al. 1996, Molecular Diversity 1: 87-96). CLIPS 주형을 시스테인 잔기에 커플링시킨다. 펩티드 중의 다중 시스테인의 측쇄를 하나 또는 2개의 CLIPS 주형에 커플링시킨다. 예를 들어, 0.5 mM의 T2 CLIPS 주형 1,3-비스(브로모메틸)벤젠 용액을 중탄산암모늄 (20 mM, pH 7.9)/아세토니트릴 (1:1(v/v))에 용해시킨다. 상기 용액을 펩티드 어레이 상에 첨가한다. CLIPS 주형은 펩티드 어레이 (3 ㎕ 웰을 포함하는 455개의 웰 플레이트)의 고체상 결합 펩티드에 존재함에 따르면 두 시스테인의 측쇄에 결합하게 될 것이다. 펩티드 어레이를 30 내지 60분 동안 용액 중에서 완만하게 진탕시키고, 그 사이 상기 펩티드는 용액 중에서 완만하게 피복된다. 마지막으로, 펩티드 어레이를 과량의 H2O로 철저하게 세척하고, PBS (pH 7.2) 중 1% SDS/0.1% 베타-머캅토에탄올을 함유하는 파괴-완충제 중에서 70℃에서 30분 동안 초음파 처리한 후, H2O에서 추가적으로 45분 동안 초음파 처리한다. 펩티드를 보유하는 T3 CLIPS를 유사한 방식으로 제조하였는데, 단, 예외적으로 시스테인 3개를 포함하였다.
천연 시스테인이 알라닌으로 치환된, 전체 단백질 중 상이한 두 영역을 조합한 CLIPS 매트릭스 세트; 길이가 6, 10, 15, 20, 25 및 33인 선형 펩티드 세트; 길이가 15인 선형 펩티드 세트로서, 여기서, 중간 잔기가 알라닌으로 치환된 것인 선형 펩티드 세트; 천연 시스테인이 알라닌으로 치환된, 길이가 15인 CLIPS 입체형태 루프 세트; 및 중간 잔기가 알라닌으로 치환되고, 여기서, 천연 시스테인이 알라닌으로 치환된, 길이가 15인 CLIPS 입체형태 루프 세트를 포함하는, 총 3,002개의 펩티드를 합성하였다.
각각의 합성된 펩티드에의 항체의 결합을 펩스캔-기판 ELISA에서 시험하였다. 펩티드 어레이를 1차 항체 (CM10) 용액과 함께 (4℃에서 밤새도록) 인큐베이션시켰다. 세척 후, 펩티드 어레이를 항체 퍼옥시다제 컨쥬게이트 1/1,000 희석액과 함께 25℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 세척 후, the 퍼옥시다제 기질 2,2'-아지노-디-3-에틸벤즈티아졸린 술포네이트 (ABTS) 및 2 ㎕/ml의 3% H2O2를 첨가하였다. 1시간 후, 발색을 측정하였다. 전하 결합 소자 (CCD) - 카메라 및 영상 처리 시스템을 이용하여 발색을 정량화하였다.
표준 96-웰 플레이트 ELISA-판독기와 유사하게, CCD 카메라로부터 얻은 값의 범위는 0 내지 3,000 mAU이다. 본 결과를 정량화하고, 펩랩(Peplab) 데이터베이스에 저장한다. 2차원 지도에서 변수에 의해 획득하게 되는 값이 색상으로 표시되는 그래프로 나타낸 데이터를 사용하여 분석을 위해 결합 값을 추출한다.
관찰된 결합 패턴에 기초하여, CM10.S91의 에피토프의 코어는 잔기 잔기 17VLLLVHNLPQQLF29로 구성된다. 2차 결합 영역은 대략 68YPNASLLIQNVT79의 서열에서 관찰되었다. 관찰된 결합 패턴을 표적 단백질의 이용가능한 결정 구조와 비교하면, CM10.S91에 대한 불연속 에피토프는 68PNASLLI75 (지지부)와 함께 17VLLLVHNLPQQLF29 (코어)로 구성된다고 제안된다.
실시예 10: CM10 의 활성을 평가하는 추가 실험
잠재적 PD 마커로서 , 효과기 세포에 의한 그랜자임 B 분비
강력한 약력학적 (PD) 마커 개발이 임상 시험에서 약물의 성공을 개선시키는 데 중요하고, 이는 효능 및 독성 사이에 균형을 이루는 최적의 약물 용량을 선택하는 데 도움을 줄 수 있다. PD 마커는 대개 약물 표적으로의 분자 경로에서 인접한 위치에 있으며, 치료학적 효과와는 상관없이 약물의 효과를 측정하는 데 사용된다. 그랜자임 B는 특이적 표적 인식시 세포 독성 T 세포 (CTL) 및 NK 세포의 세포질 과립을 통해 방출되는 세린 프로테아제이다. 결과적으로는 표적 세포의 아포프토시스를 매개한다. 본 발명자는 CM10이 특이적 표적 세포의 존재하에서 효과기 NK 및 T 세포로부터의 그랜자임 B 분비를 증진시키고, 이로써 항체에 의해 표적 세포의 사멸 증진을 관찰할 수 있는지 여부에 대해 측정하고자 하였다.
TIL을 CM10 (0.2 ㎍/ml, 1 ㎍/ml, 5 ㎍/ml 또는 10 ㎍/ml) 또는 이소타입 매칭되는 대조군 Ab (IPI-이필리무맙(Ipilimumab) 10 ㎍/ml)과 함께 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시키고; CEACAM1 및 HLA-A2-SKMEL5를 발현하는 표적 양성 흑색종 세포를 밤새도록 인큐베이션키기 위해 효과기 대 표적의 비=2.5:1로 첨가하였다. ELISA에 의해 그랜자임 B 분비를 측정하였다. 결과는 처리당 6회 반복으로부터 얻은 그랜자임 B 방출값의 평균±S.E를 나타낸다. 또 다른 독립 실험에서 유사한 결과를 관찰하였다.
도 15에 제시된 바와 같이, TIL은 CM10만이 단독으로 존재할 때에는 낮게 유지된, 낮은 초기 수준으로 그랜자임 B를 분비한다. 그랜자임 B는 오직 표적 세포가 TIL에 첨가되었을 때에만, 급상승하였다. 그러나, CM10은 그랜자임 B 분비를 높은 초기 수준을 초과하는 수준으로 유의적으로 증가시킬 수 있다. 효과기 세포로서 NK92MI 세포를 사용하였을 때에도 유사한 결과가 관찰되었는데, 이는 CM10이 유사한 방식으로 NK 세포로부터 그랜자임 B 분비를 증진시킬 수 있다는 것을 입증하는 것이다. CM10 처리에 대한 PD 마커로서의 그랜자임 B의 용도를 또한 생체내 모델 및 환자 표본을 비롯한 보충 실험 세트에서 조사하였다.
CM10 은 CEACAM1 - CEACAM5 상호작용을 차단한다
암배아성 항원 (CEA, CEACAM5, 및 CD66e)은 다양한 종류의 암, 특히, 결장직장 암종 뿐만 아니라, 위장관암, 췌장암, 비-소세포 폐암, 유방암, 갑상샘암, 위암 및난소암과 관련이 있는 것으로 밝혀졌다. 암 진단 및 요법에 대한 표적인 분자가 개발되었다.
MHC-I-결핍 흑색종 세포주와 NK 세포 사이의 동종친화성 CEACAM1 상호작용은 NK 세포에 의한 암 세포의 사멸을 유의적으로 억제시켰다 (Markel et al., J Immunol. 2002;168:2803-2810). 유사하게, HLA 클래스 I-결손 721.221 세포에서 CEACAM5의 강제 발현 또한 NK 매개 세포 독성을 억제시켰는데, 이는 CEACAM5-CEACAM1 이종친화성 상호작용 또한 면역 세포에서의 억제성 CEACAM1 신호전달을 유발할 수 있다는 것을 시사한다.
CEACAM1 양성 세포주 (SKMel 5)를 이소타입 대조군 또는 다양한 농도의 CM10과 함께 인큐베이션시킨 후, 비결합 CM10을 세척한 후, 가용성 비오티닐화된 CEACAM5와 함께, 또는 그를 포함하지 않고 인큐베이션시켰다. 2차 스트렙아비딘-APC 및 FACS 분석에 의해 비오티닐화된 CEACAM5의 세포에의 결합을 검출하였다. 결과는 2부의 웰의 평균±SE를 나타낸다. 다른 두 독립 실험에서 유사한 결과를 얻었다.
도 16의 결과는 CM10이 용량에 의존하는 방식으로 CEACAM1과 CEACAM5 사이의 결합을 억제시킨다는 것을 입증한다. 그러므로, 고수준으로 CEACAM5를 발현하고, 면역 세포를 억제시키기 위해 CEACAM1-CEACAM5 추축을 이용하는 악성 종양을 치료하는 데 CM10이 사용될 수 있다.
CM10 은 HLA 제한된 T 세포 사멸을 증진시킨다
세포 독성 T 세포는 바이러스로 감염된 세포 및 종양 세포를 파괴시키며, 이는 또한 이식 거부와도 관련이 있다. 이들 세포는 신체 거의 모든 세포의 표면에 존재하는, HLA 분자와 관련된 항원에 결합함으로써 그의 표적을 인식한다. 감염된 세포 또는 악성 세포를 사멸시키기 위해서는 적절한 반응이 발생할 수 있도록 하기 위해 여러가지 경로가 동원되어야 한다.
CM10이 HLA 제한된 "천연" CTL 활성을 증진시키는지 또는 대안적으로, 면역계의 일반 자극을 유발하는지 여부를 측정하는 데 상기 검정법 세트가 요구되었다.
TIL을 CM10 (0.2 ㎍/ml, 1 ㎍/ml, 5 ㎍/ml 또는 10 ㎍/ml) 또는 이소타입 매칭되는 대조군 항체와 함께 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. CEACAM1 및 HLA-A2를 발현하는 표적 흑색종 세포 SKMEL5를 HLA-A2 차단 단일클론 항체와 함께, 또는 그를 포함하지 않고 1시간 동안 사전 인큐베이션시킨 후, 밤새도록 인큐베이션키기 위해 효과기 대 표적의 비=2.5:1로 첨가하였다. 표준 LDH 방출 검정법에 의해 사멸을 측정하였다. 결과는 처리당 3회 반복으로부터 얻은 LDH 방출값의 평균±S.E를 나타낸다.
도 17의 결과는 HLA-A2 차단 항체의 존재하에서는 CM10이 TIL에 의한 흑색종 세포 사멸을 증강시킬 수 없고, CM10의 활성은 HLA 제한된다는 것을 입증한다. 또 다른 독립 실험에서도 유사한 결과를 관찰하였다. 그러므로, 상기 결과에 따르면, CM10은 생체내에서 악성 세포에 대한 CTL의 활성을 개선시킬 것이며, 면역계의 비특이적 활성화는 촉진시키지 않을 것이라는 것이 제안된다.
CM10 의 면역조절 활성이 생체내 종양 성장을 억제시킨다
신규한 항암제의 생체내 작용을 평가하는 데 가장 광범위하게 사용되는 모델 중 하나는 인간 종양 이종이식 모델이다. 상기 모델에서, 인간 종양 세포를, 인간 세포를 거부하지 않는 면역약화된 마우스의 피부에 이식한다. 주사되는 세포의 개수 및 세포 성장 속도에 따르면, 종양은 수주 동안에 걸쳐 발생하게 되며, 적절한 치료학적 요법에 대한 반응을 생체내에서 연구할 수 있다. 조기 단계에서 종양 형성을 치료하는 것을 포함하는 모델의 이점은 환자에서 전이 확산과 더욱더 유사할 수 있는 환경에서 작용제의 효과를 조사할 수 있고, 치료가 초기 종양 이식에 미치는 효과를 확인할 수 있는 기회가 있다는 점이다.
따라서, 예방학적 치료 요법하에 인간 흑색종 세포를 이식받은 SCID-NOD 마우스 생체내에서 CM10의 면역조절 활성을 조사하였다. 도 18에 명시된 5개의 처리군에 따르면 SCID-NOD 마우스를 무작위화시켰다. 6X106개의 SKmel5 세포 (흑색종 세포주)를 0일째 SC로 주사하였다. 마우스를 도면에 명시되어 있는 바와 같이 항체/TIL로 처리하였다. 화살표 표시는 투여 시점을 나타내고; 가는 화살표 표시는 항체-0.25 mg/마우스/주사 (CM10, IgG 대조군 및 이필리무맙 대조군)를 나타내고, 폭이 넓은 화살표 표시는 TIL (20X106개의 세포/마우스/주사)을 나타낸다. 주 2-3회에 걸쳐 종양 부피를 맹검으로 측정하였다. 결과는 각 군당 8-9마리의 마우스로부터 얻은 평균 종양 부피±SE를 나타낸다.
도 18은 입양 인간 T 세포 전달과 CM10 주사 사이의 조합으로 유의적인 시너지 작용이 나타났고, 이소타입 대조군과 비교하였을 때, 이종이식편 성장은 강력하게 억제되었다 (69% TGI)는 것을 나타낸다. 본 결과는 CM10은 또한 단일 작용제로서도 효과가 있고 (32일째 45% TGI), 가능하게는, 증식, 혈관신생을 억제시킴으로써, 또는 다른 생물학적 경로를 통해 종양 세포에 또는 종양 주변부에 직접적으로 작용하였다는 것을 입증한다.
동일 실험 세트에서, 실험 종료일 종양의 총 중량을 측정하였다. 얻은 결과는 부피 측정에 대한 것을 지지하고, TIL+ CM10 처리군에서 종양 부하량은 급격히 감소하였다는 것을 나타내며, 이는 또한 CM10 처리군에서 종양 중량은 통계학상 유의적으로 감소하였다는 것을 나타낸다.
CM10 은 CEACAM1 양성 췌장암 세포주 상에서 NK 세포의 면역조절 사멸 활성을 증진시킨다
예비 스크리닝 결과, 췌장암 세포주 및 환자 표본은 CEACAM1을 고수준으로 발현하는 것으로 나타났다 (췌장암 표본으로부터 94%는 CEACAM1 양성이었다). 그러므로, CM10이 췌장암 세포주에 대한 면역 세포의 활성을 증진시킬 수 있는지 여부를 조사하는 실험을 수행하였다. 다양한 농도의 CM10으로 사전 처리된 NK92MI 세포를 상이한 CEACAM1 양성 표적 췌장암 세포주와 함께 공동 배양함으로써 사멸 검정법을 수행하였다. NK 92MI를 CM10 (0.2 ㎍/ml, 1 ㎍/ml 또는 10 ㎍/ml) 또는 이소타입 매칭되는 대조군 Ab (10 ㎍/ml)와 함께 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다; A. CEACAM1을 발현하는 표적 세포를 추가의 5시간 동안 효과기 대 표적의 비=2.5:1로 (COLO-357), 또는 밤새도록 효과기 대 표적의 비=5:1로 (BXPC3) 첨가하였다. 결과는 고전적 LDH 방출 검정법에 의해 측정된, 처리당 3부의 웰로부터의 평균 세포 독성(%)±SE를 나타낸다.
도 19에 제시된 결과는 비록 NK 세포에 의한 췌장암 세포의 사멸이 상대적으로 낮기는 하지만, CM10이 상기 활성을 기준선 세포 독성 (PBS 또는 대조군 Ab)로부터 최대 2배 만큼 증진시켰다는 것을 나타낸다. 추가의 두 세포주에서도 유사한 결과가 관찰되었다.
CM10 은 CEACAM1 양성 췌장암 세포주의 존재하에서 NK 세포의 그랜자임 B 분비를 증진시킨다
흑색종 세포와 유사하게, CM10이 췌장암 세포주의 존재하에서 NK 세포로부터의 그랜자임 B 분비를 증진시킬 수 있는지 여부를 측정하기 위한 실험을 디자인하였다. 사멸 검정법과 유사한 환경하에서, NK 세포를 다양한 농도의 CM10으로 사전 처리한 후, 4개의 상이한 표적 췌장암 세포주와 함께 공동 배양하였다. 특이적 ELISA에 의해 상청액을 그랜자임 B 함량에 대하여 분석하였다. NK 92MI를 CM10 (0.2 ㎍/ml, 1 ㎍/ml 또는 10 ㎍/ml) 또는 이소타입 매칭되는 대조군 항체 (10 ㎍/ml)와 함께 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. CEACAM1을 발현하는 표적 췌장 세포를 추가의 5시간 동안 효과기 대 표적의 비=2.5:1로 A. (COLO-357 및 ASPC-1), 및 B. (SU8686) 첨가하거나, 또는 E:T=10:1로 C. (BXPC3) 첨가하였다. ELISA에 의해 그랜자임 B 분비를 측정하였다. 결과는 처리당 2-6회 반복으로부터 얻은 평균 그랜자임 B 방출값±SE를 나타낸다.
도 20은 CM10이 췌장암 세포의 존재하에서 NK 세포로부터의 그랜자임 B 분비를 증가시킨다는 것을 명벽하게 입증한다.
실시예 11: 인간화된 및 인간 항체
인간화된 항체는 전형적으로 비인간 CDR이 이식된 인간 프레임워크를 가진다. 따라서, 인간화된 항체는 인간이 아닌 공급원으로부터 그 내부로 도입된 하나 이상의 아미노산 서열을 가진다. 이러한 비인간 아미노산 잔기는 대개 "유입" 잔기로 지칭되며, 이는 전형적으로는 "유입" 가변 도메인으로부터 인계된다. 인간화는 본질적으로 원터(Winter)와 동료의 방법 (Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986]; [Riechmann et al., Nature, 332:323-327, 1988]; [Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988)에 따르면 인간 항체의 상응하는 서열을 대신하여 설치류 CDRs 또는 CDR 서열로 치환함으로써 수행될 수 있다. 따라서, 따라서, 상기와 같은 "인간화된" 항체는 실질적으로는 실질적으로 소수의 무손상 인간 가변 도메인이 비인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체이다 (미국 특허 제4,816,567호). 실제로, 인간화된 항체는 일부 CDR 잔기, 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체 중의 유사 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다.
인간화된 항체를 제조하는 사용되는, 경쇄 및 중쇄, 둘 모두의 인간 가변 도메인을 선택하는 것을 항원성을 감소시키는 데 매우 중요하다. 소위 "최적의" 방법으로 불리는 방법에 따르면, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열을 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대하여 스크리닝한다. 이어서, 설치류의 것과 가장 유사한 인간 서열을 인간화된 항체에 대한 인간 프레임워크 (FR)로서 수용한다 (Sims et al., J. Immunol., 151 :2296, 1993]; [Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901, 1987). 또 다른 방법에서는 경쇄 또는 중쇄의 특정 서브군의 모든 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 특정 프레임워크를 사용한다. 수개의 상이한 인간화된 항체에 대하여 동일한 프레임워크가 사용될 수 있다 (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285, 1992]; [Presta et al., J. Immunol, 151 :2623, 1993).
항체가 항원에 대한 고도한 친화도 및 다른 바람직한 생물학적 특성을 보유하면서 인간화되도록 하는 것이 추가적으로 중요하다. 이러한 목적을 달성하기 위해, 바람직한 방법에 따르면, 모체 및 인간화된 서열의 3차원 모델을 사용하여 모체 서열 및 다양한 개념상의 인간화된 생성물에 관한 분석 프로세스에 의해 인간화된 항체를 제조한다. 3차원 면역글로불린 모델은 보편적으로 이용가능하며, 이는 당업자에게는 잘 알려져 있다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 입체형태 구조를 도시하고 보여주는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 상기 디스플레이를 검사함으로써 후보 면역글로불린 서열의 기능에 있어 상기 잔기의 예상되는 역할을 분석할 수 있고, 즉, 후보 면역글로불린이 그의 항원에 결합할 수 있는 능력에 영향을 미치는 잔기를 분석할 수 있다. 이러한 방식으로, 원하는 항체 특징, 예컨대, 표적 항원(들)에 대한 친화도 증가가 달성될 수 있도록 FR 잔기를 수용체로부터 선택하고, 유입 서열과 조합할 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기가 항원 결합에 영향을 미치는 데 직접적으로 및 가장 실질적으로 관여하다.
대안적으로는 이제, 면역화되었을 때, 내인성 면역글로불린 생산 부재하에서 인간 항체의 전체 레퍼토리를 제조할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예컨대, 마우스)을 제조할 수 있다. 예를 들어, 키메라 및 생식계열 돌연변이체 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자의 동형접합성 결실은 내인성 항체 생산을 완전하게 억제시키는 것으로 기술된 바 있다. 상기 생식계열 돌연변이체 마우스에서 인간 생식계열 면역글로불린 유전자 어레이를 전달하면 항원 시험감염시 인간 항체는 제조될 것이다 (예컨대, [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551, 1993]; [Jakobovits et al., Nature, 362:255-258, 1993]; [Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33, 1993]; 및 [Duchosal et al. Nature 355:258, 1992). 인간 항체는 또한 파지-디스플레이 라이브러리로부터 유래될 수 있다 (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol, 227:381, 1991]; [Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581-597, 1991]; [Vaughan et al. Nature Biotech 14:309, 1996).
실시예 12. 항체 단편
항체 단편을 제조하는 다양한 기법이 개발되었다. 전통적으로, 이러한 단편은 무손상 항체의 단백질분해성 분해를 통해 유도되었다 (예컨대, [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117, 1992] 및 [Brennan et al., Science, 229:81, 1985). 그러나, 이들 단편은 이제 재조합 숙조 세포에 의해 직접적으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 상기 논의된 바와 같은 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 단편은 E. 콜라이(E. coli)로부터 직접적으로 회수되고, F(ab')2 단편을 형성하도록 화학적으로 커플링될 수 있다 (Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167, 1992). 또 다른 접근법에 따르면, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리될 수 있다. 항체 단편을 제조하는 다른 기법은 당업자에게 자명할 것이다. 다른 실시양태에서, 최상의 항체는 단일 쇄 Fv 단편 (scFv)이다.
실시예 13. 바이러스 감염에 대한 항 CEACAM 항체의 효능
하기 실험을 사용하여 바이러스 감염에 대한 CM10의 효능을 측정한다. 본 실험은 상이한 표적 세포, 각종 바이러스 및 수개의 생체내 및 시험관내 모델을 포함한다.
검출/진단: FACS 분석, RT PCR 및 면역조직화학법에 의한, 상이한 종류의 바이러스로 감염된 세포주 및 1차 세포에서의 CEACAM 발현 수준 조사.
예방: 표적 세포를 항CEACAM 항체와 함께 사전 인큐베이션 및 바이러스 감염 후 바이러스 부하 또는 바이러스 복제를 측정.
치료: 바이러스 감염 후, 감염된 세포를 면역계 세포와 함께 인큐베이션시키고, 효과기 세포의 사멸 능력 및 바이러스 부하를 조사한다. 추가적으로, 바이러스 감염 및 항CEACAM 항체 처리 후, 바이러스 부하 및 복제, 및 전체 생존기간을 생체내에서 측정한다.
구체적인 실시양태에 관한 전술한 설명은 본 발명자 이외의 사람들이 과도한 실험 없이도 일반 개념으로부터 벗어남 없이 다양한 적용을 위해 상기 구체적인 실시양태를 현 지식 내용을 적용시킴으로써 쉽게 변형 및/또는 개조할 수 있도록 본 발명의 일반적인 성질을 충분하게 제시할 것이며, 그러므로, 상기 개조 및 변형은 본 개시된 실시양태의 의미 및 범위 내에서 이해되어야 하고, 이해될 수 있도록 한다. 본원에서 사용된 용어 또는 전문 용어는 제한하고자 하는 것이 아니라, 설명하기 위한 것임을 이해하여야 한다. 개시된 다양한 기능을 수행하기 위한 수단, 물질, 및 단계는 본 발명으로부터 벗어남 없이 다양한 대체 형태를 취할 수 있다.
ATCC PTA-12130 20110928
<110> Tel Hashomer Medical Research Infrastructure and Services CCAM BIOTHERAPEUTICS LTD. RAMOT AT TEL-AVIV UNIVERSITY LTD. <120> ANTIBODIES TO CARCINOEMBRYONIC ANTIGEN-RELATED CELL ADHESION MOLECULE (CEACAM) <130> IPA140251-IL <150> IL PCT/IL2011/000808 <151> 2011-10-11 <160> 35 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X is Absent or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X is Absent or Ile <400> 1 Xaa Asn Asn Leu Xaa 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Ile Asn Pro Gly Ser Gly Asp Thr 1 5 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Gly Asp Tyr Tyr Gly Gly Phe Ala Val Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Gln Asp Ile Gly Asn Tyr 1 5 <210> 5 <211> 4 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Tyr Thr Ser Arg 1 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Gln Gln Gly Lys Ser Leu Pro 1 5 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Asn Asn Leu Ile Glu 1 5 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Val Ile Asn Pro Gly 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Claims (56)

  1. 서열 번호 1에 기재된 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 2에 기재된 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 3에 기재된 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 4에 기재된 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 5에 기재된 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 6에 기재된 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 가지는, 인간 CEACAM1을 인식하는 단일클론 항체 또는 그의 항체 단편 및 이의 유사체 및 이의 유도체.
  2. 제1항에 있어서, 서열 번호 7에 기재된 서열을 가지는 중쇄 CDR1, 서열 번호 8에 기재된 서열을 가지는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 9에 기재된 서열을 가지는 중쇄 CDR3을 포함하는, 단일클론 항체 또는 그의 단편.
  3. 제1항에 있어서, 서열 번호 13에 기재된 서열을 가지는 중쇄 CDR1, 서열 번호 14에 기재된 서열을 가지는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 15에 기재된 서열을 가지는 중쇄 CDR3을 포함하는, 단일클론 항체 또는 그의 단편.
  4. 제1항에 있어서, 서열 번호 10에 기재된 서열을 가지는 경쇄 CDR1, 서열 번호 11에 기재된 서열을 가지는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 12에 기재된 서열을 가지는 경쇄 CDR3을 포함하는, 단일클론 항체 또는 그의 단편.
  5. 제1항에 있어서, 서열 번호 16에 기재된 서열을 가지는 경쇄 CDR1, 서열 번호 17에 기재된 서열을 가지는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 18에 기재된 서열을 가지는 경쇄 CDR3을 포함하는, 단일클론 항체 또는 그의 단편.
  6. 제1항에 있어서, 서열 번호 13, 14, 15, 16, 17, 및 18에 기재된 CDR 서열을 가지는, 단일클론 항체 또는 그의 단편.
  7. 제1항에 있어서, 서열 번호 7, 8, 9, 10, 11, 및 12에 기재된 CDR 서열을 가지는, 단일클론 항체 또는 그의 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체의 항원 결합부와 90% 이상의 서열 동일성을 가지는, 상기 단일클론 항체 또는 그의 단편의 유사체 또는 유도체.
  9. 제1항에 있어서, 서열 번호 26에 기재된 서열을 가지는 중쇄 가변 도메인 서열, 또는 상기 중쇄 서열과 97% 이상의 서열 동일성을 가지는 그의 유사체 또는 유도체를 포함하는, 단일클론 항체 또는 그의 단편.
  10. 제1항에 있어서, 서열 번호 28에 기재된 서열을 가지는 경쇄 가변 도메인 서열, 또는 상기 경쇄 서열과 97% 이상의 서열 동일성을 가지는 그의 유사체 또는 유도체를 포함하는, 단일클론 항체 또는 그의 단편.
  11. 제1항에 있어서, 서열 번호 26에 기재된 서열을 가지는 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열 번호 28에 기재된 서열을 가지는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는, 단일클론 항체 또는 그의 단편, 또는 상기 항체 또는 단편 서열과 97% 이상의 서열 동일성을 가지는 그의 유사체 또는 유도체.
  12. 제1항에 있어서, 하기 i) 및 ii)를 포함하는 단일클론 항체 또는 그의 단편:
    i) 마우스 IgG2a, 마우스 IgG2b, 마우스 IgG3, 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 프레임워크 서열; 및
    ii) 서열 번호 13, 14, 15, 16, 17, 및 18에 기재된 서열을 가지는 6개의 CDR; 또는 서열 번호 7, 8, 9, 10, 11, 및 12에 기재된 서열을 가지는 6개의 CDR; 및 상기 CDR 서열과 97% 이상의 서열 동일성을 가지는 그의 유사체 및 유도체, 여기서, 상기 단일클론 항체 또는 단편은 약 5x10-7 M 이상의 친화도로 2개 이상의 CEACAM 서브타입에 결합한다.
  13. 제12항에 있어서, 약 10-8 M 이상의 친화도로 CEACAM1에 결합할 수 있는 것인, 단일클론 항체 또는 그의 단편.
  14. 제13항에 있어서, 약 5x10-7 M 이상의 친화도로 CEACAM3 및 CEACAM5 중 적어도 하나에 결합할 수 있는 것인, 단일클론 항체 또는 그의 단편.
  15. 제12항에 있어서, 상기 단일클론 항체 또는 단편이 키메라 단일클론 항체인 것인, 단일클론 항체 또는 그의 단편.
  16. 제15항에 있어서, 인간 IgG1, 인간 IgG2, 및 인간 IgG3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 유래 불변 영역을 포함하는, 키메라 단일클론 항체 또는 그의 단편.
  17. 제16항에 있어서, 서열 번호 13, 14, 15, 16, 17, 및 18에 기재된 서열을 가지는 6개의 CDR; 또는 서열 번호 7, 8, 9, 10, 11, 및 12에 기재된 서열을 가지는 6개의 CDR; 및 상기 CDR 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 가지는 그의 유사체 및 유도체를 포함하며, 여기서, 단일클론 항체는 약 10-8 M 이상의 친화도로 CEACAM1에 결합하는 것인, 키메라 단일클론 항체 또는 그의 단편.
  18. 제17항에 있어서, 인간 IgG1 서브타입의 불변 영역 서브부류를 포함하는, 키메라 단일클론 항체 또는 그의 단편.
  19. 제17항에 있어서, 서열 번호 30에 기재된 중쇄 서열을 포함하는, 키메라 단일클론 항체 또는 그의 단편.
  20. 제17항에 있어서, 서열 번호 31에 기재된 경쇄 서열을 포함하는, 키메라 단일클론 항체 또는 그의 단편.
  21. 제17항에 있어서, 서열 번호 30에 기재된 중쇄 서열 및 서열 번호 31에 기재된 경쇄 서열을 포함하는, 키메라 단일클론 항체 또는 그의 단편.
  22. ATCC 수탁 번호 PTA-12130으로 2011년 9월 28일 기탁된 플라스미드 중에 포함된 중쇄 및 경쇄의 DNA 서열로부터 제조된, CEACAM1을 인식하는 단일클론 항체.
  23. 서열 번호 7, 8, 9, 10, 11 및 12에 기재된 6개의 CDR 서열, 또는 서열 번호 13, 14, 15, 16, 17 및 18에 기재된 6개의 CDR 서열을 가지는 단일클론 항체가 결합하는 CEACAM1 분자 상의 동일한 에피토프에 결합할 수 있는, CEACAM1을 인식하는 단일클론 항체, 또는 적어도 항원 결합부를 포함하는 그의 단편.
  24. 제23항에 있어서, 상기 항체가 각각 서열 VLLLVHNLPQQLF (서열 번호 32) 및 YPNASLLIQNVT (서열 번호 33)를 가지는 인간 CEACAM1의 잔기 17-29 및 68-79 내의 에피토프와 반응성인 것인, 단일클론 항체 또는 그의 단편.
  25. 제23항에 있어서, 단일클론 항체가 결합하는 CEACAM1 분자 상의 상기 에피토프가 서열 VLLLVHNLPQQLF (서열 번호 32) 및 YPNASLLIQNVT (서열 번호 33) 내의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프인 것인 단일클론 항체 또는 그의 단편.
  26. 제23항에 있어서, 단일클론 항체가 결합하는 CEACAM1 분자 상의 상기 에피토프가 서열 VLLLVHNLPQQLF (서열 번호 32) 중 4개 이상의 아미노산을 포함하는 것인, 단일클론 항체 또는 그의 단편.
  27. 제23항에 있어서, 단일클론 항체가 결합하는 CEACAM1 분자 상의 상기 에피토프가 서열 VLLLVHNLPQQLF (서열 번호 32) 및 PNASLLI (서열 번호 34) 내의 에피토프인 것인, 단일클론 항체 또는 그의 단편.
  28. 서열 VLLLVHNLPQQLF (서열 번호 32)로부터 3개 이상의 아미노산, 및 서열 YPNASLLIQNVT (서열 번호 33)로부터 3개 이상의 아미노산을 포함하는 6-20개의 아미노산으로 이루어진 단리된 펩티드 서열, 또는 모체 서열과 85% 이상의 상동성을 가지는 유사체 또는 유도체.
  29. 제28항에 있어서, 서열 VLLLVHNLPQQLF (서열 번호 32)로부터 6개 이상의 아미노산을 포함하는, 단리된 펩티드.
  30. 제28항에 있어서, 서열 VLLLVHNLPQQLF (서열 번호 32) 및 PNASLLI (서열 번호 34)의 아미노산을 포함하는, 단리된 펩티드.
  31. CEACAM1을 인식하는 항체의 제조를 위한, 제28항에 따른 단리된 펩티드의 용도.
  32. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 항체 단편을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  33. 제32항에 있어서, 서열 번호 25 또는 서열 번호 27에 기재된 DNA 서열, 또는 상기 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 가지는 그의 유사체를 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오티드 서열.
  34. 1개 이상의, 제32항에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드.
  35. 제34항에 있어서, ATCC 수탁 번호 PTA-12130으로 2011년 9월 28일 기탁된 플라스미드.
  36. 치료학상 유효량의 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 단편; 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  37. 제36항에 있어서, CEACAM1, CEACAM3 또는 CEACAM5 발현, 활성화 또는 기능과 관련된 질환 또는 장애 치료를 위한 약학적 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 상기 질환 또는 장애가 세포 증식성 질환 또는 장애인 것인 약학적 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 상기 세포 증식성 질환 또는 장애가 위장관암, 결장직장암 (CRC), 췌장암, 비-소세포 폐암 (NSCL), 유방암, 갑상샘암, 위암, 난소암 및 자궁암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암인 것인 약학적 조성물.
  40. 제38항에 있어서, 상기 세포 증식성 질환 또는 장애가 흑색종, 췌장암, 폐암 및 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암인 것인 약학적 조성물.
  41. 1개 이상의, 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 항체 단편; 및 임의적인 담체 또는 부형제를 포함하는 진단학적 조성물.
  42. CEACAM의 발현, 활성화 또는 기능과 관련된 질환 또는 장애의 예방, 약화, 또는 치료를 필요로 하는 대상체에게 제36항에 따른 약학적 조성물을 포함하는 약학적 조성물의 치료학상 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, CEACAM의 발현, 활성화 또는 기능과 관련된 질환 또는 장애를 예방, 약화, 또는 치료하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 질환 또는 장애가 암인 것인 방법.
  44. 제42항에 있어서, 상기 질환 또는 장애가 바이러스 감염인 것인 방법.
  45. 제42항에 있어서, 약학적 조성물에 포함된 상기 단리된 항체 또는 항체 단편이 세포 독성 모이어티에 부착되어 있고, 상기 질환은 암인 것인 방법.
  46. 제46항에 있어서, 대상체에게 CEACAM1 발현 림프구를 투여하는 단계를 추가적으로 포함하는 것인 방법.
  47. 제46항에 있어서, 림프구가 T 세포, NK 세포 또는 종양 침윤 림프구를 포함하는 것인 방법.
  48. CEACAM 발현 림프구를, 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항체 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는, 면역조절 방법.
  49. CEACAM 발현 종양 세포를, 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항체 단편과 접촉시켜 CEACAM 발현 종양 세포의 이동을 억제시키는 단계를 포함하는, CEACAM 발현 종양 세포의 이동을 억제시키는 방법.
  50. CEACAM1 발현 림프구를, 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항체 단편과 접촉시켜 CEACAM1 동형 또는 이형 단백질-단백질 상호작용을 억제시키는 단계를 포함하는, CEACAM 동형 또는 이형 단백질-단백질 상호작용을 억제시키는 방법.
  51. 암을 앓는 대상체에게 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 항체 단편을 포함하는 조성물 및 항신생물성(anti-neoplastic) 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 항신생물성 조성물은 1개 이상의 화학요법제를 포함하고, 상기 항체 및 항신생물성 조성물의 공동 투여는 생존의 지속 기간 또는 진행을 효과적으로 증가시키는 것인, 암을 앓는 대상체의 반응 또는 생존의 지속 기간 또는 진행을 증가시키는 방법.
  52. 암 진단을 필요로 하는 대상체로부터 유래된 생물학적 샘플을 제41항의 진단학적 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서, 복합체가 사전결정된 임계치 이상으로 형성되었다면, 이는 대상체의 암을 시사하는 것인, 암 진단을 필요로 하는 대상체에서 암을 진단하는 방법.
  53. i. 생물학적 샘플을 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 항체 단편과 함께 인큐베이션시키는 단계;
    ii. 검출가능한 프로브를 사용하여 결합된 CEACAM을 검출하는 단계;
    iii. 공지된 양의 CEACAM을 함유하는 참조 샘플로부터 수득된 표준 곡선과 (ii)의 양을 비교하는 단계;
    iv. 표준 곡선으로부터 생물학적 샘플 중 CEACAM의 양을 계산하는 단계; 및
    v. (iv)의 양을 정상적인 CEACAM 양과 비교하는 단계를 포함하는, CEACAM 발현과 관련된 질환 또는 장애를 진단하는 방법.
  54. 세포 증식성 또는 혈관신생 관련 질환 또는 장애 또는 바이러스 감염을 진단, 예방 또는 치료하기 위한, 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 항체 단편의 용도.
  55. CEACAM의 발현 또는 활성화와 관련된 장애 또는 질환 치료용 약제 제조를 위한, 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 항체 단편의 용도.
  56. 세포 증식성 또는 혈관신생 관련 질환 또는 장애 또는 바이러스 감염 진단용 진단학적 조성물 제조를 위한, 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 항체 단편의 용도.
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