WO2018019380A1 - Immunstimulatorische anti-ceacam1-antikörper - Google Patents

Immunstimulatorische anti-ceacam1-antikörper Download PDF

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WO2018019380A1
WO2018019380A1 PCT/EP2016/068069 EP2016068069W WO2018019380A1 WO 2018019380 A1 WO2018019380 A1 WO 2018019380A1 EP 2016068069 W EP2016068069 W EP 2016068069W WO 2018019380 A1 WO2018019380 A1 WO 2018019380A1
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seq
antibody
ceacam1
domain
cells
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PCT/EP2016/068069
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Karl Sebastian LANG
Bernhard Singer
Vishal KHAIRNAR
Vikas DUHAN
Fan Zhou
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Universität Duisburg-Essen
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    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
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    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
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    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3

Definitions

  • the invention relates to substances for use in the therapy or diagnosis of neoplasia, (viral) infections, infectious diseases and / or T- and / or B-cell-dependent diseases, drugs and diagnostic agents, antibodies, variable antibody heavy chain ( V H ) domains, variable antibody light chain (V L ) domains, isolated nucleic acids, B cell lines, and a method of producing antibodies.
  • V H variable antibody heavy chain
  • V L variable antibody light chain
  • CEACAM1 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1
  • CD66a Cluster of Differentiation 66a
  • CEACAM 1 is a special cell-cell adhesion molecule present on leukocytes, epithelial cells and endothelial cells.
  • cells that express CEACAM1 on their surface also release it into the bloodstream.
  • the glycoprotein mediates cell adhesion via homophile or heterophile binding to other proteins of the cell adhesion molecule subset.
  • CEACAM 1 is a Potent Regulator of B Cell Receptor Complex-induced Activation
  • Gediminas Greicius, Eva Severinson, Nicole Beauchemin, Bjorn ⁇ brink and Bernhard B. Singer, Journal of Leukocyte Biology (2003), Vol. 74, 126-134 mentions that CEACAM1 regulates epithelial cell tumor growth, angiogenesis, NK cell cytotoxicity and T-cell cytotoxicity.
  • Chen et al. Editorial: CEACAM1: fine-tuned for fine tuning", Zhangguo Chen, Lanfen Chen and Richard S. Blumberg, Journal of Leukocyte Biology (2009), Vol.
  • CEACAM1 is a Negative Coreceptor for the B Cell Receptor and Promote CD19-mediated Adhesion of B Cells to a PI3K-dependent Manner
  • BCR B cell receptor
  • WO 2013/082366 A1 discloses CEACAM1 antibodies for tumor treatment, in particular cancer treatment.
  • WO 2013/054331 A1 deals with CEACAM1 antibodies in the context of the treatment of viral infections and cancers.
  • WO 2014/022332 A1 describes a composition which modulates the interaction between TIM3 and CEACAM1.
  • CEACAM1 as a so-called therapeutic target (therapeutic target substance) has thus been recognized in principle.
  • many questions regarding a therapeutic utility of CEACAM1 as a target have not yet been clarified.
  • the utility of CEACAM1 for activating other cells of the immune system, such as T cells is unknown.
  • therapeutically active substances whose therapeutic target is CEACAM 1.
  • therapeutically active substances capable of binding to CEACAM1 such as anti-CEACAM1 antibodies, which are capable of activating immune system cells such as T-cells and, more preferably, for treatment and / or Prevention of neoplasia and / or infections are suitable.
  • viral infections, viral infectious diseases and B cell-dependent diseases are also a corresponding need for viral infections, viral infectious diseases and B cell-dependent diseases.
  • the present invention was also the object of providing therapeutic substances which are particularly suitable for the therapy of viral infections, viral infectious diseases and B-cell-dependent diseases.
  • a further object of the present invention is to provide substances for use in the diagnosis of, in particular, viral infections, viral infectious diseases and B-cell-dependent diseases.
  • anti-CEACAM1 antibodies which contain an antigen binding site CDR (Complementarity Determining Region) with at least 80% sequence homology to sequence WI NTYTGEPT (SEQ ID No. 21) are particularly well suited
  • a first aspect of the present invention anti-CEACAM1 antibody comprising:
  • CDR2 H has at least 80% sequence homology to the following amino acid sequence:
  • WINTYTGEPT (SEQ ID NO: 21).
  • an antigen binding site CDR2 H of at least 80% sequence homology can be to the amino acid sequence WINTYTGEPT (SEQ ID NO. 21) can also be understood as an amino acid sequence that differs by no more than two amino acid residues of SEQ ID NO. 21, preferably by no more than a single amino acid residue differs from SEQ ID No. 21, in particular with SEQ ID No. 21 is sequence-identical.
  • the dissociation constant K d of the binding of the anti-CEACAM1 antibody according to the invention to CEACAM1 is preferably not more than 100 nM.
  • the anti- genitatis slaughter CDR1 H, CDR2 H, CDR3 H, CDR1 L, CDR2 L and CDR3 L together selected such that the anti-CEACAM1 antibody to CEACAM1 with a dissociation constant K d of not more than 100 nM, fundedugt no more than 50 nM, binds.
  • CEACAM 1 is preferably a mammalian CEACAM 1, especially human CEACAM 1.
  • the CDRs can be arranged in any order.
  • the CDRs in the following order from N- to C- terminus occur in the body anti-heavy chain (VH) domain: CDR1 H, CDR2 H, CDR3 H.
  • the CDRs in the antibody light chain (VL) domain occur in the following order from the N to the C-terminus: CDR1 L , CDR2 L , CDR3 L.
  • VH body anti-heavy chain
  • VL antibody light chain
  • amino acid residues can be located between the CDRs located closer to each other.
  • the invention is based on the following surprising findings: Surprisingly, it has been found that the antibodies according to the invention are suitable for activating T cells. It has been found that the antibodies according to the invention are suitable for the prevention and treatment of neoplasias and infections.
  • CEACAM 1 activation of CEACAM 1 in mice causes activation and especially differentiation of B cells and furthermore, in particular, makes it possible to positively influence the course of viral infections and infectious diseases.
  • the virus models used are the lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) and the vesicular stomatitis virus (VSV).
  • LCMV lymphocytic choriomeningitis virus
  • VSV vesicular stomatitis virus
  • the LCMV is not cytopathic in the mouse.
  • the damage that occurs in an infection primarily by the Immune response to the virus causes.
  • this virus behaves similar to the weakly cytopathic viruses hepatitis B virus (HBV), hepatitis C virus (HCV) and human immunodeficiency virus (HIV) in humans.
  • HBV lymphocytic choriomeningitis virus
  • HCV hepatitis C virus
  • HMV human immunodeficiency
  • the vesicular stomatitis virus is cytopathic in the mouse. It therefore behaves similarly to the Ebola virus, poliovirus, rabies virus, Ebstein-Barr virus (EBV), influenza virus, herpes simplex virus and cytomegalovirus (CMV).
  • the term “expression” encompasses all processes which are required for a complete, ie functional, expression of the protein CEACAM 1.
  • the expression "expression” in the context of the present invention in particular comprises transcription, the subsequent RNA expression. Processing, translation and protein maturation, such as protein folding and post-translational modifications, of CEACAM1.
  • function of CEACAM 1 for the purposes of the present invention defines the physiological function or physiological functions of CEACAM1, in particular its ability to influence the activity and in particular differentiation of B cells.
  • the anti-CEACAM1 antibody an antigen binding site CDR2 H of at least 80% sequence homology to the amino acid sequence WINTYTGEPT (SEQ ID NO. 21), the remaining antigen binding sites CDR1 H, CDR3 H, CDR1 L, CDR2 L and CDR3 L ) may in principle be variable with respect to their amino acid sequence, but will be suitable in their entirety to enhance the binding of the anti-CEACAM1 antibody to CEACAM 1.
  • Sequence homology is to be understood in the broadest sense, in particular as sequence homology as according to the BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) algorithm of NCBI (National Center for Biotechnology Information) for protein sequence comparisons (blastp) in the current version on July 14, 2016.
  • BLAST Basic Local Alignment Search Tool
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • amino acid sequences, anti-CEACAM1 antibodies, antibody domains, antigen binding sites CDRs, etc. shown and described herein may optionally each have post-translational modifications such as, for example, glycosylation, sulfation, phosphation, acetylation, acylation, etc.
  • An anti-CEACAM1 antibody may optionally be labeled with a radioactive or spin label be provided that one of the naturally occurring atoms is replaced by a detectable isotope (eg 3 H, 13 C, etc.).
  • labels eg, fluorophores, binding molecules (biotin, strepavidin, methotrexate, etc.
  • An anti-CEACAM1 antibody may optionally be labeled with a radioactive or spin label be provided that one of the naturally occurring atoms is replaced by a detectable isotope (eg 3 H, 13 C, etc.).
  • the antibody according to the invention preferably has an antigen binding site CDR2 H of at least 90% sequence homology, more preferably of at least 95% sequence homology, in particular with sequence identity to the amino acid sequence WINTYTGEPT (SEQ ID No. 21).
  • the anti-CEACAM1 antibody binds the N-domain of CEACAM1 according to SEQ ID NO: 39. According to a more preferred embodiment, the anti-CEACAM1 antibody binds the N-domain of CEACAM 1 according to SEQ ID Nos. 39 and additionally at least one further domain selected from the group consisting of A1 domain of CEACAM 1 according to SEQ ID No. 40, B domain of CEACAM 1 according to SEQ ID No. 41 and A2 domain of CEACAM 1 according to SEQ ID No. 42.
  • the anti-CEACAM1 antibody binds the N-domain of CEACAM 1 according to SEQ ID No. 39 and additionally the A1-domain of CEACAM 1 according to SEQ ID No. 40. According to a preferred embodiment, the anti-CEACAM1 binds - Antibodies the N-domain of CEACAM 1 according to SEQ ID No. 39 and additionally the B-domain of CEACAM 1 according to SEQ ID No. 41.
  • the anti-CEACAM1 antibody binds the N-domain of CEACAM 1 according to SEQ ID No. 39 and additionally the A2-domain of CEACAM 1 according to SEQ ID No. 42.
  • the anti-CEACAM1 antibody binds the N-domain of CEACAM 1 according to SEQ ID No. 39 and additionally the A1-domain of CEACAM 1 according to SEQ ID No. 40 and the B-domain of CEACAM1 according to SEQ ID No. 41.
  • the anti-CEACAM1 antibody binds the N-domain of CEACAM 1 according to SEQ ID No. 39 and additionally the A1-domain of CEACAM 1 according to SEQ ID No. 40 and the A2-domain of CEACAM1 according to SEQ ID No. 42.
  • the anti-CEACAM1 antibody binds the N-domain of CEACAM 1 according to SEQ ID No. 39 and additionally the B-domain of CEACAM 1 according to SEQ ID No. 41 and the A2-domain of CEACAM1 according to SEQ ID NO 42.
  • the anti-CEACAM1 antibody binds the N-domain of CEACAM 1 according to SEQ ID No.
  • bonds are preferably in each case bonds in which the dissociation constant K d of the respective bond is not more than 1000 nM, more preferably not more than 500 nM, in particular not more than 100 nM.
  • An epitope may be any epitope, e.g. a linear epitope or a structural epitope, a primary or a secondary epitope.
  • the epitope bound by the antibody is 3 to 20 amino acid residues in length and consists of 1 to 3 amino acid sequences of the N domain and 1 to 3 amino acid sequences of the A1, B and / or A2 domain.
  • CEACAM1 The consensus SEQ ID NO: 43 of CEACAM1 is as follows:
  • a polypeptide of the consensus sequence SEQ ID No. 43 of the CEACAM1 preferably forms the following secondary structures (positions): Betafaltblatt (37-46), Betafaltblatt (37-46), Betafaltblatt (51-56), Betafaltblatt (60-73), Helix ( 75-77), Betafaltblatt (78-83), Turn (84-87), Betafaltblatt (88-91), Betafaltblatt (99-101), Betafaltblatt (107-109), Helix (1 14-1 16), Betafaltblatt (1 18-126), beta sheet (132-141).
  • the epitope recognized by the anti-CEACAM1 antibody according to the invention on the CEACAM1-N domain comprises the amino acid residues Y68, K69, R72, F119 and E133 consensus sequence SEQ ID No. 43 of the CEACAM1.
  • CDR2 L of the antibody of the invention has the following amino acid sequence: YTSX b 4LX b 6Xb7 (SEQ ID NO: 22), wherein X b 4, X b 6, and X b7 each independently represent any amino acid residue.
  • the radicals X b4 , X b 6, and X b7 are defined such that: X b4 is T or K, X b6 is Q or H, and X b7 is P or S.
  • CDR2 L has at least 80% sequence homology to one of the following amino acid sequences: YTSTLQP (SEQ ID NO: 23) or YTSKLHS (SEQ ID NO: 24).
  • an antigen binding site CDR2 L of at least 80% sequence homology to the amino acid sequence TSTLQP (SEQ ID NO: 23) or YTSKLHS (SEQ ID NO: 24) can also be understood as an amino acid sequence which does not more than a single amino acid residue of SEQ ID NO. 23 or 24, in particular with SEQ ID NO. 23 or 24 is sequence-identical.
  • CDR2 L has at least 90% sequence homology, even more preferably at least 95% sequence homology, particularly sequence identity to one of the following amino acid sequences: YTSTLQP (SEQ ID NO: 23), or YTSKLHS (SEQ ID NO: 24).
  • the antibody of the invention comprises a CDR2 H an amino acid sequence WI NTYTGEPT and a CDR2 L at least 80% sequence homology to one of the following amino acid sequences (SEQ ID NO. 21): YTSTLQP or YTS- KLHS (SEQ (SEQ ID NO. 23) ID No. 24).
  • CDR1 H has the following amino acid sequence: GYX a3 FX a5 X a6 YX a8 MX a10 (SEQ ID NO. 25), wherein X a3, X a5, X a6, X a8 and X a i 0 are each independently represent any amino acid residue.
  • CDR1 H is characterized in that: X a3 T or I,
  • X a5 is T or R
  • X a6 is selected from the group consisting of V, N and T,
  • X a8 is G or V
  • X a io is selected from the group consisting of N, K and H.
  • CDR1 H has at least 80% sequence homology to one of the following amino acid sequences: GYTFTVYGMN (SEQ ID NO. 26), GYIFRNYGMK (SEQ ID NO. 27), or GYTFTTYVMH (SEQ ID NO. 28).
  • an antigen binding site CDR1 H of at least 80% sequence homology to the amino acid sequence SEQ ID Nos. 26, 27 or 28 can also be understood as an amino acid sequence which is not more than two amino acid residues of SEQ ID NO: 26, 27 or 28 more preferably not more than a single amino acid residue differs from SEQ ID NO: 26, 27 or 28, in particular SEQ ID NO: 26, 27 or 28 is sequence-identical.
  • CDR1 H has at least 90% sequence homology, even more preferably at least 95% sequence homology, in particular, sequence identity to one of the following amino acid sequences: GYTFTVYGMN (SEQ ID NO. 26), GYI FRNYGMK (SEQ ID NO. 27), or GYTFTTYVMH (SEQ ID No. 28).
  • CDR1 L has the following amino acid sequence: X d IASx d4 Xd5lXd7Xd8Xd9LXdii (SEQ ID NO. 29), wherein X d i, X d4, X d5, X d7, X d8, X d9 and X d n each independently represent each other any amino acid residue.
  • CDR1 L is characterized in that: X d i represents a basic amino acid residue, in particular K or R,
  • X d 4 is Q or D, in particular Q is;
  • X d 5 is D or H, in particular D is;
  • X d7 is N or S
  • X d g represents an aromatic amino acid residue, in particular is selected from the group consisting of F, Y and W, in particular F or Y, and
  • X d n is A or N.
  • CDR1 L is characterized in that:
  • X d i represents a basic amino acid residue, in particular K or R, X d5 is D,
  • X d7 is N or S
  • X d n is A or N.
  • CDR1 L has at least 80% sequence homology to one of the following amino acid sequences: KASQDI NKFLA (SEQ ID NO: 30), RASQDISNYLN (SEQ ID NO: 31), or KASDHINNWLA (SEQ ID NO: 32).
  • an antigen binding site CDR1 L of at least 80% sequence homology to the amino acid sequence SEQ ID Nos. 30, 31 or 32 can also be understood as an amino acid sequence containing not more than two amino acid residues of SEQ ID NO: 30, 31 or 32 more preferably not more than a single amino acid residue differs from SEQ ID NO: 30, 31 or 32, in particular SEQ ID NO: 30, 31 or 32 is sequence-identical.
  • CDR1 L has at least 90% sequence homology, even more preferably at least 95% sequence homology, particularly sequence identity to one of the following amino acid sequences: KASQDI NKFLA (SEQ ID NO: 30), RASQDISNYLN (SEQ ID NO: 31), or KASDH INNWLA ( SEQ ID NO: 32).
  • the CDR2 H CDR2 L , CDR1 H and CDR1 L are defined as described above.
  • the anti-CEACAM1 antibody according to the invention comprises: a variable antibody heavy chain (V H ) domain having at least 80% sequence homology to SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 7; and or
  • V L variable light chain domain having at least 80% sequence homology to SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 9.
  • the anti-CEACAM1 antibody of the invention has:
  • V H variable antibody heavy chain
  • V L variable light chain
  • the anti-CEACAM1 antibody of the invention has:
  • V H variable antibody heavy chain
  • V L variable light chain
  • the anti-CEACAM1 antibody of the invention has:
  • V H antibody heavy chain variable
  • V L variable light chain
  • the anti-CEACAM1 antibody according to the invention comprises:
  • V H antibody variable heavy chain
  • V L variable light chain
  • the anti-CEACAM1 antibody according to the invention has:
  • V H variable antibody heavy chain
  • V L variable light chain
  • the anti-CEACAM1 antibody to the CDR3 H has the following amino acid sequence: X c iXc2Xc3Xc4Xc5Xc6Xc7Xc8Xc9Xcio (SEQ ID NO: 33), wherein:
  • X C 3 is Y or T
  • X c5 is G or N
  • X c7 is M or A
  • CDR3 H has at least 80% sequence homology, more preferably at least 90% sequence homology, even more preferably at least 95% sequence homology, in particular, sequence identity to one of the following amino acid sequences: YRYDGGMDY (SEQ ID NO. 34) or ITTSNYALDN (SEQ ID NO. 35) ,
  • an antigen binding site CDR3 H of at least 80% sequence homology to the amino acid sequence SEQ ID No. 34 or 35 can also be understood as an amino acid sequence that deviates by not more than two amino acid residues from SEQ ID No. 34 or 35, more preferably not more than a single amino acid residue differs from SEQ ID No. 34 or 35, in particular with SEQ ID No. 34 or 35 is identical with the sequence.
  • the anti-CEACAM1 antibody a CDR3 L having the following amino acid sequence: XfiQXf 3 Xf4Xf5LXf7Xf8Xf9 (SEQ ID NO. 36), wherein X fl, X f3, X f4, X f5, xfz, X 'and X f9 each independently represent any amino acid residues.
  • amino acid residues are defined such that:
  • Xn L or Q
  • X f3 is Y or G
  • X f4 is D or N
  • X f5 is N or T
  • X f8 is T or W
  • X f9 T is or is missing.
  • CDR3 L has at least 80% sequence homology, more preferably at least 90% sequence homology, even more preferably at least 95% sequence homology, in particular sequence identity to one of the following amino acid sequences: LQYDNLYT (SEQ ID NO: 37), or QQGNTLPWT (SEQ ID NO: 37) 38).
  • an antigen binding site CDR3 L of at least 80% sequence homology to the amino acid sequence SEQ ID No. 37 or 38 can also be understood as an amino acid sequence that deviates by not more than two amino acid residues from SEQ ID No. 37 or 38, more preferably not more than a single amino acid acid residue differs from SEQ ID NO: 37 or 38, in particular with SEQ ID NO: 37 or 38 is sequence-identical.
  • the anti-CEACAM1 antibody according to the invention comprises:
  • the anti-CEACAM1 antibody according to the invention comprises:
  • the anti-CEACAM1 antibody according to the invention comprises:
  • a CDR3 L according to SEQ ID No. 39 in particular of at least 80% sequence homology to SEQ ID No. 37 or SEQ ID No. 38.
  • the anti-CEACAM1 antibody according to the invention comprises:
  • a CDR3 H according to SEQ ID No. 33 in particular of at least 80% sequence homology to SEQ ID No. 34 or SEQ ID No. 35; and a CDR3 L according to SEQ ID No. 39, in particular of at least 80% sequence homology to SEQ ID No. 37 or SEQ ID No. 38,
  • the antibody preferably binds the N-domain of CEACAM1 according to SEQ ID No. 39, in particular wherein the antibody preferably the N-domain of CEACAM1 according to SEQ ID No. 39 and additionally at least one further domain selected from the group consisting of A1 - Domain of CEACAM1 according to SEQ ID NO: 40, B domain of CEACAM1 according to SEQ ID NO: 41 and A2 domain of CEACAM1 according to SEQ ID NO: 42 binds.
  • the anti-CEACAM1 antibody according to the invention comprises:
  • the antibody preferably binds the N-domain of CEACAM1 according to SEQ ID No. 39, in particular wherein the antibody preferably the N-domain of CEACAM1 according to SEQ ID No. 39 and additionally at least one further domain selected from the group consisting of A1 - Domain of CEACAM1 according to SEQ ID NO: 40, B domain of CEACAM1 according to SEQ ID NO: 41 and A2 domain of CEACAM1 according to SEQ ID NO: 42 binds.
  • the anti-CEACAM1 antibody according to the invention comprises:
  • the antibody preferably binds the N-domain of CEACAM1 according to SEQ ID No. 39, in particular wherein the antibody preferably the N-domain of CEACAM1 according to SEQ ID No. 39 and additionally at least one further domain selected from the group consisting of A1 - Domain of CEACAM1 according to SEQ ID NO: 40, B domain of CEACAM1 according to SEQ ID NO: 41 and A2 domain of CEACAM1 according to SEQ ID NO: 42 binds.
  • the antibody according to the invention will bind generally with a dissociation constant K d of not more than 1000 nM to CEACAM1, preferentially bind with a dissociation constant K d of not more than 100 nM to CEACAM1.
  • the binding of the antibody according to the invention to CEACAM1 has a dissociation constant K d of not more than 50 nM.
  • the binding of the antibody to CEACAM1 has a dissociation constant K d of not more than 40 nM, in particular not more than 30 nM.
  • the antibody effect is optimal when the antibody binds the N domain and additionally the A1 domain, B domain or A2 domain.
  • the present invention also relates to an anti-CEACAM1 antibody comprising the N-domain of CEACAM1 according to SEQ ID No. 39, and preferably at least one further domain selected from the group consisting of A1 domain of CEACAM1 according to SEQ ID No. 40, B domain of CEACAM1 according to SEQ ID NO: 41, and the A2 domain of CEACAM1 according to SEQ ID NO: 42.
  • the anti-CEACAM1 antibody characterized by binding to the N-domain of CEACAM1 and at least one other of said domains, also has properties as described above.
  • Another aspect of the present invention relates to a nucleic acid encoding one of the anti-CEACAM1 antibodies according to the present invention.
  • the present invention relates to cells, in particular mammalian cells, containing such a nucleic acid.
  • the present invention also relates to the therapeutic, preventive and in v / 'iro application of the antibody. Therefore, one aspect relates to the anti-CEACAM1 antibody of the invention for use as a medicament. As noted above, the anti-CEACAM1 antibody of the invention is useful for the prevention of neoplasia and infection.
  • another of the present invention relates to the anti-CEACAM1 antibody of the invention for use in a method for the treatment and / or prevention of neoplasia and / or infection.
  • the present invention relates to a method for the treatment and / or prevention of neoplasms and / or infections, comprising the administration of a sufficient amount of the patients to be treated.
  • neoplasms are malignant tumors and / or cancer and / or infections are viral infections or viral infectious diseases.
  • a pharmaceutical composition containing at least one anti-CEACAM1 antibody according to the invention and at least one pharmaceutically acceptable carrier.
  • a pharmaceutically acceptable carrier can be an aqueous buffer (e.g., an Hepes, Tris or phosphate buffer), an organic solvent (e.g., dimethylsulfoxide (DMSO), ethanol), or a mixture of two or more thereof.
  • the anti-CEACAM1 antibodies of the invention are surprisingly also suitable for activating T cells. This can also be done ex vivo and therefore in vitro.
  • a further aspect of the present invention thus relates to a method for the activation of T cells in vitro, comprising the following steps:
  • step (iii) culturing the T cells treated according to step (ii) under conditions which do not hinder the activation of the T cells.
  • T cells are preferably CD8-positive T cells.
  • the T cells may be taken from a patient or may be from a cell culture.
  • the culturing conditions are preferably about 37 ° C in nutrient solution at about pH 7.1-7.4 for several hours or days.
  • the method is also exemplified in the examples below.
  • the term "antibody” should be broadly understood as any form of immunoglobulin or antigen-binding fragment thereof.Many forms of antibodies are known in the art, besides the antibody heavy chain (V H ) - domain and the antibody light chain (V L) domain of the antibody may be of any. In the experiments, a mouse antibody was used. the expert knows immediately how such a mouse antibody constructed and is obtainable. the con- constant part of the antibody (Fe) is then typical of the species. The antibody can be humanized, in particular for therapeutic and / or preventive use.
  • the antibody can be exemplary: immunoglobulin A (IgA), immunoglobulin D (IgD), immunoglobulin E (IgE), immunoglobulin G (IgG), immunoglobulin M (IgM), immunoglobulin Y (IgY) and immunoglobulin W (IgW).
  • Preferred antibodies are selected from the group consisting of IgA, IgG and IgD, in particular IgG.
  • the antibody according to the invention is a humanized antibody, in particular a humanized IgG antibody.
  • An antigen-binding fragment is for the purposes of the present invention also includes an anti gen Kunststoffsstelle CDR2 H of at least 80% sequence homology to the amino acid sequence WINTYTGEPT (SEQ ID NO.
  • an antigen-binding fragment is a fragment antigen binding (Fab fragment), a truncated antibody having one or both CDR regions or an isolated variable fragment (Fv) of an antibody.
  • the antibodies disclosed in the context of the present invention preferably each have an antibody-specific structure: they each have two identical heavy polypeptide chains and two identical light polypeptide chains, which are linked together by covalent disulphide bonds to form a Y-shaped structure.
  • the light chains each consist of a variable domain, hereinafter referred to as variable antibody light chain (V L ) domain, and a constant domain, hereinafter referred to as antibody constant light chain (C 1-) domain.
  • the heavy chains on the other hand, each have a variable domain, hereinafter referred to as variable antibody heavy chain (V H ) domain, and three constant domains, hereinafter referred to as constant antibody heavy chain (C H ) domains.
  • variable antibody heavy chain (V H ) domain of the antibody or a variable antibody light chain (V L ) domain of the antibody when referring to a variable antibody heavy chain (V H ) domain of the antibody or a variable antibody light chain (V L ) domain of the antibody, this means that the antibody has a total of two variable antibody heavy chain (V H ) domains, namely, one antibody heavy chain variable (V H ) domain per heavy chain, and two variable antibody light chain (V L ) domains, namely, antibody variable light chains - (V L ) -domain per light chain, having the features disclosed below.
  • V L constant antibody light chain
  • the present invention relates to the use of an anti-CEACAM1 antibody as an immune stimulant, which may optionally be used in combination with an anti-CEACAM1 antibody or several other immune stimulants (eg, TLR agonists, T cell ligands, etc.).
  • an immune stimulant eg, TLR agonists, T cell ligands, etc.
  • the present invention relates to an anti-CEACAM1 antibody for activating immune cells, in particular T-cells.
  • the anti-CEACAM1 antibody is an anti-CEACAM1 antibody of the invention as described herein.
  • An anti-CEACAM1 antibody can bring one or more CEACAM1 polypeptides and optionally other polypeptides into a common configuration. This can lead to the activation of a CEACAM1-mediated signal transduction pathway, which in turn can activate T cells.
  • An anti-CEACAM1 antibody, especially an anti-CEACAM1 antibody of the invention as described herein, may enhance the effect of immunostimulatory ligands.
  • the invention features a substance (particularly an anti-CEACAM1 antibody according to the present invention) for use in therapy, i. Treatment and / or prevention of viral infections and / or viral infectious diseases, preferably in humans or non-human animals.
  • the substance may in particular be intended for use in the vaccination against viral infectious diseases or be used for the vaccination against viral infectious diseases.
  • the invention relates to a substance (especially an anti-CEACAMI antibody according to the present invention) for use in therapy, i. Treatment and / or prevention of bacterial infections and / or bacterial infectious diseases, preferably in humans or non-human animals.
  • the substance may in particular be intended for use in the vaccination against bacterial infectious diseases or be used for the vaccination against bacterial infectious diseases.
  • the invention relates to a substance (especially an anti-CEACAMI antibody according to the present invention) for use in therapy, i. Treatment and / or prevention of sepsis.
  • the substance is characterized in particular by the fact that it activates CEACAM1, preferably the expression and / or function of CEACAM1.
  • the substance is an anti-CEACAM1 antibody according to the present invention.
  • the CEACAM 1 is preferably CEACAM 1 according to SEQ ID No. 1 (therefore the expression product of SEQ ID No. 1) or CEACAM1 according to SEQ ID No. 43.
  • the CEACAM1 is CEACAM 1 according to SEQ ID NO: 2 (hence the expression product of SEQ ID NO: 2).
  • the CEACAM 1 according to SEQ ID No. 2 in contrast to the CEACAM 1 according to SEQ ID No. 1, has a so-called interleukin-2 secretory sequence (I L-2 secretory sequence). This sequence causes the protein to secrete the secretory pathway and thus be secreted by cells. Without this modification, the protein would not be secreted.
  • I L-2 secretory sequence interleukin-2 secretory sequence
  • the substance activates the expression of CEACAM1 at the nucleic acid level.
  • the substance activates the expression of CEACAM 1 by activation of an endogenous CEACAM1 promoter. Furthermore, it can be provided that the substance activates the expression of CEACAM 1 at the mRNA level.
  • the substance causes an activation of CEACAM1 at the protein level.
  • the substance is a polynucleotide encoding a polypeptide or protein, wherein the polypeptide or protein activates the expression and / or function of CEACAM1.
  • the substance provided according to the invention preferably binds to CEACAM1, in particular with formation of cross-linking.
  • Crosslinking causes CEACAM1 molecules to assemble in the membrane and to unfold their effect in the cell through interaction with themselves or other signaling proteins.
  • the substance is a substance directed against CEACAM1.
  • the substance can furthermore be directed in particular against inhibitors, biological precursors and / or variants, in particular isoforms, of CEACAM 1.
  • the substance can be selected from the group consisting of antisense RNA, aptamers, mirror aptamers, antibodies, soluble binding partners, in particular soluble ligands, of CEACAM1, soluble receptors, siRNA (small interfering RNA), shRNA (small hairpin RNA), siRNA-containing particles (such as siRNA-containing calcium phosphate particles), shRNA-containing particles (such as shRNA-containing calcium phosphate particles), siRNA-containing vesicles (such as siRNA-containing liposomes), shRNA-containing vesicles (such as siRNA-containing liposomes ) and ribozymes.
  • the siRNA and shRNA are preferably packaged in the siRNA-containing particles and shRNA-containing particles.
  • the substance is an antibody directed against CEACAM 1 (anti-CEACAM1 antibody, activating antibody).
  • the antibody is a murine antibody or leporin antibody.
  • the antibody it may be preferable in the invention, when the antibody is a rabbit antibody, mouse antibody or rat antibody, d. H. an antibody produced by a rabbit, a mouse or a rat.
  • the antibody may be in particular an antibody variable heavy chain comprising (V H) domain, which is selected from the group consisting of antibody variable heavy chain (V H) domain of murine origin and antibody variable heavy chain (V H) - Domain leporins origin.
  • V H antibody variable heavy chain
  • V H variable heavy chain
  • the antibody may be provided, in particular, that the antibody has a variable antibody heavy chain (V H ) domain which has been produced by a mouse, a rat or a rabbit.
  • the antibody may in particular comprise a variable antibody light chain (V L ) domain selected from the group consisting of antibody variable light chain (V L ) domain of murine origin and variable antibody light chain (V L ) Domain of leporine origin.
  • V L variable antibody light chain
  • the antibody has a variable antibody light chain (V L ) domain which has been produced by a mouse, a rat or a rabbit.
  • the antibody has constant antibody heavy chain (C H ) domains of human origin and / or a constant antibody light chain (C L ) domain of human origin having.
  • the antibody is a humanized antibody.
  • the constant antibody heavy chain (C H ) domain as well as the constant antibody light chain (C L ) domain of the antibody are each of human origin whereas the variable antibody heavy chain (V H ) domain is of human origin.
  • Domain and antibody variable light chain (V L ) domain of the antibody each xenogeneic, especially murine or leporinen origin.
  • the antibody preferably has a variable antibody heavy chain (V H ) domain selected from the group consisting of variable antibody heavy chain (V H ) domain as shown in SEQ ID NO: 3, variable antibody heavy chain ( V H ) domain according to SEQ ID No. 7 and variable antibody heavy chain (V H ) domain according to SEQ ID No. 11.
  • V H variable antibody heavy chain
  • the antibody has a variable antibody light chain (V
  • the antibody has a variable antibody heavy chain (V H ) domain according to SEQ ID NO: 3 and a variable antibody light chain (V L ) domain according to SEQ ID NO: 5.
  • the antibody has a variable antibody heavy chain (V H ) domain according to SEQ ID NO: 7 and a variable antibody light chain (V L ) domain according to SEQ ID NO: 9.
  • the antibody to an antibody variable heavy chain (V H) domain of SEQ ID NO. 1 1 and a variable light chain antibody (V L) domain of SEQ ID NO. 13, is an antibody variable heavy chain (V H) domain of SEQ ID NO. 1 1 and a variable light chain antibody (V L) domain of SEQ ID NO. 13,.
  • the antibody has a variable antibody heavy chain (V H ) domain encoded by a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID No. 12.
  • V H variable antibody heavy chain
  • the antibody has a variable antibody light chain (V L ) domain encoded by a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 14.
  • the antibody comprises a variable antibody heavy chain (V H ) domain encoded by a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 and a variable antibody light chain (V L ) domain comprising a nucleotide sequence according to SEQ ID NO. 6 is coded on.
  • V H variable antibody heavy chain
  • V L variable antibody light chain
  • the antibody has a variable antibody heavy chain (V H ) domain which encodes by a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 and a variable antibody light chain (V L ) domain encoded by a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10.
  • V H variable antibody heavy chain
  • V L variable antibody light chain
  • the antibody has a variable antibody heavy chain (V H ) domain encoded by a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 and a variable antibody light chain (V L ) domain, which is encoded by a nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 14, on.
  • V H variable antibody heavy chain
  • V L variable antibody light chain
  • the antibody is preferably a monoclonal antibody.
  • the antibody in another embodiment, may be an antibody produced by a B cell hybridoma (B cell clone) selected from the group consisting of 6G5J, B3-17 and 18-20.
  • B cell hybridoma B cell clone
  • the substance provided according to the invention may be a natural binding partner of CEACAM1 or a modified form of such a binding partner.
  • the substance may be selected from the group consisting of Moraxella catarrhalis soluble UspA1 protein, Moraxella catarrhalis modified UspA1 protein, Neisseria gonorrhoeae soluble Opa protein, Neisseria gonorrhoeae modified Opa protein, Haemophilus influenzae soluble variable P5 protein, modified variable P5 Haemophilus influenzae protein, modified Tim3, hepatitis virus modified glycoprotein, modified Salmonella surface protein and modified Escherichia coli surface protein.
  • the substance is the soluble protein UspA1 of Moraxella catarrhalis according to SEQ ID No. 15.
  • the substance is the soluble protein UspA1 of Moraxella catarrhalis, which is encoded by a nucleotide sequence according to SEQ ID No. 16.
  • the substance is the soluble protein Opa of Neisseria gonorrhoeae according to SEQ ID No 17.
  • the substance is the soluble variable protein P5 of Haemophilus influenzae according to SEQ ID No. 18.
  • the substance is the soluble, human, recombinant CEACAM1 fusion protein according to SEQ ID No. 19. In a further embodiment, the substance is the soluble, human, recombinant CEACAM1 fusion protein which is encoded by a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 20.
  • the viral infections or infectious diseases are preferably selected from the group consisting of viral hepatitis, hepatitis B, hepatitis C, HIV infection, AIDS, influenza, poliomyelitis, virus-induced myocarditis, Epstein-Barr virus infections or infectious diseases such as Pfeiffer Glandular fever, herpes simplex, cytomegalovirus, rabies and Ebola.
  • the invention relates to a substance for use in therapy, i. Treatment and / or prevention of B-cell-dependent diseases, preferably in humans or non-human animals.
  • the substance is characterized in particular by inhibiting CEACAM1, preferably the expression and / or function of CEACAM 1.
  • the substance inhibits the expression of CEACAM1 at the nucleic acid level.
  • the substance inhibits the expression of CEACAM 1 by activation of an endogenous CEACAM1 promoter. Furthermore, it may be provided that the substance inhibits the expression of CEACAM 1 at the mRNA level.
  • the substance causes an inhibition of CEACAM1 at the protein level.
  • the substance is a polynucleotide which encodes a polypeptide or protein, wherein the polypeptide or protein inhibits the expression and / or function of CEACAM 1.
  • the B-cell-dependent diseases are preferably autoimmune diseases and / or inflammatory diseases.
  • the autoimmune diseases or inflammatory diseases are preferably selected from the group consisting of myasthenia gravis, systemic lupus erythematosus, autoimmune diseases. deroiditis, dermatitis such as atopic dermatitis and / or eczema, psoriasis, Sjögren's syndrome, Crohn's disease, conjunctivitis, ulcerative colitis, bronchial asthma, allergic asthma, lupus erythematosus such as cutaneous lupus erythematosus, allergies, Wegener's disease (granulomatous polyangiitis), Stevens-Johnson Syndrome, sprue, Graves' disease, sarcoidosis, primary biliary cirrhosis, autoimmune hepatitis, diabetes mellitus such as type 1 diabetes mellitus and / or type 2 diabetes mellitus, arthritis such as rheumatoid arthritis, osteoarthritis and / or p
  • the invention relates to a medicament, preferably for use in therapy, i. Treatment and / or prevention, of viral infections, viral infectious diseases and / or B-cell-dependent diseases, in particular in humans or non-human animals.
  • the medicament is characterized in particular by containing at least one substance according to an aspect of the invention mentioned above.
  • the medicament additionally contains a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a pharmaceutically acceptable carrier inorganic and / or organic carrier substances are suitable as suitable carriers.
  • the carrier may be selected from the group consisting of water, vegetable oils, fatty compounds, benzyl alcohols, alkylene glycols, polyethylene glycols, glycerol triacetate, gelatin, carbohydrates such as lactose and / or starch, magnesium stearate, tallow, petrolatum and mixtures thereof.
  • suitable carriers reference is made to the textbook by Bauer et al. (Textbook of Pharmaceutical Technology, 6th edition, 1999, Academicliche Verlagsgesellschaft mbH Stuttgart) and the textbook by Rowe et al.
  • the medicament also contains at least one adjuvant which is selected, for example, from the group comprising lubricants, preservatives, stabilizers, absorption accelerators, wetting agents, emulsifiers, salts for influencing the osmotic pressure, buffer substances, dyes, flavorings, Perfumes, other active ingredients and mixtures thereof.
  • the drug may be an inoculant against viral infectious diseases.
  • the at least one substance in particular the at least one substance, the viral infections, viral infectious diseases and / or B cell-dependent diseases
  • the invention relates to a substance for use in the diagnosis of viral infections, viral infectious diseases and / or B cell-dependent diseases, preferably in humans or non-human animals
  • the substance is characterized in particular by the fact that it is intended or used for the detection of CEACAM 1, preferably for the detection of the expression and / or function of CEACAM1.
  • Detection of the expression and / or function of CEACAM 1 by the substance provided according to the invention can take place in different ways.
  • the substance is used to detect the expression of CEACAM1 at the nucleic acid level.
  • the substance is used to detect the expression of CEACAM 1 at the mRNA level.
  • the substance is a polynucleotide encoding a polypeptide or protein, wherein the polypeptide or protein inhibits the expression and / or function of CEACAM 1.
  • the substance is a substance directed against CEACAM1.
  • the substance directed against CEACAM1 is particularly preferably an antibody (anti-CEACAM1 antibody).
  • an antibody can be used in the context of detection methods known to the person skilled in the art, for example ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • a specific antibody directed against the antigen to be determined (CEACAM1) is bound to a carrier material, for example cellulose or polystyrene. Immune complexes are formed on the support after incubation with a sample containing CEACAM 1 as antigen.
  • these immune complexes will bind a labeled antibody, which is also directed against the antigen CEACAM1, but conveniently at a position other than that added to the carrier antibody.
  • This labeled antibody is usually an antibody-enzyme conjugate, which enzyme is usually alkaline phosphatase or horseradish peroxidase.
  • the addition of the labeled antibody ultimately produces ternary complexes of the antigen (CEACAM1) and the two antibodies directed against the antigen (CEACAM 1). These ternary complexes can be visualized by the addition of chromogenic substrates, such as para-nitrophenol.
  • the concentration of CEACAM1 in the sample can be determined by photometric determination of the immune complex-bound marker enzymes by comparison with standards of known antigen concentration. It is also possible to use anti-CEACAM 1 antibodies (anti-CEACAM1 antibodies) in ELISPOT procedures.
  • anti-CEACAM 1 antibodies anti-CEACAM1 antibodies
  • the substance may be an oligonucleotide, which is suitable, for example by means of the so-called polymerase chain reaction (PCR), to selectively amplify certain DNA segments of CEACAM 1 and in this way a preferably quantitative detection of CEACAM1 to provide.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the substance may be an oligo- or polynucleotide that hybridizes with CEACAM1 under stringent conditions.
  • oligo- or polynucleotides for example, Southern blots or Northern blots can be performed to detect in this way the DNA or RNA content of CEACAM1. In this way, for example, the transcription rate of CEACAM 1 can be examined.
  • Corresponding methods are also sufficiently familiar to the person skilled in the art, so that further explanations should also be dispensed with at this point.
  • viral infectious diseases and / or B-cell-dependent diseases to avoid unnecessary repetition, reference is also made to the previous description.
  • the embodiments and advantages described there in relation to the substance as well as the viral infections, viral infectious diseases and / or B cell-dependent diseases mentioned there apply mutatis mutandis to the substance according to the fourth aspect of the invention.
  • the invention relates to a diagnostic agent, preferably for use in the diagnosis of viral infections, viral infectious diseases and / or B cell-dependent diseases, in particular in humans or non-human animals.
  • the diagnostic agent is characterized in particular by the fact that it contains at least one substance according to an abovementioned aspect of the invention.
  • the diagnostic agent in particular the at least one substance, the viral infections, viral infectious diseases and / or B-cell-dependent diseases, reference is likewise made in full to the previous description.
  • the embodiments and advantages described there in relation to the substance as well as the viral infections, viral infectious diseases and / or B-cell-dependent diseases mentioned there apply mutatis mutandis to the diagnostic agent according to the fifth aspect of the invention.
  • the invention relates to an antibody directed against CEACAM 1 (anti-CEACAM1 antibody).
  • the antibody is characterized in particular by having a variable antibody heavy chain (V H ) domain selected from the group consisting of variable antibody heavy chain (V H ) domain according to SEQ ID NO: 3, variable antibody Heavy chain (V H ) domain according to SEQ ID No. 7 and variable antibody heavy chain (V H ) domain according to SEQ ID No. 11, and / or a variable antibody light chain (V L ) domain, selected from the group consisting of antibody variable light chain (V L ) domain of SEQ ID NO: 5, antibody variable light chain (V L ) domain of SEQ ID NO: 9, and variable antibody light chain (V
  • the antibody has a variable heavy chain antibody (V H) domain of SEQ ID NO. 3, and an antibody variable light chain (V L) domain of SEQ ID NO. 5 in a preferred embodiment.
  • the antibody has a variable antibody heavy chain (V H ) domain according to SEQ ID NO: 7 and a variable antibody light chain (V L ) domain according to SEQ ID NO: 9.
  • the antibody comprises a variable heavy chain antibody (V H) domain of SEQ ID NO. 1 1 and an antibody variable light chain (V L) domain of SEQ ID NO. 13,.
  • the antibody is in a preferred embodiment a murine antibody or leporin antibody.
  • the antibody is a mouse antibody, rat antibody or rabbit antibody, d. H. an antibody produced by a mouse, a rat or a rabbit.
  • variable antibody heavy chain (V H ) domain may be selected from the group consisting of antibody heavy chain variable (V H ) domain of murine origin and variable antibody heavy chain (V H ) domain of leporine origin.
  • V H variable antibody heavy chain domain
  • the variable antibody Heavy chain (V H ) domain has been produced by a mouse, a rat or a rabbit.
  • variable antibody light chain (V L ) domain may be selected from the group consisting of variable antibody light chain (V L ) domain murine prime and variable antibody light chain (V L ) domain leporins origin.
  • V L variable antibody light chain
  • _ variable antibody light chain
  • the antibody is a human constant antibody heavy chain (C H ) domain and / or a constant antibody light chain (C L ) domain Origin.
  • the antibody is a humanized antibody.
  • the constant antibody heavy chain (C H ) domain as well as the antibody constant light chain (C L ) domain of the antibody are each of human origin, whereas the variable antibody heavy chain (V H ) domain and variable antibody Antibody light chain (V
  • the antibody is preferably a monoclonal antibody.
  • the antibody may be an antibody produced by a B-cell hybridoma (B cell clone) selected from the group consisting of 6G5J, B3-17 and 18-20.
  • the antibody is also preferably an antibody for use in medicine.
  • the antibody may be a diagnostic and / or therapeutic antibody. Accordingly, the antibody may be for use in diagnosis and / or therapy, i. Treatment and / or prevention, be provided by diseases.
  • the antibody may be an antibody for use in the diagnosis of viral infections, viral infectious diseases, B-cell-dependent diseases and / or tumors.
  • the antibody is an antibody for use in therapy, ie, treatment and / or prevention of disease.
  • the antibody is particularly preferably intended for use in therapy, ie treatment and / or prevention, of viral infections, viral infectious diseases, B-cell-dependent diseases and / or tumors.
  • the antibody according to a particularly preferred embodiment is an antibody for use in therapy, ie treatment and / or prevention, of viral infections, viral infectious diseases, B-cell-dependent diseases and / or tumors.
  • the tumors may in principle be benign tumors or malignant tumors.
  • the tumors are malignant tumors.
  • the malignant tumors may in particular be selected from the group consisting of carcinomas, melanomas, piastomas, lymphomas and sarcomas.
  • the carcinomas may be selected from the group consisting of anal carcinoma, bronchial carcinoma, lung carcinoma, endometrial carcinoma, gallbladder carcinoma, hepatocellular carcinoma, testicular carcinoma, colorectal carcinoma, laryngeal carcinoma, feeding tube cancer, gastric carcinoma, breast carcinoma, renal carcinoma, ovarian carcinoma, pancreatic tumor, pharyngeal carcinoma, prostate carcinoma, Thyroid carcinoma and cervical carcinoma.
  • the sarcomas may be selected from the group consisting of angiosarcoma, chondrosarcoma, Ewing sarcoma, fibrosarcoma, Karposi's sarcoma, lipo-sarcoma, leiomyosarcoma, malignant fibrous histiocytoma, neurogenic sarcoma, osteosarcoma and rhabdomyosarcoma.
  • anti-CEACAM1 antibody anti-CEACAM1 antibody
  • the antibody is particularly characterized by having a variable antibody heavy chain (V H ) domain encoded by a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO. 12, and / or an antibody variable light chain (V L) domain, which is encoded by a nucleotide sequence which is selected from the group consisting of SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 10 and SEQ ID No. 14, has. More preferably, the antibody has a variable antibody heavy chain (V H ) domain encoded by a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 4 and a variable antibody light chain (V
  • the antibody comprises a variable antibody heavy chain (V H ) domain encoded by a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 and an antibody light chain variable (V L ) domain generated by a Nucleotide sequence according to SEQ ID NO. 10 is encoded on.
  • V H variable antibody heavy chain
  • V L antibody light chain variable
  • the antibody comprises a variable heavy chain antibody (V H) domain which is encoded by a nucleotide sequence according to SEQ ID Nos. 12, and an antibody variable light chain (V L) domain, which by a nucleotide sequence according to SEQ ID NO. 14 is encoded on.
  • V H variable heavy chain antibody
  • V L antibody variable light chain
  • the antibody is in a preferred embodiment a murine antibody or leporin antibody.
  • the antibody is a mouse antibody, rat antibody or rabbit antibody, d. H. an antibody produced by a mouse, a rat or a rabbit.
  • variable antibody heavy chain (V H ) domain may be selected from the group consisting of antibody heavy chain variable (V H ) domain of murine origin and variable antibody heavy chain (V H ) domain of leporine origin.
  • V H variable antibody heavy chain
  • the variable antibody heavy chain (V H ) domain has been produced by a mouse, a rat or a rabbit.
  • variable light chain (V L) domain may in particular be selected from the group consisting of antibody variable light chain (V L) domain of murine origin and antibody variable light chain (V L) domain leporinen origin.
  • V L variable light chain
  • _ variable antibody light chain
  • _) domain has been produced by a mouse, a rat or a rabbit.
  • the antibody has a constant antibody heavy chain (C H ) - domain of human origin and / or a constant antibody light chain (C L ) domain of human origin ,
  • the antibody is a humanized antibody.
  • the constant antibody heavy chain (C H ) domain as well as the constant antibody light chain (C L ) domain of the antibody, each of human origin, whereas the variable antibody heavy chain (V H ) domain and antibody light chain variable (V L ) domain of the antibody are each xenogeneic, in particular murine or leporin, of origin.
  • the antibody is preferably a monoclonal antibody.
  • the antibody may be an antibody produced by a B-cell hybridoma (B cell clone) selected from the group consisting of 6G5J, B3-17 and 18-20.
  • B-cell hybridoma B cell clone
  • the antibody is furthermore preferably an antibody for use in medicine.
  • the antibody may be a diagnostic and / or therapeutic antibody. Accordingly, the antibody may be for use in diagnosis and / or therapy, i. Treatment and / or prevention, be provided by diseases.
  • the antibody may be an antibody for use in the diagnosis of viral infections, viral infectious diseases, B-cell-dependent diseases and / or tumors.
  • the antibody is an antibody for use in therapy, i. Treatment and / or prevention of diseases.
  • the antibody is for use in therapy, i. Treatment and / or prevention, of viral infections, viral infectious diseases, B-cell-dependent diseases and / or tumors.
  • the antibody is an antibody for use in therapy, i. Treatment and / or prevention, of viral infections, viral infectious diseases, B-cell-dependent diseases and / or tumors.
  • the antibody in particular possible viral infections, viral infectious diseases, B-cell-dependent diseases and / or tumors, for the diagnosis and / or therapy of which the antibody can be used or used, to avoid unnecessary repetitions also fully referred to the previous description.
  • variable antibody heavy chain (V H ) domain of an anti-CEACAM 1 antibody (anti-CEACAM1 antibody).
  • the variable antibody heavy chain (V H ) domain is selected from the group consisting of antibody heavy chain (V H ) domain according to SEQ ID NO: 3, variable antibody heavy chain (V H ) domain according to SEQ ID No. 7 and variable antibody heavy chain (V H ) domain according to SEQ ID No. 11.
  • the variable antibody heavy chain (V H ) domain is of murine or leporine origin in a preferred embodiment. In other words, it is preferred according to the invention if the variable antibody heavy chain (V H ) domain has been produced by a mouse, a rat or a rabbit.
  • the antibody is preferably a monoclonal antibody.
  • V H variable antibody heavy chain
  • the embodiments and advantages described there in relation to the variable antibody-heavy-chain (V H ) domain and the antibodies also analogously apply to the variable antibody heavy chain (V H ) domain according to the eighth aspect of the invention.
  • the invention relates to a variable antibody light chain (V L ) domain of a CEACAM1-directed antibody (anti-CEACAM1 antibody).
  • variable antibody light chain (V L ) domain is selected from the group consisting of variable antibody light chain (V L ) domain according to SEQ ID NO: 5, variable antibody light chain (V
  • variable antibody light chain (V L ) domain in a preferred embodiment is of murine or leporine origin. In other words, it is preferred according to the invention if the variable antibody light chain (V L ) domain has been produced by a mouse, a rat or a rabbit.
  • the antibody is preferably a monoclonal antibody.
  • variable antibody light chain (V L ) domain as well as the antibody, reference is also made to the foregoing description to avoid unnecessary repetition.
  • _) domain and the antibody also analogously apply to the variable antibody light chain (V L ) domain according to the ninth aspect of the invention.
  • the invention features an isolated nucleic acid encoding a variable antibody heavy chain (V H ) domain of a CEACAM 1 targeted antibody (anti-CEACAM1 antibody).
  • the nucleic acid and the antibody are preferably a human nucleic acid or human antibody.
  • the antibody is preferably a monoclonal antibody.
  • the nucleic acid has a nucleotide sequence or consists of a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 12.
  • V H variable antibody heavy chain
  • the invention features an isolated nucleic acid encoding a variable antibody light chain (V L ) domain of an anti-CEACAM 1 antibody (anti-CEACAM1 antibody).
  • the nucleic acid and the antibody are preferably a human nucleic acid or human antibody.
  • the antibody is preferably a monoclonal antibody.
  • the nucleic acid has a nucleotide sequence or consists of a nucleotide sequence which is selected from the group consisting of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 14.
  • V L variable antibody light chain
  • the invention relates to a hybridoma cell which produces an antibody according to an above-mentioned aspect of the invention.
  • the hybridoma cell is preferably obtained by fusion of B lymphocytes derived from a laboratory animal immunized against CEACAM1 and anti-CEACAM 1 antibodies. Produce by (anti-CEACAM1 antibody), and myeloma cells formed.
  • the test animal may be selected from the group consisting of mouse, rat, rabbit and goat.
  • Myeloma cells are generally understood to be cells (plasma cells) of a cell line obtained from a myeloma (plasmacytoma) of an animal.
  • the myeloma cells can be obtained from the myeloma of a mouse, a rat, a rabbit or a goat.
  • the myeloma cells are cells of the mouse myeloma cell line NS1 / 0.
  • the hybridoma cell preferably belongs to a B cell hybridoma (B cell clone) which is selected from the group consisting of 6G5J, B3-17 and 18-20.
  • B cell hybridoma B cell clone
  • 6G5J 6G5J
  • B3-17 6G5J
  • 18-20 18-20.
  • the embodiments and advantages described there in particular with respect to the antibody apply, mutatis mutandis, to the hybridoma cell according to the twelfth aspect of the invention.
  • the invention relates to a process for the preparation of an anti-CEACAM1 antibody (anti-CEACAM1 antibody), in particular an antibody according to the sixth or seventh aspect of the invention.
  • the method comprises the steps of: a) fusing B cells derived from an antigenically immunized animal and myeloma cells to form hybridoma cells, b) selecting the hybridoma cells, c) isolating hybridoma cells which are directed against the antigen Produce antibodies.
  • the method according to the invention is characterized in particular by the fact that the antigen is selected from the group consisting of CEACAM1 according to SEQ ID No. 1, CEACAM 1 according to SEQ ID No. 2 (therefore the expression product of SEQ ID No. 1 or 2 or to CEACAM1 according to SEQ ID No. 43, a fragment, in particular epitope, of SEQ ID No. 1 and a fragment, in particular epitope, of SEQ ID No. 2 (therefore of the expression product of SEQ ID No. 1 or 2) or SEQ ID NO. 43.
  • the antigen is CEACAM 1 according to SEQ ID No. 1 (therefore the expression product of SEQ ID No. 1) or CEACAM1 according to SEQ ID No. 43 or a fragment, in particular epitope thereof.
  • the antigen is CEACAM 1 according to SEQ ID NO: 2 (hence the expression product of SEQ ID NO: 2) or a fragment, in particular epitope thereof.
  • the test animal is a mouse, a rat, a rabbit or a goat.
  • the use of a mouse as a test animal is particularly preferred according to the invention.
  • the B cells can be fused with cells of a cell line derived from a mouse, rat, rabbit or goat myeloma.
  • the B cells are fused with cells of the mouse myeloma cell line NS1 / 0.
  • Step a), d. H. cell fusion can be carried out with the help of polyethylene glycol (PEG).
  • PEG polyethylene glycol
  • the B cells and myeloma cells are added together in an aqueous, polyethyl- englykol inconvenience fusion solution and centrifuged. Since the water is largely bound by PEG, the cell membranes are brought into close contact with each other, whereby a spontaneous fusion of the cell membranes is achieved.
  • step a) may be carried out under the action of electrical voltage, i. H. as so-called electrofusion.
  • Step b) is performed in a preferred embodiment using a selective medium in which only hybridoma cells are viable.
  • a selective medium the so-called HAT medium is preferably used.
  • the HAT medium contains the chemical substances hypoxanthine, aminopterin and thymidine.
  • Hypoxanthine is a precursor to essential molecules (purines) needed to build up deoxyribonucleic acid (DNA).
  • HGPRT hyperxanthine-guanine-phosphoribosyltransferane. Since the fusion uses a myeloma cell line that lacks this enzyme or is present in an inactive form, individual myeloma cells are therefore not viable in this medium.
  • Step c) is preferably carried out by ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) test or flow cytometry.
  • the isolated hybridoma cells are expanded. In this way, it is ensured that a sufficiently large number of hybridoma cells are available which produce the antibody directed against CEACAM 1 (anti-CEACAM1 antibodies).
  • SEQ ID NO: 1 Human CEACAM1 (Hu-CEACAM1 + Hu-IgG-Fc2) (Homo sapiens):
  • SEQ ID NO: 2 Human CEACAM1 (I L2 Secretory Seq. + Hu-CEACAM 1 + Hu-IgG-Fc2) (Homo sapiens):
  • SEQ ID NO: 4 Anti-human CEACAM1 antibody (Clone 6G5J) - heavy chain
  • V-D-J REGION (Mus musculus):
  • SEQ ID NO: 5 Anti-human CEACAM1 antibody (Clone 6G5J) - light chain (V-J REGION) (Mus musculus):
  • SEQ ID NO: 6 Anti-human CEACAM1 antibody (Clone 6G5J) - light chain (V-J REGION) (Mus musculus):
  • SEQ ID NO: 7 Anti-human CEACAM1 antibody (Clone 18-20) - heavy chain (V-D-J region) (Mus musculus):
  • SEQ ID NO: 8 Anti-human CEACAM1 antibody (Clone 18-20) - heavy chain (V-D-J region) (Mus musculus):
  • SEQ ID NO: 9 Anti-human CEACAM1 antibody (Clone 18-20) - light chain (V-J region) (Mus musculus):
  • SEQ ID NO: 1 1 Anti-human CEACAM1 antibody (Clone B3-17) - heavy chain (V-D-J REGION) (Mus musculus):
  • SEQ ID NO: 12 Anti-human CEACAM1 antibody (Clone B3-17) - heavy chain (V-D-J REGION) (Mus musculus):
  • SEQ ID NO: 13 Anti-human CEACAM1 antibody (Clone B3-17) - light chain (V-J REGION) (Mus musculus):
  • SEQ ID NO: 14 Anti-human CEACAM1 antibody (Clone B3-17) - light chain (V-J REGION) (Mus musculus):
  • SEQ ID NO: 15 Soluble UspA1 (Moraxella catarhalis) GenBank: U61725.1:
  • SEQ ID NO: 16 Soluble UspA1 (Moraxella catarhalis) GenBank: U61725.1:
  • SEQ ID NO: 17 Soluble grandpa (Neisseria gonorrhoeae) UniProtKB / Swiss-Prot: Q0PS02_NEIME:
  • SEQ ID NO: 18 outer membrane protein P5 (Haemophilus influenzae) UniProtKB / Swiss-Prot: P43840.1:
  • SEQ ID NO: 19 Soluble human recombinant CEACAM 1 fusion protein (human CEACAM1 (ENSG00000079385) with "IL-2 Secretory Leader" sequence and human IgG-Fc2 fusion protein):
  • CEACAM 1 fusion protein human EACAM1 (ENSG00000079385) with "IL-2 Secretory Leader" sequence and human IgG Fc2 fusion protein ): cctgagatca ccggcgaagg agggccacca tgtacaggat gcaactcctg tcttgcattg cactaagtct tgcacttgtc acgaattcgc agctgaccac cgagagcatg cccttcaacg tggccgaggg caaggaggtg ctgctgctgg tgcacaacct gccccagcag ctgttcggct acagctggta caagggcgagggtggacg gcaacaggca gatcgtgggcta caagggcgag agggtggacg
  • Fig. 1A representative flow cytometry histograms from proliferating B cells
  • Wild-type (WT) or CEACAM1 - / - mice CEACAM1 knockout mice
  • untreated gray area
  • anti-CEACAM1 antibody LPS
  • recombinant mouse CD40 ligand in combination with mouse IL-4 ( black line) for 48 hours.
  • FIG. 1C Representative histograms and statistical analysis of annexin V + B cells stimulated with recombinant mouse CD40 ligand in combination with mouse IL-4 or left unstimulated after 48 hours (DAPI-B cells are shown).
  • FIG. n 6).
  • Fig. 2A Scheme of development, maturation and migration of B cells into bone marrow, blood,
  • Lymph nodes and spleen Lymph nodes and spleen.
  • the solid arrows show the probable development path.
  • the dashed arrows show a development path still under discussion.
  • the dotted arrows show the differentiation after the antigen stimulation.
  • the "dash-dot arrow" shows assumed development paths.
  • B1 a shows the total number of B1 a and B2 B cell subpopulations (B1 a, CD19lowCD5int, B2,
  • FIG. 4 show an advantageous influence on the serum immunoglobulins by CEACAM1.
  • Fig. 5F Survival of WT and CEACAM1 - / - mice after intravenous infection with 2 ⁇
  • FIG. 8A Spleen VSV titer of WT or CEACAM1 - / - mice 7 h after intravenous infection with
  • Fig. 8B Interferon-alpha levels in the serum of WT or CEACAM1 - / - mice 2 and 4 hours after intravenous infection with 2 10 8 PFU of VSV.
  • WT wild-type
  • CEACAM1 - / - mice treated with control antibody or anti-CEACAM1 antibody
  • LCMV docile chronic lymphocytic choriome- ningitis virus strain
  • WT wild-type mice
  • CeacamT mice were maintained on the genetic background of C57BL / 6 (at least 8 and up to 16 times backcrossed) and were homozygous-bred.
  • VM 0 / CD45.1 - Mice expressing a VSV-specific B cell receptor as a transgene were used for cell transfer studies, and mice expressing CD45.1 transgene were used to reconstitute bone marrow. In all studies six to eight week old and same-sex mice were used. All animals were kept in ventilated single cages. In the survival experiments, the health of the mice was checked twice a day.
  • VSV Vesicular stomatitis virus
  • strain Indiana VSV-IND, Mudd-Summers isolate
  • MOI multiplicity of infection
  • mice were infected intravenously with VSV at the indicated doses and virus titers were measured by a plaque assay using organs in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), the 2 % fetal calf serum (FCS) contains, minced, 1: 3 adjusted over 12 steps and plated on Vero cells After a 2-hour incubation at 37 ° C an overlay medium (overlay) was added and the virus preparation again at 37 ° C. The plaques were counted 24 hours later by staining with crystal violet.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • FCS 2 % fetal calf serum
  • the strain of lymphocytic choriomeningitis virus LCMV-WE was originally obtained from F. Lehmann-Grube (Heinrich Pette Institute, Hamburg, Germany) and propagated in L929 cells, MC57 cells or both. Mice were infected intravenously at the indicated dose.
  • LCMV virus titers were detected by a plaque assay on MC57 fibroblasts as previously described (Battegay, M. et al., "Quantification of lymphocytic choriomeningitis virus with an immunological focus assay in 24- or 96-well plates.” J Viral Methods (J. 1991), 33, 1 91 -198.) Briefly, minced organs were plated with MC57 cells as described above and incubated at 37 ° C.
  • the strain of lymphocytic choriomeningitis virus LCMV-docile was originally obtained from F. Lehmann-Grube (Heinrich Pette Institute, Hamburg, Germany) and propagated in L929 cells, MC57 cells or both.
  • the influenza A virus was obtained from the working group Westendorf, University of Duisburg-Essen.
  • LCMV-NP nucleoprotein of LCMV
  • the cells were fixed (with 4% formaldehyde solution), permeabilized (with 1% Triton-X solution), blocked (with 10% FCS in phosphate buffered saline PBS) and stained with anti-LCMV NP antibody (made in-house).
  • the secondary antibody used was an ECL (Enhanced Chemolinuminescence) conjugated anti-rabbit IgG antibody (anti-rabbit IgG antibody). Plaques were detected by a color reaction (0.2 M Na 2 HPO 4 + 0.1 M citric acid + 30% H 2 O 2 + O-phenylenediamine dihydrochloride), all of the chemicals being purchased from Sigma-Aldrich.
  • Serum was prediluted (1:40). The complement system was inactivated at 56 ° C for 30 minutes. To take up IgG kinetics, diluted samples were treated with 2-mercaptoethanol (0.1 M) to remove IgM. Serum was adjusted 1: 2 over 1 2 steps and was incubated with 1 x 10 3 plaque forming units (PFU) of the VSV. After 90 minutes of incubation at 37 ° C, the virus-serum mixture was plated on Vero cells. After one hour, a coating medium was added and the mixture was incubated for a further 24 hours at 37 ° C. The plaques were counted by staining with crystal violet. Antibody titers are shown as 2- or 3-fold dilution levels (-log 2 and -log 3 ) -fold predilution (ie, x40).
  • mice were then challenged with anti-CEACAM1 antibody (20 ⁇ g ml, clone CC1, supplied by Dr. Kathryn V. Holmes, University of Colorado, Denver, USA) or recombinant mouse CD40 ligand (1 ⁇ g ml) in combination with mouse -IL4 (10 ng / ml; R & D Syst ems) or LPS (10 ng / ml; Sigma Aldrich) for 48 hours.
  • anti-CEACAM1 antibody (20 ⁇ g ml, clone CC1, supplied by Dr. Kathryn V. Holmes, University of Colorado, Denver, USA
  • mouse CD40 ligand (1 ⁇ g ml) in combination with mouse -IL4 (10 ng / ml; R & D Syst ems) or LPS (10 ng / ml; Sigma Aldrich) for 48 hours.
  • B cell purified for inhibition experiments were cultured in the medium described above with recombinant mouse CD40 ligand (1 ⁇ g ml) in combination with mouse IL4 (10 ng / ml; R & D Systems) and 10 ⁇ Ibrutinib (Seileck) treated.
  • mouse CD40 ligand 1 ⁇ g ml
  • mouse IL4 10 ng / ml
  • Ibrutinib Seileck
  • DMSO whole thylsulfoxide
  • Cell death was measured by staining with 4 ', 6-diamidin-2-phenylindole (DAPI; Life Technologies).
  • DAPI 6-diamidin-2-phenylindole
  • B cells were cultured as previously indicated and cells were stained with annexin-V (BD Biosciences) then DAPI.
  • splenocytes were dissociated into VLE-DMEM (very low endotoxin-DMEM) with addition of 10% LPS-free TCS and 1% antibiotics and anti-CEACAM1 antibodies (clone CC1, 20 ⁇ g / ml, K. Holmes) and anti-IgM antibody (10 ⁇ g ml) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) for various periods of time at 37 ° C.
  • VLE-DMEM very low endotoxin-DMEM
  • antibiotics and anti-CEACAM1 antibodies clone CC1, 20 ⁇ g / ml, K. Holmes
  • anti-IgM antibody 10 ⁇ g ml
  • Peripheral blood cells were stained with antibodies anti-Ly6G (RB6-8C5), anti-CDU 5 (AFS98), anti-CD45R (B220, RA3-6B2), anti-CD90.2 (30-H 1 2), anti-CEACAM 1 (CC1, with corresponding isotype control anti-IgG 1 [M 1 -14D1 2]), anti-IgD (1 1 - 26c), anti-CD93 (AA4.1), anti-CD1 9 (1 D3) ( all from eBioscience) and anti-IgM (11/41; BD Biosciences).
  • Isolated bone marrow cells were suspended in FACS buffer (0.5 M EDTA, 0.1% sodium azide, 1% FCS in PBS) and incubated with antibodies anti-CD45R (B220, RA3-6B2), anti-IgD (11 -26c), anti-IgM (11-41), anti-CEACAM 1 (CC1), anti-CD24 (M 1/69) (all from eBioscience), anti-CD43 (1 B-1 1) and anti-BP1 (6C3) (from BioLegend).
  • FACS buffer 0.5 M EDTA, 0.1% sodium azide, 1% FCS in PBS
  • Inguinal lymph nodes were disaggregated in FACS buffer and cells stained for anti-CD45R antibody (B220; RA3-6B2), anti-CD1 9 (1D3), anti-IgD (1-1-26c) (all from eBioscience) and anti -lgM (11/41) (BD Biosciences).
  • Spleens were dissociated into FACS buffer and splenocytes were incubated with antibodies anti-CD45R (B220; RA3-6B2), anti-CD1 9 (1 D3), anti-CD93 (AA4.1), anti-CD21 / 35 (8D9) , anti-CD23 (B3B4), anti-IgD (1 1 -26c), anti-CEACAM 1 (CC1), anti-CD45.1 (A20), anti-CD45.2 (1 04) (all from eBioscience) and anti-lg M (11/41) (BD).
  • Dead cells were discriminated by staining with propidium iodide (PI, eBioscience) and / or DAPI and were excluded from all analyzes except for blood analyzes.
  • PI propidium iodide
  • DAPI DAPI-associated iodide
  • cells were fixed and permeabilized according to the manufacturer's instructions (BD Phosflow, BD Biosciences). The cells were stained with antibody anti-Btk (pY223) / ltk (pY1 80) (BD Phosflow). All antibodies were diluted 1: 100 to their original concentration in FACS buffer. For the quantitative determination of the total cell numbers FACS particles were used (BD Biosciences). All stained cells were analyzed on a flow cytometer type LSRI I or FACSFortessa (BD Biosciences), and the data were analyzed with Flowjo software. 1.2.6 Gating strategy for identifying subgroups of B cells
  • Table 1 Gating strategy for identifying subgroups of B cells
  • LCMV glycoprotein GP1-specific IgG by ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) has already been described (Recher, M. et al., Deliberate removal of T cell help improving virus-neutralizing antibody production., Nature Immunology (2004), 5, 934-942.) Briefly, Nunc Immuno Plates 96-well flat plates (Thermo Scientific) were seeded with anti-human IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc) ENREF 60 in coating buffer (0.1M Na 2 C0 3 + 0.1M NaHCO 3 , pH 9.6) overnight at 4 ° C.
  • coating buffer 0.1M Na 2 C0 3 + 0.1M NaHCO 3 , pH 9.6
  • VSV-specific anti-IgG and anti-IgM antibodies For detection of VSV-specific anti-IgG and anti-IgM antibodies, flat-bottomed 96-well plates Nunc Immuno Plates (Thermo Scientific) with baculovirus VSV-GP (Lang, KS et al. "MyD88 protects from lethal encephalitis during infection with vesicular stomatitis virus "European Journal of Immunology (2007), 37, 2434-2440.) in coating buffer 0.1 M NaC0 3 (0.1 M Na 2 C0 3 + 0.1 M NaHCO 3 , pH 9 6) overnight at 4 ° C.
  • the plates were washed with a wash buffer (PBS containing 0.05% Tween20) and blocked for 1 to 2 hours with non-specific binding with 2% FCS in PBS were washed once and adjusted with prediluted (1:15) serum over 12 wells with dilutions of 1: 3 in successive wells
  • the plates were incubated at room temperature for 2 hours
  • the plates were washed with wash buffer and incubated with HRP-conjugated anti Mouse IgG antibody (Sigma) or anti-mouse IgM anti body (Sigma) for 30 to 60 minutes.
  • the plates were washed and incubated with 1X TMB substrate solution (eBioscience) in the dark, after which 10% H 2 S0 4 solution was added to stop the color reaction.
  • the optical density was measured at 450 nm (FLUOstar Omega, BMG LABTECH).
  • Several immunoglobulin isotypes and subtypes were measured in naive serum from WT mice and Ceacam 7 "A mice as described (Recher, M. et al., B cell-intrinsic deficiency of Wiskott-Aldrich syndrome protein (WASp) causes severe abnormalities of the peripheral B-cell compartment in mice. "Blood (2012), 19, 2819-2828.).
  • mice aged 8 to 10 weeks were immunized in three steps with human CEACAM1-Fc (50 ⁇ g / 90 ⁇ in PBS) mixed with Gerbu adjuvant MM (60 ⁇ ) (ideally on day 0, day 14 and day 21, intraperitoneally (ip) the first, subcutaneous (sc) the second and third immunizations).
  • the amount of the first immunization was twice the amount of all subsequent immunizations.
  • One week after the third immunization the mice were bled for serum recovery. To test whether the titer was sufficient, an ELISA or flow cytometry analysis was performed. The titre from day 0 to day 21 was usually increased 100 to 1000-fold.
  • mice of sufficient titer were boosted with 25 ⁇ g of human CEACAM1 -Fc dissolved in sterile PBS without adjuvant i.v. and i.p., four days before the mice were killed and the splenocytes (spleen cells) recovered.
  • mice were killed by cervical dislocation and the spleen was removed under aseptic conditions.
  • the spleen was squeezed through a 70 ⁇ nylon cell strainer.
  • Splenocytes were transferred to a 50 ml Falcon tube and washed three times with DMEM medium containing no additives (eg FCS).
  • the fusion partner cell line (the mouse myeloma cell line NS1 / 0) was also washed in DMEM. Thereafter, splenocytes and myeloma cells were mixed in a ratio of 5: 1 and centrifuged at 2000 rpm for 5 minutes. Then the supernatant was removed and the cell pellet was used for fusion.
  • CHO cells were transfected with all CEACAM 1 or with CEACAM 1 without N domain (Muturi HAT et al., PLoS One, 2013 Sep 1 1; 8 (9): e74654.).
  • ELISA Sandwich ELISA was coated with 0.25 ⁇ / L O micro / well anti-CEA (Dako). ELISA was washed and other binding sites blocked. Following this, CEACAM 1 or CEACAM I deltaN (hence CEACAM1 without N domain, CEACAM I dN) were added. CEACAM1 and CEACAMI deltaN were recovered from CHO transfectants. The ELISA was then incubated with different antibodies. After 4 hours of incubation, the ELISA was adjusted. see and incubated with anti-mouse Ig-HRP. After 1 hour, the substrate TMB was added and the absorbance measured at 450 nm.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • CD8 + T Cells To analyze the influence of anti-CEACAM1 antibody on the proliferation of CD8 + T cells, PBMCs of HLA-A2 + CMV + healthy donors were co-administered with CMV peptide PP65-73 and influenza matrix peptides 57-68, respectively incubated together with IL2 in RPMI 10% human serum for 10 to 13 days. Thereafter, the cells were restimulated with antigen and intracellular IFN-gamma was measured.
  • Intracellular cytokine staining 100,000 cells were transfected into 96 well plates (U soil). Cells were treated with peptide (1 ⁇ g / ml) or left untreated. After 2 hours Brefeldin A was added (Sigma). After a further 6 to 8 hours cells were incubated with anti-CD8 antibody (eBiosciences). Cells were then fixed with formalin (2% in PBS) for 10 minutes and washed 2x with saponin in FACS buffer. Subsequently, cells were incubated with anti-IFN-gamma antibody (eBiosciences) and the fluorescence measured in the FACS.
  • peptide 1 ⁇ g / ml
  • Brefeldin A was added (Sigma). After a further 6 to 8 hours cells were incubated with anti-CD8 antibody (eBiosciences). Cells were then fixed with formalin (2% in PBS) for 10 minutes and washed 2x with saponin in FACS buffer. Subsequently, cells were incubated with anti-IF
  • the table shows mean ⁇ SD (standard deviation) of absorbance at 450 nm.
  • the binding of antibody 18-20 to CEACAM1 was significantly higher than to CEACAM1 dN (18-20 CEACAM1 versus 18-20 CEACAM1 dN, p ⁇ 0.05, t-test).
  • the binding of 6G5J to CEACAM1 was significantly higher than to CEACAM1 dN (6G5J CEACAM1 versus 6G5J CEACAM1 dN p ⁇ 0.05, t-test).
  • the binding of B3-17 to CEACAM1 was not higher than to CEACAM1 dN (B3-17 CEACAM1 versus B3-17 CEACAM1 dN).
  • the in Table 2 show dargestellen experimental results indicate that the antibody, the antibody binding site CDR2 H of the sequence SEQ ID NO. 21 may have (ie antibodies 18-20 and 6G5J), in contrast to antibodies B3-17, the no such antibody binding site CDR2 H has effective binding to the N-domain of CEACAM1.
  • B3-17 and 18-20 bind human CD8 + T cells: Table shows the binding of isotype control and antibodies B3-17 and 18-20 to CD8 + T cells from the blood of healthy donors. The table shows mean ⁇ SD of the mean fluorescence intensity. The binding of antibody B3-17 to CD8 + T cells is significantly higher than the binding of isotype p ⁇ 0.05 (t-test, paired). The binding of 18-20 to CD8 + T cells is significantly higher than the binding of isotype p ⁇ 0.05 (t-test, paired).
  • PBMCs from healthy donors were either with or without CMV peptide in the presence or absence of isotype control and antibodies 18-20, 6G5J or B3 -17 incubated. On day 10, the cells were not further stimulated or restimulated for 8 hours with CMV peptide. Intracellular IFN gamma was measured in the FACS. The table shows the percent ⁇ SD of IFN-gamma positive CD8 + T cells. Presence of antibody 18-20 led to significant elevation of IFN-gamma positive T cells (CMV stimulated versus CMV, stimulated 18-20, p ⁇ 0.05, t-test).
  • 18-20 activates influenza-specific CD8 + T cells: PBMCs from healthy donors were incubated with influenza peptide along with anti-CD28 in the presence or absence of 18-20 antibodies. After 13 days, the cells were restimulated with influenza peptide and after 6 hours, intracellular IFN-gamma was measured. The table shows the percent ⁇ SD of IFN-gamma positive CD8 + T cells. Presence of antibody 18-20 resulted in significantly more IFN-gamma producing T cells (CD28 stimulated versus CD28 + 18-20 stimulated, p ⁇ 0.05 t-test).
  • humanized 18-20 activated human CD8 + T cells PBMCs from healthy donors were incubated with or without CMV peptide in the presence or absence of humanized 18-20 antibody. On day 10, the cells were restimulated with CMV peptide and after 8 hours intracellular IFN-gamma was measured in the FACS. Table shows percent ⁇ SD of the I FN-gamma positive CD8 + T cells. Presence of humanized antibody 18-20 led to a significant increase in I FN-gamma positive T cells (CMV stimulated versus CMV + hu18-20 stimulated, p ⁇ 0.05, t-test).
  • Antibody 18-20 K d 26 nM; C on : 1 .2 x10 "4 ; K off : 3.5 x10 " 4
  • Antibody 6G5J K d 23 nM; C on : 1 .0 x10 "4 ; K off : 3.1 x10 " 4
  • Antibody B3-17 K d 10 nM; K on : 3.4 x10 "4 ; K off : 3.4 x 10 " 4 All three antibodies are therefore binding in the lower double-digit nanomolar range. The differences in the activation of the T cells are therefore not due to unequal total binding strengths, but by the targeted binding to the N-domain of CEACAM1 by the inventive antibodies 18-20 and 6G5J.
  • the invention also relates to a substance for use in the therapy of viral infections and / or viral infectious diseases, which substance activates the expression and / or function of CEACAM1.
  • the invention relates to a substance for use in the therapy of B cell-dependent diseases, wherein the substance inhibits the expression and / or function of CEACAM1. Furthermore, the invention relates to a substance for use in the diagnosis of viral infections, viral infectious diseases and / or B cell-dependent diseases, wherein the substance is used to detect the expression and / or function of CEACAM1.
  • the invention further relates to an antibody, a therapeutic antibody, a variable antibody heavy chain (V H ) domain, a variable antibody light chain (V L ) domain, an isolated nucleic acid encoding a variable antibody heavy chain (V H ) domain, an isolated nucleic acid encoding a variable antibody light chain (V L ) domain, a hybridoma cell, and a method of producing an antibody.
  • Substance for use in the therapy of viral infections and / or viral infectious diseases characterized in that the substance activates the expression and / or function of CEACAM1.
  • CEACAM1 is CEACAM1 according to SEQ ID No. 1.
  • Substance according to embodiment 1 or 2 characterized in that the substance is a substance directed against CEACAM1.
  • Substance according to one of the preceding embodiments characterized in that it is an antibody directed against CEACAM1 antibody (anti-CEACAM1 antibody).
  • variable antibody heavy chain (V H ) domain selected from the group consisting of variable antibody heavy chain (V H ) domain according to SEQ ID No. 3, variable antibody heavy chain (V H ) domain according to SEQ ID NO: 7 and variable antibody heavy chain (V H ) domain according to SEQ ID NO: 1 1, and / or a variable antibody light chain (V
  • Substance according to one of embodiments 1 to 3 characterized in that it is the substance to the soluble protein UspA1 of Moraxella catarrhalis according to SEQ ID NO: 15. Substance according to one of embodiments 1 to 3, characterized in that the substance is the soluble protein Opa of Neisseria gnorrhoeae according to SEQ ID No. 17. Substance according to one of embodiments 1 to 3, characterized in that the substance is the soluble variable protein P5 of Haemophilus influenzae according to SEQ ID No. 18. Substance according to one of embodiments 1 to 3, characterized in that the substance is the soluble human recombinant CEACAM1 fusion protein according to SEQ ID No. 19.
  • the viral infections or infectious diseases are selected from the group consisting of viral hepatitis, hepatitis B, hepatitis C, HIV infection, AIDS, influenza, poliomyelitis, virus-induced myocarditis, Pfeiffer glandular fever, Herpes simplex, cytomegalovirus, rabies and Ebola.
  • Medicament for use in the therapy of viral infections and / or viral infectious diseases comprising at least one substance according to one of the preceding embodiments.
  • An antibody comprising a variable antibody heavy chain (V H ) domain of SEQ ID NO: 3 and / or a variable antibody light chain (V L ) domain of SEQ ID NO: 5.
  • Therapeutic antibody comprising a heavy chain antibody variable (V H) - domain, which is selected from the group consisting of antibody variable heavy chain (V H) domain of SEQ ID No.3, antibody variable heavy chain (V H ) - A domain according to SEQ ID NO: 7 and antibody heavy chain (V H ) domain according to SEQ ID NO: 1 1, and / or a variable antibody light chain (V L ) domain, which is selected from Group consisting of variable antibody light chain (V L ) domain according to SEQ ID No. 5, variable antibody light chain (V L ) domain according to SEQ ID No. 9 and antibody light chain (V
  • V L 7 antibody variable light chain (V L) domain of SEQ ID NO. 5 or SEQ ID NO: 9.
  • An isolated nucleic acid encoding a variable antibody heavy chain (V H ) domain wherein the nucleic acid is a nucleotide sequence or consists of a nucleotide sequence which is selected from the group consisting of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 8.
  • An isolated nucleic acid encoding a variable antibody light chain (V L ) domain wherein the nucleic acid has a nucleotide sequence or consists of a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 10.
  • Hybridoma cell which produces an antibody according to embodiment 12 or 13.
  • a process for producing an antibody comprising the following steps: a) fusion of B cells derived from an antigenically immunized animal and myeloma cells to form hybridoma cells, b) selection of the hybridoma cells , c) isolating hybridoma cells which produce antibodies directed against the antigen, characterized in that the antigen is CEACAM1 according to SEQ ID No. 1 or a fragment, in particular epitope thereof.

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Abstract

Die Erfindung betrifft einen anti-CEACAM1-Antikörper, der eine Antigenbindungsstelle mit mindestens 80% Sequenzhomologie zu Sequenz WINTYTGEPT (SEQ ID Nr. 21 ) umfasst. Die Erfindung behandelt auch Nukleinsäuren, die einen solchen Antikörper kodieren. Zudem betrifft die Erfindung die therapeutische, präventive und In vitro-Anwendung des Antikörpers.

Description

Immunstimulatorische Anti-CEACAM1 -Antikörper
Die Erfindung betrifft Substanzen zur Anwendung bei der Therapie oder Diagnose von Neopla- sein, (viralen) Infektionen, Infektionskrankheiten und/oder T- und/oder B-Zell-abhängigen Krankheiten, Arznei- und Diagnosemittel, Antikörper, variable Antikörper-Schwerketten-(VH)- Domänen, variable Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domänen, isolierte Nukleinsäuren, B-Zelllinien und ein Verfahren zur Herstellung von Antikörpern.
CEACAM1 (Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1 ) ist ein humanes Gly- koprotein, welches ebenfalls unter der Bezeichnung CD66a (Cluster of Differentiation 66a) be- kannt ist. Es gehört zur der„carcinoembryonic antigen" Gen-Familie. Dieser Familie gehören zwei Untergruppen an, nämlich die Untergruppe der Zelladhäsionsmoleküle, zu welchen das CEACAM1 zählt, sowie die Untergruppe der schwangerschaftsspezifischen Glykoproteine.
Es ist bekannt, dass es sich bei CEACAM 1 um ein spezielles Zell-Zell-Adhäsionsmolekül handelt, welches auf Leukozyten, Epithelzellen und Endothelzellen vorhanden ist. Zellen, die CEACAM1 auf ihrer Oberfläche exprimieren, geben dieses aber auch in die Blutbahn ab. Das Glykoprotein vermittelt die Zelladhäsion mittels homophiler oder heterophiler Bindung zu anderen Proteinen der Zelladhäsionsmolekül-Untergruppe.
Es ist weiterhin bekannt, dass diverse Zellaktivitäten, wie beispielsweise die Differenzierung und Anordnung von dreidimensionalen Gewebestrukturen, die Angiogenese, die Apoptose, die Tumorsuppression und die Metastase, durch CEACAM1 beeinflusst werden kann.
Die Publikation von Singer et al. („Adhesion Molecule 1 Expression and Carcinoembryonic Anti- gen-Related Cell Signaling in Human, Mouse, and Rat Leukocytes: Evidence for Replacement of the Short Cytoplasmic Domain Isoform by Glycosylphosphatidylinositol-Linked Proteins in Human Leukocytes", Bernhard B. Singer, Inka Scheffrahn, Robert Heymann, Kristmundur Sig- mundsson, Robert Kammerer und Björn Öbrink, The Journal of Immunology (2002), Vol. 168, 5139-5146) beschäftigt sich mit Expressionsuntersuchungen von CEACAM 1 auf Leukozyten von Menschen, Mäusen sowie Ratten.
Die Publikation von Greicius et al. („CEACAM 1 is a Potent Regulator of B Cell Receptor Com- plexinduced Activation", Gediminas Greicius, Eva Severinson, Nicole Beauchemin, Björn Öbrink und Bernhard B. Singer, Journal of Leukocyte Biology (2003), Vol. 74, 126-134) erwähnt, dass CEACAM1 das Tumorwachstum von epithelialen Zellen, die Angiogenese, die NK- Zellzytotoxizität sowie die T-Zellzytotoxizität reguliert. Die Publikation von Chen et al. („Editorial: CEACAM1 : fine-tuned for fine-tuning", Zhangguo Chen, Lanfen Chen und Richard S. Blumberg, Journal of Leukocyte Biology (2009), Vol. 86, 195-197) unterstreicht die Bedeutung von CEACAM1 in Bezug auf Tumorgenese, Angiogenese und Metabolismus. Die Publikation von Lobo et al. („Pivotal Advance: CEACAM1 is a Negative Coreceptor for the B Cell Receptor and Promotes CD19-mediated Adhesion of B Cells in a PI3K-dependent Manner", Elizabeth O. Lobo, Zhifang Zhang und John E. Shively, Journal of Leukocyte Biology (2009), Vol. 86, 205-218) offenbart, dass CEACAM1 ein negativer Rezeptor für den sogenannten B-Zellen-Rezeptor (BCR) darstellt. Die Publikation von Blau et al. („Targeted Disruption of the Ceacaml (MHVR) Gene Leads to Reduced Susceptibility of Mice to Mouse Hepatitis Virus Infection", Dianna M. Blau, Ciaire Tur- bide, Michel Tremblay, Melanie Olson, Stephanie Letourneau, Eva Michaliszyn, Serge Jothy, Kathryn V. Holmes und Nicole Beauchemin, Journal of Virology (2001 ), Vol. 75, 8173-8186) offenbart, dass CEACAM1 -Knockout-Mäuse weniger anfällig für eine Hepatitisinfektion sind. WO 2005/058358 A2 offenbart von CEACAM1 abgeleitete Fusionsproteine im Zusammenhang von entzündlichen Erkrankungen.
Die US 8,598,322 B2 sowie die WO 2013/054331 A1 offenbaren jeweils Anti-CEACAM1 - Antikörper sowie deren Verwendung zur Behandlung von Krebs.
Die WO 2013/082366 A1 offenbart CEACAM1 -Antikörper für die Tumorbehandlung, insbeson- dere Krebsbehandlung.
Die WO 2013/054331 A1 thematisiert CEACAM1 -Antikörper im Kontext der Behandlung von viralen Infektionen und Krebserkrankungen.
In der WO 2014/022332 A1 wird eine Zusammensetzung beschrieben, welche die Interaktion zwischen TIM3 und CEACAM1 moduliert.
Der potentielle Nutzen von CEACAM1 als sogenanntes therapeutisches Target (therapeutische Zielsubstanz) ist somit zwar grundsätzlich erkannt worden. Gleichwohl sind bislang viele Fragen bezüglich einer therapeutischen Verwendbarkeit von CEACAM1 als Target noch nicht geklärt. Insbesondere gibt es bislang widersprüchliche Daten, ob CEACAM1 auf B-Zellen exprimiert wird und inwieweit CEACAM1 -bindende Substanzen, insbesondere Antikörper, in der Lage sind, B-Zellen in vitro zu beeinflussen. Ebenso ist bislang die Verwendbarkeit von CEACAM1 zur Aktivierung anderer Zellen des Immunsystems, wie etwa T-Zellen, unbekannt.
Es besteht daher weiterhin ein großer Bedarf an der Entwicklung von therapeutisch wirksamen Substanzen, deren therapeutisches Target CEACAM 1 darstellt. Besonderer Bedarf besteht für die Bereitstellung von therapeutisch wirksamen Substanzen, die CEACAM1 binden können, wie etwa anti-CEACAM1 -Antikörpern, die in der Lage sind, Zellen des Immunsystems, wie etwa T-Zellen, zu aktivieren und bevorzugt zudem zur Behandlung und/oder Prävention von Neoplasien und/oder Infektionen geeignet sind. Ein entsprechender Bedarf besteht dabei auch insbesondere für die Indikationsgebiete virale Infektionen, virale In- fektionskrankheiten sowie B-Zell-abhängige Krankheiten.
Zudem lag der vorliegenden Erfindung auch die Aufgabe zugrunde, therapeutische Substanzen bereitzustellen, welche sich insbesondere für die Therapie von viralen Infektionen, viralen Infektionskrankheiten sowie B-Zell-abhängigen Krankheiten eignen. Weiterhin lag der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, Substanzen zur Anwendung bei der Diagnose von insbeson- dere viralen Infektionen, viralen Infektionskrankheiten sowie B-Zell-abhängigen Krankheiten bereitzustellen.
Überraschend wurde gefunden, dass anti-CEACAM1 -Antikörper, die eine Antigenbindungsstelle CDR (engl.„Complementarity Determining Region") mit mindestens 80% Sequenzhomologie zu Sequenz WI NTYTGEPT (SEQ ID Nr. 21 ) enthalten, besonders gut geeignet sind. Demnach betrifft ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung anti-CEACAM1 -Antikörper, umfassend:
(A) mindestens eine Antikörper-Schwerketten-(VH)-Domäne enthaltend Antigenbindungs- stellen CDR1 H, CDR2H und CDR3H, und
(B) mindestens eine Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne enthaltend Antigenbindungsstel- len CDR1 L, CDR2L und CDR3L,
wobei CDR2H mindestens 80% Sequenzhomologie zu folgender Aminosäuresequenz aufweist:
WINTYTGEPT (SEQ I D Nr. 21 ). Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform kann eine Antigenbindungsstelle CDR2H von mindestens 80% Sequenzhomologie zu der Aminosäuresequenz WINTYTGEPT (SEQ ID Nr. 21 ) auch verstanden werden als eine Aminosäuresequenz, die um nicht mehr als zwei Aminosäurereste von SEQ ID Nr. 21 abweicht, bevorzugt um nicht mehr als einen einzigen Aminosäur- reest von SEQ I D Nr. 21 abweicht, insbesondere mit SEQ I D Nr. 21 sequenzidentisch ist.
Bevorzugt beträgt die Dissoziationskonstante Kd der Bindung des erfindungsgemäßen anti- CEACAM1 -Antikörpers an CEACAM1 nicht mehr als 100 nM. Mit anderen Worten sind die Anti- genbindungsstellen CDR1 H, CDR2H, CDR3H, CDR1 L, CDR2L und CDR3L zusammen so gewählt, dass der anti-CEACAM1 -Antikörpers an CEACAM1 mit einer Dissoziationskonstante Kd von nicht mehr als 100 nM, bevorugt nicht mehr als 50 nM, bindet. Wie hierin verwendet, ist CEACAM 1 bevorzugt CEACAM 1 eines Säugetiers, insbesondere humanes CEACAM 1 .
Die CDRs können in beliebiger Reihenfolge angeordnet sein. Bevorzugt kommen in der Anti- körper-Schwerketten-(VH)-Domäne die CDRs in der folgenden Reihenfolge vom N- zum C- Terminus vor: CDR1 H, CDR2H, CDR3H. Bevorzugt kommen in der Antikörper-Leichtketten-(VL)- Domäne die CDRs in der folgenden Reihenfolge vom N- zum C-Terminus vor: CDR1 L, CDR2L, CDR3L. Es können jeweils beliebig viele, bevorzugt jedoch nicht mehr als 50 Aminosäurereste zwischen den jeweils näher beieinander liegenden CDRs liegen.
Weitere Aufgaben werden erfindungsgemäß gelöst durch eine Substanz gemäß unabhängigem unten angeführter Ausführungsform 1 , ein Arzneimittel gemäß unten angeführter Ausführungsform 1 1 , einen Antikörper gemäß unabhängigem unten angeführter Ausführungsform 12, einen therapeutischen Antikörper gemäß unabhängigem unten angeführter Ausführungsform 13, eine variable Antikörper-Schwerketten-(VH)-Domäne gemäß unabhängigem unten angeführter Ausführungsform 14, eine variable Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne gemäß unabhängigem unten angeführter Ausführungsform 15, isolierte Nukleinsäuren gemäß den unabhängigen Ausführungsformen 16 und 17, eine B-Zelllinie gemäß unten angeführter Ausführungsform 18 sowie ein Verfahren gemäß unten angeführter Ausführungsform 19. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den abhängigen Ausführungsformen 2 bis 9 definiert. Der Wortlaut sämtlicher Ausführungsformen wird hiermit durch ausdrückliche Bezugnahme zum Inhalt der vorliegenden Beschreibung gemacht.
Weiterhin werden die der Erfindung zugrundeliegenden Aufgaben durch die in der Beschreibung offenbarten Erfindungsgegenstände gelöst.
Die Erfindung beruht auf den folgenden überraschenden Befunden: Überraschenderweise wurde gefunden, dass die erfindungsgemäßen Antikörper geeignet sind T-Zellen zu aktivieren. Es wurde erkannt, dass die erfindungsgemäßen Antikörper zur Prävention und Behandlung von Neoplasien und Infektionen geeignet sind.
Überraschenderweise konnte zudem festgestellt werden, dass eine Aktivierung von CEACAM 1 in Mäusen eine Aktivierung und insbesondere Differenzierung von B-Zellen bewirkt und weiter- hin insbesondere eine positive Beeinflussung des Verlaufs von viralen Infektionen sowie Infektionskrankheiten ermöglicht. Als Virusmodelle werden das lymphozytäre Choriomeningitis Virus (LCMV) und das vesikuläre Stomatitis Virus (VSV) verwendet. Das LCMV ist in der Maus nicht zytopathisch. Somit wird der Schaden, der bei einer Infektion entsteht, in erster Linie durch die Immunantwort gegen das Virus verursacht. Damit verhält sich dieses Virus ähnlich wie die schwach zytopathischen Viren Hepatitis-B-Virus (HBV), Hepatitis-C-Virus (HCV) und Humanes Immundefizienz-Virus (HIV) im Menschen. Das vesikuläre Stomatitis Virus ist in der Maus zyto- pathisch. Es verhält sich daher ähnlich dem Ebola-Virus, Poliovirus, Rabiesvirus, Ebstein-Barr- Virus (EBV), Influenza-Virus, Herpes-Simplex-Virus sowie Cytomegalievirus (CMV).
Weiterhin konnte im Rahmen von Mäuseversuchen überraschenderweise nachgewiesen werden, dass eine Inhibierung von CEACAM 1 in vivo die Aktivierung und Differenzierung bzw. Entwicklung von B-Zellen stark inhibiert und insbesondere den Ausbruch einer B-Zellabhängigen Autoimmunität verhindert. Hierzu wurde bei Mäusen eine B-Zell-abhängige Auto- Immunität mittels Pristan induziert. Dabei stellte sich heraus, dass eine Inhibierung von CEACAM1 eine Erkrankung der Mäuse verhinderte. Des Weiteren konnte der Erfinder nachweisen, dass eine Inhibierung von CEACAM 1 zu reduzierten Serum-lgE-Konzentrationen führte.
Der Ausdruck„Expression" umfasst im Sinne der vorliegenden Erfindung alle Prozesse, welche für eine vollständige, d. h. funktionsfähige, Ausprägung des Proteins CEACAM 1 erforderlich sind. So umfasst der Ausdruck„Expression" im Sinne der vorliegenden Erfindung insbesondere die Transkription, die nachfolgende RNA-Prozessierung, die Translation sowie die Proteinreifung, wie beispielsweise Proteinfaltung und posttranslationale Modifikationen, von CEACAM1 .
Der Ausdruck„Funktion von CEACAM 1 " definiert im Sinne der vorliegenden Erfindung die phy- siologische Funktion bzw. die physiologischen Funktionen von CEACAM1 , insbesondere dessen Befähigung, die Aktivität und insbesondere Differenzierung von B-Zellen zu beeinflussen.
Wie oben dargelegt, weist der anti-CEACAM1 -Antikörper eine Antigenbindungsstelle CDR2H von mindestens 80% Sequenzhomologie zu der Aminosäuresequenz WINTYTGEPT (SEQ I D Nr. 21 ) auf, die übrigen Antigenbindungsstellen CDR1 H, CDR3H, CDR1 L, CDR2L und CDR3L) können grundsätzlich bezüglich ihrer Aminosäuresequenz variabel sein, werden jedoch geeignet sein in ihrer Gesamtheit die Bindung des anti-CEACAM1 -Antikörpers an CEACAM 1 zu verbessern.
Sequenzhomologie ist im weitesten Sinne zu verstehen, insbesondere als Sequenzhomologie wie nach dem BLAST-Algorithmus (Basic Local Alignment Search Tool) des NCBI (National Center for Biotechnology Information) für Proteinsequenzvergleiche (blastp) in der am 14. Juli 2016 aktuellen Version.
Es wird verstanden werden, dass die hierin gezeigten und beschriebenen Aminosäuresequen- zen, anti-CEACAM1 -Antikörper, Antikörper-Domänen, Antigenbindungsstellen CDRs usw. optional jeweils posttranslationale Modifikationen aufweisen können wie beispielhaft Glykosylie- rung, Sulfatierung, Phosphatierung, Acetylierung, Acylierung usw. Alternativ oder zusätzlich können die hierin gezeigten und beschriebenen Aminosäuresequenzen, anti-CEACAM1 - Antikörper, Antikörper-Domänen, Antigenbindungsstellen CDRs usw. optional jeweils synthetische Modifikationen aufweisen wie beispielhaft Markierungen (z.B. Fluorophore, Bindungsmoleküle (Biotin, Strepavidin, Methotrexat usw.). Auch kann ein anti-CEACAM1 -Antikörper optional dadurch mit einem radioaktiven oder Spin-Label versehen sein, dass eines der natürlich vor- kommenden Atome durch ein detektierbares Isotop (z.B. 3H, 13C usw.) ersetzt ist.
Bevorzugt weist der erfindungsgemäße Antikörper eine Antigenbindungsstelle CDR2H von mindestens 90% Sequenzhomologie, stärker bevorzugt von mindestens 95% Sequenzhomologie, insbesondere mit Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz WINTYTGEPT (SEQ ID Nr. 21 ) auf.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform bindet der Anti-CEACAM1 -Antikörper die N- Domäne von CEACAM1 gemäß SEQ I D Nr. 39. Gemäß einer stärker bevorzugten Ausführungsform bindet der Anti-CEACAM1 -Antikörper die N-Domäne von CEACAM 1 gemäß SEQ ID Nr. 39 und zusätzlich mindestens eine weitere Domäne ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus A1 -Domäne von CEACAM 1 gemäß SEQ I D Nr. 40, B-Domäne von CEACAM 1 gemäß SEQ ID Nr. 41 und A2-Domäne von CEACAM 1 gemäß SEQ I D Nr. 42.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform bindet der Anti-CEACAM1 -Antikörper die N- Domäne von CEACAM 1 gemäß SEQ ID Nr. 39 und zusätzlich die A1 -Domäne von CEACAM 1 gemäß SEQ I D Nr. 40. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform bindet der Anti-CEACAM1 -Antikörper die N- Domäne von CEACAM 1 gemäß SEQ ID Nr. 39 und zusätzlich die B-Domäne von CEACAM 1 gemäß SEQ I D Nr. 41 .
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform bindet der Anti-CEACAM1 -Antikörper die N- Domäne von CEACAM 1 gemäß SEQ ID Nr. 39 und zusätzlich die A2-Domäne von CEACAM 1 gemäß SEQ I D Nr. 42.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform bindet der Anti-CEACAM1 -Antikörper die N- Domäne von CEACAM 1 gemäß SEQ ID Nr. 39 und zusätzlich die A1 -Domäne von CEACAM 1 gemäß SEQ I D Nr. 40 und die B-Domäne von CEACAM1 gemäß SEQ I D Nr. 41 .
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform bindet der Anti-CEACAM1 -Antikörper die N- Domäne von CEACAM 1 gemäß SEQ ID Nr. 39 und zusätzlich die A1 -Domäne von CEACAM 1 gemäß SEQ I D Nr. 40 und die A2-Domäne von CEACAM1 gemäß SEQ I D Nr. 42. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform bindet der Anti-CEACAM1 -Antikörper die N- Domäne von CEACAM 1 gemäß SEQ ID Nr. 39 und zusätzlich die B-Domäne von CEACAM 1 gemäß SEQ I D Nr. 41 und die A2-Domäne von CEACAM1 gemäß SEQ I D Nr. 42. Gemäß einer stärker bevorzugten Ausführungsform bindet der Anti-CEACAM1 -Antikörper die N-Domäne von CEACAM 1 gemäß SEQ ID Nr. 39 und zusätzlich die A1 -Domäne von CEACAM 1 gemäß SEQ ID Nr. 40, die B-Domäne von CEACAM1 gemäß SEQ I D Nr. 41 und die A2-Domäne von CEACAM1 gemäß SEQ I D Nr. 42. Diese Bindungen werden durch die besondere Antigenbindungsstelle CDR2H erreicht, insbesondere die besondere Antigenbindungsstelle CDR2H in Kombination mit einer oder mehreren weiteren CDRs in den bevorzugten Ausführungsformen.
Bevorzugt sind diese Bindungen jeweils Bindungen, bei denen die Dissoziationskonstante Kd der jeweiligen Bindung nicht mehr als 1000 nM, stärker bevorzugt nicht mehr als 500 nM, insbesondere nicht mehr als 100 nM, beträgt.
Es wird verstanden werden, dass der Antikörper jeweils ein oder mehrere Epitope innerhalb dieser Sequenzen binden wird. Ein Epitop kann jeweils ein beliebiges Epitop sein wie z.B. ein lineares Epitop oder ein strukturelles Epitop, ein primäres oder ein sekundäres Epitop.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das Epitop, das durch den Antikörper gebunden wird, 3 bis 20 Aminosäurerreste lang und besteht aus 1 bis 3 Aminosäuresequenzen der N- Domäne sowie 1 bis 3 Aminosäuresequenzen der A1 -, B- und/oder A2-Domäne.
Die Aminosäuresequenzen SEQ I D Nr. 39-42 stellen sich wie folgt dar: SEQ I D Nr. 39: CEACAM1 -N-Domäne (=lg-like V-type)
QLTTESMPFNVAEGKEVLLLVHN LPQQLFGYSWYKGERVDGNRQIVGYAIGTQQATPGPANS GRETIYPNASLLIQNVTQNDTGFYTLQVIKSDLVNEEATGQFHVYP
SEQ I D Nr. 40: CEACAM1 -A1 -Domäne (=lg-like C2-type 1 )
PKPSISSNNSNPVEDKDAVAFTCEPETQDTTYLWWIN NQSLPVSPRLQLSNGNRTLT- LLSVTRN DTGPYECEIQNPVSANRSDPVTLN
SEQ I D Nr. 41 : CEACAM1 -B-Domäne (=lg-like C2-type 2)
PDTPTISPSDTYYRPGANLSLSCYAASNPPAQYSWLI NGTFQQSTQELFIP-
NITVNNSGSYTCHANNSVTGCNRTTVKTI I SEQ I D Nr. 42: CEACAM1 -A2-Domäne (=lg-like C2-type 3)
PWAKPQI KASKTTVTGDKDSVNLTCSTNDTGISIRWFFKNQSLPSSERMKLSQGNTTLS I NPVKREDAGTYWCEVFN PISKNQSDPIMLN Die Konsensussequenz SEQ ID Nr. 43 des CEACAM1 stellt sich wie folgt dar:
MGHLSAPLHRVRVPWQGLLLTASLLTFWN PPTTAQLTTESMPFNVAEGKEVLLLVHNLPQQLF GYSWYKGERVDGNRQIVGYAIGTQQATPGPANSGRETIYPNASLLIQNVTQN DTGFYTLQVI KS DLVNEEATGQFHVYPELPKPSISSNNSNPVEDKDAVAFTCEPETQDTTYLWWI NNQSLPVSPR LQLSNGNRTLTLLSVTRNDTGPYECEIQNPVSAN RSDPVTLNVTYGPDTPTISPSDTYYRPGAN LSLSCYAASN PPAQYSWLI NGTFQQSTQELFI PNITVNNSGSYTCHANNSVTGCNRTTVKTI IVT ELSPVVAKPQI KASKTTVTGDKDSVNLTCSTNDTGISI RWFFKNQSLPSSERMKLSQGNTTLSI N PVKREDAGTYWCEVFNPISKNQSDPIMLNVNYNALPQENGLSPGAIAGIVIGVVALVALIAVALA CFLHFGKTGRASDQRDLTEHKPSVSNHTQDHSNDPPNKMNEVTYSTLNFEAQQPTQPTSASP SLTATEIIYSEVKKQ
Ein Polypeptid der Konsensussequenz SEQ ID Nr. 43 des CEACAM1 bildet bevorzugt folgende Sekundärstrukturen (Positionen) aus: Betafaltblatt (37-46), Betafaltblatt (37-46), Betafaltblatt (51 -56), Betafaltblatt (60-73), Helix (75-77), Betafaltblatt (78-83), Turn (84-87), Betafaltblatt (88- 91 ), Betafaltblatt (99-101 ), Betafaltblatt (107-109), Helix (1 14-1 16), Betafaltblatt (1 18-126), Betafaltblatt (132-141 ). Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das von dem erfindungsgemäße anti-CEACAM1 -Antikörper erkannte Epitop auf der CEACAM1 -N-Domäne die Aminosäurereste Y68, K69, R72, F1 19 und E133 Konsensussequenz SEQ I D Nr. 43 des CEACAM1 .
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform weist CDR2L des erfindungsgemäßen Antikörpers die folgende Aminosäuresequenz auf: YTSXb4LXb6Xb7 (SEQ ID Nr. 22), wobei Xb4, Xb6, und Xb7 jeweils unabhängig voneinander einen beliebigen Aminosäurerest darstellen.
Stärker bevorzugt sind in der Aminosäuresequenz YTSXb4LXb6Xb7 (SEQ ID Nr. 22), die Reste Xb4, Xb6, und Xb7 so definiert, dass: Xb4 T oder K ist, Xb6 Q oder H ist, und Xb7 P oder S ist.
Demnach können die Reste wie folgt definiert sein: Xb4 = T, Xb6 = Q und Xb7 = P; Xb4 = T, Xb6 = Q und Xb7 = S; Xb4 = T, Xb6 = H und Xb7 = P; Xb4 = T, Xb6 = H und Xb7 = S; Xb4 = K, Xb6 = Q und Xb7 = P; Xb4 = K, Xb6 = Q und Xb7 = S; Xb4 = K, Xb6 = H und Xb7 = P; oder Xb4 = T, Xb6 = H und Xb7 = S.
Gemäß einer besonders stark bevorzugten Ausführungsform weist CDR2L mindestens 80% Sequenzhomologie zu einer der folgenden Aminosäuresequenzen auf: YTSTLQP (SEQ ID Nr. 23) oder YTSKLHS (SEQ ID Nr. 24).
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform kann eine Antigenbindungsstelle CDR2L von mindestens 80% Sequenzhomologie zu der Aminosäuresequenz TSTLQP (SEQ ID Nr. 23) oder YTSKLHS (SEQ I D Nr. 24) auch verstanden werden als eine Aminosäuresequenz, die um nicht mehr als einen einzigen Aminosäurreest von SEQ I D Nr. 23 oder 24 abweicht, insbesondere mit SEQ ID Nr. 23 oder 24 sequenzidentisch ist.
Stärker bevorzugt weist CDR2L mindestens 90% Sequenzhomologie, noch stärker bevorzugt mindestens 95% Sequenzhomologie, insbesondere Sequenzidentität zu einer der folgenden Aminosäuresequenzen auf: YTSTLQP (SEQ I D Nr. 23), oder YTSKLHS (SEQ I D Nr. 24).
Besonders bevorzugt weist der erfindungsgemäße Antikörper eine CDR2H einer Aminosäuresequenz WI NTYTGEPT (SEQ ID Nr. 21 ) und eine CDR2L mindestens 80% Sequenzhomologie zu einer der folgenden Aminosäuresequenzen auf: YTSTLQP (SEQ ID Nr. 23), oder YTS- KLHS (SEQ I D Nr. 24) auf.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform weist CDR1 H die folgende Aminosäuresequenz auf: GYXa3FXa5Xa6YXa8MXa10 (SEQ ID Nr. 25), wobei Xa3, Xa5, Xa6, Xa8 und Xai0 jeweils unabhängig voneinander einen beliebigen Aminosäurerest darstellen. Gemäß einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist CDR1 H dadurch charakterisiert, dass: Xa3 T oder I ist,
Xa5 T oder R ist,
Xa6 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus V, N und T,
Xa8 G oder V ist, und
Xaio ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus N, K und H.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist CDR1 H mindestens 80% Sequenzhomologie zu einer der folgenden Aminosäuresequenzen auf: GYTFTVYGMN (SEQ I D Nr. 26), GYIFRNYGMK (SEQ I D Nr. 27), oder GYTFTTYVMH (SEQ I D Nr. 28).
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform kann eine Antigenbindungsstelle CDR1 H von mindestens 80% Sequenzhomologie zu der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 26, 27 oder 28 auch verstanden werden als eine Aminosäuresequenz, die um nicht mehr als zwei Aminosäurreste von SEQ ID Nr. 26, 27 oder 28 abweicht, stärker bevorzugt um nicht mehr als einen einzigen Aminosäurreest von SEQ ID Nr. 26, 27 oder 28 abweicht, insbesondere mit SEQ ID Nr. 26, 27 oder 28 sequenzidentisch ist.
Stärker bevorzugt weist CDR1 H mindestens 90% Sequenzhomologie, noch stärker bevorzugt mindestens 95% Sequenzhomologie, insbesondere Sequenzidentität zu einer der folgenden Aminosäuresequenzen auf: GYTFTVYGMN (SEQ ID Nr. 26), GYI FRNYGMK (SEQ I D Nr. 27), oder GYTFTTYVMH (SEQ I D Nr. 28).
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform weist CDR1 L die folgende Aminosäuresequenz auf: XdiASXd4Xd5lXd7Xd8Xd9LXdii (SEQ ID Nr. 29), wobei Xdi, Xd4, Xd5, Xd7, Xd8, Xd9 und Xdn jeweils unabhängig voneinander einen beliebigen Aminosäurerest darstellen. Gemäß einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist CDR1 L dadurch charakterisiert, dass: Xdi einen basischen Aminosäurerest darstellt, insbesondere K oder R ist,
Xd4 Q oder D ist, insbesondere Q ist;
Xd5 D oder H ist, insbesondere D ist;
Xd7 N oder S ist,
Figure imgf000011_0001
Xdg einen aromatischen Aminosäurerest darstellt, insbesondere ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus F, Y und W, insbesondere F oder Y ist, und
Xdn A oder N ist.
Gemäß einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform ist CDR1 L dadurch charakterisiert, dass:
Xdi einen basischen Aminosäurerest darstellt, insbesondere K oder R ist, Xd5 D ist,
Xd7 N oder S ist,
Figure imgf000011_0002
Xdn A oder N ist.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist CDR1 L mindestens 80% Sequenzhomologie zu einer der folgenden Aminosäuresequenzen auf: KASQDI NKFLA (SEQ ID Nr. 30), RASQDISNYLN (SEQ ID Nr. 31 ), oder KASDHINNWLA (SEQ I D Nr. 32). Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform kann eine Antigenbindungsstelle CDR1 L von mindestens 80% Sequenzhomologie zu der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 30, 31 oder 32 auch verstanden werden als eine Aminosäuresequenz, die um nicht mehr als zwei Aminosäurreste von SEQ ID Nr. 30, 31 oder 32 abweicht, stärker bevorzugt um nicht mehr als einen einzigen Aminosäurreest von SEQ ID Nr. 30, 31 oder 32 abweicht, insbesondere mit SEQ I D Nr. 30, 31 oder 32 sequenzidentisch ist.
Stärker bevorzugt weist CDR1 L mindestens 90% Sequenzhomologie, noch stärker bevorzugt mindestens 95% Sequenzhomologie, insbesondere Sequenzidentität zu einer der folgenden Aminosäuresequenzen auf: KASQDI NKFLA (SEQ I D Nr. 30), RASQDISNYLN (SEQ I D Nr. 31 ), oder KASDH INNWLA (SEQ ID Nr. 32).
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die CDR2H CDR2L, CDR1 H und CDR1 L wie oben beschrieben definiert. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist der erfindungsgemäße Anti- CEACAM1 -Antikörper auf: eine variable Antikörper-Schwerketten-(VH)-Domäne mit mindestens 80% Sequenzhomologie zu SEQ I D Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 7; und/oder
eine variable Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne mit mindestens 80% Sequenzhomologie zu SEQ I D Nr. 5 oder SEQ I D Nr. 9.
Noch stärker bevorzugt weist der erfindungsgemäße Anti-CEACAM1 -Antikörper auf:
eine variable Antikörper-Schwerketten-(VH)-Domäne mit mindestens 90% Sequenzhomologie zu SEQ I D Nr. 3 oder SEQ I D Nr. 7; und/oder
eine variable Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne mit mindestens 90% Sequenzhomologie zu SEQ I D Nr. 5 oder SEQ I D Nr. 9.
Noch stärker bevorzugt weist der erfindungsgemäße Anti-CEACAM1 -Antikörper auf:
eine variable Antikörper-Schwerketten-(VH)-Domäne mit mindestens 95% Sequenzhomologie zu SEQ I D Nr. 3 oder SEQ I D Nr. 7; und/oder
eine variable Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne mit mindestens 95% Sequenzhomologie zu SEQ I D Nr. 5 oder SEQ I D Nr. 9.
Noch stärker bevorzugt weist der erfindungsgemäße Anti-CEACAM1 -Antikörper auf:
eine variable Antikörper-Schwerketten-(VH)-Domäne mit Sequenzidentität zu SEQ I D Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 7; und/oder
eine variable Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne mit Sequenzidentität zu SEQ ID Nr. 5 oder SEQ I D Nr. 9.
Gemäß einer anderen besonders bevorzugten Ausführunsgform weist der erfindungsgemäße Anti-CEACAM1 -Antikörper auf:
eine variable Antikörper-Schwerketten-(VH)-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 7 oder einer Aminosäuresequenz, die um einen einzigen Aminosäurerest von SEQ I D Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 7 abweicht; und/oder
eine variable Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 9 o- der einer Aminosäuresequenz, die um einen einzigen Aminosäurerest von SEQ ID Nr. 5 oder SEQ I D Nr. 9 abweicht.
Ganz besonders bevorzugt weist der erfindungsgemäße Anti-CEACAM1 -Antikörper auf:
eine variable Antikörper-Schwerketten-(VH)-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 7; und
eine variable Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne gemäß SEQ I D Nr. 5 oder SEQ I D Nr. 9.
Bevorzugt weist der Anti-CEACAM1 -Antikörper zu dem CDR3H mit folgender Aminosäuresequenz auf: XciXc2Xc3Xc4Xc5Xc6Xc7Xc8Xc9Xcio (SEQ I D Nr. 33), wobei:
Figure imgf000012_0001
XC3 Y oder T ist,
Figure imgf000013_0001
Xc5 G oder N ist,
Figure imgf000013_0002
Xc7 M oder A ist,
Figure imgf000013_0003
Xcio N ist oder fehlt,
Bevorzugt weist CDR3H mindestens 80% Sequenzhomologie, stärker bevorzugt mindestens 90% Sequenzhomologie, noch stärker bevorzugt mindestens 95% Sequenzhomologie, insbesondere Sequenzidentität zu einer der folgenden Aminosäuresequenzen auf: YRYDGGMDY (SEQ I D Nr. 34) oder ITTSNYALDN (SEQ ID Nr. 35).
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform kann eine Antigenbindungsstelle CDR3H von min- destens 80% Sequenzhomologie zu der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 34 oder 35 auch verstanden werden als eine Aminosäuresequenz, die um nicht mehr als zwei Aminosäurreste von SEQ ID Nr. 34 oder 35 abweicht, stärker bevorzugt um nicht mehr als einen einzigen Amino- säurreest von SEQ ID Nr. 34 oder 35 abweicht, insbesondere mit SEQ ID Nr. 34 oder 35 sequenzidentisch ist.
Bevorzugt weist zudem der Anti-CEACAM1 -Antikörper eine CDR3L mit folgender Aminosäuresequenz auf: XfiQXf3Xf4Xf5LXf7Xf8Xf9 (SEQ ID Nr. 36), wobei Xfl , Xf3, Xf4, Xf5, Xfz, X« und Xf9 jeweils unabhängig voneinander beliebige Aminosäurereste darstellen. Bevorzugt sind die Aminosäurereste so definiert, dass:
Xn L oder Q ist,
Xf3 Y oder G ist,
Xf4 D oder N ist,
Xf5 N oder T ist,
Figure imgf000013_0004
Xf8 T oder W ist,
Xf9 T ist oder fehlt.
Bevorzugt weist CDR3L mindestens 80% Sequenzhomologie, stärker bevorzugt mindestens 90% Sequenzhomologie, noch stärker bevorzugt mindestens 95% Sequenzhomologie, insbe- sondere Sequenzidentität zu einer der folgenden Aminosäuresequenzen auf: LQYDNLYT (SEQ I D Nr. 37), oder QQGNTLPWT (SEQ I D Nr. 38).
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform kann eine Antigenbindungsstelle CDR3L von mindestens 80% Sequenzhomologie zu der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 37 oder 38 auch ver- standen werden als eine Aminosäuresequenz, die um nicht mehr als zwei Aminosäurreste von SEQ ID Nr. 37 oder 38 abweicht, stärker bevorzugt um nicht mehr als einen einzigen Amino- säurreest von SEQ ID Nr. 37 oder 38 abweicht, insbesondere mit SEQ ID Nr. 37 oder 38 sequenzidentisch ist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der erfindungsgemäße anti-CEACAM1 - Antikörper:
eine CDR1 H gemäß SEQ ID Nr. 25, insbesondere von mindestens 80% Sequenzhomologie zu SEQ ID Nr. 26, SEQ ID Nr. 27 oder SEQ ID Nr. 28;
eine CDR2H von mindestens 80% Sequenzhomologie zu SEQ I D Nr. 21 ; und
eine CDR3H gemäß SEQ ID Nr. 33, insbesondere von mindestens 80% Sequenzhomo- logie zu SEQ I D Nr. 34 oder SEQ I D Nr. 35.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der erfindungsgemäße anti-CEACAM1 - Antikörper:
eine CDR1 H gemäß SEQ ID Nr. 25, insbesondere von mindestens 80% Sequenzhomo- logie zu SEQ I D Nr. 26, SEQ ID Nr. 27 oder SEQ ID Nr. 28;
eine CDR1 L gemäß SEQ ID Nr. 29, insbesondere von mindestens 80% Sequenzhomologie zu SEQ I D Nr. 30, SEQ ID Nr. 31 oder SEQ ID Nr. 32;
eine CDR2H von mindestens 80% Sequenzhomologie zu SEQ I D Nr. 21 ; und
eine CDR2L gemäß SEQ ID Nr. 22, insbesondere von mindestens 80% Sequenzhomo- logie zu SEQ I D Nr. 23 oder SEQ ID Nr. 24.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der erfindungsgemäße anti-CEACAM1 - Antikörper:
eine CDR2H von mindestens 80% Sequenzhomologie zu SEQ ID Nr. 21 ;
- eine CDR2L gemäß SEQ ID Nr. 22, insbesondere von mindestens 80% Sequenzhomologie zu SEQ I D Nr. 23 oder SEQ ID Nr. 24;
eine CDR3H gemäß SEQ ID Nr. 33, insbesondere von mindestens 80% Sequenzhomologie zu SEQ ID Nr. 34 oder SEQ ID Nr. 35; und
eine CDR3L gemäß SEQ ID Nr. 39, insbesondere von mindestens 80% Sequenzhomo- logie zu SEQ I D Nr. 37 oder SEQ ID Nr. 38.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der erfindungsgemäße anti-CEACAM1 - Antikörper:
eine CDR1 H gemäß SEQ ID Nr. 25, insbesondere von mindestens 80% Sequenzhomo- logie zu SEQ ID Nr. 26, SEQ ID Nr. 27 oder SEQ ID Nr. 28;
eine CDR1 L gemäß SEQ ID Nr. 29, insbesondere von mindestens 80% Sequenzhomologie zu SEQ I D Nr. 30, SEQ ID Nr. 31 oder SEQ ID Nr. 32;
eine CDR2H von mindestens 80% Sequenzhomologie zu SEQ ID Nr. 21 ;
eine CDR2L gemäß SEQ ID Nr. 22, insbesondere von mindestens 80% Sequenzhomo- logie zu SEQ I D Nr. 23 oder SEQ ID Nr. 24;
eine CDR3H gemäß SEQ ID Nr. 33, insbesondere von mindestens 80% Sequenzhomologie zu SEQ ID Nr. 34 oder SEQ ID Nr. 35; und eine CDR3L gemäß SEQ ID Nr. 39, insbesondere von mindestens 80% Sequenzhomologie zu SEQ ID Nr. 37 oder SEQ ID Nr. 38,
wobei der Antikörper bevorzugt die N-Domäne von CEACAM1 gemäß SEQ ID Nr. 39 bindet, insbesndere wobei der der Antikörper bevorzugt die N-Domäne von CEACAM1 gemäß SEQ ID Nr. 39 und zusätzlich mindestens eine weitere Domäne ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus A1 -Domäne von CEACAM1 gemäß SEQ ID Nr. 40, B-Domäne von CEACAM1 gemäß SEQ ID Nr. 41 und A2-Domäne von CEACAM1 gemäß SEQ ID Nr. 42 bindet.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst der erfindungsgemäße anti- CEACAM1 -Antikörper:
eine CDR1 H von mindestens 80% Sequenzhomologie zu SEQ I D Nr. 26, SEQ ID Nr. 27 oder SEQ ID Nr. 28;
eine CDR1 L von mindestens 80% Sequenzhomologie zu SEQ ID Nr. 30, SEQ ID Nr. 31 oder SEQ ID Nr. 32;
eine CDR2H von mindestens 80% Sequenzhomologie zu SEQ ID Nr. 21 ;
eine CDR2L von mindestens 80% Sequenzhomologie zu SEQ ID Nr. 23 oder SEQ ID Nr. 24;
eine CDR3H von mindestens 80% Sequenzhomologie zu SEQ ID Nr. 34 oder SEQ ID Nr. 35; und
eine CDR3L von mindestens 80% Sequenzhomologie zu SEQ ID Nr. 37 oder SEQ ID Nr. 38,
wobei der Antikörper bevorzugt die N-Domäne von CEACAM1 gemäß SEQ ID Nr. 39 bindet, insbesndere wobei der der Antikörper bevorzugt die N-Domäne von CEACAM1 gemäß SEQ ID Nr. 39 und zusätzlich mindestens eine weitere Domäne ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus A1 -Domäne von CEACAM1 gemäß SEQ ID Nr. 40, B-Domäne von CEACAM1 gemäß SEQ ID Nr. 41 und A2-Domäne von CEACAM1 gemäß SEQ ID Nr. 42 bindet.
Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst der erfindungsgemäße anti-CEACAM1 -Antikörper:
- eine CDR1 H gemäß SEQ ID Nr. 26, SEQ ID Nr. 27 oder SEQ ID Nr. 28;
eine CDR1 L gemäß SEQ ID Nr. 30, SEQ ID Nr. 31 oder SEQ ID Nr. 32;
eine CDR2H gemäß SEQ ID Nr. 21 ;
eine CDR2L gemäß SEQ ID Nr. 23 oder SEQ ID Nr. 24; und
eine CDR3H gemäß SEQ ID Nr. 34 oder SEQ ID Nr. 35; und
- eine CDR3L gemäß SEQ ID Nr. 37 oder SEQ ID Nr. 38,
wobei der Antikörper bevorzugt die N-Domäne von CEACAM1 gemäß SEQ ID Nr. 39 bindet, insbesndere wobei der der Antikörper bevorzugt die N-Domäne von CEACAM1 gemäß SEQ ID Nr. 39 und zusätzlich mindestens eine weitere Domäne ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus A1 -Domäne von CEACAM1 gemäß SEQ ID Nr. 40, B-Domäne von CEACAM1 gemäß SEQ ID Nr. 41 und A2-Domäne von CEACAM1 gemäß SEQ ID Nr. 42 bindet. Der erfindungsgemäße Antikörper wird in der Regel mit einer Dissoziationskonstante Kd von nicht mehr als 1000 nM an CEACAM1 binden, bevorzugt mit einer Dissoziationskonstante Kd von nicht mehr als 100 nM an CEACAM1 binden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform weist die Bindung des erfindungsgemäßen Antikörpers an CEACAM1 eine Dissoziationskonstante Kd von nicht mehr als 50 nM auf.
Stärker bevorzugt weist die Bindung des Antikörpers an CEACAM1 eine Dissoziationskonstante Kd von nicht mehr als 40 nM, insbesondere nicht mehr als 30 nM auf.
Überraschend wurde gefunden, dass die Antikörper Wirkung optimal ist, wenn der Antikörper die N Domäne und zusätzlich die A1 -Domäne, B-Domäne oder A2-Domäne bindet.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt auch einen anti-CEACAM1 Antikörper, der die N-Domäne von CEACAM1 gemäß SEQ ID Nr. 39, und bevorzugt mindestens eine weitere Domäne ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus A1 -Domäne von CEACAM1 gemäß SEQ ID Nr. 40, B-Domäne von CEACAM1 gemäß SEQ ID Nr. 41 und die A2-Domäne von CEACAM1 gemäß SEQ ID Nr. 42 bindet. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform weist der anti-CEACAM1 Antikörper, der dadurch charakterisiert ist, dass er an die N-Domäne des CEACAM1 und mindestens eine weitere der genannten Domänen bindet, auch weiter Eigenschaften wie oben beschrieben auf.
Dem Fachmann wird verständlich sein, dass die Antikörper in der Regel über Genexpression erhalten werden. Daher betrifft ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung eine Nukleinsäure, kodierend für einen der Anti-CEACAM1 -Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung.
Ebenso betrifft die vorliegende Erfindung Zellen, insbesondere Säugetierzellen, die eine solche Nukleinsäure enthalten.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die therapeutische, präventive und In v/'iro-Anwendung des Antikörpers. Daher betrifft ein Aspekt den erfindungsgemäßen Anti-CEACAM1 -Antikörper zur Verwendung als Medikament. Wie oben angemerkt, ist der erfindungsgemäße Anti-CEACAM1 -Antikörper geeignet zur Prävention von Neoplasien und Infektionen.
Daher betrifft ein weiterer der vorliegenden Erfindung den erfindungsgemäßen Anti-CEACAM1 - Antikörper zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung und/oder Prävention von Neo- plasien und/oder Infektionen. Anders ausgedrückt, betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung und/oder Prävention von Neoplasien und/oder Infektionen, umfassend die Verabreichung einer ausreichenden Menge an den zu behandelnden Patienten. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform sind Neoplasien maligne Tumore und/oder Krebs und/oder Infektionen virale Infektionen oder virale Infektionskrankheiten. Diese sind hierin detaillierter beschrieben.
Es wird verstanden werden, dass der erfindungsgemäßen Anti-CEACAM1 -Antikörper zu einer solchen therapeutischen oder präventiven Anwendung in einem geeigneten pharmazeutisch verträglichen flüssigen oder pastösen Träger gelöst sein kann. Daher betrifft ein Aspekt der vorliegenden Erfindung auch eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend mindestens einen erfindungsgemäßen Anti-CEACAM1 -Antikörper und mindestens einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Beispielhaft kann ein pharmazeutisch verträglicher Träger ein wässriger Puffer (z.B. ein Hepes-, Tris- oder Phosphatpuffer), ein organisches Lösungsmittel (z.B. Dime- thylsulfoxid (DMSO), Ethanol) oder eine Mischung aus zweien oder mehreren davon sein.
Wie oben beschrieben sind die erfindungsgemäßen Anti-CEACAM1 -Antikörper überraschend auch dazu geeignet T-Zellen zu aktivieren. Dies kann auch ex vivo und daher in vitro gesche- hen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Aktivierung von T-Zellen in vitro, umfassend die folgenden Schritte:
(i) Bereitstellen von nicht-aktivierten T-Zellen;
(ii) Inkontaktbringen der nicht-aktivierten T-Zellen mit:
(a) einem Anti-CEACAM1 -Antikörper gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 12, und
(b) einem Epitop gegen das die T-Zellen gerichtet sind; und
(iii) Kultivieren der gemäß Schritt (ii) behandelten T-Zellen unter Bedingungen, die die Aktivierung der T-Zellen nicht behindern.
T-Zellen sind bevorzugt CD8-positive T-Zellen. Die T-Zellen können einem Patienten entnommen sein oder können einer Zellkultur entstammen. Die Kultivierungsbedingungen sind bevorzugt etwa 37°C in Nährlösung bei ungefähr pH 7,1 -7.4 für einige Stunden oder Tage. Das Ver- fahren ist auch in den unten stehenden Beispielen beispielhaft verdeutlicht.
Der Begriff „Antikörper" sollte wie hierin verwendet im weitesten Sinne verstanden werden als jede beliebige Form von Immunglobulin oder Antigen-Bindungsfragment von einem solchen. Zahlreiche Formen von Antikörpern sind im Stand der Technik bekannt. Neben der Antikörper- Schwerketten-(VH)-Domäne und der Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne kann der Antikörper beliebig aufgebaut sein. In den Versuchen wurde ein maus-Antikörper verwendet. Der Fachmann weiß unmittelbar, wie ein solcher Maus-Antikörper aufgebaut und erhältlich ist. Der kon- stante Teil des Antikörpers (Fe) ist dann maustypisch. Der Antikörper kann, insbesondere für die therapeutischen und/oder präventiven Anwendung, humanisiert werden.
Beispielhaft kann der Antikörper sein: Immunoglobulin A (IgA), Immunoglobulin D (IgD), Immu- noglobulin E (IgE), Immunoglobulin G (IgG), Immunoglobulin M (IgM), Immunoglobulin Y (IgY) und Immunoglobulin W (IgW). Bevorzugte Antikörper sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus IgA, IgG und IgD, insbesondere IgG. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist der erfindungsgemäße Antikörper ein humanisierter Antikörper, insbesondere ein humanisierter IgG-Antikörper. Ein Antigen-Bindungsfragment wird im Sinne der vorliegenden Erfindung weist auch eine Anti- genbindungsstelle CDR2H von mindestens 80% Sequenzhomologie zu der Aminosäuresequenz WINTYTGEPT (SEQ ID Nr. 21 ) auf, die übrigen Antigenbindungsstellen CDR1 H, CDR3H, CDR1 L, CDR2L und CDR3L) sind variabel. Ein Beispiel eines Antigen-Bindungsfragments ist ein "fragment antigen binding" (Fab-Fragment), ein trunkierter Antikörper mit einer oder beiden CDR-Regionen oder ein isoliertes variables Fragment (Fv) eines Antikörpers.
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung offenbarten Antikörper besitzen bevorzugt jeweils eine für Antikörper charakteristische Struktur: Sie weisen jeweils zwei identische schwere Polypeptidketten und zwei identische leichte Polypeptidketten auf, welche durch kovalente Disul- fidbindungen zu einer Y-förmigen Struktur miteinander verknüpft sind. Die leichten Ketten bestehen aus jeweils einer variablen Domäne, nachfolgend als variable Antikörper-Leichtketten- (VL)-Domäne bezeichnet, und einer konstanten Domäne, nachfolgend als konstante Antikörper- Leichtketten-(Ci_)-Domäne bezeichnet. Die schweren Ketten hingegen haben jeweils eine variable Domäne, nachfolgend als variable Antikörper-Schwerketten-(VH)-Domäne bezeichnet, und drei konstante Domänen, nachfolgend als konstante Antikörper-Schwerketten-(CH)-Domänen bezeichnet. Wenn daher im Rahmen der vorliegenden Erfindung von einer variablen Antikörper- Schwerketten-(VH)-Domäne des Antikörpers oder einer variablen Antikörper-Leichtketten-(VL)- Domäne des Antikörpers die Rede ist, so bedeutet dies, dass der Antikörper insgesamt zwei variable Antikörper-Schwerketten-(VH)-Domänen, nämlich eine variable Antikörper- Schwerketten-(VH)-Domäne pro schwere Kette, bzw. zwei variable Antikörper-Leichtketten-(VL)- Domänen, nämlich eine variable Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne pro leichte Kette, mit den im Folgenden offenbarten Merkmalen aufweist. Entsprechendes gilt sinngemäß, wenn im Folgenden von einer konstanten Antikörper-Leichtketten-(CL)-Domäne des Antikörpers die Rede ist. Wenn im Folgenden von konstanten Antikörper-Schwerketten-(CH)-Domänen des Antikör- pers die Rede ist, so sind damit die konstanten Antikörper-Schwerketten-(CH)-Domänen von beiden schweren Ketten des Antikörpers gemeint.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines anti- CEACAM1 -Antikörpers als Immunstimulanz, wobei dieser optional in Kombination mit einem oder mehreren anderen Immunstimulantien (z.B. TLR-Agonisten, T-Zell-Liganden usw.) eingesetzt wird.
Anders ausgedrückt, betrifft die vorliegende Erfindung einen anti-CEACAM1 -Antikörper zur Aktivierung von Immunzellen, insbesondere T-Zellen. Bervorzugt ist hierbei der anti-CEACAM1 -Antikörper ein erfindungsgemäßer anti-CEACAM1 - Antikörper wie hierin beschrieben.
Ein anti-CEACAM1 -Antikörper, insbesondere ein erfindungsgemäßer anti-CEACAM1 -Antikörper wie hierin beschrieben, kann ein oder mehrere CEACAM1 -Polypeptide und optional weitere Polypeptide in eine gemeinsame Konfiguration bringen. Dies kann zur Aktivierung eines CEACAM1 -vermittelten Signaltransduktiosnwegs führen, was wiederum T-Zellen aktivieren kann. Ein anti-CEACAM1 -Antikörper, insbesondere ein erfindungsgemäßer anti-CEACAM1 - Antikörper wie hierin beschrieben, kann die Wirkung von immunstimulatorischen Liganden verstärken.
Gemäß einem weiteren Aspekt schlägt die Erfindung eine Substanz (insbesondere einen anti- CEACAM1 -Abntikorper gemäß der vorliegnden Erfindung) zur Anwendung bei der Therapie, d.h. Behandlung und/oder Vorbeugung, von viralen Infektionen und/oder viralen Infektionskrankheiten, vorzugsweise beim Menschen oder nichthumanen Tier, vor. Die Substanz kann insbesondere zur Anwendung bei der Impfung gegen virale Infektionskrankheiten vorgesehen sein bzw. zur Impfung gegen virale Infektionskrankheiten verwendet werden. Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Substanz (insbesondere einen anti- CEACAMI -Abntikorper gemäß der vorliegnden Erfindung) zur Anwendung bei der Therapie, d.h. Behandlung und/oder Vorbeugung, von bakteriellen Infektionen und/oder bakteriellen Infektionskrankheiten, vorzugsweise beim Menschen oder nichthumanen Tier. Die Substanz kann insbesondere zur Anwendung bei der Impfung gegen bakterielle Infektionskrankheiten vorgese- hen sein bzw. zur Impfung gegen bakterielle Infektionskrankheiten verwendet werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Substanz (insbesondere einen anti- CEACAMI -Abntikorper gemäß der vorliegnden Erfindung) zur Anwendung bei der Therapie, d.h. Behandlung und/oder Vorbeugung, von Sepsis.
Die Substanz zeichnet sich besonders dadurch aus, dass sie CEACAM1 , bevorzugt die Ex- pression und/oder Funktion von CEACAM1 , aktiviert.
Insbesondere handelt es sich bei der Substanz um einen anti-CEACAM1 -Abntikorper gemäß der vorliegnden Erfindung. Vorzugsweise handelt es sich bei dem CEACAM 1 um CEACAM 1 gemäß SEQ ID Nr. 1 (daher das Expressionsprodukt aus SEQ I D Nr. 1 ) bzw. um CEACAM1 gemäß SEQ I D Nr. 43.
In einer alternativen Ausführungsform handelt es sich bei dem CEACAM1 um CEACAM 1 gemäß SEQ ID Nr. 2 (daher das Expressionsprodukt aus SEQ ID Nr. 2). Das CEACAM 1 gemäß SEQ ID Nr. 2 besitzt im Unterschied zu dem CEACAM 1 gemäß SEQ ID Nr.1 eine sogenannte lnterleukin-2 sekretorische Sequenz (I L-2 secretory sequence). Diese Sequenz führt dazu, dass das Protein den sekretorischen Weg einschlägt und somit von Zellen sezerniert wird. Ohne diese Modifikation würde das Protein nicht sezerniert werden.
Eine Aktivierung der Expression und/oder Funktion von CEACAM1 durch die erfindungsgemäß vorgesehene Substanz kann in unterschiedlicher Weise erfolgen.
Erfindungsgemäß kann es beispielsweise vorgesehen sein, dass die Substanz die Expression von CEACAM1 auf Nukleinsäureebene aktiviert.
Weiterhin kann es vorgesehen sein, dass die Substanz die Expression von CEACAM 1 durch Aktivierung eines endogenen CEACAM1 -Promotors aktiviert. Des Weiteren kann es vorgesehen sein, dass die Substanz die Expression von CEACAM 1 auf mRNA-Ebene aktiviert.
Ferner kann es erfindungsgemäß vorgesehen sein, dass die Substanz eine Aktivierung von CEACAM1 auf Proteinebene bewirkt.
In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der Substanz um ein Polynukleotid, wel- ches ein Polypeptid bzw. Protein codiert, wobei das Polypeptid bzw. Protein die Expression und/oder Funktion von CEACAM1 aktiviert.
Die erfindungsgemäß vorgesehene Substanz bindet bevorzugt, insbesondere unter Ausbildung einer Kreuzvernetzung, an CEACAM1 . Die Kreuzvernetzung führt dazu, dass sich CEACAM1 - Moleküle in der Membran zusammenlagern und durch Interaktion mit sich selbst oder anderen Signalproteinen ihre Wirkung in der Zelle entfalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Substanz um eine gegen CEACAM1 gerichtete Substanz.
Die Substanz kann weiterhin insbesondere gegen Inhibitoren, biologische Vorläufer und/oder Varianten, insbesondere Isoformen, von CEACAM 1 gerichtet sein. Grundsätzlich kann die Substanz ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Antisense- RNA, Aptamere, Spiegel-Aptamere, Antikörper, lösliche Bindungspartner, insbesondere lösliche Liganden, von CEACAM1 , löslichen Rezeptoren, siRNA (small interfering RNA), shRNA (small hairpin RNA), siRNA-haltige Partikel (wie siRNA-haltige Calciumphosphat-Partikel), shRNA- haltige Partikel (wie shRNA-haltige Calciumphosphat-Partikel), siRNA-haltige Vesikel (wie siRNA-haltige Liposomen), shRNA-haltige Vesikel (wie siRNA-haltige Liposomen) und Ribozy- me. Bevorzugt liegen die siRNA und shRNA in den siRNA-haltigen Partikel und shRNA-haltigen Partikel verpackt vor.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Substanz um einen gegen CEACAM 1 gerichteten Antikörper (anti-CEACAM1 -Antikörper, aktivierender Antikörper).
Bei dem Antikörper handelt es sich in einer weiteren Ausführungsform um einen murinen Antikörper oder leporinen Antikörper. Mit anderen Worten kann es erfindungsgemäß bevorzugt sein, wenn es sich bei dem Antikörper um einen Kaninchen-Antikörper, Maus-Antikörper oder Ratten-Antikörper handelt, d. h. um einen Antikörper, welcher von einem Kaninchen, einer Maus oder einer Ratte hergestellt worden ist.
Der Antikörper kann insbesondere eine variable Antikörper-Schwerketten-(VH)-Domäne aufweisen, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus variable Antikörper-Schwerketten- (VH)-Domäne murinen Ursprungs und variable Antikörper-Schwerketten-(VH)-Domäne leporinen Ursprungs. Mit anderen Worten kann es erfindungsgemäß insbesondere vorgesehen sein, dass der Antikörper eine variable Antikörper-Schwerketten-(VH)-Domäne aufweist, welche von einer Maus, einer Ratte oder einem Kaninchen hergestellt worden ist.
Weiterhin kann der Antikörper insbesondere eine variable Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne aufweisen, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus variable Antikörper- Leichtkette-(VL)-Domäne murinen Ursprungs und variable Antikörper-Leichtkette-(VL)-Domäne leporinen Ursprungs. Mit anderen Worten kann es erfindungsgemäß insbesondere vorgesehen sein, dass der Antikörper eine variable Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne aufweist, welche von einer Maus, einer Ratte oder einem Kaninchen hergestellt worden ist.
Zur Verbesserung der Verträglichkeit des Antikörpers kann es in einer weiteren Ausführungs- form vorgesehen sein, dass der Antikörper konstante Antikörper-Schwerketten-(CH)-Domänen humanen Ursprungs und/oder eine konstante Antikörper-Leichtketten-(CL)-Domäne humanen Ursprungs aufweist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Antikörper um einen humanisierten Antikörper. Bei dieser Ausführungsform sind die konstanten Antikörper- Schwerketten-(CH)-Domäne sowie die konstante Antikörper-Leichtketten-(CL)-Domäne des Antikörpers jeweils humanen Ursprungs, wohingegen die variable Antikörper-Schwerketten-(VH)- Domäne und variable Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne des Antikörpers jeweils xenogenen, insbesondere murinen oder leporinen, Ursprungs sind.
Der Antikörper weist vorzugsweise eine variable Antikörper-Schwerketten-(VH)-Domäne auf, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus variable Antikörper-Schwerketten-(VH)- Domäne gemäß SEQ ID Nr. 3, variable Antikörper-Schwerketten-(VH)-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 7 und variable Antikörper-Schwerketten-(VH)-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 1 1 .
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist der Antikörper eine variable Antikörper- Leichtketten-(V|_)-Domäne auf, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus variable Antikörper-Leichtketten-(V|_)-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 5, variable Antikörper-Leichtketten- (VL)-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 9 und variable Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 13.
Besonders bevorzugt weist der Antikörper eine variable Antikörper-Schwerketten-(VH)-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 3 und eine variable Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne gemäß SEQ I D Nr. 5 auf. In einer alternativen Ausführungsform weist der Antikörper eine variable Antikörper- Schwerketten-(VH)-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 7 und eine variable Antikörper-Leichtketten- (VL)-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 9 auf.
Gemäß einer weiteren alternativen Ausführungsform weist der Antikörper eine variable Antikör- per-Schwerketten-(VH)-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 1 1 und eine variable Antikörper- Leichtketten-(VL)-Domäne gemäß SEQ I D Nr. 13 auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist der Antikörper eine variable Antikörper- Schwerketten-(VH)-Domäne auf, welche durch eine Nukleotidsequenz codiert ist, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 4, SEQ I D Nr. 8 und SEQ I D Nr. 12.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist der Antikörper eine variable Anti- körper-Leichtketten (VL)-Domäne auf, welche durch eine Nukleotidsequenz codiert ist, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ I D Nr. 6, SEQ I D Nr. 10 und SEQ I D Nr. 14.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist der Antikörper eine variable Antikörper- Schwerketten-(VH)-Domäne, welche durch eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ I D Nr. 4 codiert ist, und eine variable Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne, welche durch eine Nukleotidse- quenz gemäß SEQ I D Nr. 6 codiert ist, auf.
Gemäß einer alternativen Ausführungsform weist der Antikörper eine variable Antikörper- Schwerketten-(VH)-Domäne, welche durch eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ I D Nr. 8 codiert ist, und eine variable Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne, welche durch eine Nukleotidse- quenz gemäß SEQ I D Nr. 10 codiert ist, auf.
Gemäß einer weiteren alternativen Ausführungsform weist der Antikörper eine variable Antikör- per-Schwerketten-(VH)-Domäne, welche durch eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 12 codiert ist, und eine variable Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne, welche durch eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 14 codiert ist, auf.
Weiterhin handelt es sich bei dem Antikörper vorzugsweise um einen monoklonalen Antikörper.
Bei dem Antikörper kann es sich in einer weiteren Ausführungsform um einen Antikörper handeln, welcher von einer B-Zell-Hybridomlinie (B-Zellklon) produziert wird, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 6G5J, B3-17 und 18-20.
Gemäß weiteren Ausführungsformen kann es sich bei der erfindungsgemäß vorgesehenen Substanz um einen natürlichen Bindungspartner von CEACAM1 oder um eine modifizierte Form eines solchen Bindungspartners handeln. Beispielsweise kann die Substanz ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus lösliches UspA1 Protein von Moraxella catarrhalis, modifiziertes UspA1 Protein von Moraxella catarrhalis, lösliches Opa Protein von Neisseria gonorrhoeae, modifiziertes Opa Protein von Neisseria gonorrhoeae, lösliches variables P5 Protein von Haemophilus influenzae, modifiziertes variables P5 Protein von Haemophilus influenzae, modifiziertes Tim3, modifiziertes Glykoprotein des Hepatitisvirus, modifiziertes Salmonella- Oberflächenprotein und modifiziertes Escherichia coli-Oberflächenprotein. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Substanz um das lösliche Protein UspA1 von Moraxella catarrhalis gemäß SEQ I D Nr. 15.
In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der Substanz um das lösliche Protein UspA1 von Moraxella catarrhalis, welches durch eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 16 codiert wird. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der Substanz um das lösliche Protein Opa von Neisseria gonorrhoeae gemäß SEQ I D Nr. 17.
In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der Substanz um das lösliche variable Protein P5 von Haemophilus influenzae gemäß SEQ ID Nr. 18.
In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der Substanz um das lösliche, humane, rekombinante CEACAM1 -Fusionsprotein gemäß SEQ I D Nr. 19. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der Substanz um das lösliche, humane, rekombinante CEACAM1 -Fusionsprotein, welches durch eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ I D Nr. 20 codiert wird.
Die viralen Infektionen bzw. Infektionskrankheiten sind vorzugsweise ausgewählt aus der Grup- pe bestehend aus virale Hepatitis, Hepatitis B, Hepatitis C, HIV-Infektion, Aids, Influenza, Poliomyelitis, virusinduzierte Myokarditis, Epstein-Barr-Virus-Infektionen bzw. Infektionskrankheiten wie Pfeiffer-Drüsenfieber, Herpes simplex, Zytomegalie, Tollwut und Ebola.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Substanz zur Anwendung bei der The- rapie, d.h. Behandlung und/oder Vorbeugung, von B-Zell-abhängigen Krankheiten, vorzugsweise beim Menschen oder nichthumanen Tier.
Die Substanz zeichnet sich besonders dadurch aus, dass sie CEACAM1 , bevorzugt die Expression und/oder Funktion von CEACAM 1 , inhibiert.
Eine Inhibierung der Expression und/oder Funktion von CEACAM1 durch die erfindungsgemäß vorgesehene Substanz kann in unterschiedlicher Weise erfolgen.
Erfindungsgemäß kann es beispielsweise vorgesehen sein, dass die Substanz die Expression von CEACAM1 auf Nukleinsäureebene inhibiert.
Weiterhin kann es vorgesehen sein, dass die Substanz die Expression von CEACAM 1 durch Aktivierung eines endogenen CEACAM1 -Promotors inhibiert. Des Weiteren kann es vorgesehen sein, dass die Substanz die Expression von CEACAM 1 auf mRNA-Ebene inhibiert.
Ferner kann es erfindungsgemäß vorgesehen sein, dass die Substanz eine Inhibierung von CEACAM1 auf Proteinebene bewirkt.
In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der Substanz um ein Polynukleotid, wel- ches ein Polypeptid bzw. Protein codiert, wobei das Polypeptid bzw. Protein die Expression und/oder Funktion von CEACAM 1 inhibiert.
Bei den B-Zell-abhängigen Krankheiten handelt es sich vorzugsweise um Autoimmunkrankheiten und/oder entzündliche Krankheiten.
Bevorzugt sind die Autoimmunkrankheiten bzw. entzündlichen Krankheiten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Myasthenia gravis, systemischer Lupus erythematodes, Autoimmunthy- reoiditis, Dermatitis wie atopische Dermatitis und/oder Ekzem, Psoriasis, Sjögren Syndrom, Morbus Crohn, Konjunktivitis, Cholitis ulcerosa, Asthma bronchiale, allergisches Asthma, Lupus erythematodes wie kutaner Lupus erythematodes, Allergien, Morbus Wegener (granulomatose Polyangiitis), Stevens-Johnson-Syndrom, Sprue, Morbus Basedow, Sarkoidose, primär biliäre Zirrhose, Autoimmunhepatitis, Diabetes mellitus wie Diabetes mellitus Typ 1 und/oder Diabetes mellitus Typ 2, Arthritis wie rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis und/oder Psoriasisarthritis, Multiple Sklerose und B-Zell-Lymphom.
Bezüglich weiterer Merkmale und Vorteile der Substanz wird zur Vermeidung von unnötigen Wiederholungen vollständig auf die im Rahmen des ersten Erfindungsaspekts gemachten Aus- führungen Bezug genommen. Die dort beschriebenen Ausführungsformen und Vorteile gelten sinngemäß auch für die Substanz gemäß zweitem Erfindungsaspekt.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Arzneimittel, vorzugsweise zur Anwendung bei der Therapie, d.h. Behandlung und/oder Vorbeugung, von viralen Infektionen, viralen Infektionskrankheiten und/oder B-Zell-abhängigen Krankheiten, insbesondere beim Menschen oder nichthumanen Tier.
Das Arzneimittel zeichnet sich besonders dadurch aus, dass es wenigstens eine Substanz gemäß einem oben gennaten Erfindungsaspekt enthält.
Bevorzugt enthält das Arzneimittel zusätzlich einen pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff. Als geeignete Trägerstoffe kommen grundsätzlich anorganische und/oder organische Träger- Stoffe in Frage. Beispielsweise kann der Trägerstoff ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Wasser, pflanzliche Öle, Fettverbindungen, Benzylalkohole, Alkylenglykole, Polyethylengly- kole, Glycerintriacetat, Gelatine, Kohlenhydrate wie Laktose und/oder Stärke, Magnesiumstea- rat, Talg, Vaseline und Mischungen davon. Bezüglich geeigneter Trägerstoffe sei beispielhaft auf das Lehrbuch von Bauer et al. (Lehrbuch der Pharmazeutischen Technologie, 6. Auflage, 1999, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH Stuttgart) sowie auf das Lehrbuch von Rowe et al. (Handbook of Pharmaceutical Excipients, 5. Auflage, 2006, Pharmaceutical Press and American Pharmacists Association) verwiesen, deren Offenbarungsgehalt in Bezug auf die dort beschriebenen Trägerstoffe durch ausdrückliche Bezugnahme zum Inhalt der vorliegenden Beschreibung gemacht wird. Erfindungsgemäß kann es weiterhin vorgesehen sein, dass das Arzneimittel ferner wenigstens einen Hilfsstoff enthält, welcher beispielsweise ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gleitstoffe, Konservierungsstoffe, Stabilisierungsstoffe, Resorptionsbeschleuniger, Netzmittel, Emulgatoren, Salze zur Beeinflussung des osmotischen Druckes, Puffersubstanzen, Farbstoffe, Geschmackstoffe, Duftstoffe, weitere Wirkstoffe und Mischungen davon. Bei dem Arzneimittel kann es sich insbesondere um ein Impfmittel gegen virale Infektionskrankheiten handeln. Bezüglich weiterer Merkmale und Vorteile des Arzneimittels, insbesondere der wenigstens einen Substanz, der viralen Infektionen, viralen Infektionskrankheiten und/oder B-Zell-abhängigen Krankheiten, wird zur Vermeidung von unnötigen Wiederholungen vollständig auf die bisherige Beschreibung Bezug genommen. Die dort in Bezug auf die Substanz beschriebenen Ausfüh- rungsformen und Vorteile sowie die dort erwähnten viralen Infektionen, viralen Infektionskrankheiten und/oder B-Zell-abhängigen Krankheiten gelten sinngemäß auch für das Arzneimittel gemäß drittem Erfindungsaspekt.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Substanz zur Anwendung bei der Diagnose von viralen Infektionen, viralen Infektionskrankheiten und/oder B-Zell-abhängigen Krankheiten, vorzugsweise beim Menschen oder nichthumanen Tier
Die Substanz zeichnet sich besonders dadurch aus, dass sie zum Nachweis von CEACAM 1 , bevorzugt zum Nachweis der Expression und/oder Funktion von CEACAM1 , vorgesehen ist bzw. verwendet wird.
Ein Nachweis der Expression und/oder Funktion von CEACAM 1 durch die erfindungsgemäß vorgesehene Substanz kann in unterschiedlicher Weise erfolgen.
Erfindungsgemäß kann es beispielsweise vorgesehen sein, dass die Substanz zum Nachweis der Expression von CEACAM1 auf Nukleinsäureebene verwendet wird.
Weiterhin kann es vorgesehen sein, dass die Substanz zum Nachweis der Expression von CEACAM 1 auf mRNA-Ebene verwendet wird. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der Substanz um ein Polynukleotid, welches ein Polypeptid bzw. Protein codiert, wobei das Polypeptid bzw. Protein die Expression und/oder Funktion von CEACAM 1 inhibiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Substanz um eine gegen CEACAM1 gerichtete Substanz. Besonders bevorzugt ist die gegen CEACAM1 gerichtete Substanz ein Antikörper (anti- CEACAM1 -Antikörper). Ein derartiger Antikörper kann im Rahmen von dem Fachmann bekannten Nachweisverfahren, beispielsweise ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), eingesetzt werden. Im Falle des ELISA wird ein gegen das zu bestimmende Antigen (CEACAM1 ) gerichteter spezifischer Antikörper an ein Trägermaterial, beispielsweise Cellulose oder Polysty- rol, gebunden. Auf dem Trägermaterial bilden sich nach einer Inkubation mit einer Probe, welche CEACAM 1 als Antigen enthält, Immunkomplexe. In einem nachfolgenden Schritt wird diesen Immunkomplexen ein markierter Antikörper, welcher ebenfalls gegen das Antigen CEACAM1 gerichtet ist, aber zweckmäßigerweise an einer anderen Stelle bindet als der auf dem Trägermaterial gebundene Antikörper, hinzugegeben. Bei diesem markierten Antikörper handelt es sich gewöhnlich um ein Antikörper-Enzym-Konjugat, wobei es sich bei dem Enzym in der Regel um alkalische Phosphatase oder Meerrettichperoxidase handelt. Durch die Zugabe des markierten Antikörpers entstehen letztendlich ternäre Komplexe aus dem Antigen (CEACAM1 ) und den beiden jeweils gegen das Antigen (CEACAM 1 ) gerichteten Antikörpern. Diese ternären Komplexe lassen sich durch Zugabe von chromogenen Substraten, wie beispielsweise para-Nitrophenol, sichtbar machen. Hieraus kann die Konzentration von CEACAM1 in der Probe über eine photometrische Bestimmung der Immunkomplex-gebundenen Markerenzyme durch Vergleich mit Standards bekannter Antigenkonzentration ermittelt werden. Ebenso ist es möglich, gegen CEACAM 1 gerichtete Antikörper (anti-CEACAM1 -Antikörper) im Rahmen von ELISPOT-Verfahren einzusetzen. Die in diesem Absatz erwähnten Verfahren sind dem Fachmann hinreichend vertraut, so dass auf weitergehende Ausführungen verzichtet wird.
In einer weiteren Ausführungsform kann es sich bei der Substanz um ein Oligonukleotid handeln, welches beispielsweise mittels der sogenannten Polymerase-Kettenreaktion (PCR) dazu geeignet ist, selektiv bestimmte DNA-Abschnitte von CEACAM 1 zu amplifizieren und auf diese Weise einen vorzugsweise quantitativen Nachweis von CEACAM1 zu erbringen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann es sich bei der Substanz um ein Oligo- oder Polynukleotid handeln, welches mit CEACAM1 unter stringenten Bedingungen hybridisiert. Mit Hilfe von derartigen Oligo- bzw. Polynukleotiden können beispielsweise Southern Blots oder Northern Blots durchgeführt werden, um auf diese Weise den DNA- oder RNA-Gehalt an CEACAM1 nachzuweisen. Auf diese Weise lässt sich beispielsweise auch die Transkriptionsrate von CEACAM 1 untersuchen. Entsprechende Verfahren sind dem Fachmann ebenfalls hinreichend geläufig, so dass auf weiterführende Ausführungen an dieser Stelle ebenfalls verzichtet werden soll. Bezüglich weiterer Merkmale und Vorteile der Substanz sowie bezüglich möglicher viraler Infektionen, viraler Infektionskrankheiten und/oder B-Zell-abhängigen Krankheiten wird zur Vermeidung von unnötigen Wiederholungen ebenfalls vollständig auf die bisherige Beschreibung Bezug genommen. Die dort in Bezug auf die Substanz beschriebenen Ausführungsformen und Vorteile sowie die dort genannten viralen Infektionen, viralen Infektionskrankheiten und/oder B- Zell-abhängigen Krankheiten gelten sinngemäß auch für die Substanz gemäß viertem Erfindungsaspekt.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Diagnosemittel, vorzugsweise zur Anwendung bei der Diagnose von viralen Infektionen, viralen Infektionskrankheiten und/oder B- Zell-abhängigen Krankheiten, insbesondere beim Menschen oder nichthumanen Tier. Das Diagnosemittel zeichnet sich besonders dadurch aus, dass es wenigstens eine Substanz gemäß einem oben genannten Erfindungsaspekt enthält. Bezüglich weiterer Merkmale und Vorteile des Diagnosemittels, insbesondere der wenigstens einen Substanz, der viralen Infektionen, viralen Infektionskrankheiten und/oder B-Zellabhängigen Krankheiten, wird ebenfalls vollständig auf die bisherige Beschreibung Bezug genommen. Die dort in Bezug auf die Substanz beschriebenen Ausführungsformen und Vorteile sowie die dort genannten viralen Infektionen, viralen Infektionskrankheiten und/oder B-Zellabhängigen Krankheiten gelten sinngemäß auch für das Diagnosemittel gemäß fünftem Erfindungsaspekt.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung einen gegen CEACAM 1 gerichteten Antikörper (anti-CEACAM1 -Antikörper). Der Antikörper zeichnet sich besonders dadurch aus, dass er eine variable Antikörper- Schwerketten-(VH)-Domäne, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus variable Antikörper- Schwerketten-(VH)-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 3, variable Antikörper-Schwerketten-(VH)- Domäne gemäß SEQ I D Nr. 7 und variable Antikörper-Schwerketten-(VH)-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 1 1 , und/oder eine variable Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus variable Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 5, variable Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 9 und variable Antikörper- Leichtketten-(V|_)-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 13, aufweist.
Der Antikörper weist in einer bevorzugten Ausführungsform eine variable Antikörper- Schwerketten-(VH)-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 3 und eine variable Antikörper-Leichtketten- (VL)-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 5 auf.
In einer alternativen Ausführungsform weist der Antikörper eine variable Antikörper- Schwerketten-(VH)-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 7 und eine variable Antikörper-Leichtketten- (VL)-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 9 auf.
In einer weiteren alternativen Ausführungsform weist der Antikörper eine variable Antikörper- Schwerketten-(VH)-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 1 1 und eine variable Antikörper-Leichtketten- (VL)-Domäne gemäß SEQ I D Nr. 13 auf.
Bei dem Antikörper handelt es sich in einer bevorzugten Ausführungsform um einen murinen Antikörper oder leporinen Antikörper. Mit anderen Worten ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn es sich bei dem Antikörper um einen Maus-Antikörper, Ratten-Antikörper oder Kaninchen- Antikörper handelt, d. h. um einen Antikörper, welcher von einer Maus, einer Ratte oder einem Kaninchen hergestellt worden ist.
Insbesondere kann die variable Antikörper-Schwerketten-(VH)-Domäne ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus variable Antikörper-Schwerketten-(VH)-Domäne murinen Ursprungs und variable Antikörper-Schwerketten-(VH)-Domäne leporinen Ursprungs. Mit anderen Worten kann es erfindungsgemäß insbesondere vorgesehen sein, dass die variable Antikörper- Schwerketten-(VH)-Domäne von einer Maus, einer Ratte oder einem Kaninchen hergestellt worden ist.
Weiterhin kann insbesondere die variable Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus variable Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne murinen Ur- Sprungs und variable Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne leporinen Ursprungs. Mit anderen Worten kann es erfindungsgemäß insbesondere vorgesehen sein, dass die variable Antikörper- Leichtketten-(V|_)-Domäne von einer Maus, einer Ratte oder einem Kaninchen hergestellt worden ist.
Zur Verbesserung der Verträglichkeit des Antikörpers kann es in einer weiteren Ausführungs- form vorgesehen sein, dass der Antikörper eine konstante Antikörper-Schwerketten-(CH)- Domäne humanen Ursprungs und/oder eine konstante Antikörper-Leichtketten-(CL)-Domäne humanen Ursprungs aufweist.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem Antikörper um einen humanisierten Antikörper. Bei dieser Ausführungsform sind die konstante Antikörper-Schwerketten- (CH)-Domäne sowie die konstante Antikörper-Leichtketten-(CL)-Domäne des Antikörpers jeweils humanen Ursprungs, wohingegen die variable Antikörper-Schwerketten-(VH)-Domäne und variable Antikörper-Leichtketten-(V|_)-Domäne des Antikörpers jeweils xenogenen, insbesondere murinen oder leporinen, Ursprungs sind.
Weiterhin handelt es sich bei dem Antikörper vorzugsweise um einen monoklonalen Antikörper. Bei dem Antikörper kann es sich insbesondere um einen Antikörper handeln, welcher von einer B-Zell-Hybridomlinie (B-Zellklon) produziert wird, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 6G5J, B3-17 und 18-20.
Bei dem Antikörper handelt es sich weiterhin vorzugsweise um einen Antikörper zur Anwendung in der Medizin. Grundsätzlich kann es sich bei dem Antikörper um einen diagnostischen und/oder therapeutischen Antikörper handeln. Entsprechend kann der Antikörper zur Anwendung bei der Diagnose und/oder Therapie, d.h. Behandlung und/oder Vorbeugung, von Krankheiten vorgesehen sein.
Grundsätzlich kann es sich bei dem Antikörper um einen Antikörper zur Anwendung bei der Diagnose von viralen Infektionen, viralen Infektionskrankheiten , B-Zell-abhängigen Krankheiten und/oder Tumoren handeln.
Vorzugsweise handelt es sich bei dem Antikörper um einen Antikörper zur Anwendung bei der Therapie, d.h. Behandlung und/oder Vorbeugung, von Krankheiten. Besonders bevorzugt ist der Antikörper zur Anwendung bei der Therapie, d.h. Behandlung und/oder Vorbeugung, von viralen Infektionen, viralen Infektionskrankheiten, B-Zell-abhängigen Krankheiten und/oder Tumoren vorgesehen. Mit anderen Worten handelt es sich bei dem Antikörper gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform um einen Antikörper zur Anwen- dung bei der Therapie, d.h. Behandlung und/oder Vorbeugung, von viralen Infektionen, viralen Infektionskrankheiten, B-Zell-abhängigen Krankheiten und/oder Tumoren.
Bei den Tumoren kann es sich grundsätzlich um benigne Tumore oder maligne Tumore handeln.
Vorzugsweise handelt es sich bei den Tumoren um maligne Tumore. Die maligne Tumore kön- nen dabei insbesondere ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Karzinome, Melanome, Piastome, Lymphome und Sarkome.
Die Karzinome können ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Analkarzinom, Bronchialkarzinom, Lungenkarzinom, Endometriumkarzinom, Gallenblasenkarzinom, hepatozelluläres Karzinom, Hodenkarzinom, kolorektales Karzinom, Larynxkarzinom, Speisenröhrenkrebs, Ma- genkarzinom, Mammakarzinom, Nierenkarzinom, Ovarialkarzinom, Pankreastumor, Pharynx- karzinom, Prostatakarzinom, Schilddrüsenkarzinom und Cervixkarzinom.
Die Sarkome können ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Angiosarkom, Chondrosarkom, Ewing-Sarkom, Fibrosarkom, Karposi-Sarkom, Lipo-Sarkom, Leiomyosarkom, malignes fibröses Histiozytom, neurogenes Sarkom, Osteosarkom und Rhabdomyosarkom. Bezüglich weiterer Merkmale und Vorteile des Antikörpers, insbesondere möglicher viraler Infektionen, viraler Infektionskrankheiten und/oder B-Zell-abhängigen Krankheiten, zu deren Diagnose und/oder Therapie der Antikörper verwendet bzw. eingesetzt werden kann, wird zur Vermeidung von unnötigen Wiederholungen ebenfalls vollständig auf die bisherige Beschreibung Bezug genommen. Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung einen weiteren, gegen CEACAM1 gerichteten Antikörper (anti-CEACAM1 -Antikörper).
Der Antikörper zeichnet sich besonders dadurch aus, dass er eine variable Antikörper- Schwerketten-(VH)-Domäne, welche durch eine Nukleotidsequenz codiert ist, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 8 und SEQ ID Nr. 12, und/oder eine variable Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne, welche durch eine Nukleotidsequenz codiert ist, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ I D Nr. 6, SEQ I D Nr. 10 und SEQ I D Nr. 14, aufweist. Besonders bevorzugt weist der Antikörper eine variable Antikörper-Schwerketten-(VH)-Domäne, welche durch eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ I D Nr. 4 codiert ist, und eine variable Antikör- per-Leichtketten-(V|_)-Domäne, welche durch eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 6 codiert ist, auf. In einer alternativen Ausführungsform weist der Antikörper eine variable Antikörper- Schwerketten-(VH)-Domäne, welche durch eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ I D Nr. 8 codiert ist, und eine variable Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne, welche durch eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ I D Nr. 10 codiert ist, auf.
In einer weiteren alternativen Ausführungsform weist der Antikörper eine variable Antikörper- Schwerketten-(VH)-Domäne, welche durch eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ I D Nr. 12 codiert ist, und eine variable Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne, welche durch eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 14 codiert ist, auf.
Bei dem Antikörper handelt es sich in einer bevorzugten Ausführungsform um einen murinen Antikörper oder leporinen Antikörper. Mit anderen Worten ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn es sich bei dem Antikörper um einen Maus-Antikörper, Ratten-Antikörper oder Kaninchen- Antikörper handelt, d. h. um einen Antikörper, welcher von einer Maus, einer Ratte oder einem Kaninchen hergestellt worden ist.
Insbesondere kann die variable Antikörper-Schwerketten-(VH)-Domäne ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus variable Antikörper-Schwerketten-(VH)-Domäne murinen Ursprungs und variable Antikörper-Schwerketten-(VH)-Domäne leporinen Ursprungs. Mit anderen Worten kann es erfindungsgemäß insbesondere vorgesehen sein, dass die variable Antikörper- Schwerketten-(VH)-Domäne von einer Maus, einer Ratte oder einem Kaninchen hergestellt worden ist.
Weiterhin kann insbesondere die variable Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus variable Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne murinen Ursprungs und variable Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne leporinen Ursprungs. Mit anderen Worten kann es erfindungsgemäß insbesondere vorgesehen sein, dass die variable Antikörper- Leichtketten-(V|_)-Domäne von einer Maus, einer Ratte oder einem Kaninchen hergestellt worden ist. Zur Verbesserung der Verträglichkeit des Antikörpers kann es in einer weiteren Ausführungsform vorgesehen sein, dass der Antikörper eine konstante Antikörper-Schwerketten-(CH)- Domäne humanen Ursprungs und/oder eine konstante Antikörper-Leichtketten-(CL)-Domäne humanen Ursprungs aufweist.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem Antikörper um einen humani- sierten Antikörper. Bei dieser Ausführungsform sind die konstante Antikörper-Schwerketten- (CH)-Domäne sowie die konstante Antikörper-Leichtketten-(CL)-Domäne des Antikörpers jeweils humanen Ursprungs, wohingegen die variable Antikörper-Schwerketten-(VH)-Domäne und variable Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne des Antikörpers jeweils xenogenen, insbesondere murinen oder leporinen, Ursprungs sind. Weiterhin handelt es sich bei dem Antikörper vorzugsweise um einen monoklonalen Antikörper.
Bei dem Antikörper kann es sich insbesondere um einen Antikörper handeln, welcher von einer B-Zell-Hybridomlinie (B-Zellklon) produziert wird, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 6G5J, B3-17 und 18-20.
Bei dem Antikörper handelt es sich weiterhin vorzugsweise um einen Antikörper zur Anwen- dung in der Medizin.
Grundsätzlich kann es sich bei dem Antikörper um einen diagnostischen und/oder therapeutischen Antikörper handeln. Entsprechend kann der Antikörper zur Anwendung bei der Diagnose und/oder Therapie, d.h. Behandlung und/oder Vorbeugung, von Krankheiten vorgesehen sein.
Grundsätzlich kann es sich bei dem Antikörper um einen Antikörper zur Anwendung bei der Diagnose von viralen Infektionen, viralen Infektionskrankheiten, B-Zell-abhängigen Krankheiten und/oder Tumoren handeln.
Vorzugsweise handelt es sich bei dem Antikörper um einen Antikörper zur Anwendung bei der Therapie, d.h. Behandlung und/oder Vorbeugung, von Krankheiten.
Besonders bevorzugt ist der Antikörper zur Anwendung bei der Therapie, d.h. Behandlung und/oder Vorbeugung, von viralen Infektionen, viralen Infektionskrankheiten, B-Zell-abhängigen Krankheiten und/oder Tumoren vorgesehen. Mit anderen Worten handelt es sich bei dem Antikörper gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform um einen Antikörper zur Anwendung bei der Therapie, d.h. Behandlung und/oder Vorbeugung, von viralen Infektionen, viralen Infektionskrankheiten, B-Zell-abhängigen Krankheiten und/oder Tumoren. Bezüglich weiterer Merkmale und Vorteile des Antikörpers, insbesondere möglicher viraler Infektionen, viraler Infektionskrankheiten, B-Zell-abhängigen Krankheiten und/oder Tumoren, zu deren Diagnose und/oder Therapie der Antikörper eingesetzt bzw. verwendet werden kann, wird zur Vermeidung von unnötigen Wiederholungen ebenfalls vollständig auf die bisherige Beschreibung Bezug genommen.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine variable Antikörper-Schwerketten- (VH)-Domäne eines gegen CEACAM 1 gerichteten Antikörpers (anti-CEACAM1 -Antikörpers). Die variable Antikörper-Schwerketten-(VH)-Domäne ist ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antikörper-Schwerketten-(VH)-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 3, variable Antikörper- Schwerketten-(VH)-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 7 und variable Antikörper-Schwerketten-(VH)- Domäne gemäß SEQ ID Nr. 1 1 . Die variable Antikörper-Schwerketten-(VH)-Domäne ist in einer bevorzugten Ausführungsform murinen oder leporinen Ursprungs. Mit anderen Worten ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn die variable Antikörper-Schwerketten-(VH)-Domäne von einer Maus, einer Ratte oder einem Kaninchen hergestellt worden ist.
Der Antikörper ist vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper. Bezüglich weiterer Merkmale und Vorteile der variablen Antikörper-Schwerketten-(VH)-Domäne sowie des Antikörpers wird zur Vermeidung von unnötigen Wiederholungen ebenso vollständig auf die bisherige Beschreibung Bezug genommen. Die dort in Bezug auf die variable Antikör- per-Schwerketten-(VH)-Domäne sowie den Antikörper beschriebenen Ausführungsformen sowie Vorteile gelten sinngemäß auch für die variable Antikörper-Schwerketten-(VH)-Domäne gemäß achtem Erfindungsaspekt.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine variable Antikörper-Leichtketten-(VL)- Domäne eines gegen CEACAM1 gerichteten Antikörpers (anti-CEACAM1 -Antikörpers).
Die variable Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne ist ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus variable Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 5, variable Antikörper- Leichtketten-(V|_)-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 9 und variable Antikörper-Leichtketten-(VL)- Domäne gemäß SEQ ID Nr. 13.
Die variable Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne ist in einer bevorzugten Ausführungsform murinen oder leporinen Ursprungs. Mit anderen Worten ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn die variable Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne von einer Maus, einer Ratte oder einem Kaninchen hergestellt worden ist.
Der Antikörper ist vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper.
Bezüglich weiterer Merkmale und Vorteile der variablen Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne sowie des Antikörpers wird zur Vermeidung von unnötigen Wiederholungen ebenso vollständig auf die bisherige Beschreibung Bezug genommen. Die dort in Bezug auf die variable Antikör- per-Leichtketten-(V|_)-Domäne sowie den Antikörper beschriebenen Ausführungsformen und Vorteile gelten sinngemäß auch für die variable Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne gemäß neuntem Erfindungsaspekt. Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine isolierte Nukleinsäure, welche für eine variable Antikörper-Schwerketten-(VH)-Domäne eines gegen CEACAM 1 gerichteten Antikörpers (anti-CEACAM1 -Antikörpers) codiert.
Bei der Nukleinsäure sowie dem Antikörper handelt es sich vorzugsweise um eine humane Nukleinsäure bzw. humanen Antikörper. Der Antikörper ist vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper.
Die Nukleinsäure weist eine Nukleotidsequenz auf oder besteht aus einer Nukleotidsequenz, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 4 und SEQ I D Nr. 8 und SEQ I D Nr. 12. Bezüglich weiterer Merkmale und Vorteile der Nukleinsäure wird zur Vermeidung von unnötigen Wiederholungen ebenfalls vollständig auf die bisherige Beschreibung Bezug genommen. Die dort insbesondere in Bezug auf die variable Antikörper-Schwerketten-(VH)-Domäne sowie den Antikörper beschriebenen Ausführungsformen und Vorteile gelten sinngemäß auch für die Nukleinsäure gemäß zehntem Erfindungsaspekt. Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine isolierte Nukleinsäure, welche für eine variable Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne eines gegen CEACAM 1 gerichteten Antikörpers (anti-CEACAM1 -Antikörpers) codiert.
Bei der Nukleinsäure sowie dem Antikörper handelt es sich vorzugsweise um eine humane Nukleinsäure bzw. humanen Antikörper. Der Antikörper ist vorzugsweise ein monoklonaler Anti- körper.
Die Nukleinsäure weist eine Nukleotidsequenz auf oder besteht aus einer Nukleotidsequenz, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ I D Nr. 6, SEQ ID Nr. 10 und SEQ I D Nr. 14.
Bezüglich weiterer Merkmale und Vorteile der Nukleinsäure wird zur Vermeidung von unnötigen Wiederholungen ebenfalls vollständig auf die bisherige Beschreibung Bezug genommen. Die dort insbesondere in Bezug auf die variable Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne sowie den Antikörper beschriebenen Ausführungsformen und Vorteile gelten sinngemäß auch für die Nukleinsäure gemäß elftem Erfindungsaspekt.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Hybridomzelle, welche einen Antikör- per gemäß einem oben genanten Erfindungsaspekt produziert.
Die Hybridomzelle ist vorzugsweise durch Fusion von B-Lymphozyten, welche aus einem gegen CEACAM1 immunisierten Versuchstier stammen und gegen CEACAM 1 gerichtete Antikör- per (anti-CEACAM1 -Antikörper) produzieren, und Myelomzellen gebildet. Das Versuchstier kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Maus, Ratte, Kaninchen und Ziege. Unter Myelomzellen werden allgemein Zellen (Plasmazellen) einer aus einem Myelom (Plasmazytom) eines Tieres gewonnenen Zelllinie verstanden. Die Myelomzellen können im Rahmen der vor- liegenden Erfindung aus dem Myelom einer Maus, einer Ratte, eines Kaninchens oder einer Ziege gewonnen sein.
Bevorzugt handelt es sich bei den Myelomzellen um Zellen der Maus-Myelom-Zelllinie NS1/0.
Die Hybridomzelle gehört vorzugsweise zu einer B-Zell-Hybridomlinie (B-Zellklon), welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 6G5J, B3-17 und 18-20. Bezüglich weiterer Merkmale und Vorteile der Hybridomzelle wird zur Vermeidung von unnötigen Wiederholungen ebenfalls vollständig auf die bisherige Beschreibung Bezug genommen. Die dort insbesondere in Bezug auf den Antikörper beschriebenen Ausführungsformen und Vorteile geltend sinngemäß auch für die Hybridomzelle gemäß zwölftem Erfindungsaspekt.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines gegen CEACAM1 gerichteten Antikörpers (anti-CEACAM1 -Antikörpers), insbesondere eines Antikörpers gemäß sechstem oder siebtem Erfindungsaspekt.
Das Verfahren weist die folgenden Schritte auf: a) Fusionieren von B-Zellen, welche aus einem gegen ein Antigen immunisierten Versuchstier stammen, und Myelomzellen unter Ausbildung von Hybridomzellen, b) Selektieren der Hybridomzellen, c) Isolieren von Hybridomzellen, welche gegen das Antigen gerichtete Antikörper produzieren.
Gegenüber gattungsgemäßen Verfahren zeichnet sich das erfindungsgemäße Verfahren besonders dadurch aus, dass das Antigen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus CEACAM1 gemäß SEQ ID Nr. 1 , CEACAM 1 gemäß SEQ I D Nr. 2 (daher das Expressionsprodukt aus SEQ I D Nr. 1 oder 2) bzw. um CEACAM1 gemäß SEQ I D Nr. 43, ein Fragment, insbesondere Epitop, der SEQ ID Nr. 1 und ein Fragment, insbesondere Epitop, der SEQ ID Nr. 2 (daher des Expressionsprodukts aus SEQ I D Nr. 1 oder 2) bzw. der SEQ I D Nr. 43.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Antigen um CEACAM 1 gemäß SEQ ID Nr. 1 (daher das Expressionsprodukts aus SEQ ID Nr. 1 ) bzw. um CEACAM1 gemäß SEQ I D Nr. 43oder ein Fragment, insbesondere Epitop, davon. In einer alternativen Ausführungsform handelt es sich bei dem Antigen um CEACAM 1 gemäß SEQ I D Nr. 2 (daher das Expressionsprodukts aus SEQ I D Nr. 2) oder ein Fragment, insbesondere Epitop, davon.
Bei dem Versuchstier handelt es sich in einer bevorzugten Ausführungsform um eine Maus, eine Ratte, ein Kaninchen oder eine Ziege. Die Verwendung einer Maus als Versuchstier ist erfindungsgemäß jedoch besonders bevorzugt.
Die B-Zellen können mit Zellen einer aus einem Myelom einer Maus, einer Ratte, eines Kaninchens oder einer Ziege gewonnenen Zelllinie fusioniert werden.
Vorzugsweise werden die B-Zellen mit Zellen der Maus-Myelom-Zelllinie NS1/0 fusioniert. Der Schritt a), d. h. die Zellfusion, kann mit Hilfe von Polyethylenglykol (PEG) durchgeführt werden. Hierzu werden die B-Zellen und Myelom-Zellen zusammen in eine wässrige, polyethyl- englykolhaltige Fusionslösung gegeben und zentrifugiert. Da das Wasser weitgehend durch PEG gebunden wird, werden die Zellmembranen in engen Kontakt zueinander gebracht, wodurch eine spontane Fusion der Zellmembranen erreicht wird. Alternativ kann der Schritt a) unter Einwirkung von elektrischer Spannung, d. h. als sogenannte Elektrofusion, vorgenommen werden. Bei der Elektrofusion werden mittels elektrischer Pulse die Zellmembranen lokal„aufgeschmolzen", wodurch eine Verschmelzung der Zellmembranen erreicht wird. Um die Fusion zu unterstützen, kann die Zugabe von geringen Mengen an PEG vorgesehen sein. Die B-Zellen und die Myelom-Zellen werden in einer weiteren Ausführungsform in einem Verhältnis von 5:1 fusioniert (B-Zellen zu Myelom-Zellen).
Der Schritt b) wird in einer bevorzugten Ausführungsform unter Verwendung eines selektiven Mediums, in welchem nur Hybridomzellen überlebensfähig sind, durchgeführt. Als selektives Medium wird vorzugsweise das sogenannte HAT-Medium verwendet. Das HAT-Medium enthält die chemischen Substanzen Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin. Hypoxanthin stellt eine Vorstufe für essentielle Moleküle (Purine) dar, die für den Aufbau der Desoxyribonukleinsäure (DNA) benötigt werden. Zu dessen Umwandlung ist allerdings das Enzym HGPRT (Hypo- xanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferanse) notwendig. Da bei der Fusion eine Myelom- Zelllinie verwendet wird, der eben dieses Enzym fehlt oder bei der es in inaktiver Form vorliegt, sind einzelne Myelom-Zellen in diesem Medium somit nicht überlebensfähig. Milzzellen besitzen hingegen HGPRT, sind für sich aber nicht überlebensfähig und sterben im Kulturmedium rasch ab. Einzig Hybridomzellen können kultiviert werden, da sie die Immortalität der Myelom-Zellen sowie die HGPRT-Gene der Milzzellen besitzen. Aminopterin dient allein der Blockierung anderer Purin-Synthesewege. Da dadurch auch das essentielle Thymidin nicht mehr de novo herge- stellt werden kann, muss es dem Medium beigegeben werden. Der Schritt c) wird vorzugsweise mittels ELISA (Enzyme-Iinked immunosorbant assay)-Test oder Durchflusszytometrie durchgeführt.
In einer weiteren Ausführungsform werden die isolierten Hybridomzellen expandiert. Auf diese Weise wird sichergestellt, dass eine ausreichend große Anzahl an Hybridomzellen zur Verfü- gung steht, welche den gegen CEACAM 1 gerichteten Antikörper (anti-CEACAM1 -Antikörper) produzieren.
Bezüglich weiterer Merkmale und Vorteile des Verfahrens, insbesondere der Hybridomzellen, des Antigens sowie des Antikörpers, wird vollständig auf die bisherige sowie auf die im Beispielteil gemachten Ausführungen Bezug genommen. Die dort insbesondere in Bezug auf die Hyb- ridomzelle, das Antigen sowie den Antikörper beschriebenen Ausführungsformen und Vorteile gelten sinngemäß auch für das Verfahren gemäß dreizehntem Erfindungsaspekt.
Die weiteren in der vorliegenden Anmeldung gezeigten Sequenzen stellen sich wie folgt dar:
SEQ ID Nr. 1 : Humanes CEACAM1 (Hu-CEACAM1 + Hu-lgG-Fc2) (Homo sapiens):
CAGCTGACCACCGAGAGCATGCCCTTCAACGTGGCCGAGGGCAAGGAGGTGCTGCTGCT GGTGCACAACCTGCCCCAGCAGCTGTTCGGCTACAGCTGGTACAAGGGCGAGAGGGTGG ACGGCAACAGGCAGATCGTGGGCTACGCCATCGGCACCCAGCAGGCCACCCCCGGCCCC GCCAACAGCGGCAGGGAGACCATCTACCCCAACGCCAGCCTGCTGATCCAGAACGTGAC CCAGAACGACACCGGCTTCTACACCCTGCAGGTGATCAAGAGCGACCTGGTGAACGAGGA GGCCACCGGCCAGTTCCACGTGTACCCCGAGCTGCCCAAGCCCAGCATCAGCAGCAACA ACAGCAACCCCGTGGAGGACAAGGACGCCGTGGCCTTCACCTGCGAGCCCGAGACCCAG GACACCACCTACCTGTGGTGGATCAACAACCAGAGCCTGCCCGTGAGCCCCAGGCTGCA GCTGAGCAACGGCAACAGGACCCTGACCCTGCTGAGCGTGACCAGGAACGACACCGGCC CCTACGAGTGCGAGATCCAGAACCCCGTGAGCGCCAACAGGAGCGACCCCGTGACCCTG AACGTGACCTACGGCCCCGACACCCCCACCATCAGCCCCAGCGACACCTACTACAGGCCC GGCGCCAACCTGAGCCTGAGCTGCTACGCCGCCAGCAACCCCCCCGCCCAGTACAGCTG GCTGATCAACGGCACCTTCCAGCAGAGCACCCAGGAGCTGTTCATCCCCAACATCACCGT G AAC AAC AG C G G C AG CT AC AC CTG C C AC G C C AAC AAC AG C GTG AC C G G CTG C AAC AG G A CCACCGTGAAGACCATCATCGTGACCGAGCTGAGCCCCGTGGTGGCCAAGCCCCAGATC AAGGCCAGCAAGACCACCGTGACCGGCGACAAGGACAGCGTGAACCTGACCTGCAGCAC CAACGACACCGGCATCAGCATCAGGTGGTTCTTCAAGAACCAGAGCCTGCCCAGCAGCGA GAGGATGAAGCTGAGCCAGGGCAACACCACCCTGAGCATCAACCCCGTGAAGAGGGAGG ACGCCGGCACCTACTGGTGCGAGGTGTTCAACCCCATCAGCAAGAACCAGAGCGACCCCA TCATGCTGAACGTGGAGTGCCCACCTTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCTTCAGTCT TCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACAT GCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGAC GGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTA CCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAA GTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCATCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAA GGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAA GAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGA GTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACT CCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGG GGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGA GCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ I D Nr. 2: Humanes CEACAM1 (I L2 Secretory Seq. + Hu-CEACAM 1 + Hu-lgG-Fc2) (Homo sapiens):
CCTGAGATCACCGGCGAAGGAGGGCCACCATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTG CACTAAGTCTTGCACTTGTCACGAATTCGCAGCTGACCACCGAGAGCATGCCCTTCAACGT GGCCGAGGGCAAGGAGGTGCTGCTGCTGGTGCACAACCTGCCCCAGCAGCTGTTCGGCT ACAGCTGGTACAAGGGCGAGAGGGTGGACGGCAACAGGCAGATCGTGGGCTACGCCATC GGCACCCAGCAGGCCACCCCCGGCCCCGCCAACAGCGGCAGGGAGACCATCTACCCCAA CGCCAGCCTGCTGATCCAGAACGTGACCCAGAACGACACCGGCTTCTACACCCTGCAGGT GATCAAGAGCGACCTGGTGAACGAGGAGGCCACCGGCCAGTTCCACGTGTACCCCGAGC TGCCCAAGCCCAGCATCAGCAGCAACAACAGCAACCCCGTGGAGGACAAGGACGCCGTG GCCTTCACCTGCGAGCCCGAGACCCAGGACACCACCTACCTGTGGTGGATCAACAACCAG AGCCTGCCCGTGAGCCCCAGGCTGCAGCTGAGCAACGGCAACAGGACCCTGACCCTGCT GAGCGTGACCAGGAACGACACCGGCCCCTACGAGTGCGAGATCCAGAACCCCGTGAGCG CCAACAGGAGCGACCCCGTGACCCTGAACGTGACCTACGGCCCCGACACCCCCACCATC AGCCCCAGCGACACCTACTACAGGCCCGGCGCCAACCTGAGCCTGAGCTGCTACGCCGC CAGCAACCCCCCCGCCCAGTACAGCTGGCTGATCAACGGCACCTTCCAGCAGAGCACCCA GGAGCTGTTCATCCCCAACATCACCGTGAACAACAGCGGCAGCTACACCTGCCACGCCAA CAACAGCGTGACCGGCTGCAACAGGACCACCGTGAAGACCATCATCGTGACCGAGCTGA GCCCCGTGGTGGCCAAGCCCCAGATCAAGGCCAGCAAGACCACCGTGACCGGCGACAAG GACAGCGTGAACCTGACCTGCAGCACCAACGACACCGGCATCAGCATCAGGTGGTTCTTC AAGAACCAGAGCCTGCCCAGCAGCGAGAGGATGAAGCTGAGCCAGGGCAACACCACCCT GAGCATCAACCCCGTGAAGAGGGAGGACGCCGGCACCTACTGGTGCGAGGTGTTCAACC CCATCAGCAAGAACCAGAGCGACCCCATCATGCTGAACGTGGAGTGCCCACCTTGCCCAG CACCACCTGTGGCAGGACCTTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCAT GATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTG AGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGC GGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAG GACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCATCCTCC ATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTG CCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGG CTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTA CAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCAC CGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGG CTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA SEQ ID Nr. 3: Anti-human CEACAM1 -Antikörper (Clone 6G5J) - schwere Kette (V-D-J- REGION) (Mus musculus):
KPGETVKISCKTSGYIFRNYGMKWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFAFSLET SASTAYLQINNLKNEDMATYFCARRGMITTSNYALDNWGQGTSVTVSS
SEQ ID Nr. 4: Anti-human CEACAM1 -Antikörper (Clone 6G5J) - schwere Kette
(V-D-J-REGION) (Mus musculus):
aagcctggag agacagtcaa gatctcctgc aagacttctg ggtatatatt cagaaactat ggaatgaaat gggtgaagca ggctccagga aagggtttaa agtggatggg ctggataaac acctatactg gagagccaac atatgctgat gacttcaagg gacggtttgc cttctctttg gaaacctctg ccagcactgc ctatttgcag atcaacaacc tcaaaaatga ggacatggct acatatttct gtgcaagaag ggggatgatt acgacgagta attatgctct ggacaactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca g
SEQ ID Nr. 5: Anti-human CEACAM1 Antikörper (Clone 6G5J) - leichte Kette (V-J-REGION) (Mus musculus):
SSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTIKLLIYYTSKLHSGVPSRFSGSGSGTDYS LTISNLDQEDIATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK
SEQ ID Nr. 6: Anti-human CEACAM1 -Antikörper (Clone 6G5J) - leichte Kette (V-J-REGION) (Mus musculus):
tcctccctgt ctgcctctct gggagacaga gtcaccatca gttgcagggc aagtcaggac attagcaatt atttaaactg gtatcagcag aaaccagatg gaactattaa actcctgatc tactacacat caaagttaca ctcaggagtc ccatcaagat tcagtggcag tgggtctgga acagattatt ctctcaccat tagcaacctg gaccaggaag atattgccac ttacttttgc caacagggta atactcttcc gtggacgttc ggtggaggca ccaagctgga aatcaaac
SEQ ID Nr. 7: Anti-human CEACAM1 -Antikörper (Clone 18-20) - schwere Kette (V-D-J Region) (Mus musculus):
KPGETVKISCKASGYTFTVYGMNWVKQAPGKDLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFAFSLET SASTAYLQI N N LKN EDMATYFCARKAFYRYDGGMDYWGQGTSVTVSS
SEQ ID Nr. 8: Anti-human CEACAM1 -Antikörper (Clone 18-20) - schwere Kette (V-D-J Region) (Mus musculus):
aagcctggag agacagtcaa gatctcctgc aaggcttctg ggtatacctt cacagtctat ggaatgaact gggtgaagca ggctccagga aaggatttaa agtggatggg ctggataaac acctacactg gagagccaac atatgctgat gacttcaagg gacggtttgc cttctctttg gaaacctctg ccagcactgc ctatttgcag atcaacaacc tcaaaaatga ggacatggct acatatttct gtgcaagaaa ggccttctat aggtacgacg ggggtatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctcag
SEQ ID Nr. 9: Anti-human CEACAM1 -Antikörper (Clone 18-20) - leichte Kette (V-J-Region) (Mus musculus):
SSLSASLGGKVTITCKASQDINKFLAWYQHKPGKGPRLLIHYTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYS FSISNLEPEDIATYYCLQYDNLYTFGGGTKLEIK SEQ ID Nr. 10: Anti-human CEACAM1 -Antikörper (Clone 18-20) - leichte Kette (V-J-Region) (Mus musculus):
tcctcactgt ctgcatctct gggaggcaaa gtcaccatca cttgcaaggc aagccaagac attaacaagt ttttagcttg gtaccaacac aagcctggaa aaggtcctag gctgctcata cattacacat ctacattaca gccaggcatc ccatcaaggt tcagtggaag tgggtctggg agagattatt ccttcagcat cagcaacctg gagcctgaag atattgcaac ttattattgt ctacaatatg ataatctgta cacgttcggt ggggggacca agctggaaat aaaac
SEQ ID Nr. 1 1 : Anti-human CEACAM1 -Antikörper (Clone B3-17) - schwere Kette (V-D-J- REGION) (Mus musculus):
GPELVKPGTSVKMSCKASGYTFTTYVMHWVQQKPGQGLDWIGFFNPYNDGTKYNEKFKGKA TLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARWAYDGSYAYWGQGTTLTVSS
SEQ ID Nr. 12: Anti-human CEACAM1 -Antikörper (Clone B3-17) - schwere Kette (V-D-J- REGION) (Mus Musculus):
ggacctgagc tggtaaagcc tgggacttca gtgaagatgt cctgcaaggc ttctggatac acattcacta cctatgttat gcactgggtg caacagaagc ctgggcaggg ccttgactgg attggatttt ttaatcctta caatgatggt actaagtaca atgagaagtt caaaggcaag gccacactga cttcagacaa atcctccagc acagcctaca tggaactcag cagcctgacc tctgaggact ctgcggtcta ttactgtgca agatgggcct acgatggtag ctacgcctac tggggccaag gcaccactct cacagtctcc tcag
SEQ ID Nr. 13: Anti-human CEACAM1 -Antikörper (Clone B3-17) - leichte Kette (V-J-REGION) (Mus musculus):
SYLSVFLGGRVTITCKASDHINNWLAWYQQKPGNAPRLLISGATSLETGVPSRFSGSGSGKDY TLSI ISLQTEDVATYYCQQYWRTPFTFGSGTKLEI K
SEQ ID Nr. 14: Anti-human CEACAM1 -Antikörper (Clone B3-17) - leichte Kette (V-J-REGION) (Mus musculus):
tcctacttgt ctgtatttct aggaggcaga gtcaccatta cttgcaaggc aagtgaccac attaataatt ggttagcctg gtatcagcag aaaccaggaa atgctcctag gctcttaata tctggggcaa ccagtttgga aactggggtt ccttcaagat tcagtggcag tggatctgga aaggattaca ctctcagcat tatcagtctt cagactgaag atgttgctac ttattactgt caacagtatt ggagaactcc attcacgttc ggctcgggga caaagttgga aataaaac
SEQ I D Nr. 15: Lösliches UspA1 (Moraxella catarhalis) GenBank: U61725.1 :
MNKIYKVKKNAAGHLVACSEFAKGHTKKAVLGSLLIVGALGMATTASAQATKGTGKHVVDNKD NKAKGDYSTASGGKDNEAKGNYSTVGGGDYNEAKGNYSTVGGGSSNTAKGEKSTIGGGDTN DANGTYSTIGGGYYSRAIGDSSTIGGGYYNQATGEKSTVAGGRNNQATGNNSTVAGGSYNQA TGNNSTVAGGSHNQATGEGSFAAGVENKANANNAVALGKN NTIDGDNSVAIGSNNTI DSGKQ NVFILGSSTNTTNAQSGSVLLGHNTAGKKATAVSSAKVNGLTLGNFAGASKTGNGTVSVGSEN NERQIVNVGAGNISADSTDAVNGSQLYALATAVKADADENFKALTKTQNTLI EQGEAQDALIAQ NQTDITANKTAI ERNFNRTVVNGFEIEKN KAGIAKNQADIQTLENNVGEELLNLSGRLLDQKADID NNI NNIYDLAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLDLSGRLI DQKADLTKDI KTLENNVEEGLLDLSG RLIDQKADIAKNQADIAQNQTDIQDLAAYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSANTDRIATAELGIA
ENKKDAQIAKAQANENKDGIAKNQADIQLHDKKITNLGILHSMVARAVGNNTQGVATNKADIAK
NQADIANNIKNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKVSAANTDRIAKNKAEADASFETLTKNQNTLIEQG
EALVEQNKAINQELEGFAAHADVQDKQILQNQADITTNKAAIEQNINRTVANGFEIEKNKAGIATN
KQELILQNDRLNQINETNNRQDQKIDQLGYALKEQGQHFNNRISAVERQTAGGIANAIAIATLPS
PSRAGEHHVLFGSGYHNGQAAVSLGAAGLSDTGKSTYKIGLSWSDAGGLSGGVGGSYRWK
SEQ ID Nr. 16: Lösliches UspA1 (Moraxella catarhalis) GenBank: U61725.1 :
tgtgagcaaa tgactggcgt aaatgactga tgaatgtcta tttaatgaaa gatatcaata tataaaagtt gactatagcg atgcaataca gtaaaatttg ttacggctaa acataacgac ggtccaagat ggcggatatc gccatttacc aacctgataa tcagtttgat agccattagc gatggcatca agttgtgttg ttgtattgtc atataaacgg taaatttggt ttggtggatg ccccatctga tttaccgtcc ccctaataag tgaggggggg ggagacccca gtcatttatt aggagactaa gatgaacaaa atttataaag tgaaaaaaaa tgccgcaggt cacttggtgg catgttctga atttgccaaa ggccatacca aaaaggcagt tttgggcagt ttattgattg ttggggcatt gggcatggca acgacggcgt ctgcacaagc aaccaaaggc acaggcaagc acgttgttga caataaggac aacaaagcca aaggcgatta ctctaccgcc agtggtggca aggacaacga agccaaaggc aattactcta ccgtcggtgg tggcgattat aacgaagcca aaggcaatta ctctaccgtc ggtggtggct ctagtaatac cgccaaaggc gagaaatcaa ccatcggtgg tggcgatact aacgacgcca acggcacata ctctaccatc ggtggtggct attatagccg agccataggc gatagctcta ccatcggtgg tggttattat aaccaagcca caggcgagaa atcaacggtt gcagggggca ggaataacca agccacaggc aacaactcaa cggttgcagg cggctcttat aaccaagcca caggcaacaa ctcaacggtt gcaggtggct ctcataacca agccacaggt gaaggttcat ttgcagcagg tgtagagaac aaagccaatg ccaacaacgc cgtcgctcta ggtaaaaata acaccatcga tggcgataac tcagtagcca tcggctctaa taataccatt gacagtggca aacaaaatgt ctttattctt ggctctagca caaacacaac aaatgcacaa agcggctccg tgctgctggg tcataatacc gctggcaaaa aagcaaccgc tgttagcagt gccaaagtga acggcttaac cctaggaaat tttgcaggtg catcaaaaac tggtaatggt actgtatctg tcggtagtga gaataatgag cgtcaaatcg tcaatgttgg tgcaggtaat atcagtgctg attcaacaga tgctgttaat ggctcacagc tatatgcttt ggccacagct gtcaaagccg atgccgatga aaactttaaa gcactcacca aaactcaaaa tactttgatt gagcaaggtg aagcacaaga cgcattaatc gctcaaaatc aaactgacat cactgccaat aaaactgcca ttgagcgaaa ttttaataga actgttgtca atgggtttga gattgagaaa aataaagctg gtattgctaa aaaccaagcg gatatccaaa cgcttgaaaa caatgtcgga gaagaactat taaatctaag cggtcgcctg cttgatcaaa aagcggatat tgataataac atcaacaata tctatgatct ggcacaacag caagatcagc atagctctga tatcaaaaca cttaaaaaaa atgtcgaaga aggtttgttg gatctaagtg gtcgcctcat tgatcaaaaa gcagatctta cgaaagacat caaaacactt gaaaacaatg tcgaagaagg tttgttggat ctaagcggtc gcctcattga tcaaaaagca gatattgcta aaaaccaagc tgacattgct caaaaccaaa cagacatcca agatctggcc gcttacaacg agctacaaga ccagtatgct caaaagcaaa ccgaagcgat tgacgctcta aataaagcaa gctctgccaa tactgatcgt attgctactg ctgaattggg tatcgctgag aacaaaaaag acgctcagat cgccaaagca caagccaatg aaaataaaga cggcattgct aaaaaccaag ctgatatcca gttgcacgat aaaaaaatca ccaatctagg tatccttcac agcatggttg caagagcggt aggaaataac acacaaggtg ttgctaccaa taaagctgac attgctaaaa accaagcaga tattgctaat aacatcaaaa atatctatga gctggcacaa cagcaagatc agcatagctc tgatatcaaa accttggcaa aagtaagtgc tgccaatact gatcgtattg ctaaaaacaa agctgaagct gatgcaagtt ttgaaacgct caccaaaaat caaaatactt tgattgagca aggtgaagca ttggttgagc aaaataaagc catcaatcaa gagcttgaag ggtttgcggc tcatgcagat gttcaagata agcaaatttt acaaaaccaa gctgatatca ctaccaataa ggccgctatt gaacaaaata tcaatagaac tgttgccaat gggtttgaga ttgagaaaaa taaagctggt attgctacca ataagcaaga gcttattctt caaaatgatc gattaaatca aattaatgag acaaataatc gtcaggatca gaagattgat caattaggtt atgcactaaa agagcagggt cagcatttta ataatcgtat tagtgctgtt gagcgtcaaa cagctggagg tattgcaaat gctatcgcaa ttgcaacttt accatcgccc agtagagcag gtgagcatca tgtcttattt ggttcaggtt atcacaatgg tcaagctgcg gtatcattgg gtgcggctgg gttaagtgat acaggaaaat caacttataa gattggtcta agctggtcag atgcaggtgg attatctggt ggtgttggtg gcagttaccg ctggaaatag agcctaaatt taactgctgt atcaaaaaat atggtctgta taaacagacc atatttttat ctaaaaactt atcttaactt ttatgaagca tcataagcca aagctgagta ataataagag atgttaaaat aagagatgtt aaaactgcta aacaatcggc ttacgacgat aaaataaaat acctggaatg gacagcccca aaaccaatgc tgagatgata aaaatcgcct caaaaaaatg acgcatcata acgataaata aatccatatc aaatccaaaa tagccaattt gtaccatgct aaccatggct ttataggcag cgattcccgg catcatacaa atcaagctag gtacaatcaa ggctttaggc ggcaggccat gacgctgagc a
SEQ ID Nr. 17: Lösliches Opa (Neisseria gonorrhoeae) UniProtKB/Swiss-Prot: Q0PS02_NEIME:
YAAERITHDYPKATGANNTSTVSDYFRNIRAHSI HPRVSVGYDFGGWRIAADYASYRKWKESN SSTNAENRDSIQNYVKIETKHQGNGSFHAASSLGLSAIYDFKLNDKFKPYIGARVAYGHVKHQV HSVESKNTI ITSKPTGNTPAGGPVPTGFVPKSAYHESHSISSL
SEQ ID Nr. 18: Aussenmembran Protein P5 (Haemophilus influenzae) UniProtKB/Swiss-Prot: P43840.1 :
MKKTAIALWAGLAAASVAQAAPQENTFYAGVKAGQASFH DGLRALAREYKVGYHRNSFTYGV FGGYQILNQNNLGLAVELGYDDFGRAKGREKGKTVVKHTNHGTHLSLKGSYEVLEGLDVYGK AGVALVRSDYKLYNENSSTLKKLGEHHRARASGLFAVGAEYAVLPELAVRLEYQWLTRVGKYR PQDKPNTALNYNPWIGSINAGISYRFGQGAAPVVAAPEVVSKTFSLNSDVTFAFGKANLKPQA QATLDSIYGEMSQVKSAKVAVAGYTDRIGSDAFNVKLSQERADSVANYFVAKGVAADAISATG YGKAN PVTGATCDQVKGRKALIACFAPDRRVEIAVNGTK
SEQ ID Nr. 19: Lösliches humanes rekombinantes CEACAM 1 Fusionsprotein (Humanes CEACAM1 (ENSG00000079385) mit "IL-2 Secretory Leader" Sequenz und human lgG-Fc2 Fusionsprotein):
PEITGEGGPPCTGCNSCLALHVLHLSRIRQLTTESMPFNVAEGKEVLLLVHNLPQQLFGYSWYK GERVDGNRQIVGYAIGTQQATPGPANSGRETIYPNASLLIQNVTQNDTGFYTLQVIKSDLVNEE ATGQFHVYPELPKPSISSNNSNPVEDKDAVAFTCEPETQDTTYLWWIN NQSLPVSPRLQLSNG NRTLTLLSVTRNDTGPYECEIQNPVSANRSDPVTLNVTYGPDTPTISPSDTYYRPGANLSLSCY AASNPPAQYSWLI NGTFQQSTQELFI PNITVNNSGSYTCHANNSVTGCNRTTVKTI IVTELSPW AKPQI KASKTTVTGDKDSVNLTCSTNDTGISI RWFFKNQSLPSSERMKLSQGNTTLSI NPVKRE DAGTYWCEVFNPISKNQSDPIMLNVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVW DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID Nr. 20: Lösliches humanes rekombinantes CEACAM 1 Fusionsprotein (Humanes EACAM1 (ENSG00000079385) mit "IL-2 Secretory Leader" Sequenz und human lgG-Fc2 Fusionsprotein): cctgagatca ccggcgaagg agggccacca tgtacaggat gcaactcctg tcttgcattg cactaagtct tgcacttgtc acgaattcgc agctgaccac cgagagcatg cccttcaacg tggccgaggg caaggaggtg ctgctgctgg tgcacaacct gccccagcag ctgttcggct acagctggta caagggcgag agggtggacg gcaacaggca gatcgtgggc tacgccatcg gcacccagca ggccaccccc ggccccgcca acagcggcag ggagaccatc taccccaacg ccagcctgct gatccagaac gtgacccaga acgacaccgg cttctacacc ctgcaggtga tcaagagcga cctggtgaac gaggaggcca ccggccagtt ccacgtgtac cccgagctgc ccaagcccag catcagcagc aacaacagca accccgtgga ggacaaggac gccgtggcct tcacctgcga gcccgagacc caggacacca cctacctgtg gtggatcaac aaccagagcc tgcccgtgag ccccaggctg cagctgagca acggcaacag gaccctgacc ctgctgagcg tgaccaggaa cgacaccggc ccctacgagt gcgagatcca gaaccccgtg agcgccaaca ggagcgaccc cgtgaccctg aacgtgacct acggccccga cacccccacc atcagcccca gcgacaccta ctacaggccc ggcgccaacc tgagcctgag ctgctacgcc gccagcaacc cccccgccca gtacagctgg ctgatcaacg gcaccttcca gcagagcacc caggagctgt tcatccccaa catcaccgtg aacaacagcg gcagctacac ctgccacgcc aacaacagcg tgaccggctg caacaggacc accgtgaaga ccatcatcgt gaccgagctg agccccgtgg tggccaagcc ccagatcaag gccagcaaga ccaccgtgac cggcgacaag gacagcgtga acctgacctg cagcaccaac gacaccggca tcagcatcag gtggttcttc aagaaccaga gcctgcccag cagcgagagg atgaagctga gccagggcaa caccaccctg agcatcaacc ccgtgaagag ggaggacgcc ggcacctact ggtgcgaggt gttcaacccc atcagcaaga accagagcga ccccatcatg ctgaacgtgg agtgcccacc ttgcccagca ccacctgtgg caggaccttc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aaggcctccc atcctccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg aggagatgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gtaaa
Beispielteil
1.1 Figurenbeschreibungen
Die Figuren zeigen schematisch:
Fig. 1A: repräsentative Durchflusszytometrie Histogramme von wuchernden B-Zellen aus
Wildtyp-(WT) oder CEACAM1 -/- Mäusen (CEACAM1 -Knockout-Mäusen), die unbehandelt (graue Fläche), mit anti-CEACAM1 Antikörper, LPS oder mit rekombinantem Maus-CD40-Ligand in Kombination mit Maus-IL-4 (schwarze Linie) für 48 Stunden behandelt wurden. DAPI-Zellen sind gezeigt (n = 6).
Fig. 1 B: Absolute Anzahl lebender Zellen B (DAPI-) zu angegebenen Zeitpunkten (n = 3);
aus der Milz sortiert, nach der Behandlung mit oder ohne rekombinantem Maus- CD40-Ligand in Kombination mit Maus IL-4 (n = 3). Fig. 1 C: Repräsentative Histogramme und statistische Analyse der Annexin-V+ B-Zellen, die mit rekombinantem Maus-CD40-Ligand in Kombination mit Maus IL-4 stimuliert oder unstimuliert belassen wurden, nach 48 Stunden (DAPI- B Zellen sind gezeigt, n = 6).
Fig. 1 D: Prozentsatz der DAPI+ B-Zellen aus der Milz von WT und CEACAM1 -/- Mäusen nach der Aktivierung mit rekombinantem Maus-CD40-Ligand in Kombination mit Maus-IL-4 in Anwesenheit oder Abwesenheit von Btk Inhibitor Ibrutinib kultiviert für 48 Stunden durch FACS-Analyse bestimmt (n = 6 ). * P <0,05; ** P <0,01 ; und *** P <0,001 (Student-t-Test).
Die in den Figuren 1A bis 1 D grafisch dargestellten Ergebnisse zeigen, dass CEACAM1 das Überleben von B-Zellen in vitro fördert.
Fig. 2A: Schema der Entwicklung, Reifung und Migration von B-Zellen in Knochenmark, Blut,
Lymphknoten und Milz. Die durchgezogenen Pfeile zeigen den wahrscheinlichen Entwicklungsweg. Die gestrichelten Pfeile zeigen einen noch in der Diskussion befindlichen Entwicklungsweg. Die punktierten Pfeile zeigen die Differenzierung nach der Antigen-Stimulation. Der„Strich-Punkt Pfeil" zeigt angenommene Entwicklungswege.
Fig. 2B-E: Gesamtzahl der B-Zell-Subpopulationen von Wildtyp (WT) und CEACAM1 -/- Mäusen, gemessen mittels Durchflusszytometrie im Knochenmark (b, n = 6), im Blut (c, n = 4), Lymphknoten (d, n = 4) und in der Milz (e, n = 10). Marker siehe Methoden.
Die in den Figuren 2A bis 2D grafisch dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die Expression von CEACAM1 die B-Zell-Differenzierung und das Überleben der B- Zellen in vivo fördert.
Fig. 3: Gesamtzahl der B1 a und B2 B-Zell-Subpopulationen (B1 a, CD19lowCD5int; B2,
CD19highCD5neg) und T-Zellen aus Wildtyp-(WT) und CEACAM1 -/- Mäuse, gemessen mittels Durchflusszytometrie in der Bauchhöhle (n = 6). * P <0,05 (Student- t-Test); ns = nicht signifikant.
Die in Figur 3 grafisch dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die Expression von CEACAM1 die B1 B-Zellen verändert.
Menge der Serum Immunglobuline in naiv-Wildtyp (WT) und CEACAM1 -/- Mäusen (n = 8 pro Genotyp). ** P <0,01 ; und *** P <0,001 (Student-t-Test).
Die in Figur 4 grafisch dargestellten Ergebnisse zeigen eine vorteilhafte Beeinflussung der Serum-Immunglobuline durch CEACAM1 . Fig. 5A: Prozent von WT x Vi10 B-Zellen und CEACAM1 -/- x Vi10 B-Zellen, die adoptiv in WT-Mäusen (1 x 107 pro Maus) am Tag -1 übertragen wurden und die mit 2 x 106 PFU VSV (Vesikuläres Stomatitis Virus) am Tag 0 infiziert wurden. Analyse Tag 3 nach Infektion (n = 3). Fig. 5B,C: Gesamt VSV neutralisierende Antikörper und neutralisierende IgG-Antikörper in WT und CEACAM1 -/- Mäusen nach intravenöser Infektion mit 2 χ 106 PFU VSV (B, n = 6-9 pro Gruppe) und / oder nach der intravenösen Infektion mit 2 108 PFU von UV- inaktivierten VSV (C, n = 8-9 pro Gruppe).
Fig. 5D: VSV neutralisierende Antikörperantwort und neutralisierende IgG-Antikörper in Se- ren von WT und CEACAM 1 -/- Mäusen, die 1 107 VSV-spezifische B-Zellen (Vi10) am Tag -1 erhalten hatten und dann mit 2 106 PFU VSV am Tag 0 infiziert wurden (n = 7-9 pro Gruppe).
Fig. 5E: VSV-Titer in verschiedenen Organen von WT und CEACAM1 -/- Mäuse nach intravenöser Infektion mit 2 x 106 PFU VSV analysiert 8 Tage nach Infektion (n = 6 pro Gruppe).
Fig. 5F: Überleben von WT und CEACAM1 -/- Mäusen nach intravenöser Infektion mit 2 χ
106 PFU VSV (n = 9-12 pro Gruppe).
Fig. 5G: Überleben von WT und CEACAM1 -/- Mäusen, die unbehandelt waren oder adoptiv mit 1 x 107 VSV-spezifischen B-Zellen (Vi10) am Tag -1 behandelt wurden und am Tag 0 mit 2 x 106 PFU VSV infiziert wurden (n = 4-9). * P <0,05; ** P <0,01 ; und ***
P <0,001 (Student-t-Test).
Die in den Figuren 5A bis 5G grafisch dargestellten Ergebnisse zeigen, dass Aktivierung von CEACAM 1 für eine Infektion mit VSV essentiell ist.
Fig. 6: Anti-VSV-spezifische IgM-und IgG-Antikörper in Wildtyp (WT) und CEACAM1 -/- Mäusen nach intravenöser Infektion mit 2 χ 106 PFU von VSV (n = 4-7 pro Gruppe).
* P <0,05; ** P <0,01 ; und *** P <0,001 (Student-t-Test). Daten, die für zwei Experimente sind (Mittelwert ± SEM).
Die in Figur 6 grafisch dargestellten Ergebnisse zeigen, dass CEACAM 1 für eine Anti-VSV spezifische Ig-Produktion essentiell ist. Fig. 7A: LCMV (lymphozytäres Choriomeningitis Virus) Glykoprotein-spezifische IgG- Antikörper im Serum von Wildtyp (WT) und CEACAM 1 -/- Mäusen nach intravenöser Infektion mit 200 PFU LCMV-WE (n = 3-6 pro Gruppe). Fig. 7B: Leber Virustiter von WT und CEACAM1 -/- Mäusen 10 Tage nach intravenöser Infektion mit 2 x 106 PFU LCMV-WE (n = 3 pro Gruppe). *** P <0,001 (Student-t-Test).
Die in Figur 7A und 7B grafisch dargestellten Ergebnisse zeigen, dass eine Aktivierung von CEACAM1 die LCMV-abhängige B-Zell-Aktivierung erhöht. Fig. 8A: Milz VSV-Titer von WT oder CEACAM1 -/- Mäuse 7 h nach intravenöser Infektion mit
2 x 106 PFU von VSV (n = 6 pro Genotyp). ** P <0,01 (Student-t-Test).
Fig. 8B: Interferon-alpha levels im Serum von WT oder CEACAM1 -/- Mäusen 2 und 4 Stunden nach intravenöser Infektion mit 2 108 PFU von VSV.
Die in den Figuren 8A und 8B grafisch dargestellten Ergebnisse zeigen mangelhafte Randzonen, Replikation und Interferon-Induktion in CEACAM1 -/- Mäusen.
Fig. 9: Anzahl Autoantikörper-bindender Zellen auf Lebergewebsschnitten, die mit Serum von WT und CEACAM1 -/- Mäusen 100 Tage nach intraperitonealer Injektion mit 500 L Pristan, und fluoreszierendem anti-mouse IgG behandelt wurden (n = 3-5).
Fig. 10: Menge von Virus in unterschiedlichen Organen von Wildtyp-(WT) oder CEACAM1 -/- Mäusen nach Infektion mit 200 PFU des chronischen lymphozytären Choriomeningi- tis Virusstammes (LCMV-Docile), gemessen 10 Tage nach Infektion (n = 3).
Fig. 1 1 A: Menge von Virus in Blut von Wildtyp-(WT) oder CEACAM1 -/- Mäusen, die mit Kontrollantikörper oder Anti-CEACAM1 -Antikörper (200μg Tag -1 ) behandelt wurden und zusätzlich am Tag 0 mit 2x104 PFU des chronischen lymphozytären Choriome- ningitis Virusstammes (LCMV-Docile) infiziert wurden (n = 6).
Fig. 1 1 B: Alanin-Aminotransferase (Biomarker für Leberschaden) im Serum von Wildtyp-(WT) oder CEACAM1 -/- Mäusen, die mit Kontrollantikörper oder Anti-CEACAM1 - Antikörper (200μg Tag -1 ) behandelt wurden und zusätzlich am Tag 0 mit 2x104 PFU des chronischen lymphozytären Choriomeningitis Virusstammes (LCMV- Docile) infiziert wurden (n = 6).
Fig. 12: Menge von Virus in unterschiedlichen Organen von Wildtyp-(WT) Mäusen (gemessen Tag 60), die am Tag 0 mit 2x106 PFU des chronischen lymphozytären Choriomeningitis Virusstammes (LCMV-Docile) infiziert wurden und zusätzlich am Tag 16 unbehandelt blieben oder mit Anti-CEACAM1 -Antikörper (200μg) behandelt wurden (n = 3-4).
1.2 Methoden und Materialien: 1.2.1 Mäuse:
CeacamT -Mäuse wurden auf dem genetischen Hintergrund von C57BL/6 gehalten (mindestens 8-mal und bis zu 16-mal rückgekreuzt) und wurden homozygot gezüchtet. VM 0/CD45.1 - Mäuse, die einen VSV-spezifischen B-Zellenrezeptor als Transgen exprimieren, wurden für Zell- transferuntersuchungen verwendet, und Mäuse, die das CD45.1 -Transgen exprimieren, wurden zur Rekonstitution von Knochenmark verwendet. In allen Untersuchungen wurden sechs bis acht Wochen alte und gleichgeschlechtliche Mäuse verwendet. Alle Tiere wurden in belüfteten Einzelkäfigen gehalten. Bei den Überlebensexperimenten wurde der Gesundheitszustand der Mäuse zweimal täglich überprüft. Die Tierversuche wurden mit Genehmigung vom Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen (Recklinghausen, Deutschland) und gemäß dem deutschen Tierschutzgesetz oder gemäß den Institutsrichtlinien des Ontario Cancer Institute of the University Health Network und der McGill University, USA durchgeführt. Tiere, die schwere Krankheitssymptome oder Paralyse zeigten oder während einer VSV- Infektion beträchtlichen Gewichtsverlust erlitten, wurden aus dem Experiment genommen und für die statistische Analyse als Todesfälle gezählt.
1.2.2 Virus-Assays und Plaque-Assays:
Vesikuläre Stomatitis virus (VSV), Stamm Indiana (VSV-IND, Mudd-Summers-Isolat) wurde ursprünglich von Prof. D. Kolakofsky (Universität Genf, Schweiz) erhalten. Das Virus wurde auf BHK-21 -Zellen mit einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 0,01 vermehrt. Die VSV-Konzentration wurde wie beschrieben bestimmt, und wurde dann in der Plaquetechnik auf Vero-Zellen ausplattiert (Fink, K. et al.„Early type I interferon-mediated Signals on B cells specifically enhance antiviral humoral responses." European journal of immunology (2006), 36, 2094-2105.). Mäuse wurden intravenös mit VSV in den angegebenen Dosen infiziert. Virustiter wurden mit einem Plaque-Assay gemessen. Für dieses Assay wurden Organe in Dulbecco's Modified Eagle Me- dium (DMEM), das 2 % fötales Kälberserum (FKS) enthält, zerkleinert, 1 :3 über 12 Stufen eingestellt und auf Vero-Zellen ausplattiert. Nach einer 2-stündigen Inkubation bei 37 °C wurde ein Überschichtungsmedium (Overlay) zugegeben und das Virus-Präparat nochmals bei 37 °C inkubiert. Die Plaques wurden 24 h später mittels Anfärbung mit Kristallviolett ausgezählt.
Der Stamm des lymphozytären Choriomeningitis Virus LCMV-WE wurde ursprünglich von F. Lehmann-Grube (Heinrich Pette Institut, Hamburg, Deutschland) erhalten und in L929-Zellen, MC57-Zellen oder beiden vermehrt. Mäuse wurden intravenös in der angegebenen Dosis infiziert. LCMV-Virustiter wurden durch ein Plaque-Assay auf MC57- Fibroblasten wie zuvor beschrieben nachgewiesen (Battegay, M. et al.„Quantification of lymphocytic choriomeningitis virus with an immunological focus assay in 24- or 96- well plates." J Viral Methods (1991 ), 33, 1 91 -198.). Kurz gesagt, zerkleinerte Organe wurden mit MC57-Zellen wie oben beschrieben ausplattiert und bei 37 °C inkubiert.
Der Stamm des lymphozytären Choriomeningitis Virus LCMV-Docile wurde ursprünglich von F. Lehmann-Grube (Heinrich Pette Institut, Hamburg, Deutschland) erhalten und in L929-Zellen, MC57-Zellen oder beiden vermehrt. Das Influenza A Virus wurde von der Arbeitsgruppe Westendorf, Universität Duisburg-Essen erhalten.
Nach einer Inkubation von 3 h bei 37 °C wurde ein Überschichtungsmedium zugegeben und das Virus-Präparat nochmals bei 37 °C inkubiert. Die Plaques wurden 72 h später mittels Anfärbung mit LCMV-NP (Nukleoprotein des LCMV) ausgezählt Die Zellen wurden fixiert (mit 4 % Formaldehydlösung), permeabilisiert (mit 1 % Triton-X-Lösung), blockiert (mit 10 % FKS in phosphatgepufferter Salzlösung PBS) und mit anti-LCMV-NP-Antikörper (hausintern hergestellt) angefärbt. Als sekundärer Antikörper wurde ein mit ECL (Enhanced Chemolumine- scence) konjugierter anti-Kaninchen-lgG-Antikörper (anti-rabbit-IgG antibody) verwendet. Plaques wurden durch eine Farbreaktion nachgewiesen (0,2 M Na2HP04 + 0,1 M Citronensäure + 30 % H202 + o-Phenylendiamindihydrochlorid), wobei alle Chemikalien von Sigma-Aldrich bezogen wurden.
1.2.3 Test auf neutralisierende Antikörper:
Serum wurde vorverdünnt (1 :40). Das Komplementsystem wurde bei 56°C 30 min lang inaktiviert. Um eine IgG-Kinetik aufzunehmen, wurden verdünnte Proben mit 2- Mercaptoethanol (0,1 M) behandelt, um IgM zu entfernen. Serum wurde 1 :2 über 1 2 Stufen eingestellt und wurde mit 1 x 103 Plaque bildenden Einheiten (PFU , Plaque Forming Units) des VSV inkubiert. Nach 90 Minuten Inkubation bei 37 °C wurde das Virus-Serum-Gemisch auf Vero-Zellen ausplattiert. Nach einer Stunde wurde ein Über- schichtungsmedium zugegeben und die Mischung wurde nochmals 24 h lang bei 37 °C inkubiert. Die Plaques wurden durch Anfärbung mit Kristallviolett ausgezählt. Antikör- pertiter sind als 2- oder 3-fache Verdünnungsstufen (-log2 und -log3)-fache Vorverdünnung (d .h. x40) dargestellt.
1.2.4 Kultur von B-Zellen: Milzpräparate von Mäusen des Wildtyps (WT) und Ceacam 7"A-Mäusen wurden in MACS- Puffer (1 % FKS und 0,8 % 0,5 M EDTA) zur magnetaktivierten Zellsortierung homogenisiert. B220+-B-Zellen wurden durch positive Selektion mit CD45R-konjugierten Magnetpartikeln (MACS Miltenyi Biotech) isoliert. Mittels Durchflusszytometrie wurde bestätigt, dass die Reinheit der B220+-Zellen über 95 % betrug. Für Proliferationsversuche wurden die Zellen mit 5 μΜ Carboxyfluoresceinsuccinimidylester (CFSE) markiert, und es wurden 2 x 105 Zellen pro Vertiefung in 96-Lochplatten in Zellkulturmedium RPMI 1640 unter Zusatz von 10 % LPS-freiem FKS (ohne Lipopolysaccharid), 1 % Antibiotika und 0,1 % 50 mM 2-Mercaptoethanol kultiviert. Danach wurden sie mit anti-CEACAM1 -Antikörper (20 μg ml, Klon CC1 ; überlassen von Dr. Kathryn V. Holmes, University of Colorado, Denver, USA) oder rekombinantem Maus-CD40- Liganden (1 μg ml) in Kombination mit Maus-IL4 (10 ng/ml; R&D Systems) oder LPS (10 ng/ml; Sigma Aldrich) 48 h lang behandelt. Ebenso wurden für Inhibitionsexperimente gereinigte B- Zellen (wie oben beschrieben) in dem oben beschriebenen Medium mit rekombinantem Maus- CD40-Liganden (1 μg ml) in Kombination mit Maus-IL4 (10 ng/ml; R&D Systems) kultiviert und mit 10 μΜ Ibrutinib (Seileck) behandelt. Als Kontrolle wurden gleiche Mengen an DMSO (Dirne- thylsulfoxid), das zum Lösen von Ibrutinib verwendet wird, in Vertiefungen gegeben. Der Zelltod wurde durch Anfärbung mit 4',6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI ; Life Technologies) gemessen. Für Überlebensexperimente wurden B-Zellen wie zuvor angegeben kultiviert und die Zellen wurden mit Annexin-V (BD Biosciences) danach mit DAPI angefärbt. Zu angegebenen Zeit- punkten wurden die Proliferation und das Überleben durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) bestimmt. Für Zellsignalexperimente wurden Splenozyten in VLE-DMEM (Very Low Endotoxin-DMEM) unter Zusatz von 10 % LPS-freiem FKS und 1 % Antibiotika dissoziiert und mit anti-CEACAM1 -Antikörper (Klon CC1 , 20 Mg/ml,; K. Holmes) und anti-IgM-Antikörper (10 μg ml) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) über unterschiedliche Zeitdauern bei 37 °C behandelt.
1.2.5 Durchflusszytometrie:
Periphere Blutzellen wurden angefärbt mit Antikörpern anti-Ly6G (RB6-8C5), anti- CDU 5 (AFS98), anti-CD45R (B220; RA3-6B2), anti-CD90.2 (30-H 1 2), anti-CEACAM 1 (CC1 ; mit korrespondierender Isotyp-Kontrolle anti-lgG 1 [M 1 -14D1 2]), anti-lgD (1 1 - 26c), anti-CD93 (AA4.1 ), anti-CD1 9 (1 D3) (alle von eBioscience) und anti-lgM (11/41 ; BD Biosciences). Isolierte Knochenmarkzellen wurden in FACS-Puffer (0,5 M EDTA, 0, 1 % Natriumazid , 1 % FKS in PBS) suspend iert und in kubiert mit Antikörpern anti- CD45R (B220; RA3-6B2), anti-lgD (1 1 -26c), anti-lgM (11-41 ), anti-CEACAM 1 (CC1 ), anti-CD24 (M 1 /69) (alle von eBioscience), anti-CD43 (1 B-1 1 ) und anti-BP1 (6C3) (von BioLegend). Leistenlymphknoten wurden in FACS-Puffer disaggregiert und die Zellen wurden angefärbt auf Antikörper anti-CD45R (B220; RA3-6B2), anti-CD1 9 (1 D3), anti- lgD (1 1 -26c) (alle von eBioscience) und anti-lgM (11/41 ) (BD Biosciences). Milzen wurden in FACS-Puffer dissoziiert und Splenozyten wurden inkubiert mit Antikörpern anti- CD45R (B220; RA3-6B2), anti-CD1 9 (1 D3), anti-CD93 (AA4.1 ), anti-CD21 /35 (8D9), anti-CD23 (B3B4), anti-lgD (1 1 -26c), anti-CEACAM 1 (CC1 ), anti-CD45.1 (A20), anti- CD45.2 (1 04) (alle von eBioscience) und anti-lg M (11/41 ) (BD). Humane periphere Blutproben wurden angefärbt mit Antikörpern anti-lgD (IA6-2) und anti-CD27 (M-T271 ) (beide von BD Biosciences) u nd Antikörper anti-CEACAM 1 (mAB, B3-1 7) (von Dr. Singer, Essen). Peritoneale B-Zellen wurden angefärbt auf Antikörper anti-CD1 9 (1 D3), anti-CD45R (B220; RA3-6B2), anti-lg M (11/41 ) (alle von eBioscience) und anti-CD5 (53- 7.3) (BD Biosciences) und anti-CD43 (1 B-1 1 ) (von BioLegend). Tote Zellen wurden durch Anfärben mit Propidiumiodid (PI , eBioscience) und/oder DAPI diskriminiert und wurden von allen Analysen außer Blutanalysen ausgeschlossen . Für Zellsignalexperimente wurden Zellen gemäß der Herstellerangaben fixiert und permeabilisiert (BD Phosflow, BD Biosciences). Die Zellen wurden mit Antikörper anti-Btk (pY223)/ltk (pY1 80) (BD Phosflow) angefärbt. Alle Antikörper wurden 1 : 1 00 zu ihrer Ausgangskonzentration in FACS-Puffer verdü nnt. Zur quantitativen Bestimmung der Gesamtzellzahlen wurden FACS-Partikel verwendet (BD Biosciences). Alle angefärbten Zellen wurden auf einem Durchflusszytometer vom Typ LSRI I oder FACSFortessa (BD Biosciences) analysiert, und d ie Daten wurden mit Flowjo-Software analysiert. 1.2.6 Gatingstrategie zum Identifizieren von Untergruppen von B-Zellen
Herkunft B-Zelluntergruppe Marker
Knochenmark unreif, neugebildet B220+ CD43" lgD"/low lgM+ reif rezirkulierend, follikulär (FO) B220+ CD43" lgDhigh IgM"
Blut unreif, neugebildet B220+ lgD"/l0W lgM+ reif rezirkulierend, follikulär (FO) B220+ lgDhigh IgM" nativ-ähnlich B220+ CD93high lgD" IgM"
Lymphknoten unreif, neugebildet B220+ CD19+ lgD"/low lgM+ reif rezirkulierend, follikulär (FO) B220+ CD19+ lgDhigh IgM"
Milz Marginalzone (MZ) B220+ CD19+ CD93"/|0W CD21/35high CD23" follikulär (FO) B220+ CD19+ CD93"/|0W CD21/35int CD23+ transitional T1 B220" CD19" CD93+ CD23" lgMhigh transitional T2 B220" CD19" CD93+ CD23+ lgMhigh transitional T3 B220" CD19" CD93+ CD23+ lgMl0W
Tabelle 1 : Gatingstrategie zum Identifizieren von Untergruppen von B-Zellen
1.2.7 LCMV-Glykoprotein GP1 -spezifische IgG-Messungen:
Der Nachweis des LCMV-Glykoprotein GP1 -spezifischen IgG durch ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) wurde schon beschrieben (Recher, M. et al. „Deliberate removal of T cell help improves virus-neutralizing antibody production." Nature immunology (2004), 5, 934- 942.). Kurz gesagt, flachbödige 96-Lochplatten Nunc Immuno Plates (Thermo Scientific) wurden mit anti-human IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc) ENREF 60 in Bes- chichtungspuffer (0, 1 M Na2C03 + 0,1 M NaHC03; pH 9,6) über Nacht bei 4 °C beschichtet. Am nächsten Tag wurden die Platten mit einem Waschpuffer (PBS mit 0,05 % Tween20) gewaschen und 2 Stunden lang eine Blockierung unspezifischer Bindung mit 2 % FKS in PBS vorge- nommen. Die Platten wurden mit LCMV Gp-Fc Überstand (hausintern hergestellt) 3 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden gewaschen und mit vorverdünntem (1 :20) Serum über 12 Vertiefungen mit Verdünnungen von 1 :3 in aufeinanderfolgenden Vertiefungen eingestellt. Nach einer Inkubation von 90 Minuten wurden die Platten mit HRP- konjugiertem (Horseradish Peroxidase) anti-Maus-lgG-Antikörper (Sigma) inkubiert. Nach einer Stunde Inkubation wurden die Platten wie nachfolgend beschrieben entwickelt. 1.2.8 ELISA-Messungen:
Zum Nachweis von VSV-spezifischen anti-IgG- und anti-IgM-Antikörpern wurden flachbö- dige 96-Lochplatten Nunc Immuno Plates (Thermo Scientific) mit Baculovirus VSV-GP (Lang, K.S. et al.„MyD88 protects from lethal encephalitis during infection with vesicular Stomatitis vi- rus." European journal of immunology (2007), 37, 2434-2440.) in Beschichtungspuffer 0,1 M NaC03 (0,1 M Na2C03 + 0,1 M NaHC03; pH 9,6) über Nacht bei 4 °C beschichtet. Am nächsten Tag wurden die Platten mit einem Waschpuffer (PBS mit 0,05 % Tween20) gewaschen und 1 bis 2 Stunden lang eine Blockierung unspezifischer Bindung mit 2 % FKS in PBS vorgenommen. Die Platten wurden einmal gewaschen und mit vorverdünntem (1 :15) Serum über 12 Ver- tiefungen mit Verdünnungen von 1 :3 in aufeinanderfolgenden Vertiefungen eingestellt. Die Platten wurden bei Raumtemperatur 2 h lang inkubiert. Die Platten wurden mit Waschpuffer gewaschen und mit HRP-konjugiertem anti-Maus-lgG-Antikörper (Sigma) oder anti-Maus-IgM- Antikörper (Sigma) 30 bis 60 min lang inkubiert. Die Platten wurden gewaschen und mit 1X TMB Substratlösung (eBioscience) im Dunkeln inkubiert, wonach 10 % H2S04-Lösung zugege- ben wurde, um die Farbreaktion zu unterbrechen. Die optische Dichte wurde bei 450 nm gemessen (FLUOstar Omega, BMG LABTECH). Es wurden verschiedene Immunglobulin-Isotypen und -Untertypen in naivem Serum von WT-Mäusen und Ceacam 7"A-Mäusen gemessen, wie es beschrieben wurde (Recher, M. et al.„B cell-intrinsic deficiency of the Wiskott-Aldrich Syndrome protein (WASp) causes severe abnormalities of the peripheral B-cell compartment in mice." Blood (2012), 1 19, 2819-2828.).
1.2.9 Bildung von Maus-anti-Human-CEACAM1 -Antikörper:
Weibliche Mäuse im Alter von 8 bis 10 Wochen wurden in drei Stufen mit humanem CEACAM1 - Fc (50 μg / 90 μΙ in PBS) gemischt mit Gerbu Adjuvans MM (60 μΙ) immunisiert (idealerweise an Tag 0, Tag 14 und Tag 21 ; intraperitoneal (i.p.) die erste, subkutan (s.c.) die zweite und dritte Immunisierung). Die Menge der ersten Immunisierung war die doppelte Menge aller nachfolgenden Immunisierungen. Eine Woche nach der dritten Immunisierung wurde den Mäusen zur Serumgewinnung Blut entnommen. Um zu testen, ob der Titer ausreichend war, wurde ein ELISA oder eine Durchflusszytometrieanalyse durchgeführt. Der Titer von Tag 0 bis Tag 21 war in der Regel 100 bis 1000-fach erhöht. Mäuse mit ausreichendem Titer wurden geboostet mit 25 μg humanem CEACAM1 -Fc, gelöst in sterilem PBS ohne Adjuvans i.v. und i.p., vier Tage bevor die Mäuse getötet wurden und die Splenozyten (Milzzellen) gewonnen wurden.
Die Mäuse wurden durch Genickbruch getötet und die Milz wurde unter aseptischen Bedingungen entfernt. Die Milz wurde durch ein 70 μηη Nylon-Zellsieb gequetscht. Splenozyten wurden in ein 50 ml Falcon-Röhrchen überführt und dreimal mit DMEM-Medium, das keine Additive (z.B. FKS) enthält, gewaschen. Parallel wurde die Fusionspartner-Zelllinie (die Maus-Myelom- Zelllinie NS1/0) ebenfalls in DMEM gewaschen. Danach wurden Splenozyten und Myelomzellen in einem Verhältnis von 5:1 gemischt und bei 2000 U/min 5 min lang zentrifugiert. Dann wurde der Überstand entfernt und das Zellpellet wurde zur Fusion verwendet. Dazu wurde 1 ml PEG langsam zu dem Zellpellet zugegeben und vorsichtig innerhalb von 1 min vermischt. Danach wurde PEG sehr langsam mit warmen DMEM, nach dem folgenden Protokoll, verdünnt: 1 min = 1 ml, 1 min = 1 ml, 1 min = 1 ml, 1 min = 1 ,5 ml, 1 min = 1 ,5 ml, 1 min = 2,5 ml, 1 min = 2,5 ml, 1 min = 5 ml, 1 min = 5 ml, 1 min = 5 ml, 1 min = 5 ml, 1 min = 5 ml, 1 min = 5 ml.
Dann wurden die fusionierten Zellen zentrifugiert (10 min bei 800 U/min) und der Überstand wurde vorsichtig entfernt. Dann wurde das Zellpellet resuspendiert (8 ml HAT-Medium pro 107 NS/1/0-Zellen) und die Zellen wurden in flachbödigen 96-Loch-Zellkulturplatten zur HAT- Selektion ausplattiert. Das Medium wurde jeden dritten Tag entfernt. Nach 10 bis 14 Tagen, wenn Zellklone sichtbar waren und das Medium durch die pH-Verschiebung gelb wurde, wurden Überstände auf sekretierte anti-human-CEACAM1 -Antikörper mittels Durchflusszytometrie und ELISA getestet. Positive Zellklone wurden subkloniert (= monoklonal), weiter getestet und für eine mAb-Produktion verwendet.
Anschließend wurden mAbs vom Zellkulturüberstand (beispielsweise 500 ml) über Protein G- Sepharose-Säulen (Säulenchromatographie) gereinigt, durch pH-Verschiebung unter Verwendung von 0, 1 M Glycin-Puffer (pH 2,5) eluiert und gegen sterile PBS dialysiert. Steril-filtrierte mAb-Lösung wurde verwendet, um die Ig-Konzentration durch Messung der OD280nm zu bestimmen und die Konzentration wurde unter Verwendung der Formel OD280nm/1 ,36 = x mg/ml berechnet.
1 .2.10 Statistische Analyse:
Daten wurde in Abbildungen als Mittelwerte ± S.E.M . (Statistischer Standardfehler des Mittels) und in Tabellen als Mittelwerte ± S.D. (Standartabweichung) ausgedrückt. Der Student t-Test (gepaart oder u ngepaart, einseitig oder zweiseitig) wurde eingesetzt, u m statistisch signifikante Differenzen zwischen Gruppen zu erfassen . Signifikante Differenzen zwischen verschiedenen Gruppen wurden durch einfaktorielle Varianzanalyse (one-way ANOVA, Analysis of Variance) mit Post-Hoc-Tests nach Bonferroni oder Dun nett erfasst. Das Überleben wurde mit Log -Ran k-Tests (Mantel-Cox-Tests) verglichen . Das statistische Signifikanzniveau wurde bei P < 0,05 festgelegt.
1.2.11 Charakterisierung Antikörperbindung
Zellen: CHO-Zellen wurden mit gesamt CEACAM 1 oder mit CEACAM 1 ohne N Domäne trans- fiziert (Muturi HAT et al. PLoS One. 2013 Sep 1 1 ;8(9):e74654.). ELISA: Sandwich ELISA wurde mit 0,25 μς/1 OOmicroL/well anti-CEA (Dako) beschichtet. ELISA wurde gewaschen und übrige Bindungsstellen blockiert. Im Anschluß wurden CEACAM 1 oder CEACAM I deltaN (daher CEACAM1 ohne N-Domäne, CEACAM I dN) dazugegeben. CEACAM1 und CEACAMI deltaN wurde aus CHO-Transfektanten gewonnen. Der ELISA wurde dann mit unterschiedlichen Antikörpern inkubiert. Nach 4 Stunden Inkubation wurde der ELISA gewa- sehen und mit anti-Maus Ig-HRP inkubiert. Nach 1 Stunde wurde das Substrat TMB zugegeben und die Absorption bei 450nm gemessen.
FACS: Zur Analyse der Antikörperbindung an humanen Immunzellen wurden PBMCs (= Periphere Blut Mononukleäre Zellen) mit anti-CEACAM1 Antikörpern bei 4°C für mindestens 20 Mi- nuten inkubiert. Danach wurden die Zellen gewaschen und es wurden anti-Mouse IgG-APC (eBioscience) zusammen mit anti-CD8 Antikörpern (eBioscience) dazugegeben. Nach 30 Minuten wurden die Zellen gewaschen und im FACS die Fluoreszenz gemessen.
1.2.12 Aktivierung von T -Zellen
In vitro Aktivierung CD8+ T Zellen: Um den Einfluß von anti-CEACAM1 Antikörper auf die Proliferation von CD8+ T Zellen zu analysieren, wurden PBMCs von HLA-A2+ CMV+ gesunden Spendern zusammen mit CMV-Peptid PP65-73 bzw. Influenza Matrixpeptide 57-68 zusammen mit IL2 in RPMI 10% human Serum für 10 bis 13 Tage inkubiert. Danach wurden die Zellen mit Antigen restimuliert und intrazelluläres IFN-gamma gemessen.
Intrazelluläres Zytokine staining: 100.000 Zellen wurden in 96 Lochplatte (U Boden) transfe- riert. Zellen wurden mit Peptid (1 Mg/ml) behandelt oder unbehandelt gelassen. Nach 2 Stunden wurden Brefeldin A dazugegeben (Sigma). Nach weiteren 6 bis 8 Stunden wurden Zellen mit anti-CD8 Antikörper (eBiosciences) inkubiert. Zellen wurden dann für 10 Minuten mit Formalin (2% in PBS) fixiert und 2x mit Saponin in FACS Buffer gewaschen. Im Anschluß wurden Zellen mit anti-IFN-gamma Antikörper (eBiosciences) inkubiert und die Fluoreszenz im FACS gemes- sen.
Ergebnisse: Die experimentellen Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen gezeigt:
Tabelle 2, B3-17, aber nicht 18-20 und 6G5J kann in Abwesenheit von N Domäne binden:
Tabelle zeigt die Bindung von den Antikörpern B3-17, 18-20 und 6G5J an CEACAM1 und CEACAM1 ohne N-Domäme (=CEACAM1 dN) gemessen im ELISA. Die Tabelle zeigt Mittelwer- te ± SD (Standardabweichung) der Absorption bei 450nm. Die Bindung von Antikörper 18-20 an CEACAM1 war signifikant höher als an CEACAM1 dN (18-20 CEACAM1 versus 18-20 CEACAM1 dN, p<0.05, t-test). Die Bindung von 6G5J an CEACAM1 war signifikant höher als an CEACAM1 dN (6G5J CEACAM1 versus 6G5J CEACAM1 dN p<0.05, t-test). Die Bindung von B3-17 an CEACAM1 war nicht höher als an CEACAM1 dN (B3-17 CEACAM1 versus B3-17 CEACAM1 dN). WT CEACAM1 CEACAM1 dN
(Mittelwert ± SD, n) (Mittelwert ± SD, n) (Mittelwert ± SD, n)
B3-17 0.05 ± 0.003, 3 0.62 ± 0.048, 3 0.910 ± 0.056, 3
18-20 0.06 ± 0.004, 3 1 .30 ± 0.093, 3 0.053 ± 0.0057, 3
6G5J 0.054 ± 0.004, 3 1 .09 ± 0.088, 3 0.066 ± 0.0053, 3
Die in Tabelle 2 dargestellen experimentellen Ergebnisse zeigen, dass die Antikörper, die eine Antikörperbindestelle CDR2H der Sequenz SEQ I D Nr. 21 aufweisen (d.h. Antikörper 18-20 und 6G5J), im Gegensatz zum Antikörper B3-17, der keine solche Antikörperbindestelle CDR2H aufweist, effektive an die N-Domäne des CEACAM1 binden.
Tabelle 3, B3-17 und 18-20 binden menschliche CD8+ T-Zellen: Tabelle zeigt die Bindung von Isotyp-Kontrolle und den Antikörpern B3-17 und 18-20 an CD8+ T Zellen aus dem Blut von gesunden Spendern. Die Tabelle zeigt Mittelwerte ± SD der mittleren Fluoreszenz Intensität. Die Bindung von Antikörper B3-17 an CD8+ T Zellen ist signifikant höher als die Bindung von Isotyp p < 0.05 (t-test, gepaart). Die Bindung von 18-20 an CD8+ T Zellen ist signifikant höher als die Bindung von Isotyp p < 0.05 (t-test, gepaart).
Figure imgf000054_0001
Die in Tabelle 3 dargestellen experimentellen Ergebnisse zeigen, dass die Antikörper auch an (menschliche) T-Zellen binden. Diese wurden dann im Falle der erfindungsgemäßen Antikörper 18-20 und 6G5J überraschend stark aktiviert (siehe unten Tabellen 4-6), wohingegen Antikörper B3-17 bei stimulierten deutlich weniger aktivierend wirkte.
Tabelle 4, 18-20, 6G5J, aber nicht B3-17 aktiviert CD8+ T-Zellen: PBMCs von gesunden Spendern wurden mit oder ohne CMV-Peptid in Anwesenheit oder Abwesenheit von Isotyp- Kontrolle und den Antikörpern 18-20, 6G5J oder B3-17 inkubiert. Am Tag 10 wurden die Zellen nicht weiter stimuliert oder für 8 Stunden mit CMV-Peptid restimuliert. Intrazelluläres IFN- gamma wurde im FACS gemessen. Die Tabelle zeigt die Prozent ± SD der IFN-gamma positiven CD8+ T Zellen. Anwesenheit von Antikörper 18-20 führte zur signifikanten Erhöhung der IFN-gamma positiven T Zellen (CMV stimuliert versus CMV, 18-20 stimuliert, p<0.05, t-test). Anwesenheit von B3-17 führte zu keiner signifikanten Erhöhung der IFN-gamma positiven T Zellen (CMV stimuliert versus CMV, B3-17 stimuliert, p =0,344, t-test). 18-20 stimuliert signifikant besser als B3-17 (CMV, 18-20 stimuliert versus CMV, B3-17 stimuliert, p <0.05, t-test).
Figure imgf000055_0001
Tabelle 5, 18-20 aktiviert Influenza-spezifischen CD8+ T-Zellen: PBMCs von gesunden Spendern wurden mit Influenza-Peptid zusammen mit anti-CD28 in Anwesenheit oder Abwesenheit von 18-20 Antikörper inkubiert. Nach 13 Tagen wurden die Zellen mit Influenza Peptid restimuliert und nach 6 Stunden wurde intrazelluläres IFN-gamma gemessen. Die Tabelle zeigt die Prozent ± SD der IFN-gamma positiven CD8+ T Zellen. Anwesenheit von Antikörper 18-20 führte zu signifikant mehr IFN-gamma produzierenden T Zellen (CD28 Stimuliert versus CD28 + 18-20 Stimuliert, p < 0.05 t-test).
Nicht stimmuliert Stimmuliert
(Mittelwert ± SD, n) (Mittelwert ± SD, n)
CD28 1 .12 ± 1 .99, 5 4.08 ± 4.33, 8 CD28 + 18-20 0.217 ± 0.150, 3 1 1 .74 ± 9.914, 10
Tabelle 6, humanisierte 18-20 aktiviert menschliche CD8+ T-Zellen: PBMCs von gesunden Spendern wurden mit oder ohne CMV-Peptid in Anwesenheit oder Abwesenheit von humanisierten 18-20 Antikörper inkubiert. Am Tag 10 wurden die Zellen mit CMV Peptid restimuliert und nach 8 Stunden wurde intrazelluläres IFN-gamma im FACS gemessen. Tabelle zeigt Prozent ± SD der I FN-gamma positiven CD8+ T Zellen. Anwesenheit von humanisiertem Antikörper 18-20 führte zur signifikanten Erhöhung der I FN-gamma positiven T Zellen (CMV stimuliert versus CMV +hu18-20 stimuliert, p<0.05, t-test).
Figure imgf000056_0001
Für die Bindung der Antikörper an CEACAM1 wurden folgende Bindungswerte ermittelt:
Antikörper 18-20: Kd 26 nM; Kon: 1 .2 x10"4; Koff: 3.5 x10"4
Antikörper 6G5J: Kd 23 nM; Kon: 1 .0 x10"4; Koff: 3.1 x10"4
Antikörper B3-17: Kd 10 nM; Kon: 3.4 x10"4; Koff: 3.4 x10"4 Alle drei Antikörper sind demnach im unteren zweistelligen nanomolaren Bereich bindend. Die unterschiede in der Aktivierung der T-Zellen kommen demnach nicht durch unetrschiedliche Gesamtbindungsstärken zustande, sondern durch die gezielte Bindung an die N-Domäne des CEACAM1 durch die erfindungsgemäßen Antikörper 18-20 und 6G5J.
Weitere Bevorzugte Ausführungsformen:
Die Erfindung betrifft auch eine Substanz zur Anwendung bei der Therapie von viralen Infektionen und/oder viralen Infektionskrankheiten, wobei die Substanz die Expression und/oder Funktion von CEACAM1 aktiviert.
Weiterhin betrifft die Erfindung eine Substanz zur Anwendung bei der Therapie von B-Zellabhängigen Krankheiten, wobei die Substanz die Expression und/oder Funktion von CEACAM1 inhibiert. Des Weiteren betrifft die Erfindung eine Substanz zur Anwendung bei der Diagnose von viralen Infektionen, viralen Infektionskrankheiten und/oder B-Zell-abhängigen Krankheiten, wobei die Substanz zum Nachweis der Expression und/oder Funktion von CEACAM1 verwendet wird.
Die Erfindung betrifft ferner einen Antikörper, einen therapeutischen Antikörper, eine variable Antikörper-Schwerketten-(VH)-Domäne, eine variable Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne, eine isolierte Nukleinsäure codierend für eine variable Antikörper-Schwerketten-(VH)-Domäne, eine isolierte Nukleinsäure codierend für eine variable Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne, eine Hybridomzelle sowie ein Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers.
Weitere Bevorzugte Ausführungsformen sind:
1 . Substanz zur Anwendung bei der Therapie von viralen Infektionen und/oder viralen Infektionskrankheiten, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz die Expression und/oder Funktion von CEACAM1 aktiviert.
2. Substanz nach Ausführungsform 1 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei CEACAM1 um CEACAM1 gemäß SEQ ID Nr. 1 handelt.
3. Substanz nach Ausführungsform 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Substanz um eine gegen CEACAM1 gerichtete Substanz handelt.
4. Substanz nach einem der vorhergehenden Ausführungsformen, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Substanz um einen gegen CEACAM1 gerichteten Antikörper (anti- CEACAM1 -Antikörper) handelt.
5. Substanz nach Ausführungsform 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper eine variable Antikörper-Schwerketten-(VH)-Domäne, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus variable Antikörper-Schwerketten-(VH)-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 3, variable Anti- körper-Schwerketten-(VH)-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 7 und variable Antikörper- Schwerketten-(VH)-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 1 1 , und/oder eine variable Antikörper- Leichtketten-(V|_)-Domäne, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus variable Antikör- per-Leichtketten-(V|_)-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 5, variable Antikörper-Leichtketten-(VL)- Domäne gemäß SEQ ID Nr. 9 und variable Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 13, aufweist.
6. Substanz nach einem der Ausführungsformen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Substanz um das lösliche Protein UspA1 von Moraxella catarrhalis gemäß SEQ ID Nr. 15 handelt. Substanz nach einem der Ausführungsformen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Substanz um das lösliche Protein Opa von Neisseria gnorrhoeae gemäß SEQ ID Nr. 17 handelt. Substanz nach einem der Ausführungsformen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Substanz um das lösliche variable Protein P5 von Haemophilus influenzae gemäß SEQ ID Nr. 18 handelt. Substanz nach einem der Ausführungsformen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Substanz um das lösliche humane rekombinante CEACAM1 -Fusionsprotein gemäß SEQ ID Nr. 19 handelt. Substanz nach einem der vorhergehenden Ausführungsformen, dadurch gekennzeichnet, dass die viralen Infektionen bzw. Infektionskrankheiten ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus virale Hepatitis, Hepatitis B, Hepatitis C, HIV-Infektion, Aids, Influenza, Poliomyelitis, virusinduzierte Myokarditis, Pfeiffer-Drüsenfieber, Herpes simplex, Zytomegalie, Tollwut und Ebola. Arzneimittel zur Anwendung bei der Therapie von viralen Infektionen und/oder viralen Infektionskrankheiten, enthaltend wenigstens eine Substanz nach einem der vorhergehenden Ausführungsformen. Antikörper, aufweisend eine variable Antikörper-Schwerketten-(VH)-Domäne gemäß SEQ ID Nr.3 und/oder eine variable Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne gemäß SEQ ID Nr.5. Therapeutischer Antikörper, aufweisend eine variable Antikörper-Schwerketten-(VH)- Domäne, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus variable Antikörper- Schwerketten-(VH)-Domäne gemäß SEQ ID Nr.3, variable Antikörper-Schwerketten-(VH)- Domäne gemäß SEQ ID Nr. 7 und Antikörper-Schwerketten-(VH)-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 1 1 , und/oder eine variable Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus variable Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne gemäß SEQ ID Nr.5, variable Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 9 und An- tikörper-Leichtketten-(V|_)-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 13. Variable Antikörper-Schwerketten-(VH)-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 7. Variable Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 9. Isolierte Nukleinsäure codierend für eine variable Antikörper-Schwerketten-(VH)-Domäne, wobei die Nukleinsäure eine Nukleotidsequenz aufweist oder aus einer Nukleotidsequenz besteht, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 4 und SEQ ID Nr. 8. Isolierte Nukleinsäure codierend für eine variable Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne, wobei die Nukleinsäure eine Nukleotidsequenz aufweist oder aus einer Nukleotidsequenz besteht, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 6 und SEQ ID Nr. 10. Hybridomzelle, welche einen Antikörper nach Ausführungsform 12 oder 13 produziert. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers, insbesondere eines Antikörpers nach Ausführungsform 12 oder 13, aufweisend die folgenden Schritte: a) Fusionieren von B-Zellen, welche aus einem gegen ein Antigen immunisierten Versuchstier stammen, und Myelomzellen unter Ausbildung von Hybridomzellen, b) Selektieren der Hybridomzellen, c) Isolieren von Hybridomzellen, welche gegen das Antigen gerichtete Antikörper produ- zieren, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Antigen um CEACAM1 gemäß SEQ ID Nr. 1 oder ein Fragment, insbesondere Epitop, davon handelt.

Claims

Patentansprüche
Anti-CEACAM1 -Antikörper, umfassend:
(A) mindestens eine Antikörper-Schwerketten-(VH)-Domäne enthaltend Antigenbin- dungsstellen CDR1 H, CDR2H und CDR3H, und
(B) mindestens eine Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne enthaltend Antigenbin- dungsstellen CDR1 L, CDR2L und CDR3L,
wobei CDR2H mindestens 80% Sequenzhomologie zu folgender Aminosäuresequenz aufweist:
WINTYTGEPT (SEQ ID Nr. 21 ).
Anti-CEACAM1 -Antikörper gemäß Anspruch 1 , wobei der Antikörper die N-Domäne von CEACAM1 gemäß SEQ ID Nr. 39 bindet, bevorzugt wobei der Antikörper zusätzlich mindestens eine weitere Domäne ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus A1 - Domäne von CEACAM1 gemäß SEQ ID Nr. 40, B-Domäne von CEACAM1 gemäß SEQ ID Nr. 41 und A2-Domäne von CEACAM1 gemäß SEQ ID Nr. 42 bindet.
Anti-CEACAM1 -Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei CDR2L die folgende Aminosäuresequenz aufweist:
YTSXb4LXb6Xb7 (SEQ ID Nr. 22), wobei Xb4, Xb6, und Xb7 jeweils unabhängig voneinander einen beliebigen Aminosäurerest darstellen,
insbesondere wobei:
Xb4 T oder K ist,
Xb6 Q oder H ist, und
Xb7 P oder S ist.
Anti-CEACAM1 -Antikörper gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 3, wobei CDR2L mindestens 80% Sequenzhomologie zu einer der folgenden Aminosäuresequenzen aufweist:
YTSTLQP (SEQ ID Nr. 23), oder
YTSKLHS (SEQ ID Nr. 24).
Anti-CEACAM1 -Antikörper einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 4, wobei CDR1 H die folgende Aminosäuresequenz aufweist:
GYXa3FXa5Xa6YXa8MXa10 (SEQ ID Nr. 25), wobei Xa3, Xas, a6, a8 und Xaio jeweils unabhängig voneinander einen beliebigen Aminosäurerest darstellen,
insbesondere wobei:
Figure imgf000061_0001
Xa6 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus V, N und T,
Xas G oder V ist, und
Xaio ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus N, K und H.
Anti-CEACAM1 -Antikörper gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 5, wobei CDR1 H mindestens 80% Sequenzhomologie zu einer der folgenden Aminosäuresequenzen aufweist:
GYTFTVYGMN (SEQ ID Nr. 26),
GYIFRNYGMK (SEQ ID Nr. 27), oder
GYTFTTYVMH (SEQ ID Nr. 28).
Anti-CEACAM1 -Antikörper gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6, wobei CDR1 L die folgende Aminosäuresequenz aufweist:
Xd1ASXd4Xd5IXd7Xd8Xd9LXdi i (SEQ ID Nr. 29) wobei Xdi , Xd4, Xd5, Xd7, Xd8, Xd9 und Xdn jeweils unabhängig voneinander einen beliebigen Aminosäurerest darstellen, bevorzugt wobei:
Xdi einen basischen Aminosäurerest darstellt, insbesondere K oder R ist,
Xd4 Q oder D ist,
Figure imgf000061_0002
Xd7 N oder S ist,
Figure imgf000061_0003
Xdg einen aromatischen Aminosäurerest darstellt, insbesondere ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus F, Y und W, und
Figure imgf000061_0004
Anti-CEACAM1 -Antikörper gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 7, wobei CDR1 L mindestens 80% Sequenzhomologie zu einer der folgenden Aminosäuresequenzen aufweist:
KASQDINKFLA (SEQ ID Nr. 30),
RASQDISNYLN (SEQ ID Nr. 31 ), oder KASDHINNWLA (SEQ ID Nr. 32).
Anti-CEACAM1 -Antikörper gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 8, aufweisend: eine variable Antikörper-Schwerketten-(VH)-Domäne mit mindestens 80% Sequenzhomologie zu SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 7; und/oder
eine variable Antikörper-Leichtketten-(VL)-Domäne mit mindestens 80% Sequenzhomologie zu SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 9.
Anti-CEACAM1 -Antikörper gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Bindung des Antikörpers an CEACAM1 eine Dissoziationskonstante Kd von nicht mehr als 50 nM aufweist.
1 1 . Anti-CEACAM1 Antikörper, der die N-Domäne von CEACAM1 gemäß SEQ ID Nr. 39, und bevorzugt mindestens eine weitere Domäne ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus A1 -Domäne von CEACAM1 gemäß SEQ ID Nr. 40, B-Domäne von CEACAM1 gemäß SEQ ID Nr. 41 und die A2-Domäne von CEACAM1 gemäß SEQ ID Nr. 42 bindet.
12. Anti-CEACAM1 -Antikörper gemäß Anspruch 1 1 , wobei der Anti-CEACAM1 -Antikörper ein Antikörper gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 10 ist.
13. Nukleinsäure, kodierend für einen der Anti-CEACAM1 -Antikörper gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 12.
14. Anti-CEACAM1 -Antikörper gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 12 zur Ver- wendung in einem Verfahren zur Behandlung und/oder Prävention von Neoplasien und/oder Infektionen, insbesondere wobei die Neoplasien maligne Tumore und/oder Krebs sind und/oder die Infektionen virale Infektionen oder virale Infektionskrankheiten sind.
Verfahren zur Aktivierung von T-Zellen in vitro, umfassend die folgenden Schritte:
(i) Bereitstellen von nicht-aktivierten T-Zellen;
(ii) Inkontaktbringen der nicht-aktivierten T-Zellen mit:
(a) einem Anti-CEACAM1 -Antikörper gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 12, und
(b) einem Epitop gegen das die T-Zellen gerichtet sind; und
(iii) Kultivieren der gemäß Schritt (ii) behandelten T-Zellen unter Bedingungen, die die Aktivierung der T-Zellen nicht behindern.
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