KR101794111B1

KR101794111B1 - 방사선 저항성 진단용 조성물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101794111B1
Application number: KR1020160042279A
Authority: KR
Inventors: 김재성; 김현아; 노우철; 성민기; 황상구
Original assignee: 한국원자력의학원
Priority date: 2015-12-15
Filing date: 2016-04-06
Publication date: 2017-11-06
Also published as: KR20170071393A

Abstract

본 발명은 STAT3 및 서바이빈(survivin)으로 이루어진 유전자 mRNA 또는 이의 단백질군을 유효성분으로 함유하는 유방암세포 방사선 저항성 진단용 바이오마커 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 HR-/HER2+ 유방암 환자에게서 나타나는 방사선 저항성은 STAT3 및 서바이빈의 활성 또는 발현 증가에 의한 것으로 확인됨에 따라, 상기 STAT3 및 서바이빈 유전자 또는 이들의 단백질들은 HR-/HER2 유방암 환자 방사선 저항성 예측용 바이오마커로 제공될 수 있으며, 이들의 발현 조절을 통하여 유방암 환자의 방사선 치료 효과를 증진시킬 수 있다.

Description

방사선 저항성 진단용 조성물 및 이의 용도{Composition for diagnosis of radioresistance and use thereof}

본 발명은 방사선 저항성을 나타내는 유방암세포로부터 발굴된 방사선 저항성 측정용 바이오마커 및 이의 의학적 용도에 관한 것이다.

유방암은 전세계 여성에게 가장 흔히 발병되는 암으로, 발병률 또한 꾸준히 증가하고 있으며, 이러한 유방암의 치료방법으로는 외과적 수술이나 방사선 치료, 에스트로겐 수용체나 HER2를 타겟팅하는 호르몬 치료 또는 표적치료 방법이 이용되고 있다.

대부분의 유방암은 주로 호르몬 양성 유방암으로 외과적 수술 방법이나, 타목시펜과 같은 약물요법으로 치료되고 있으나, 유방암의 화학적 치료방법은 내성이 잘 생기며, 전이능을 가진 형태로 쉽게 변화하게 한다.

방사선 치료는 유방 보존수술뿐만 아니라 재발 위험이 높은 유방 절제술을 받은 환자들의 효과적인 국소 부위 관리를 위해 추천되는 치료방법이나, 일부 환자들에게는 방사선 치료 저항성과 국소 부위 관리 실패에 따른 생존율 감소가 나타난다.

HER2는 약 20-30%의 유방암 환자에서 과발현되어 유방암의 진행 및 전이에 중요한 역할을 하는 유전자로, HER2의 과발현은 나쁜 예후 및 환자의 생존율 감소와 관련 있다고 보고되어짐에 따라, HER2 발현 억제는 종양 공격성 감소를 위한 효과적인 전략이 될 수 있으며, HER2가 억제될 경우, 유방암세포의 방사선 민감성이 증가되는 것이 확인됨에 따라, HER2는 유방암 환자의 방사선 치료를 위한 타겟 분자 및 방사선 치료 결과 예측을 위한 바이오마커로 사용할 수 있을 것으로 제안되었으나, 아직까지는 HER2 상태만으로는 유방절제 후 방사선치료에 대한 생존율 예측이 어렵다는 연구 결과가 보고되었다(Kyndi M, Sorensen FB, Knudsen H, Overgaard M, Nielsen HM and Overgaard J. Estrogen receptor, progesterone receptor, HER-2, and response to postmastectomy radiotherapy in high-risk breast cancer: the Danish Breast Cancer Cooperative Group. J Clin Oncol. 2008; 26(9):1419-1426.).

이러한 방사선 치료의 문제점을 해결하기 위해, 방사선 치료 결과를 예측할 수 있을 뿐만 아니라 방사선 저항성을 갖는 세포에 민감성을 증가시키기 위한 분자 신호에 대한 연구가 필요한 실정이다.

공개특허 제2016-0029053호(2016년 3월 14일 공개)

본 발명은 유방암 환자의 효과적인 방사선 치료를 위해 STAT3 또는 서바이빈(survivin)에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 이의 단백질을 방사선 치료 결과 예측을 위한 바이오마커로 제공하며, 상기 바이오마커를 이용하여 방사선 민감성을 증가시킬 수 있는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 STAT3 또는 서바이빈(survivin)에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA, 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 암세포의 방사선 저항성 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명은 상기 조성물을 포함하는 암세포의 방사선 저항성 진단용 키트를 제공한다.

본 발명은 생물학적 시료로부터 STAT3 또는 서바이빈(survivin)에서 선택되는 하나 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계; 및 상기 유전자 mRNA 또는 단백질 수준을 정상 대조군으로부터 측정한 STAT3 또는 서바이빈(survivin)에서 선택되는 하나 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 방사선 저항성 예후 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명은 STAT3 또는 서바이빈(survivin)에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 제제를 유효성분으로 함유하는, 암세포에 대한 방사선 민감성 증진용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 STAT3 또는 서바이빈(survivin)에서 선택되는 하나 이상의 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 제제를 유효성분으로 함유하는, 암세포에 대한 방사선 민감성 증진용 약학조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, HR-/HER2 유방암 환자에게서 나타나는 방사선 저항성은 STAT3 또는 서바이빈의 활성 또는 발현 증가에 의한 것으로 확인됨에 따라, 상기 STAT3 또는 서바이빈 유전자 또는 이들의 단백질들은 HR-/HER2 유방암 환자 방사선 저항성 예측용 바이오마커로 제공될 수 있으며, 이들의 발현 조절을 통하여 유방암 환자의 방사선 치료 효과를 증진시킬 수 있다.

도 1은 유방암 환자 및 유방암 세포주에서 HR-/HER2+ 서브타입(subtype)과 방사선 저항성의 상관관계를 확인한 결과로, 도 1A는 보조적인 방사선치료를 수행한 유방 보존 치료를 받은 환자의 생존율을 확인한 Kaplan-Meier 결과이며(log-rank test, P < 0.001), 도 1B는 MCF7, MDA-MB231, SKBR3, T47D 및 BT-474 세포에 다양한 선량의 방사선을 직접 조사하고 집락형성 분석을 수행하여 세포 생존율을 확인한 결과이며, 도 1C는 MCF7, MDA-MB231, SKBR3, T47D 및 BT-474 세포에서 항-HER2 및 항-ER 항체를 이용한 면역블롯 분석결과로, β-액틴을 로딩 대조군으로 이용하였으며, 각 실험 데이터는 3번씩 반복 수행된 실험 결과를 평균±표준편차로 나타내었다.
도 2는 HER2가 결핍된 HR-/HER2+ 유방암세포의 방사선 저항성을 확인한 결과로, 도 2A는 SKBR3 세포에 100 nM 대조군 siRNA 또는 100 nM HER2 siRNA를 48시간 동안 형질주입한 후 다양한 선량의 방사선을 처리하고 세포 생존율을 확인한 결과이며, 도 2B는 48시간 동안 SKBR3 세포 또는 MDA-MB453 세포에 100 nM 대조군 siRNA 또는 HER2 siRNA가 형질주입 후 10 Gy 방사선을 조사하고, 48시간 후 방사선이 조사된 세포군(IR)과 조사되지 않은 세포군(Ctrl)의 세포 생존율을 유세포분석기(FACScan flow cytometer)로 확인한 결과이며, 도 2C는 100 nM 대조군 siRNA 또는 HER2 siRNA 형질주입 후 방사선 조사된 SKBR3 세포 또는 MDA-MB453 세포에 항-cleaved-PARP 및 항-HER2 항체를 이용한 면역블롯 분석결과로, β-액틴을 로딩 대조군으로 이용하였으며, 각 실험 데이터는 3번씩 반복 수행된 실험 결과를 평균±표준편차로 나타내었으며, *P < 0.05 또는 **P < 0.01 compared with irradiated siRNA control cells (A 및 B) 값이다.
도 3은 HER2가 결핍된 HR-/HER2+ 유방암세포에서 STAT3 조절에 따른 방사선 민감성을 확인한 결과로, 도 3A 및 도 3B는 SKBR3 세포 또는 MDA-MB453 세포에 100 nM 대조군 siRNA 또는 HER2 siRNA를 48시간 동안 형질주입하여 10 Gy 방사선을 처리(IR)하거나 처리하지 않고(Ctrl) 48시간 후 로딩 대조군인 β-액틴 및 각각의 항체를 이용하여 면역블롯을 수행한 결과이며, 도 3C는 상기 방법으로 처리된 각 세포에서 STAT3 활성을 확인한 결과로, 각 실험 데이터는 3번씩 반복 수행된 실험 결과를 평균±표준편차로 나타내었으며, **P < 0.01 compared with irradiated siRNA control cells (C) 값이다.
도 4는 HER2, STAT3 및 서바이빈 억제에 따른 HR-/HER2+ 유방암세포의 방사선 민감성을 확인한 결과로, 도 4A는 1 μM 라파티닙 또는 100 μM S3I-201 존재하에서 SKBR3 세포에 10 Gy 방사선을 처리 또는 처리하지 않고 24시간 동안 배양한 후 HER2, STAT3 및 서바이빈 단백질 발현량을 확인한 결과이며, 도 4B는 상기 과정으로 처리된 SKBR3 세포의 세포 생존율을 유세포 분석기로 측정하고 PI-양성 세포에 대한 백분율로 나타낸 결과이며, 도 4C는 1 μM 라파티닙, 100 μM S3I-201 또는 1 μM 라파티닙 + 100 μM S3I-201 존재하에서 3 Gy 방사선이 처리 또는 처리하지 않은 SKBR3 세포의 생존율을 확인한 결과이며, 도 4D는 48시간 동안 100 nM 대조군 siRNA 또는 서바이빈 siRNA가 형질주입된 SKBR3 세포에 10 Gy 방사선을 처리하고 각각의 항체를 이용하여 단백질 발현량을 확인한 면역블롯팅 결과이며, 도 4E는 48시간 동안 100 nM 대조군 siRNA 또는 서바이빈 siRNA가 형질주입된 SKBR3 세포에 10 Gy 방사선을 처리하고 콜로니 형성 분석을 통하여 집락형성 생존율을 확인한 결과로, β-액틴을 로딩 대조군을 사용하였으며(A 및 D), 각 실험 데이터는 3번씩 반복 수행된 실험 결과를 평균±표준편차로 나타내었으며, **P < 0.01 compared with irradiated siRNA control cells (B, C 및 E) 값이다.
도 5는 방사선 치료 후 재발된 HER2-양성 유방암과 인산화된 STAT3, STAT3 및 서바이빈 발현 사이의 정적 상관관계를 확인한 결과로, 도 5A는 재발된 HER2-양성 유방암 조직에서 항-인산화된 STAT3 (Y705), 항-STAT3 및 항-서바이빈 염색을 확인한 현미경 사진이며, 도 5B는 재발되지 않은 HER2-양성 유방암 조직에서 항-인산화된 STAT3 (Y705), 항-STAT3 및 항-서바이빈 염색하고 각 단백질의 핵산 염색 패턴을 확인한 고배율 현미경 사진이며(Scale bar, 50 μm), 도 3C는 재발군 조직(n=7)과 비재발군 조직(n=7)의 인산화된 STAT3의 염색 강도를 각각 정량한 결과이며, 도 3D는 재발군 조직(n=7)과 비재발군 조직(n=7)의 STAT3 염색 강도를 정량한 결과이며, 도 3E는 재발군 조직(n=7)과 비재발군 조직(n=7)의 서바이빈 염색 강도를 정량한 결과로, 상기 결과들은 box-and-whisker plot의 대표적인 결과이며, 염색강도는 다음과 같은 점수로 평가하였다: 0, 염색되지 않음; +1, 약한 염색; +2, 보통; 및 +3, 강한 염색; *P < 0.05 compared with responder group.

본 발명은 STAT3 또는 서바이빈(survivin)에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA, 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 암세포의 방사선 저항성 진단용 조성물을 제공할 수 있다.

상기 암세포는 유방암세포일 수 있으며, 보다 바람직하게는 HR-/HER2+ 서브타입 유방암세포일 수 있다.

상기 유전자 mRNA의 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다.

상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머를 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 유방암 환자의 분자 서브타입에 따라 국소부위 무재발 생존율이 유의한 차이를 나타내는 것으로 확인되었는데, 도 1A를 참고하면, HR+/HER2- 유방암 환자들은 매우 높은 국소 부위 무재발 생존율을 나타낸 반면, HR-/HER2+ 환자들은 재발할 경우 매우 낮은 생존율이 나타나는 것으로 확인되었다. 상기 결과를 재확인하기 위해, MCF7 및 T47D (HR+/HER2-), MDA-MB231 (HR-/HER2-), BT474 (HR+/HER2+), 및 SKBR3 (HR-/HER2+)을 포함한 유방암 세포주에 다양한 선량의 방사선을 조사하여 반응성을 확인한 결과, 도 1B 및 1C와 같이 다른 유방암 세포와 비교하여 HER2-양성(HR-/HER2+) 유방암 세포주인 SKBR3에서 매우 높은 방사선 저항성이 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 방사선 치료 민감성은 유방암의 분자 서브타입 차이와 관련이 있으며, 특히 HR-/HER2 유방암 환자의 방사선 치료 예후가 매우 나쁜 것으로 확인되었다.

상기 결과에서 확인된 HR-/HER2 유방암 환자에게서 나타나는 방사선 저항성의 신호과정을 확인한 결과, 도 3A와 같이 HER2가 결핍된 HER2-양성 SKBR3 및 MDA-MB453 유방암 세포에서 인산화된 STAT3와 서바이빈의 감소가 확인되었으며, 실제로 STAT3의 억제가 HER2-양성 SKBR3 유방암세포의 방사선 민감성을 증가시킬 수 있는 지를 확인하기 위해 HER2 및 STAT3의 억제자인 라파티닙(lapatinib) 및 S3I-201를 HER2-양성 SKBR3 유방암세포에 각각 처리하고, 10 Gy 선량의 방사선을 조사하였다.

그 결과, 도 4A와 같이 라파티닙(lapatinib) 및 S3I-201이 처리된 HER2-양성 SKBR3 유방암세포에서 방사선 조사에 의해 유도된 세포사멸이 매우 효과적으로 증가된 것이 확인되었을 뿐만 아니라, 도 4B와 같이 방사선에 의해 유도되는 STAT3 인산화 및 서바이빈 발현이 매우 효과적으로 감소된 것을 확인할 수 있었다.

또한, 3Gy 방사선 조사 후 콜로니 형성율을 확인하여 생존율 분석을 수행한 결과, 도 4C와 같이 라파티닙(lapatinib) 또는 S3I-201과 방사선이 함께 처리된 HER2-양성 SKBR3 유방암세포군의 생존율이 매우 유의하게 감소된 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 HR-/HER2 유방암 환자에게서 나타나는 방사선 저항성은 STAT3 및 서바이빈의 활성 또는 발현에 의한 것으로 확인되었다.

따라서 상기 STAT3 및 서바이빈 유전자 또는 이들의 단백질들은 HR-/HER2 유방암 환자 방사선 민감성 예측용 바이오마커로 사용할 수 있으며, 이들의 발현 조절을 통하여 유방암 환자의 방사선 치료 효과를 증진시킬 수 있다.

본 발명은 상기 조성물을 포함하는 암세포의 방사선 저항성 진단용 키트를 제공할 수 있다.

상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, 마이크로어레이 또는 단백질 칩 키트일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명은 생물학적 시료로부터 STAT3 또는 서바이빈(survivin)에서 선택되는 하나 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계; 및 상기 유전자 mRNA 또는 단백질 수준을 정상 대조군으로부터 측정한 STAT3 또는 서바이빈(survivin)에서 선택되는 하나 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 방사선 저항성 예후 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공할 수 있다.

상기 생물학적 시료는 조직 및 혈액으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 상기 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준은 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase chain Reaction, RT-PCR), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학(Immunohistochemistry), 웨스턴 블랏(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정될 수 있다.

또한, 본 발명은 STAT3 또는 서바이빈(survivin)에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 제제를 유효성분으로 함유하는, 암세포에 대한 방사선 민감성 증진용 약학조성물을 제공할 수 있다.

상기 제제는 STAT3 또는 서바이빈(survivin) 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, siRNA 및 shRNA로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것을 아니다.

또한, 본 발명은 STAT3 또는 서바이빈(survivin)에서 선택되는 하나 이상의 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 제제를 유효성분으로 함유하는, 암세포에 대한 방사선 민감성 증진용 약학조성물을 제공할 수 있다.

상기 제제는 STAT3 또는 서바이빈(survivin) 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 앱타머, 항체 및 천연물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

상기 “방사선 민감성 증진”이란 방사선을 이용한 질병 치료에 있어서, 방사선에 대한 세포의 민감성을 증진시키는 것을 의미한다. 이를 통해 방사선 치료 효율을 상승시킬 수 있는데, 특히, 암치료시 병행처리되면 암세포의 방사선 민감성이 증진되어 암세포의 살상 효과 및 증식 억제효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 방사선 민감성 증진용 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제제화될 수 있다.

본 발명에서 "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미한다.

액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 방사선 민감성 증진용 조성물은 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용 제형으로 제조할 수 있으며, 투여의 용이성과 투여량의 균일화를 위해 단위 투여 형태로 제형화할 수 있다. 본 발명의 약학적 제형은 구강(oral), 직장(rectal), 비강(nasal), 국소(topical; 볼 및 혀 밑을 포함), 피하, 질(vaginal) 또는 비경구(parenteral; 근육내, 피하 및 정맥 내를 포함) 투여에 적당한 것 또는 흡입(inhalation) 또는 주입(insufflation)에 의한 투여에 적당한 형태를 포함한다.

상기 경구 투여용 제형으로는, 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 함유할 수 있다.

또한, 상기 비경구 투여용 제형으로는, 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태, 좌제 주입방식 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 좌제로 주입하기 위해서는, 코코아버터 또는 다른 글리세라이드 등 통상의 좌약 베이스를 포함하는 좌약 또는 체료 관장제와 같은 직장투여용 조성물로 제제화할 수 있다. 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실험예 1> 세포배양 및 방사선 조사

사람 유방암 세포 MCF7, MDA-MB231, SKBR3, T47D 및 BT474를 ATCC(American Type Culture Collection; Manassas, VA)에서 구입하였다.

상기 구입한 세포를 10% 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS; HyClone, South Logan, UT) 및 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO₂ 조건으로 배양하였다.

¹³⁷세슘(Cs) 광원(Atomic Energy of Canada Ltd., Mississauga, Canada)을 분당 3.81Gy 선량으로 세포에 조사하였으며, S3I-201 100 μM (EMD Millipore, Billerica, MA) 및 라파티닙 1 μM(lapatinib; Selleckchem., Houston, TX)을 세포에 처리하여 각각 STAT3 및 HER2 활성을 억제하였다.

< 실험예 2> 집락형성 분석법( Clonogenic assay)

방사선 조사 후 세포 생존율을 확인하기 위해 이전에 보고된 방법(Kim JS et al., Proteomics. 2010; 10(14):2589-2604.)으로 집락형성 분석을 수행하였다.

먼저, 각각 다른 선량의 방사선 처리된 세포를 다양한 밀도로 60 mm 배양 디쉬에 접종하였다. 10-14일 후 콜로니를 메탄올로 고정하고 트립토판 블루로 염색하였다.

균락수측정기(Image Products, Chantilly, VA)를 이용하여 50 세포 이상을 포함하는 콜로니만을 생존 콜로니로 측정하였다.

< 실험예 3> RNA 간섭

siRNA를 Genolution　Pharmaceuticals Inc. (Seoul, Korea)에서 합성하여 사용하였으며, RNA 간섭에 사용된 서열은 다음과 같다: HER2, 5'-CUGGUGUAUGCAGAUUGCC-3' 및 서바이빈(survivin), 5'-AAGGAGAUCAACAUUUUCA-3'.

non-targeting siRNA(Genolution　Pharmaceuticals Inc.)를 음성 대조군으로 사용하였으며, G-Fectin (Genolution Pharmaceuticals Inc.)을 이용하여 제조사의 설명서대로 siRNA 형질주입을 수행하였다.

< 실험예 4> 웨스턴 블롯 분석

이전에 보고된 방법(Kim JS et al., Proteomics. 2010; 10(14):2589-2604.)으로 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.

먼저, SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 통하여 단백질을 분리하고 니트로셀룰로스 막으로 옮긴 후 특이적인 항체를 이용하여 단백질을 검출하였다.

사용된 항체로는 래빗 단일클론 항-서바이빈, 래빗 다중클론 항-phospho-STAT3(Tyr705) 및 항-cleaved-PARP (Asp214)를 Cell Signaling Technology (Beverly, MA)에서 구입하여 사용하였으며, 마우스 단일클론 항-STAT3, 래빗 다중클론 항-ERα 및 항-HER2는 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA)에서 구입하여 사용하였으며, 마우스 단일클론 항-β-액틴은 Sigma (St. Louis, MO)에서 구입하여 사용하였다.

HRP-결합 2차 항체와 향상된 화학발광 검출 시스템(Amersham Life Science, Piscataway, NJ)을 이용하여 블롯을 검출하였다.

< 실험예 5> STAT3 활성 분석

이미 보고된 방법(Shin DS et al., Cancer Res. 2009; 69(1):193-202.)으로 STAT3 활성을 확인하였다.

Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 세포에 21pSTAT3-TA-Luc와 대조군 siRNA 또는 HER2 siRNA를 48시간 동안 함께 형질주입한 후 방사선 10 Gy를 처리 또는 비처리하였다.

24시간 후 패시브 용해 버퍼를 이용하여 세포를 수집하고 Dual Luciferase Reporter Assay Kit (Promega, Madison, WI)와 Wallac Victor2 plate reader (Perkin Elmer Corp., Norwalk, CT)를 이용하여 루시퍼레이즈 활성을 확인하였다.

< 실험예 6> 세포사멸 분석

이전에 보고된 방법(Kim JS et al., Proteomics. 2010; 10(14):2589-2604.)으로 세포사멸 분석을 수행하였다.

트립신 처리된 세포를 세척한 후 10분간 프로피디움 아이오다이드(5 μM/mL)와 인큐배이션하고, FACScan flow cytometer (Becton Dickson, Franklin Lakes, NJ)을 이용하여 세포사멸을 분석하였다.

< 실험예 7> 국소부위 무병생존율 분석을 위한 환자군

1980년 1월부터 2010년 9월 사이의 근치 수술과 보조적인 방사선 치료를 받은 일차 유방암 환자 총 1,693명을 대상으로 향후 분석을 수행하였다.

모든 임상 및 병리학적 데이터는 한국 암센터 병원 유방암 센터에서 제공받았다.

< 실험예 8> 종양의 분자 서브타입(molecular subtypes)에 따른 유방암 환자 분류

수술 직후 immunohistochemistry (IHC)를 수행하여 종양 조직에서 ER, PR 및 HER2 발현 정도를 평가하였다. ER 또는 PR 양성 반응은 10 고배율 시야관찰에서 핵내 최소 10% 염색이 확인된 경우로 분류하였으며, IHC 염색반응 또는 fluorescence in situ hybridization을 통한 HER2 유전자 증폭에서 3+일 경우 HER2 양성 반응으로 분류하였다.

상기 환자들은 ER, PR 및 HER2의 종양 발현 정도를 기본으로 한 하기 4종류의 서브타입에 따라 분류되었다.

(a) 호르몬 수용체 HR+/HER2- : ER- 및/또는 PR-양성 및 HER2-음성

(b) HR+/HER2+ : ER- 및/또는 PR-양성 및 HER2-양성

(c) HR-/HER2+ : ER-음성, PR-음성 및 HER2-양성

(d) HR-/HER2- : ER-음성, PR-음성 및 HER2-음성

< 실험예 9> 면역조직화학( Immunohistochemistry )

근치 수술을 통하여 제거된 HER2 과발현된 1차 유방암 조직 파라핀 블록으로부터 IHC를 위한 표본을 얻었다.

방사선 치료 후 1년 이내 국소 재발이 나타난 환자들을 민감 반응군으로 분류하였으며, 방사선 치료 후 최소 2년간의 추적 치료기간 동안 질환의 증후가 나타나지 않은 환자들을 비민감 반응군으로 분류하고, 각 그룹의 환자들의 병리학적 TNM 염색 및 HR 상태를 매치시켰다.

이전에 보고된 방법(Kim JS et al., Cancer Res. 2013; 73(22):6667-6678.; Min JW et al., Biochem Biophys Res Commun. 2013; 440(1):137-142.)에 따라, IHC 실험을 수행하였다.

간략하게, 항-STAT3 마우스 단일클론 항체(1:200 dilution; Santa Cruz), 항-phospho-STAT3 래빗 다중클론 항체(1:50 dilution; GeneTex, Irvine, CA), 또는 항-서바이빈 래시 단일클론 항체(1:100 dilution; Cell Signaling Technology)를 이용하여 면역조직화학 염색을 수행하였다.

면역염색은 아비딘-바이오틴-퍼옥사이드를 이용하여 제조사(Invitrogen)의 설명서대로 수행하였다.

염색 강도는 다음과 같은 기준으로 평가하였다: 0 (염색이 관찰되지 않음), 1+ (희미한 염색정도), 2+ (보통강도의 염색정도), and 3+ (강한 염색이 확인됨).

<실시예 1> 방사선 저항성과 HER2-양성 유방암 관련성 확인

근치 수술 후 적절한 보조적 방사선 치료를 받은 1693명의 1차 유방암 환자들을 대상으로 방사선 저항성과 HER2-양성 유방암 관련성을 확인하였다.

상기 환자들은 그들의 종양조직에서 HER2 및 HR (Estrogen receptor [ER] and/or progesterone receptor [PR]) 분자 발현을 기반으로 한 네 범주(HR+/HER2-, HR+/HER2+, HR-/HER2+, 및 HR-/HER2-)로 분류하였으며, 임상 병리학적 특징은 하기 표 1과 같이 나타났다.

그 결과, 표 1과 같이 HR+/HER2- (54.9%, 929 of 1,693 patients) 환자가 가장 많은 것으로 확인되었으며, 그 다음으로 HR-/HER2- (20.5%, 1,693 환자 중 347 명), HR+/HER2+ (13.6%, 1,693 환자 중 231 명) 및 HR-/HER2+ (11.0%, 1,693 환자 중 183 명)순인 것으로 확인되었다.

또한, 도 1A를 참고하면, 유방암 환자의 분자 서브타입을 기반으로 그룹을 분리한 결과, 서브타입에 따라 국소부위 무재발 생존율의 유의한 차이를 나타내는 것으로 확인되었는데, HR+/HER2- 유방암 환자들은 매우 높은 국소 부위 무재발 생존율을 나타낸 반면, HR-/HER2+ 환자들은 재발할 경우 매우 낮은 생존율을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 방사선 치료 민감성은 유방암의 분자 서브타입 차이와 관련있을 것으로 제안될 수 있다.

이러한 HR-/HER2+ 서브타입과 높은 방사선 치료 저항성의 관련성을 확인하기 위해, 유방암의 다른 서브타입들과 방사선 치료 효과를 비교하였다.

클론성 생존 분석을 위해, MCF7 및 T47D (HR+/HER2-), MDA-MB231 (HR-/HER2-), BT474 (HR+/HER2+), 및 SKBR3 (HR-/HER2+)을 포함한 유방암 세포주에 다양한 선량의 방사선을 조사하여 반응성을 확인하였다.

그 결과, 도 1B 및 1C와 같이 다른 유방암 세포와 비교하여 HER2-양성(HR-/HER2+) 유방암 세포주인 SKBR3에서 매우 높은 방사선 저항성 표현형이 나타나는 것으로 확인되었다.

상기 결과들로부터 HER2-양성 유방암에서 방사선 저항성이 나타나는 것으로 확인되었다.

< 실시예 2> HER2 -양성 유방암 세포의 방사선 저항성 신호과정 확인

앞선 실험을 통하여 HER2 발현이 유방암의 방사선 저항성과 관련있음이 확인됨에 따라, HER2 양성 유방암세포에서 HER2의 siRNA에 의해 유도되는 유전자 억제를 통하여 HER2가 방사선 저항성의 주요 매개자인지를 확인하였다.

그 결과, 도 2A와 같이 siRNA에 의해 HER2 발현이 억제된 SKBR3 세포군은 다양한 선량의 방사선에 민감하게 반응하여 낮은 생존율을 나타내었으며, 도 2B 및 2C와 같이 HER2-양성 SKBR3 및 MDA-MB453 유방암세포에서도 HER2가 결핍될 경우, 방사선에 의한 세포 죽음이 증가되는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 HER2는 HER2-양성 유방암 세포에서 방사선 저항성을 조절하는 주요 인자인 것으로 확인되었다.

다음으로, 다양한 발암경로를 통하여, HER2는 방사선에 의해 유도되는 STAT3의 활성을 촉진시키고, 이러한 신호과정은 복합 방사선 저항성 암의 주요 신호과정 중 하나일 것으로 제안됨에 따라, 이를 확인하였다.

그 결과, 도 3A와 같이 HER2가 결핍된 HER2-양성 SKBR3 및 MDA-MB453 유방암 세포에서 인산화된 STAT3와 서바이빈의 감소가 확인되었으며, 이를 통하여 방사선에 의해 유도되는 STAT3 활성이 억제된 것을 확인할 수 있었다.

추가적으로 STAT3 결합 요소를 가진 STAT3 리포터 플라스미드를 이용하여 루시퍼레이즈 분석을 수행하여 STAT3의 직접적인 전사활동을 확인한 결과, 방사선이 조사된 세포에서 HER2를 결핍시킨 경우, 방사선 유도성 STAT3 활성이 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 HER2 양성 유방암 세포에서 HER2가 STAT3 신호 활성화를 통하여 방사선 저항성을 향상시키는 것으로 확인되었다.

< 실시예 3> HER2 -양성 유방암 세포에서 HER2 - STAT3 - Survivin 신호과정 억제를 통한 방사선 민감성 증가 확인

HER2 및 STAT3의 억제가 HER2-양성 SKBR3 유방암세포의 방사선 민감성을 증가시킬 수 있는 지를 확인하였다.

HER2 및 STAT3의 억제자인 라파티닙(lapatinib) 및 S3I-201를 HER2-양성 SKBR3 유방암세포에 각각 처리하고, 10 Gy 선량의 방사선을 조사하였다.

그 결과, 도 4A와 같이 라파티닙(lapatinib) 및 S3I-201이 처리된 HER2-양성 SKBR3 유방암세포에서 방사선 조사에 의해 유도된 세포사멸이 매우 효과적으로 증가된 것이 확인되었을 뿐만 아니라, 도 4B와 같이 방사선에 의해 유도되는 STAT3 인산화 및 서바이빈 발현이 역시 효과적으로 감소되는 것을 확인할 수 있었다.

다음으로, HER2-양성 SKBR3 유방암세포에서 siRNA를 통하여 서바이빈이 억제된 경우, 방사선 민감성이 향상되는지 확인하였다.

그 결과, 도 4D 및 4E를 참고하면 앞서 확인된 HER2 및 STAT3 억제 효과와 유사하게, 서바이빈이 결핍된 세포에서는 HER2 및 STAT3 인산화와 관계없이 방사선에 의해 유도되는 세포 사멸이 증가가 확인되었다.

상기 결과로부터 HER2-STAT3-서바이빈 신호과정은 HER2-양성 SKBR3 유방암세포에서 나타나는 방사선 저항성의 주요 인자인 것으로 확인됨에 따라, HER2-STAT3-서바이빈 신호는 HER2-양성 유방암 치료를 위한 방사선 보조치료의 주요 타겟으로 제안될 수 있다.

< 실시예 4> HER2 -양성 유방암 조직에서 HER2 - STAT3 - 서바이빈 신호와 방사선 치료 저항성 사이의 정적 상관관계(positive correlation) 확인

HER2-양성 유방암에서 HER2-STAT3-서바이빈 조절과 방사선 치료 저항성 사이의 생리학적 관련성을 확인하기 위해, 방사선 치료 후 재발된 HER2-양성 유방암 환자(비민감성 군; n = 7) 또는 재발되지 않은 HER2-양성 유방암 환자군(민감성 군; n = 8)에서 인산화된 STAT3 (Tyr705), STAT3 및 서바이빈의 발현 수준을 확인하였다.

그 결과, 도 5A 및 도 5B와 같이 재발된 HER2-양성 유방암 환자군의 연속 절편에서는 인산화된 STAT3, STAT3 및 서바이빈의 염색 패턴이 유사하게 나타났으나, 재발되지 않은 환자군에서는 상이하게 나타났다.

추가적으로 STAT3 활성을 나타내는 인산화된 STAT3 및 서바이빈의 강한 핵산 염색 패턴을 확인하였다.

그 결과, 도 5A 및 도 5B의 오른쪽 상측 이미지를 참고하면 재발되지 않은 HER2-양성 유방암 환자군보다 재발된 HER2-양성 유방암 환자군에서 인산화된 STAT3 및 서바이빈의 강한 핵산 염색 패턴이 확인되었다. 또한, 도 5C 내지 도 5E를 통하여 인산화된 STAT3, STAT3 및 서바이빈의 발현 증가는 방사선치료에 민감성을 나타내지 않은 군과 정적 상관관계를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과들로부터 HER2-양성 유방암에서 나타나는 방사선치료 저항성은 HER2-STAT3-서바이빈 신호과정에 의한 것임이 확인되었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

HER2, STAT3 및 서바이빈(survivin) 유전자 또는 이의 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 HR-/HER2+ 서브타입 유방암세포의 방사선 저항성 진단용 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 HER2, STAT3 및 서바이빈(survivin) 유전자 또는 이의 단백질은 방사선 조사시 HR-/HER2+ 서브타입 유방암세포에서 증가되는 것을 특징으로 하는 HR-/HER2+ 서브타입 유방암세포의 방사선 저항성 진단용 조성물.
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청구항 1의 조성물을 포함하는 HR-/HER2+ 서브타입 유방암세포의 방사선 저항성 진단용 키트.
청구항 6에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, 마이크로어레이 또는 단백질 칩 키트인 것을 특징으로 하는 HR-/HER2+ 서브타입 유방암세포의 방사선 저항성 진단용 키트.
생물학적 시료에서 HER2, STAT3 및 서바이빈(survivin) 유전자 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계;
상기 유전자 또는 이의 단백질 수준을 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 HR-/HER2+ 서브타입 유방암세포의 방사선 저항성 예후 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
청구항 8에 있어서, 상기 생물학적 시료는 조직 및 혈액으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 HR-/HER2+ 서브타입 유방암세포의 방사선 저항성 예후 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
청구항 8에 있어서, 상기 유전자 또는 이의 단백질 수준은 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase chain Reaction, RT-PCR), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학(Immunohistochemistry), 웨스턴 블랏(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것을 특징으로 하는 HR-/HER2+ 서브타입 유방암세포의 방사선 저항성 예후 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
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