BR112020022655A2 - epítopo de antígeno de superfície de células t reguladoras e anticorpo que se liga especificamente ao mesmo - Google Patents

Abstract

A presente invenção se refere a um epítopo de proteína de domínios 1 (Lrig-1) rica em leucina e semelhante à imunoglobulina, que é um antígeno presente na superfície de células T reguladoras, e um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente ao mesmo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “EPÍTOPO

DE ANTÍGENO DE SUPERFÍCIE DE CÉLULAS T REGULADORAS E ANTICORPO QUE SE LIGA ESPECIFICAMENTE AO MESMO” Campo Técnico

[001] A presente invenção se refere a um epítopo de proteína de domínios 1 (Lrig-1) rica em leucina e semelhante à imunoglobulina, que é um antígeno presente na superfície de células T reguladoras, e um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente ao mesmo.

Técnica Anterior

[002] Um dos traços mais importantes em todos os indivíduos normais é ter a capacidade de reconhecer e eliminar antígenos não próprios, embora não responda de forma prejudicial às substâncias antigênicas que constituem os mesmos. Como tal, a não resposta do corpo vivo aos antígenos próprios é chamada de falta de resposta ou tolerância imunológica. A autotolerância ocorre pela eliminação de linfócitos que podem ter receptores específicos para antígenos próprios ou pela autoinativação da capacidade de responder após o contato com antígenos próprios. No caso em que surge um problema na indução ou manutenção da autotolerância, ocorre uma resposta imunológica aos antígenos próprios, e a doença resultante da mesma é chamada de doença autoimune.

[003] Para o tratamento da doença autoimune, um conceito de células T supressoras sugerindo a possibilidade da presença de células T capazes de controlar e suprimir a função efetora das células T convencionais foi introduzido e apresentado pela primeira vez por Gershon no início dos anos 1970 (R.K. Gershon e K. Kondo, Immunology, 1970, 18: 723-37). Desde então, estudos têm sido conduzidos para provocar as propriedades biológicas e funções das células T reguladoras em muitas áreas da imunologia.

[004] A esse respeito, foi relatado que as células T reguladoras (células Treg) desempenham um papel importante na prevenção natural da ocorrência de inflamação excessiva e respostas imunológicas; no entanto, em um caso em que ocorrem doenças autoimunes e doenças inflamatórias crônicas, a função e o número de células T reguladoras são notavelmente diminuídos. Portanto, no caso de pacientes com doenças imunes e inflamatórias, é importante que as células T reguladoras sejam produzidas em níveis normais, o que pode ser um dos tratamentos para essas doenças.

[005] Até agora, estudos sobre genes e proteínas que estão presentes especificamente em células T reguladoras têm sido realizados, e foi apresentado que substâncias, tais como, CD25, CTLA4, CD62L, CD38, CD103, GITR e CD45RB podem corresponder a substâncias marcadoras. No entanto, não existem genes e proteínas que podem ter como alvo apenas as células T reguladoras sozinhas.

[006] Por outro lado, existem três regiões hipervariáveis chamadas regiões determinantes de complementaridade (doravante referidas como “CDRs”) e quatro regiões estruturais. As CDRs servem principalmente para se ligar a um epítopo em um antígeno. As CDRs de cada cadeia são tipicamente referidas, tais como, CDR1, CDR2 e CDR3 sequencialmente a partir do terminal N e também são distinguidas pela cadeia onde estão localizadas CDRs específicas.

Problema técnico

[007] Um objetivo da presente invenção é fornecer um epítopo da proteína dos domínios 1 (Lrig-1) rica em leucina e semelhante à imunoglobulina presente na superfície de células T reguladoras (células Treg).

[008] Outro objetivo da presente invenção é fornecer um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente ao epítopo.

[009] Ainda outro objetivo da presente invenção é fornecer uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar o câncer, compreendendo o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente ao epítopo.

[0010] Ainda outro objetivo da presente invenção é fornecer um método para prevenir ou tratar o câncer, usando o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente ao epítopo.

[0011] No entanto, o problema técnico a ser alcançado pela presente invenção não está limitado aos problemas mencionados acima, e outros problemas que não são mencionados serão claramente compreendidos pelos habilitados na técnica a partir da seguinte descrição.

Solução para o Problema

[0012] A presente invenção se refere a um epítopo de proteína de domínios 1 (Lrig-1) rica em leucina e semelhante à imunoglobulina, ou um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente ao epítopo.

[0013] Na presente invenção, a “proteína de Lrig-1” é uma proteína transmembranar presente na superfície das células T reguladoras, e é composta de repetições ricas em leucina (LRRs) e três domínios semelhantes a imunoglobulinas no lado extracelular ou de lúmen, sequência transmembranar celular e uma porção da cauda citoplasmática. A família de genes LRIG inclui LRIG1, LRIG2 e LRIG3, e os aminoácidos entre os mesmos são altamente conservados. O gene LRIG1 é altamente expresso na pele normal e pode ser expresso nas células basais e do folículo capilar para regular a proliferação de células-tronco epiteliais. Portanto, o gene LRIG1 desempenha um papel importante na manutenção da homeostase da epiderme, e sua ausência pode desenvolver psoríase ou câncer de pele. Foi relatado que, em um caso em que a porção 3p14.3 do cromossomo, em que LRIG1 está localizado, é cortada, existe a possibilidade de se desenvolver em células cancerígenas. Na verdade, foi identificado que a expressão de LRIG1 está muito diminuída no carcinoma de células renais e no carcinoma de células escamosas cutâneo. Recentemente, verificou-se também que Lrig-1 é expressado em apenas cerca de 20 a 30% dos cânceres. Por outro lado, para o propósito da presente invenção, a proteína Lrig-1 pode ser, mas não está limitada a, uma proteína presente em humanos ou camundongos.

[0014] Em um exemplo da presente invenção, a proteína Lrig-1 pode ser a proteína Lrig-1 derivada de mamíferos, incluindo primatas, tais como humanos e macacos, e roedores, tais como camundongos e ratos.

[0015] Em um exemplo da presente invenção, a proteína Lrig-1 pode ser proteína Lrig-1 derivada de humano representada por SEQ ID NO: 1, que pode ser codificada por, mas não está limitada a, uma sequência de ácidos nucleicos representada por SEQ ID NO: 2 (ver a Tabela 1).

[Tabela 1]

[0016] Em outro exemplo da presente invenção, a proteína Lrig-1 pode ser, mas não está limitada a, proteína Lrig-1 derivada de camundongo representada por SEQ ID NO: 3 (ver Tabela 2).

[Tabela 2] SEQ ID NO Informação da Sequência SEQ ID NO: 3 MARPGPGVLG APRLAPRLLL WLLLLLLQWP ESAGAQAGPR APCAAACTCA GDSLDCSGRG 60

LATLPRDLPS WTRSLNLSYN RLSEIDSAAF EDLTNLQEVY LNSNELTAIP SLGTASIGVV 120

SLFLQHNKIL SVDGSQLKSY LSLEVLDLSS NNITEIRSSC FPNGLRIREL NLASNRISIL 180

ESGAFDGLSR SLLTLRLSKN RITQLPVKAF KLPRLTQLDL NRNRIRLIEG LTFQGLDSLE 240

VLRLQRNNIS RLTDGAFWGL SKMHVLHLEY NSLVEVNSGS LYGLTALHQL HLSNNSISRI 300

QRDGWSFCQK LHELILSFNN LTRLDEESLA ELSSLSILRL SHNAISHIAE GAFKGLKSLR 360

VLDLDHNEIS GTIEDTSGAF TGLDNLSKLT LFGNKIKSVA KRAFSGLESL EHLNLGENAI 420

RSVQFDAFAK MKNLKELYIS SESFLCDCQL KWLPPWLMGR MLQAFVTATC AHPESLKGQS 480

IFSVLPDSFV CDDFPKPQII TQPETTMAVV GKDIRFTCSA ASSSSSPMTF AWKKDNEVLA 540

NADMENFAHV RAQDGEVMEY TTILHLRHVT FGHEGRYQCI ITNHFGSTYS HKARLTVNVL 600

PSFTKIPHDI AIRTGTTARL ECAATGHPNP QIAWQKDGGT DFPAARERRM HVMPDDDVFF 660

ITDVKIDDMG VYSCTAQNSA GSVSANATLT VLETPSLAVP LEDRVVTVGE TVAFQCKATG 720

SPTPRITWLK GGRPLSLTER HHFTPGNQLL VVQNVMIDDA GRYTCEMSNP LGTERAHSQL 780

SILPTPGCRK DGTTVGIFTI AVVCSIVLTS LVWVCIIYQT RKKSEEYSVT NTDETIVPPD 840

VPSYLSSQGT LSDRQETVVR TEGGHQANGH IESNGVCLRD PSLFPEVDIH STTCRQPKLC 900

VGYTREPWKV TEKADRTAAP HTTAHSGSAV CSDCSTDTAY HPQPVPRDSG QPGTASSQEL 960

RQHDREYSPH HPYSGTADGS HTLSGGSLYP SNHDRILPSL KNKAASADGN GDSSWTLAKL 1020

HEADCIDLKP SPTLASGSPE LMEDAISTEA QHLLVSNGHL PKACDSSPES VPLKGQITGK 1080

RRGPLLLAPR S

[0017] De acordo com uma forma de realização da presente invenção, como o epítopo da proteína Lrig-1, é fornecido um epítopo incluindo um polipeptídeo que consiste em uma sequência de aminoácidos representada pela Fórmula 1, [Fórmula 1] Lx1Lx2x3N.

[0018] Na Fórmula 1, cada um de x1 a x3 pode ser, independentemente, um aminoácido neutro, um aminoácido ácido, um aminoácido básico ou um aminoácido aromático. Nesse documento, o aminoácido neutro pode ser glicina (G), alanina (A), valina (V), leucina (L), isoleucina (I), serina (S) ou treonina (T); o aminoácido ácido pode ser ácido aspártico (D), ácido glutâmico (E), asparagina (N) ou glutamina (Q); o aminoácido básico pode ser lisina (K), arginina (R) ou histidina (H); e o aminoácido aromático pode ser fenilalanina (F) ou tirosina (Y).

[0019] Em um exemplo da presente invenção, cada um de x1 a x3 pode ser, independentemente, um aminoácido selecionado do grupo que consiste em asparagina (N), ácido aspártico (D), serina (S), tirosina (Y), arginina (R),

fenilalanina (F), lisina (K), histidina (H), leucina (L), valina (V), treonina (T), alanina (A), glutamina (Q), ácido glutâmico (E) e glicina (G).

[0020] Em outro exemplo da presente invenção, x 1 pode ser um aminoácido selecionado do grupo que consiste em asparagina (N), fenilalanina (F), ácido aspártico (D), lisina (K), histidina (H), valina (V) , arginina (R) e treonina (T); x2 pode ser um aminoácido selecionado do grupo que consiste em serina (S), glutamina (Q), alanina (A), asparagina (N), ácido glutâmico (E), ácido aspártico (D), fenilalanina (F) e glicina (G); e x3 pode ser um aminoácido selecionado do grupo que consiste em tirosina (Y), histidina (H), glicina (G), arginina (R), asparagina (N), leucina (L), lisina (K) e fenilalanina (F).

[0021] Em ainda outro exemplo da presente invenção, cada um de x1 a x3 pode ser, independentemente, um aminoácido selecionado do grupo que consiste em asparagina (N), ácido aspártico (D), serina (S), tirosina (Y) e arginina (R).

[0022] Ainda em outro exemplo da presente invenção, x 1 pode ser asparagina (N) ou ácido aspártico (D); x2 pode ser serina (S) ou asparagina (N); e x3 pode ser tirosina (Y) ou arginina (R).

[0023] Na presente invenção, o epítopo inclui um polipeptídeo que consiste em uma sequência de aminoácidos representada pela Fórmula 1 e pode consistir em 10- a 20-

meros, de preferência 10- a 15-meros, e mais de preferência 11- a 14-meros.

[0024] Além disso, na presente invenção, o polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos representada pela Fórmula 1 no epítopo pode estar localizado nas posições 3 a 6, de preferência, nas posições 4 a 6, e mais de preferência, na posição 5 do terminal N do epítopo.

[0025] Como um exemplo da presente invenção, o polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos representada pela Fórmula 1 pode ser representado por, mas não está limitado a, qualquer sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 4 a 17 na Tabela 3 abaixo: [Tabela 3] SEQ ID NO Informação da Sequência SEQ ID NO: 4 LNLSYN SEQ ID NO: 5 LDLNRN SEQ ID NO: 6 LFLQHN SEQ ID NO: 7 LNLAGN SEQ ID NO: 8 LDLSLN SEQ ID NO: 9 LRLSKN SEQ ID NO: 10 LKLQRN SEQ ID NO: 11 LHLEYN SEQ ID NO: 12 LHLSNN SEQ ID NO: 13 LVLSFN SEQ ID NO: 14 LRLSHN SEQ ID NO: 15 LDLDHN SEQ ID NO: 16 LTLFGN SEQ ID NO: 17 LNLGGN

[0026] Como outro exemplo da presente invenção, o epítopo pode ser representado por, mas não está limitado a,

uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 ou 20.

[0027] De acordo com outra forma de realização da presente invenção, como o epítopo da proteína Lrig-1, é fornecido um epítopo incluindo um polipeptídeo representado por qualquer sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 18 a 29 na Tabela 4 abaixo: [Tabela 4] SEQ ID NO Informação da Sequência SEQ ID NO: 18 WTRSLNLSYNKL SEQ ID NO: 19 TEVRNTCFPHGPPI SEQ ID NO: 20 RLTQLDLNRNRIR SEQ ID NO: 21 DLNRNRIRLIEGLTF SEQ ID NO: 22 NSIARIHRKGW SEQ ID NO: 23 WLPPWLIGRMLQAF SEQ ID NO: 24 RQVTFGHEGRY SEQ ID NO: 25 FGHEGRYQCVITNHF SEQ ID NO: 26 RLTVNVLPSFTKTPH SEQ ID NO: 27 RRMHVMPDDDVFF SEQ ID NO: 28 FFITDVKIDDAGVYS SEQ ID NO: 29 KGDRPLSLTERHH

[0028] De acordo com ainda outra forma de realização da presente invenção, é fornecida uma molécula de ácido nucleico que codifica o epítopo fornecido pela presente invenção.

[0029] A molécula de ácido nucleico da presente invenção inclui todas as moléculas de ácido nucleico obtidas pela tradução das sequências de aminoácidos dos polipeptídeos fornecidos pela presente invenção em sequências de polinucleotídeos, como conhecido pelos habilitados na técnica. Portanto, várias sequências de polinucleotídeos podem ser preparadas por uma fase de leitura aberta (ORF), e todas essas sequências de polinucleotídeos também estão incluídas na molécula de ácido nucleico da presente invenção.

[0030] De acordo com ainda outra forma de realização da presente invenção, é fornecido um vetor de expressão no qual a molécula de ácido nucleico isolada fornecida pela presente invenção é inserida.

[0031] Na presente invenção, o “vetor” é uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ligado à mesma. Um tipo de vetor é um “plasmídeo”, que se refere a DNA circular de fita dupla ao qual um segmento de DNA adicional pode ser ligado. Outro tipo de vetor é um vetor de fago. Ainda outro tipo de vetor é um vetor viral, onde um segmento de DNA adicional pode ser ligado ao genoma viral.

Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem de replicação bacteriana são vetores epissomais de mamíferos). Outros vetores (por exemplo, vetores de mamíferos não epissomais) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira após a introdução na célula hospedeira e, portanto, são replicados junto com o genoma do hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais estão operacionalmente ligados. Esses vetores são referidos nesse documento como “vetores de expressão recombinantes” ou simplesmente “vetores de expressão”. Em geral, os vetores de expressão úteis em técnicas de DNA recombinante são frequentemente na forma de plasmídeos. No presente relatório descritivo, “plasmídeo” e “vetor” podem ser usados indistintamente, pois o plasmídeo é a forma de vetor mais comumente usada.

[0032] Exemplos específicos do vetor de expressão na presente invenção podem ser selecionados do, mas não estão limitados ao, grupo que consiste em vetores pCDNA amplamente usados comercialmente, vetores F, R1, RP1, Col, pBR322, ToL, Ti; cosmídeos; fagos, tais como, lambda, lambdoides, M13, Mu, p1 P22, Qµµ, T-even, T2, T3, T7; vírus de plantas.

Qualquer vetor de expressão conhecido, pelos habilitados na técnica, como vetores de expressão, pode ser usado na presente invenção, e o vetor de expressão é selecionado dependendo da natureza da célula hospedeira alvo. A introdução de um vetor em uma célula hospedeira pode ser realizada por transfecção de fosfato de cálcio, infecção viral, transfecção mediada por DEAE-dextrano, transfecção de lipofectamina ou eletroporação. No entanto, a presente invenção não está limitada a isso, e os habilitados na técnica podem adotar e usar um método de introdução apropriado para o vetor de expressão e a célula hospedeira que são usados. O vetor pode conter, de preferência, pelo menos um marcador de seleção. No entanto, a presente invenção não está limitada a isso, e a seleção pode ser feita usando o vetor que não contém nenhum marcador de seleção, dependendo se um produto é ou não produzido. O marcador de seleção é selecionado dependendo da célula hospedeira alvo, o que é feito usando métodos já conhecidos pelos habilitados na técnica e, portanto, a presente invenção não tem nenhuma limitação na mesma.

[0033] De modo a facilitar a purificação da molécula de ácido nucleico da presente invenção, uma sequência etiqueta pode ser inserida e fundida a um vetor de expressão. A etiqueta inclui, mas não está limitada a, etiqueta de hexa- histidina, etiqueta de hemaglutinina, etiqueta myc ou etiqueta FLAG, e qualquer etiqueta conhecida pelos habilitados na técnica que facilite a purificação pode ser usada na presente invenção.

[0034] De acordo com ainda outra forma de realização da presente invenção, é fornecida uma linha de células hospedeiras, transfectada com o vetor de expressão fornecido pela presente invenção.

[0035] Na presente invenção, a “célula hospedeira” inclui células individuais ou culturas de células que podem ser ou ter sido receptoras do(s) vetor(es) para incorporação de uma inserção de polipeptídeo. A célula hospedeira inclui a progênie de uma única célula hospedeira, e a progênie pode não ser necessariamente completamente idêntica (em morfologia ou em complemento de DNA genômico) à célula-mãe original devido à mutação natural, acidental ou intencional.

A célula hospedeira inclui células transfectadas in vivo com o(s) polinucleotídeo(s) nesse documento.

[0036] Na presente invenção, a célula hospedeira pode incluir células de mamífero, planta, inseto, fungo ou origem celular, e pode ser, por exemplo, células bacterianas, tais como, E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; células fúngicas, tais como, células de levedura e Pichia pastoris; células de inseto, tais como, células de Drosophila e Spodoptera Sf9; células animais, tais como, CHO (células de ovário de hamster chinês), SP2/0 (mieloma de camundongo), linfoblastoide humano, COS, NSO (mieloma de camundongo), 293T, células de melanoma de Bowes, HT-1080, BHK (células de rim de hamster bebê), HEK (células renais embrionárias humanas) ou PERC.6 (células retinais humanas); ou células de planta. No entanto, a célula hospedeira não está limitada às mesmas, e qualquer célula conhecida dos habilitados na técnica que pode ser usada como uma linha celular hospedeira está disponível.

[0037] De acordo com ainda outra forma de realização da presente invenção, é fornecido um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente ao epítopo da presente invenção.

[0038] Além disso, o anticorpo de acordo com a presente invenção se liga especificamente a um epítopo incluindo um polipeptídeo consistindo em uma sequência de aminoácidos representada pela Fórmula 1, ou um epítopo incluindo um polipeptídeo representado por qualquer sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 18 a 29, na proteína Lrig-1 presente em células T reguladoras, de modo que a função das células T reguladoras possa ser suprimida e a atividade das células T efetoras possa ser mantida ou aumentada, suprimindo assim eficazmente o crescimento de células cancerígenas, em particular, células cancerígenas sólidas.

[0039] Como usado nesse documento, o “câncer” se refere a, ou indica uma, condição fisiológica caracterizada pelo crescimento celular em mamíferos que não é regulado de uma forma típica. O câncer a ser prevenido, melhorado ou tratado na presente invenção pode ser tumor sólido formado por aglomerados causados pelo crescimento anormal de células em um órgão sólido e pode ser, mas não está limitado a, câncer gástrico, câncer de fígado, glioblastoma, câncer de ovário, câncer colorretal, câncer de cabeça e pescoço, câncer de bexiga, câncer de células renais, câncer de mama, câncer metastático, câncer de próstata, câncer pancreático, melanoma, câncer de pulmão ou semelhantes, dependendo da localização do órgão sólido.

[0040] Na presente invenção, o anticorpo como um anticorpo de comprimento total ou como parte do anticorpo tem a capacidade de se ligar à proteína Lrig-1 e inclui qualquer fragmento de anticorpo que se liga ao sítio de determinação do antígeno Lrig-1 em uma maneira competitiva com a molécula de ligação da presente invenção.

[0041] Como usado nesse documento, o “anticorpo” se refere a uma molécula de proteína que serve como um receptor que reconhece especificamente um antígeno, incluindo uma molécula de imunoglobulina que é imunologicamente reativa com um antígeno particular. Para a finalidade da presente invenção, o antígeno pode ser a proteína Lrig-1 presente na superfície de células T reguladoras. De preferência, o anticorpo pode reconhecer especificamente a região rica em leucina ou domínio semelhante à imunoglobulina da proteína Lrig-1, mas não está limitado à mesma.

[0042] Na presente invenção, a “imunoglobulina” tem uma cadeia pesada e uma cadeia leve, e cada uma das cadeias pesada e leve compreende uma região constante e uma região variável. A região variável de cada uma das cadeias leve e pesada contém três regiões hipervariáveis chamadas regiões determinantes de complementaridade (doravante referidas como “CDRs”) e quatro regiões estruturais. As CDRs servem principalmente para se ligarem a um epítopo em um antígeno.

As CDRs de cada cadeia são tipicamente referidas como CDR1, CDR2 e CDR3 sequencialmente a partir do terminal N e também são distinguidas pela cadeia onde estão localizadas CDRs específicas.

[0043] Na presente invenção, o “anticorpo de comprimento total” tem uma estrutura com duas cadeias leves de comprimento total e duas cadeias pesadas de comprimento total em que cada cadeia leve está ligada a uma cadeia pesada por ligação dissulfeto e inclui IgA, IgD, IgE, IgM e IgG. O IgG inclui, como subtipos dos mesmos, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.

[0044] Além disso, como usado nesse documento, o “fragmento de ligação ao antígeno” se refere a um fragmento tendo uma função de ligação ao antígeno e exemplos do fragmento de ligação ao antígeno incluem (i) um fragmento Fab que consiste em uma região variável da cadeia leve (VL) , uma região variável da cadeia pesada (VH), uma região constante da cadeia leve (CL) e uma região constante 1 da cadeia pesada (CH1); (ii) um fragmento Fd que consiste em domínios VH e CH1; (iii) um fragmento Fv que consiste em domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo; (iv) um fragmento dAb (Ward, E. S. et al., Nature 341: 544-546 (1989)) consistindo em um domínio VH; (v) uma região CDR isolada; (vi) um fragmento F(ab’) 2, que é um fragmento bivalente incluindo dois fragmentos Fab ligados; (vii) uma molécula Fv de cadeia única (scFv), na qual um domínio VH e um domínio VL são ligados por um ligante peptídico que permite que os dois domínios se associem para formar um sítio de ligação ao antígeno; (viii) um dímero Fv de cadeia simples biespecífico; e (ix) um fragmento biespecífico, que é um fragmento multivalente ou multiespecífico construído por fusão gênica. O fragmento de ligação ao antígeno pode ser obtido como um fragmento Fab ou F(ab’)2 em um caso onde uma enzima proteolítica, por exemplo, papaína ou pepsina, é usada e pode ser produzida através de uma técnica recombinante genética.

[0045] Além disso, na presente invenção, o anticorpo pode ser, mas não está limitado a, um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, uma molécula bivalente biespecífica, um fragmento monoespecífico, um anticorpo de domínio, um anticorpo biespecífico, um mimético de anticorpo, um fragmento biespecífico, um fragmento triespecífico ou um fragmento tetraespecífico ou um fragmento dos mesmos.

[0046] Além disso, como usado nesse documento, o “anticorpo monoclonal” se refere a uma molécula de anticorpo de uma única composição molecular que é obtida substancialmente da mesma população de anticorpos e exibe especificidade de ligação única e afinidade para um epítopo particular.

[0047] Na presente invenção, o “anticorpo quimérico” é um anticorpo que é obtido por recombinação de uma região variável de um anticorpo de camundongo e uma região constante de um anticorpo humano, e tem uma resposta imune muito melhorada em comparação com o anticorpo de camundongo.

[0048] Adicionalmente, como usado nesse documento, o “anticorpo humanizado” se refere a um anticorpo obtido pela modificação de uma sequência de proteínas de um anticorpo derivado de uma espécie não humana de modo que a sequência de proteínas seja similar a uma variante de anticorpo produzida naturalmente em humanos. Por exemplo, o anticorpo humanizado pode ser preparado como a seguir. As CDRs derivadas de camundongo podem ser recombinadas com uma FR derivada de anticorpo humano para preparar uma região variável humanizada, e a região variável humanizada pode ser recombinada com uma região constante de um anticorpo humano preferido para preparar um anticorpo humanizado.

[0049] Como usado nesse documento, a “ligação” ou “ligação específica” se refere à afinidade do anticorpo ou da composição de anticorpo nesse documento para um antígeno.

Na ligação antígeno-anticorpo, a “ligação específica” é distinguível da ligação de base não específica, tipicamente em um caso em que uma constante de dissociação (Kd) é menor que 1x10-5 M, menor que 1x10-6 M, ou menor que 1x10-7 M. A ligação específica pode ser detectada por métodos conhecidos na técnica, tais como, ELISA, ressonância plasmônica de superfície (SPR), imunoprecipitação e coprecipitação, que incluem um controle apropriado que pode distinguir entre ligação não específica e ligação específica.

[0050] O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção pode existir como um multímero, tal como um dímero, um trímero, um tetrâmero ou um pentâmero, que inclui pelo menos parte da capacidade de ligação ao antígeno de um monômero. Esse multímero também inclui um homomultímero ou um heteromultímero. Os multímeros de anticorpos contêm um grande número de sítios de ligação ao antígeno e, portanto, têm capacidade de ligação ao antígeno superior em comparação com os monômeros. Os multímeros de anticorpos também são facilmente usados para produzir anticorpos multifuncionais (isto é, bifuncionais, trifuncionais, tetrafuncionais ou semelhantes).

[0051] Como usado nesse documento, o “multifuncional” se refere a um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que tem duas ou mais atividades ou funções (por exemplo, capacidade de ligação ao antígeno, atividade enzimática e capacidade de ligação a ligante ou receptor). Por exemplo, o anticorpo da presente invenção pode ser ligado a um polipeptídeo tendo atividade enzimática, tais como, luciferase, acetiltransferase e galactosidase e semelhantes.

Os anticorpos multifuncionais também incluem formas multivalentes ou multiespecíficas (isto é, biespecíficas, triespecíficas ou semelhantes) de anticorpos.

[0052] De acordo com ainda outra forma de realização da presente invenção, é fornecido um conjugado anticorpo- fármaco (ADC) compreendendo o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno fornecido pela presente invenção e um fármaco.

[0053] Como usado nesse documento, o “conjugado anticorpo-fármaco (ADC)” se refere a uma forma na qual o fármaco e o anticorpo estão quimicamente ligados um ao outro sem degradar a atividade biológica do anticorpo e do fármacos. Na presente invenção, o conjugado anticorpo- fármaco indica uma forma em que o fármaco é ligado a um resíduo de aminoácido no terminal N da cadeia pesada e/ou leve do anticorpo, especificamente, uma forma na qual o fármacos é ligado a um grupo -amina no terminal N da cadeia pesada e/ou da cadeia leve do anticorpo.

[0054] Como usado nesse documento, o “fármaco” pode significar qualquer substância tendo uma certa atividade biológica para uma célula, que é um conceito que inclui DNA, RNA ou um peptídeo. O fármacos pode estar em uma forma que contém um grupo reativo capaz de reagir e reticular com um grupo α-amina, e também inclui uma forma que contém um grupo reativo capaz de reagir e reticular com um grupo -amina e ao qual um ligante é ligado.

[0055] Na presente invenção, os exemplos do grupo reativo capaz de reagir e reticular com o grupo -amina não são particularmente limitados em termos de tipo, desde que o grupo reativo possa reagir e reticular com um grupo - amina no terminal N de uma cadeia pesada ou uma cadeia leve de um anticorpo. O grupo reativo inclui todos os tipos de grupos conhecidos na técnica que reagem com um grupo amina.

O grupo reativo pode ser, por exemplo, qualquer um de isotiocianato, isocianato, acil azida, éster NHS, cloreto de sulfonila, aldeído, glioxal, epóxido, oxirano, carbonato, haleto de arila, imidoéster, carbodiimida, anidrido e éster fluorofenílico, mas é limitado aos mesmos.

[0056] Na presente invenção, o conjugado anticorpo- fármaco inclui, como o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente ao epítopo da presente invenção, isto é, um epítopo incluindo um polipeptídeo que consiste em uma sequência de aminoácidos representada pela Fórmula 1, ou um epítopo incluindo um polipeptídeo representado por qualquer sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 18 a 29, na proteína Lrig-1, na qual o fármacos pode ser um fármaco que pode tratar o câncer, a doença direcionada por um anticorpo Lrig-1, isto é, um agente anticâncer.

[0057] Na presente invenção, o agente anticâncer pode incluir qualquer fármacos, sem limitação, desde que o fármaco seja usado para prevenção, melhoria ou tratamento do câncer.

O agente anticâncer pode ser, por exemplo, selecionado do grupo que consiste em mostarda nitrogenada, imatinib,

oxaliplatina, rituximabe, erlotinib, neratinib, lapatinib,

gefitinib, vandetanib, nilotinib, semaxanib, bosutinib,

axitinib, cediranib, lestaurtinib, trastuzumab, gefitinib,

bortezomib, sunitinib, carboplatin, sorafenib, bevacizumab,

cisplatin, cetuximab, Visgo, asparaginase, tretinoína,

hidroxicarbamida, dasatinib, estramustina, gemtuzumab ozogamicina, ibritumomab tiuxetano, heptaplatina, ácido metil aminolevulínico, amsacrina, alemtuzumab, procarbazina,

alprostadil, quitosano nitrato de hólmio, gencitabina,

doxifluridina, pemetrexede, tegafur, capecitabina,

gimeracil, oteracil, azacitidina, metotrexato, uracila,

citarabina, fluorouracil, fludarabina, enocitabina,

flutamida, capecitabina, decitabina, mercaptopurina,

tioguanina, cladribine, carmofur, raltitrexedo, docetaxel,

paclitaxel, irinotecano, belotecan, topotecan, vinorelbina,

etoposida, vinblastina, idarubicina, mitomicina, bleomicina,

dactinomicina, pirarubicina, aclarubicina, peplomicina,

temsirolimus, temozolomida, busulfan, ifosfamida,

ciclofosfamida, melfalana, altretamina, dacarbazina,

tiotepa, nimustina, clorambucil, mitolactol, leucovorina,

tretinoína, exemestano, aminoglutetimida, anagrelida,

olaparib, navelbine, fadrozol, tamoxifeno, toremifeno,

testolactona, anastrozol, letrozol, vorozol, bicalutamida,

lomustina, 5FU, vorinostat, entinostat, e carmustina.

No entanto, o agente anticâncer não está limitado aos mesmos.

[0058] Na presente invenção, o câncer pode ser tumor sólido formado de aglomerados causados por crescimento anormal de células em um órgão sólido, e exemplos específicos dos mesmos podem incluir, mas não estão limitados a, câncer gástrico, câncer de fígado, glioblastoma, câncer de ovário, câncer colorretal, câncer de cabeça e pescoço, câncer de bexiga, câncer de células renais, câncer de mama, câncer metastático, câncer de próstata, câncer pancreático, melanoma, câncer de pulmão ou semelhantes, dependendo da localização do órgão sólido.

[0059] De acordo com ainda outra forma de realização da presente invenção, é fornecida uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar o câncer, compreendendo, como um ingrediente ativo, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno fornecido pela presente invenção, ou o conjugado anticorpo-fármaco (ADC) fornecido pela presente invenção.

[0060] Na presente invenção, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, ou o conjugado anticorpo-fármacos obtido pela ligação de um fármaco ao mesmo, que está contido como um ingrediente ativo na composição farmacêutica, se liga especificamente a um epítopo incluindo um polipeptídeo que consiste em uma sequência de aminoácidos representada pela Fórmula 1, ou um epítopo incluindo um polipeptídeo representado por qualquer sequência de aminoácidos de SEQ ID

NOs: 18 a 29, na proteína Lrig-1 presente em células T reguladoras, de modo que a função das células T reguladoras possa ser suprimida e a atividade das células T efetoras possa ser mantida ou aumentada, suprimindo assim eficazmente o crescimento de células cancerígenas, em particular, células cancerígenas sólidas.

[0061] Na presente invenção, o câncer pode ser tumor sólido formado de aglomerados causados por crescimento anormal de células em um órgão sólido, e exemplos específicos dos mesmos podem incluir, mas não estão limitados a, câncer gástrico, câncer de fígado, glioblastoma, câncer de ovário, câncer colorretal, câncer de cabeça e pescoço, câncer de bexiga, câncer de células renais, câncer de mama, câncer metastático, câncer de próstata, câncer pancreático, melanoma, câncer de pulmão ou semelhantes, dependendo da localização do órgão sólido.

[0062] Enquanto isso, na presente invenção, a “prevenção” pode incluir, sem limitação, qualquer ato de bloquear os sintomas de uma doença, ou suprimir ou retardar os sintomas, usando a composição farmacêutica da presente invenção.

[0063] Adicionalmente, na presente invenção, o “tratamento” pode incluir, sem limitação, qualquer ato de melhorar ou alterar beneficamente os sintomas de uma doença, usando a composição farmacêutica da presente invenção.

[0064] Na presente invenção, a composição farmacêutica pode ser caracterizada por estar na forma de cápsulas, comprimidos, grânulos, injeções, pomadas, pós ou bebidas, e a composição farmacêutica pode ser caracterizada por ser direcionada a humanos.

[0065] Na presente invenção, a composição farmacêutica pode ser formulada na forma de preparações orais, tais como, pós, grânulos, cápsulas, comprimidos e suspensões aquosas, preparações para uso externo, supositórios e soluções injetáveis estéreis, respectivamente, de acordo com métodos convencionais, e usado. No entanto, a composição farmacêutica não está limitada aos mesmos. A composição farmacêutica da presente invenção pode compreender adicionalmente um carreador farmaceuticamente aceitável.

Como o carreador farmaceuticamente aceitável, um aglutinante, um agente deslizante, um desintegrante, um excipiente, um solubilizante, um dispersante, um estabilizador, um agente de suspensão, um pigmento, um aroma e semelhantes podem ser usados para administração oral; um tampão, um agente conservante, um agente de alívio da dor, um solubilizante, um agente isotônico, um estabilizador e semelhantes podem ser usados em mistura para injeções; e uma base, um excipiente, um lubrificante, um agente conservante e semelhantes podem ser usados para administração tópica. As preparações da composição farmacêutica da presente invenção podem ser preparadas de várias maneiras, sendo misturadas com o carreador farmaceuticamente aceitável como descrito acima. Por exemplo, para administração oral, a composição farmacêutica pode ser formulada na forma de comprimidos, trociscos, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, tabletes ou semelhantes. Para injeções, a composição farmacêutica pode ser formulada na forma de ampolas de dosagem unitária ou formas de múltiplas dosagens. Alternativamente, a composição farmacêutica pode ser formulada em soluções, suspensões, comprimidos, cápsulas, preparações de liberação sustentada ou semelhantes.

[0066] Enquanto isso, como exemplos de carreadores, diluentes ou excipientes adequados para preparar preparações, lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, xilitol, eritritol, maltitol, amido, goma acácia, alginato, gelatina, fosfato de cálcio, silicato de cálcio, celulose, metil celulose, celulose microcristalina, polivinilpirrolidona, água, hidroxibenzoato de metila, hidroxibenzoato de propila, talco, estearato de magnésio, óleo mineral ou semelhantes, podem ser usados.

Adicionalmente, uma carga, um anticoagulante, um lubrificante, um agente umectante, uma fragrância, um emulsificante, um conservante e semelhantes podem adicionalmente ser incluídos.

[0067] A via de administração da composição farmacêutica da presente invenção inclui, mas não está limitada a, via oral, intravenosa, intramuscular, intra- arterial, intramedular, intradural, intracardíaca, transdérmica, subcutânea, intraperitoneal, intranasal, intestinal, tópica, sublingual ou retal. A administração oral ou parenteral é preferida.

[0068] Na presente invenção, o “parenteral” inclui técnicas de injeção e infusão subcutânea, intradérmica, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intrabursal, intraesternal, intradural, intralesional e intracraniana. A composição farmacêutica da presente invenção também pode ser administrada na forma de supositórios para administração retal.

[0069] A composição farmacêutica da presente invenção pode variar dependendo de uma variedade de fatores, incluindo a atividade de um determinado composto usado, a idade do paciente, peso corporal, estado geral de saúde, sexo, dieta, tempo de administração, via de administração, taxa de excreção, combinação por fármacos e gravidade de uma determinada doença a ser prevenida ou tratada. Uma dose da composição farmacêutica pode variar dependendo da(o) condição do paciente, peso corporal, gravidade da doença, forma do fármaco, via de administração e duração, e pode ser apropriadamente selecionada por aqueles habilitados na técnica. A composição farmacêutica pode ser administrada em uma quantidade de 0,0001 a 50 mg/kg ou 0,001 a 50 mg kg, por dia. A administração pode ser feita uma vez ao dia ou várias vezes ao dia. A dose não se destina a limitar o escopo da presente invenção de forma alguma. A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser formulada na forma de pílulas, comprimidos revestidos com açúcar, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas ou suspensões.

[0070] De acordo com ainda outra forma de realização da presente invenção, é fornecido um método para prevenir ou tratar o câncer, compreendendo uma etapa de administração, a um indivíduo, do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a presente invenção, ou do conjugado anticorpo-fármaco (ADC) de acordo com a presente invenção.

[0071] O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção e o conjugado anticorpo-fármaco da presente invenção se ligam especificamente a um epítopo incluindo um polipeptídeo consistindo em uma sequência de aminoácidos representada pela Fórmula 1, ou um epítopo incluindo um polipeptídeo representado por qualquer uma sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 18 a 29, na proteína Lrig-1 presente nas células T reguladoras, de modo que a função das células T reguladoras possa ser suprimida e a atividade das células T efetoras possa ser mantida ou aumentada, suprimindo assim eficazmente crescimento de células cancerígenas, em particular, células cancerígenas sólidas.

[0072] Na presente invenção, o “indivíduo” é um indivíduo com suspeita de desenvolver câncer, e o indivíduo com suspeita de desenvolver câncer significa um mamífero, tais como, humanos, camundongos e animais domésticos, que desenvolveu ou tem probabilidade de desenvolver a doença em questão. No entanto, qualquer indivíduo que seja tratável com o anticorpo ou o conjugado anticorpo-fármaco da presente invenção está incluído nesse sem limitação.

[0073] O método da presente invenção pode compreender a administração do anticorpo ou do conjugado anticorpo- fármaco em uma quantidade farmaceuticamente eficaz. Uma quantidade diária total apropriada usada pode ser determinada por um médico assistente ou veterinário dentro do escopo de um julgamento médico sensato, e a administração pode ser feita uma ou várias vezes. No entanto, para as finalidades da presente invenção, uma quantidade terapeuticamente eficaz específica para um determinado paciente é, de preferência, aplicada de forma diferente dependendo de vários fatores, incluindo tipo e grau de reação a ser alcançado, a composição específica incluindo se outros agentes são usados com ela como o caso pode ser, a idade do paciente, o peso corporal, o estado geral de saúde, o sexo e a dieta, o tempo de administração, a via de administração, a taxa de secreção da composição, a duração do tratamento e fármacos usados simultaneamente ou em combinação com a composição específica, e fatores similares bem conhecidos no campo médico.

[0074] Enquanto isso, o método para prevenir ou tratar o câncer pode ser, mas não está limitado a, uma terapia de combinação que compreende adicionalmente a administração de um(a) composto ou substância tendo atividade terapêutica contra uma ou mais de doenças cancerígenas.

[0075] Na presente invenção, a “combinação” deve ser entendida como representando a administração simultânea, individual ou sequencial. No caso em que a administração é feita de maneira sequencial ou individual, o segundo componente deve ser administrado em intervalos de modo que os efeitos benéficos da combinação não sejam perdidos.

[0076] Na presente invenção, uma dosagem do anticorpo ou conjugado anticorpo-fármaco pode ser, mas não está limitada a, cerca de 0,0001 μg a 500 mg por kg de peso corporal do paciente.

[0077] Na presente invenção, o câncer pode ser tumor sólido formado de aglomerados causados por crescimento anormal de células em um órgão sólido e exemplos específicos dos mesmos podem incluir, mas não estão limitados a, câncer gástrico, câncer de fígado, glioblastoma, câncer de ovário, câncer colorretal, câncer de cabeça e pescoço, câncer de bexiga, câncer de células renais, câncer de mama, câncer metastático, câncer de próstata, câncer pancreático, melanoma, câncer de pulmão ou semelhantes, dependendo da localização do órgão sólido.

Efeitos Vantajosos da Invenção

[0078] O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente a um epítopo da proteína Lrig- 1, de acordo com a presente invenção, se liga especificamente ao epítopo da presente invenção presente em células T reguladoras, de modo que a função das células T reguladoras possa ser suprimida e a atividade das células T efetoras possa ser mantida ou aumentada, suprimindo assim eficazmente o crescimento de células cancerígenas, em particular, células cancerígenas sólidas.

Breve Descrição dos Desenhos

[0079] A FIG. 1 ilustra uma estrutura da proteína Lrig- 1 de acordo com uma forma de realização da presente invenção.

[0080] A FIG. 2 ilustra uma estrutura da proteína Lrig- 1 de acordo com uma forma de realização da presente invenção.

[0081] A FIG. 3 ilustra um nível de expressão de mRNA de Lrig-1 de acordo com uma forma de realização da presente invenção.

[0082] A FIG. 4 ilustra um nível de expressão de mRNA de Lrig-1 de acordo com uma forma de realização da presente invenção.

[0083] A FIG. 5 ilustra um nível de expressão de mRNA de Lrig-1 de acordo com uma forma de realização da presente invenção.

[0084] A FIG. 6 ilustra os níveis de expressão de mRNAs de Lrig-1, Lrig-2 e Lrig-3 de acordo com uma forma de realização da presente invenção.

[0085] A FIG. 7 ilustra os resultados obtidos pela comparação dos níveis de expressão da proteína Lrig-1 em células T reguladoras e células T não reguladoras de acordo com uma forma de realização da presente invenção.

[0086] A FIG. 8 ilustra a expressão da proteína Lrig-1 na superfície de células T reguladoras de acordo com uma forma de realização da presente invenção.

[0087] A FIG. 9 ilustra os resultados obtidos pela análise da capacidade de ligação de anticorpos (A7, C8, E7, G3, A8, B8, D9 e H6) à proteína Lrig-1 em uma forma de realização da presente invenção.

[0088] A FIG. 10 ilustra os resultados obtidos pela análise do mecanismo de regulação da fosforilação de Stat3 induzida pela proteína Lrig-1, em células T reguladoras, de anticorpos monoclonais específicos da proteína Lrig-1 (A7, C8, E7, G3, A8, B8, D9 e H6) em uma forma de realização da presente invenção.

[0089] A FIG. 11 ilustra uma configuração experimental para terapia do câncer usando anticorpos monoclonais específicos da proteína Lrig-1 (A8, B8, D9 e H6) em uma forma de realização da presente invenção.

[0090] A FIG. 12 ilustra os efeitos terapêuticos do câncer obtidos usando anticorpos monoclonais específicos da proteína Lrig-1 (A8, B8, D9 e H6) em uma forma de realização da presente invenção.

[0091] A FIG. 13 ilustra os resultados obtidos através da realização de mapeamento de epítopo de 10 μg/ml de um anticorpo monoclonal (H6) para a proteína Lrig-1 usando um microarranjo em uma forma de realização da presente invenção.

[0092] A FIG. 14 ilustra os resultados obtidos por meio da realização de mapeamento de epítopo de 100 μg/ml de um anticorpo monoclonal (H6) para a proteína Lrig-1 usando um microarranjo em uma forma de realização da presente invenção.

[0093] A FIG. 15 ilustra os resultados obtidos pela realização de mapeamento de epítopo de um anticorpo monoclonal (H6) para a proteína Lrig-1 usando um microarranjo em uma forma de realização da presente invenção.

Descrição Detalhada da Invenção

[0094] A presente invenção se refere a um epítopo de proteína de domínios 1 (Lrig-1) rica em leucina e semelhante à imunoglobulina, ou um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente ao epítopo.

[0095] De acordo com uma forma de realização da presente invenção, como o epítopo da proteína Lrig-1, é fornecido um epítopo incluindo um polipeptídeo que consiste em uma sequência de aminoácidos representada pela Fórmula 1, [Fórmula 1] Lx1Lx2x3N.

[0096] Na Fórmula 1, cada um de x 1 a x3 pode ser, independentemente, um aminoácido neutro, um aminoácido ácido, um aminoácido básico ou um aminoácido aromático. Nesse documento, o aminoácido neutro pode ser glicina (G), alanina (A), valina (V), leucina (L), isoleucina (I), serina (S) ou treonina (T); o aminoácido ácido pode ser ácido aspártico (D), ácido glutâmico (E), asparagina (N) ou glutamina (Q); o aminoácido básico pode ser lisina (K), arginina (R) ou histidina (H); e o aminoácido aromático pode ser fenilalanina (F) ou tirosina (Y).

[0097] Em um exemplo da presente invenção, cada um de x1 a x3 pode ser, independentemente, um aminoácido selecionado do grupo que consiste em asparagina (N), ácido aspártico (D), serina (S), tirosina (Y), arginina (R), fenilalanina (F), lisina (K), histidina (H), leucina (L), valina (V), treonina (T), alanina (A), glutamina (Q), ácido glutâmico (E) e glicina (G).

[0098] Em outro exemplo da presente invenção, x 1 pode ser um aminoácido selecionado do grupo que consiste em asparagina (N), fenilalanina (F), ácido aspártico (D), lisina (K), histidina (H), valina (V) , arginina (R) e treonina (T); x2 pode ser um aminoácido selecionado do grupo que consiste em serina (S), glutamina (Q), alanina (A), asparagina (N), ácido glutâmico (E), ácido aspártico (D), fenilalanina (F) e glicina (G); e x3 pode ser um aminoácido selecionado do grupo que consiste em tirosina (Y), histidina (H), glicina (G), arginina (R), asparagina (N), leucina (L), lisina (K) e fenilalanina (F).

[0099] Em ainda outro exemplo da presente invenção, cada um de x1 a x3 pode ser, independentemente, um aminoácido selecionado do grupo que consiste em asparagina (N), ácido aspártico (D), serina (S), tirosina (Y) e arginina (R).

[00100] Ainda em outro exemplo da presente invenção, x1 pode ser asparagina (N) ou ácido aspártico (D); x 2 pode ser serina (S) ou asparagina (N); e x 3 pode ser tirosina (Y) ou arginina (R).

[00101] Em ainda outro exemplo da presente invenção, o polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos representada pela Fórmula 1 pode ser representado por, mas não está limitado a, qualquer sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 4 a 17.

[00102] De acordo com outra forma de realização da presente invenção, como o epítopo da proteína Lrig-1, é fornecido um epítopo incluindo um polipeptídeo representado por qualquer sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 18 a 29 na Tabela 4.

[00103] De acordo com ainda outra forma de realização da presente invenção, é fornecido um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente ao epítopo da presente invenção.

[00104] De acordo com ainda outra forma de realização da presente invenção, é fornecida uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar o câncer, compreendendo, como um ingrediente ativo, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno fornecido pela presente invenção.

[00105] A seguir, a presente invenção será descrita em mais detalhes por meio de exemplos. Esses exemplos são apenas para descrever a presente invenção em mais detalhes, e será evidente para os habilitados na técnica que, de acordo com a essência da presente invenção, o escopo da presente invenção não é limitado por esses exemplos.

Exemplos [Exemplo de Preparação 1] Cultura de células do subtipo de células T

[00106] De modo a identificar se a proteína Lrig-1 é expressada apenas em células T reguladoras (Treg), foram preparados os subconjuntos de células T Th0, Th1, Th2, Th17 e iTreg. A iTreg se refere a células cuja diferenciação foi artificialmente induzida em um meio tendo a seguinte composição, ao contrário da nTreg que foi isolada naturalmente.

[00107] Os subconjuntos de células T foram induzidos a se diferenciar em células respectivas isolando primeiro células T naive obtidas do baço de camundongos, causando meio nutriente RPMI1640 (Invitrogen Gibco, Grand Island, NY) que contém 10% de soro fetal bovino (FBS; HyClone, Logan, UT) para conter adicionalmente os respectivos ingredientes da Tabela 5 abaixo e realizar a incubação de 72 horas em uma incubadora a 37 C, 5% de CO2.

[Tabela 5] Célula diferenciada Composição Th0 anti-CD3, anti-CD28 Th1 IL-12, anticorpo anti-IL-4 Th2 IL-4, anti-IFNβ Th17 IL-6, TGFβ, anti-IFNβ, anti-IL- 4 iTreg IL-2, TGFβ [Exemplo 1] Análise estrutural de Lrig-1

[00108] Uma estrutura estérica tridimensional do domínio extracelular da proteína Lrig-1 foi prevista para produzir um anticorpo específico para a proteína Lrig-1, uma proteína superficial de células T reguladoras.

[00109] Primeiro, a fim de prever as sequências de base de epítopos, as ferramentas do Uniprot (http://www.uniprot.org) e do Banco de Dados de Proteínas RCSB (http://www.rcsb.org/pdb) foram usadas para prever um estrutura estérica tridimensional do domínio extracelular (ECD) da proteína Lrig-1 de modo que a estrutura de ECD seja identificada. Em seguida, os resultados são ilustrados nas FIGS. 1 e 2.

[00110] Como ilustrado na FIG. 1, um total de 15 regiões ricas em leucina de LRR1 a LRR15 existem no domínio Lrig-LRR (sequência de aminoácidos nas posições 41 a 494) no domínio extracelular da proteína Lrig-1. Cada um dos domínios LRR é composto de 23 a 27 aminoácidos, com 3 a 5 leucinas estando presentes.

[00111] Além disso, como ilustrado na FIG. 2, existem três domínios semelhantes à imunoglobulina nas sequências de aminoácidos nas posições 494 a 781 da proteína Lrig-1 no domínio extracelular da proteína Lrig-1.

[Exemplo 2] Identificação da expressão específica de mRNA de Lrig-1 em células T reguladoras

[00112] Foi verificado se a proteína Lrig-1 pode atuar como um biomarcador específico para células T reguladoras.

[00113] Para a verificação, as células T CD4 + foram isoladas usando classificação de células ativadas por ímã (MACS), através de esferas CD4, do baço de camundongos.

Subsequentemente, células T reguladoras (T CD4 + CD25+) e células T não reguladoras (T CD4+ CD25−) foram isoladas com um classificador de células ativadas por fluorescência (FACS) usando um anticorpo CD25. Para as respectivas células e as células diferenciadas no Exemplo de Preparação 1, o mRNA foi extraído usando Trizol e, em seguida, o gDNA foi removido do RNA genômico usando o kit de extração de gDNA (Qiagen) de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante.

O mRNA removido com gDNA foi sintetizado em cDNA através do Kit de Síntese de cDNA BDsprint (Clonetech).

[00114] A reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT PCR) foi realizada para identificar quantitativamente um nível de expressão do mRNA de Lrig-1 no cDNA.

[00115] A reação em cadeia da polimerase em tempo real foi realizada com os iniciadores mostrados na Tabela 6 abaixo usando SYBR Green (Sondas Moleculares) de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante sob condições de 40 ciclos consistindo em 95 C por 3 minutos, 61 C por 15 segundos, 72 C por 30 segundos; e um nível de expressão gênica relativo foi calculado usando o método ΔCT e normalizado usando HPRT. Os resultados são ilustrados nas FIGS. 3 a 6.

[Tabela 6] Iniciador Sequência Lrig-1 de Camundongo 5’-GAC GGA ATT CAG TGA GGA GAA CCT-3’ Direta 5’-CAA CTG GTA GTG GCA GCT TGT AGG-3’ Reversa Lrig-2 de Camundongo 5’-TCA CAA GGA ACA TTG TCT GAA CCA-3’ Direta 5’-GCC TGA TCT AAC ACA TCC TCC TCA-3’

Reversa Lrig-3 de Camundongo 5’-CAG CAC CTT GAG CTG AAC AGA AAC-3’ Direta 5’-CCA GCC TTT GGT AAT CTC GGT TAG-3’ Reversa FOXP3 de Camundongo 5’-CTT TCA CCT ATC CCA CCC TTA TCC-3’ Direta 5’-ATT CAT CTA CGG TCC ACA CTG CTC-3’ Reversa ACTG1 5’-GGC GTC ATG GTG GGC ATG GG-3’ Direta 5’-ATG GCG TGG GGA AGG GCG TA-3’ Reversa

[00116] Como ilustrado na FIG. 3, pode-se observar que a expressão de Lrig-1 em células T reguladoras (T CD4 + CD25+) é 18,1 vezes maior do que em células T não reguladoras (T CD4+ CD25). Este foi um nível de expressão cerca de 10 vezes maior do que Lag3 e Ikzf4, que são marcadores previamente conhecidos para células T reguladoras. Além disso, como ilustrado nas FIGS. 4 e 5, a expressão de mRNA de Lrig-1 foi notavelmente alta em células T reguladoras em comparação com outros tipos de células imunes e, em particular, foi notavelmente alta em células T reguladoras isoladas naturalmente (nTreg) em comparação com células T reguladoras induzidas (iTreg).

[00117] Além disso, como ilustrado na FIG. 6, a expressão de Lrig-1 foi a maior entre Lrig-1, Lrig-2 e Lrig- 3 que correspondem à família Lrig.

[00118] A partir dos resultados acima, pode ser visto que a proteína Lrig-1 de acordo com a presente invenção é especificamente expressada em células T reguladoras, em particular, células T reguladoras de ocorrência natural.

[Exemplo 3] Identificação da expressão específica da proteína Lrig-1 em células T reguladoras

[00119] Foi identificado se a proteína Lrig-1 expressada a partir do mRNA de Lrig-1 é especificamente expressada apenas em células T reguladoras. Usando camundongos com genes modificados FOXP3-RFP, o FOXP3-RFP obtido por acoplamento de proteína fluorescente vermelha (RFP) ao promotor FOXP3, que é um fator de transcrição específico para células T reguladoras, células T CD4 + foram isoladas usando classificação de células ativadas por ímã (MACS), por meio de sedimentos CD4, do baço dos camundongos.

Subsequentemente, usando a proteína RFP, células T reguladoras (T CD4+ RFP+) e células T não reguladoras (T CD4+ RFP-) foram obtidas por meio de isolamento por meio de um classificador de células ativadas por fluorescência (FACS).

As respectivas células foram coradas com o anticorpo Lrig-1 adquirido e um controle negativo foi corado com um anticorpo de controle compatível com o isotipo, para medir um nível de expressão de Lrig-1 com o classificador de células ativado por fluorescência. Os resultados são ilustrados na FIG. 7.

[00120] Como ilustrado na FIG. 7, as células T não reguladoras indicadas por uma linha pontilhada mostraram quase o mesmo nível de expressão de Lrig-1 que o controle negativo, enquanto havia um grande número de células com alto nível de expressão de Lrig-1 nas células T reguladoras.

[00121] A partir dos resultados acima, pode ser visto que a proteína Lrig-1 de acordo com a presente invenção é especificamente expressada em células T reguladoras.

[Exemplo 4] Identificação da expressão específica da proteína Lrig-1 na superfície de células T reguladoras

[00122] Do ponto de vista de que para ser alvo de terapia celular, a proteína Lrig-1 deve ser expressada na superfície das células T reguladoras, o que por sua vez permite uma terapia alvo mais eficaz, foi identificado se a proteína Lrig-1 é expressada na superfície das células T reguladoras.

[00123] Os respectivos subconjuntos de células T diferenciadas do Exemplo de Preparação 1 foram corados com anticorpos anti-CD4-APC e anti-Lrig-1-PE, e os níveis de expressão de Lrig-1 foram medidos nas respectivas superfícies celulares usando um classificador de células ativado por fluorescência (FACS). Os resultados são ilustrados na FIG. 8.

[00124] Como ilustrado na FIG. 8, Lrig-1 foi expressado em uma quantidade de 0,77 a 15,3 em células T ativadas, células Th1, células Th2, células Th17 e células T naive, enquanto Lrig-1 foi expressada em tão alto quanto 83,9 em células T induzidas por diferenciação (células iTreg).

[00125] A partir dos resultados acima, pode ser visto que a proteína Lrig-1 de acordo com a presente invenção não é apenas expressada especificamente em células T reguladoras (Treg), mas também é, em particular, expressada em um nível mais alto na superfície do Células Treg.

[Exemplos de produção 1 a 8] Produção de anticorpos monoclonais específicos para a proteína Lrig-1

[00126] Foram produzidos anticorpos específicos para a proteína Lrig-1 de acordo com a presente invenção. Os presentes anticorpos não foram produzidos pelo relatório descritivo de um determinado epítopo, mas foram produzidos como anticorpos capazes de se ligar a qualquer sítio na proteína Lrig-1.

[00127] De modo a produzir os anticorpos, foram produzidas células que expressam a proteína Lrig-1. Mais especificamente, um fragmento de DNA correspondente à SEQ ID NO: 2 e pcDNA (higro) foram clivados com uma enzima de clivagem, incubados a 37 C e ligados para produzir pcDNA no qual uma sequência de DNA da proteína Lrig-1 é inserida. O pcDNA assim produzido no qual a SEQ ID NO: 2 é inserida foi introduzido, por transfecção, em células L, de modo que a proteína Lrig-1 pode ser expressada na superfície das células L.

[00128] As sequências de aminoácidos da cadeia leve e da cadeia pesada capazes de se ligarem a Lrig-1 expressada na superfície celular foram selecionadas da biblioteca de scFv humano de modo que um total de oito cadeias pesadas e leves foram selecionadas.

[00129] As sequências de aminoácidos da cadeia pesada e da cadeia leve selecionadas foram fundidas com a região Fc mlgG2a, para produzir anticorpos monoclonais. As sequências dos anticorpos monoclonais são mostradas na Tabela 7 abaixo.

[Tabela 7] Classificação Clone Locação Sequência do Aminoácido Informação da Sequência Exemplo de Clone Cadeia EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYDMSWVRQAPGKGLEWVSLIYP SEQ ID NO: Produção 1 A7 pesada DSGNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDAGLSWAG 30

AFDYWGQGTLVTVSSTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLT WNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKV DKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVV VDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSG KEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMV TDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNS

YSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK Cadeia leve QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVTWYQQLPGTAPKLLIYSDS SEQ ID NO: HRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCGSWDYSLSAYVFGGGTK 31

LTVLRTVAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQ NGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSF

NRNEC Exemplo de Clone Cadeia EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYYMSWVRQAPGKGLEWVSGISP SEQ ID NO: Produção 2 C8 pesada GDSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGLYSNPNE 32

PFDYWGQGTLVTVSSTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLT WNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKV DKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVV VDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSG KEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMV TDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNS

YSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK Cadeia leve QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGSNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDDS SEQ ID NO: QRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGTWDYSLNGYVFGGGTK 33

LTVLRTVAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQ NGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSF

NRNEC Exemplo de Clone Cadeia EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSGISP SEQ ID NO: Produção 3 E7 pesada DGSNIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVGLRCRYE 34

ACSYAYGMDVWGQGTLVTVSSTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFP EPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHP ASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSP IVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQH QDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQV TLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKN

WVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK Cadeia leve QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVSWYQQLPGTAPKLLIYSDS SEQ ID NO: HRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCATWDSSLNGYVFGGGTK 35

LTVLRTVAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQ NGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSF

NRNEC Exemplo de Clone Cadeia EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYDMSWVRQAPGKGLEWVSSISP SEQ ID NO: Produção 4 G3 pesada SSGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDLDAFWRP 36

SFDYWGQGTLVTVSSTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLT WNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKV DKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVV VDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSG KEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMV TDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNS

YSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK Cadeia leve QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGNNNVNWYQQLPGTAPKLLIYSDS SEQ ID NO: HRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDDSLSAYVFGGGTK 37

LTVLRTVAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQ NGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSF

NRNEC Exemplo de Clone Cadeia EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYDMSWVRQVPGKGLEWVSWISH SEQ ID NO: Produção 5 A8 pesada GGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGLGLCKTG 38

LCYYYDAMDVWGQGTLVTVSSTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFP EPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHP ASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSP IVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQH QDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQV TLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKN

WVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK Cadeia leve QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGNNSVTWYQQLPGTAPKLLIYADN SEQ ID NO: NRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDSSLSAYVFGGGTK 39

LTVLRTVAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQ NGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSF

NRNEC Exemplo de Clone Cadeia EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWVRQAPGKGLEWVSGISH SEQ ID NO: Produção 6 B8 pesada DSGSKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHWTTFDYW 40

GQGTLVTVSSTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGS LSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIE PRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSE DDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKC KVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMP EDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSV

VHEGLHNHHTTKSFSRTPGK Cadeia leve QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNNVTWYQQLPGTAPKLLIYANS SEQ ID NO: NRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGAWDYSLSAYVFGGGTK 41

LTVLRTVAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQ NGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSF

NRNEC Exemplo de Clone Cadeia EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIYP SEQ ID NO: Produção 7 D9 pesada GGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDILPCPWG 42

RCYYDYAMDVWGQGTLVTVSSTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFP EPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHP ASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSP IVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQH QDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQV TLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKN

WVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK Cadeia leve QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSDSSSNIGSNTVSWYQQLPGTAPKLLIYADN SEQ ID NO: NRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGTWDYSLSGYVFGGGTK 43

LTVLRTVAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQ NGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSF

NRNEC Exemplo de Clone Cadeia EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSVISH SEQ ID NO: Produção 8 H6 pesada GGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVISNCHLG 44

VCYYSNGMDVWGQGTLVTVSSTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFP EPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHP ASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSP IVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQH QDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQV TLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKN

WVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK Cadeia leve QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGNNDVYWYQQLPGTAPKLLIYSDS SEQ ID NO: QRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGTWDYSLSGYVFGGGTK 45

LTVLRTVAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQ NGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSF

NRNEC [Exemplo 5] Avaliação da capacidade de ligação de anticorpos de acordo com a presente invenção à proteína Lrig-1

[00130] De modo a identificar se os anticorpos monoclonais de acordo com a presente invenção produzidos nos Exemplos de Produção 1 a 8 reconhecem bem Lrig-1, cada um dos anticorpos dos Exemplos de Produção 1 a 8 foi ligado a células L que expressam Lrig-1 de forma estável. Em seguida, um anticorpo secundário que é conjugado com eFlour 670 e é capaz de reconhecer anticorpos de camundongo foi adicionado a ele, e então a capacidade de ligação dos anticorpos monoclonais à proteína Lrig-1 foi analisada usando FACS. Os resultados são ilustrados na FIG. 9.

[00131] Como ilustrado na FIG. 9, verificou-se que todos os anticorpos monoclonais específicos da proteína Lrig-1 (A7, A8, B8, C8, D9, E7, G3 e H6) de acordo com a presente invenção efetivamente reconhecem e se ligam à proteína Lrig-1 presente na superfície das células L.

[Exemplo 6] Regulação da via de transdução de sinal em células T reguladoras, por anticorpos de acordo com a presente invenção

[00132] A fim de analisar como os anticorpos monoclonais de acordo com a presente invenção produzidos nos Exemplos de Produção 1 a 8 afetam a via de transdução de sinal em células T reguladoras através da proteína Lrig-1, Lrig-1 presente na superfície das células T reguladoras foi estimulada tratando as células T reguladoras com os anticorpos dos Exemplos de Produção 1 a 8, e então um nível de fosforilação da tirosina da proteína Stat3 presente nas células T reguladoras estimuladas foi analisado através de imunoblot de fosfotirosina. Os resultados são ilustrados na FIG. 10.

[00133] Como ilustrado na FIG. 10, verificou-se que os anticorpos monoclonais específicos da proteína Lrig-1 (A7, C8, E7 e G3) de acordo com a presente invenção aumentam a fosforilação de Stat3 para o mesmo nível que as células Th17. Por outro lado, verificou-se que os anticorpos monoclonais específicos da proteína Lrig-1 (A8, B8, D9 e H6) de acordo com a presente invenção continuam a manter e diminuir a fosforilação de Stat3 ao mesmo nível que as células iTreg.

[Exemplo 7] Efeitos terapêuticos do câncer de anticorpos A8, B8, D9 e H6

[00134] De modo a identificar os efeitos terapêuticos, no câncer sólido, dos anticorpos monoclonais (A8, B8, D9 e H6) de acordo com a presente invenção, os quais foram produzidos nos Exemplos de Produção 5 a 8, como ilustrado na FIG. 11, as células de melanoma B16F10 foram injetadas subcutaneamente na área dorsal de camundongos em uma quantidade de 3 x 10 5 células e, em seguida, os anticorpos dos Exemplos de Produção 5 a 8 foram injetados intraperitonealmente nos camundongos em uma quantidade de 200 ug nos dias 4, 8 e 12. Após o transplante das células de melanoma, as mudanças no volume do tumor ao longo do tempo foram medidas e os resultados são ilustrados na FIG. 12.

[00135] Como ilustrado na FIG. 12, verificou-se que tamanhos de tumor de melanoma notavelmente diminuídos são observados em um caso de tratamento com os anticorpos monoclonais específicos da proteína Lrig-1 (A8, B8, D9 e H6) de acordo com a presente invenção, em comparação com um controle negativo não tendo recebido tratamento com anticorpos.

[00136] A partir desses resultados, pode-se verificar que os anticorpos monoclonais específicos da proteína Lrig- 1 de acordo com a presente invenção suprimem o crescimento de várias células cancerígenas sólidas, prevenindo,

melhorando ou tratando eficazmente tais cânceres.

[Exemplo 8] Determinação de epítopos na proteína Lrig-1 de acordo com a presente invenção

[00137] De modo a descobrir epítopos que se ligam ao anticorpo H6 do Exemplo de Produção 8, em que os epítopos estão presentes nos respectivos domínios LRR e domínios semelhantes a Ig na proteína Lrig-1 presente na superfície de células T reguladoras, o seguinte experimento foi realizada.

1. Preparação experimental (1) Microarranjo

[00138] A proteína Lrig-1 foi alongada por ligantes GSGSGSG nos seus terminais C e N para evitar o truncamento de peptídeos. A sequência antigênica alongada foi traduzida em 15 aminoácidos com uma sobreposição de peptídeo-peptídeo de 14 aminoácidos. Os microarranjos de peptídeo Lrig-1 resultantes continham 1.091 peptídeos diferentes impressos em duplicatas e enquadrados por peptídeos de controle HA (YPYDVPDYAG, 102 pontos) adicionais.

(2) Material experimental

[00139] Amostra: anticorpo monoclonal H6 do Exemplo de Produção 8

[00140] Tampão de lavagem: PBS, pH 7,4 com Tween 20 a 0,05% (3 vezes, 10 segundos após cada incubação)

[00141] Tampão de bloqueio: tampão de bloqueio

Rockland MB-070 (30 minutos antes do primeiro ensaio)

[00142] Tampão de incubação: tampão de lavagem com tampão de bloqueio a 10%

[00143] Condições de ensaio: concentração de anticorpo no tampão de incubação sendo ajustada para 1 μg/ml, 10 μg/ml e 100 μg/ml; e a incubação sendo realizada a 4 C por 16 horas, e a agitação sendo realizada a 140 rpm

[00144] Anticorpo secundário: IgG anti-humano de cabra (H + L) DyLight680 (0,2 μg/ml); coloração sendo realizada em tampão de incubação em temperatura ambiente por 45 minutos

[00145] Anticorpo de controle: anti-HA monoclonal de camundongo (12CA5) DyLight800 (0,5 μg/ml); coloração sendo realizada em tampão de incubação em temperatura ambiente por 45 minutos

[00146] Escâner: Sistema de Geração de Imagem LI-COR Odyssey; deslocamento de varredura de 0,65 mm, resolução de 21 μm, intensidade de varredura de 7/7 (vermelho = 700 nm/verde = 800 nm)

2. Método experimental

[00147] A pré-coloração de uma cópia de microarranjo de peptídeo Lrig-1 usando anticorpos secundários e de controle em tampão de incubação foi realizada para identificar se eles podem interagir com peptídeos derivados de antígenos que podem interferir com os ensaios principais.

A incubação subsequente de outras cópias de microarranjo de peptídeo Lrig-1 com o anticorpo monoclonal H6 do Exemplo de Produção 8 (1 μg/ml, 10 μg/ml e 100 μg/ml) em tampão de incubação foi seguida pela coloração com anticorpos secundários e de controle. A leitura foi realizada em uma intensidade de varredura de 7/7 (vermelho/verde) usando o Sistema de Geração de Imagem LI-COR Odyssey. A quantificação de intensidades de ponto e anotação de peptídeo foram baseadas nos arquivos tiff de escala de cinza de 16 bits. A análise da imagem de microarranjo foi feita com Analisador PepSlide®. Os resultados são ilustrados nas FIGS. 13 a 15, e as sequências de epítopos analisadas são mostradas na Tabela 8 abaixo.

[Tabela 8] SEQ ID NO Informação da Sequência SEQ ID NO: 18 WTRSLNLSYNKL SEQ ID NO: 19 TEVRNTCFPHGPPI SEQ ID NO: 20 RLTQLDLNRNRIR SEQ ID NO: 21 DLNRNRIRLIEGLTF SEQ ID NO: 22 NSIARIHRKGW SEQ ID NO: 23 WLPPWLIGRMLQAF SEQ ID NO: 24 RQVTFGHEGRY SEQ ID NO: 25 FGHEGRYQCVITNHF SEQ ID NO: 26 RLTVNVLPSFTKTPH SEQ ID NO: 27 RRMHVMPDDDVFF SEQ ID NO: 28 FFITDVKIDDAGVYS SEQ ID NO: 29 KGDRPLSLTERHH

3. Resultados experimentais

[00148] Como ilustrado nas FIGS. 13 a 15, verificou- se que o anticorpo monoclonal (H6), que se liga especificamente à proteína Lrig-1 presente nas células T reguladoras e, portanto, trata eficazmente o câncer, se liga especificamente a um epítopo representado por qualquer sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs : 18 a 29 na proteína Lrig-1 e, portanto, exerce essa função. Além disso, verificou-se que os epítopos representados pelas SEQ ID NOs: 18 e 20 têm uma repetição rica em leucina em comum e, especificamente, esses epítopos contêm uma sequência de consenso, que pode ser representada pela sequência de aminoácidos da Fórmula 1 da presente invenção, na quinta posição de aminoácido do terminal N.

[00149] Embora a presente invenção tenha sido descrita em detalhes acima, o escopo da presente invenção não está limitado aos mesmos. Será óbvio para os habilitados na técnica que várias modificações e mudanças podem ser feitas sem se afastar do espírito técnico da presente invenção descrito nas reivindicações.

Disponibilidade Industrial

[00150] A presente invenção se refere a um epítopo de proteína de domínios 1 (Lrig-1) rica em leucina e semelhante à imunoglobulina, que é um antígeno presente na superfície de células T reguladoras, e um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente ao mesmo.

Claims (20)

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, caracterizado pelo fato de que se liga especificamente a um epítopo incluindo um polipeptídeo que consiste em uma sequência de aminoácidos representada pela Fórmula 1, [Fórmula 1] Lx1Lx2x3N (na Fórmula 1, cada um de x 1 a x3 é, independentemente, um aminoácido neutro, um aminoácido ácido, um aminoácido básico ou um aminoácido aromático).

2. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que cada um de x 1 a x3 é, independentemente, um aminoácido selecionado do grupo que consiste em asparagina (N), ácido aspártico (D), serina (S), tirosina (Y), arginina (R), fenilalanina (F), lisina (K), histidina (H), leucina (L), valina (V), treonina (T), alanina (A), glutamina (Q), ácido glutâmico (E) e glicina (G).

3. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que x1 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em asparagina (N), fenilalanina (F), ácido aspártico (D), lisina (K), histidina (H), valina (V), arginina (R) e treonina (T), x2 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em serina (S), glutamina (Q), alanina (A), asparagina (N), ácido glutâmico (E), ácido aspártico (D), fenilalanina (F) e glicina (G), e x3 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em tirosina (Y), histidina (H), glicina (G), arginina (R), asparagina (N), leucina (L), lisina (K) e fenilalanina (F).

4. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o epítopo consiste em 10 a 20 meros.

5. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos representada pela Fórmula 1 é localizado nas posições 3 a 6 do terminal N do epítopo.

6. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é representado por qualquer sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 4 a 17.

7. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, caracterizado pelo fato de que se liga especificamente a um epítopo da proteína Lrig-1 representado por qualquer sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 18 a 29.

8. Epítopo da proteína de domínios 1 (Lrig-1) rica em leucina e semelhante à imunoglobulina, caracterizado pelo fato de que compreende: um polipeptídeo que consiste em uma sequência de aminoácidos representada pela Fórmula 1, [Fórmula 1] Lx1Lx2x3N (na Fórmula 1, cada um de x 1 a x3 é, independentemente, um aminoácido neutro, um aminoácido ácido, um aminoácido básico ou um aminoácido aromático).

9. Epítopo da proteína de domínios 1 (Lrig-1) rica em leucina e semelhante à imunoglobulina, caracterizado pelo fato de que compreende: um polipeptídeo que consiste em qualquer sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 18 a 29.

10. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que codifica o epítopo conforme definido na reivindicação 9.

11. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que no qual a molécula de ácido nucleico conforme definida na reivindicação 10 é inserida.

12. Linhagem de células hospedeiras, transfectada com o vetor de expressão, conforme definido na reivindicação 11.

13. Composição farmacêutica para a prevenção ou o tratamento de câncer, caracterizada pelo fato de que compreende como ingrediente ativo: o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

14. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o câncer é câncer gástrico, câncer de fígado, glioblastoma, câncer de ovário, câncer colorretal, câncer de cabeça e pescoço, câncer de bexiga, câncer de células renais, câncer de mama, câncer metastático, câncer de próstata, câncer pancreático, melanoma ou câncer de pulmão.

15. Composição farmacêutica para prevenção ou tratamento do câncer, caracterizada pelo fato de que compreende como ingrediente ativo: o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno conforme definido na reivindicação 7.

16. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o câncer é câncer gástrico, câncer de fígado, glioblastoma, câncer de ovário, câncer colorretal, câncer de cabeça e pescoço, câncer de bexiga, câncer de células renais, câncer de mama, câncer metastático, câncer de próstata, câncer pancreático, melanoma ou câncer de pulmão.

17. Conjugado anticorpo-fármaco, caracterizado pelo fato de que compreende: o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6; e um fármaco.

18. Conjugado anticorpo-fármaco, caracterizado pelo fato de que compreende: o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno conforme definido na reivindicação 7; e um fármaco.

19. Método para prevenir ou tratar câncer, caracterizado pelo fato de que compreende: uma etapa de administração, a um indivíduo, do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

20. Método para prevenir ou tratar câncer, caracterizado pelo fato de que compreende: uma etapa de administração, a um indivíduo, do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno conforme definido na reivindicação 7.