KR101896557B1 - 재발성 암 치료제의 스크리닝 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 재발성 암에 대하여 약물을 처리한 후 히알루로니다제의 발현 수준을 측정함으로써 상기 재발성 암에 있어서 방사선에 대한 감수성을 증진시킬 수 있는 약제를 높은 정확도로 스크리닝할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 히알루로니다제의 활성 억제제 또는 상기 히알루로니다제를 코딩하는 유전자의 발현 억제제를 사용하여 재발성 암에 대한 방사선 감수성을 증진시킬 수 있다.

Description

재발성 암 치료제의 스크리닝 방법{Method for screening therapeutic agents for recurrent cancer}

본 발명은 재발성 암 치료제의 스크리닝 방법 및 재발성 암의 방사선 감수성 증진용 약학적 조성물에 관한 것이다.

교모세포종(glioblastoma, GBM)은 가장 흔하고 공격적인 1차 뇌 종양에 해당한다. 최근 외래적 및 치료적 요법의 비약적 발전에도 불구하고, 교모세포종은 여전히 치료하기 어려운 뇌 질환에 해당한다. 수술 후 방사선 요법은 환자 생존 기간을 연장시키나, 중앙 생존기간(median survival)은 여전히 15개월 이하이고, 장기 생존(long-term survival)은 극히 드물다. 교모세포종의 경우 외과적 수술 후 방사선 치료와 함께 테모졸로마이드(temozolomide) 보조 요법을 수행하여도 종양 세포가 계속하여 침윤하므로, 교모세포종 환자는 일반적으로 나쁜 예후를 보인다.

한편, 최근에 방사선 치료가 오히려 암 세포의 악성 표현형(malignant phenotype)을 높이고 재발을 일으키는 것으로 알려지고 있다. 이는 방사선을 거의 치사량에 가깝지만 1차 종양을 뿌리 뽑기에는 충분하지 않은 양으로 조사한 후에 흔히 발생한다. 하지만, 방사선 치료 후 교모세포종이 재발하는 것과 관련하여 신호 메커니즘에 대하여는 아직 밝혀진 바 없다.

최근에 통합 유전 분석은 신경 교종을 유전자 표현형에 근거하여, 임상적으로 관련된 일반계(classical), 전신경계(proneural), 신경계(neural) 및 중간엽계(mesenchymal) 아형으로 분류하였다. 이렇게 분자적으로 정의된 아형은 신경 교종의 조직학적 분류보다 임상적 결과를 높은 정확도로 예견할 수 있도록 한다. 상기 분류 중에서 중간엽계 아형의 경우 침윤성이 높고, 다른 아형에 비하여 나쁜 예후를 보인다. 교모세포종의 재발 시 종양 세포는 Olig2 감소(loss), YKL40, 비멘틴(VIM), CD44 및 STAT3의 상향 조정과 같이 중간엽계 아형의 성질로 유전자 발현 패턴이 전환하는 것은 매우 주목할 만하다.

한편, 뇌에서 세포 외 기질(extracellular matrix, ECM)은 특이한 조성을 갖는다. 구체적으로 상기 세포 외 기질은 주로 히알루론산(hyaluronic acid, HA)으로 이루어지며, 콜라겐(collagen), 피브로넥틴(fibronectin) 및 라미닌(laminin)과 같은 단단한 단백질 장벽(protein barrier)이 부족하다. 이러한 상기 뇌 세포 외 기질의 특이적 구조 및 조성은 뇌 종양의 뚜렷한 침윤성 메커니즘에 영향을 미치는 것으로 예측할 수 있다.

일반적인 세포 외 기질의 경우, 히알루론산은 조직의 항상성 유지 및 생체 역학적 상태, 구조 및 조직 조립에 긍정적인 영향을 미친다. 하지만, 상기 히알루론산이 과다하게 존재하는 경우, 종양 세포의 침윤성을 촉진하고, 특히 교모세포종 환자의 경우는 나쁜 예후와 영향이 있는 것으로 보인다.

본 발명의 일 목적은 재발성 암의 방사선에 대한 감수성 증진제를 높은 정확도로 스크리닝할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 다른 목적은 재발성 암에 대한 방사선 감수성을 증진시킬 수 있는 약학적 조성물을 제공하고자 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

뇌암의 치료법 중 방사선 요법은 방사선에 의한 DNA 손상에 대하여 세포 주기를 지연(DNA damage checkpoint)시키거나 세포사멸(apoptosis)을 유도하여 비정상 세포를 제거하는 방법이다. 그러나 방사선 요법의 문제점은 암세포의 내재적인 방사선 저항성과 방사선 치료에 따른 내성 증가로 인해서 방사선 저항성 암 세포들이 암의 재발을 유발시키며 방사선 저항성 세포는 항암제에도 내성을 가진다.

따라서, 방사선에 대해서 내재적인 방사선 저항성을 가진 암 세포의 방사선 민감성을 증진시키는 방사선 감수성 증진제의 개발이 절실히 요구되고 있다.

본 발명의 발명자들은 교모세포종에 대하여 방사선을 조사하자 히알루로니다제(hyaluronidase)의 발현량이 현저히 증가하며 재발성 교모세포종으로 변환하는 것을 발견하여 본 발명에 이르게 되었다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면, (a) 암 세포에 방사선을 조사하는 단계; (b) 상기 방사선이 조사된 암 세포에 약물을 처리하는 단계; (c) 상기 약물이 투여된 암 세포의 히알루로니다제(Hyaluronidase) 또는 이를 코딩하는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (d) 상기 암 세포의 히알루로니다제 또는 이를 코딩하는 mRNA 발현 수준이 약물 처리 전에 비하여 감소된 경우, 상기 약물을 재발성 암의 방사선 감수성 증진제의 후보물질로 판단하는 단계를 포함하는 재발성 암의 방사선 감수성 증진제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 "재발성 암"은 통상의 원발암에 대하여 치료 과정을 수행한 후 재발생된 암을 뜻하며, 상기 치료 과정에 대하여 내성을 가진 암을 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 치료 과정으로는 예를 들어, 수술, 화학 치료, 방사선 치료, 호르몬 치료, 생물학적 치료, 면역 치료 등을 포함할 수 있으나, 바람직하게는 방사선 치료일 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 암은 뇌암, 폐암, 비소세포성폐암, 결장암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군에서 선택될 수 있고, 바람직하게는 뇌암일 수 있으며, 보다 바람직하게는 교모세포종일 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 방법을 각각의 단계 별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:

단계 (a): 암 세포에 방사선을 조사하는 단계에 해당한다.

본 발명에서는 암 환자로부터 암 세포를 분리한 뒤 그에 방사선을 조사하여 재발성 암을 유도할 수 있다.

본 발명에서 상기 환자는 포유류에 해당하는 동물을 모두 포함할 수 있으나, 바람직하게는 인간일 수 있다.

본 발명에서 상기 방사선은 0 초과 4Gy의 조사량으로 1회 내지 5회 조사되는 것이, 상기 암 세포의 재발을 유도할 수 있어서 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에서 상기와 같이 방사선 조사에도 불구하고 생존한 재발성 암 세포의 경우 통상의 원발암에 비하여 Olig2 단백질의 발현 수준이 감소하고, YKL40, 비멘틴(VIM), CD44 및 STAT3의 상향 조정되는 등의 중간엽계 아형의 성질로 유전자 발현 패턴이 전환될 수 있다.

단계 (b): 방사선이 조사된 암 세포에 약물을 처리하는 단계에 해당한다.

본 발명에서는 상기 (a) 단계에서 방사선 조사로 유도된 재발성 암 세포에 약물로 시험 물질을 처리할 수 있다.

다만, 본 발명에서는 상기 시험 물질과 함께 시너지 효과를 얻기 위하여 항암제를 함께 처리할 수 있다. 여기서 상기 항암제로는 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 네라티닙, 라파티닙, 제피티닙, 반데타닙, 니로티닙, 세마사닙, 보수티닙, 악시티닙, 세디라닙, 레스타우르티닙, 트라스투주맙, 게피티니브, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 베바시주맙, 시스플라틴, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 메토트렉세이트, 우라실, 시타라빈, 플루오로우라실, 플루다가빈, 에노시타빈, 플루타미드, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 테니포시드, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 미토마이신, 블레로마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 템시롤리무스, 테모졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 레우코보린, 트레토닌, 엑스메스탄, 아미노글루테시미드, 아나그렐리드, 나벨빈, 파드라졸, 타목시펜, 토레미펜, 테스토락톤, 아나스트로졸, 레트로졸, 보로졸, 비칼루타미드, 로무스틴 및 카르무스틴으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

단계 (c): 약물이 투여된 암 세포의 히알루로니다제(Hyaluronidase) 또는 이를 코딩하는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계에 해당한다.

본 발명에서는 상기와 같이 시험 물질이 처리된 재발성 암 세포에서 히알루로니다제의 발현 수준을 측정할 수 있다.

본 발명에서 상기 히알루로니다제(Hyaluronidase)는 히알루론산을 분해하는 효소로, 히알루로니다제 1(Hyaluronidase 1, HYAL1), 히알루로니다제 2(Hyaluronidase 2, HYAL2), 히알루로니다제 3(Hyaluronidase 3, HYAL3), 히알루로니다제 4(Hyaluronidase 4, HYAL4) 및 히알루로니다제 5(Hyaluronidase 5, HYAL5)의 5 종이 알려져 있다. 다만, 본 발명에서 상기와 같이 재발성 암 세포에서 상기 히알루로니다제 중에서 특히 히알루로니다제 1 및 히알루로니다제 3 중 적어도 하나, 보다 바람직하게는 히알루로니다제 3의 발현 수준을 측정함으로써 재발성 암 치료제를 높은 정확도로 스크리닝할 수 있다.

본 발명에서 상기 히알루로니다제 3은 서열번호는 1로 표시될 수 있고, 상기 히알루로니다제 1은 서열번호 2로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 히알루로니다제의 발현 수준을 측정하는 제제는 이에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.

본 발명에서 상기 "항체"란, 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질성 분자를 의미하는데, 이러한 항체는, 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현 벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있을 뿐만 아니라, 인간화 항체 등의 특수 항체를 포함할 수도 있다. 아울러, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 항체는 상기 히알루로니다제에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 될 수 있고, 바람직하게는 상기 각 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 그의 일부가 될 수 있다.

본 발명에서 상기 히알루로니다제의 발현 수준은 당업계에 공지된 다양한 면역 분석 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, 방사능 면역 분석, 방사능 면역 침전, 면역 침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbentassay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 그리고 샌드위치 분석을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 면역 분석 또는 면역 염색의 방법은 문헌(Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)에 기재되어 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능 면역 분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능 동위원소(예컨대, C14, I125, P32 및 S35)로 표지된 단백질-특이 항체가 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 시료가 처리된 세포로부터 추출물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 1차 항체로서의 Ire1 혹은 단백질-특이 항체와 상기 세포 추출물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 2차 항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 여기서, 상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다. 상기 2차 항체에 결합된 효소는 발색 반응, 형광 반응, 발광 반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함할 수 있다. 상기한 2차 항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-ASB1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색 반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), TMB(3,3,5,5-tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]) 및 o-페닐렌디아민(OPD)과 같은 기질이 이용될 수 있다. 상기 ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.

또한, 본 발명에서는 상기와 같이 시험 물질이 처리된 재발성 암 세포에서 히알루로니다제를 코딩하는 mRNA의 발현 수준을 측정할 수 있다.

본 발명에서 상기 히알루로니다제를 코딩하는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브일 수 있다.

본 발명에서 상기 "프라이머"란, 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시될 수 있다.

본 발명에서 상기 프라이머는 상기 히알루로니다제의 mRNA 유전자의 증폭에 사용될 수 있는 프라이머가 될 수 있고, 상기 히알루로니다제의 mRNA 유전자와 상보적으로 결합하여 PCR 방법으로 증폭시킬 수 있는 한, 상기 프라이머의 뉴클레오티드 서열은 제한되지 않는다.

본 발명에서 상기 "프로브"란, 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하는데, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 라벨링될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 프로브는 히알루로니다제를 코딩하는 mRNA 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 프로브가 될 수 있고, 상기 히알루로니다제를 코딩하는 mRNA 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 한, 상기 프로브의 뉴클레오티드 서열은 제한되지 않는다.

본 발명에서 상기 히알루로니다제를 코딩하는 mRNA의 발현 수준은 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있다.

단계 (d): 상기 암 세포의 히알루로니다제 또는 이를 코딩하는 mRNA의 발현 수준이 약물 처리 전에 비하여 감소된 경우, 상기 약물을 재발성 암의 방사선 감수성 증진제의 후보물질로 판단하는 단계에 해당한다.

본 발명에서 상기 단계 (c)에서 측정된 것으로, 약물 처리 후 암 세포에서 측정된 히알루로니다제, 바람직하게는 히알루로니다제 1 및 3 중 적어도 하나, 보다 바람직하게는 히알루로니다제 3의 발현 수준이 약물 처리 전보다 감소한 경우, 상기 약물을 재발성 암의 방사선에 대한 내성을 극복하고, 감수성을 증진제의 후보물질로 판단할 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 단계 (c)에서 측정된 것으로, 약물 처리 후 암 세포에서 측정된 히알루로니다제, 바람직하게는 히알루로니다제 1 및 3 중 적어도 하나, 보다 바람직하게는 히알루로니다제 3를 코딩하는 mRNA의 발현 수준이 약물 처리 전보다 감소한 경우, 상기 약물을 재발성 암의 방사선에 대한 내성을 극복하고, 감수성을 증진제의 후보물질로 판단할 수 있다.

단, 상기 단계 (b)에서 약물로 시험 물질과 함께 항암제를 병용 투여한 결과, 약물 처리 후 재발성 암 세포에서 측정된 히알루로니다제 1 및 3 중 적어도 하나의 단백질이나 이를 코딩하는 mRNA의 발현 수준이 약물 처리 전보다 감소한 경우, 상기 시험 물질 및 항암제 모두를 재발성 암 치료제의 후보물질로 판단할 수 있다.

본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 히알루로니다제(Hyaluronidase)의 활성 억제제 또는 상기 히알루로니다제를 코딩하는 유전자의 발현 억제제를 유효 성분으로 포함하는, 재발성 암의 방사선 감수성 증진용 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 히알루로니다제는 히알루론산을 분해하는 효소로, 히알루로니다제 1(Hyaluronidase 1, HYAL1), 히알루로니다제 2(Hyaluronidase 2, HYAL2), 히알루로니다제 3(Hyaluronidase 3, HYAL3), 히알루로니다제 4(Hyaluronidase 4, HYAL4) 및 히알루로니다제 5(Hyaluronidase 5, HYAL5)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 바람직하게는 히알루로니다제 1 및 히알루로니다제 3 중 적어도 하나일 수 있고, 보다 바람직하게는 히알루로니다제 3일 수 있다.

본 발명에서 상기 히알루로니다제 3은 서열번호 1로 표시될 수 있고, 상기 히알루로니다제 1은 서열번호 2로 표시될 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 히알루로니다제의 활성 억제제의 종류는 특별히 제한하지 않으며, 히알루로니다제의 활성을 억제시킬 수 있는 물질이라면 제한없이 사용될 수 있으나, 예를 들면, 상기 히알루로니다제에 특이적으로 결합할 수 있는 항체, 단일사슬 가변영역 단편 및 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

본 발명에서 상기 "항체"란 폴리클로날 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 본 발명에서 상기 히알루로니다제에 대한 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler et al., European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al.,J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 문헌(Harlow, E. et al., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991)에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 포함된다. 예를 들어, 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 SIRT2 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

본 발명에서 항체는 단일사슬 가변영역 단편(scFv)을 포함할 수 있다. 상기 단일사슬 가변영역 단편은 "경사슬의 가변성 부위(VL)-링커-중사슬의 가변성 부위(VH)"로 구성될 수 있다. 상기 링커는 중사슬 및 경사슬의 가변성 부위를 인위적으로 연결하는 작용을 하는 일정 길이의 아미노산 서열을 의미한다.

또한, 본 발명에서 상기 히알루로니다제를 코딩하는 유전자의 발현 억제제의 종류는 특별히 제한하지 않으며, 상기 히알루로니다제를 코딩하는 유전자의 발현을 억제시킬 수 있는 물질이라면 제한없이 사용될 수 있으나, 예를 들면, 상기 히알루로니다제를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA 및 앱타머로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 "안티센스 올리고뉴클레오타이드"란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 본 발명의 안티센스 서열은 히알루로니다제를 코딩하는 mRNA에 상보적이고 상기 mRNA에 결합 할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하며, 상기 mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다.

더불어, 상기 안티센스 핵산은 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5, 3, 343-55, 1995). 핵산 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-메틸피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6(6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다. 또한, 본 발명의 안티센스 핵산은 상기 안티센스 핵산의 활성 및 세포 흡착성을 향상시키는 하나 이상의 모이어티(moiety) 또는 컨쥬게이트(conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티, 콜릭산, 티오에테르, 티오콜레스테롤, 지방성 사슬, 인지질, 폴리아민, 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다맨탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민, 헥실아미노-카르보닐-옥시콜에스테롤 모이어티 등의 지용성 모이어티 등이 있고 이에 제한되지는 않는다. 지용성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 제조 방법은 본 발명의 기술 분야에서 이미 잘 알려져 있다(미국특허 제 5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호). 상기 변형된 핵산은 뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키고 안티센스 핵산과 표적 mRNA와의 결합 친화력을 증가시킬 수 있다.

안티센스 올리고뉴클레오타이드는 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 일예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 "siRNA"는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(국제공개 특허번호 00/44895, 01/36646, 99/32619, 01/29058, 99/07409 및 00/44914 참조). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운(knock-down) 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다.

본 발명의 siRNA 분자는, 센스 가닥(상기 마커 유전자의 mRNA 서열에 상응하는 서열)과 안티센스 가닥(상기 mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있으며, 또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. 나아가 siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 또한, siRNA 말단 구조는 상기 마커 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하고, 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다.

또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오티드 서열이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자 내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.

본 발명의 siRNA를 제조하는 방법은 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 뒤, 형질전환 과정을 거쳐 세포 안으로 도입시키는 방법과 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-유래의 siRNA 발현 카세트 등을 세포안으로 형질전환 또는 감염(infection)시키는 방법이 있다.

본 발명에서의 "앱타머(aptamer)"는 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 올리고뉴클레오타이드 분자를 말한다. 앱타머는, 소정의 표적 분자에 대하여 결합함으로써, 소정의 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다.

본 발명의 앱타머는 RNA, DNA, 수식(modified) 올리고뉴클레오타이드 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 본 발명의 앱타머는 또한, 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있다. 본 발명의 앱타머의 길이는 특별히 한정되지 않고, 통상 15 내지 200 뉴클레오타이드일 수 있지만, 예컨대 15 ~ 100 뉴클레오타이드이고, 바람직하게는 18 ~ 80 뉴클레오타이드이며, 보다 바람직하게는 20 ~ 60 뉴클레오타이드이고, 가장 바람직하게는 22 ~ 45 뉴클레오타이드일 수 있다. 총 뉴클레오타이드 개수가 적으면 화학합성, 화학수식 및 대량 생산이 보다 용이하고, 경제적이며, 생체내 안정성은 높으면서 독성은 낮아 유리하다.

본 발명에서는 상기 히알루로니다제 중에서도 특히 히알루로니다제 1 및 히알루로니다제 3의 활성을 억제하거나 상기 히알루로니다제 1 및 3을 코딩하는 유전자의 발현을 억제함으로써 암 중에서도 특히 재발성 암에 있어서 방사선 감수성을 증진시켜 치료 효과를 높일 수 있다.

본 발명에서는 상기와 같이 히알루로니다제 1 또는 히알루로니다제 3의 활성 억제제 또는 상기 히알루로니다제 1 또는 히알루로니다제 3을 코딩하는 유전자의 발현 억제제를 처리함으로써 암 중에서도 특히 재발성 암의 방사선 조사에 대한 감수성을 증진시킬 수 있다. 여기서, 상기 암은 뇌암, 폐암, 비소세포성폐암, 결장암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군에서 선택될 수 있고, 바람직하게는 뇌암일 수 있으며, 보다 바람직하게는 교모세포종일 수 있다.

본 발명의 방사선 치료는 암 세포에 본 발명의 조성물을 투여하고, 방사선을 조사하는 것을 포함하는데, 여기서 "방사선 조사"란 이온화 방사선, 특히, 특별하게는 오늘날 통상 사용하고 있는 선형 가속기(linear accelerators) 또는 방사핵종(radionuclides)에 의해 방사된 감마 방사선을 의미한다. 방사핵종에 의한 암 세포에의 방사선 요법은 외부적 또는 내부적으로 이루어질 수 있다. 조성물 투여 시기는 바람직하게는, 종양에 방사선을 조사하기 한 달 전까지는, 특히 10일 또는 일주일 전까지는 본 발명의 조성물 투여를 시작하는 것이 좋다. 추가적으로, 종양의 방사선 조사를 분별하고, 최초와 최후의 방사선 조사 기간 사이에 조성물의 투여를 지속하는 것이 유리하다. 투여되는 히알루로니다제의 활성 억제제 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 억제제의 양, 방사선 조사량 및 방사선 조사량의 간헐성은 암의 종류, 그것의 위치, 화학 요법 또는 방사선 요법에 대한 환자의 반응과 같은 일련의 파라미터에 따라 달라진다. 또한, 본 발명의 방사선 요법은 근접치료, 방사성 핵종 치료, 외부 빛살 방사선요법(external-beam radiation therapy), 온열치료(냉동절제 치료, 고열치료), 방사선 외과, 하전입자 방사선 치료(charged-particle radiotherapy), 중성자 방사선 요법 및 광역동치료 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 다른 항암제와도 추가로 병용 투여할 수 있으며, 이를 통해서 암의 방사선에 대한 감수성을 더욱 증강시킬 수 있다.

여기서 상기 항암제로는 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 네라티닙, 라파티닙, 제피티닙, 반데타닙, 니로티닙, 세마사닙, 보수티닙, 악시티닙, 세디라닙, 레스타우르티닙, 트라스투주맙, 게피티니브, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 베바시주맙, 시스플라틴, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 메토트렉세이트, 우라실, 시타라빈, 플루오로우라실, 플루다가빈, 에노시타빈, 플루타미드, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 테니포시드, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 미토마이신, 블레로마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 템시롤리무스, 테모졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 레우코보린, 트레토닌, 엑스메스탄, 아미노글루테시미드, 아나그렐리드, 나벨빈, 파드라졸, 타목시펜, 토레미펜, 테스토락톤, 아나스트로졸, 레트로졸, 보로졸, 비칼루타미드, 로무스틴 및 카르무스틴으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 약제적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.

한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다.

본 발명에서, "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학적 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.

본 발명은 재발성 암에 대하여 약물을 처리한 후 히알루로니다제의 발현 수준을 측정함으로써 상기 재발성 암에 있어서 방사선에 대한 감수성을 증진시킬 수 있는 약제를 높은 정확도로 스크리닝할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 히알루로니다제의 활성 억제제 또는 상기 히알루로니다제를 코딩하는 유전자의 발현 억제제를 사용하여 재발성 암에 대한 방사선 감수성을 증진시킬 수 있다.

도 1의 (a)는 본 발명의 일 실시예에서, 콜라겐 기반 매트릭스를 이용하여 U87MG 교모세포종 세포(GBM cells)에 방사선 조사 시 침윤성의 변화를 분석하기 위한 실험 모식도를 나타낸 것이다.
도 1의 (b)는 본 발명의 일 실시예에서, 방사선 조사가 교모세포종 세포의 침윤성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 콜라겐 기반 매트릭스에서 방사선이 조사(IR)된 U87MG 교모세포종 세포(GBM cells)와 방사선이 조사되지 않은(Ctrl) U87MG 교모세포종 세포를 H&E 염색한 사진을 나타낸 것이다. 단, 도 1의 (b)에서 스케일 바는 400㎛를 의미한다.
도 1의 (c)는 본 발명의 일 실시예에서, 방사선이 조사(IR)된 U87MG 교모세포종 세포(GBM cells)와 방사선이 조사되지 않은(Ctrl) U87MG 교모세포종 세포에 있어서 침윤 세포의 수를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 2의 (a)는 본 발명의 일 실시예에서, 콜라겐 기반 매트릭스를 이용하여 방사선이 조사(IR)된 U87MG 교모세포종 세포(GBM cells)와 방사선이 조사되지 않은(Ctrl) U87MG 교모세포종 세포의 스페로이드에 녹색 형광 단백질(GFP)을 형질 도입시킨 뒤 침윤성을 분석하기 위한 실험 모식도를 나타낸 것이다.
도 2의 (b)는 본 발명의 일 실시예에서, 콜라겐 기반 매트릭스에서 방사선이 조사(IR)되거나 혹은 조사되지 않은(Ctrl) U87MG 교모세포종 세포의 스페로이드부터 GFP-라벨된 U87MG 교모세포종 세포의 침윤성을 분석한 사진을 나타낸 것이다. 단, 상기 도 2의 (b)에서 A_o는 초기 시간에서 면적을 의미하고, A_t는 48시간에서 침윤한 세포를 포함하는 면적을 의미한다. 또한, 스케일 바는 100㎛를 의미한다.
도 2의 (c)는 본 발명의 일 실시예에서, 콜라겐 기반 매트릭스에서 방사선 조사 후 스페로이드로부터 침윤한 GFP-라벨된 U87MG 교모세포종 세포의 침윤성을 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다. 단, 상기 도 2의 (c)에서 침윤성은 (A_t-A_o)/A_o로 측정하였다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서, 콜라겐 기반 매트릭스에서 방사선이 조사(IR)되거나 혹은 조사되지 않은(Ctrl) U87MG 교모세포종 세포의 스페로이드부터 침윤한 GFP-형질 도입된 U87MG 교모세포종 세포의 사진을 나타낸 것이다. 단, 상기 도 3에서 A_o는 초기 시간에서 면적을 의미하고, A_t는 48시간에서 침윤한 세포를 포함하는 면적을 의미한다. 또한, 스케일 바는 100㎛를 의미한다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에서, 방사선이 조사(IR)되거나 혹은 조사되지 않은(Ctrl) U87MG 교모세포종 세포에서 간엽계 아형 마커의 웨스턴 블럿 분석 결과를 나타낸 것이다. 단, 상기 도 4에서 β-액틴은 로딩 대조군으로 사용된 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에서, 방사선이 조사(IR)되거나 혹은 조사되지 않은(Ctrl) U87MG 교모세포종 세포에서 간엽계 아형 마커의 IHC 염색 결과를 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에서, 방사선이 조사(IR)되거나 혹은 조사되지 않은(Ctrl) XO1 교모세포종 세포, U373MG 교모세포종 세포 및 U251MG 교모세포종 세포에서 CDH-2 및 VIM의 웨스턴 블럿 분석 결과를 나타낸 것이다. 단, 상기 도 6에서 β-액틴은 로딩 대조군으로 사용된 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에서, 방사선 조사가 생체 내에서 교모세포종 세포의 침윤성에 미치는 효과를 확인하기 위하여, 마우스에 U87MG 교모세포종 세포를 이식하고 방사선을 조사하는 실험 개략도를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에서, 방사선이 조사(IR)되거나 혹은 조사되지 않은(Ctrl) U87MG 교모세포종 세포를 마우스에 정위적으로 이식하여 형성된 뇌 종양을 H&E 염색하여 교모세포종 세포의 용해 정도를 확인한 사진을 나타낸 것이다. 단, 상기 도 8에서 스케일 바는 200㎛를 의미한다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에서, 방사선이 조사(IR)되거나 혹은 조사되지 않은(Ctrl) U87MG 교모세포종 세포를 마우스에 정위적으로 이식하여 형성된 뇌 종양에서 VIM, CDH-2, ZEB1 및 CD44 발현 수준을 qRT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 것이다. 단, 상기 도 9의 실험 시 각 그룹당 마우스는 6마리씩으로 수행하였으며, 데이터 값은 3회의 독립적인 실험에서 평균±표준편차로 나타내었다. 또한, *은 대조군 대비 p　<　0.05인 것을 의미한다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에서, 방사선이 조사(IR)되거나 혹은 조사되지 않은(Ctrl) U87MG 교모세포종 세포를 마우스에 정위적으로 이식하여 형성된 뇌 종양에서 ZEB1 및 VIM의 IHC 염색 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에서, 방사선 유도된 ECM 리모델링 시 교모세포종 세포의 침윤성에 미치는 영향을 분석하기 위한 실험 모식도를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 12의 (a)는 본 발명의 일 실시예에서, 방사선이 조사(IR)되거나 혹은 조사되지 않은(Ctrl) U87MG 교모세포종 세포에 의해 조정된 콜라겐 기반 매트릭스에서 침윤하는 U87MG 교모세포종 세포의 H&E 염색 사진을 나타낸 것이다.
도 12의 (b)는 본 발명의 일 실시예에서, 방사선이 조사(IR)되거나 혹은 조사되지 않은(Ctrl) U87MG 교모세포종 세포에 의해 조정된 콜라겐 기반 매트릭스에서 침윤하는 U87MG 교모세포종 세포의 수를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 13의 (a)는 본 발명의 일 실시예에서, 방사선이 조사(IR)되거나 혹은 조사되지 않은(Ctrl) U87MG 교모세포종에 의해 수축된 매트릭스의 스캔 이미지를 나타낸 것이다.
도 13의 (b)는 본 발명의 일 실시예에서, 방사선이 조사(IR)되거나 혹은 조사되지 않은(Ctrl) U87MG 교모세포종에 의해 매트릭스의 수축 정도를 그래프로 나타낸 것이다. 단, 상기 도 13의 (b)에서 데이터는 평균±표준편차로 나타내었다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에서, 방사선이 조사(IR) 시 U87MG 교모세포종 세포에서 분비된 ECM 성분의 발현 수준의 변화를 qRT-PCR로 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에서, 방사선이 조사(IR)된 U87MG 교모세포종 세포에서 히알루론산(HA)의 함량의 변화를 ELISA로 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에서, 방사선이 조사(IR)된 X01 교모세포종, U373MG 교모세포종 및 U251MG 교모세포종 세포에서 히알루론산(HA)의 함량의 변화를 ELISA로 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에서, 방사선 조사(IR) 후 콜라겐 기반 매트릭스로 침윤한 U87MG 교모세포종 세포에서 히알루론산(HA)을 면역 염색한 사진을 나타낸 것이다. 단, 도 17에서 스케일 바는 200㎛를 의미한다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에서, 방사선 조사(IR) 후 U87MG 교모세포종 세포에서 HAS1, HAS2 및 HAS3의 발현 수준을 qRT-PCR로 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에서, 방사선이 조사(IR)되거나, 혹은 조사되지 않은(Ctrl) X01 교모세포종, U373MG 교모세포종 및 U251MG 교모세포종 세포에서 HAS2의 발현 수준을 qRT-PCR로 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에서, 방사선을 다양한 치사량으로 조사한 후 U87MG 교모세포종 세포에서 HAS2의 발현 수준을 ELISA로 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다. 단, 상기 도 20에서 β-액틴은 로딩 대조군으로 사용된 것이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에서, siRNA를 처리한 후 방사선을 조사(IR)하거나, 혹은 방사선을 조사하지 않은 경우(Ctrl)에서 U87MG 교모세포종 세포 내 히알루론산(HA)의 발현 수준의 변화를 ELISA로 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 22의 (a)는 본 발명의 일 실시예에서, siRNA 처리 후 방사선이 조사된 U87MG 교모세포종 세포에 의해 조정된 콜라겐 기반 매트릭스에서 침윤하는 U87MG 교모세포종 세포를 H&E 염색한 사진을 나타낸 것이다. 단, 도 22의 (a)에서 스케일 바는 200㎛를 의미한다.
도 22의 (b)는 본 발명의 일 실시예에서, siRNA 처리 후 방사선이 조사된 U87MG 교모세포종 세포에 의해 조정된 콜라겐 기반 매트릭스에서 침윤하는 U87MG 교모세포종 세포의 수를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 23의 (a)는 본 발명의 일 실시예에서, siRNA 처리 후 방사선을 조사(IR)하거나 혹은 조사하지 않은 경우(Ctrl)에서, U87MG 교모세포종 세포에 의해 수축된 매트릭스의 사진을 나타낸 것이다.
도 23의 (b)는 본 발명의 일 실시예에서, siRNA 처리 후 방사선을 조사(IR)하거나 혹은 조사하지 않은 경우(Ctrl)에서, U87MG 교모세포종 세포에 의한 매트릭스의 수축 정도를 그래프로 나타낸 것이다. 단, 상기 도 23의 (b)에서 **은 대조군 대비 p　<　0.001인 것을 의미한다.
도 24는 본 발명의 일 실시예에서, 방사선이 조사(IR)되거나, 혹은 조사되지 않은(Ctrl) U87MG 교모세포종 세포에서 히알루로니다제 1(HYAL-1), 히알루로니다제 2(HYAL-2) 및 히알루로니다제 3(HYAL-3)의 발현 수준을 반정량적 RT-PCR로 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다. 단, 상기 도 24에서 β-액틴은 로딩 대조군으로 사용된 것이다.
도 25는 본 발명의 일 실시예에서, 방사선이 조사(IR) 시 U87MG 교모세포종 세포에서 히알루로니다제 1(HYAL-1), 히알루로니다제 2(HYAL-2) 및 히알루로니다제 3(HYAL-3)의 발현 수준의 변화를 qRT-PCR로 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다. 단, 상기 도 25에서 **은 대조군 대비 p　<　0.01인 것을 의미한다.
도 26의 (a)는 본 발명의 일 실시예에서, 히알루론산의 존재 하에서 침윤하는 U87MG 교모세포종 세포의 사진을 나타낸 것이다.
도 26의 (b)는 본 발명의 일 실시예에서, 히알루론산의 존재 하에서 침윤하는 U87MG 교모세포종 세포의 수를 그래프로 나타낸 것이다.
도 27의 (a)는 본 발명의 일 실시예에서, 콜라겐 기반 매트릭스에서 히알루론산으로 처리하자 침윤한 GFP-형질 도입된 U87MG 교모세포종 스페로이드 세포의 사진을 나타낸 것이다. 단, 상기 도 27의 (a)에서 A_o는 초기 시간에서 면적을 의미하고, A_t는 48시간에서 침윤한 세포를 포함하는 면적을 의미한다. 또한, 스케일 바는 100㎛를 의미한다.
도 27의 (b)는 본 발명의 일 실시예에서, 콜라겐 기반 매트릭스에서 히알루론산으로 처리하자 침윤한 GFP-형질 도입된 U87MG 교모세포종 스페로이드 세포의 침윤성을 그래프로 나타낸 것이다. 단, 상기 도 27의 (b)에서 침윤성은 (A_t-A_o)/A_o로 측정하였다.
도 28은 본 발명의 일 실시예에서, 히알루론산으로 처리 시 U87MG 교모세포종 세포에서 YKL40, VIM 및 CDH-2의 발현 수준의 변화를 웨스턴 블럿으로 분석한 결과를 나타낸 것이다. 단, 상기 도 28에서 β-액틴은 로딩 대조군으로 사용된 것이다.
도 29는 본 발명의 일 실시예에서, 방사선이 조사(IR)되거나 방사선이 조사되지 않은(Ctrl) U87MG 교모세포종 세포를 정위 이식하여 형성된 뇌 종양에서 HAS2 및 히알루론산을 IHC로 분석한 사진을 나타낸 것이다. 단, 상기 도 29에서 스케일 바는 200㎛를 의미한다.
도 30은 본 발명의 일 실시예에서, 방사선이 조사(IR)되거나 방사선이 조사되지 않은(Ctrl) U87MG 교모세포종 세포를 정위 이식하여 형성된 뇌 종양에서 HAS2의 발현 수준을 qRT-PCR로 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다. 단, 상기 도 30에서 *은 대조군 대비 p　<　0.05인 것을 의미한다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예

화학 약제 및 항체

히알루론산(저분자량)은 R&D에서 구입하였고, VIM, CDH-2, SRC, STAT3, IκB, p-IκB 및 NFκB에 대한 폴리클로날 항체는 Santa Cruz (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다. 또한, p-STAT3 (Y705), p-NFκB 및 p-SRC에 대한 폴리클로날 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)에서 구입하였으며, CD44, HA, IL1-α 및 TNF-α에 대한 폴리클로날 항체와 HAS2, IL8, 및 TNF-α에 대한 모노클로날 항체는 Abcam (MA, USA)에서 구입하였다. β-액틴 및 ZEB1에 대한 모노클로날 항체는 Sigma (St Louis, MO, USA)에서 구입하였다.

인간 교모세포종 시료

교모세포종 환자의 조직은 연세 세브란스 병원으로부터 얻었으며, 2009년부터 2014년도 사이에 교모세포종이 발병한 환자 20명으로부터 무작위로 채취하였다. 모든 환자는 외과적 수술 후 방사선 치료(1명) 또는 CCRT(19명)를 받았다.

세포 배양

U87MG, U373MG, 및 U251MG 신경 교종 세포는 한국 세포주 은행(Seoul, Korea)으로부터 구입하였다. X01 교모세포종 세포(X01 GBM 세포)는 교모세포종 환자로부터 얻어진 것으로, Dr Akio Soeda (Department of Neurological Surgery, Gifu University, Japan)로부터 확보하였다. 모든 교모세포종 세포에 플라즈모신-마이크로플라즈마 제거 약제(Plasmocin-Microplasma Elimination Reagent) (Invitrogen, Seoul, Korea)를 처리하여 마이크로플라즈마 오염을 방지하였다. 이후, 상기 교모세포종 세포를 냉동시켜 액체 질소에 보관하였다. 해동 후에는 세포는 6개월 미만 동안 유지될 수 있다. 모든 교모세포종 세포는 10% 소 태아 혈청이 보충된 둘베코 변형 이글 배지 (Invitrogen, Seoul, Korea)에서 배양하였다.

웨스턴 블럿 분석

프로테아즈 억제제(protease inhibitors)로 보충된 용해 완충액 (40 mM Tris-HCl (pH 8.0), 120 mM NaCl, 0.1% Nonidet-P40)을 사용하여 추출 단백질로 세포 용해물을 준비하였다. 단백질을 SDS-PAGE로 분리한 뒤, 니트로셀룰로오스 막 (Amersham, Arlington Heights, IL, USA)으로 이송시켰다. 상기 막을 트리스 생리 식염 완충액(Tris-buffered saline, TBS) 내에서 5% 무지방 분유로 블록한 뒤, 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새 배양하였다. 페록시다제-컨쥬게이트 2차 항체를 사용하자 오염(blots)이 더욱 진해졌고, 단백질은 향상 화학 루미네센스(enhanced chemiluminescence, ECL)로 시각화하였다.

qRT - PCR

트리졸 (Invitrogen)을 사용하여 총 RNA를 분리한 뒤 KAPA 바이오시스템(Wilmington, MA, USA)의 KAPA SYBR FAST qPCR 키트를 사용하여 qRT-PCR을 수행하였다. Rotor Gene Q (Qiagene, Seoul, Korea) 내에서 반응을 수행하였고, 결과물은 컴Ct 방법으로 계산된 배수 변화로 나타내었다. GAPDH를 내부 표준화 대조군으로 사용하였다.

세포 이동 및 침윤능 분석

침윤능 분석을 위하여, 교모세포종 세포를 8㎛ 포어 사이즈 필터 삽입물 (Corning Glass, Seoul, Korea)을 포함하는 트랜스웰(Transwells)에 로딩하였다. 단, 상기 삽입물은 챔버의 상부에 10mg/ml 성장인자-감소 마트리겔 (BD Biosciences, Seoul, Korea)로 전코팅(pre-coating)되어 있고, 웰의 하부에는 0.8ml 성장 배지로 채워져 있다. 37℃에서 48시간 동안 배양한 후, 필터의 상부 표면에 남은 비침윤성 세포는 면 스왑(cotton swab)으로 제거하고, 필터의 하부 표면으로 이동한 세포는 고정시킨 뒤 Diff-Quick 키트 (Fisher, Pittsburgh, PA, USA)로 고정시킨 뒤 20배율로 확대하여 촬영하였다. 침윤능은 웰당 5개의 현미경 필드(microscopic fileds) 내 세포를 계수하여 평가하였고, 침윤 정도는 현미경 필드 당 평균 세포 수로 나타내었다. 세포는 위상차 현미경 (Leica Microsystems, Bannockburn, IL)으로 촬영하였다. 이동 분석(migration assay)은 상기와 동일한 막이 구비된 삽입물을 포함하는 트랜스웰을 사용하되, 마트리겔 코팅은 수행하지 않았다.

콜라겐 기반 매트릭스의 침윤성 분석

콜라겐 기반 매트릭스에서 교모세포종 세포의 침윤성을 분석하였다. 상기 콜라겐 기반 매크릭스는, 각각의 챔버 슬라이드에 콜라겐 Ⅰ형(2mg/ml)과 마트리겔(11%)을 놓은 뒤 이들을 성장 배지 내에서 중합화였다. 교모세포종 세포의 침윤 정도는 H&E 염색으로 시각화하였다. 또한, 교모세포종 세포의 침윤성은 콜라겐 기반 매트릭스에서 스페로이드(spheroids)로 분석하였다. 침윤성을 시각화하기 위하여, U87MG 교모세포종 세포를 매트릭스에 접종하기에 앞서 GFP를 형질 도입하였다. 접종 후 48시간이 경과하였을 때 확산된 교모세포종 세포의 면적(A_t)을 이미지 J 소프트웨어 (NIH, rsbweb.nih.gov/ij)로 측정하였다. 침윤 면적은 (A_t-A₀)/A₀의 식으로 계산하였으며, 여기서 상기 "A₀"는 초기 시간에서 면적을 의미하고, "A_t"는 매트릭스에 접종한 후 48시간이 경과하였을 때 침윤한 세포가 차지하는 면적을 의미한다.

방사선 조사

교모세포종 세포 또는 마우스 뇌에 ¹³⁷Cs γ-레이 소스 (Atomic Energy of Canada, Ltd., Mississauga, Canada)를 사용하여 3.81Gy/min의 양으로 조사하였다.

방사선이 조사된 세포에 의하여 조정된 ECM 내 교모세포종 세포의 침윤성

방사선이 조사된 U87MG 교모세포종 세포와 방사선이 조사되지 않은 U87MG 교모세포종 세포 각각을 콜라겐 기반 매트릭스에 접종하고, 7일 동안 상기 교모세포종에 의하여 세포 외 기질(ECM)이 재조정되도록 하였다. 이후, 퓨로마이신(1 μg/ml)을 이용하여 U87MG 교모세포종 세포를 사멸시키고, 상기 교모세포종 세포로부터 분비된 ECM 조성물만 남도록 하였다. 이후, 조정된 ECM에 U87MG 교모세포종 세포를 도말한 뒤 48시간 후에 겔을 수직으로 절단하고, H&E 염색하여 침윤성을 시각화하였다.

매트릭스 리모델링 분석

교모세포종 세포 (1 x 10⁵ cells)를 0.5ml 콜라겐 겔 (3mg/ml)에 깊이 박아 접종한 뒤 37℃에서 1시간 경과 후 겔을 성장 배지로 덮어 씌웠다. 1일 경과 후, 성장 배지를 인산화 완충 수용액 (PBS)으로 교체한 뒤, 교모세포종 세포에 의하여 3일 동안 매트릭스가 재조정되도록 하였다. 3일째에 겔을 사진 촬영하고, 웰과 겔 각각의 직경을 이미지 J를 이용하여 측정하였다. 식 100 x (웰 직경 - 겔 직경)/웰 직경을 이용하여 수축율을 측정하였다.

면역 조직 화학

세포를 4% 파라포름알데하이드로 고정하고 인산화 완충 수용액 내에서 0.1% 트리톤 X-100로 막투과(permeabilization) 처리를 하였다. 고정화 후 세포를 인산화 완충 수용액 내에서 항-인간 VIM(1:200), 항-N-카데린(1:200), 항-HAS(1:200), 항-CD44(1:200), 또는 항-β-카테닌(1:200) 1차 항체, 1% 소 혈청 알부민 및 0.1% 트리톤 X-100과 함께 4℃에서 밤새 배양하였다. 염색 단백질은 Alexa Fluor 488-컨쥬게이트 된 항-토끼 또는 항-마우스 2차 항체 (Molecular Probes, Seoul, Korea)를 사용하여 시각화하였다. 핵은 DAPI(Sigma)로 대비 염색하였다. 염색된 세포는 올림푸스 IX71 형광 현미경 (Olympus, Seoul, Korea)으로 관찰하였다.

형질 주입

마이크로포레이터-미니 (Digital Bio Technology, Seoul, Korea)를 사용하여 pBMN-CD44, pBMN 빈 벡터, 또는 siRNA를 세포 내에 도입하였다. 모든 siRNA는 제놀루션 제약회사 (Seoul, Korea)에서 구입하였다. 벡터 pBMN-CD44 및 Pbmn는 한양대학교 신인철님으로부터 확보하였다.

면역 침전

프로테아즈 억제제(protease inhibitors)로 차가운 용해 버퍼(40 mM Tris-HCl (pH 8.0), 120 mM NaCl, 0.1% Nonidet-P40)를 사용하여 단백질을 추출함으로써 교모세포종 세포 용해물을 준비하였다. 단백질 A-세파로오스 (Sigma-Aldrich)를 사용하여 용해물로부터 불필요한 물질을 미리 제거한 뒤, 상청액 분율을 1차 항체와 함께 4℃에서 4시간 동안 배양하였다. 이후 4℃에서 2분 동안 원심분리를 수행한 뒤, 단백질 A-세파로오스와 함께 1시간 동안 배양시킨 후 면역 침전물을 회수하였다. 펠렛을 용해 버퍼로 5회 세척하였다. SDS 샘플 버퍼에 용해된 면역 침전물은 웨스턴 블럿으로 분석하였다.

IHC 분석

파라핀 섹션을 준비하기 위하여 마우스 조직 및 환자 조직을 포르말린에서 고정하였다. 파라핀에 삽입된 조직 섹션을 크실렌, 95, 90 및 70% 에탄올 하에서 파라핀을 제거하였다. 인산화 완충 수용액 내 20mg/mL 프로테이나제와 0.1% 트리톤 X-100을 이용하여 에피토프를 노출시켰다. 섹션을 H&E 염색을 하거나, 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새 면역 염색을 수행하였다. 인산화 완충 수용액으로 세척한 후, 섹션에 비오티닐화된 염소 항-토끼 IgG 또는 항-마우스 IgG 항체를 30분 동안 적용하였다. 인산화 완충 수용액으로 세척한 후, ABC 시약 (Vector Laboratories Inc, Burlingame, CA, USA)을 섹션에 30분 동안 적용하였다. 3, 3'-디아미노벤지딘 (Vector Laboratories)을 이용하여 발색 반응을 수행하였다. 헤마톡실린을 이용한 대비 염색 후 농도가 다른 일련의 에탄올(graded ethanol series) 및 크실렌으로 세척하고, 캐나다 발삼으로 섹션을 마운팅(mounting) 하였다. 이미지는 IX71 현미경 (Olympus, Seoul, Korea)에서 DP71 디지털 이미지 시스템으로 캡쳐하였다. 정량화는 칼라 데콘볼루션 플러그-인을 이용하여 DAB 및 헤마톡실린을 분리한 뒤 DAB 신호를 정량하여 이미지 J 소프트웨어로 수행하였다.

동물 실험

6 내지 8주된 수컷의 무흉선 발브/시 누드 마우스 (Central Lab Animal Inc., Seoul, Korea)를 사용하였다. 가이드-스크류 시스템을 사용하여 U87MG 교모세포종 세포를 마우스의 오른쪽 전두엽에 이식하였다. 해밀턴 시린지 (Dongwoo Science Co., Seoul, Korea)를 통해 5X10⁵ U87MG 교모세포종 세포를 4.5 mm의 깊이에 주입하였다. 다중 마이크로-주입식 시린지 펌프 (Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA)를 사용하여 0.5㎕/분의 속도로 5마리의 마우스에 동시에 U87MG 교모세포종 세포를 주입하였다.

마이크로 어레이( Microarray )

트리졸을 이용하여 RNA를 분리한 뒤 Illumina Human HT-12 V.4 BeadChip (Illumina, Inc., San Diego, CA, USA)을 이용하여 유전자 발현 프로파일을 결정하였다. 데이터 값은 로그로 변환하였고, 변위치 방법(quantile method)으로 표준화하였다. 유전자는 방사선 조사에 의해 2배 증가한 것을 선택하였고, MultiExperiment 뷰어 프로그램을 사용하여 히트맵을 작성하였다.

통계적 분석

모든 실험 데이터는 평균으로 나타내었고, 에러 막대는 표준 편차(standard deviation, SD)로 나타내었다. 통계적 분석은 GraphPad Prism 7.0에서 모수적 스튜던트 테스트 (parametric Student's t-test)로 결정 하였다.

방사선 조사된 교모세포종 세포의 침윤성과 관련하여 발현되는 간엽성의 특성

방사선이 교모세포종의 진행에 미치는 영향을 알아보기 위하여, U87 교모세포종 세포에 이온화 방사선 (2 Gy x 3; 3일 동안 2 Gy/일로 조사)을 조사하였다. 이후 콜라겐 Ⅰ형, 일반적인 ECM 성분 및 마트리겔을 기저막과 유사한 조성으로 혼합한 뒤 성장 배지 내에서 굳혀 제조한 콜라겐 기반 매트릭스 상에서 방사선 조사된 세포와 방사선 조사하지 않은 세포의 침윤성을 비교하였다. 도 1에서 보는 바와 같이, 상기 매트릭스에 도말된, 방사선 조사된 U87MG 교모세포종 세포는 방사선이 조사되지 않은 세포에 비교하여 높은 침윤성을 보였다. 침윤성을 시각화하기 위하여 U87MG 교모세포종 세포에 녹색 형광 단백질(GFP)을 형질 도입한 뒤 U87MG 스페로이드(spheroid)를 매트릭스에 접종하였다. 도 2 및 3에서 보는 바와 같이, 방사선이 조사된 스페로이드는 매트릭스에서 높은 침윤성을 보였다. 교모세포종 세포가 재발 시 간엽계 아형으로 전환하는 경향을 갖는 지 확인하기 위하여, 방사선 조사 후 교모세포종 세포에서 간엽계 아형 마커의 발현 수준을 조사하였다. 도 4 내지 6에서 보는 바와 같이 방사선의 분할 조사 시 교모세포종에서 간엽계 단백질인 YKL40, 비멘틴(VIM), CD44, CDH-2 및 ZEB1의 발현량이 증가하였다. 이로써 방사선 조사 시 교모세포종 세포의 침윤성은 간엽계로의 전환과 관련이 있음을 알 수 있다. 생체 내에서 상기 관련성을 확인해 보기 위하여, 도 7에서 보는 바와 같이, U87MG 교모세포종 세포를 마우스의 뇌에 정위적으로 주입하였다. 주입 후 11일이 경과하자 뇌 종양이 형성되어, 마우스의 뇌에 방사선을 조사하였다(2.5 Gy x 3) 다. 방사선이 조사된 마우스의 뇌 섹션의 조직학적 염색 결과, 종양 조직이 느슨하고 뚜렷한 경계를 보이지 않으며, 교모세포종 세포가 가장자리 부분으로부터 용해된 것으로 보였다. 하지만, 방사선이 조사되지 않은 마우스의 뇌 섹션의 경우 온전한 종양 조직을 보였으며, 조직이 빽빽한 밀도를 갖는 것을 볼 수 있었다(도 8). 또한, 생체 외 데이터로, 도 9 및 10에서 보는 바와 같이, 방사선이 조사된 종양 조직의 경우 방사선이 조사되지 않은 종양 조직 보다 CDH-2, VIM, CD44 및 ZEB1의 발현 수준이 높은 것을 볼 수 있었다.

이를 통하여, 교모세포종 세포에 방사선 조사 시 표현형이 간엽계 아형으로 전환됨에 따라 상기 교모세포종 세포의 침윤성이 증가하는 것을 알 수 있다.

방사선 조사 후 HAS2 -중재 히알루론산 합성을 통한 간엽계로의 전환

ECM 조절 장애(dysregulation) 및 분열(disorganization)이 교모세포종의 침윤성과 관련이 있음을 확인하기 위하여, 종양 미세 환경에 있어서 방사선 조사 시 ECM 조성의 변화를 확인하였다. 이를 위하여, 도 11에서 보는 바와 같이, 방사선이 조사되지 않은 U87MG 교모세포종 세포와, 방사선이 조사된 U87MG 교모세포종 세포를 성장 배지 내에서 콜라겐 Ⅰ형과 마트리겔의 혼합물을 포함하는 Millicell 삽입물 상에 도말한 뒤 세포가 3일 동안 ECM 성분을 분비하도록 하였다. 이후, 퓨로마이신으로 교모세포종 세포를 사멸시키고 상기 교모세포종 세포가 분비한 ECM만이 남도록 하였다. 이어서, U87MG 교모세포종 세포를 상기와 같이 방사선이 조사된 교모세포종 세포가 분비한 ECM에서 배양한 후, 겔 매트릭스를 수직으로 절단하고 H&E 염색을 수행하여 상기 세포의 침윤 정도를 시각화하였다. 그 결과 도 12에서 보는 바와 같이, 방사선이 조사된 교모세포종 세포에서 분비한 ECM에 도말한 교모세포종 세포는, 방사선이 조사되지 않은 교모세포종 세포가 분비한 ECM에 도말한 교모세포종 세포보다 높은 침윤성을 보였다. 동시에, 도 13에서 보는 바와 같이, 방사선이 조사된 교모세포종 세포는 방사선이 조사되지 않은 세포와 비교하여 콜라겐 겔을 수축시키는 것을 볼 수 있었고, 이는 방사선 조사가 침윤성 ECM 리모델링을 위하여 생물학적 긴장(biomechanical tension)을 변화시키는 것을 알 수 있었다. 즉, 방사선 조사는 종양의 미세 환경에서 ECM을 변화시키고, 이는 교모세포종 세포의 침윤성과 관련이 있는 것을 알 수 있었다. 이에, ECM 성분 중 특히 어떤 성분이 침윤성과 관련되어 있는 지 조사하기 위하여, 방사선이 조사된 U87MG 교모세포종 세포에서 분비한 다양한 ECM 성분인 COL1A1 (collagen type I alpha 1), COL3A1 (collagen type III alpha 1), BCAN (brevican), VCAN (versican), NCAN (neurocan), ACAN (aggrecan), 및 히알루론산의 발현 수준을 측정하였다. 한편, 상기 히알루론산은 다당류로 세포 조정된 배지 내 그 발현 수준을 확인하기 위하여 ELISA 분석을 수행하였다. 그 결과, 방사선 조사 후 교모세포종 세포의 조정된 배지에서 히알루론산의 발현 수준만 현저하게 변화하였고, 그 외의 성분들은 특별한 변화를 보이지 않았다(도 14 내지 16). 또한, 도 17에서 보는 바와 같이, 콜라겐 기반 매트릭스에서 성장한, 방사선이 조사된 U87MG 교모세포종 세포는 방사선이 조사되지 않은 세포와 비교하여 히알루론산 염색이 강하게 된 것을 볼 수 있다. 히알루론산 합성 효소(HAS)가 히알루론산 합성에 중요한 역할을 하므로, qRT-PCR을 이용하여 방사선이 조사된 U87MG 교모세포종 세포에서 HAS1, HAS2 및 HAS3의 발현 수준을 분석하였다. 그 결과 도 18 및 19에서 보는 바와 같이, 방사선 조사 시 HAS2의 발현 수준이 HAS1 또는 HAS3에 비하여 현저하게 증가한 것을 확인할 수 있었다. 더욱이, 도 20에서 보는 바와 같이, 상기 HAS2에 있어서 방사선의 조사량이 증가할수록(10, 20, 또는 30 Gy) 그 발현 수준 또한 증가하는 것을 볼 수 있었다. 방사선 조사 시 히알루론산의 합성이 증가하는 것이 HAS2에 기인한 것인지 확인하기 위하여, 상기 HAS2에 대한 소간섭 RNA(siRNA)를 처리해 상기 HAS2의 발현 수준을 감소시킨 결과, 도 21에서 보는 바와 같이, 방사선을 조사하여도 히알루론산의 생산량이 크게 증가하지 않는 것을 볼 수 있었다. 하지만, HAS1 또는 HAS3의 넉다운 시 상기한 효과는 얻을 수 없었다. 방사선 조사에 대응하여 교모세포종 세포의 침윤성에 있어서 히알루론산이 중요한 ECM 성분인지 확인하기 위하여, 교모세포종 세포를 HAS2 siRNA 또는 스크램블 siRNA(scrambled siRNA)로 형질 전환시킨 뒤 방사선을 조사하고, 상기 교모세포종 세포에 의해 조정된 ECM에서 U87MG 교모세포종 세포의 침윤성을 비교하였다. 그 결과 도 22에서 보는 바와 같이, HAS2의 발현 수준이 감소된 교모세포종 세포에 의해 조정된 ECM에서 U87MG 교모세포종 세포의 침윤성은 대조군에 비하여 감소된 것을 확인할 수 있었다. 게다가 도 23에서 보는 바와 같이, HAS2 감소는 방사선이 교모세포종 세포의 형상을 수축시키는 효과 또한 저하시키는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통하여 히알루론산이 방사선 조사에 대응한 침윤성 ECM 리모델링에 영향을 미치는 것을 알 수 있었다.

한편, 히알루론산은 합성된 이후에 히알루로니다제(HYALs)에 의해 작은 분자량의 형태로 이화된다. 방사선 조사 시 상기와 같이 히알루론산을 이화시키는 히알루로니다제가 유도되는지 확인하였다. 그 결과, 방사선 조사된 U87MG 교모세포종 세포에서 히알루로니다제 1(HYAL-1) 및 히알루로니다제 3(HYAL-3)은 방사선이 조사되지 않은 교모세포종 세포와 비교하여 발현 수준이 대략 2배 이상 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 24 및 25). 이를 통하여 방사선 조사 시 히알루론산 합성이 촉진되고 이를 작은 분자 형태로 분해하는 가수분해 반응 또한 촉진되는 것을 알 수 있었다.

히알루론산이 교모세포종의 침윤성에 직접적으로 영향을 미치는 지 확인하기 위하여, 히알루론산의 짧은 형태(short forms)를 첨가하여 침윤능 분석을 수행하였다. 도 26 및 27에서 보는 바와 같이, 히알루론산을 첨가한 결과 농도 의존적으로 교모세포종 세포의 침윤성이 증가하였다. 히알루론산의 외인성 첨가는 방사선 조사와 마찬가지로 간엽성 아형 마커 단백질인 YKL40, VIM 및 CDH-2의 발현을 촉진하였다(도 28). 면역 조직 화학적 분석(IHC) 결과, 방사선이 조사되지 않은 마우스의 뇌 종양 섹션보다 방사선이 조사된 뇌 종양 섹션에서 HAS2 및 히알루론산 발현 수준이 높은 것을 볼 수 있었다(도 29). 마우스 뇌 종양의 qRT-PCR 분석 결과, 도 30에서 보는 바와 같이 방사선 조사에 의해 HAS2 발현이 유도되는 것을 알 수 있었다.

이러한 결과로부터 방사선 조사는 HAS2 발현을 촉진하고, 그에 따라 종양 미세 환경에서 히알루론산이 증가함에 따라 교모세포종 세포의 간엽계 이동을 일으키며 침윤성을 향상시키는 것을 알 수 있었다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Method for screening therapeutic agents for recurrent cancer <130> DPB167329 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 417 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Thr Thr Gln Leu Gly Pro Ala Leu Val Leu Gly Val Ala Leu Cys 1 5 10 15 Leu Gly Cys Gly Gln Pro Leu Pro Gln Val Pro Glu Arg Pro Phe Ser 20 25 30 Val Leu Trp Asn Val Pro Ser Ala His Cys Glu Ala Arg Phe Gly Val 35 40 45 His Leu Pro Leu Asn Ala Leu Gly Ile Ile Ala Asn Arg Gly Gln His 50 55 60 Phe His Gly Gln Asn Met Thr Ile Phe Tyr Lys Asn Gln Leu Gly Leu 65 70 75 80 Tyr Pro Tyr Phe Gly Pro Arg Gly Thr Ala His Asn Gly Gly Ile Pro 85 90 95 Gln Ala Leu Pro Leu Asp Arg His Leu Ala Leu Ala Ala Tyr Gln Ile 100 105 110 His His Ser Leu Arg Pro Gly Phe Ala Gly Pro Ala Val Leu Asp Trp 115 120 125 Glu Glu Trp Cys Pro Leu Trp Ala Gly Asn Trp Gly Arg Arg Arg Ala 130 135 140 Tyr Gln Ala Ala Ser Trp Ala Trp Ala Gln Gln Val Phe Pro Asp Leu 145 150 155 160 Asp Pro Gln Glu Gln Leu Tyr Lys Ala Tyr Thr Gly Phe Glu Gln Ala 165 170 175 Ala Arg Ala Leu Met Glu Asp Thr Leu Arg Val Ala Gln Ala Leu Arg 180 185 190 Pro His Gly Leu Trp Gly Phe Tyr His Tyr Pro Ala Cys Gly Asn Gly 195 200 205 Trp His Ser Met Ala Ser Asn Tyr Thr Gly Arg Cys His Ala Ala Thr 210 215 220 Leu Ala Arg Asn Thr Gln Leu His Trp Leu Trp Ala Ala Ser Ser Ala 225 230 235 240 Leu Phe Pro Ser Ile Tyr Leu Pro Pro Arg Leu Pro Pro Ala His His 245 250 255 Gln Ala Phe Val Arg His Arg Leu Glu Glu Ala Phe Arg Val Ala Leu 260 265 270 Val Gly His Arg His Pro Leu Pro Val Leu Ala Tyr Val Arg Leu Thr 275 280 285 His Arg Arg Ser Gly Arg Phe Leu Ser Gln Asp Asp Leu Val Gln Ser 290 295 300 Ile Gly Val Ser Ala Ala Leu Gly Ala Ala Gly Val Val Leu Trp Gly 305 310 315 320 Asp Leu Ser Leu Ser Ser Ser Glu Glu Glu Cys Trp His Leu His Asp 325 330 335 Tyr Leu Val Asp Thr Leu Gly Pro Tyr Val Ile Asn Val Thr Arg Ala 340 345 350 Ala Met Ala Cys Ser His Gln Arg Cys His Gly His Gly Arg Cys Ala 355 360 365 Arg Arg Asp Pro Gly Gln Met Glu Ala Phe Leu His Leu Trp Pro Asp 370 375 380 Gly Ser Leu Gly Asp Trp Lys Ser Phe Ser Cys His Cys Tyr Trp Gly 385 390 395 400 Trp Ala Gly Pro Thr Cys Gln Glu Pro Arg Pro Gly Pro Lys Glu Ala 405 410 415 Val <210> 2 <211> 435 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Ala His Leu Leu Pro Ile Cys Ala Leu Phe Leu Thr Leu Leu 1 5 10 15 Asp Met Ala Gln Gly Phe Arg Gly Pro Leu Leu Pro Asn Arg Pro Phe 20 25 30 Thr Thr Val Trp Asn Ala Asn Thr Gln Trp Cys Leu Glu Arg His Gly 35 40 45 Val Asp Val Asp Val Ser Val Phe Asp Val Val Ala Asn Pro Gly Gln 50 55 60 Thr Phe Arg Gly Pro Asp Met Thr Ile Phe Tyr Ser Ser Gln Leu Gly 65 70 75 80 Thr Tyr Pro Tyr Tyr Thr Pro Thr Gly Glu Pro Val Phe Gly Gly Leu 85 90 95 Pro Gln Asn Ala Ser Leu Ile Ala His Leu Ala Arg Thr Phe Gln Asp 100 105 110 Ile Leu Ala Ala Ile Pro Ala Pro Asp Phe Ser Gly Leu Ala Val Ile 115 120 125 Asp Trp Glu Ala Trp Arg Pro Arg Trp Ala Phe Asn Trp Asp Thr Lys 130 135 140 Asp Ile Tyr Arg Gln Arg Ser Arg Ala Leu Val Gln Ala Gln His Pro 145 150 155 160 Asp Trp Pro Ala Pro Gln Val Glu Ala Val Ala Gln Asp Gln Phe Gln 165 170 175 Gly Ala Ala Arg Ala Trp Met Ala Gly Thr Leu Gln Leu Gly Arg Ala 180 185 190 Leu Arg Pro Arg Gly Leu Trp Gly Phe Tyr Gly Phe Pro Asp Cys Tyr 195 200 205 Asn Tyr Asp Phe Leu Ser Pro Asn Tyr Thr Gly Gln Cys Pro Ser Gly 210 215 220 Ile Arg Ala Gln Asn Asp Gln Leu Gly Trp Leu Trp Gly Gln Ser Arg 225 230 235 240 Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Met Pro Ala Val Leu Glu Gly Thr Gly 245 250 255 Lys Ser Gln Met Tyr Val Gln His Arg Val Ala Glu Ala Phe Arg Val 260 265 270 Ala Val Ala Ala Gly Asp Pro Asn Leu Pro Val Leu Pro Tyr Val Gln 275 280 285 Ile Phe Tyr Asp Thr Thr Asn His Phe Leu Pro Leu Asp Glu Leu Glu 290 295 300 His Ser Leu Gly Glu Ser Ala Ala Gln Gly Ala Ala Gly Val Val Leu 305 310 315 320 Trp Val Ser Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile 325 330 335 Lys Glu Tyr Met Asp Thr Thr Leu Gly Pro Phe Ile Leu Asn Val Thr 340 345 350 Ser Gly Ala Leu Leu Cys Ser Gln Ala Leu Cys Ser Gly His Gly Arg 355 360 365 Cys Val Arg Arg Thr Ser His Pro Lys Ala Leu Leu Leu Leu Asn Pro 370 375 380 Ala Ser Phe Ser Ile Gln Leu Thr Pro Gly Gly Gly Pro Leu Ser Leu 385 390 395 400 Arg Gly Ala Leu Ser Leu Glu Asp Gln Ala Gln Met Ala Val Glu Phe 405 410 415 Lys Cys Arg Cys Tyr Pro Gly Trp Gln Ala Pro Trp Cys Glu Arg Lys 420 425 430 Ser Met Trp 435

Claims (13)

1. (a) 교모세포종 세포에 방사선을 조사하는 단계;
   (b) 상기 방사선이 조사된 교모세포종 세포에 약물을 처리하는 단계;
   (c) 상기 약물이 투여된 교모세포종 세포의 히알루로니다제 3(Hyaluronidase 3, HYAL3) 또는 이를 코딩하는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
   (d) 상기 교모세포종 세포의 히알루로니다제 3 또는 이를 코딩하는 mRNA 발현 수준이 약물 처리 전에 비하여 감소된 경우, 상기 약물을 재발성 암의 방사선 감수성 증진제의 후보물질로 판단하는 단계를 포함하는 재발성 암의 방사선 감수성 증진제의 스크리닝 방법.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서,
   상기 방사선은 0 초과 4Gy 이하의 조사량으로 조사되는, 재발성 암의 방사선 감수성 증진제의 스크리닝 방법.
5. 제4항에 있어서,
   상기 방사선은 1회 내지 5회 조사되는, 재발성 암의 방사선 감수성 증진제의 스크리닝 방법.
6. 제1항에 있어서,
   상기 (c) 단계에서 히알루로니다제 1(Hyaluronidase 1, HYAL1) 또는 이를 코딩하는 mRNA의 발현 수준을 추가로 측정하여,
   상기 (d) 단계에서 히알루로니다제 1 또는 이를 코딩하는 mRNA 발현 수준이 약물 처리 전에 비하여 감소된 경우, 상기 약물을 재발성 암의 방사선 감수성 증진제의 후보물질로 판단하는, 재발성 암의 방사선 감수성 증진제의 스크리닝 방법.
7. 제1항에 있어서,
   상기 히알루로니다제 3의 발현 수준은 방사능 면역 분석, 방사능 면역 침전, 면역 침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbentassay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 및 샌드위치 분석으로 이루어진 군에서 선택되는 면역 분석 방법에 의해 수행되는, 재발성 암의 방사선 감수성 증진제의 스크리닝 방법.
8. 제1항에 있어서,
   상기 히알루로니다제 3을 코딩하는 mRNA의 발현 수준은 수준은 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의하여 수행되는, 재발성 암의 방사선 감수성 증진제의 스크리닝 방법.
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