KR102166982B1 - 간암에서 CEACAM1 및 EpCAM의 상관관계 및 이를 이용한 간암 치료효과에 대한 정보를 제공하는 방법 - Google Patents

간암에서 CEACAM1 및 EpCAM의 상관관계 및 이를 이용한 간암 치료효과에 대한 정보를 제공하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 간암에서 간암에서 CEACAM1 및 EpCAM의 상관관계 및 이를 이용한 간암 치료효과에 대한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서는 Huh7-EpCAMhigh세포에서 CEACAM1 발현이 양의 상관관계가 있음을 확인하였다. 또한, EpCAMhigh 간암 줄기세포에서 CEACAM1의 발현을 억제하면 NK세포에 의한 세포독성이 증가되어 간암세포가 효과적으로 사멸되는 것을 확인하였으므로, 본 발명은 EpCAM 발현 간암 환자의 CEACAM1 발현 억제를 통한 간암 치료에 대한 정보 제공방법, CEACAM1 발현 억제제 및 항-CEACAM1 항체를 처리한 NK세포를 포함하는 간암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 효과적으로 제공할 수 있다.

Description

간암에서 CEACAM1 및 EpCAM의 상관관계 및 이를 이용한 간암 치료효과에 대한 정보를 제공하는 방법{Correlation of CEACAM1 and EpCAM in liver cancer and Methods for providing information for liver cancer therapeutic effect using using the same}
본 발명은 간암에서 간암에서 CEACAM1 및 EpCAM의 상관관계 및 이를 이용한 간암 치료효과에 대한 정보를 제공하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 EpCAM 발현이 높은 간암 환자의 CEACAM1 발현 억제를 통한 간암 치료효과에 대한 정보를 제공하는 방법 및 CEACAM1 발현 억제제 및 항- CEACAM1 항체를 처리한 NK세포를 유효성분으로 포함하는 간암치료용 조성물에 관한 것이다.
간암은 국내에서 전체 암 사망률의 151%로 사망률이 두 번째로 높은 암의 종류다. 크기가 3cm 미만이 작은 간암(소간암)은 특별한 치료 없이도 1년간 생존할 확률이 90%에 이르며 수술을 하였으면 5년 생존율이 40~50%에 이를 정도로 예후가 좋은 것으로 알려져 소간암의 조기 진단이 중요하다. 그러나 발견 당시에 암이 상당히 진행된 경우가 흔하며 간경변증 등으로 간이 나빠져 치료를 하더라도 재발하는 환자가 많아, 간암 수술환자의 70%가 5년 이내에 다시 재발하는 높은 재발률을 보이고 있으며 재발한 간암의 치료 예후 또한 좋지 않아 근본적인 암 재발 억제 및 진행 암에 대한 약효 성이 높은 치료제 개발이 필요한 상황이다.
상피 세포 부착 분자 EpCAM(CD326 또는 ESA로도 알려짐)는 상피 세포-세포 부착을 촉진 및 억제할 수 있는 다면발현성 분자이다. 상기 EpCAM은 30-40 kDa 크기의 다양한 인간 상피 조직에서 낮은 수준으로 발현되는 타입Ⅰ 당화(glycosylated) 막 단백질로, 대부분의 고형 암에서 고발현된다. EpCAM은 길항성 세포 사멸(antagonising apoptosis)보다는 증식을 유도하여 원발암유전자(protooncogene) c-myc 및 사이클린 A 및 E, 및 Wnt 경로에 의한 세포 핵으로의 신호 전달을 상향조절하는 세포주기에 직접적인 영향을 준다. 유방암, 대장암, 췌장암 및 간암과 같은 다수의 고형암에서 암 줄기세포에서 EpCAM이 발현되는 것으로 보고되었으며, 다양한 암에서의 EpCAM 발현하는 경우 환자의 예후가 좋지 않은 것으로 보고되었다.
암배아 항원-관련 세포 부착 분자 1(Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1, 이하 CEACAM1)은 암배아 항원(carcinoembryonic antigen) 그룹에 속하는 것으로 생체의 막관통 당단백질 중 하나이다. 사람에게서는 CEACAM1, CEACAM3, CEACAM4, CEACAM5, CEACAM6, CEACAM7 및 CEACAM8이 발현된다. 그 중, CEACAM1은 활성화된 T세포 및 자연살해 세포에서 주로 발현되며 암세포에서 높은 발현을 보인다. 이외에도 상피세포, 내피세포, 및 조혈모세포에서도 낮은 발현을 보인다.
또한, CEACAM1은 또한 선천성 및 적응 면역반응의 조절에 역할을 담당한다 (Morales et al., J. Immunol., 163:1363-1370, 1999). CEACAM1은 PD-1 및 CTLA-4와 같은 면역 체크포인트 물질로서 면역 체크포인트 경로를 활성화시킨다. 면역체크포인트 경로는 생리학적 조건하에서 면역계에 의한 손상으로부터 조직을 보호하고, 자기 면역관용(selftolerance)을 유지하기 위해 협력하여 작용하는 다양한 공동 자극성 및 억제성 분자로 이루어진다. CEACAM1이 활성화되면 T세포 및 자연살해 세포의 동종 친화성 상호작용이 림프구 세포독성 효과의 억제를 유도하여 면역을 회피할 수 있다. 따라서, 암세포에서 상기 면역 체크포인트 경로를 억제시키는 것이 유망한 항암 치료 전략법으로서 부상하였다.
또한, 여러 인간 종양 유형에 관한 연구 결과, CEACAM1 신호전달 경로를 이용함으로써 종양이 면역을 회피할 수 있다는 것이 보고되었고, 종양에 관한 전임상 동물 모델에서는 모노클로날 항체(mAb)를 이용하여 CEACAM1 상호작용을 차단한다면, 종양에 대한 면역 반응을 증진시킬 수 있는 것으로 나타났다.
이에, 본 발명자들은 간암 줄기세포 표지자인 EpCAM을 발현하는 간세포암에서 CEACAM1과의 상관관계를 밝히고자 노력한 결과, EpCAM의 발현과 CEACAM1의 발현이 양의 상관관계가 있음을 확인하였으며, 이를 통해, EpCAM의 발현이 높은 간암줄기세포(Huh7-EpCAMhigh)에서 CEACAM1의 발현을 억제하면 NK세포에 의한 세포독성을 증가시켜 간암줄기세포를 효과적으로 사멸시키는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 CEACAM1 발현 억제를 이용한 간암 치료 효과에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 항-CEACAM1 항체를 처리한 NK세포를 포함하는 간암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 EpCAMhigh세포를 이용한 CEACAM1 발현 억제제 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위해
본 발명은 정상 대조군과 비교하여 EpCAM 발현이 증가된 간암 환자에 대해 CEACAM1 발현 억제제 투여 효과 예측에 관한 정보를 제공하는 단계를 포함하는 CEACAM1 발현 억제를 이용한 간암 치료 효과에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 EpCAM 발현이 증가된 간암 환자는 EpCAMhigh 간암 세포를 발현할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 있어서, 상기 CEACAM1 발현 억제제 투여에 의해 간암 세포 사멸이 촉진될 수 있으며, 상기 간암 세포 사멸 촉진은 CEACAM1 발현 억제제 투여에 의해 자연살해 세포의 활성이 촉진되어 유도될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 CEACAM1 발현 억제제는 CEACAM1 유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, 앱타머 및 항체로 이루어진 군 중 1종 이상일 수 있다.
본 발명은 또한, 항-CEACAM1 항체를 처리한 자연살해 세포를 유효성분으로 포함하는 간암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 간암은 EpCAM 발현이 정상 대조군과 비교하여 증가된 것으로, 특히 EpCAMhigh 간암 줄기 세포를 발현할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 있어서, 상기 자연살해 세포는 항-CEACAM1 항체 처리에 의해 암세포에서 발현되는 CEACAM1와 리간드 결합이 차단될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 CEACAM1 억제제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 CEACAM1 억제제는 CEACAM1 유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, 앱타머 및 항체로 이루어진 군 중 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 CEACAM1 억제제에 의해 자연살해 세포의 활성이 촉진되어 간암 줄기세포 사멸이 유도될 수 있다.
본 발명은 또한, EpCAMhigh 간암 줄기세포를 이용한 CEACAM1 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 스크리닝 방법은
(a) EpCAMhigh 간암 줄기세포에 CEACAM1 억제제 후보 물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 후보 물질 처리 후, CEACAM1 발현 정도를 측정하는 단계; 및
(c) 상기 CEACAM1 발현 정도가 후보 물질을 처리하지 않는 대조군에 비해 감소한 후보 물질을 선별하는 단계;를 통해 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에서, 상기 스크리닝 방법은
(a) EpCAMhigh 간암 줄기세포에 CEACAM1 억제제 후보 물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 후보 물질 처리 후, EpCAMhigh 간암 줄기세포와 자연살해 세포를 공동배양 하는 단계; 및
(c) 자연살해 세포에 의한 EpCAMhigh 간암 줄기세포 사멸율을 측정하고, 후보 물질을 처리 하지 않는 대조군에 비해 사멸율이 높은 후보 물질을 선별하는 단계;를 통해 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에서, 상기 EpCAMhigh 간암 줄기세포는 Huh7-EpCAMhigh세포일 수 있다.
본 발명은 간암에서 간암에서 CEACAM1 및 EpCAM의 상관관계 및 이를 이용한 간암 치료효과에 대한 정보를 제공하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에서는 Huh7-EpCAMhigh세포에서 CEACAM1 발현이 양의 상관관계가 있음을 확인하였다. 또한, EpCAMhigh 간암 줄기세포에서 CEACAM1의 발현을 억제하면 NK세포에 의한 세포독성이 증가되어 간암세포가 효과적으로 사멸되는 것을 확인하였으므로, 본 발명은 EpCAM 발현 간암 환자의 CEACAM1 발현 억제를 통한 간암 치료에 대한 정보 제공방법 및 CEACAM1 발현 억제제 및 항-CEACAM1 항체를 처리한 NK세포를 포함하는 간암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, EpCAMhigh 간암 줄기세포를 이용한 CEACAM1 발현 억제제 스크리닝 방법을 제공할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 EpCAM+ 환자군에서 수술 후 간암 재발이 높은 것을 확인한 데이터이다.
도 2는 EpCAM+ 환자군에서 AFP, Ki67 발현을 확인한 데이터이다.
도 3은 Huh7-EpCAMhigh, Huh7-EpCAMlow 세포의 분류(A) 및 NK세포에 대한 저항성(B)을 확인한 데이터이다.
도 4는 Huh7-EpCAMhigh 세포에서 CEACAM1의 발현을 확인한 데이터이다.
도 5는 Huh7-EpCAMhigh, Huh7-EpCAMlow 세포에서 CEACAM1의 발현을 확인한 데이터이다.
도 6은 EpCAM+ 환자군의 혈청(Serum)에서 CEACAM1 단백질 발현을 확인한 데이터이다.
도 7은 간암환자 조직에서 EpCAM 및 CEACAM1 단백질 발현양상을 확인한 데이터이다.
도 8은 CEACAM1의 발현을 억제시킨 Huh7 세포에서 NK세포의 세포독성증가 확인한 데이터이다.
A는 shRNA를 활용하여 CEACAM1을 넉다운(Knockdown)하였을 때, CEACAM1 발현량을 확인한 데이터이며, B는 CEACAM1을 넉다운한 Huh7 세포 및 NK세포를 공동배양하였을 때, 세포 독성 정도를 확인한 데이터이다.
도 9는 Huh7 세포에 항 CEACAM1 항체를 처리한 NK세포를 공동배양 하였을 때, 세포 독성 정도를 확인한 데이터이다.
도 10은 Huh7-EpCAMhigh 세포 및 NK세포를 공동배양 하였을 때, 세포 독성 정도를 확인한 데이터이다.
도 11은 CEACAM1의 발현을 억제시킨 Huh7 세포에 항 CEACAM1 항체를 처리한 NK세포를 공동배양 하였을 때, 세포 독성 정도를 확인한 데이터이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
일 관점에서 본 발명은,
정상 대조군과 비교하여 EpCAM 발현이 증가된 간암 환자에 대해 CEACAM1 발현 억제제 투여 효과 예측에 관한 정보를 제공하는 단계를 포함하는 CEACAM1 발현 억제를 이용한 간암 치료 효과에 관한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 상기 정보를 제공하는 방법은
(a) 간암 환자의 생물학적 시료로 부터 EpCAM 발현 정도를 확인하는 단계;
(b) 정상 대조군과 비교하여 EpCAM 발현이 증가된 간암 환자에 대해 CEACAM1 발현 억제제 투여 효과 예측에 관한 정보를 제공하는 단계;를 포함하는 방법으로 수행될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 시료는 환자로부터 채취한 조직 또는 혈액일 수 있으며, DNA를 함유하는 특정 조직 또는 기관으로부터 유래될 수 있다. 조직의 대표적인 예로는 결합, 피부, 근육 또는 신경 조직이 포함된다. 기관의 대표적인 예로는, 눈, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 소장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선 및 내부 혈관이 포함된다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계에서 CEACAM1 발현 억제제 투여에 의해 간암 줄기세포 사멸이 촉진되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 구체적으로, CEACAM1 발현 억제제 투여에 의해 자연살해 세포의 활성이 촉진되어 간암 세포에 대한 자연살해 세포(이하, NK 세포로 표기함)의 독성이 증가하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 CEACAM1 발현 억제제는 CEACAM1 유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, 앱타머, 항체 및 화합물로 이루어진 군 중 1종 이상인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에서는 서열번호 1의 염기서열로 구성된 CEACAM1 shRNA를 사용하였다.
본 발명에서는 간암 환자의 생존율을 추적 관찰한 결과 도 1에 나타난 바와 같이, EpCAM 발현 환자(EpCAM+ 환자)에서 EpCAM 미발현 환자(EpCAM- 환자)보다 수술 후 간암 재발이 높은 것을 확인하였다. 또한, 도 2에 나타난 바와 같이, 간암 표지자로 사용되고 있는 AFP(alpha-fetoproteinP) 및 Ki67의 수치가 EpCAM+ 환자군에서 유의미 하게 높은 것을 확인하였다.
간암에서 EpCAM 발현에 의한 영향을 좀 더 구체적으로 확인하기 위해, 본 발명의 구체적인 일구현예에서는, 간암 줄기세포인 Huh7를 EpCAM 발현 정도에 따라 상,하 위 10퍼센트로 분리하였다. Huh7-EpCAMhigh세포 및 Huh7-EpCAMlow 세포의 NK 세포에 대한 저항성을 확인한 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 간암 줄기세포에서 EpCAM 발현이 높은 경우 NK세포의 세포독성에 저항성이 높음을 확인하였다.
또한, 본 발명의 구체적인 다른 일구현예에서는, Huh7-EpCAMhigh 세포 및 Huh7-EpCAMlow 세포에서 NK 세포와 결합 가능한 리간드가 발현되는 것을 확인하였다. 도 4에 나타난 바와 같이, 리간드 중에서 CEACAM1의 발현이 Huh7-EpCAMhigh 세포 및 Huh7-EpCAMlow 세포에 따라 확연하게 차별되는 것을 확인하였다.
CEACAM1은 활성화된 T세포 및 자연살해 세포에서 주로 발현되며 암세포에서 높은 발현을 보이는 것으로 알려져있으며, 암세포에서 발현되게되면 NK 세포의 저해 리간드(inhibition ligand)로 작용하여 NK세포에 의한 세포독성 효과를 억제하게 된다.
도 5에 나타난 바와 같이, Huh7-EpCAMhigh 세포 및 Huh7-EpCAMlow 세포에서 CEACAM1 발현을 확인한 결과, EpCAM의 발현과 CEACAM1의 발현이 양성적 상관관계를 나타냄을 확인하였으며, 도 6에 나타난 바와 같이, 간암 환자의 혈청(serum)에서 CEACAM1을 확인해본 결과, EpCAM- 환자군에 비해 EpCAM+ 환자군에서 CEACAM1 단백질 발현 수준이 유의미하게 높은 것을 확인하였다.
또한, 도 7에 나타난 바와 같이, 환자의 간암 조직에서 EpCAM 및 CEACAM1 단백질 발현량을 확인한 결과, EpCAM의 발현과 CEACAM1의 발현이 양성적 상관관계를 나타냄을 확인하였다.
본 발명의 구체적인 또 다른 일구현예에서, CEACAM1 발현 억제에 따른 NK세포의 세포 독성 정도를 확인하였다. 도 8에 나타난 바와 같이, shRNA를 이용하여 Huh7 세포에서 CEACAM1을 넉다운(Knockdown) 시킨 결과, 대조군에 비해 CEACAM1 발현을 억제시킨 경우 NK세포의 세포독성이 증가한 것을 확인하였다.
즉, EpCAM의 발현이 높은 간암줄기세포에서 CEACAM1의 발현이 감소되면 NK세포에 의한 간암줄기세포 사멸이 증가하는 것을 확인하였으며, CEACAM1 발현 억제를 통해 간암, 특히 EpCAM의 발현이 높은 것으로 확인된 간암의 치료에 대한 정보를 제공할 수 있다.
다른 관점에서 본 발명은, 항-CEACAM1 항체를 처리한 자연살해 세포를 유효성분으로 포함하는 간암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 간암은 EpCAM 발현이 정상 대조군과 비교하여 증가된 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 EpCAMhigh 간암 줄기 세포를 발현하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 자연살해 세포는 항-CEACAM1 항체 처리에 의해 간암 세포에서 발현된 CEACAM1 리간드와 결합이 차단되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 구체적인 일구현예에서, NK 세포에 항-CEACAM1 항체를 처리하였을 때 NK 세포의 활성이 증가하는지 확인하고자 하였다. 도 9에 나타난 바와 같이, Huh7 세포 및 항-CEACAM1 항체를 처리한 NK 세포를 공동배양 하였을 때 NK 세포의 세포독성이 증가하여 간암 세포인 Huh7 세포 사멸율이 높아진 것을 확인하였다.
또한, Huh7-EpCAMhigh 세포와 Huh7-EpCAMlow세포에 각각 항-CEACAM1 항체를 처리한 NK 세포를 공동배양 하였다. 도 10에 나타난 바와 같이, NK 세포에 대한 저항성이 높은 Huh7-EpCAMhigh세포에서도 항-CEACAM1 항체를 처리한 NK 세포에 의한 세포 독성이 높게 나타난 것을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 CEACAM1 억제제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 CEACAM1 발현 억제제는 CEACAM1 유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, 앱타머, 항체 및 화합물로 이루어진 군 중 1종 이상인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에서는 서열번호 1의 염기서열로 구성된 CEACAM1 shRNA를 사용하였다.
본 발명에 있어서, 상기 CEACAM1 억제제에 의해 자연살해 세포의 활성이 촉진되어 간암 줄기세포 사멸이 유도되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 구체적인 다른 일구현예에서, CEACAM1 발현 억제 및 항-CEACAM1 항체를 처리한 NK세포 투여를 동시에 진행하였을 때, 간암 세포 사멸율이 증가하는지 확인한 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, NK 세포에 의한 세포 독성이 현저하게 증가한 것을 확인하였다.
즉, CEACAM1 억제제 및 항-CEACAM1 항체를 처리한 NK 세포를 동시에 처리하면 NK 세포에 의한 세포 독성이 증가하여 간암 세포의 사멸율이 현저하게 증가하므로, 간암 치료 효능이 극대화 될 수 있다.
또 다른 관점에서 본 발명은, EpCAMhigh 간암 줄기세포를 이용한 CEACAM1 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.
구체적으로 상기 스크리닝 방법은
(a) EpCAMhigh 간암 줄기세포에 CEACAM1 억제제 후보 물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 후보 물질 처리 후, CEACAM1 발현 정도를 측정하는 단계; 및
(c) 상기 CEACAM1 발현 정도가 후보 물질을 처리하지 않는 대조군에 비해 감소한 후보 물질을 선별하는 단계;를 통해 수행될 수 있으며,
또한, 상기 스크리닝 방법은
(a) EpCAMhigh 간암 줄기세포에 CEACAM1 억제제 후보 물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 후보 물질 처리 후, EpCAMhigh 간암 줄기세포와 자연살해 세포를 공동배양 하는 단계; 및
(c) 자연살해 세포에 의한 EpCAMhigh 간암 줄기세포 사멸율을 측정하고, 후보 물질을 처리 하지 않는 대조군에 비해 사멸율이 높은 후보 물질을 선별하는 단계;를 통해 수행되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 EpCAMhigh 간암 줄기세포는 Huh7-EpCAMhigh세포인 것을 특징으로 할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
EpCAM+ 환자에서 간암 재발율 확인 및 간암 표지자 발현 확인
1-1 : 간암 재발 확인
EpCAM 및 간암의 예후와의 관계를 확인하기 위해, 간암 환자의 생존율을 추적 관찰하였다.
근치적 간절제술을 받은 간암 환자 280명을 대상으로 조사하였다. 예후 측정방법은 카플란-마이어 생존 곡선(Kaplan-Meier survival curve)을 이용하였으며, 통계 분석은 로그순위 검정(logrank test)을 사용하여 무재발 생존기간을 비교하였다.
EpCAM+ 와 EpCAM- 환자는 면역조직화학 염색을 통해서 EpCAM을 발현하는 간암 세포가 존재하면 EpCAM+, 존재하지 않으면 EpCAM-로 명명하였으며, EpCAM 양성 간암조직의 경우, 모든 암세포가 EpCAM을 발현하는 경우도 있으며, 또한 일부의 암세포만이 EpCAM을 발현하는 경우도 포함하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, EpCAM 발현 환자(EpCAM+ 환자)에서 EpCAM 미발현 환자(EpCAM- 환자)보다 수술 후 간암 재발이 높은 것을 확인하였다.
1-2 : 간암 표지자 발현 확인
간암 환자의 혈액을 분리하여 혈청 속에 포함된 간암 표지자로 사용되고 있는 AFP(alpha-fetoproteinP)의 경우 서울성모병원 병리과에서 혈액분석을 진행하여 측정하였다. Ki67 측정 역시 서울성모병원 병리과에서 진행하였으며, 간암 환자의 수술에서 수득한 조직을 면역화학염색(Immunohistochemistry; IHC) 방법으로 염색하여 Ki67 수치를 측정하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, AFP 및 Ki67의 수치가 EpCAM- 환자군에 비해 EpCAM+ 환자군에서 유의미하게 높은 것을 확인하였다.
EpCAM 발현에 따른 NK 세포에 대한 저항성 확인
2-1 : EpCAM 발현 세포 분리
HCC 세포주 중에서 Huh7 세포(한국세포주 은행)를 간암줄기세포 마커인 EpCAM(BD biosciences, cat. 347198)으로 염색한 후, FACS(Fluorescence-activated cell sorter)를 이용하여 간암 줄기세포인 Huh7를 EpCAM 발현 정도에 따라 분류하였다. EpCAM 발현이 상위 10%인 그룹을 Huh7-EpCAMhigh세포로, EpCAM 발현이 상위 10%인 그룹을 Huh7-EpCAMlow 세포로 분류하였다 (도 3A).
상기에서 분리한 Huh7-EpCAMhigh세포 및 Huh7-EpCAMlow 세포의 NK 세포(건강한 사람에서 채혈 후 MACS(Magnetic-activated cell sorting)를 활용하여 분리)에 대한 저항성을 확인하기 위해 Huh7-EpCAMhigh세포 및 Huh7-EpCAMlow 세포가 1Х105 세포/웰이 되도록 24웰 플레이트에 분주하였다. 그 다음, NK 세포가 Huh7-EpCAMhigh세포 또는 Huh7-EpCAMlow 세포와 각각 1(1Х105 세포/웰):1 또는 5(5Х105 세포/웰):1비율이 되도록 첨가하여 공동배양하였다.
배양시 각 웰에는 RPMI1640 배지를 2 ㎖씩 첨가하였으며, 6시간 동안 공동배양을하며 NK세포의 활성을 돕기위해 IL-12를 10 ng/㎖를 함께 첨가하였다. 6시간 이후에 트립신-EDTA를 활용하여 플레이트에서 Huh7-EpCAMhigh세포 및 Huh7-EpCAMlow세포를 회수한 다음, 원심분리하여 세포를 침전시켰다. 침전된 세포에 1 ㎖의 1X PBS 첨가하여 세포를 재현탁시킨 다음, FACS 튜브로 세포를 옮겼다. 3 ㎖의 1X PBS 첨가한 다음, 원심분리하여 세포를 침전시킨 후, 침전된 세포에 200 ㎕의 1X PBS를 첨가하여 세포를 재현탁 시켰다. 세포가 포함된 튜브에 사멸된 세포를 염색하는 시약(To-pro-3 iodide)을 1 ㎕ 첨가한 다음, FACS 기기를 사용하여 NK세포에 의한 Huh7-EpCAMhigh세포 및 Huh7-EpCAMlow 세포사멸을 측정하였다.
그 결과, 도 3B에 나타난 바와 같이, 간암 줄기세포에서 EpCAM 발현이 높은 경우 NK세포의 세포독성에 저항성이 높음을 확인하였다.
2-2 : EpCAM 발현 간암 세포에서 NK 세포와 결합 가능한 리간드 확인
Huh7-EpCAMhigh 세포 및 Huh7-EpCAMlow 세포에서 NK 세포와 결합 가능한 리간드가 존재 하는지 확인하고자 하였다.
구체적으로, NK(Natural Killer)세포와 암세포가 결합할 때, NK세포를 활성을 촉진 또는 저해 시킬 수 있는 수용체(receptor)와 결합하는 리간드(ligands)의 발현 정도를 확인하기 위해 잘 알려진 리간드들(MHC-1, ICAM1, CEACAM1, ULBP-1, ULBP-2, ULBP-3, TRAIL-R1, HLA-G, MIC A/B)을 형광염색 하여 FACS기기를 사용하여 확인하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 리간드 중에서 CEACAM1의 발현이 Huh7-EpCAMhigh 세포 및 Huh7-EpCAMlow 세포에 따라 확연하게 차이가 나는 것을 확인하였다.
EpCAM 및 CEACAM1의 상관관계 확인
3-1 : Huh7 세포에서 EpCAM 및 CEACAM1 발현정도 확인
본 발명에서는 EpCAM 및 CEACAM1간의 상관 관계를 확인하기 위해, Huh7-EpCAMhigh 세포 및 Huh7-EpCAMlow 세포에서 CEACAM1 발현정도를 확인하였다.
Huh7 세포를 APC-항-EpCAM 항체를 이용하여 염색한 후, FACS 기기(FACS ARIAⅢ Sorter)를 사용하여 Huh7-EpCAMhigh세포 및 Huh7-EpCAMlow세포를 분리하였다. 분리된 세포에 RIPA 버퍼를 200 ㎕ 첨가하여 세포를 용해시켰다. 그 다음, 단백질을 분리하여 웨스턴 블랏을 통해 각 세포에서 CEACAM1 단백발현을 확인하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, Huh7-EpCAMlow 세포에 비해 Huh7-EpCAMhigh 세포에서 CEACAM1 발현이 높은 것을 확인하였다.
3-2 : 간암 환자 혈청에서 EpCAM 및 CEACAM1 발현정도 확인
본 발명에서는 EpCAM 및 CEACAM1간의 상관 관계를 확인하기 위해, 간암 환자를 EpCAM- 환자군 및 EpCAM+ 환자군으로 나눈 다음, 각 환자의 혈청(serum) 속에 포함된 CEACAM1 농도를 ELISA 키트(Duo Set Human CEACAM-1/CD66a ELISA kit; R&D SYSTEMS, Cat.DY2244)를 사용하여 측정하였다.
도 6에 나타난 바와 같이, 간암 환자의 혈청(serum)에서 CEACAM1을 확인해본 결과, EpCAM- 환자군에 비해 EpCAM+ 환자군에서 CEACAM1 단백질 발현 수준이 유의미하게 높은 것을 확인하였다.
3-3 : 간암 조직에서 EpCAM 및 CEACAM1 발현정도 확인
또한, 간암 환자의 조직을 수득한 다음, 공지된 방법으로 조직에서 단백질을 분리하였다.
구체적으로, 간암 환자의 조직 수득의 경우 수술 후 수술 표본을 파라핀 블록(block)으로 제작하였다. 상기 조직을 잘게 자른 후, 마이크로비드(microbeads)가 있는 튜브에 RIPA 버퍼와 함께 첨가하여 균질화기(homogenizer)를 이용하여 분쇄하였다. 분쇄물을 원심분리한 다음, 상층액만 따로 회수하여 보관하였다. 상기 상층액에서 단백질을 분리한 다음, 웨스턴 블롯을 이용하여 EpCAM 및 CEACAM1 단백질 발현향을 확인하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, EpCAM 발현이 높은 경우 대부분 CEACAM1도 발현이 높은 것으로 확인되었다. 즉, EpCAM의 발현과 CEACAM1의 발현이 양성적 상관관계를 나타냄을 확인하였다.
CEACAM1 발현 억제에 따른 NK세포 활성 증가
4-1 : CEACAM1의 발현을 넉다운(Knockdown)시킨 Huh7 세포주 제작
CEACAM1의 발현 여부와 NK세포의 세포독성에 대한 상관관계를 확인하기 위해, shCEACAM1(SIGMA-ALDRICH, Lentiviral Transduction Particles, Clone ID:NM_001712.3-2050s21c1; 서열번호 1 : CCG GCT ATC ACT CTA ATT CGG ATT TCT CGA GAA ATC CGA ATT AGA GTG ATA GTT TTT G)을 Huh-7세포에 처리하여 CEACAM1의 발현이 넉다운(Knockdown)된 세포주(stable cell line)을 획득하였다 (도 8A).
4-2 : CEACAM1 발현 억제에 따른 NK세포의 세포 독성 확인
상기 실시예 4-1에서 제작한 CEACAM1 넉다운 Huh7 세포에 대한 NK 세포 독성은 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 수행하였다.
도 8B에 나타난 바와 같이, shRNA를 이용하여 Huh7 세포에서 CEACAM1을 넉다운(Knockdown) 시킨 결과, 대조군에 비해 CEACAM1 발현을 억제시킨 경우 NK세포의 세포독성이 증가한 것을 확인하였다.
즉, EpCAM의 발현이 높은 간암줄기세포에서 CEACAM1의 발현이 감소되면 NK세포에 의한 간암줄기세포 사멸이 증가하는 것을 확인하므로, EpCAM의 발현이 높은 것으로 확인된 간암 치료에 CEACAM1 발현 억제제의 투여 여부에 대한 정보를 제공할 수 있다.
항-CEACAM1 항체를 이용한 NK 세포의 세포독성증가 확인
5-1 : 항-CEACAM1 항체를 처리한 NK 세포 공동배양에 따른 세포 독성 확인
본 발명에서는 NK 세포에 항-CEACAM1 항체를 처리하였을 때 NK 세포에 의한 간암 세포 독성이 증가하는지 확인하고자 하였다. 대조군으로 IgG를 처리하였다.
먼저, 건강한 사람에게서 얻은 혈액에서 MACS(Magnetic-activated cell sorting)를 활용하여 분리한 NK 세포를 두 그룹으로 나누어서 한쪽에는 항-pan CEACAM1 항체(abcam, Cat.ab4567)를 20 ㎍/㎖ 첨가하고, 나머지 한쪽은 대조군으로써 항-IgG(Santacruz, sc-3877)를 20 ㎍/㎖ 첨가한 다음, 30분 동안 37℃, 5% CO2 에서 배양하였다. 그 다음, 1X PBS를 첨가하고 원심분리하여 세척하였으며, 3번 반복하였다. 세척이 완료된 Huh7 세포는 1Х105 세포/웰이 되도록 24웰 플레이트에 분주한 다음, 실시예 2-1과 동일한 방법으로 NK세포에 의한 Huh7세포 세포사멸을 측정하였다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, Huh7 세포 및 항-CEACAM1 항체를 처리한 NK 세포를 공동배양 하였을 때 NK 세포의 세포독성이 증가하여 Huh7 세포 사멸율이 높진 것을 확인하였다.
5-2 : Huh7-EpCAM high 세포와 항-CEACAM1 항체를 처리한 NK 세포 공동배양에 따른 세포 독성 확인
본 발명에서는 상기 실시예 2에서 분류한 Huh7-EpCAMhigh 세포 및 Huh7-EpCAMlow세포에 항-CEACAM1 항체를 처리한 NK 세포를 투여하였을 때, NK 세포에 의한 간암 세포 독성이 증가하는지 확인하고자 하였다.
Huh7-EpCAMhigh 세포 및 Huh7-EpCAMlow세포에 각각 항-CEACAM1 항체를 처리한 NK 세포를 공동배양 하였으며, 상기 실시예 5-1과 동일한 방법으로 수행하였다.
도 10에 나타난 바와 같이, NK 세포에 대한 저항성이 높은 Huh7-EpCAMhigh세포에서도 항-CEACAM1 항체를 처리한 NK 세포에 의한 세포 독성이 높게 나타난 것을 확인하였다.
5-3 : CEACAM1 발현 억제제 및 항-CEACAM1 항체를 처리한 NK세포 병용 투여
본 발명에서는 CEACAM1 발현 억제 및 항-CEACAM1 항체를 처리한 NK세포 투여를 동시에 진행하였을 때, 간암 세포 사멸율이 증가하는지 확인하고자하였다.
먼저, 상기 실시예 4-1에서 제작한 CEACAM1 넉다운 Huh7 세포를 1Х105 세포/웰이 되도록 24웰 플레이트에 분주하였다. 그 다음, 상기 실시예 5-1과 같이 항-CEACAM1 항체를 처리한 NK세포가 CEACAM1 넉다운 Huh7 세포와 1(1Х105 세포/웰):1 또는 5(5Х105 세포/웰):1 비율이 되도록 첨가하여 공동배양하였으며, 실시예 2-1과 동일한 방법으로 NK세포에 의한 Huh7세포 세포사멸을 측정하였다.
도 11에 나타난 바와 같이, CEACAM1의 발현을 억제시킨 Huh7 세포에 항-CEACAM1 항체를 처리한 NK세포를 공동배양 한 결과, NK 세포에 의한 세포 독성이 현저하게 증가한 것을 확인하였다.
즉, CEACAM1 억제제 및 항-CEACAM1 항체를 처리한 NK 세포를 동시에 처리하면 NK 세포에 의한 세포 독성이 증가하여 간암 세포의 사멸율이 현저하게 증가하므로, 간암 치료 효능이 극대화 될 수 있다.
<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Correlation of CEACAM1 and EpCAM in liver cancer and Methods for providing information for liver cancer therapeutic effect using using the same <130> 1064699 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shCEACAM1 <400> 1 ccggctatca ctctaattcg gatttctcga gaaatccgaa ttagagtgat agtttttg 58

Claims (13)

  1. 정상 대조군과 비교하여 EpCAM 발현이 증가된 간암 환자에 대해 CEACAM1 발현 억제제 투여 효과 예측에 관한 정보를 제공하는 단계를 포함하는 CEACAM1 발현 억제를 이용한 간암 치료 효과에 관한 정보를 제공하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 CEACAM1 발현 억제제 투여에 의해 간암 세포 사멸이 촉진되는 것을 특징으로 하는 CEACAM1 발현 억제를 이용한 간암 치료 효과에 관한 정보를 제공하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 간암 세포 사멸 촉진은 CEACAM1 발현 억제제 투여에 의해 자연살해 세포의 활성이 촉진되어 유도되는 것을 특징으로 하는 CEACAM1 발현 억제를 이용한 간암 치료 효과에 관한 정보를 제공하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 CEACAM1 발현 억제제는 CEACAM1 유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, 앱타머 및 항체로 이루어진 군 중 1종 이상인 것을 특징으로 하는 CEACAM1 발현 억제를 이용한 간암 치료 효과에 관한 정보를 제공하는 방법.
  5. 항-CEACAM1 항체를 처리한 자연살해 세포를 유효성분으로 포함하는 간암 예방 또는 치료용 약학적 조성물로,
    상기 간암은 자연살해세포에 저항성을 보이며, EpCAM 발현이 정상 대조군에 비해 증가된 간암인 것을 특징으로 하는 간암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 삭제
  7. 제5항에 있어서, 상기 자연살해 세포는 항-CEACAM1 항체 처리에 의해 간암 세포에서 발현된 CEACAM1 리간드와 결합이 차단되는 것을 특징으로 하는 간암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제5항에 있어서, 상기 조성물은 CEACAM1 억제제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 간암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 CEACAM1 억제제는 CEACAM1 유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, 앱타머 및 항체로 이루어진 군 중 1종 이상인 것을 특징으로 하는 간암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 상기 CEACAM1 억제제에 의해 자연살해 세포의 활성이 촉진되어 간암 줄기세포 사멸이 유도되는 것을 특징으로 하는 간암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. EpCAMhigh 간암 줄기세포를 이용한 CEACAM1 억제제 스크리닝 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 스크리닝 방법은
    (a) EpCAMhigh 간암 줄기세포에 CEACAM1 억제제 후보 물질을 처리하는 단계;
    (b) 상기 후보 물질 처리 후, CEACAM1 발현 정도를 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 CEACAM1 발현 정도가 후보 물질을 처리하지 않는 대조군에 비해 감소한 후보 물질을 선별하는 단계;를 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 CEACAM1 억제제 스크리닝 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 EpCAMhigh 간암 줄기세포는 Huh7-EpCAMhigh세포인 것을 특징으로 하는 CEACAM1 억제제 스크리닝 방법.
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