KR101894863B1 - 방사선 민감성 마커 조성물 및 진단 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 방사선 조사시 발현량이 크게 변화되는 유전자 또는 이의 발현 단백질에 관한 것으로, 상기 유전자 또는 그 발현 단백질은 Adam8, Hapln3, Ephx1, Nuak1 및 Depdc1b로 이루어진 군에서 선택된 유전자 또는 그 발현 단백질로서, 이는 방사선 민감성 마커 조성물, 키트 또는 민감성 진단에 유용한 정보를 제공하는 방법으로 활용될 수 있으며, 더불어, 상기 유전자 또는 그 발현 단백질을 타겟으로 하여 방사선 민감성을 높이는 약물을 개발하여 방사선 치료 효과를 한층 증진시킬 수 있다.

Description

방사선 민감성 마커 조성물 및 진단 방법{Radiation sensitive marker composition and diagnosing method}
본 발명은 특정 유전자 또는 그 발현 단백질을 포함하는 바이오마커 조성물 및 이의 의학적 용도에 관한 것이다.
암의 치료법은 수술, 방사선 치료법 및 화학요법으로 크게 나눌 수 있다. 상기 치료법으로 50% 정도의 완치율을 나타내는데, 현재 암 환자 중 국내의 경우 약 35%, 미국의 경우 약 50% 정도가 방사선 치료를 받고 있으며, 국내에서 방사선 치료를 받는 암 환자의 수가 매년 증가하고 있기 때문에 암 치료에 있어 방사선 치료의 중요성 또한 증가하고 있다.
방사선 치료는 현재 다양한 종류의 암에 필수적인 치료 방법으로 알려져 있으나, 암세포의 방사선 내성 획득, 고선량 방사선 치료시 정상 조직의 손상 등이 치료의 효율을 떨어뜨려 방사선 치료의 문제점으로 대두되어 왔다.
따라서, 이러한 방사선 치료의 효율을 증대시키기 위한 증진제에 관한 연구들이 계속 진행되고 있는 실정이며, 다양한 체내 2차 신호전달물질들을 자극하는 세포사멸촉진제나 암세포 특이 수용체를 자극하여 세포사멸을 일으키는 물질, 세포주기 교란물질, 전사인자 억제물질 등을 대상으로 하여 연구를 하고 있다.
현재 항암제로 알려진 탁솔(Taxol)과 5-FU(5-fluorouracil) 등이 방사선 치료시 병용투여를 통하여 방사선 치료 효율을 증진시키는 것으로 알려져 있다.
그러나, 상기와 같이 방사선치료 효과를 증진시키기 위해 사용되는 항암제들을 방사선 치료와 병용할 때, 항암제의 독성이 방사선 치료시 나타나는 부작용, 즉, 방사선 치료부위의 염증, 위장장애, 오심, 구토, 설사 등과 복합적으로 나타날 수 있기 때문에 사용에 제한이 있다는 단점이 있다.
방사선 치료의 효과를 최대화시켜 다양한 암 질환을 효과적으로 치료하기 위해서 상기 문제점이 해결되어 부작용이 최소화된 방사선 민감제의 개발이 요구되고 있다.
1. 대한민국특허 10-2010-0118239
따라서 본 발명은 방사선 민감성 마커 조성물을 제공하는 데 그 목적이 있다.
또한 본 발명은 방사선 민감성 진단용 키트를 제공하는 데 또 다른 목적이 있다.
또한 본 발명은 방사선 민감성 진단에 유용한 정보를 제공하는 방법을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.
또한 본 발명은 방사선 민감성 증진용 조성물을 제공하는 데 또 다른 목적이 있다.
또한 본 발명은 방사선에 대한 민감도를 증진시키는 화합물의 스크리닝 방법을 제공하는 데 또 다른 목적이 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Adam8, Hapln3, Ephx1, Nuak1 및 Depdc1b로 이루어진 군에서 선택된 유전자 또는 그 발현 단백질 중 어느 하나 이상을 포함하는 방사선 민감성 마커 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 Adam8, Hapln3, Ephx1, Nuak1 및 Depdc1b로 이루어진 군에서 선택된 유전자에 결합하는 프라이머쌍 또는 프로브, 또는 그 발현 단백질에 결합하는 항체 중 어느 하나 이상을 포함하는 방사선 민감성 진단용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 생물학적 시료에서 Adam8, Hapln3, Ephx1, Nuak1 및 Depdc1b로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 또는 그 발현 단백질의 발현 변화를 분석하는 단계를 포함하는 방사선 민감성 진단에 유용한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 Adam8, Hapln3, Ephx1, Nuak1 및 Depdc1b로 이루어진 군에서 선택된 유전자 또는 그 발현 단백질의 억제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방사선 민감성 증진용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 생물학적 시료에 임의의 화합물을 처리하는 단계; 상기 생물학적 시료로부터 Adam8, Hapln3, Ephx1, Nuak1 및 Depdc1b로 이루어진 군에서 선택된 유전자 또는 그 발현 단백질의 발현 수준을 확인하는 단계; 및 상기 발현 수준을 임의의 화합물을 처리하지 않은 정상 대조군에서의 동일 유전자 또는 단백질의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 방사선에 대한 민감도를 증진시키는 화합물 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, Adam8, Hapln3, Ephx1, Nuak1 및 Depdc1b로 이루어진 군에서 선택된 유전자 또는 그 발현 단백질은 장상피세포(IEC-6)에 방사선 조사시 발현량이 크게 변화되므로, 방사선 민감성 마커 조성물, 키트 또는 민감성 진단에 유용한 정보를 제공하는 방법으로 활용될 수 있으며, 더불어, 상기 유전자 또는 그 발현 단백질을 타겟으로 하여 방사선 민감성을 높이는 약물을 개발하여 방사선 치료 효과를 한층 증진시킬 수 있다.
도 1은 발명의 일실시예에 따라 발굴된 총 유전자의 계층별 클러스터링을 나타낸 것이고,
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 마이크로어레이 데이터를 재확인하고자 수행한 실시간 PCR(real-time PCR) 결과를 나타낸 것이고,
도 3은 특정 유전자의 결손(knock down)을 위해 작은 간섭 RNA(siRNA)를 일시적으로 형질주입(transient transfection)한 후 발현양을 실시간 PCR(real-time PCR)로 확인한 것이고,
도 4는 특정 유전자를 결손시킨 후 방사선 조사의 영향을 집락형성 분석법(clonogenic assay)을 통해 확인한 것이고,
도 5는 특정 유전자를 결손시킨 후 방사선 조사의 영향을 MTT 분석으로 확인한 것이다.
본 발명자들은 방사선이 조사된 세포의 유전자의 발현 변화 양상에 대하여 연구하던 중, 특정 유전자의 발현이 변하는 것을 확인하였다. 특히 방사선 조사시 Adam8, Hapln3 및 Ephx1의 유전자의 발현의 증가와 Nuak1 및 Depdc1b의 유전자의 발현의 감소를 확인한 후, 상기 유전자들의 결핍시 방사선에 의한 세포의 생존율을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명은 Adam8, Hapln3, Ephx1, Nuak1 및 Depdc1b로 이루어진 군에서 선택된 유전자 또는 그 발현 단백질 중 어느 하나 이상을 포함하는 방사선 민감성 마커 조성물을 제공한다.
상기 유전자들은 각각 Adam8: XM_001056204, Hapln3: NM_001008559, Ephx1: NM_001034090, Nuak1: XM_001079579 및 Depdc1b: XM_001074048의 식별 넘버(accession ID)를 갖는다.
상기 Adam8, Hapln3 및 Ephx1로 이루어진 군에서 선택된 유전자 또는 그 발현 단백질은 방사선 처리에 의하여 발현이 증가하며, 상기 Nuak1 및 Depdc1b로 이루어진 군에서 선택된 유전자 또는 그 발현 단백질은 방사선 처리에 의하여 발현이 감소한다.
상기 단백질을 포함하는 마커 조성물의 검출은 인간의 조직 또는 체액으로부터 이차원 전기영동으로 상기 단백질의 존재를 직접 검출하거나, 인간의 조직 또는 체액을 본 발명의 항체와 접촉시켜 항원항체반응을 통해 상기 단백질의 존재를 간접적으로 확인함으로써 수행할 수 있다. 항원항체반응으로서, 면역분석법은 효소면역측정법 (ELISA, Coated tube), 항체결합 마그네틱 입자를 이용한 마그네틱 입자법, 항체결합 라텍스를 이용한 라텍스 입자법 등을 포함한다.
더불어 상기 유전자를 포함하는 마커 조성물의 검출은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), 노던 블롯팅(Northern blotting), DNA 칩 등을 통해 확인할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
더불어 본 발명은 Adam8, Hapln3, Ephx1, Nuak1 및 Depdc1b로 이루어진 군에서 선택된 유전자에 결합하는 프라이머쌍 또는 프로브, 또는 그 발현 단백질에 결합하는 항체 중 어느 하나 이상을 포함하는 방사선 민감성 진단용 키트를 제공한다.
상기 프로브는 올리고뉴클로타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브 및 RNA 프로브로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 프라이머쌍 또는 프로브를 포함하는 키트는 생물학적 시료에서 상기 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 측정하는 데 사용할 수 있다.
이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), 노던 블롯팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항체는 다클론성 항체(polyclonal antibody) 또는 단일클론 항체(monoclonal antibody)이다.
상기 다클론성 항체는 당업자에 알려진 방법에 따라 면역원으로 상기 유전자에 의해 발현된 단백질 또는 그 단편을 외부 숙주에 주사함으로써 제조할 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 랫트, 양 또는 토끼와 같은 포유동물을 포함한다. 면역원은 근내, 복강내 또는 피하 주사방법으로 주사되며, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여된다. 외부숙주로부터 정기적으로 혈청을 채취하여 향상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하거나 이로부터 항체를 분리정제한다.
상기 단일클론 항체는 당업자에 알려진 융합에 의한 불멸화된 세포주 생성기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 유전자에 의해 발현된 단백질을 마우스에 면역화시키거나 펩타이드를 합성하여 소혈청 알부민과 결합시켜 마우스에 면역화시킨다. 마우스에서 분리된 항원-생산 B 임파구를 인간 또는 마우스의 골수종(myeloma)과 융합하여 불멸화된 하이브리도마(hybridoma)를 생성하며, 상기 하이브리도마 세포를 가지고 간접적인 효소 결합 면역흡착 분석법(enzyme-linked immunoabsorbent assays, ELISA)을 사용하여 모노클노날 항체의 생성 여부를 확인하고 양성 클론을 택하여 배양한 후 항체를 분리정제하거나 랫트의 복강에 주입한 후 복수를 채취함으로써, 단일클론 항체를 제조할 수 있다.
상기 단일클론 항체는 일반적으로 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase, AP) 또는 호올스래디쉬 퍼록시다제(horseradish peroxidase, HRP) 등의 효소가 결합된 2차 항체 및 이들의 기질을 사용하여 발색반응 시킴으로써 정량분석할 수도 있고, 또는 직접 상기 단백질에 대한 단일클론 항체에 AP 또는 HRP 효소 등이 결합된 것을 사용하여 정량분석할 수 있다.
상기 단백질과 항체의 반응은 웨스턴 블랏(western blot), 면역침강법(Immunoprecipitation, IP), 효소 결합 면역흡착 분석법(enzyme-linked immunoabsorbent assays, ELISA) 및 면역염색법(Immunohistochemistry, IHC)등의 단백질 확인 실험을 통해 확인할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항체를 포함하는 키트는 전형적으로 동결건조형태의 항체와 버퍼, 안정화제, 불활성 단백질 등을 포함할 수 있으며, 상기 항체는 방사종(radionuclides), 형광원(fluorescors), 효소(enzymes) 등에 의해 표지화될 수 있다.
또한 본 발명은 생물학적 시료에서 Adam8, Hapln3, Ephx1, Nuak1 및 Depdc1b로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 또는 그 발현 단백질의 발현 변화를 분석하는 단계를 포함하는 방사선 민감성 진단에 유용한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 생물학적 시료는 세포, 이를 포함하는 세포주 또는 이를 포함하는 조직일 수 있으며, 바람직하게는 세포일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
더불어 본 발명은 Adam8, Hapln3, Ephx1, Nuak1 및 Depdc1b로 이루어진 군에서 선택된 유전자 또는 그 발현 단백질의 억제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방사선 민감성 증진용 조성물을 제공한다.
상기 억제제는 Adam8, Hapln3, Ephx1, Nuak1 및 Depdc1b로 이루어진 군에서 선택된 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드(antisense RNA) 또는 작은 간섭 RNA(small interfering RNA)에서 선택된 어느 하나이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 상기 억제제는 Adam8, Hapln3, Ephx1, Nuak1 및 Depdc1b로 이루어진 군에서 선택된 유전자의 발현 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩타이드 및 항체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 "방사선 민감성 증진"이란 방사선을 이용한 질병 치료에 있어서, 방사선에 대한 세포의 민감성을 증진시키는 것을 의미한다. 이를 통해 방사선 치료 효율을 상승시킬 수 있는데, 특히, 암 치료시 병행처리되면 암세포의 방사선 민감성이 증진되어 암세포의 살상 효과 및 증식 억제효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 방사선 민감성 증진용 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제제화될 수 있다.
본 발명에서 "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 방사선 민감성 증진용 조성물은 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용 제형으로 제조할 수 있으며, 투여의 용이성과 투여량의 균일화를 위해 단위 투여 형태로 제형화할 수 있다. 본 발명의 약학적 제형은 구강(oral), 직장(rectal), 비강(nasal), 국소(topical; 볼 및 혀 밑을 포함), 피하, 질(vaginal) 또는 비경구(parenteral; 근육내, 피하 및 정맥 내를 포함) 투여에 적당한 것 또는 흡입(inhalation) 또는 주입(insufflation)에 의한 투여에 적당한 형태를 포함한다.
상기 경구 투여용 제형으로는, 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마스네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 함유할 수 있다.
또한, 상기 비경구 투여용 제형으로는, 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태, 좌제 주입방식 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 좌제로 주입하기 위해서는, 코코아버터 또는 다른 글리세라이드 등 통상의 좌약 베이스를 포함하는 좌약 또는 체료 관장제와 같은 직장투여용 조성물로 제제화할 수 있다. 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.
더불어 본 발명은 생물학적 시료에 임의의 화합물을 처리하는 단계; 상기 생물학적 시료로부터 Adam8, Hapln3, Ephx1, Nuak1 및 Depdc1b로 이루어진 군에서 선택된 유전자 또는 그 발현 단백질의 발현 수준을 확인하는 단계; 및 상기 발현 수준을 임의의 화합물을 처리하지 않은 정상대조군에서의 동일 유전자 또는 단백질의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 방사선에 대한 민감도를 증진시키는 화합물 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 생물학적 시료는 세포, 이를 포함하는 세포주 또는 이를 포함하는 조직일 수 있으며, 바람직하게는 세포일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실시예 1> 세포주 및 방사선 조사
랫트의 장상피세포(intestinal epithelial cell, IEC-6)는 10%의 소태아혈청(Fetal bovine serum, FBS)을 첨가한 DMEM 배양배지를 이용하여 5% CO2, 37℃ 인큐베이터에서 배양하였다. 배양한 세포에 감마선을 조사하였으며, 137Cs γ-선 소스 (Atomic Energy of Canada, Ltd, Canada)를 사용하였다.
< 실시예 2> 마이크로어레이 분석을 통한 방사선 피폭 진단용 유전자 발굴
1. RNA 추출
100mm 플레이트(plate)에 배양한 세포에 1ml의 트리졸(TRIzol, Invitrogen)을 첨가한 후, 클로로포름(chloroform)을 첨가하여 RNA를 추출하였다. 시료를 15 내지 20초 동안 진탕하고, 실온에서 2 내지 3분 동안 배양한 후, 차가운 이소프로판올(isopropanol)을 처리하여 수층을 분리하고 차가운 70% 에탄올로 세정하였다. 세정하고 얻은 RNA 펠렛을 공기 건조한 후 50ul의 디에틸 피로카보네이트(diethylpyrocarbonate, DEPC)가 포함된 물에 재현탁하였다.
2. 마이크로어레이 분석
상기 실시예 2 중 1에서 준비한 각각의 RNA 10㎍을 역전사효소, SuperScrip ll (Invitrogen, Carlsbad, California)을 이용한 역전사 반응을 통해 시아닌(Cy5) 접합 dCTP (Amersharm, Piscataway, NJ)로 표지하였다. 에탄올 침강법을 이용하여 표지된 cDNA를 농축하였다. 상기 표지 cDNA를 Roche NimbleGen Human whole genome 12-plex array (Roche NimbleGen, Inc., WI) 상에 놓고, NimbleGen H12 mixer (Roche NimbleGen, Inc., WI)로 덮었다. 상기 슬라이드를 이용하여 42℃ MAUI 시스템(Biomicro systems, Inc. UT)에서 12시간 동안 혼성화 반응을 수행하였다. 혼성화된 슬라이드를 실온에서 2X 살린-소듐 시트레이트 용액(saline-sodium citrate solution, SSC), 0.1 % 소듐 도데실 설포네이트(saline-sodium citratesolution, SDS)에서 2분, 1 X SSC에서 3분, 그 후 0.2 X SSC에서 2분 동안 세정하였다. 얻어진 슬라이드를 3,000rpm에서 20초 동안 원심분리하여 건조하였다.
3. 마이크로어레이 데이터 분석
상기 어레이를 Roche NimbleGen Inc.에 제출하였다. 칩 당 각 게놈의 12개의 복제물이 포함되었다. 평균 3개의 다른 60-베이스 올리고뉴클레오티드(60-mer 탐침)가 게놈의 각 유전자로 나타났다. 표적 게놈에서 모든 다른 60-mer 탐침과 비교하여 적어도 3개의 미스매치를 가지는 각 탐침을 선별하였다. 대조군 체크(혼성화)는 on-chip 대조군 올리고뉴클레오티드를 포함한 각 어레이에서 수행하였다. 상기 어레이는 관련 소프트웨어를 갖는 Axon GenePix 4000B 스캐너를 이용하여 분석하였다. 유전자 발현 수준은 NimbeScan Version 2.4 (Roche NimbleGen, Inc., WI)를 이용하여 산출하였고 각 유전자에 관한 상대적인 신호강도는 Robust Multi-Array Average algorithm을 이용하여 산출하였다. 각 데이터는 NimbeScan Version 2.4 (Roche NimbleGen, Inc., WI)를 이용한 중위수 다듬기 표준화법(median polish normalization method)을 근거로 처리하였다. 이렇게 표준화되고 로그 변환된 강도값은 GeneSpring GX 10 (Agilent technologies, CA)을 이용하여 분석하였다. 상향 조절된 유전자로서 대조군의 적어도 200% 이상으로 존재하는 유전자와, 하향 조절된 유전자로서 대조군의 50% 이하로 존재하는 유전자를 측정하기 위하여 배수 변화 필터를 포함하였다.
그 결과, 도 1과 같은 총 유전자의 계층별 클러스터링이 나타났으며, 방사능 조사에 따른 발현의 변화를 보이는 유전자와 그 변화 폭을 표 1에 나타내었다.
하기 표 1과 같이, 방사선 조사 전후 총 10개의 유전자의 발현 양상이 달라졌으며, Rars, Litaf, Adam8, Hapln3 및 Ephx1는 발현이 증가되었고, Adsl, Nuak1, Depdc1b, Prc1 및 RGD1560076의 발현은 감소된 것을 확인하였다.
유전자 명 유전자 설명 Target ID Test / Control . fc
1 Rars arginyl-tRNA synthetase XM_213276 5.239229
2 Litaf lipopolysaccharide-induced TNF factor XM_001078236 3.990412
3 Adam8 ADAM metallopeptidase domain 8 XM_001056204 3.824811
4 Hapln3 hyaluronan and proteoglycan link protein 3 NM_001008559 3.783261
5 Ephx1 Epoxide hydrolase 1, microsomal NM_001034090 3.770394
6 Adsl Adenylosuccinate lyase XM_001076341 -4.69635
7 Nuak1 NUAK family, SNF1-like kinase,1 XM_001079579 -4.744969
8 Depdc1b DEP domain containing 1B XM_001074048 -5.152876
9 Prc1 Protein regulator of cytokinesis 1 XM_218820 -5.93975
10 RGD1560076 Similar to 60S ribosomal protein L29(P23) XM_001073916 -7.17262
< 실시예 3> 실시간 PCR 을 통한 유전자 발현양 분석
상기 실시예 2 중 3의 마이크로어레이 데이터를 재확인 하고자 실시간 정량 역전사효소 PCR(real-time quantitative reverse transcriptase PCR)을 수행하였다. 총 RNA를 뽑은 후 100ng의 RNA를 One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit(Perfect Real Time, takara)를 이용하여 혼합물을 만든 뒤, DNA engine2, OPTICON(MJ Research)를 이용하여 수행하였다.
이때 사용된 프라이머 시퀀스는 하기 표 2와 같다.
유전자 이름 프라이머 시퀀스 서열번호
1 Rars Forward: CATCCGTTGCATATGGCTGC 서열번호 1
Reverse: AGGCGTACAGTAGGTAGGCA 서열번호 2
2 Litaf Forward: GTGTCTTTTAGGGGGTGGGG 서열번호 3
Reverse: AAAGCAACACCCAAGGTCCA 서열번호 4
3 Adam8 Forward: GCAGCCAGGTTGACCTAGAG 서열번호 5
Reverse: TCACACTGCTCTCCACGTTC 서열번호 6
4 Hapln3 Forward: GGCGTGAAGTTAGTGGTGGA 서열번호 7
Reverse: CACATGTCTCGGAGATGCCA 서열번호 8
5 Ephx1 Forward: GAGTGGAGAAACTGCACACCA 서열번호 9
Reverse: AGATGACAAAGCCCAGAAGGG 서열번호 10
6 Adsl Forward: GCTACGCCAGCCATGAAATG 서열번호 11
Reverse: CCGTGATAGGCAAACCCAGT 서열번호 12
7 Nuak1 Forward: TAGGTTAGCGAGCCTGGTCT 서열번호 13
Reverse: GGTGTGCCTGGTCCACTAAA 서열번호 14
8 Depdc1b Forward: AGAAACCCAAGGCCAAACCA 서열번호 15
Reverse: GTCCCTCAAGCTTCGTCACA 서열번호 16
9 Prc1 Forward: GAAAGTTGAAGGCTGCCGTG 서열번호 17
Reverse: GGAGGCATACGATGGACTCG 서열번호 18
10 RGD1560076 Forward: CTGAGGAAGATGCAGGCCAA 서열번호 19
Reverse: GCTGGAGCCCTTTAGCATCT 서열번호 20
그 결과 도 2와 같이, 마이크로어레이 결과와는 다르게 Rars과 Litaf는 컨트롤에 비해 발현양이 늘어나지 않았고, Ads1, Prc1 및 RGD1560076도 컨트롤에 비해 발현양이 감소하지 않은 것을 확인하였다.
반면, Adam8, Hapln3 및 Ephx1은 컨트롤에 비해 발현양이 현저히 증가하였으며, Nuak1과 Depdc1b는 컨트롤에 비해 발현양이 감소한 것을 확인하였다.
< 실시예 4> 특정 유전자 결손에 따른 방사선 민감성 변화 측정
1. siRNA 형질주입
상기 실시예 3에서 확인한 Adam8, Hapln3, Ephx1, Nuak1 또는 Depdc1b의 결손시 세포의 방사선 민감성의 변화를 확인하기 위해, 각 유전자에 해당하는 siRNA를 일시적 형질주입(siRNA transient transfection)하였다.
siRNA는 Dharmacon에서 구입하여 사용하였다. IEC-6 세포를 분주한 후, 각각의 siRNA를 100 nM의 농도로 리포펙타민 2000(lipofectamin 2000, invitrogen)을 이용하여 형질주입 시켰다. 그 결과 도 3과 같이, 72시간 이후 RNA 양이 50% 미만으로 감소한 것을 확인한 후 집락형성 분석 및 세포 생존율 분석 실험에 사용하였다.
2. 집락형성 분석법( clonogenic assay )
상기 실시예 4 중 1에서 형질감염시킨 IEC-6 세포를 60mm 플레이트에 100, 200, 500, 1000, 2000개로 분주한 뒤 0, 1, 2, 3, 4 Gy의 방사선을 조산한 뒤 10일 후 콜로니 형성을 확인 후 배지를 제거하였다. 그런 후 PBS로 2회 세척한 후, 고정 용액(fixing solution(메탄올:아세트산 = 부피비 3:1)을 세포가 잠기도록 넣어주고 상온에서 10분 반응시켰다. 그 후 고정 용액을 제거한 후 트립판 블루(tryphan blue)를 세포가 잠기도록 넣고 30분 반응시켰다. 반응이 끝난 후 증류수(Distilled water)로 2회 세척한 후 수분을 제거하고 배양 접시를 말린 후 콜로니 카운팅 하였다.
그 결과 도 4와 같이, Adam8, Hapln3, Ephx1, Nuak1 또는 Depdc1b이 결핍된 경우 전체적으로 세포의 집락형성이 저하된 것을 확인할 수 있었다.
3. 세포 생존율 분석( MTT assay )
Adam8, Hapln3, Ephx1, Nuak1 또는 Depdc1b이 결핍된 IEC-6 세포에 방사선을 조사하였을 때 생존율을 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)를 이용한 MTT 분석을 통해 측정하였다. 세포를 24 웰 플레이트에 분주하고 방사선을 조사한 것과 조사하지 않은 두 군으로 나누고, 각각에 방사선을 조사 후 24, 72, 96, 120 시간에 각각 MTT 분석을 수행하였다. 0.5 mg/ml의 MTT를 각 웰에 넣어주고 1시간 동안 37℃에서 배양하였고 배양배지를 제거한 뒤, 300 ul의 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)를 넣었다. 그 후 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 595nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과 도 5와 같이, Adam8, Hapln3, Ephx1, Nuak1 또는 Depdc1b이 결핍된 경우 전체적으로 세포의 생존율이 저하된 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> KOREA INSTITUTE OF RADIOLOGICAL & MEDICAL SCIENCES <120> Radiation sensitive marker composition and diagnosing method <130> ADP-2014-0564 <160> 20 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rars forward primer <400> 1 catccgttgc atatggctgc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rars reverse primer <400> 2 aggcgtacag taggtaggca 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Litaf forward primer <400> 3 gtgtctttta gggggtgggg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Litaf reverse primer <400> 4 aaagcaacac ccaaggtcca 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adam8 forward primer <400> 5 gcagccaggt tgacctagag 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adam8 reverse primer <400> 6 tcacactgct ctccacgttc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hapln3 forward primer <400> 7 ggcgtgaagt tagtggtgga 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hapln3 reverse primer <400> 8 cacatgtctc ggagatgcca 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ephx1 forward primer <400> 9 gagtggagaa actgcacacc a 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ephx1 reverse primer <400> 10 agatgacaaa gcccagaagg g 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ads1 forward primer <400> 11 gctacgccag ccatgaaatg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ads1 reverse primer <400> 12 ccgtgatagg caaacccagt 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nuak1 forward primer <400> 13 taggttagcg agcctggtct 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nuak1 reverse primer <400> 14 ggtgtgcctg gtccactaaa 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Depdc1b forward primer <400> 15 agaaacccaa ggccaaacca 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Depdc1b reverse primer <400> 16 gtccctcaag cttcgtcaca 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pcr1 forward primer <400> 17 gaaagttgaa ggctgccgtg 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pcr1 reverse primer <400> 18 ggaggcatac gatggactcg 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD1560076 forward primer <400> 19 ctgaggaaga tgcaggccaa 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD1560076 reverse primer <400> 20 gctggagccc tttagcatct 20

Claims (9)

  1. Adam8, Hapln3, Ephx1, Nuak1 및 Depdc1b 유전자 또는 그 발현 단백질을 포함하는 방사선 피폭 진단용 마커 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 Adam8, Hapln3 및 Ephx1 유전자 또는 그 발현 단백질은 방사선 처리에 의하여 발현이 증가하는 것을 특징으로 하는 방사선 피폭 진단용 마커 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 Nuak1 및 Depdc1b 유전자 또는 그 발현 단백질은 방사선 처리에 의하여 발현이 감소하는 것을 특징으로 하는 방사선 피폭 진단용 마커 조성물.
  4. Adam8, Hapln3, Ephx1, Nuak1 및 Depdc1b 유전자에 결합하는 프라이머쌍 또는 프로브, 또는 그 발현 단백질에 결합하는 항체를 포함하는 방사선 피폭 진단용 키트.
  5. 생물학적 시료에서 Adam8, Hapln3, Ephx1, Nuak1 및 Depdc1b 유전자 또는 그 발현 단백질의 발현 변화를 분석하는 단계를 포함하는 방사선 피폭 진단에 유용한 정보를 제공하는 방법.
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