JP2017526676A - がんの処置のための併用療法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、がんを処置するための併用療法を含む方法を提供する。がんおよび他の疾患の処置のために、Wnt経路インヒビターを有糸分裂インヒビターと併用して、時間差または逐次投薬様式で投与する。

Description

関連出願の相互参照
本願は、2014年8月27日に出願された米国仮出願第62/042,710号；2014年12月2日に出願された米国仮出願第62/086,376号；および2015年3月18日に出願された米国仮出願第62/134,661号の優先権の恩典を主張し、これにより、前記仮出願のそれぞれはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
発明の分野
本発明は、がんを処置するための併用療法を含む方法を提供する。特に、本発明は、がんおよび他の疾患の処置のための、Wnt経路インヒビターを有糸分裂インヒビターと組み合わせて含む方法を提供する。
発明の背景
がんは、先進諸国における主な死亡原因の一つであり、米国だけで毎年100万人を超える人々ががんと診断され、500,000人が死亡している。全体として、3人に1人より多くが、その生涯のうちに何らかの形態のがんを発生させると見積もられる。がんには200より多くの異なるタイプがあり、そのうちの4つ、すなわち乳がん、肺がん、結腸直腸がん、および前立腺がんが、全新規症例の半分を超えて占める（Siegel et al., 2012, CA: Cancer J. Clin., 62:10-29（非特許文献1））。
シグナル伝達経路は、通常、細胞外のシグナルを核へと接続することで、細胞の成長、分化、生存、および死を直接的または間接的に制御する遺伝子の発現につながる。多種多様ながんにおいて、シグナル伝達経路は調節異常を起こしており、腫瘍のイニシエーションおよび/または進行と関連づけることができる。ヒト腫瘍発生と関係があるとされているシグナル伝達経路には、Wnt経路、Ras-Raf-MEK-ERK経路すなわちMAPK経路、PI3K-AKT経路、CDKN2A/CDK4経路、Bcl-2/TP53経路、およびNotch経路が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
Wntシグナル伝達経路は、がん療法のための標的として特定されている。Wntシグナル伝達経路は、胚パターン形成、後胚期の組織維持、および幹細胞生物学のいくつかの決定的調節因子の一つである。より具体的には、Wntシグナル伝達は、細胞極性の生成および幹細胞集団による自己再生を含む細胞運命指定に、重要な役割を果たす。Wnt経路の無秩序な活性化は、数多くのヒトがんと関連し、そのようなヒトがんでは、その活性化が細胞の発生運命を変化させうると考えられている。Wnt経路の活性化は、腫瘍細胞を未分化状態に維持し、かつ/または無制御な増殖につながる可能性がある。こうして、正常な発生および組織修復を制御するホメオスタシス機構を凌駕することによって、発がんが進行しうる（Reya & Clevers, 2005, Nature, 434:843-50（非特許文献2）；Beachy et al., 2004, Nature, 432:324-31（非特許文献3）において概説されている）。
Wntシグナル伝達経路は、最初は、ショウジョウバエ（Drosophila）発生ミュータントwingless（wg）において、およびマウスがん原遺伝子int-1（現在はWnt1）から解明された（Nusse & Varmus, 1982, Cell, 31:99-109（非特許文献4）；Van Ooyen & Nusse, 1984, Cell, 39:233-40（非特許文献5）；Cabrera et al., 1987, Cell, 50:659-63（非特許文献6）；Rijsewijk et al., 1987, Cell, 50:649-57（非特許文献7））。Wnt遺伝子は、分泌性の脂質修飾糖タンパク質をコードし、そのうちの19種類が哺乳動物において同定されている。これらの分泌性リガンドは、Frizzled（FZD）受容体ファミリーメンバーと低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質5または6（LRP5/6）とからなる受容体複合体を活性化する。FZD受容体は、Gタンパク質共役受容体（GPCR）スーパーファミリーの7回膜貫通ドメインタンパク質であり、システインリッチドメイン（CRD）またはFriドメインとして公知である、10個の保存されたシステインを有する細胞外N末端リガンド結合ドメインを含有している。ヒトFZD受容体には、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、およびFZD10の10種類がある。異なるFZD CRDは、特異的なWntタンパク質に対して異なる結合親和性を有し（Wu & Nusse, 2002, J. Biol. Chem., 277:41762-9（非特許文献8））、FZD受容体は、古典的β-カテニン経路を活性化するものと非古典的経路を活性化するものとに分類されている（Miller et al., 1999, Oncogene, 18:7860-72（非特許文献9））。
がんにおけるWntシグナル伝達の役割は、マウスウイルスの近傍挿入によって形質転換された乳房腫瘍において、Wnt1（元々はint1）ががん遺伝子として同定されたことで、初めて明らかになった（Nusse & Varmus, 1982, Cell, 31:99-109（非特許文献4））。乳がんにおけるWntシグナル伝達の役割についてのさらなる証拠が、時間をかけて蓄積されてきている。例えば、マウスの乳腺におけるβ-カテニンのトランスジェニック過剰発現は、過形成および腺癌をもたらし（Imbert et al., 2001, J. Cell Biol., 153:555-68（非特許文献10）；Michaelson & Leder, 2001, Oncogene, 20:5093-9（非特許文献11））、一方、Wntシグナル伝達の喪失は、正常な乳腺発生を妨害する（Tepera et al., 2003, J. Cell Sci., 116:1137-49（非特許文献12）；Hatsell et al., 2003, J. Mammary Gland Biol. Neoplasia, 8:145-58（非特許文献13））。ヒト乳がんでは、β-カテニン蓄積が、50％を超える癌腫においてWntシグナル伝達の活性化を示し、特異的な変異は特定されていないものの、Frizzled受容体発現の上方制御が観察されている（Brennan & Brown, 2004, J. Mammary Gland Biol. Neoplasia, 9:119-31（非特許文献14）；Malovanovic et al., 2004, Int. J. Oncol., 25:1337-42（非特許文献15））。
Wnt経路の活性化は、結腸直腸がんとも関連する。全結腸直腸がんの約5〜10％が遺伝性であり、その主要形態の1つは家族性大腸腺腫症（FAP）である。これは、常染色体優性疾患であり、罹患個体の約80％は、大腸腺腫症（APC）遺伝子に生殖細胞系変異を含有している。変異はまた、アキシンおよびβ-カテニンを含む他のWnt経路構成要素においても同定されている。個々の腺腫は、第2の不活性化アレルを含有する上皮細胞のクローン増殖物であり、多数のFAP腺腫は、がん遺伝子および/または腫瘍抑制遺伝子の付加的変異により、不可避的に腺癌の発生をもたらす。さらにまた、APCにおける機能喪失型変異およびβ-カテニンにおける安定化型変異を含む、Wntシグナル伝達経路の活性化は、マウスモデルにおいて過形成発生および腫瘍成長を誘発することができる（Oshima et al., 1997, Cancer Res., 57:1644-9（非特許文献16）；Harada et al., 1999, EMBO J., 18:5931-42（非特許文献17））。
非小細胞肺がん（NSCLC）において、β-カテニンおよびAPCの変異はまれであるが、Wntシグナル伝達はNSCLC細胞株において重要であり、Wnt阻害は増殖を低減する。いくつかのWntタンパク質および他のWnt経路構成要素の過剰発現が、切除されたNSCLCにおいてよく見られ、不良な予後と関連している。Wntインヒビターの下方制御（例えば高メチル化による）が、NSCLC腫瘍細胞株および切除された試料においてよく見られ、不良な予後と関連している場合がある。このように、データにより、Wntシグナル伝達は、NSCLCの腫瘍形成、予後、および療法に対する抵抗性に影響を及ぼすことが示される（Tennis et al., 2007, J. of Thoracic Oncology, 2:889-892（非特許文献18）；Stewart, 2014, JNCI, 106:djt356（非特許文献19））。
がん処置のための改善された方法、特に、Wnt経路インヒビターを有糸分裂インヒビターと組み合わせて用いる、戦略的に時間の間隔をあけた（すなわち、時間差または逐次）投薬レジメンを提供することが、本発明の目的の1つである。
Siegel et al., 2012, CA: Cancer J. Clin., 62:10-29 Reya & Clevers, 2005, Nature, 434:843-50 Beachy et al., 2004, Nature, 432:324-31 Nusse & Varmus, 1982, Cell, 31:99-109 Van Ooyen & Nusse, 1984, Cell, 39:233-40 Cabrera et al., 1987, Cell, 50:659-63 Rijsewijk et al., 1987, Cell, 50:649-57 Wu & Nusse, 2002, J. Biol. Chem., 277:41762-9 Miller et al., 1999, Oncogene, 18:7860-72 Imbert et al., 2001, J. Cell Biol., 153:555-68 Michaelson & Leder, 2001, Oncogene, 20:5093-9 Tepera et al., 2003, J. Cell Sci., 116:1137-49 Hatsell et al., 2003, J. Mammary Gland Biol. Neoplasia, 8:145-58 Brennan & Brown, 2004, J. Mammary Gland Biol. Neoplasia, 9:119-31 Malovanovic et al., 2004, Int. J. Oncol., 25:1337-42 Oshima et al., 1997, Cancer Res., 57:1644-9 Harada et al., 1999, EMBO J., 18:5931-42 Tennis et al., 2007, J. of Thoracic Oncology, 2:889-892 Stewart, 2014, JNCI, 106:djt356
本発明は、疾患を処置する方法であって、Wnt経路インヒビターを有糸分裂インヒビターと併用して、それを必要とする対象に投与する工程を含む方法を提供する。少なくとも2種の治療剤での併用療法は、異なる作用機序によって働く、および／または異なる経路を標的とする作用物質を使用することが多く、相加効果または相乗効果をもたらしうる。併用療法では、各作用物質の用量を、単剤療法で使用される用量より低くすることが可能になり、それによって毒性の副作用が低減し、および/または作用物質の治療係数が増大しうる。併用療法では、作用物質に対する耐性が発生する可能性が減少しうる。併用療法では、1つの作用物質が、第2の作用物質により増強された活性に対して腫瘍細胞（がん幹細胞を含む）を敏感にすることが可能になる。加えて、各治療剤の投与の順序および／またはタイミングは、薬物併用の有効性全体に影響を及ぼしうる。
方法は、少なくとも1種のWntタンパク質に結合する抗体および他のポリペプチド、少なくとも1種のFZDタンパク質に結合する抗体および他のポリペプチド、ならびにWnt結合可溶性受容体を含むがそれらに限定されるわけではない、Wnt経路インヒビターを含む。方法はまた、小分子であるWnt経路インヒビターも含む。方法は、タキサン、ビンカアルカロイド、エポチロン、およびエリブリンメシラートを含むがそれらに限定されるわけではない、有糸分裂インヒビターを含む。Wnt経路インヒビターおよび／または有糸分裂インヒビターを含む組成物が、提供される。Wnt経路インヒビターまたは有糸分裂インヒビターを含む薬学的組成物が、提供される。
一局面において、本発明は、腫瘍成長を阻害する方法を提供する。いくつかの態様では、方法が、腫瘍細胞を、有効量の有糸分裂インヒビターと併用して有効量のWnt経路インヒビターと接触させる工程を含み、ここで、インヒビターは時間差投薬スケジュールで使用されて、Wnt経路インヒビターは最初に使用され、有糸分裂インヒビターは2番目に使用される。方法は、インビボまたはインビトロでありうる。一定の態様では、腫瘍が対象中にあり、腫瘍細胞をWnt経路インヒビターおよび有糸分裂インヒビターと接触させる工程が、治療有効量の各インヒビターを対象に投与することを含む。
一局面において、本発明は、腫瘍のサイズを低減する方法を提供する。いくつかの態様では、方法が、腫瘍細胞を、有効量の有糸分裂インヒビターと併用して有効量のWnt経路インヒビターと接触させる工程を含み、ここで、インヒビターは時間差投薬スケジュールで使用されて、Wnt経路インヒビターは最初に使用され、有糸分裂インヒビターは2番目に使用される。方法は、インビボまたはインビトロでありうる。一定の態様では、腫瘍が対象中にあり、腫瘍細胞をWnt経路インヒビターおよび有糸分裂インヒビターと接触させる工程が、治療有効量の各インヒビターを対象に投与することを含む。
一局面において、本発明は、腫瘍が退縮するように誘発する方法を提供する。いくつかの態様では、方法が、腫瘍細胞を、有効量の有糸分裂インヒビターと併用して有効量のWnt経路インヒビターと接触させる工程を含み、ここで、インヒビターは時間差投薬スケジュールで使用されて、Wnt経路インヒビターは最初に使用され、有糸分裂インヒビターは2番目に使用される。方法は、インビボまたはインビトロでありうる。一定の態様では、腫瘍が対象中にあり、腫瘍細胞をWnt経路インヒビターおよび有糸分裂インヒビターと接触させる工程が、治療有効量の各インヒビターを対象に投与することを含む。
別の局面において、本発明は、がんを処置する方法を提供する。いくつかの態様では、がんを処置する方法が、対象に、治療有効量の有糸分裂インヒビターと併用して治療有効量のWnt経路インヒビターを投与する工程を含む。いくつかの態様では、がんを処置する方法が、対象に、治療有効量のWnt経路インヒビターおよび治療有効量の有糸分裂インヒビターを投与する工程を含み、ここで、Wnt経路インヒビターは最初に投与され、有糸分裂インヒビターは2番目に投与される。いくつかの態様では、がんを処置する方法が、対象に、治療有効量のWnt経路インヒビターおよび治療有効量の有糸分裂インヒビターを投与する工程を含み、ここで、Wnt経路インヒビターおよび有糸分裂インヒビターは時間差投薬スケジュールを用いて投与され、Wnt経路インヒビターが最初に投与される。
いくつかの態様では、がんを処置する方法が、対象に、治療有効量のWnt経路インヒビターおよび治療有効量の有糸分裂インヒビターを投与する工程を含み、ここで、Wnt経路インヒビターおよび有糸分裂インヒビターは時間差投薬スケジュールを用いて投与され、Wnt経路インヒビターが最初に投与され；かつ、Wnt経路インヒビターは、少なくとも1種のヒトFrizzled（FZD）タンパク質に特異的に結合する抗体、またはヒトFZDタンパク質のFriドメインを含む可溶性受容体である。
別の局面において、本発明は、対象におけるがんの処置において有糸分裂インヒビターの有効性を増大させる方法であって、対象に有糸分裂インヒビターを、Wnt経路インヒビターが投与された約1、2、3、4、5、6、または7日後に投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの態様では、本発明が、対象におけるがんの処置において有糸分裂インヒビターの有効性を増大させる方法であって、（a）対象にWnt経路インヒビターを投与する工程；および（b）対象に有糸分裂インヒビターを、Wnt経路インヒビターが投与された約1、2、3、4、5、6、または7日後に投与する工程を含む方法を提供する。
別の局面において、本発明は、Wnt経路活性化と関連する疾患を処置する方法であって、治療有効量のWnt経路インヒビターおよび治療有効量の有糸分裂インヒビターを対象に投与する工程を含み、ここで、Wnt経路インヒビターおよび有糸分裂インヒビターが時間差投薬様式で投与され、Wnt経路インヒビターが最初に投与される方法を提供する。
本明細書に記載する方法のいくつかの態様では、有糸分裂インヒビターが、Wnt経路インヒビターの投与の少なくとも1日後に投与される。本明細書に記載する方法のいくつかの態様では、有糸分裂インヒビターが、Wnt経路インヒビターの投与の少なくとも2日後に投与される。本明細書に記載する方法のいくつかの態様では、有糸分裂インヒビターが、Wnt経路インヒビターの投与の少なくとも3日後に投与される。
前述した各局面のいくつかの態様、ならびに本明細書の他の項で記載する他の局面および態様では、Wnt経路インヒビターおよび有糸分裂インヒビターが、相乗的に作用する。本明細書に記載する方法のいくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、がん細胞を有糸分裂インヒビターに対して敏感にする。本明細書に記載する方法のいくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、がん幹細胞を含むがん細胞を、有糸分裂インヒビターに対して敏感にする。本明細書に記載する方法のいくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、細胞周期進行をG2/Mチェックポイントで抑制または停止して、有糸分裂インヒビターの有効性を増大させる。本明細書に記載する方法のいくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、細胞周期進行をM期で抑制または停止して、有糸分裂インヒビターの有効性を増大させる。
本明細書に記載する方法のいくつかの態様では、有糸分裂インヒビターと併用したWnt経路インヒビターの時間差投薬スケジュールが、腫瘍細胞のアポトーシスを増大させる。本明細書に記載する方法のいくつかの態様では、有糸分裂インヒビターと併用したWnt経路インヒビターの時間差投薬スケジュールが、腫瘍部位でのWnt経路インヒビターの蓄積を可能にする。本明細書に記載する方法のいくつかの態様では、有糸分裂インヒビターと併用したWnt経路インヒビターの時間差投薬スケジュールが、Wnt経路インヒビターおよび有糸分裂インヒビターの抗腫瘍活性の同調を可能にする。
本明細書に記載する方法のいくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、約3週間に1回投与される。本明細書に記載する方法のいくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、約4週間に1回投与される。本明細書に記載する方法のいくつかの態様では、有糸分裂インヒビターが、約1週間に1回、約2週間に1回、約3週間に1回、約4週間に1回、または4週間（すなわち28日）サイクルのうち3週間にわたって約1週間に1回投与される。本明細書に記載する方法のいくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、2、3、4、5、6、7、8サイクル、またはそれ以上のサイクルにわたって投与される。本明細書に記載する方法のいくつかの態様では、有糸分裂インヒビターが、2、3、4、5、6、7、8サイクル、またはそれ以上のサイクルにわたって投与される。
本明細書に記載する方法のいくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、対象に、約2mg/kg〜約10mg/kgの投薬量で投与される。本明細書に記載する方法のいくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、約2mg/kg〜約5mg/kgの投薬量で投与される。本明細書に記載する方法のいくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、約3mg/kg〜約7.5mg/kgの投薬量で投与される。本明細書に記載する方法のいくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、約2mg/kg〜約5mg/kgの投薬量で3週間ごとに投与される。本明細書に記載する方法のいくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、約3mg/kg〜約7.5mg/kgの投薬量で4週間ごとに投与される。
本明細書に記載する方法のいくつかの態様では、有糸分裂インヒビターが、対象に、約25mg/m2〜約200mg/m2の投薬量で投与される。本明細書に記載する方法のいくつかの態様では、有糸分裂インヒビターが、約50mg/m2〜約150mg/m2の投薬量で投与される。本明細書に記載する方法のいくつかの態様では、有糸分裂インヒビターが、約50mg/m2〜約150mg/m2の投薬量で1週間に1回投与される。
いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、少なくとも1種のヒトFZDタンパク質に特異的に結合する抗体である。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、およびFZD10からなる群より選択される少なくとも1種のヒトFZDタンパク質に特異的に結合する抗体である。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8からなる群より選択される少なくとも1種のヒトFZDタンパク質に特異的に結合する抗体である。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、少なくとも1種のヒトFZDタンパク質に特異的に結合する抗体であり、該抗体は、
Figure 2017526676
を含む重鎖CDR1、
Figure 2017526676
を含む重鎖CDR2、および
Figure 2017526676
を含む重鎖CDR3、ならびに／または
Figure 2017526676
を含む軽鎖CDR1、DKSNRPSG（SEQ ID NO:11）を含む軽鎖CDR2、およびQSYANTLSL（SEQ ID NO:12）を含む軽鎖CDR3を含む。
前述した各局面の一定の態様、ならびに本明細書の他の項で記載する他の局面および態様では、Wnt経路インヒビターが、少なくとも1種のヒトFZDタンパク質に特異的に結合する抗体であり、該抗体は、（a）SEQ ID NO:5に対して少なくとも約90％、少なくとも約95％、もしくは100％の配列同一性を有する重鎖可変領域；および／または（b）SEQ ID NO:6に対して少なくとも約90％、少なくとも約95％、もしくは100％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、抗体OMP-18R5（バンチクツマブとしても知られている）である。
前述した各局面の一定の態様、ならびに本明細書の他の項で記載する他の局面および態様では、Wnt経路インヒビターが、少なくとも1種のヒトWntタンパク質に特異的に結合する抗体である。
前述した各局面の一定の態様、ならびに本明細書の他の項で記載する他の局面および態様では、Wnt経路インヒビターが組換え抗体である。いくつかの態様では、抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である。いくつかの態様では、抗体が、抗原結合部位を含む抗体フラグメントである。一定の態様では、抗体または抗体フラグメントが、一価、単一特異性、二価、二重特異性、または多重特異性である。いくつかの態様では、抗体が、IgG1抗体、IgG2抗体、またはIgG4抗体である。一定の態様では、抗体が単離されている。他の態様では、抗体が実質的に純粋である。
前述した各局面の一定の態様、ならびに本明細書の他の項で記載する他の局面および態様では、Wnt経路インヒビターが可溶性受容体である。いくつかの態様では、可溶性受容体がヒトFZDタンパク質のFriドメインを含む。いくつかの態様では、Friドメインが、FZD1のFriドメイン、FZD2のFriドメイン、FZD3のFriドメイン、FZD4のFriドメイン、FZD5のFriドメイン、FZD6のFriドメイン、FZD7のFriドメイン、FZD8のFriドメイン、FZD9のFriドメイン、またはFZD10のFriドメインを含む。いくつかの態様では、FriドメインがFZD8のFriドメインを含む。いくつかの態様では、ヒトFZDタンパク質のFriドメインが、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、およびSEQ ID NO:23からなる群より選択される配列を含む。いくつかの態様では、FriドメインがSEQ ID NO:20またはSEQ ID NO:21を含む。
本明細書に記載する方法のいくつかの態様では、可溶性受容体が非FZDポリペプチドを含む。いくつかの態様では、非FZDポリペプチドが、ヒトFZDタンパク質のFriドメインに直接連結されている。いくつかの態様では、非FZDポリペプチドが、リンカーによってヒトFZDタンパク質のFriドメインに接続されている。いくつかの態様では、非FZDポリペプチドがヒトFc領域を含む。いくつかの態様では、非FZDポリペプチドが、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、またはSEQ ID NO:28を含む。いくつかの態様では、非FZDポリペプチドがSEQ ID NO:27を含む。
本明細書に記載する方法のいくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、（a）SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、またはSEQ ID NO:23を含む第1ポリペプチド；および（b）SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、またはSEQ ID NO:28を含む第2ポリペプチドを含み、第1ポリペプチドは第2ポリペプチドに直接連結されている。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、（a）SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、またはSEQ ID NO:23を含む第1ポリペプチド；および（b）SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、またはSEQ ID NO:28を含む第2ポリペプチドを含み、第1ポリペプチドはリンカーによって第2ポリペプチドに接続されている。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、（a）SEQ ID NO:20またはSEQ ID NO:21を含む第1ポリペプチド；および（b）SEQ ID NO:27を含む第2ポリペプチドを含み、第1ポリペプチドは第2ポリペプチドに直接連結されている。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、（a）SEQ ID NO:20またはSEQ ID NO:21を含む第1ポリペプチド；および（b）SEQ ID NO:27を含む第2ポリペプチドを含み、第1ポリペプチドはリンカーによって第2ポリペプチドに接続されている。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターがSEQ ID NO:29またはSEQ ID NO:30を含む。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、FZD8-Fc可溶性受容体OMP-54F28（イパフリセプト（ipafricept）としても知られている）である。
前述した各局面の一定の態様、ならびに本明細書の他の項で記載する他の局面および態様では、有糸分裂インヒビターが、タキサン、ビンカアルカロイド、エポチロン、またはエリブリンメシラートからなる群より選択される。いくつかの態様では、有糸分裂インヒビターがタキサンである。いくつかの態様では、タキサンが、パクリタキセル（TAXOL）、nab-パクリタキセル（ABRAXANE）、またはドセタキセル（TAXOTERE）からなる群より選択される。いくつかの態様では、有糸分裂インヒビターがビンカアルカロイドである。いくつかの態様では、ビンカアルカロイドが、ビンブラスチン（VELBAN）、ビンクリスチン（MARQIBO）、またはビノレルビン（NAVELBINE）からなる群より選択される。いくつかの態様では、有糸分裂インヒビターがエポチロンである。いくつかの態様では、エポチロンがイキサベピロン（IXEMPRA）である。いくつかの態様では、有糸分裂インヒビターがエリブリンメシラート（HALAVEN）である。
前述した各局面の一定の態様、ならびに本明細書の他の項で記載する他の局面および態様では、がんが、結腸直腸がん、膵臓がん、肺がん、卵巣がん、肝臓がん、乳がん、腎臓がん、前立腺がん、胃腸がん、メラノーマ、子宮頸がん、膀胱がん、神経膠芽腫、および頭頸部がんからなる群より選択されるがんである。一定の態様では、がんが乳がんである。いくつかの態様では、がんが卵巣がんである。一定の態様では、がんが肺がんである。一定の態様では、がんが膵臓がんである。
いくつかの態様では、がんを処置する方法が、対象に、治療有効量のバンチクツマブ（OMP-18R5）および治療有効量の、パクリタキセル、nab-パクリタキセル、およびドセタキセルからなる群より選択されるタキサンを投与する工程を含み、ここで、タキサンは、バンチクツマブが投与された約1、2、3、4、5、6、または7日後に投与される。いくつかの態様では、タキサンが、バンチクツマブが投与された約2日後に投与される。いくつかの態様では、バンチクツマブが約3週間に1回投与される。いくつかの態様では、バンチクツマブが約4週間に1回投与される。いくつかの態様では、タキサンが1週間に1回投与される。いくつかの態様では、タキサンが、4週間サイクルのうち3週間にわたって1週間に1回投与される。
いくつかの態様では、がんを処置する方法が、対象に、治療有効量のイパフリセプト（OMP-54F28）および治療有効量の、パクリタキセル、nab-パクリタキセル、およびドセタキセルからなる群より選択されるタキサンを投与する工程を含み、ここで、タキサンは、イパフリセプトが投与された約1、2、3、4、5、6、または7日後に投与される。いくつかの態様では、タキサンが、イパフリセプトが投与された約2日後に投与される。いくつかの態様では、イパフリセプトが約3週間に1回投与される。いくつかの態様では、イパフリセプトが約4週間に1回投与される。いくつかの態様では、タキサンが1週間に1回投与される。いくつかの態様では、タキサンが、4週間サイクルのうち3週間にわたって1週間に1回投与される。
いくつかの態様では、本発明が、対象において腫瘍の成長を阻害する方法であって、対象に、治療有効量の抗FZD抗体を有糸分裂インヒビターと併用して、時間差投薬スケジュールを用いて投与する工程を含む方法を提供する。
いくつかの態様では、本発明が、対象において腫瘍の成長を阻害する方法であって、対象に、治療有効量のバンチクツマブを有糸分裂インヒビターと併用して、時間差投薬スケジュールを用いて投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの態様では、対象において腫瘍の成長を阻害する方法が、対象に、治療有効量のバンチクツマブをタキサンと併用して投与する工程を含む。いくつかの態様では、対象において腫瘍の成長を阻害する方法が、対象に、治療有効量のバンチクツマブをパクリタキセルと併用して投与する工程を含む。いくつかの態様では、対象において腫瘍の成長を阻害する方法が、対象に、治療有効量のバンチクツマブをnab-パクリタキセルと併用して投与する工程を含む。いくつかの態様では、対象において腫瘍の成長を阻害する方法が、対象に、治療有効量のバンチクツマブをドセタキセルと併用して投与する工程を含む。
いくつかの態様では、本発明が、対象において腫瘍の成長を阻害する方法であって、対象に、治療有効量のFZD可溶性受容体を有糸分裂インヒビターと併用して、時間差投薬スケジュールを用いて投与する工程を含む方法を提供する。
いくつかの態様では、本発明が、対象において腫瘍の成長を阻害する方法であって、対象に、治療有効量のイパフリセプトを有糸分裂インヒビターと併用して、時間差投薬スケジュールを用いて投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの態様では、対象において腫瘍の成長を阻害する方法が、対象に、治療有効量のイパフリセプトをタキサンと併用して投与する工程を含む。いくつかの態様では、対象において腫瘍の成長を阻害する方法が、対象に、治療有効量のイパフリセプトをパクリタキセルと併用して投与する工程を含む。いくつかの態様では、対象において腫瘍の成長を阻害する方法が、対象に、治療有効量のイパフリセプトをnab-パクリタキセルと併用して投与する工程を含む。いくつかの態様では、対象において腫瘍の成長を阻害する方法が、対象に、治療有効量のイパフリセプトをドセタキセルと併用して投与する工程を含む。
前述した各局面の一定の態様、ならびに本明細書の他の項で記載する他の局面および態様では、方法が、少なくとも1種の追加の治療剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの態様では、追加の治療剤が化学療法剤である。いくつかの態様では、追加の治療剤が抗体である。
本明細書に記載する有糸分裂インヒビターおよび薬学的に許容されるビヒクルを含む薬学的組成物と組み合わせて使用される、本明細書に記載するWnt経路インヒビターおよび薬学的に許容されるビヒクルを含む薬学的組成物もまた、提供される。
本発明の局面または態様が、マーカッシュ群または他の選択肢の群の形で記載されている場合、本発明は、列挙された群全体をまとめて包含するだけではなく、その群の各メンバーも個別に包含し、主群の考えうる部分群も全て包含し、群のメンバーの1つまたは複数を欠く主群も包含する。本発明はまた、請求項に係る発明における群メンバーのいずれかの1つまたは複数の明示的な排除も、想定している。
化学療法剤と併用したWnt経路インヒビターによるインビボでの卵巣腫瘍成長の阻害。OMP-OV19卵巣腫瘍細胞を、NOD/SCIDマウスに皮下注射した。マウスを、対照抗体（-●-）、パクリタキセル（-■-）、またはFZD8-Fc可溶性受容体OMP-54F28およびパクリタキセルの併用（-▲-）で処置した。45mg/kgのOMP-54F28、10mg/kgのパクリタキセル、7.5mg/kgのnab-パクリタキセル、30mg/kgのカルボプラチン、および5mg/kgのパクリタキセルと併用した15mg/kgのカルボプラチンを投与した。すべての作用物質を3週間ごとに投与し、腹腔内投与した。データを処置後の日数に対する腫瘍体積（mm3）として示す。「処置後の日数」とは、最初の処置後の日の数を指す。 化学療法剤と併用したWnt経路インヒビターによるインビボでの卵巣腫瘍成長の阻害。OMP-OV19卵巣腫瘍細胞を、NOD/SCIDマウスに皮下注射した。マウスを、対照抗体（-●-）、nab-パクリタキセル（-■-）、またはOMP-54F28およびnab-パクリタキセルの併用（-▲-）で処置した。45mg/kgのOMP-54F28、10mg/kgのパクリタキセル、7.5mg/kgのnab-パクリタキセル、30mg/kgのカルボプラチン、および5mg/kgのパクリタキセルと併用した15mg/kgのカルボプラチンを投与した。すべての作用物質を3週間ごとに投与し、腹腔内投与した。データを処置後の日数に対する腫瘍体積（mm3）として示す。「処置後の日数」とは、最初の処置後の日の数を指す。 化学療法剤と併用したWnt経路インヒビターによるインビボでの卵巣腫瘍成長の阻害。OMP-OV19卵巣腫瘍細胞を、NOD/SCIDマウスに皮下注射した。マウスを、対照抗体（-●-）、カルボプラチン（-■-）、またはOMP-54F28およびカルボプラチンの併用（-▲-）で処置した。45mg/kgのOMP-54F28、10mg/kgのパクリタキセル、7.5mg/kgのnab-パクリタキセル、30mg/kgのカルボプラチン、および5mg/kgのパクリタキセルと併用した15mg/kgのカルボプラチンを投与した。すべての作用物質を3週間ごとに投与し、腹腔内投与した。データを処置後の日数に対する腫瘍体積（mm3）として示す。「処置後の日数」とは、最初の処置後の日の数を指す。 化学療法剤と併用したWnt経路インヒビターによるインビボでの卵巣腫瘍成長の阻害。OMP-OV19卵巣腫瘍細胞を、NOD/SCIDマウスに皮下注射した。マウスを、対照抗体（-●-）、カルボプラチンおよびパクリタキセル（-■-）、またはOMP-54F28、カルボプラチン、およびパクリタキセルの併用（-▲-）で処置した。45mg/kgのOMP-54F28、10mg/kgのパクリタキセル、7.5mg/kgのnab-パクリタキセル、30mg/kgのカルボプラチン、および5mg/kgのパクリタキセルと併用した15mg/kgのカルボプラチンを投与した。すべての作用物質を3週間ごとに投与し、腹腔内投与した。データを処置後の日数に対する腫瘍体積（mm3）として示す。「処置後の日数」とは、最初の処置後の日の数を指す。 時間差投薬スケジュールを用いた、タキサンと併用したWnt経路インヒビターによるインビボでの乳房腫瘍成長の阻害。UM-PE13乳房腫瘍細胞を、NOD/SCIDマウスに皮下注射した。マウスを、対照抗体（-●-）、パクリタキセル（-■-）、同じ日に投与したパクリタキセルおよび抗FZD抗体OMP-18R5（-▲-）、パクリタキセルをOMP-18R5の3日前に投与したパクリタキセルおよびOMP-18R5（-○-）、または、OMP-18R5をパクリタキセルの3日前に投与したパクリタキセルおよびOMP-18R5（-□-）で処置した。OMP-18R5は25mg/kgで、パクリタキセルは20mg/kgで投与した。作用物質を3週間ごとに投与し、腹腔内投与した。データを処置後の日数に対する腫瘍体積（mm3）として示す。 時間差投薬スケジュールを用いた、タキサンと併用したWnt経路インヒビターによるインビボでの卵巣腫瘍成長の阻害。OMP-OV38卵巣腫瘍細胞を、NOD/SCIDマウスに皮下注射した。マウスを、対照抗体（-●-）、パクリタキセル（-■-）、同じ日に投与したパクリタキセルおよびFZD8-Fc可溶性受容体OMP-54F28（-▲-）、パクリタキセルをOMP-54F28の2日前に投与したパクリタキセルおよびOMP-54F28（-○-）、または、OMP-54F28をパクリタキセルの2日前に投与したパクリタキセルおよびOMP-54F28（-□-）で処置した。OMP-54F28は25mg/kgで、パクリタキセルは20mg/kgで投与した。作用物質を3週間ごとに投与し、腹腔内投与した。データを処置後の日数に対する腫瘍体積（mm3）として示す。 時間差投薬スケジュールを用いた、タキサンと併用したWnt経路インヒビターによるインビボでの卵巣腫瘍成長の阻害。OMP-OV22卵巣腫瘍細胞を、NOD/SCIDマウスに皮下注射した。マウスを、対照抗体（-●-）、パクリタキセル（-■-）、同じ日に投与したパクリタキセルおよびOMP-54F28（-▲-）、パクリタキセルをOMP-54F28の2日前に投与したパクリタキセルおよびOMP-54F28（-○-）、または、OMP-54F28をパクリタキセルの2日前に投与したパクリタキセルおよびOMP-54F28（-□-）で処置した。OMP-54F28は25mg/kgで、パクリタキセルは20mg/kgで投与した。作用物質を3週間ごとに投与し、腹腔内投与した。データを処置後の日数に対する腫瘍体積（mm3）として示す。 時間差投薬スケジュールを用いた、タキサンと併用したWnt経路インヒビターによるインビボでの卵巣腫瘍成長の阻害。OMP-OV38卵巣腫瘍細胞を、NOD/SCIDマウスに皮下注射した。マウスを、対照抗体（-●-）、パクリタキセル（-■-）、パクリタキセルの1日前に投与したOMP-54F28（-○-）、パクリタキセルの2日前に投与したOMP-54F28（-▲-）、または、パクリタキセルの4日前に投与したOMP-54F28（-□-）で処置した。OMP-54F28は20mg/kgで、パクリタキセルは20mg/kgで投与した。作用物質を2週間ごとに投与し、腹腔内投与した。データを処置後の日数に対する腫瘍体積（mm3）として示す。 時間差投薬スケジュールを用いた、タキサンと併用したWnt経路インヒビターによるインビボでの肺腫瘍成長の阻害。OMP-LU77肺腫瘍細胞を、NOD/SCIDマウスに皮下注射した。マウスを、対照抗体（-●-）、パクリタキセル（-■-）、同じ日に投与したバンチクツマブ（OMP-18R5）およびパクリタキセル（-▲-）、または、バンチクツマブをパクリタキセルの2日前に投与したバンチクツマブおよびパクリタキセル（-□-）で処置した。バンチクツマブは25mg/kgで、パクリタキセルは15mg/kgで投与した。作用物質を1週間おきに投与し、腹腔内投与した。データを処置後の日数に対する腫瘍体積（mm3）として示す。 がん幹細胞の頻度。対照抗体（対照mAb）、パクリタキセル（Pac）、またはOMP-18R5およびパクリタキセルの併用（Van＋Pac）のいずれかで処置していたマウスから取得した50、150、または500個のOMP-LU77腫瘍細胞の移植後の、マウスにおける腫瘍成長。 がん幹細胞の頻度。限界希釈解析により決定した、対照抗体（対照mAb）、パクリタキセル、またはOMP-18R5抗体およびパクリタキセルの併用（Van＋Pac）での処置後のOMP-LU77肺腫瘍におけるがん幹細胞（CSC）の頻度。 時間差投薬スケジュールを用いた、タキサンと併用したWnt経路インヒビターによるインビボでの卵巣腫瘍成長の阻害。OMP-OV38卵巣腫瘍細胞を、NOD/SCIDマウスに皮下注射した。マウスを、対照抗体（-▲-）、パクリタキセル（-■-）、OMP-54F28をパクリタキセルと同じ日に投与したOMP-54F28およびパクリタキセルの併用（-◆-）、または、OMP-54F28をパクリタキセルの投与の2日前に投与したOMP-54F28およびパクリタキセルの併用（-●-）で処置した。OMP-54F28およびパクリタキセルは、20mg/kgで投与した。作用物質を2週間ごとに投与し、腹腔内投与した。データを処置後の日数に対する腫瘍体積（mm3）として示す。 時間差投薬スケジュールを用いた、タキサンと併用したWnt経路インヒビターによるインビボでの乳房腫瘍成長の阻害。図7AO：MP-B90乳房腫瘍細胞を、NOD/SCIDマウスに皮下注射した。マウスを、対照抗体（-●-）、パクリタキセル（-▲-）、OMP-18R5をパクリタキセルと同じ日に投与したOMP-18R5およびパクリタキセルの併用（-□-）、または、OMP-18R5をパクリタキセルの投与の2日前に投与したOMP-18R5およびパクリタキセルの併用（-◇-）で処置した。図7B：OMP-B90乳房腫瘍細胞を、NOD/SCIDマウスに皮下注射した。マウスを、対照抗体（-●-）、OMP-54F28（-■-）、パクリタキセル（-▲-）、OMP-54F28をパクリタキセルと同じ日に投与したOMP-54F28およびパクリタキセルの併用（-□-）、または、OMP-54F28をパクリタキセルの投与の2日前に投与したOMP-54F28およびパクリタキセルの併用（-◇-）で処置した。OMP-18R5、OMP-54F28、および対照抗体は25mg/kgで投与し、パクリタキセルは10mg/kgで投与した。OMP-18R5、OMP-54F28、および対照抗体は2週間に1回投与し、パクリタキセルは1週間に1回投与し、すべての作用物質を腹腔内投与した。データを処置後の日数に対する腫瘍体積（mm3）として示す。 時間差投薬スケジュールを用いた、タキサンと併用したWnt経路インヒビターによるインビボでの結腸腫瘍成長の阻害。図8A：OMP-C28結腸腫瘍細胞を、NOD/SCIDマウスに皮下注射した。マウスを、対照抗体（-●-）、OMP-18R5（-▲-）、nab-パクリタキセル（-■-）、または、OMP-18R5をnab-パクリタキセルの投与の2日前に投与したOMP-18R5およびnab-パクリタキセルの併用（-◇-）で処置した。図18B：OMP-C28結腸腫瘍細胞を、NOD/SCIDマウスに皮下注射した。マウスを、対照抗体（-●-）、OMP-54F28（-▲-）、nab-パクリタキセル（-■-）、または、OMP-54F28をnab-パクリタキセルの投与の2日前に投与したOMP-54F28およびnab-パクリタキセルの併用（-◇-）で処置した。OMP-18R5、OMP-54F28、および対照は25mg/kgで投与し、nab-パクリタキセルは15mg/kgで投与した。OMP-18R5、OMP-54F28、および対照は2週間に1回投与し、パクリタキセルは1週間に1回投与し、すべての作用物質を腹腔内投与した。データを処置後の日数に対する腫瘍体積（mm3）として示す。 時間差投薬スケジュールを用いた、タキサンと併用したWnt経路インヒビターによるインビボでの卵巣腫瘍成長の阻害。図9A：OMP-OV40卵巣腫瘍細胞を、NOD/SCIDマウスに皮下注射した。マウスを、対照抗体（-●-）、OMP-18R5（-▲-）、パクリタキセル（-■-）、または、OMP-18R5をパクリタキセルの投与の2日前に投与したOMP-18R5およびパクリタキセルの併用（-◇-）で処置した。図9B：OMP-OV40卵巣腫瘍細胞を、NOD/SCIDマウスに皮下注射した。マウスを、対照抗体（-●-）、OMP-54F28（-▲-）、パクリタキセル（-■-）、または、OMP-54F28をパクリタキセルの投与の2日前に投与したOMP-54F28およびパクリタキセルの併用（-◇-）で処置した。OMP-18R5、OMP-54F28、および対照抗体は25mg/kgで投与し、パクリタキセルは20mg/kgで投与した。作用物質を2週間に1回投与し、腹腔内投与した。データを処置後の日数に対する腫瘍体積（mm3）として示す。
発明の詳細な説明
本発明は、腫瘍成長を阻害する方法、腫瘍サイズを低減する方法、およびがんを処置する方法を提供する。本明細書において提供する方法は、対象に、治療有効量の有糸分裂インヒビターと併用して治療有効量のWnt経路インヒビターを、時間差投薬スケジュールを用いて投与する工程を含む。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが抗体である。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、少なくとも1種のWntタンパク質に特異的に結合する抗体である。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、少なくとも1種のFZDタンパク質に特異的に結合する抗体である。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが可溶性受容体である。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、FZDタンパク質のFriドメインを含む可溶性受容体である。いくつかの態様では、有糸分裂インヒビターが、タキサン、ビンカアルカロイド、エポチロン、またはエリブリンメシラートである。
Wnt経路インヒビターである抗FZD抗体OMP-18R5での処置は、他のクラスの化学療法剤よりもタキサンと併用して、より大きな活性（すなわち、腫瘍成長の阻害）を有していた（実施例1；図1）。驚くべきことに、タキサンの投与の前の、抗FZD抗体OMP-18R5（バンチクツマブとしても知られている）またはFZD8-Fc可溶性受容体OMP-54F28（イパフリセプトとしても知られている）のいずれかのWnt経路インヒビターの投与（時間差または逐次様式の投薬）は、異種移植モデルにおける腫瘍成長の阻害が他の投薬レジメンよりも良好であった（実施例2、3、および6；図2、3、および4）。時間差投薬レジメンでのWnt経路インヒビターおよびタキサンの投与は、さまざまな腫瘍タイプにおいて腫瘍成長を阻害した（実施例2、3、および6〜10；図2〜4および6〜9）。加えて、いくつかの研究において、時間差投薬レジメンでのWnt経路インヒビターおよびタキサンの投与が、実際に、確立された腫瘍のサイズの低減をもたらした（実施例3、6、8、および9；図3、4、6、および7）。
I．定義
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語および表現を以下に定義する。
本明細書において使用する「アンタゴニスト」および「アンタゴニスト性」という用語は、標的および/またはシグナル伝達経路（例えばWnt経路）の生物学的活性を部分的または完全に遮断し、阻害し、低減し、または中和する任意の分子を指す。「アンタゴニスト」という用語は、本明細書においては、タンパク質（例えばFZDタンパク質またはWntタンパク質）の活性を部分的または完全に遮断し、阻害し、低減し、または中和する任意の分子を含むように使用される。適切なアンタゴニスト分子には、具体的には、アンタゴニスト抗体、抗体フラグメント、可溶性受容体、または小分子が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
本明細書において使用する「抗体」という用語は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖質、ポリヌクレオチド、脂質、または前述の組み合わせなどの標的を、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも1つの抗原結合部位によって認識し、それらに特異的に結合する、免疫グロブリン分子を指す。本明細書において使用する場合、この用語は、インタクトなポリクローナル抗体、インタクトなモノクローナル抗体、抗原結合部位を含む抗体フラグメント（例えばFab、Fab'、F(ab')2、およびFvフラグメント）、一本鎖Fv（scFv）抗体、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体、単一特異性抗体、一価抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原結合部位を含む融合タンパク質、およびその抗体が所望の生物学的活性を呈する限り、抗原結合部位を含む任意の他の修飾免疫グロブリン分子を包含する。抗体は、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる重鎖定常ドメインの独自性に基づく5種の主要な免疫グロブリンクラス：IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgM、またはそのサブクラス（アイソタイプ）（例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2）のいずれかであることができる。異なるクラスの免疫グロブリンは、異なる周知のサブユニット構造および三次元配置を有する。抗体は、そのままでもよいし、限定されるわけではないが、毒素および放射性同位体を含む他の分子にコンジュゲートされてもよい。
本明細書において使用する「抗体フラグメント」という用語は、インタクトな抗体の一部分を指し、一般に、インタクトな抗体の抗原決定可変領域または抗原結合部位を含む。抗体フラグメントの例には、Fab、Fab'、F(ab')2、およびFvフラグメント、線状抗体（linear antibody）、一本鎖抗体、および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が含まれるが、それらに限定されるわけではない。本明細書において使用する「抗体フラグメント」は、少なくとも1つの抗原結合部位またはエピトープ結合部位を含む。
本明細書において使用する抗体の「可変領域」という用語は、単独または組み合わせのいずれかの、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を指す。重鎖または軽鎖の可変領域は一般に、「超可変領域」としても知られる3つの相補性決定領域（CDR）によって接続された4つのフレームワーク領域からなる。各鎖中のCDRは、フレームワーク領域によって近接した状態にまとめられており、他方の鎖からのCDRと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。CDRを決定するための技法は少なくとも2つある：（1）異種間の配列可変性に基づくアプローチ（すなわちKabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, National Institutes of Health, Bethesda MD）および（2）抗原-抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ（Al-Lazikani et al., 1997, J. Mol. Biol., 273:927-948）。加えて、当技術分野では、これら2つのアプローチの組み合わせを用いて、CDRを決定することもある。
本明細書において使用する「モノクローナル抗体」という用語は、単一の抗原決定基またはエピトープの著しく特異的な認識および結合に関わる均一な抗体集団を指す。これは、典型的には異なる抗原決定基に対する異なる抗体の混合物を含むポリクローナル抗体とは対照的である。「モノクローナル抗体」という用語は、インタクトな抗体と完全長抗体の両方、ならびに抗体フラグメント（例えばFab、Fab'、F(ab')2、Fv）、一本鎖（scFv）抗体、抗体の一部分を含む融合タンパク質、および少なくとも1つの抗原結合部位を含む任意の他の修飾免疫グロブリン分子を包含する。さらにまた、「モノクローナル抗体」は、限定されるわけではないが、ハイブリドーマ生産、ファージ選択、組換え発現、およびトランスジェニック動物を含む、いくつもある技法によって作られた、そのような抗体を指す。
本明細書において使用する「ヒト化抗体」という用語は、最小限の非ヒト配列を含有する特異的免疫グロブリン鎖、キメラ免疫グロブリン、またはそのフラグメントである抗体を指す。典型的には、ヒト化抗体は、CDRのアミノ酸残基が、所望の特異性、親和性、および/または結合能を有する非ヒト種（例えばマウス、ラット、ウサギ、またはハムスター）のCDRからのアミノ酸残基により置き換えられているヒト免疫グロブリンである。
本明細書において使用する「ヒト抗体」という用語は、ヒトによって産生される抗体、または、当技術分野において公知の技法のいずれかを用いて作られる、ヒトによって産生される抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体を指す。
本明細書において使用する「キメラ抗体」という用語は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が2つ以上の種に由来する抗体を指す。典型的には、軽鎖と重鎖の両方の可変領域が、所望の特異性、親和性、および/または結合能を有する1つの哺乳動物種（例えばマウス、ラット、ウサギなど）に由来する抗体の可変領域に対応し、一方、定常領域は、別の種（通常はヒト）に由来する抗体中の配列に相同である。
本明細書において使用する「親和性成熟抗体」という用語は、1つまたは複数のCDR中に、改変を持たない親抗体と比較して抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす1つまたは複数の改変を有する抗体を指す。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対してナノモルの親和性、さらにはピコモルの親和性を有することになる。親和性成熟抗体は、重鎖および軽鎖可変領域シャッフリング、CDRおよび/もしくはフレームワーク残基のランダム変異導入法、またはCDRおよび／もしくはフレームワーク残基の部位指定変異導入法を含む、当技術分野において公知の手法によって産生される。
「エピトープ」および「抗原決定基」という用語は、本明細書では互換的に使用され、特定の抗体により認識されて特異的に結合される能力を有する抗原の一部分を指す。抗原がポリペプチドである場合、エピトープは、連続するアミノ酸からも、タンパク質の三次フォールディングによって並置される不連続なアミノ酸からも形成されうる。連続するアミノ酸から形成されるエピトープ（線状エピトープとも呼ばれる）は、典型的には、タンパク質変性時に保たれるのに対し、三次フォールディングによって形成されるエピトープ（コンフォメーショナルエピトープとも呼ばれる）は、典型的には、タンパク質変性時に失われる。エピトープは、典型的には、特有の空間的コンフォメーションにある少なくとも3個、より通常は少なくとも5個、または8〜10個のアミノ酸を含む。
本明細書において使用する「選択的に結合する」または「特異的に結合する」という用語は、結合作用物質または抗体が、エピトープ、タンパク質、または標的分子に、無関連のタンパク質または関連するタンパク質を含む代替物質よりも、より高い頻度で、より迅速に、より長い持続時間で、より強い親和性で、または前記の何らかの組み合わせで、反応または会合することを意味する。一定の態様では、「特異的に結合する」が、例えば、抗体が、約0.1 mM以下、しかしより通常は約1μM未満のKDで標的に結合することを意味する。一定の態様では、「特異的に結合する」が、抗体が、少なくとも約0.1μM以下、少なくとも約0.01μM以下、または少なくとも約1 nM以下のKDで標的に結合することを意味する。異なる種における相同タンパク質間の配列同一性ゆえに、特異的結合は、2つ以上の種のタンパク質（例えばヒトFZDタンパク質およびマウスFZDタンパク質）を認識する抗体を含むことができる。同様に、異なるタンパク質のポリペプチド配列の一定領域内の相同性ゆえに、特異的結合は、2種以上のタンパク質（例えばヒトFZD2およびヒトFZD7）を認識する抗体（または他のポリペプチドもしくは結合作用物質）を含むことができる。一定の態様では、第1の標的に特異的に結合する抗体または結合作用物質が、第2の標的に特異的に結合する場合も、特異的には結合しない場合もありうると理解される。したがって、「特異的結合」は、排他的結合、すなわち単一標的への結合を（含むことはできるものの）必ずしも必要とはしない。したがって、抗体は、一定の態様では、2つ以上の標的に特異的に結合しうる。一定の態様では、複数の標的が、抗体上の同じ抗原結合部位によって結合されうる。例えば、抗体は、ある例では、それぞれが2種以上のタンパク質（例えばFZD2およびFZD7）上の同じエピトープに特異的に結合する2つの同一抗原結合部位を含みうる。一定の代替的な態様では、抗体が二重特異性であって、特異性が異なる少なくとも2つの抗原結合部位を含みうる。非限定的な例として、二重特異性抗体は、1つのタンパク質（例えばヒトFZDタンパク質）上のエピトープを認識する1つの抗原結合部位を含み、さらに、第2のタンパク質（例えばWntタンパク質）上の異なるエピトープを認識する第2の異なる抗原結合部位を含みうる。一般に、結合への言及は特異的結合を意味するが、必ずしもそうとは限らない。
本明細書において使用する「可溶性受容体」という用語は、可溶型で細胞から分泌されうる、受容体の第1膜貫通ドメインの前にある受容体タンパク質の細胞外フラグメント（またはその一部分）を指す。
本明細書において使用する「FZD可溶性受容体」という用語は、可溶型で細胞から分泌されうる、受容体の第1膜貫通ドメインの前にあるFZD受容体タンパク質の細胞外フラグメントを指す。細胞外ドメイン（ECD）全体およびより小さいECDのフラグメントを含むFZD可溶性受容体が、この用語によって包含される。したがって、Friドメインを含むFZD可溶性受容体もまた、この用語に含まれる。
「ポリペプチド」および「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、線状でも分岐していてもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸により中断されていてもよい。これらの用語はまた、天然に修飾された、または介入、例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは修飾、例えば標識構成要素とのコンジュゲーションによって修飾された、アミノ酸ポリマーも包含する。この定義には、例えば、1つまたは複数のアミノ酸類似体（例えば非天然アミノ酸を含む）、および当技術分野において公知の他の修飾を含有するポリペプチドも含まれる。本明細書に記載する方法において使用するポリペプチドは抗体に基づきうるため、一定の態様では、ポリペプチドは一本鎖または会合した鎖として存在しうることが理解される。
本明細書において使用する「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および合成アミノ酸、ならびに、天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣薬を指す。天然アミノ酸は、遺伝コードによってコードされているもの、ならびに、後に修飾されているアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタマート、およびO-ホスホセリンである。「アミノ酸類似体」という表現は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造、例えば、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびR基に結合しているα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は、修飾されたR基を有しうる（例えばノルロイシン）か、または修飾されたペプチドバックボーンを有しうるが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保つ。「アミノ酸模倣薬」という表現は、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様に機能する化学化合物を指す。
「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、本明細書では互換的に使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、DNAおよびRNAを包含する。ヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは修飾塩基、および/またはそれらの類似体、またはDNAポリメラーゼもしくはRNAポリメラーゼによって組み込まれうる任意の基質であることができる。
2つ以上の核酸またはポリペプチドに関して「同一」またはパーセント「同一性」という用語は、比較して、どの保存的アミノ酸置換も配列同一性の一部とみなさずに一致度が最大になるように（必要であればギャップを導入して）整列させた時に、同じであるか、または指定したパーセンテージの同じヌクレオチド残基もしくはアミノ酸残基を有する、2つ以上の配列または部分配列を指す。パーセント同一性は、配列比較用のソフトウェアまたはアルゴリズムによって、または目視検査によって測定することができる。当技術分野では、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列のアラインメントを得るために使用することができるさまざまなアルゴリズムおよびソフトウェアがよく知られている。これらには、BLASTおよびBLASTバリエーション、ALIGNおよびALIGNバリエーション、Megalign、BestFit、GCG Wisconsin Packageなどがあるが、それらに限定されるわけではない。いくつかの態様では、2つの核酸またはポリペプチドが実質的に同一である。すなわち、それらは、比較して、配列比較アルゴリズムを使った測定で、または目視検査による測定で、一致度が最大になるように整列させた時に、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、またいくつかの態様では、少なくとも95％、96％、97％、98％、99％のヌクレオチド残基同一性またはアミノ酸残基同一性を有する。いくつかの態様では、同一性が、当該配列のうち、少なくとも約10、少なくとも約20、少なくとも約40〜60ヌクレオチドもしくは残基長、少なくとも約60〜80ヌクレオチドもしくは残基長、またはそれらの間の任意の整数値である領域にわたって存在する。いくつかの態様では、同一性が、60〜80ヌクレオチドもしくは残基より長い領域、例えば少なくとも約80〜100ヌクレオチドもしくは残基の領域にわたって存在し、いくつかの態様では、比較されている配列、例えばヌクレオチド配列のコード領域の全長にわたって、配列が実質的に同一である。
本明細書において使用する「保存的アミノ酸置換」という用語は、あるアミノ酸残基が、類似する側鎖を有する別のアミノ酸残基で置き換えられる置換を指す。当技術分野では、類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが規定されており、これには、塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ-分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。例えば、フェニルアラニンによるチロシンの置換は保存的置換である。好ましくは、ポリペプチドおよび抗体の配列における保存的置換は、そのアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたは抗体の、抗原への結合を、抑止しない。抗原結合を排除しないヌクレオチドおよびアミノ酸の保存的置換を同定する方法は、当技術分野では周知である。
本明細書において使用する「ベクター」という用語は、宿主細胞に、1つまたは複数の関心対象の遺伝子または配列を送達し、通常は、それを発現させる能力を有する、コンストラクトを意味する。ベクターの例には、ウイルスベクター、裸のDNAまたはRNA発現ベクター、プラスミド、コスミド、またはファージベクター、カチオン性凝集剤と会合したDNAまたはRNA発現ベクター、およびリポソームに封入されたDNAまたはRNA発現ベクターなどがあるが、それらに限定されるわけではない。
本明細書において使用する「単離された」ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物とは、自然には見いだされない形態にあるポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物である。単離されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物には、それらがもはや自然に見いだされる形態にはない程度にまで精製されたものが含まれる。いくつかの態様では、単離されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、実質的に純粋である。
本明細書において使用する「実質的に純粋」という用語は、少なくとも50％純粋（すなわち不純物を含まない）、少なくとも90％純粋、少なくとも95％純粋、少なくとも98％純粋、または少なくとも99％純粋である材料を指す。
本明細書において使用する「がん」および「がん性」という用語は、細胞の集団が無秩序な細胞成長を特徴とするような哺乳動物における生理的状態を指すか、そのような生理的状態を記述している。がんの例には、癌腫、芽細胞腫、肉腫、ならびにリンパ腫および白血病などの血液がんなどがあるが、それらに限定されるわけではない。
本明細書において使用する「増殖性障害」および「増殖性疾患」という用語は、がんのような異常な細胞増殖に関連する障害を指す。
本明細書において使用する「腫瘍」および「新生物」という用語は、良性（非がん性）であれ、前がん病巣を含む悪性（がん性）であれ、過剰な細胞成長または細胞増殖がもたらす任意の組織塊を指す。
本明細書において使用する「転移」という用語は、がんが元の部位から身体の別の領域に伝播または移行して、類似するがん性病巣を新しい場所に発生させる過程を指す。「転移」細胞または「転移性」細胞は概して、近隣細胞との付着接触を失って疾患の原発部位から移動することで、隣接した体構造に侵入するものである。
「がん幹細胞」および「CSC」および「腫瘍幹細胞」および「腫瘍始原細胞」という用語は、本明細書では互換的に使用され、（1）高い増殖能を有し、（2）非対称細胞分裂を起こして増殖能または発生能が低減している1タイプまたは複数タイプの分化型細胞の子孫を生成させる能力を有し、（3）自己再生または自己維持のために対称細胞分裂を起こす能力を有する、がんまたは腫瘍からの細胞を指す。これらの性質は、免疫不全宿主（例えばマウス）への累代移植時に、腫瘍を形成しえない腫瘍細胞の大部分と比べて、腫瘍またはがんを形成または確立する能力を、がん幹細胞に付与する。がん幹細胞は、自己再生と分化とを無秩序に起こすことで、変異が発生するにつれて経時的に変化しうる異常細胞タイプを伴う腫瘍を形成する。
本明細書において使用する「がん細胞」および「腫瘍細胞」という用語は、がんまたは腫瘍または前がん病巣に由来する細胞の全集団を指し、がん細胞集団の大部分を構成する非腫瘍形成性細胞と、腫瘍形成性細胞（がん幹細胞）の両方を包含する。本明細書において使用する「がん細胞」または「腫瘍細胞」という用語は、それらの腫瘍細胞をがん幹細胞とは区別するために、再生し分化する能力を欠く細胞をもっぱら指す場合には、「非腫瘍形成性」という用語で修飾される。
本明細書において使用する「腫瘍形成性」という用語は、自己再生（新たな腫瘍形成性がん幹細胞を生じさせる）性質と、増殖によって他の全ての腫瘍細胞を生成する（分化した、したがって非腫瘍形成性の腫瘍細胞を生じさせる）性質とを含む、がん幹細胞の機能的特色を指す。
本明細書において使用する「腫瘍形成性」という用語は、免疫不全宿主（例えばマウス）への累代移植時に触知可能な腫瘍を形成するという、腫瘍由来の細胞試料の能力を指す。
本明細書において使用する「対象」という用語は、特定の処置の受容者となる任意の動物（例えば哺乳動物）を指し、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、齧歯類動物などを含むが、それらに限定されるわけではない。典型的には、「対象」および「患者」という用語は、ヒト対象に関して、本明細書では互換的に使用される。
「薬学的に許容される」という用語は、ヒトを含む動物における使用について、連邦政府もしくは州政府の規制当局によって承認されたかもしくは承認されうる、または、米国薬局方もしくは他の一般に認識されている薬局方に掲載されている、作用物質、化合物、分子などを指す。
「薬学的に許容される賦形剤、担体、またはアジュバント」および「許容される薬学的担体」という表現は、治療剤と一緒に対象に投与することができて、その薬理学的活性を破壊せず、治療効果を送達するのに十分な用量で投与した時に非毒性である、賦形剤、担体、またはアジュバントを指す。一般に、当業者およびFDAは、薬学的に許容される賦形剤、担体、またはアジュバントを、任意の製剤または薬学的組成物の不活性成分であると考える。
本明細書において使用する「有効量」および「治療有効量」および「治療効果」という用語は、対象または哺乳動物における疾患または障害を「処置する」のに有効な結合作用物質、抗体、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、小分子、または他の治療剤の量を指す。がんの場合、作用物質（例えば抗体）の治療有効量は、治療効果を有し、したがって、がん細胞の数を低減し、腫瘍形成性、腫瘍形成頻度、または腫瘍形成能を減少させ、がん幹細胞の数または頻度を低減し、腫瘍サイズを低減し、がん細胞集団を低減し、例えば軟組織および骨へのがんの伝播を含む、周辺臓器へのがん細胞の浸潤を阻害および/または停止し、腫瘍またはがん細胞の転移を阻害および停止し、腫瘍またはがん細胞の成長を阻害および/または停止し、がんと関連する症状の1つまたは複数をある程度は除去し、罹病率および死亡率を低減し、生活の質を改善することができるか、またはそのような効果の組み合わせを起こすことができる。作用物質が、成長を防止し、かつ/または既存のがん細胞を殺す限りにおいて、それを、細胞増殖抑制性および/または細胞傷害性と呼ぶことができる。
「処置する」および「処置」および「処置すること」および「軽減する」および「軽減すること」という用語は、1）診断された病的状態または障害を治し、減退させ、その症状を減らし、かつ/またはその進行を停止させる治療的手段と、2）標的とする病的状態または障害の発生を防止するか、または遅らせる予防的または防止的手段との両方を指す。したがって、処置を必要とする者には、すでに障害を有する者、障害を患いやすい者、および障害を防止すべき者が含まれる。いくつかの態様では、患者が以下の1つまたは複数を示すのであれば、対象は本明細書に記載する方法によってうまく「処置され」ている：がん細胞の数の低減またはがん細胞の完全な欠如；腫瘍サイズの低減；軟組織および骨へのがん細胞の伝播を含む、周辺臓器へのがん細胞の浸潤の阻害または欠如；腫瘍またはがん細胞の転移の阻害または欠如；がん成長の阻害または欠如；特定のがんと関連する1つまたは複数の症状の除去；罹病率および死亡率の低減；生活の質の改善；腫瘍形成性の低減；がん幹細胞の数または頻度の低減；または効果のいくつかの組み合わせ。
本開示および特許請求の範囲において使用する場合、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈上そうでないことが明らかな場合を除き、複数形を含む。
本明細書において「を含む（comprising）」という言葉を用いて態様が説明されている場合は常に、「からなる（consisting of）」および/または「から本質的になる（consisting essentially of）」という用語で説明される、それ以外の点では類似する態様も提供されると理解される。また、本明細書において「から本質的になる」という言葉を用いて態様が説明されている場合は常に、「からなる」という用語で説明される、それ以外の点では類似する態様も提供されると理解される。
本明細書において「Aおよび/またはB」などの表現で使用される「および/または」という用語は、AとBの両方、AまたはB、A（のみ）、およびB（のみ）を含むものとする。同様に、「A、B、および/またはC」などの表現で使用される「および/または」という用語は、以下の態様のそれぞれを包含するものとする：A、B、およびC；A、B、またはC；AまたはC；AまたはB；BまたはC；AおよびC；AおよびB；BおよびC；A（のみ）；B（のみ）；ならびにC（のみ）。
II．使用方法および薬学的組成物
有糸分裂インヒビターと併用した、本明細書に記載するWnt経路インヒビター（例えばWnt結合作用物質およびFDZ結合作用物質）は、特に時間差または逐次投薬レジメンで使用する時に、がんの処置などの治療的処置法を含むがそれらに限定されるわけではない、さまざまな適用に有用である。一定の態様では、Wnt経路インヒビターおよび有糸分裂インヒビターの併用が、特に時間差または逐次投薬レジメンで使用する時に、Wntシグナル伝達（例えば、古典的Wntシグナル伝達、自己分泌Wntシグナル伝達、有糸分裂Wntシグナル伝達）を阻害する、有糸分裂を阻害する、腫瘍成長を阻害する、分化を誘発する、アポトーシスを誘発する、腫瘍細胞死を誘発する、分化を増加させる、アポトーシスを増加させる、腫瘍細胞死を増加させる、腫瘍体積を低減する、腫瘍サイズを低減する、がん幹細胞頻度を低減する、および／または腫瘍の腫瘍形成性を低減する方法に有用である。使用方法は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボの方法でありうる。
本明細書において使用する場合、「時間差または逐次投薬レジメン」という用語および「時間差投薬スケジュール」などの関連する用語法または表現法は、一般に、各作用物質の使用または投与が時間をかけて時間差である、有糸分裂インヒビターと併用したWnt経路インヒビターの使用を指す。いくつかの態様では、第1作用物質が、第2作用物質の投与の少なくとも約12、24、36、48、60、72、84、または96時間前に投与される。いくつかの態様では、第1作用物質が、第2作用物質の投与の少なくとも約1日、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、または約7日前に投与される。いくつかの態様では、第1作用物質が、第2作用物質の投与の約2日前に投与される。いくつかの態様では、2種の作用物質の時間差投与が、投薬量のバリエーションを含む。本明細書において使用する場合、この定義は、追加の治療剤の投与を妨げない。
いくつかの態様では、有糸分裂インヒビターと併用したWnt経路インヒビター（例えばWnt結合作用物質またはFDZ結合作用物質）を、特に時間差または逐次投薬レジメンで使用する時に、Wnt経路活性化と関連する疾患を処置する方法において使用する。いくつかの態様では、疾患が、Wntシグナル伝達に依存する疾患である。特定の態様では、Wntシグナル伝達が古典的Wntシグナル伝達である。いくつかの態様では、Wntシグナル伝達が自己分泌Wntシグナル伝達である。いくつかの態様では、Wntシグナル伝達が有糸分裂Wntシグナル伝達である。
いくつかの態様では、Wnt経路インヒビター（例えばWnt結合作用物質またはFDZ結合作用物質）および有糸分裂インヒビターの併用で処置され、治療剤が時間差投薬レジメンを用いて投与される疾患が、がんである。一定の態様では、がんがWnt依存性腫瘍を特徴とする。一定の態様では、がんが、1種または複数種のWntタンパク質を発現または過剰発現する腫瘍を特徴とする。一定の態様では、がんが、1種または複数種のFZDタンパク質を発現または過剰発現する腫瘍を特徴とする。一定の態様では、がんが、β-カテニンを発現または過剰発現する腫瘍を特徴とする。
本発明は、がんを処置する方法であって、対象に、治療有効量のWnt経路インヒビターおよび治療有効量の有糸分裂インヒビターを投与する工程を含み、ここで、Wnt経路インヒビターが最初に投与され、有糸分裂インヒビターが2番目に投与される方法を提供する。本発明は、がんを処置する方法であって、対象に、治療有効量のWnt経路インヒビターおよび治療有効量の有糸分裂インヒビターを投与する工程を含み、ここで、Wnt経路インヒビターおよび有糸分裂インヒビターが時間差投薬スケジュールを用いて投与され、Wnt経路インヒビターが最初に投与される方法を提供する。いくつかの態様では、有糸分裂インヒビターが、Wnt経路インヒビターが投与された約1日、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、または約7日後に投与される。本発明はまた、対象におけるがんの処置において有糸分裂インヒビターの有効性を増大させる方法であって、対象に有糸分裂インヒビターを、Wnt経路インヒビターが投与された約1日、約2日、約3日、約4日、約5日、または約6日後に投与する工程を含む方法も提供する。いくつかの態様では、がんを処置する方法が、対象に、治療有効量のWnt経路インヒビターおよび治療有効量の有糸分裂インヒビターを投与する工程を含み、ここで、Wnt経路インヒビターおよび有糸分裂インヒビターは時間差投薬スケジュールを用いて投与され、Wnt経路インヒビターが最初に投与され；かつ、Wnt経路インヒビターは、少なくとも1種のヒトFrizzled（FZD）タンパク質に特異的に結合する抗体、またはヒトFZDタンパク質のFriドメインを含む可溶性受容体である。いくつかの態様では、有糸分裂インヒビターが、Wnt経路インヒビターが投与された約1、2、3、4、5、6、または7日後に投与される。いくつかの態様では、有糸分裂インヒビターが、Wnt経路インヒビターが投与された約2日後に投与される。
いくつかの態様では、方法が、がんの処置のためのWnt経路インヒビターおよび有糸分裂インヒビターの使用を含み、ここで、Wnt経路インヒビターおよび有糸分裂インヒビターは時間差投薬スケジュールで使用され、Wnt経路インヒビターが最初に使用され；かつ、Wnt経路インヒビターは、（i）少なくとも1種のヒトFrizzled（FZD）タンパク質に特異的に結合する抗体、または(ii)ヒトFZDタンパク質のFriドメインを含む可溶性受容体である。
本発明はまた、対象におけるがんの処置において有糸分裂インヒビターの有効性を増大させる方法であって、（a）対象にWnt経路インヒビターを投与する工程；および（b）対象に有糸分裂インヒビターを、Wnt経路インヒビターが投与された約1日、約2日、約3日、約4日、約5日、または約6日後に投与する工程を含む方法も提供する。いくつかの態様では、対象におけるがんの処置において有糸分裂インヒビターの有効性を増大させる方法が、対象に有糸分裂インヒビターを、Wnt経路インヒビターが投与された約1、2、3、4、5、または6日後に投与する工程を含み、ここで、Wnt経路インヒビターは、（i）少なくとも1種のヒトFrizzled（FZD）タンパク質に特異的に結合する抗体、または（ii）ヒトFZDタンパク質のFriドメインを含む可溶性受容体である。いくつかの態様では、対象におけるがんの処置において有糸分裂インヒビターの有効性を増大させる方法が、（a）対象にWnt経路インヒビターを投与する工程であって、Wnt経路インヒビターが、（i）少なくとも1種のヒトFrizzled（FZD）タンパク質に特異的に結合する抗体、または（ii）ヒトFZDタンパク質のFriドメインを含む可溶性受容体である工程；および（b）対象に有糸分裂インヒビターを、Wnt経路インヒビターが投与された約1、2、3、4、5、または6日後に投与する工程を含む。いくつかの態様では、有糸分裂インヒビターが、Wnt経路インヒビターが投与された約2日後に投与される。いくつかの態様では、がんの処置における有糸分裂インヒビターの有効性の増大が、有糸分裂インヒビターおよびWnt経路インヒビターが患者に実質的に同時に、例えば同じ日に投与される時に観察される有効性に対するものである。
本発明はまた、対象におけるがんの処置において併用療法の有効性を増大させる方法であって、（a）対象にWnt経路インヒビターを投与する工程；および（b）対象に有糸分裂インヒビターを、Wnt経路インヒビターが投与された約1日、約2日、約3日、約4日、約5日、または約6日後に投与する工程を含む方法も提供する。いくつかの態様では、対象におけるがんの処置において併用療法の有効性を増大させる方法が、対象に有糸分裂インヒビターを、Wnt経路インヒビターが投与された約1、2、3、4、5、または6日後に投与する工程を含み、ここで、Wnt経路インヒビターは、（i）少なくとも1種のヒトFrizzled（FZD）タンパク質に特異的に結合する抗体、または（ii）ヒトFZDタンパク質のFriドメインを含む可溶性受容体である。いくつかの態様では、対象におけるがんの処置において併用療法の有効性を増大させる方法が、（a）対象にWnt経路インヒビターを投与する工程であって、Wnt経路インヒビターが、（i）少なくとも1種のヒトFrizzled（FZD）タンパク質に特異的に結合する抗体、または（ii）ヒトFZDタンパク質のFriドメインを含む可溶性受容体である工程；および（b）対象に有糸分裂インヒビターを、Wnt経路インヒビターが投与された約1、2、3、4、5、または6日後に投与する工程を含む。いくつかの態様では、有糸分裂インヒビターが、Wnt経路インヒビターが投与された約2日後に投与される。いくつかの態様では、がんの処置における併用療法の有効性の増大が、有糸分裂インヒビターおよびWnt経路インヒビターが患者に実質的に同時に、例えば同じ日に投与される時に観察される有効性に対するものである。
いくつかの態様では、がんの処置のために有糸分裂インヒビターの有効性を増大させる方法が、Wnt経路インヒビターが使用された約1，2、3、4、5、または6日後の有糸分裂インヒビターの使用を含み、ここで、Wnt経路インヒビターは、（i）少なくとも1種のヒトFrizzled（FZD）タンパク質に特異的に結合する抗体、または（ii）ヒトFZDタンパク質のFriドメインを含む可溶性受容体である。いくつかの態様では、有糸分裂インヒビターが、Wnt経路インヒビターが使用された約2日後に使用される。いくつかの態様では、がんの処置における有糸分裂インヒビターの有効性の増大が、有糸分裂インヒビターおよびWnt経路インヒビターが実質的に同時に、例えば同じ日に使用される時に観察される有効性に対するものである。
本発明はまた、Wnt経路インヒビターおよび有糸分裂インヒビターを含む併用療法の有効性を改善する方法も提供し、該方法は、Wnt経路インヒビターがその標的に達するのに十分な時間を可能にした後に有糸分裂インヒビターを投与する工程を含む。いくつかの態様では、本発明が、Wnt経路インヒビターおよび有糸分裂インヒビターを含む併用療法の有効性を改善する方法を提供し、該方法は、Wnt経路インヒビターがその標的で蓄積するのに十分な時間を可能にした後に有糸分裂インヒビターを投与する工程を含む。いくつかの態様では、標的がFZDタンパク質である。いくつかの態様では、標的がWntタンパク質である。いくつかの態様では、標的が腫瘍と関連して見いだされる。
本明細書に記載する方法のいくつかの態様では、有糸分裂インヒビターが、Wnt経路インヒビターが投与された約1日後に投与される。いくつかの態様では、有糸分裂インヒビターが、Wnt経路インヒビターが投与された約2日後に投与される。いくつかの態様では、有糸分裂インヒビターが、Wnt経路インヒビターが投与された約3日後に投与される。
本明細書に記載する方法のいくつかの態様では、Wnt経路インヒビターおよび有糸分裂インヒビターが、相乗的に作用する。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、がん細胞を有糸分裂インヒビターに対して敏感にする。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、がん幹細胞を有糸分裂インヒビターに対して敏感にする。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、細胞周期進行を有糸分裂（M）期中に抑制または停止する。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、細胞周期進行をG2/Mチェックポイントで抑制または停止する。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、細胞周期進行をG2/Mチェックポイントで抑制または停止して、有糸分裂インヒビターの有効性を増大させる。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、細胞周期進行をM期で抑制または停止して、有糸分裂インヒビターの有効性を増大させる。いくつかの態様では、時間差投薬が、Wnt経路活性の阻害の持続および有糸分裂インヒビターの有効性の増大を可能にする。
本明細書に記載する方法のいくつかの態様では、有糸分裂インヒビターと併用したWnt経路インヒビターの時間差投薬スケジュールが、腫瘍細胞のアポトーシスを増大させる。本明細書に記載する方法のいくつかの態様では、有糸分裂インヒビターと併用したWnt経路インヒビターの時間差投薬スケジュールが、腫瘍細胞の溶解を増大させる。いくつかの態様では、有糸分裂インヒビターと併用したWnt経路インヒビターの時間差投薬スケジュールが、腫瘍部位でのWnt経路インヒビターの蓄積を可能にする。いくつかの態様では、有糸分裂インヒビターと併用したWnt経路インヒビターの時間差投薬スケジュールが、Wnt経路インヒビターおよび有糸分裂インヒビターの抗腫瘍活性の同調を可能にする。
本明細書に記載する方法のいくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、3週間に1回投与される。いくつかの態様では、有糸分裂インヒビターが、約1週間に1回、約2週間に1回、約3週間に1回、約4週間に1回、または4週間（すなわち28日）サイクルのうち3週間にわたって約1週間に1回投与される。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、約3週間に1回投与され、有糸分裂インヒビターが、1週間に1回、または4週間サイクルのうち3週間にわたって1週間に1回投与される。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、4週間に1回投与される。いくつかの態様では、有糸分裂インヒビターが、約1週間に1回、約2週間に1回、約3週間に1回、または約4週間に1回投与される。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、4週間に1回投与され、有糸分裂インヒビターが、1週間に1回、または4週間サイクルのうち3週間にわたって1週間に1回投与される。
いくつかの態様では、処置または投薬レジメンは、特定の数の投与または「サイクル」に限定されうる。「サイクル」とは、標準治療の治療剤について周知であるか、または当業者によってよく使用される投薬スケジュールでありうる。例えば、パクリタキセルのサイクルは、4週間サイクルのうち3週間にわたって1週間に1回の投与（4週間ごとに投与のない1週間がある）でありうる。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、2、3、4、5、6、7、8サイクル、またはそれ以上のサイクルにわたって投与される。いくつかの態様では、有糸分裂インヒビターが、2、3、4、5、6、7、8サイクル、またはそれ以上のサイクルにわたって投与される。いくつかの態様では、1つの作用物質が1サイクルまたはそれ以上のサイクルに抑えられ、一方、第2の作用物質の投与が継続される。
本明細書に記載する方法のいくつかの態様では、がんが、直腸結腸がん、膵臓がん、肺がん、卵巣がん、肝臓がん、乳がん、腎臓がん、前立腺がん、胃腸がん、メラノーマ、子宮頸がん、膀胱がん、神経膠芽腫、および頭頸部がんからなる群より選択されるがんである。一定の態様では、がんが乳がんである。いくつかの態様では、がんが卵巣がんである。一定の態様では、がんが肺がんである。本明細書において使用する場合、「肺がん」は、小細胞肺がんおよび非小細胞肺がん（NSCLC）を含むが、それらに限定されるわけではない。一定の態様では、がんが膵臓がんである。いくつかの態様では、がんが結腸がんである。
いくつかの態様では、がんを処置する方法が、対象に、治療有効量のバンチクマブ（OMP-18R5）および治療有効量の、パクリタキセル、nab-パクリタキセル、およびドセタキセルからなる群より選択されるタキサンを投与する工程を含み、ここで、タキサンは、バンチクツマブが投与された約1、2、3、4、5、6、または7日後に投与される。いくつかの態様では、タキサンが、バンチクツマブが投与された約2日後に投与される。いくつかの態様では、バンチクツマブが約2週間に1回投与される。いくつかの態様では、バンチクツマブが約3週間に1回投与される。いくつかの態様では、バンチクツマブが約4週間に1回投与される。いくつかの態様では、タキサンが1週間に1回投与される。いくつかの態様では、タキサンが2週間に1回投与される。いくつかの態様では、タキサンが3週間に1回投与される。いくつかの態様では、タキサンが、4週間サイクルのうち3週間にわたって1週間に1回投与される。いくつかの態様では、がんを処置する方法が、対象に、治療有効量のバンチクツマブ（OMP-18R5）および治療有効量のドセタキセルを投与する工程を含み、ここで、ドセタキセルは、バンチクツマブが投与された約2または3日後に投与される。いくつかの態様では、がんを処置する方法が、対象に、治療有効量のバンチクツマブ（OMP-18R5）、治療有効量のnab-パクリタキセル、および治療有効量のゲムシタビンを投与する工程を含み、ここで、nab-パクリタキセルおよびゲムシタビンは、バンチクツマブが投与された約2または3日後に投与される。いくつかの態様では、がんを処置する方法が、対象に、治療有効量のバンチクツマブ（OMP-18R5）、治療有効量のnab-パクリタキセル、および治療有効量のゲムシタビンを投与する工程を含み、ここで、nab-パクリタキセルは、バンチクツマブが投与された約2または3日後に投与される。いくつかの態様では、がんを処置する方法が、対象に、治療有効量のバンチクツマブ（OMP-18R5）および治療有効量のパクリタキセルを投与する工程を含み、ここで、パクリタキセルは、バンチクツマブが投与された約2または3日後に投与される。
いくつかの態様では、がんを処置する方法が、対象に、治療有効量のイパフリセプト（OMP-54F28）および治療有効量のパクリタキセル、nab-パクリタキセル、およびドセタキセルからなる群より選択されるタキサンを投与する工程を含み、ここで、タキサンは、イパフリセプトが投与された約1、2、3、4、5、6、または7日後に投与される。いくつかの態様では、タキサンが、イパフリセプトが投与された約2日後に投与される。いくつかの態様では、イパフリセプトが約2週間に1回投与される。いくつかの態様では、イパフリセプトが約3週間に1回投与される。いくつかの態様では、イパフリセプトが約4週間に1回投与される。いくつかの態様では、タキサンが1週間に1回投与される。いくつかの態様では、タキサンが2週間に1回投与される。いくつかの態様では、タキサンが3週間に1回投与される。いくつかの態様では、タキサンが、4週間サイクルのうち3週間にわたって1週間に1回投与される。いくつかの態様では、がんを処置する方法が、対象に、治療有効量のイパフリセプト（OMP-54F28）、治療有効量のパクリタキセル、および治療有効量のカルボプラチンを投与する工程を含み、ここで、パクリタキセルおよびカルボプラチンは、イパフリセプトが投与された約2または3日後に投与される。いくつかの態様では、がんを処置する方法が、対象に、治療有効量のイパフリセプト（OMP-54F28）、治療有効量のパクリタキセル、および治療有効量のカルボプラチンを投与する工程を含み、ここで、パクリタキセルは、イパフリセプトが投与された約2または3日後に投与される。いくつかの態様では、がんを処置する方法が、対象に、治療有効量のイパフリセプト（OMP-54F28）、治療有効量のnab-パクリタキセル、および治療有効量のゲムシタビンを投与する工程を含み、ここで、nab-パクリタキセルおよびゲムシタビンは、イパフリセプトが投与された約2または3日後に投与される。いくつかの態様では、がんを処置する方法が、対象に、治療有効量のイパフリセプト（OMP-54F28）、治療有効量のnab-パクリタキセル、および治療有効量のゲムシタビンを投与する工程を含み、ここで、nab-パクリタキセルは、イパフリセプトが投与された約2または3日後に投与される。
本発明は、さらに、腫瘍成長を阻害する方法であって、腫瘍細胞を、有効量のWnt経路インヒビターおよび有効量の有糸分裂インヒビターと接触させる工程を含み、ここで、Wnt経路インヒビターが最初に細胞に投与され、有糸分裂インヒビターが2番目に細胞に投与される方法を提供する。本発明は、腫瘍成長を阻害する方法であって、腫瘍細胞を、有効量のWnt経路インヒビターおよび有効量の有糸分裂インヒビターと接触させる工程を含み、ここで、Wnt経路インヒビターおよび有糸分裂インヒビターが時間差投薬スケジュールを用いて細胞に投与され、Wnt経路インヒビターが最初に細胞に投与される方法を提供する。いくつかの態様では、有糸分裂インヒビターが、Wnt経路インヒビターが投与された約12、24、36、48、60、72、84、または96時間後に投与される。いくつかの態様では、有糸分裂インヒビターが、Wnt経路インヒビターが投与された約1日、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、または約7日後に投与される。本発明はまた、腫瘍成長の阻害において有糸分裂インヒビターの有効性を増大させる方法であって、（a）腫瘍細胞をWnt経路インヒビターと接触させる工程；および（b）Wnt経路インヒビターが投与された約1日、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、または約7日後に腫瘍細胞を有糸分裂インヒビターと接触させる工程を含む方法も提供する。
本明細書に記載する方法の一定の態様では、腫瘍成長を阻害する方法が、腫瘍または腫瘍細胞を、Wnt経路インヒビターおよび有糸分裂経路インヒビターとインビトロで接触させる工程を含む。例えば、いくつかの態様では、不死化細胞株またはがん細胞株を培地中で培養し、それに対して、腫瘍細胞成長を阻害するためにWnt経路インヒビターを添加し、その後有糸分裂インヒビターの添加を行う。いくつかの態様では、腫瘍細胞を、例えば、組織生検材料、胸水、または血液試料などの患者試料から単離して、培地中で培養し、それに対して、腫瘍細胞成長を阻害するためにWnt経路インヒビターおよび有糸分裂インヒビターを添加する。
いくつかの態様では、腫瘍成長を阻害する方法が、腫瘍または腫瘍細胞を、Wnt経路インヒビターおよび有糸分裂インヒビターとインビボで接触させる工程を含む。一定の態様では、腫瘍または腫瘍細胞をWnt経路インヒビターおよび有糸分裂インヒビターと接触させる工程が、動物モデルにおいて着手される。例えば、Wnt経路インヒビターおよび有糸分裂インヒビターは、腫瘍の成長を阻害するために、異種移植腫瘍を有する免疫不全マウス（例えばNOD/SCIDマウス）に時間差投薬様式で投与されてもよい。一定の態様では、がん幹細胞を、例えば、組織生検材料、胸水、または血液試料などの患者試料から単離して、免疫不全マウス中に注射し、次いで、腫瘍細胞成長を阻害するために、時間差投薬様式でWnt経路インヒビターを投与し、その後有糸分裂インヒビターの投与を行う。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターおよび有糸分裂インヒビターが、腫瘍成長を防止するために（防止的モデル）、細胞の動物中への導入と同時または直後に、時間差投薬様式で投与される。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターおよび有糸分裂インヒビターが、腫瘍成長を阻害および／または低減するために（治療的モデル）、細胞が特定のサイズの腫瘍に成長した後に、時間差投薬様式で投与される。
本発明はまた、対象において腫瘍成長を阻害する方法であって、対象に、治療有効量のWnt経路インヒビターおよび治療有効量の有糸分裂インヒビターを時間差投薬様式で投与する工程を含み、ここで、Wnt経路インヒビターが有糸分裂インヒビターの投与の前に投与される方法も提供する。一定の態様では、対象がヒトである。一定の態様では、対象が腫瘍を有するか、または腫瘍が除去されている。いくつかの態様では、対象が、転移している腫瘍を有する。いくつかの態様では、対象が、事前の治療的処置を受けたことがある。
本発明はまた、対象において腫瘍サイズを低減する方法であって、対象に、治療有効量のWnt経路インヒビターおよび治療有効量の有糸分裂インヒビターを時間差投薬様式で投与する工程を含み、ここで、Wnt経路インヒビターが有糸分裂インヒビターの投与の前に投与される方法も提供する。いくつかの態様では、腫瘍サイズが、腫瘍細胞のアポトーシスを誘発することによって低減する。いくつかの態様では、腫瘍サイズが、腫瘍細胞の溶解を誘発することによって低減する。一定の態様では、対象がヒトである。一定の態様では、対象が腫瘍を有するか、または腫瘍が除去されている。いくつかの態様では、対象が、転移している腫瘍を有する。いくつかの態様では、対象が、事前の治療的処置を受けたことがある。
本発明はまた、対象において腫瘍退縮を誘発する方法であって、対象に、治療有効量のWnt経路インヒビターおよび治療有効量の有糸分裂インヒビターを時間差投薬様式で投与する工程を含み、ここで、Wnt経路インヒビターが有糸分裂インヒビターの投与の前に投与される方法も提供する。一定の態様では、対象がヒトである。一定の態様では、対象が腫瘍を有するか、または腫瘍が除去されている。いくつかの態様では、対象が、転移している腫瘍を有する。いくつかの態様では、対象が、事前の治療的処置を受けたことがある。
本発明はまた、対象において腫瘍の侵襲性を阻害する方法であって、対象に、治療有効量のWnt経路インヒビターおよび治療有効量の有糸分裂インヒビターを時間差投薬様式で投与する工程を含み、ここで、Wnt経路インヒビターが有糸分裂インヒビターの投与の前に投与される方法も提供する。いくつかの態様では、侵襲性の阻害が、腫瘍細胞のE-カドヘリン発現を増加させることを含む。一定の態様では、対象がヒトである。一定の態様では、対象が腫瘍を有するか、または腫瘍が除去されている。
本発明はまた、対象において転移を低減または防止する方法であって、対象に、治療有効量のWnt経路インヒビターおよび治療有効量の有糸分裂インヒビターを時間差投薬様式で投与する工程を含み、ここで、Wnt経路インヒビターが有糸分裂インヒビターの投与の前に投与される方法も提供する。いくつかの態様では、転移の低減または阻止が、腫瘍の侵襲性の阻害を含む。いくつかの態様では、転移の低減または阻止が、腫瘍細胞のE-カドヘリン発現を増加させることによる腫瘍の侵襲性の阻害を含む。一定の態様では、対象がヒトである。一定の態様では、対象が腫瘍を有するか、または腫瘍が除去されている。
本発明はまた、細胞においてWntシグナル伝達を阻害する方法であって、細胞を、有効量のWnt経路インヒビターおよび有効量の有糸分裂インヒビターと時間差投薬様式で接触させる工程を含み、ここで、Wnt経路インヒビターが有糸分裂インヒビターの投与の前に投与される方法も提供する。一定の態様では、細胞が腫瘍細胞である。一定の態様では、方法が、細胞をインヒビターと接触させる工程が治療有効量のインヒビターの対象への投与を含む、インビボの方法である。いくつかの態様では、方法が、インビトロまたはエクスビボの方法である。一定の態様では、阻害されるWntシグナル伝達が古典的Wntシグナル伝達である。一定の態様では、阻害されるWntシグナル伝達が自己分泌Wntシグナル伝達である。一定の態様では、阻害されるWntシグナル伝達が有糸分裂Wntシグナル伝達である。一定の態様では、Wntシグナル伝達が、Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt7b、および／またはWnt10bによるシグナル伝達である。一定の態様では、Wntシグナル伝達が、Wnt1、Wnt3a、Wnt7b、および／またはWnt10bによるシグナル伝達である。
加えて、本発明は、対象において腫瘍の腫瘍形成性を低減する方法であって、対象に、治療有効量のWnt経路インヒビターおよび治療有効量の有糸分裂インヒビターを時間差投薬様式で投与する工程を含み、ここで、Wnt経路インヒビターが有糸分裂インヒビターの投与の前に投与される方法を提供する。一定の態様では、腫瘍ががん幹細胞を含む。いくつかの態様では、腫瘍の腫瘍形成性が、腫瘍におけるがん幹細胞の頻度を低減することによって低減される。一定の態様では、腫瘍におけるがん幹細胞の頻度が、Wnt経路インヒビターの投与によって低減される。いくつかの態様では、腫瘍の腫瘍形成性が、腫瘍細胞の分化を誘発することによって低減される。いくつかの態様では、腫瘍の腫瘍形成性が、腫瘍細胞のアポトーシスを誘発することによって低減される。いくつかの態様では、腫瘍の腫瘍形成性が、腫瘍細胞のアポトーシスを増大させることによって低減される。
本発明はまた、がん幹細胞を含む腫瘍においてがん幹細胞頻度を低減する方法であって、対象に、治療有効量のWnt経路インヒビターおよび治療有効量の有糸分裂インヒビターを時間差投薬様式で投与する工程を含み、ここで、Wnt経路インヒビターが有糸分裂インヒビターの投与の前に投与される方法も提供する。一定の態様では、有糸分裂インヒビターと併用したWnt経路インヒビターが、マウス異種移植モデルなどの動物モデルにおいてがん幹細胞を含む腫瘍の腫瘍形成性を低減する能力を有する。一定の態様では、処置された腫瘍におけるがん幹細胞の数または頻度が、処置されていない腫瘍におけるがん幹細胞の数または頻度と比較して、少なくとも約2分の1、約3分の1、約5分の1、約10分の1、約50分の1、約100分の1、または約1000分の1に低減される。一定の態様では、がん幹細胞の数または頻度の低減が、動物モデルを使った限界希釈アッセイによって決定される。
一定の態様では、腫瘍が、Wntシグナル伝達が活性である腫瘍である。一定の態様では、活性であるWntシグナル伝達が古典的Wntシグナル伝達である。一定の態様では、活性であるWntシグナル伝達が非古典的Wntシグナル伝達である。一定の態様では、活性であるWntシグナル伝達が自己分泌Wntシグナル伝達である。一定の態様では、活性であるWntシグナル伝達が有糸分裂Wntシグナル伝達である。一定の態様では、腫瘍がWnt依存性腫瘍である。
本明細書に記載する方法の一定の態様では、腫瘍が、Wnt結合作用物質が結合する1種または複数種のヒトWntタンパク質を発現する。一定の態様では、腫瘍が、1種または複数種のヒトWntタンパク質を過剰発現する。一定の態様では、腫瘍が、同じ組織タイプの正常組織におけるWntタンパク質発現と比較して1種または複数種のヒトWntタンパク質を過剰発現する。一定の態様では、腫瘍が、少なくとも1つの他の腫瘍におけるWntタンパク質発現と比較して1種または複数種のヒトWntタンパク質を過剰発現する。いくつかの態様では、腫瘍が、Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、およびWnt16を過剰発現する。いくつかの態様では、腫瘍がWnt3またはWnt3aを過剰発現する。
一定の態様では、腫瘍が、FZD結合作用物質が結合する1種または複数種のヒトFZDタンパク質を発現する。一定の態様では、腫瘍が、1種または複数種のヒトFZDタンパク質を過剰発現する。一定の態様では、腫瘍が、ヒトFZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、および／またはFZD10を過剰発現する。一定の態様では、腫瘍が、ヒトFZD1、FZD2、FZD5、FZD7、および／またはFZD8を過剰発現する。一定の態様では、腫瘍がヒトFZD8を過剰発現する。ヒトFZDタンパク質の「過剰発現」は、本明細書に記載するFZD結合作用物質の使用のために必要とされないかまたは必要であることが、理解されるべきである。
本明細書に記載する方法のいくつかの態様では、腫瘍が、結腸直腸腫瘍、膵臓腫瘍、肺腫瘍、卵巣腫瘍、肝臓腫瘍、乳房腫瘍、腎臓腫瘍、前立腺腫瘍、胃腸腫瘍、メラノーマ、子宮頸部腫瘍、膀胱腫瘍、神経膠芽腫、および頭頸部腫瘍からなる群より選択される腫瘍である。一定の態様では、腫瘍が乳房腫瘍である。いくつかの態様では、腫瘍が卵巣腫瘍である。一定の態様では、腫瘍が肺腫瘍である。一定の態様では、腫瘍が膵臓腫瘍である。
本明細書に記載する方法のいずれかのいくつかの態様では、Wnt経路インヒビターがWnt結合作用物質である。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターがFZD結合作用物質である。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが抗体である。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが抗Wnt抗体である。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが抗FZD抗体である。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが抗体OMP-18R5である。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが可溶性受容体である。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターがFZD-Fc可溶性受容体である。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターがFZD8-Fc可溶性受容体である。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターがFZD8-Fc可溶性受容体OMP-54F28（イパフリセプト）である。
本明細書に記載する方法のいずれかのいくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、少なくとも1種のFrizzled（FZD）タンパク質またはそのフラグメントに特異的に結合する抗体である。いくつかの態様では、抗体が、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、およびFZD10からなる群より選択される少なくとも1種のヒトFZDタンパク質に特異的に結合する。いくつかの態様では、抗体が、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8からなる群より選択される少なくとも1種のヒトFZDタンパク質に特異的に結合する。いくつかの態様では、
Wnt経路インヒビターが、少なくとも1種のヒトFZDタンパク質に特異的に結合する抗体であり、該抗体は、（a）
Figure 2017526676
を含む重鎖CDR1、
Figure 2017526676
を含む重鎖CDR2、および
Figure 2017526676
を含む重鎖CDR3、ならびに（b）
Figure 2017526676
を含む軽鎖CDR1、DKSNRPSG（SEQ ID NO:11）を含む軽鎖CDR2、およびQSYANTLSL（SEQ ID NO:12）を含む軽鎖CDR3を含む。
本明細書に記載する方法のいずれかの一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、（a）
Figure 2017526676
を含む重鎖CDR1、
Figure 2017526676
を含む重鎖CDR2、および
Figure 2017526676
を含む重鎖CDR3、ならびに（b）
Figure 2017526676
を含む軽鎖CDR1、DKSNRPSG（SEQ ID NO:11）を含む軽鎖CDR2、およびQSYANTLSL（SEQ ID NO:12）を含む軽鎖CDR3を含む抗体であり、有糸分裂インヒビターと併用して時間差投薬様式で投与される。
本明細書に記載する方法のいずれかの一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、（a）
Figure 2017526676
を含む重鎖CDR1、
Figure 2017526676
を含む重鎖CDR2、および
Figure 2017526676
を含む重鎖CDR3、ならびに（b）
Figure 2017526676
を含む軽鎖CDR1、DKSNRPSG（SEQ ID NO:11）を含む軽鎖CDR2、およびQSYANTLSL（SEQ ID NO:12）を含む軽鎖CDR3を含む抗体であり、タキサンと併用して時間差投薬様式で投与される。
本明細書に記載する方法のいずれかの一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、（a）
Figure 2017526676
を含む重鎖CDR1、
Figure 2017526676
を含む重鎖CDR2、および
Figure 2017526676
を含む重鎖CDR3、ならびに（b）
Figure 2017526676
を含む軽鎖CDR1、DKSNRPSG（SEQ ID NO:11）を含む軽鎖CDR2、およびQSYANTLSL（SEQ ID NO:12）を含む軽鎖CDR3を含む抗体であり、パクリタキセル、nab-パクリタキセル、またはドセタキセルと併用して時間差投薬様式で投与される。
本明細書に記載する方法のいずれかの一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、SEQ ID NO:5を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO:6を含む軽鎖可変領域を含む抗体であり、有糸分裂インヒビターと併用して時間差投薬様式で投与される。
本明細書に記載する方法のいずれかの一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、SEQ ID NO:5を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO:6を含む軽鎖可変領域を含む抗体であり、タキサンと併用して時間差投薬様式で投与される。
本明細書に記載する方法のいずれかの一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、SEQ ID NO:5を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO:6を含む軽鎖可変領域を含む抗体であり、パクリタキセル、nab-パクリタキセル、またはドセタキセルと併用して時間差投薬様式で投与される。
いくつかの態様では、抗体が、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、または抗原結合部位を含む抗体フラグメントである。いくつかの態様では、抗体が単一特異性抗体または二重特異性抗体である。いくつかの態様では、抗体がIgG1抗体またはIgG2抗体である。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが抗体OMP-18R5（バンチクツマブ）である。
本明細書に記載する方法のいずれかの一定の態様では、Wnt経路インヒビターが可溶性受容体である。いくつかの態様では、可溶性受容体がヒトFZDタンパク質のFriドメインを含む。いくつかの態様では、ヒトFZDタンパク質のFriドメインが、FZD1のFriドメイン、FZD2のFriドメイン、FZD3のFriドメイン、FZD4のFriドメイン、FZD5のFriドメイン、FZD6のFriドメイン、FZD7のFriドメイン、FZD8のFriドメイン、FZD9のFriドメイン、またはFZD10のFriドメインを含む。いくつかの態様では、ヒトFZDタンパク質のFriドメインがFZD8のFriドメインを含む。いくつかの態様では、ヒトFZDタンパク質のFriドメインが、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、およびSEQ ID NO:23からなる群より選択される配列を含む。
本明細書に記載する方法のいずれかの一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、SEQ ID NO:20またはSEQ ID NO:21を含むFZD-Fc可溶性受容体であり、有糸分裂インヒビターと併用して時間差投薬様式で投与される。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、SEQ ID NO:20を含むFZD-Fc可溶性受容体である。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、SEQ ID NO:21を含むFZD-Fc可溶性受容体である。いくつかの態様では、有糸分裂インヒビターがタキサンである。いくつかの態様では、タキサンが、パクリタキセル、nab-パクリタキセル、またはドセタキセルである。
本明細書に記載する方法のいずれかの一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、SEQ ID NO:29またはSEQ ID NO:30を含むFZD-Fc可溶性受容体であり、有糸分裂インヒビターと併用して時間差投薬様式で投与される。いくつかの態様では、有糸分裂インヒビターがタキサンである。いくつかの態様では、タキサンが、パクリタキセル、nab-パクリタキセル、またはドセタキセルである。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、SEQ ID NO:29を含むFZD-Fc可溶性受容体であり、タキサンと併用して時間差投薬様式で投与される。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、SEQ ID N0:29を含むFZD-Fc可溶性受容体であり、パクリタキセル、nab-パクリタキセル、またはドセタキセルと併用して時間差投薬様式で投与される。
本発明は、さらに、Wnt経路インヒビターおよび／または有糸分裂インヒビターを含む組成物を提供する。いくつかの態様では、組成物が、本明細書に記載するWnt結合作用物質またはポリペプチドを含む。いくつかの態様では、組成物が、本明細書に記載するFZD結合作用物質またはポリペプチドを含む。いくつかの態様では、組成物が、本明細書に記載する有糸分裂インヒビターを含む。いくつかの態様では、組成物が、Wnt経路インヒビターおよび薬学的に許容されるビヒクルを含む薬学的組成物である。いくつかの態様では、組成物が、有糸分裂インヒビターおよび薬学的に許容されるビヒクルを含む薬学的組成物である。薬学的組成物は、腫瘍細胞成長の阻害、腫瘍サイズの低減、腫瘍退縮の誘発、およびヒト患者におけるがんの処置において用途を見いだす。いくつかの態様では、本明細書に記載するFZD結合作用物質が、有糸分裂インヒビターと併用したがんの処置用の薬剤の製造において用途を見いだす。いくつかの態様では、本明細書に記載するWnt結合作用物質が、有糸分裂インヒビターと併用したがんの処置用の薬剤の製造において用途を見いだす。
製剤を、治療剤を薬学的に許容される担体、賦形剤、および／または安定剤と、滅菌凍結乾燥粉末、水溶液などとして組み合わせることによって、保存および使用のために調製する（Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition, 2012, Pharmaceutical Press, London）。当業者は、一般に、薬学的に許容される担体、賦形剤、および／または安定剤を、製剤または薬学的組成物の不活性成分であると考える。
適切な担体、賦形剤、または安定剤は、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの非毒性緩衝剤；塩化ナトリウムなどの塩；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド；ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；3-ペンタノール；およびm-クレゾール）；低分子量ポリペプチド（約10アミノ酸残基未満など）；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；単糖、二糖、グルコース、マンノース、もしくはデキストリンなどの糖質；EDTAなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属複合体（例えばZnタンパク質複合体）；ならびに／またはポリソルバート（TWEEN）もしくはポリエチレングリコール（PEG）などの非イオン性界面活性剤を含む。
治療用製剤は、単位剤形であることができる。そのような製剤には、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、水もしくは非水性媒体中の溶液もしくは懸濁液、または、経口、非経口、もしくは直腸投与のため、もしくは吸入による投与のための坐剤が含まれる。錠剤などの固体組成物において、主要な活性成分は薬学的担体と混合されている。本明細書に記載する場合、薬学的担体は、製剤または組成物の不活性成分であると考えられる。従来の錠剤化成分には、コーンスターチ、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウムまたはガム、および、化合物またはその非毒性の薬学的に許容される塩の均一混合物を含有する固体の製剤前（pre-formulation）組成物を形成するための他の希釈剤（例えば水）が含まれる。次いで、固体の製剤前組成物を、上記のタイプの単位剤形に細分する。新規組成物の錠剤、丸剤などは、長期の作用の利点をもたらす剤形を提供するために、コーティングするかまたは他の形で調合することができる。例えば、錠剤または丸剤は、外部構成要素によって覆われた内部組成物を含むことができる。さらにまた、2つの構成要素を、崩壊に抵抗するように働き、内部組成物が無傷で胃を通過するかまたは放出が遅延されることを可能にする腸溶層によって分離することができる。いくつかのポリマー酸、ならびに、ポリマー酸とシェラック、セチルアルコール、および酢酸セルロースなどの材料との混合物を含むさまざまな材料を、そのような腸溶層またはコーティングのために使用することができる。
薬学的製剤は、リポソームと複合体化されたWnt経路インヒビターおよび／または有糸分裂インヒビターを含みうる。リポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびPEG誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（PEG-PE）を含む脂質組成物との逆相蒸発によって生成することができる。リポソームは、所望の直径を有するリポソームを生じるために、画定された孔サイズのフィルターを通して押し出し成形される。
Wnt経路インヒビターおよび／または有糸分裂インヒビターはまた、マイクロカプセルに封入することもできる。そのようなマイクロカプセルは、例えば、コアセルベーション技法によって、または界面重合、例えば、ヒトロキシメチルセルロースまたはゼラチン-マイクロカプセルおよびポリ-(メチルメタクリラート)マイクロカプセルによって、それぞれ、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition, 2012, Pharmaceutical Press, Londonに記載されているようなコロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）においてまたはマクロエマルジョンにおいて、調製される。
加えて、Wnt経路インヒビターおよび／または有糸分裂インヒビターを含む徐放性調製物を調製することができる。徐放性調製物の適切な例は、作用物質を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリクスを含み、該マトリクスは、成形物品（例えばフィルムまたはマイクロカプセル）の形態である。徐放性マトリクスの例には、ポリエステル、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリラート)またはポリ(ビニルアルコール)などのヒドロゲル、ポリラクチド、L-グルタミン酸および7エチル-L-グルタマートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOT（商標）（乳酸-グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドで構成されている注射可能なマイクロスフェア）などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、スクロースアセタートイソブチラート、およびポリ-D-(-)-3-ヒドロキシブチル酸が含まれる。
Wnt経路インヒビターおよび有糸分裂インヒビターは、公知の方法にしたがって、適当な薬学的組成物としてヒト患者に投与される。薬学的組成物は、局所処置または全身処置のいずれかのための任意の数のやり方で投与することができる。投与の適切な方法には、静脈内（ボーラスとしてのもしくはある期間にわたる連続注入による投与）、動脈内、筋肉内（注射もしくは注入）、腫瘍内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液包内、頭蓋内（例えばクモ膜下腔内もしくは脳室内）、または経口が含まれるが、それらに限定されるわけではない。加えて、投与は、局所（例えば、経皮貼付剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、坐剤、スプレー剤、液体および粉末剤）または肺（例えば、ネブライザーによるものを含む、粉末剤もしくはエアロゾルの吸入または吹送による；気管内、鼻内、表皮性および経皮）であることができる。
疾患の処置のために、有糸分裂インヒビターと併用するWnt経路インヒビターの適当な投薬量は、処置されるべき疾患のタイプ、疾患の重篤度および経過、疾患の応答性、インヒビターが治療目的で投与されるかまたは予防目的で投与されるか、事前の療法、患者の臨床歴などに依存し、すべてが処置する医師の自由裁量である。Wnt経路インヒビターは、一度にもしくは数日から数か月にわたる一連の処置として、または、治癒がもたらされるかもしくは疾患状態の減退が達成される（例えば腫瘍サイズの低減）まで投与することができる。有糸分裂インヒビターは、一度にもしくは数日から数か月にわたる一連の処置として、または、治癒がもたらされるかまたは疾患状態の減退が達成される（例えば腫瘍サイズの低減）まで投与することができる。各作用物質のための最適な投薬スケジュールは、患者の身体における薬物蓄積の測定値から算出することができ、個々の作用物質の相対的な効力に依存して変動することになる。投与する医師は、最適投薬量、投薬方法論、および反復率を決定することができる。
いくつかの態様では、併用投与が、単一の薬学的製剤における共投与を含む。いくつかの態様では、併用投与が、別個の製剤の使用、および、いずれかの順序であるが、一般にすべての活性作用物質がその生物学的活性を同時に発揮することができる期間内での連続的投与を含む。いくつかの態様では、併用投与が、別個の製剤の使用および時間差投薬レジメンを含む。いくつかの態様では、併用投与が、別個の製剤の使用および特定の順序での投与を含む。いくつかの態様では、併用投与が、別個の製剤の使用、ならびに、特定の順序および時間差投薬レジメンでの作用物質の投与を含む。例えば、いくつかの態様では、有糸分裂インヒビターが、Wnt経路インヒビターが投与された約1日、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、または約7日後に投与される。いくつかの態様では、有糸分裂インヒビターが、Wnt経路インヒビターが投与された約2日後に投与される。
一定の態様では、Wnt経路インヒビターの投薬量が、約0.01μg〜約100mg/kg体重、約0.1μg〜約100mg/kg体重、約1μg〜約100mg/kg体重、約1mg〜約100mg/kg体重、約1mg〜約80mg/kg体重、約10mg〜約100mg/kg体重、約10mg〜約75mg/kg体重、または約10mg〜約50mg/kg体重である。一定の態様では、Wnt経路インヒビターの投薬量が約0.1mg〜約20mg/kg体重である。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、約2mg/kg〜約10mg/kgの投薬量で対象に投与される。一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、毎日、毎週、毎月、または毎年、1回またはそれより多く投与される。一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、1週間に1回、2週間に1回、3週間に1回、または4週間に1回投与される。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、約2mg/kg〜約5mg/kgの投薬量で3週間ごとに投与される。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、約3mg/kg〜約7.5mg/kgの投薬量で4週間ごとに投与される。
一定の態様では、有糸分裂インヒビターの投薬量が、約20mg/m2〜約3000mg/m2、約20mg/m2〜約2000mg/m2、約20mg/m2〜約1000mg/m2、約20mg/m2〜約500mg/m2、または約20mg/m2〜約250mg/m2である。一定の態様では、有糸分裂インヒビターの投薬量が約20mg/m2〜約150mg/m2である。一定の態様では、有糸分裂インヒビターの投薬量が約50mg/m2である。一定の態様では、有糸分裂インヒビターの投薬量が約75mg/m2である。一定の態様では、有糸分裂インヒビターの投薬量が約90mg/m2である。一定の態様では、有糸分裂インヒビターの投薬量が約125mg/m2である。一定の態様では、有糸分裂インヒビターが、毎日、毎週、毎月、または毎年、1回またはそれより多く投与される。一定の態様では、有糸分裂インヒビターが、1日に2回またはそれより多く、1日に1回、2日ごとに1回、3日ごとに1回、4日ごとに1回、5日ごとに1回、1週間に1回、2週間に1回、3週間に1回、または4週間に1回投与される。いくつかの態様では、有糸分裂インヒビターが、標準治療の治療剤について確立された投薬スケジュールにしたがって投与される。
いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターおよび／または有糸分裂インヒビターが、その後に1回または複数回のより低い用量が続く、初回のより高い「負荷」用量で投与されうる。いくつかの態様では、投与の頻度もまた、変化しうる。いくつかの態様では、投薬レジメンが、その後に1週間に1回、2週間に1回、3週間に1回、または1か月ごとに1回の追加用量（または「維持」用量）が続く、初回用量の投与を含みうる。例えば、投薬レジメンは、その後に例えば初回用量の半分の毎週の維持用量が続く、初回負荷用量の投与を含みうる。または、投薬レジメンは、その後に例えば1週間おきの初回用量の半分の維持用量が続く、初回負荷用量の投与を含みうる。または、投薬レジメンは、その後に例えば1週間おきの同じ量の維持用量が続く、3週間にわたる3回の初回用量の投与を含みうる。
当業者に公知であるように、いずれの治療剤の投与も、副作用および／または毒性につながりうる。いくつかの場合には、副作用および/または毒性があまりに重篤であるために、治療有効用量での特定の作用物質の投与ができない。いくつかの場合には、薬物療法を中断しなければならず、他の作用物質が試されるかもしれない。しかし、同じ治療クラスの多くの作用物質は、類似する副作用および/または毒性を示すことが多く、患者は、治療を停止するか、またはもし可能であれば、治療剤に伴う不快な副作用を辛抱するかのいずれかでなければならないことになる。
本発明は、対象においてがんを処置する方法であって、2種以上の作用物質を投与するための投薬戦略を使用する工程を含み、それが、Wnt経路インヒビターおよび／または有糸分裂インヒビターの投与に伴う副作用および／または毒性を低減しうる方法を提供する。いくつかの態様では、ヒト対象においてがんを処置するための方法が、対象に、治療有効用量の有糸分裂インヒビターと併用して治療有効用量のWnt経路インヒビターを投与する工程を含み、ここで、インヒビターの1つまたは両方は、間欠的投薬戦略にしたがって投与される。いくつかの態様では、間欠的投薬戦略が、初回用量のWnt経路インヒビターを対象に投与する工程、および、後続用量のWnt経路インヒビターを約2週間に1回投与する工程を含む。いくつかの態様では、間欠的投薬戦略が、初回用量のWnt経路インヒビターを対象に投与する工程、および、後続用量のWnt経路インヒビターを約3週間に1回投与する工程を含む。いくつかの態様では、間欠的投薬戦略が、初回用量のWnt経路インヒビターを対象に投与する工程、および、後続用量のWnt経路インヒビターを約4週間に1回投与する工程を含む。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、間欠的投薬戦略を用いて投与され、有糸分裂インヒビターが、4週間サイクルのうち3週間にわたって毎週または1週間ごとに投与される。
2種以上の治療剤での併用療法は、異なる作用機序によって働く作用物質を使用することが多いが、これが必要なわけではない。異なる作用機序を有する作用物質を用いる併用療法は、相加効果または相乗効果をもたらしうる。併用療法では、各作用物質の用量を、単剤療法で使用される用量より低くすることが可能になり、それによって毒性の副作用が低減し、および／または作用物質の治療係数が増大しうる。併用療法では、耐性がん細胞が発生する可能性が減少しうる。いくつかの態様では、併用療法が、非腫瘍形成性細胞に影響を及ぼす（例えば阻害するまたは殺す）治療剤と、腫瘍形成性CSCに影響を及ぼす（例えば阻害するまたは殺す）治療剤とを含む。
いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターおよび有糸分裂インヒビターの併用が、相加的または相乗的な結果をもたらす。いくつかの態様では、併用療法が、Wnt経路インヒビターの治療係数の増大をもたらす。いくつかの態様では、併用療法が、有糸分裂インヒビターの治療係数の増大をもたらす。いくつかの態様では、併用療法が、Wnt経路インヒビターの毒性および／または副作用の減少をもたらす。いくつかの態様では、併用療法が、有糸分裂インヒビターの毒性および／または副作用の減少をもたらす。
処置する医師は、測定された滞留時間および体液または組織中の薬物の濃度に基づいて、投薬についての反復率を見積もることができる。治療の進捗は、従来の技法およびアッセイによってモニタリングすることができる。
一定の態様では、有糸分裂インヒビターと併用してWnt経路インヒビターを投与する工程に加えて、処置法が、Wnt経路インヒビターおよび／または有糸分裂インヒビターの投与の前に、それと並行して、および／またはその後に少なくとも1種の追加の治療剤を投与する工程を、さらに含みうる。
いくつかの態様では、追加の治療剤が、Wnt経路インヒビターまたは有糸分裂インヒビターと実質的に同時にまたは並行して投与されることになる。例えば、対象は、追加の治療剤（例えば追加の化学療法剤）での処置クールを受けながら、Wnt経路インヒビターおよび有糸分裂インヒビターを与えられうる。一定の態様では、Wnt経路インヒビターおよび有糸分裂インヒビターが、追加の治療剤での処置の1年以内に投与されることになる。一定の代替態様では、Wnt経路インヒビターおよび有糸分裂インヒビターが、追加の治療剤での任意の処置の10、8、6、4、または2か月以内に投与されることになる。一定の他の態様では、Wnt経路インヒビターおよび有糸分裂インヒビターが、追加の治療剤での任意の処置の4、3、2、または1週間以内に投与されることになる。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターおよび有糸分裂インヒビターが、追加の治療剤での任意の処置の5、4、3、2、または1日以内に投与されることになる。作用物質または処置が、Wnt経路インヒビターまたは有糸分裂インヒビターとほんの数時間または数分のうちに（すなわち実質的に同時に）対象に投与されうることが、さらに理解されるであろう。
有用なクラスの追加の治療（例えば抗がん）剤には、例えば、アウリスタチン、DNA副溝結合剤、DNA複製インヒビター、アルキル化剤（例えば、シスプラチン、一（白金）、二（白金）、および三核白金錯体、ならびにカルボプラチンなどの白金錯体）、アントラサイクリン、抗生物質、葉酸拮抗物質、代謝拮抗物質、化学療法増感剤、デュオカルマイシン、エトポシド、フッ化ピリミジン、イオノフォア、レキシトロプシン、ニトロソウレア、platinol、プリン代謝拮抗物質、ピューロマイシン、放射線増感剤、ステロイド、トポイソメラーゼインヒビターなどが含まれる。一定の態様では、追加の治療剤が、代謝拮抗物質、トポイソメラーゼインヒビター、または血管新生インヒビターである。
Wnt経路インヒビターおよび有糸分裂インヒビターと併用して投与されうる治療剤は、化学療法剤を含む。したがって、いくつかの態様では、方法または処置が、化学療法剤または複数の異なる化学療法剤のカクテルと併用したWnt経路インヒビターおよび有糸分裂インヒビターの投与を含む。Wnt経路インヒビターおよび有糸分裂インヒビターでの処置は、化学療法剤の投与の前に、それと並行して、またはその後に行うことができる。本発明により企図される化学療法剤は、当技術分野において公知であり、市販されている化学物質または薬物、例えば、ゲムシタビン、イリノテカン、ドキソルビシン、5-フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（「Ara-C」）、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン（cytoxin）、メトトレキサート、シスプラチン、メルファラン、およびカルボプラチンを含む。併用投与は、単一の薬学的製剤におけるかもしくは別個の製剤を用いるかのいずれかでの共投与、または、いずれかの順序であるが、一般にすべての活性作用物質がその生物学的活性を同時に発揮することができる期間内での連続的投与を含むことができる。そのような化学療法剤についての調製および投薬スケジュールは、製造者の説明書にしたがって、または熟練した医療実務者が経験的に決定するように使用することができる。そのような化学療法についての調製および投薬スケジュールは、Chemotherapy Service, 1992, M. C. Perry, Editor, Williams & Wilkins, Baltimore, MDにも記載されている。
本明細書に記載する方法において有用な化学療法剤にはまた、アルキル化剤、例えばチオテパおよびシクロホスファミド；アルキルスルホナート、例えばブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファン；アジリジン、例えばベンゾドパ（benzodopa）、カルボコン、メツレドパ（meturedopa）、およびウレドパ（uredopa）; アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、およびトリメチロールメラミンを含むエチレンイミンおよびメチラメラミン（methylamelamines）；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（cholophosphamide）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、例えばアクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウトラマイシン（authramycin）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン（carabicin）、カミノマイシン（caminomycin）、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（potfiromycin）、ピューロマイシン、クエラマイシン（quelamycin）、ロドルビシン（rodorubicin）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗物質、例えばメトトレキサートおよび5-フルオロウラシル（5-FU）；葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリン類似体、例えばフルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、5-FU；アンドロゲン、例えばカルステロン、ドロモスタノロンプロピオナート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎薬（antiadrenal）、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充薬、例えばフロリン酸（frolinic acid）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デフォファミン（defofamine）；デメコルチン；ジアジコン；エルフォルミチン（elformithine）；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；2-エチルヒドラジド；プロカルバジン；PSK.；ラゾキサン；シゾフラン（sizofuran）；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；2,2',2''-トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（gacytosine）；アラビノシド（「Ara-C」）；シクロホスファミド；チオテパ；クロラムブシル；ゲムシタビン；6-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、例えばシスプラチンおよびカルボプラチン；白金；エトポシド（VP-16）；イホスファミド；マイトマイシンC；ミトキサントロン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；xeloda；イバンドロナート；CPT11；トポイソメラーゼインヒビターRFS 2000；ジフルオロメチルオルニチン（DMFO）；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン；および上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体も含まれるが、それらに限定されるわけではない。化学療法剤にはまた、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性4(5)-イミダゾール、4-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、LY117018、オナプリストン、およびトレミフェンを例えば含む抗エストロゲン；ならびに、抗アンドロゲン、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリン；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体も含まれる。
一定の態様では、化学療法剤がトポイソメラーゼインヒビターである。トポイソメラーゼインヒビターは、トポイソメラーゼ酵素（例えばトポイソメラーゼIまたはII）の作用を妨害する化学療法剤である。トポイソメラーゼインヒビターには、ドキソルビシンHCl、クエン酸ダウノルビシン、ミトキサントロンHCl、アクチノマイシンD、エトポシド、トポテカンHCl、テニポシド（VM-26）、およびイリノテカンが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
一定の態様では、化学療法剤が代謝拮抗物質である。代謝拮抗物質は、正常な生化学反応に必要とされる代謝産物に類似しているが、細胞分裂などの1つまたは複数の正常な細胞の機能を妨害しうるほどに異なる構造を有する化学物質である。代謝拮抗物質には、ゲムシタビン、フルオロウラシル、カペシタビン、メトトレキサートナトリウム、ラリトレキセド（ralitrexed）、ペメトレキセド、テガフル、シトシンアラビノシド、チオグアニン、5-アザシチジン、6-メルカプトプリン、アザチオプリン、6-チオグアニン、ペントスタチン、リン酸フルダラビン、およびクラドリビン、ならびにこれらのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が含まれるが、それらに限定されるわけではない。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターおよび有糸分裂インヒビターが、ゲムシタビンと組み合わせて使用される。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターおよび有糸分裂インヒビターが、膵臓がんの処置のためにゲムシタビンと組み合わせて使用され、ここで、Wnt経路インヒビターはOMP-18R5であり、有糸分裂インヒビターはパクリタキセルまたはnab-パクリタキセル（ABRAXANE）である。
いくつかの態様では、処置が、1種または複数種のサイトカイン（例えばリンホカイン、インターロイキン、腫瘍壊死因子、および/または成長因子）の投与を含むことができるか、または、腫瘍もしくはがん細胞の外科的除去、または処置する医師が必要とみなす任意の他の療法を伴うことができる。
一定の態様では、処置が、放射線療法と併用したWnt経路インヒビターおよび有糸分裂インヒビターの投与を含む。Wnt経路インヒビターおよび有糸分裂インヒビターでの処置は、放射線療法の前に、それと並行して、またはその後に行うことができる。そのような放射線療法についての施行スケジュールは、熟練した医療実務者が決定することができる。
III．Wnt経路インヒビター
本発明は、特に有糸分裂インヒビターと併用した、腫瘍成長の阻害、腫瘍サイズの低減、またはがんの処置における使用のための、本明細書に記載するWnt経路インヒビターを含む方法を提供する。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、逐次または時間差投薬スケジュールにしたがって有糸分裂インヒビターと組み合わせて使用され、ここで、Wnt経路インヒビターは有糸分裂インヒビターの前に投与される。
一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、Wnt経路の1種または複数種の可溶性細胞外構成要素に結合する作用物質である。一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、Wnt経路の膜結合構成要素の1種または複数種の細胞外領域に結合する作用物質である。一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、Wnt経路の1種または複数種の可溶性細胞外構成要素を直接調整する作用物質である。一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、Wnt経路の膜結合構成要素の1種または複数種の細胞外領域を直接調整する作用物質である。
一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、1種または複数種のヒトfrizzledタンパク質（FZD）に結合する作用物質である。これらの作用物質を、本明細書において「FZD結合作用物質」と呼ぶ。いくつかの態様では、FZD結合作用物質が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10種のFZDタンパク質に特異的に結合する。いくつかの態様では、FZD結合作用物質が、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、およびFZD10からなる群より選択される1種または複数種のFZDタンパク質に結合する。一定の態様では、FZD結合作用物質が、1、2、3、4、5種、またはそれ以上のFZDタンパク質に結合する。いくつかの態様では、FZD結合作用物質が、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8からなる群より選択される1、2、3、4、または5種のFZDタンパク質に特異的に結合する。いくつかの態様では、FZD結合作用物質が、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、および/またはFZD8を含む1種または複数種のFZDタンパク質に結合する。一定の態様では、FZD結合作用物質が、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8に特異的に結合する。FZD結合作用物質の非限定的な例は、米国特許第7,982,013号に見いだすことができる。
一定の態様では、FZD結合作用物質がFZDアンタゴニストである。一定の態様では、FZD結合作用物質がWnt経路アンタゴニストである。一定の態様では、FZD結合作用物質がWntシグナル伝達を阻害する。いくつかの態様では、FZD結合作用物質が古典的Wntシグナル伝達を阻害する。いくつかの態様では、FZD結合作用物質が自己分泌Wntシグナル伝達を阻害する。いくつかの態様では、FZD結合作用物質が有糸分裂Wntシグナル伝達を阻害する。
いくつかの態様では、FZD結合作用物質が抗体である。いくつかの態様では、FZD結合作用物質がポリペプチドである。一定の態様では、FZD結合作用物質が、抗体または抗原結合部位を含むポリペプチドである。一定の態様では、本明細書に記載するFZD結合抗体またはポリペプチドの抗原結合部位が、1、2、3、4、5種、またはそれ以上のヒトFZDタンパク質に結合する能力を有する（または結合する）。一定の態様では、FZD結合抗体またはポリペプチドの抗原結合部位が、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、およびFZD10からなる群より選択される1、2、3、4、または5種のヒトFZDタンパク質に特異的に結合する能力を有する。いくつかの態様では、FZD結合作用物質が、1種より多いFZDタンパク質に特異的に結合する抗体である場合、それを「汎FZD抗体」と呼ぶことができる。
一定の態様では、FZD結合作用物質（例えば抗体）が、それが結合する1種または複数種のヒトFZDタンパク質の細胞外ドメイン（ECD）に特異的に結合する。一定の態様では、FZD結合作用物質が、それが結合するヒトFZDタンパク質のFriドメイン（システインリッチドメイン（CRD）としても知られている）に特異的に結合する。各ヒトFZDタンパク質のFriドメインの配列は、当技術分野において公知であり、SEQ ID NO:13（FZD1）、SEQ ID NO:14（FZD2）、SEQ ID NO:15（FZD3）、SEQ ID NO:16（FZD4）、SEQ ID NO:17（FZD5）、SEQ ID NO:18（FZD6）、SEQ ID NO:19（FZD7）、SEQ ID NO:20（FZD8）、SEQ ID NO:21（FZD8）、SEQ ID NO:22（FZD9）、およびSEQ ID NO:23（FZD10）として提供される。
いくつかの態様では、FZD結合作用物質が、少なくとも1種のヒトFZDタンパク質に、約1μM以下、約100nM以下、約40nM以下、約20nM以下、約10nM以下、約1nM以下、または約0.1nM以下の解離定数（KD）で結合する。いくつかの態様では、FZD結合作用物質が、少なくとも1種のFZDタンパク質に、約1nM以下のKDで結合する。いくつかの態様では、FZD結合作用物質が、少なくとも1種のFZDタンパク質に、約0.1nM以下のKDで結合する。一定の態様では、FZD結合作用物質が、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8のうちの1種または複数種（例えば1、2、3、4、または5種）のそれぞれに、約40nM以下のKDで結合する。一定の態様では、FZD結合作用物質が、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8のうちの1種または複数種のそれぞれに、約10nM以下のKDで結合する。一定の態様では、FZD結合作用物質が、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8のそれぞれに、約10nMのKDで結合する。いくつかの態様では、FZDタンパク質に対する結合作用物質（例えば抗体）のKDが、Biacoreチップ上に固定化されたFZD細胞外ドメインまたはFZD-Friドメインの少なくとも一部分を含むFZD-Fc融合タンパク質を使って決定されるKDである。
一定の態様では、FZD結合作用物質が、1種または複数種の（例えば2種以上、3種以上、または4種以上の）ヒトFZDタンパク質に、約1μM以下、約100nM以下、約40nM以下、約20nM以下、約10nM以下、または約1nM以下のEC50で結合する。一定の態様では、FZD結合作用物質が、1種より多いFZDタンパク質に、約40nM以下、約20nM以下、または約10nM以下のEC50で結合する。一定の態様では、FZD結合作用物質が、以下のFZDタンパク質：FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8のうちの1種または複数種（例えば1、2、3、4、または5種）に関して、約20nM以下のEC50を有する。一定の態様では、FZD結合作用物質が、以下のFZDタンパク質：FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8のうちの1種または複数種（例えば1、2、3、4、または5種）に関して、約10nM以下のEC50を有する。一定の態様では、FZD結合作用物質が、FZD5および/またはFZD8の結合に関して、約40nM以下または20nM以下のEC50を有する。
一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、抗体であるFZD結合作用物質である。いくつかの態様では、抗体が組換え抗体である。いくつかの態様では、抗体がモノクローナル抗体である。いくつかの態様では、抗体がキメラ抗体である。いくつかの態様では、抗体がヒト化抗体である。いくつかの態様では、抗体がヒト抗体である。一定の態様では、抗体がIgG1抗体である。一定の態様では、抗体がIgG2抗体である。一定の態様では、抗体が、抗原結合部位を含む抗体フラグメントである。いくつかの態様では、抗体が、一価、単一特異性、二価、二重特異性、または多重特異性である。いくつかの態様では、抗体が細胞傷害性部分にコンジュゲートされている。いくつかの態様では、抗体が単離されている。いくつかの態様では、抗体が実質的に純粋である。
FZD結合作用物質（例えば抗体）は、当技術分野において公知である任意の方法により、特異的結合についてアッセイすることができる。使用することができるイムノアッセイには、Biacore分析、FACS分析、免疫蛍光、免疫細胞化学、ウェスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ、ELISA、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線アッセイ、蛍光イムノアッセイ、およびプロテインAイムノアッセイなどの技法を用いる競合アッセイ系および非競合アッセイ系が含まれるが、それらに限定されるわけではない。そのようなアッセイは、当技術分野ではルーチンであり、周知である（例えばAusubel et al.編, 1994〜現在, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, NYを参照されたい）。
例えば、ヒトFZDタンパク質に対する作用物質の特異的結合は、ELISAを用いて決定されうる。ELISAアッセイは、抗原（例えばFZDタンパク質またはそのフラグメント）を調製する工程、96ウェルマイクロタイタープレートのウェルを抗原でコーティングする工程、ウェルに、酵素基質（例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）などの検出可能な化合物にコンジュゲートされたFZD結合作用物質（例えば抗体）を添加する工程、ある期間にわたってインキュベートする工程、および抗原に結合したFZD結合作用物質の存在を検出する工程を含む。いくつかの態様では、FZD結合作用物質が、検出可能な化合物にコンジュゲートされていないが、その代わりに、FZD結合作用物質を認識する、検出可能な化合物にコンジュゲートされた第2の抗体がウェルに添加される。いくつかの態様では、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、FZD結合作用物質をウェルにコーティングすることができ、検出可能な化合物にコンジュゲートされた第2の抗体を、コーティングされたウェルへの抗原の添加後に、添加することができる。当業者は、検出されるシグナルを増大させるために変更することができるパラメータ、および使用されうるELISAの他のバリエーションについて熟知しているであろう。
別の例において、ヒトFZDタンパク質に対する作用物質の特異的結合は、FACSを用いて決定されうる。FACSスクリーニングアッセイは、抗原を融合タンパク質（例えばFZD-CD4TM融合タンパク質）として発現させるcDNAコンストラクトを生成させる工程、コンストラクトを細胞中にトランスフェクトする工程、抗原を細胞の表面上に発現させる工程、FZD結合作用物質をトランスフェクト細胞と混合する工程、およびある期間にわたってインキュベートする工程を含みうる。FZD結合作用物質が結合した細胞は、検出可能な化合物にコンジュゲートされた二次抗体（例えばPEコンジュゲート抗Fc抗体）およびフローサイトメーターを用いて同定されうる。当業者は、検出されるシグナルを最適化するために変更することができるパラメータ、およびスクリーニング（例えば遮断抗体のスクリーニング）を強化しうるFACSの他のバリエーションについて熟知しているであろう。
抗原（例えばFZDタンパク質）に対するFZD結合作用物質の結合親和性および結合作用物質-抗原相互作用のオフ速度は、競合結合アッセイによって決定することができる。競合結合アッセイの1つの例において、ラジオイムノアッセイは、標識抗原（例えば3Hまたは125Iで標識されたFZDタンパク質）またはそのフラグメントもしくは変異体と関心対象の結合作用物質との、増加する量の非標識抗原の存在下でのインキュベーション、およびその後の、標識抗原に結合した作用物質の検出を含む。抗原に対する作用物質の親和性および結合オフ速度は、データからスキャッチャードプロット解析によって決定することができる。いくつかの態様では、Biacore速度論解析が、FZD結合作用物質の結合オン速度および結合オフ速度を決定するために使用される。Biacore速度論解析は、表面上に固定化抗原を有するチップから、FZD結合作用物質の結合および解離を解析する工程を含む。
一定の態様では、本明細書に記載する方法が、少なくとも1種のヒトFZDタンパク質に特異的に結合する抗体であるWnt経路インヒビターを含む。いくつかの態様では、抗体が、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、およびFZD10からなる群より選択される少なくとも1種のヒトFZDタンパク質に特異的に結合する。いくつかの態様では、抗体が、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8からなる群より選択される少なくとも1種のヒトFZDタンパク質に特異的に結合する。いくつかの態様では、抗体が、
Figure 2017526676
を含む重鎖CDR1、
Figure 2017526676
を含む重鎖CDR2、および
Figure 2017526676
を含む重鎖CDR3を含む。いくつかの態様では、抗体が、さらに、
Figure 2017526676
を含む軽鎖CDR1、DKSNRPSG（SEQ ID NO:11）を含む軽鎖CDR2、およびQSYANTLSL（SEQ ID NO:12）を含む軽鎖CDR3を含む。いくつかの態様では、抗体が、
Figure 2017526676
を含む軽鎖CDR1、DKSNRPSG（SEQ ID NO:11）を含む軽鎖CDR2、およびQSYANTLSL（SEQ ID NO:12）を含む軽鎖CDR3を含む。一定の態様では、抗体が、（a）
Figure 2017526676
を含む重鎖CDR1、
Figure 2017526676
を含む重鎖CDR2、および
Figure 2017526676
を含む重鎖CDR3、ならびに（b）
Figure 2017526676
を含む軽鎖CDR1、DKSNRPSG（SEQ ID NO:11）を含む軽鎖CDR2、およびQSYANTLSL（SEQ ID NO:12）を含む軽鎖CDR3を含む。
一定の態様では、本明細書に記載する方法が、（a）
Figure 2017526676
を含む重鎖CDR1、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換を含むその変異体；（b）
Figure 2017526676
を含む重鎖CDR2、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換を含むその変異体；（c）
Figure 2017526676
を含む重鎖CDR3、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換を含むその変異体；（d）
Figure 2017526676
を含む軽鎖CDR1、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換を含むその変異体；（e）DKSNRPSG（SEQ ID NO:11）を含む軽鎖CDR2、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換を含むその変異体；および（f）QSYANTLSL（SEQ ID NO:12）を含む軽鎖CDR3、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換を含むその変異体を含む抗体である、FZD結合作用物質を含む。一定の態様では、アミノ酸置換が保存的置換である。
一定の態様では、本明細書に記載する方法が、SEQ ID NO:5に対して少なくとも約80％の配列同一性を有する重鎖可変領域、および／またはSEQ ID NO:6に対して少なくとも80％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む抗体である、FZD結合作用物質を含む。一定の態様では、抗体が、SEQ ID NO:5に対して少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む。一定の態様では、抗体が、SEQ ID NO:6に対して少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。一定の態様では、抗体が、SEQ ID NO:5に対して少なくとも約95％の配列同一性を有する重鎖可変領域、および／またはSEQ ID NO:6に対して少なくとも約95％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。一定の態様では、抗体が、SEQ ID NO:5を含む重鎖可変領域、および／またはSEQ ID NO:6を含む軽鎖可変領域を含む。一定の態様では、抗体が、SEQ ID NO:5から本質的になる重鎖可変領域、およびSEQ ID NO:6から本質的になる軽鎖可変領域を含む。
一定の態様では、本明細書に記載する方法が、（a）SEQ ID NO:1もしくはSEQ ID NO:3に対して少なくとも90％の配列同一性を有する重鎖、および／または（b）SEQ ID NO:2もしくはSEQ ID NO:4に対して少なくとも90％の配列同一性を有する軽鎖を含む抗体である、FZD結合作用物質を含む。いくつかの態様では、抗体が、（a）SEQ ID NO:1もしくはSEQ ID NO:3に対して少なくとも95％の配列同一性を有する重鎖、および／または（b）SEQ ID NO:2もしくはSEQ ID NO:4に対して少なくとも95％の配列同一性を有する軽鎖を含む。いくつかの態様では、抗体が、SEQ ID NO:1もしくはSEQ ID NO:3を含む重鎖、および／またはSEQ ID NO:2もしくはSEQ ID NO:4を含む軽鎖を含む。いくつかの態様では、抗体が、SEQ ID NO:1のアミノ酸20〜463を含む重鎖、およびSEQ ID NO:2のアミノ酸20〜232を含む軽鎖を含む。いくつかの態様では、抗体が、SEQ ID NO:3を含む重鎖、およびSEQ ID NO:4を含む軽鎖を含む。いくつかの態様では、抗体が、SEQ ID NO:1のアミノ酸20〜463から本質的になる重鎖、およびSEQ ID NO:2のアミノ酸20〜232から本質的になる軽鎖を含む。いくつかの態様では、抗体が、SEQ ID NO:3から本質的になる重鎖、およびSEQ ID NO:4から本質的になる軽鎖を含む。
一定の態様では、本明細書に記載する方法が、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、および／またはFZD8のうちの少なくとも1種に特異的に結合するFZD結合作用物質（例えば抗体）であるWnt経路インヒビターを含み、該FZD結合作用物質（例えば抗体）は、抗体OMP-18R5のCDRのうちの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、および／または6つを含む。抗体OMP-18R5（バンチクツマブとしても知られている）および他のFZD結合作用物質は、米国特許第7,982,013号に以前に記載されている。18R5 IgG2抗体の重鎖および軽鎖をコードするDNAは、2008年9月29日にブタペスト条約の条件下でATCCに寄託され、ATCC寄託指定番号PTA-9541が割り当てられた。いくつかの態様では、FZD結合作用物質が、OMP-18R5のCDRのうちの1つ以上、OMP-18R5のCDRのうちの2つ以上、OMP-18R5のCDRのうちの3つ以上、OMP-18R5のCDRのうちの4つ以上、OMP-18R5のCDRのうちの5つ以上、またはOMP-18R5のCDRの6つすべてを含む。
いくつかの態様では、本明細書に記載する方法が、Wnt経路インヒビターであるポリペプチドを含む。ポリペプチドには、ヒトFZDタンパク質またはそのフラグメントに特異的に結合する抗体が含まれるが、それらに限定されるわけではない。いくつかの態様では、ポリペプチドが、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、およびFZD10からなる群より選択される1種または複数種のFZDタンパク質またはそのフラグメントに結合する。いくつかの態様では、ポリペプチドが、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、および／またはFZD8に結合する。いくつかの態様では、ポリペプチドが、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8に結合する。
一定の態様では、ポリペプチドが、抗体OMP-18R5のCDRのうちの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、および／または6つを含む。いくつかの態様では、ポリペプチドが、CDRあたり4個まで（すなわち0、1、2、3、または4個）のアミノ酸置換を有するCDRを含む。一定の態様では、重鎖CDRが重鎖可変領域内に含有される。一定の態様では、軽鎖CDRが軽鎖可変領域内に含有される。
いくつかの態様では、本明細書に記載する方法が、1種または複数種のヒトFZDタンパク質に特異的に結合するポリペプチドを含み、該ポリペプチドは、SEQ ID NO:5に対して少なくとも約80％の配列同一性を有するアミノ酸配列、および/またはSEQ ID NO:6に対して少なくとも約80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一定の態様では、ポリペプチドが、SEQ ID NO:5に対して少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一定の態様では、ポリペプチドが、SEQ ID NO:6に対して少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一定の態様では、ポリペプチドが、SEQ ID NO:5に対して少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列、および/またはSEQ ID NO:6に対して少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一定の態様では、ポリペプチドが、SEQ ID NO:5を含むアミノ酸配列、および/またはSEQ ID NO:6を含むアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、FZD結合作用物質が、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、およびSEQ ID NO:6からなる群より選択される配列を含むポリペプチドを含む。
一定の態様では、FZD結合作用物質が、OMP-18R5抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。一定の態様では、FZD結合作用物質が、OMP-18R5抗体の重鎖および軽鎖（リーダー配列ありまたはリーダー配列なし）を含む。
一定の態様では、FZD結合作用物質が、抗体OMP-18R5（バンチクツマブ）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。
一定の態様では、FZD結合作用物質（例えば抗体）が、1種または複数種のヒトFZDタンパク質への特異的結合について、SEQ ID NO:5を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO:6を含む軽鎖可変領域を含む抗体と競合する。一定の態様では、FZD結合作用物質（例えば抗体）が、1種または複数種のヒトFZDタンパク質への特異的結合について、SEQ ID NO:1を含む重鎖（シグナル配列ありまたはシグナル配列なし）およびSEQ ID NO:2を含む軽鎖可変領域（シグナル配列ありまたはシグナル配列なし）を含む抗体と競合する。一定の態様では、FZD結合作用物質（例えば抗体）が、1種または複数種のヒトFZDタンパク質への特異的結合について、SEQ ID NO:3を含む重鎖およびSEQ ID NO:4を含む軽鎖可変領域を含む抗体と競合する。一定の態様では、FZD結合作用物質が、1種または複数種のヒトFZDタンパク質への特異的結合について、抗体OMP-18R5と競合する。いくつかの態様では、FZD結合作用物質または抗体が、インビトロ競合結合アッセイにおいて、1種または複数種のヒトFZDタンパク質への特異的結合について、抗体OMP-18R5と競合する。
一定の態様では、FZD結合作用物質（例えば抗体）が、本発明の抗体と同じ、または本質的に同じ、1種または複数種のヒトFZDタンパク質上のエピトープに結合する。別の態様において、FZD結合作用物質は、本発明の抗体が結合するFZDタンパク質上のエピトープとオーバーラップする、1種または複数種のヒトFZDタンパク質上のエピトープに結合する抗体である。一定の態様では、FZD結合作用物質（例えば抗体）が、抗体OMP-18R5と同じ、または本質的に同じ、1種または複数種のFZDタンパク質上のエピトープに結合する。別の態様において、FZD結合作用物質は、抗体OMP-18R5が結合するFZDタンパク質上のエピトープとオーバーラップする、1種または複数種のヒトFZDタンパク質上のエピトープに結合する抗体である。
一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、1種または複数種のヒトWntタンパク質に結合する作用物質である。これらの作用物質は、本明細書において、「Wnt結合作用物質」と称する。一定の態様では、作用物質が1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10種、またはそれ以上のWntタンパク質に特異的に結合する。いくつかの態様では、Wnt結合作用物質が、Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、およびWnt16からなる群より選択される1種または複数種のヒトWntタンパク質に結合する。一定の態様では、Wnt結合作用物質が、Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a、およびWnt10bからなる群より選択される1種または複数種の（または2種以上、3種以上、4種以上、5種以上などの）Wntタンパク質に結合する。一定の態様では、1種または複数種の（または2種以上、3種以上、4種以上、5種以上などの）Wntタンパク質が、Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a、およびWnt10bからなる群より選択される。
一定の態様では、Wnt結合作用物質がWntアンタゴニストである。一定の態様では、Wnt結合作用物質がWnt経路アンタゴニストである。一定の態様では、Wnt結合作用物質がWntシグナル伝達を阻害する。いくつかの態様では、Wnt結合作用物質が古典的Wntシグナル伝達を阻害する。いくつかの態様では、Wnt結合作用物質は、自己分泌Wntシグナル伝達を阻害する。いくつかの態様では、Wnt結合作用物質は、有糸分裂Wntシグナル伝達を阻害する。
一定の態様では、Wnt結合作用物質が、1種または複数種の（例えば2種以上、3種以上、または4種以上の）Wntタンパク質に、約1μM以下、約100nM以下、約40nM以下、約20nM以下、または約10nM以下のKDで結合する。例えば、一定の態様では、2種以上のWntタンパク質に結合する本明細書に記載のWnt結合作用物質が、それらWntタンパク質に、約100nM以下、約20nM以下、または約10nM以下のKDで結合する。一定の態様では、Wnt結合作用物質が、1種または複数種（例えば1、2、3、4、または5種）のWntタンパク質のそれぞれに、約40nM以下のKDで結合し、ここで、Wntタンパク質は、Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a、およびWnt10bからなる群より選択される。いくつかの態様では、Wntタンパク質に対する結合作用物質（例えば抗体）のKDが、Biacoreチップ上に固定化されたWnt C末端システインリッチドメインの少なくとも一部分を含むWnt融合タンパク質を使って決定されるKDである。
一定の態様では、Wnt結合作用物質が、1種または複数種の（例えば2種以上、3種以上、または4種以上の）ヒトWntタンパク質に、約1μM以下、約100nM以下、約40nM以下、約20nM以下、約10nM以下、または約1nM以下のEC50で結合する。一定の態様では、Wnt結合作用物質が、2種以上のWntに、約40nM以下、約20nM以下、または約10nM以下のEC50で結合する。一定の態様では、Wnt結合作用物質が、Wntタンパク質Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、および/またはWnt16のうちの1種または複数種（例えば1、2、3、4、または5種）に関して、約20nM以下のEC50を有する。一定の態様では、Wnt結合作用物質が、以下のWntタンパク質のうちの1種または複数種（例えば1、2、3、4、または5種）に関して、約10nM以下のEC50を有する:Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a、および/またはWnt10b。
本明細書に記載する方法において使用されるWnt結合作用物質（例えば抗体または可溶性受容体）は、当技術分野において公知である任意の方法により、特異的結合についてアッセイすることができる。使用することができるイムノアッセイには、Biacore分析、FACS分析、免疫蛍光、免疫細胞化学、ウェスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ、ELISA、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線アッセイ、蛍光イムノアッセイ、およびプロテインAイムノアッセイなどの技法を用いる競合アッセイ系および非競合アッセイ系が含まれるが、それらに限定されるわけではない。そのようなアッセイは、当技術分野ではルーチンであり、周知である（例えばAusubel et al.編, 1994〜現在, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, NYを参照されたい）。
例えば、ヒトWntタンパク質に対するWnt結合作用物質の特異的結合は、ELISAを用いて決定されうる。ELISAアッセイは、抗原（例えばWntタンパク質またはそのフラグメント）を調製する工程、96ウェルマイクロタイタープレートのウェルを抗原でコーティングする工程、ウェルに、酵素基質（例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）などの検出可能な化合物にコンジュゲートされたWnt結合作用物質（例えば抗体または可溶性受容体）を添加する工程、ある期間にわたってインキュベートする工程、および抗原に結合したWnt結合作用物質の存在を検出する工程を含む。いくつかの態様では、Wnt結合作用物質が、検出可能な化合物にコンジュゲートされていないが、その代わりに、Wnt結合作用物質を認識する、検出可能な化合物にコンジュゲートされた第2の抗体がウェルに添加される。いくつかの態様では、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、Wnt結合作用物質をウェルにコーティングすることができ、検出可能な化合物にコンジュゲートされた第2の抗体を、コーティングされたウェルへの抗原の添加後に、添加することができる。当業者は、検出されるシグナルを増大させるために変更することができるパラメータ、および使用されうるELISAの他のバリエーションについて熟知しているであろう。
別の例において、ヒトWntタンパク質に対するWnt結合作用物質の特異的結合は、FACSを用いて決定されうる。FACSスクリーニングアッセイは、抗原を融合タンパク質として発現させるcDNAコンストラクトを生成させる工程、コンストラクトを細胞中にトランスフェクトする工程、抗原を細胞の表面上に発現させる工程、Wnt結合作用物質をトランスフェクト細胞と混合する工程、およびある期間にわたってインキュベートする工程を含みうる。Wnt結合作用物質が結合した細胞は、検出可能な化合物にコンジュゲートされた二次抗体（例えばPEコンジュゲート抗Fc抗体）およびフローサイトメーターを用いて同定されうる。当業者は、検出されるシグナルを最適化するために変更することができるパラメータ、およびスクリーニングを強化しうるFACSの他のバリエーションについて熟知しているであろう。
抗原（例えばWntタンパク質）に対するWnt結合作用物質の結合親和性および結合作用物質-抗原相互作用のオフ速度は、FZD結合作用物質について上述したもののような競合結合アッセイによって決定することができる。
一定の態様では、Wnt結合作用物質が可溶性受容体である。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが可溶性受容体である。一定の態様では、可溶性受容体がFZD受容体タンパク質の細胞外ドメインを含む。いくつかの態様では、可溶性受容体がFZDタンパク質のFriドメインを含む。いくつかの態様では、FZD Friドメインを含む可溶性受容体が、FZD細胞外ドメイン全体を含む可溶性受容体と比較して、改変された生物学的活性（例えば増加したタンパク質半減期）を示すことができる。タンパク質半減期は、ポリエチレングリコール（PEG）またはポリエチレンオキシド（PEO）での共有結合修飾によって、さらに増加させることができる。一定の態様では、FZDタンパク質がヒトFZDタンパク質である。一定の態様では、ヒトFZDタンパク質が、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、またはFZD10である。可溶性FZD受容体の非限定的な例は、米国特許第7,723,477号および同第7,947,277号、ならびに国際公開公報第2011/088123号に見いだすことができる。
ヒトFZD1〜10タンパク質のそれぞれの予測Friドメインを、SEQ ID NO:13〜23として提供する。さまざまなFriドメインに対応する正確なアミノ酸の理解において、当業者が意見を異にする可能性がある。したがって、上記および本明細書において概説するドメインのN末端および/またはC末端は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、またはさらには10アミノ酸分、伸長または短縮する可能性がある。
一定の態様では、可溶性受容体が、ヒトFZDタンパク質のFriドメイン、または、1種もしくは複数種のヒトWntタンパク質に結合するFriドメインのフラグメントもしくは変異体を含む。一定の態様では、ヒトFZDタンパク質が、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、またはFZD10である。一定の態様では、ヒトFZDタンパク質がFZD8である。一定の態様では、FZDタンパク質がFZD8であり、Wnt結合作用物質がSEQ ID NO:20を含む。一定の態様では、FZDタンパク質がFZD8であり、Wnt結合作用物質がSEQ ID NO:21を含む。
いくつかの態様では、可溶性受容体が、FZD1のFriドメイン、FZD2のFriドメイン、FZD3のFriドメイン、FZD4のFriドメイン、FZD5のFriドメイン、FZD6のFriドメイン、FZD7のFriドメイン、FZD8のFriドメイン、FZD9のFriドメイン、またはFZD10のFriドメインから本質的になるFriドメインを含む。いくつかの態様では、可溶性受容体が、FZD8のFriドメインから本質的になるFriドメインを含む。
いくつかの態様では、可溶性受容体が、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、およびSEQ ID NO:23からなる群より選択される配列を含む。いくつかの態様では、可溶性受容体が、SEQ ID NO:20を含むFriドメインを含む。いくつかの態様では、可溶性受容体が、SEQ ID NO:21を含むFriドメインを含む。いくつかの態様では、可溶性受容体が、SEQ ID NO:20から本質的になるFriドメインを含む。いくつかの態様では、可溶性受容体が、SEQ ID NO:21から本質的になるFriドメインを含む。
一定の態様では、可溶性受容体が、1個または複数個（例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個など）の保存的置換を含み、Wntタンパク質に結合する能力を有する、前述のFZD Friドメイン配列のいずれか1つの変異体を含む。
一定の態様では、可溶性受容体、例えばヒトFZD受容体のFriドメインを含む作用物質が、非FZD（例えば異種）ポリペプチドをさらに含む。いくつかの態様では、可溶性受容体が、ヒトFc領域、少なくとも1つのタンパク質タグ（例えばmyc、FLAG、GST、GFP）、他の内在性タンパク質もしくはタンパク質フラグメント、または、FZD ECDもしくはFriドメインと第2のポリペプチドとの間の任意のリンカー領域を含む任意の他の有用タンパク質配列を含むがそれらに限定されるわけではない、他の非FZDの機能および構造ポリペプチドに連結された、FZD ECDまたはFriドメインを含みうる。一定の態様では、非FZDポリペプチドがヒトFc領域を含む。Fc領域は、免疫グロブリンのクラス、IgG、IgA、IgM、IgD、およびIgEのいずれかから得ることができる。いくつかの態様では、Fc領域がヒトIgG1 Fc領域である。いくつかの態様では、Fc領域がヒトIgG2 Fc領域である。いくつかの態様では、Fc領域が野生型Fc領域である。いくつかの態様では、Fc領域が変異型Fc領域である。いくつかの態様では、Fc領域が、N末端側で1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10アミノ酸分（例えばヒンジドメインにおいて）切り詰められる。いくつかの態様では、望ましくないジスルフィド結合形成を妨げるために、ヒンジドメイン中のアミノ酸が変更される。いくつかの態様では、望ましくないジスルフィド結合形成を妨げるために、システインがセリンで置き換えられる。いくつかの態様では、Fc領域が、C末端側で1、2、3アミノ酸分またはそれ以上、切り詰められる。いくつかの態様では、Fc領域が、C末端側で1アミノ酸分切り詰められる。一定の態様では、非FZDポリペプチドが、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、またはSEQ ID NO:28を含む。一定の態様では、非FZDポリペプチドが、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、またはSEQ ID NO:28から本質的になる。一定の態様では、非FZDポリペプチドがSEQ ID NO:27を含む。一定の態様では、非FZDポリペプチドがSEQ ID NO:27から本質的になる。
一定の態様では、可溶性受容体が、FZD受容体の少なくとも最小FriドメインとFc領域とを含む融合タンパク質である。本明細書において使用する場合、「融合タンパク質」とは、少なくとも2種の遺伝子のヌクレオチド配列を含む核酸分子によって発現されるハイブリッドタンパク質である。いくつかの態様では、第1ポリペプチドのC末端が、免疫グロブリンFc領域のN末端に連結される。いくつかの態様では、第1ポリペプチド（例えばFZD Friドメイン）が、Fc領域に直接（すなわち介在ペプチドリンカーなしで）連結される。いくつかの態様では、第1ポリペプチドがリンカーを介してFc領域に連結される。
本明細書において使用する場合、「リンカー」という用語は、第1ポリペプチド（例えばFZD構成要素）と第2ポリペプチド（例えばFc領域）との間に挿入されるリンカーを指す。いくつかの態様では、リンカーがペプチドリンカーである。リンカーは、ポリペプチドの発現、分泌、または生物活性に有害な影響を及ぼしてはならない。リンカーは、抗原性であってはならず、免疫応答を誘発してはならない。適切なリンカーは、当業者に公知であり、グリシン残基とセリン残基との混合物を含むことが多く、立体的に妨げられていないアミノ酸を含むことが多い。有用なリンカー中に組み込むことができる他のアミノ酸には、スレオニン残基およびアラニン残基が含まれる。リンカーは、長さが、例えば1〜50アミノ酸長、1〜22アミノ酸長、1〜10アミノ酸長、1〜5アミノ酸長、または1〜3アミノ酸長の範囲にわたることができる。本明細書において使用する場合、「リンカー」は、第1ポリペプチド（例えばFZD Friドメイン）のC末端または第2ポリペプチド（例えばFc領域）のN末端のいずれ由来のアミノ酸残基も含まない、介在ペプチド配列である。
いくつかの態様では、可溶性受容体が、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、またはSEQ ID NO:23を含む第1ポリペプチドと、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、またはSEQ ID NO:28を含む第2ポリペプチドとを含み、ここで、第1ポリペプチドは第2ポリペプチドに直接連結されている。いくつかの態様では、可溶性受容体が、SEQ ID NO:20を含む第1ポリペプチドと、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、またはSEQ ID NO:28を含む第2ポリペプチドとを含む。いくつかの態様では、可溶性受容体が、SEQ ID NO:20を含む第1ポリペプチドと、SEQ ID NO:27を含む第2ポリペプチドとを含む。いくつかの態様では、可溶性受容体が、SEQ ID NO:20から本質的になる第1ポリペプチドと、SEQ ID NO:27から本質的になる第2ポリペプチドとを含む。いくつかの態様では、可溶性受容体が、SEQ ID NO:21を含む第1ポリペプチドと、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、またはSEQ ID NO:28を含む第2ポリペプチドとを含む。いくつかの態様では、可溶性受容体が、SEQ ID NO:21を含む第1ポリペプチドと、SEQ ID NO:27を含む第2ポリペプチドとを含む。いくつかの態様では、可溶性受容体が、SEQ ID NO:21から本質的になる第1ポリペプチドと、SEQ ID NO:27から本質的になる第2ポリペプチドとを含む。
いくつかの態様では、可溶性受容体が、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、またはSEQ ID NO:23を含む第1ポリペプチドと、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、またはSEQ ID NO:28を含む第2ポリペプチドとを含み、ここで、第1ポリペプチドはリンカーによって第2ポリペプチドに接続されている。いくつかの態様では、可溶性受容体が、SEQ ID NO:20を含む第1ポリペプチドと、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、またはSEQ ID NO:28を含む第2ポリペプチドとを含み、ここで、第1ポリペプチドはリンカーによって第2ポリペプチドに接続されている。いくつかの態様では、可溶性受容体が、SEQ ID NO:20を含む第1ポリペプチドと、SEQ ID NO:27を含む第2ポリペプチドとを含み、ここで、第1ポリペプチドはリンカーによって第2ポリペプチドに接続されている。いくつかの態様では、可溶性受容体が、SEQ ID NO:20から本質的になる第1ポリペプチドと、SEQ ID NO:27から本質的になる第2ポリペプチドとを含み、ここで、第1ポリペプチドはリンカーによって第2ポリペプチドに接続されている。いくつかの態様では、可溶性受容体が、SEQ ID NO:21を含む第1ポリペプチドと、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、またはSEQ ID NO:28を含む第2ポリペプチドとを含み、ここで、第1ポリペプチドはリンカーによって第2ポリペプチドに接続されている。いくつかの態様では、可溶性受容体が、SEQ ID NO:21を含む第1ポリペプチドと、SEQ ID NO:27を含む第2ポリペプチドとを含み、ここで、第1ポリペプチドはリンカーによって第2ポリペプチドに接続されている。いくつかの態様では、可溶性受容体が、SEQ ID NO:21から本質的になる第1ポリペプチドと、SEQ ID NO:27から本質的になる第2ポリペプチドとを含み、ここで、第1ポリペプチドはリンカーによって第2ポリペプチドに接続されている。
いくつかの態様では、可溶性受容体が、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、またはSEQ ID NO:23に対して少なくとも95％同一である第1ポリペプチドと、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、またはSEQ ID NO:28を含む第2ポリペプチドとを含み、ここで、第1ポリペプチドは第2ポリペプチドに直接連結されている。いくつかの態様では、可溶性受容体が、SEQ ID NO:20に対して少なくとも95％同一である第1ポリペプチドと、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、またはSEQ ID NO:28を含む第2ポリペプチドとを含む。いくつかの態様では、可溶性受容体が、SEQ ID NO:21に対して少なくとも95％同一である第1ポリペプチドと、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、またはSEQ ID NO:28を含む第2ポリペプチドとを含む。
いくつかの態様では、可溶性受容体が、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、またはSEQ ID NO:23に対して少なくとも95％同一である第1ポリペプチドと、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、またはSEQ ID NO:28を含む第2ポリペプチドとを含み、ここで、第1ポリペプチドはリンカーによって第2ポリペプチドに接続されている。いくつかの態様では、可溶性受容体が、SEQ ID NO:20に対して少なくとも95％同一である第1ポリペプチドと、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、またはSEQ ID NO:28を含む第2ポリペプチドとを含み、ここで、第1ポリペプチドはリンカーによって第2ポリペプチドに接続されている。いくつかの態様では、可溶性受容体が、SEQ ID NO:21に対して少なくとも95％同一である第1ポリペプチドと、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、またはSEQ ID NO:28を含む第2ポリペプチドとを含み、ここで、第1ポリペプチドはリンカーによって第2ポリペプチドに接続されている。
FZDタンパク質は、タンパク質の輸送を指示するシグナル配列を含有する。シグナル配列（シグナルペプチドまたはリーダー配列ともいう）は通常、新生ポリペプチドのN末端に位置する。それらはポリペプチドを小胞体に向かわせ、タンパク質はそれぞれの行き先に、例えば細胞小器官の内部空間、内膜、細胞外膜、または分泌により細胞外部へと、分別される。大半のシグナル配列は、タンパク質が小胞体に輸送された後に、シグナルペプチダーゼによってタンパク質から切除される。ポリペプチドからのシグナル配列の切除は、通常、アミノ酸配列中の特異的部位で起こり、シグナル配列内のアミノ酸残基に依存する。特異的切断部位は通常は1つであるが、2つ以上の切断部位がシグナルペプチダーゼによって認識され、かつ/または使用されて、ポリペプチドのN末端が不均一になる場合がある。例えば、シグナル配列内の異なる切断部位が使用されることにより、発現されるポリペプチドのN末端アミノ酸が異なることになりうる。したがって、いくつかの態様において、本明細書に記載するポリペプチドは、異なるN末端を持つポリペプチドの混合物を含みうる。いくつかの態様では、N末端が長さで1、2、3、4、5、6、7、8、9、10アミノ酸、またはそれ以上異なる。いくつかの態様では、N末端が長さで1、2、3、4、または5アミノ酸異なる。いくつかの態様では、ポリペプチドが実質的に均一、すなわちポリペプチドが同じN末端を有する。いくつかの態様では、ポリペプチドのシグナル配列が、1つまたは複数（例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個など）のアミノ酸置換および/またはアミノ酸欠失を含む。いくつかの態様では、ポリペプチドのシグナル配列が、1つの切断部位を優勢にすることで1種類のN末端を持つ実質的に均一なポリペプチドをもたらすことを可能にするアミノ酸置換および/またはアミノ酸欠失を含む。
いくつかの態様では、可溶性受容体が、SEQ ID NO:29またはSEQ ID NO:30のアミノ酸配列を含む。
一定の態様では、可溶性受容体がSEQ ID NO:29の配列を含む。一定の態様では、可溶性受容体が、1個または複数個（例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個など）の保存的置換を含む、SEQ ID NO:29の配列を含む。一定の態様では、可溶性受容体が、SEQ ID NO:29と少なくとも約90％、約95％、または約98％の配列同一性を有する配列を含む。一定の態様では、SEQ ID NO:29の変異体が、1種または複数種のヒトWntタンパク質に結合する能力を維持している。
一定の態様では、Wnt結合作用物質が、SEQ ID NO:29またはSEQ ID NO:30のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。いくつかの態様では、ポリペプチドが、SEQ ID NO:29またはSEQ ID NO:30から本質的になる。一定の態様では、ポリペプチドがSEQ ID NO:29のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、ポリペプチドが、SEQ ID NO:29のアミノ酸配列を含む実質的に精製されたポリペプチドである。一定の態様では、実質的に精製されたポリペプチドが、少なくとも90％の、アラニン-セリン-アラニン（ASA）のN末端アミノ酸配列を有するポリペプチドからなる。いくつかの態様では、新生ポリペプチドが、1種類のN末端配列を有する実質的に均一なポリペプチド産物をもたらすシグナル配列を含む。
一定の態様では、Wnt結合作用物質が、免疫グロブリンのFc領域を含む。本発明の結合作用物質のいくつかが、ネイティブの、すなわち改変されていない定常領域を含む、ほぼ同じ免疫原性の融合タンパク質と比較した場合に、所望の生化学的特徴、例えば増加したがん細胞局在、増加した腫瘍浸透、低減した血清中半減期、または増加した血清中半減期を与えることができるように、Fc領域の少なくとも一部分が欠失しているか、または他の形で改変されている融合タンパク質を含むことは、当業者には理解されるであろう。Fc領域の修飾は、1つまたは複数のドメインにおける1つまたは複数のアミノ酸の付加、欠失、または置換を含みうる。本明細書に開示する修飾融合タンパク質は、2つある重鎖定常ドメイン（CH2またはCH3）のうちの1つまたは複数の改変もしくは変更、またはヒンジ領域の改変もしくは変更を含みうる。別の態様では、CH2ドメイン全体を除去することもできる（ΔCH2コンストラクト）。いくつかの態様では、省かれた定常領域ドメインが、欠如している定常領域ドメインによって通例付与されている分子の可動性の一部を提供する短いアミノ酸スペーサー（例えば10残基）で置き換えられる。
いくつかの態様において、修飾融合タンパク質は、CH3ドメインをヒンジ領域に直接連結するように工学的に操作されている。別の態様では、ヒンジ領域と修飾CH2および/またはCH3ドメインとの間にペプチドスペーサーが挿入されている。例えば、CH2ドメインが欠失していて、残ったCH3ドメイン（修飾または無修飾）が5〜20アミノ酸のスペーサーでヒンジ領域に接合されているコンストラクトを、発現させることができる。そのようなスペーサーは、定常ドメインの調節要素が自由かつアクセス可能な状態を保っていることまたはヒンジ領域が可動性を保っていることを保証するために、付加することができる。しかし、アミノ酸スペーサーは、場合によっては、免疫原性であって、コンストラクトに対する望まれない免疫応答を誘発することになりうる点に注意すべきである。したがって一定の態様では、コンストラクトに付加されるスペーサーはいずれも、融合タンパク質の望ましい生物学的品質が維持されるように、比較的非免疫原性であるだろう。
いくつかの態様では、修飾融合タンパク質が、定常ドメインの部分的でしかない欠失を有するか、小数の、あるいは一つだけのアミノ酸の置換を有しうる。例えば、CH2ドメインの選択された区域における単一アミノ酸の変異は、Fc結合を実質的に低減させ、よってがん細胞局在および/または腫瘍浸透を増加させるのに十分でありうる。同様に、1つまたは複数の定常領域ドメインのうち、特異的エフェクター機能（例えば補体C1q結合）を制御する部分を、単純に欠失させることが望ましい場合もありうる。そのような定常領域の部分的欠失は、対象定常領域ドメインに関連する他の望ましい機能を損なわずに残したまま、結合作用物質の選ばれた特徴（例えば血清中半減期）を改良しうる。そのうえ、上記で言及したように、本開示の融合タンパク質の定常領域は、結果として得られるコンストラクトのプロファイルを強化する1つまたは複数のアミノ酸の変異または置換によって修飾してもよい。この点で、修飾融合タンパク質の立体配置および免疫原性プロファイルを実質的に維持したまま、保存された結合部位が与える活性（例えばFc結合）を妨害することが可能になりうる。一定の態様では、修飾融合タンパク質が、エフェクター機能の減少または増加などといった望ましい特徴を強化するために、またはより多くの細胞毒もしくは糖質取り付け部位を設けるために、定常領域への1つまたは複数のアミノ酸の付加を含む。
定常領域が数種類のエフェクター機能を媒介することは、当技術分野において公知である。例えば（抗原に結合した）IgG抗体またはIgM抗体のFc領域への補体のC1構成要素の結合は、補体系を活性化する。補体の活性化は、細胞病原体のオプソニン化および溶解において重要である。補体の活性化は炎症応答も刺激し、自己免疫過敏症にも関与しうる。加えて、免疫グロブリンのFc領域は、Fc受容体（FcR）を発現する細胞に結合することができる。IgG（ガンマ受容体）、IgE（イプシロン受容体）、IgA（アルファ受容体）およびIgM（ミュー受容体）など、異なる抗体クラスに特異的なFc受容体がいくつかある。細胞表面上のFc受容体への抗体の結合は、抗体被覆粒子の貪食と破壊、免疫複合体のクリアランス、キラー細胞による抗体被覆標的細胞の溶解、炎症性メディエーターの放出、胎盤移行、および免疫グロブリン生産の制御などといった、いくつかの重要で多様な生物学的応答を誘発する。
いくつかの態様では、修飾融合タンパク質が改変されたエフェクター機能を与え、それが、結果として、投与された作用物質の生物学的プロファイルに影響を及ぼす。例えば、いくつかの態様において、定常領域ドメインの欠失または（点変異もしくは他の手段による）不活化は、循環修飾作用物質のFc受容体結合を低減し、それによってがん細胞局在および/または腫瘍浸透を増加させうる。別の態様では、定常領域修飾が作用物質の血清中半減期を増加または低減させる。いくつかの態様では、ジスルフィド連結またはオリゴ糖部分が排除されるように、定常領域が修飾される。
一定の態様では、修飾融合タンパク質が、通常はFc領域に関連する1つまたは複数のエフェクター機能を持たない。いくつかの態様では、作用物質が、抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC）活性、および/または補体依存性細胞傷害（CDC）活性を持たない。一定の態様では、作用物質が、Fc受容体および/または補体因子に結合しない。一定の態様では、作用物質はエフェクター機能を持たない。
いくつかの態様において、本明細書に記載するWnt結合作用物質（例えば可溶性受容体）は、免疫原性が低減するように修飾されている。一般に、完全に正常なヒトタンパク質に対する免疫応答は、それらのタンパク質を治療薬として使用する場合には稀である。しかし、多くの融合タンパク質は自然界に見いだされる配列と同じポリペプチド配列を含むものの、いくつかの治療用融合タンパク質は、哺乳動物において免疫原性であることが示されている。いくつかの研究では、リンカーを含む融合タンパク質は、リンカーを含有しない融合タンパク質より免疫原性が高いことが見いだされている。したがって、いくつかの態様において、本発明のポリペプチドは、免疫原性を予測するために、計算的手法によって解析される。いくつかの態様では、ポリペプチドが、T細胞エピトープおよび/またはB細胞エピトープの存在について解析される。T細胞エピトープまたはB細胞エピトープが同定され、かつ/または予測されたら、そのエピトープを妨害または破壊するために、それらの領域に修飾（例えばアミノ酸置換）を加えることができる。T細胞エピトープおよび/またはB細胞エピトープを予測するために使用することができるアルゴリズムおよびソフトウェアは、当技術分野では種々知られている。例えば、ソフトウェアプログラムSYFPEITHI、HLA Bind、PEPVAC、RANKPEP、DiscoTope、ElliPro、およびAntibody Epitope Predictionは、いずれも公的に利用することができる。
いくつかの態様では、本明細書に記載する可溶性受容体またはポリペプチドのいずれかを含む組成物が提供される。いくつかの態様では、組成物が、少なくとも80％、90％、95％、97％、98％、または99％のポリペプチドがアラニン-セリン-アラニン（ASA）というN末端アミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。いくつかの態様では、組成物が、100％のポリペプチドがASAというN末端アミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。いくつかの態様では、組成物が、少なくとも80％のポリペプチドがASAというN末端アミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。いくつかの態様では、組成物が、少なくとも90％のポリペプチドがASAというN末端アミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。いくつかの態様では、組成物が、少なくとも95％のポリペプチドがASAというN末端アミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
本明細書に記載するポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチド、または合成ポリペプチドであることができる。本発明の一部のアミノ酸配列を、タンパク質の構造または機能に著しい影響を及ぼさずに変化させうることは、当技術分野では認識されるであろう。そのような配列の相違が考えられる場合は、タンパク質上には活性を決定する重要な区域があるだろうということに留意すべきである。したがって本発明はさらに、FZDタンパク質の実質的な活性を示す、またはFZDタンパク質の領域、例えば本明細書において論述するタンパク質部分を含む、ポリペプチドのバリエーションを包含する。そのようなミュータントは、欠失、挿入、逆位、反復、およびタイプ置換（type substitution）を含む。
もちろん、当業者が行うであろうアミノ酸置換の数は、上述したものを含む多くの因子に依存する。一定の態様では、任意の所与の可溶性受容体ポリペプチドについて、置換の数は、50、40、30、25、20、15、10、5または3個以下であるだろう。
ポリペプチドのフラグメントまたは部分は、対応する完全長ポリペプチドをペプチド合成によって生産するために使用することができる。それゆえに、フラグメントは、完全長ポリペプチドを生産するための中間体として使用することができる。ポリペプチドのこれらのフラグメントまたは部分を「タンパク質フラグメント」または「ポリペプチドフラグメント」ということもできる。
タンパク質フラグメントは、1種もしくは複数種のヒトWntタンパク質または1種もしくは複数種のヒトFZDタンパク質に結合する能力を有するタンパク質の一部分または全部である。いくつかの態様では、フラグメントが、1種または複数種のヒトWntタンパク質に対して高い親和性を有する。いくつかの態様では、フラグメントが、1種または複数種のヒトFZDタンパク質に対して高い親和性を有する。本明細書に記載するWnt結合作用物質のいくつかのフラグメントは、免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部（例えばFc領域）に連結されたFZDタンパク質の細胞外部分の少なくとも一部を含むタンパク質フラグメントである。タンパク質フラグメントの結合親和性は約10-11〜10-12Mの範囲内にありうる。ただし、フラグメントのサイズが変わると、親和性はかなり変動して、10-7〜10-13Mの範囲に及びうる。いくつかの態様では、フラグメントが約100〜約200アミノ酸長であり、免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部に連結された結合ドメインを含む。
いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、抗体であるWnt結合作用物質である。いくつかの態様では、Wnt結合作用物質がポリペプチドである。一定の態様では、Wnt結合作用物質が、抗体または抗原結合部位を含むポリペプチドである。一定の態様では、本明細書に記載するWnt結合抗体またはポリペプチドの抗原結合部位が、1、2、3、4、5種、またはそれ以上のヒトWntタンパク質に結合する能力を有する（または結合する）。一定の態様では、Wnt結合抗体またはポリペプチドの抗原結合部位が、Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a、およびWnt10bからなる群より選択される1、2、3、4、または5種のヒトWntタンパク質に特異的に結合する能力を有する。Wnt結合作用物質の非限定的な例は、米国特許第7,723,477号、国際公開公報第2011/088123号、および国際公開公報第2011/088127号に見いだすことができる。
一定の態様では、Wnt結合作用物質が、1種または複数種のヒトWntタンパク質のC末端システインリッチドメインに結合する。一定の態様では、Wnt結合作用物質が、SEQ ID NO:31（Wnt1）、SEQ ID NO:32（Wnt2）、SEQ ID NO:33（Wnt2b）、SEQ ID NO:34（Wnt3）、SEQ ID NO:35（Wnt3a）、SEQ ID NO:36（Wnt7a）、SEQ ID NO:37（Wnt7b）、SEQ ID NO:38（Wnt8a）、SEQ ID NO:39（Wnt8b）、SEQ ID NO:40（Wnt10a）、およびSEQ ID NO:41（Wnt10b）からなる群より選択される、その作用物質または抗体が結合する1種または複数種のWntタンパク質内のドメインに結合する。
一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、抗体であるWnt結合作用物質である。いくつかの態様では、抗体が組換え抗体である。いくつかの態様では、抗体がモノクローナル抗体である。いくつかの態様では、抗体がキメラ抗体である。いくつかの態様では、抗体がヒト化抗体である。いくつかの態様では、抗体がヒト抗体である。一定の態様では、抗体がIgG1抗体である。一定の態様では、抗体がIgG2抗体である。一定の態様では、抗体が、抗原結合部位を含む抗体フラグメントである。いくつかの態様では、抗体が、一価、単一特異性、二価、二重特異性、または多重特異性である。いくつかの態様では、抗体が細胞傷害性部分にコンジュゲートされている。いくつかの態様では、抗体が単離されている。いくつかの態様では、抗体が実質的に純粋である。
いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターがポリクローナル抗体である。ポリクローナル抗体は任意の公知の方法によって調製することができる。いくつかの態様では、関連する抗原（例えば精製されたペプチドフラグメント、完全長組換えタンパク質、または融合タンパク質）を皮下または腹腔内に複数回注射することで動物（例えばウサギ、ラット、マウス、ヤギ、ロバ）を免疫することにより、ポリクローナル抗体を生じさせる。抗原は、任意で、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）または血清アルブミンなどの担体にコンジュゲートすることができる。抗原（担体タンパク質ありまたは担体タンパク質なし）を滅菌食塩水に希釈し、通常はアジュバント（例えば完全フロイントアジュバントまたは不完全フロイントアジュバント）と混和することで、安定なエマルションを形成させる。十分な期間の後、免疫された動物の血液および/または腹水からポリクローナル抗体が回収される。ポリクローナル抗体は当技術分野における標準的方法によって、例えば限定するわけではないが、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、および透析などによって、血清または腹水から精製することができる。
いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターがモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、当業者に公知のハイブリドーマ法を使って調製することができる。ハイブリドーマ法を使用するいくつかの態様では、マウス、ハムスター、または他の適当な宿主動物を上述のように免疫することで、免疫抗原に特異的に結合するであろう抗体の生産をリンパ球に生じさせる。いくつかの態様では、リンパ球をインビトロで免疫することができる。いくつかの態様において、免疫抗原はヒトタンパク質またはその一部分であることができる。いくつかの態様において、免疫抗原はマウスタンパク質またはその一部分であることができる。
免疫後に、リンパ球を単離し、適切な骨髄腫細胞株と例えばポリエチレングリコールを使って融合させることで、ハイブリドーマ細胞を形成させ、次にそれを、未融合のリンパ球および骨髄腫細胞から選び出すことができる。選んだ抗原を特異的に指向するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマは、例えば限定するわけではないが、免疫沈降、免疫ブロッティング、およびインビトロ結合アッセイ（例えばフローサイトメトリー、FACS、ELISA、およびラジオイムノアッセイ）を含むさまざまな方法によって同定することができる。ハイブリドーマは、インビトロ培養において標準的方法を使って増殖させるかまたはインビボで動物における腹水腫瘍として増殖させることができる。モノクローナル抗体は、例えば限定するわけではないが、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、および透析を含む当技術分野における標準的方法に従って、培養培地または腹水から精製することができる。
一定の態様では、当業者に公知の組換えDNA技法を使って、モノクローナル抗体を作ることができる。抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを使ったRT-PCRなどによって、成熟B細胞またはハイブリドーマ細胞から、モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを単離し、それらの配列を従来の技法を使って決定する。次に、重鎖および軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドを、本来であれば免疫グロブリンタンパク質を生産しない大腸菌（E. coli）、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトした時にモノクローナル抗体を生産する適切な発現ベクターにクローニングする。別の態様では、組換えモノクローナル抗体、またはそのフラグメントを、ファージディスプレイライブラリーから単離することができる。
モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドは、代替抗体を生成させるために、組換えDNA技術を使って、いくつかの異なる方法で、さらに修飾することができる。いくつかの態様では、例えばマウスモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の定常ドメインで、例えばヒト抗体の同領域を置換することで、キメラ抗体を生成させるか、または非免疫グロブリンポリペプチドを置換することで、融合抗体を生成させることができる。いくつかの態様では、定常領域を切り詰めるか除去することで、モノクローナル抗体の所望の抗体フラグメントを生成させる。いくつかの態様において、モノクローナル抗体の特異性、親和性などを最適化するために、可変領域の部位指定変異導入または高密度変異導入を使用することができる。
いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターがヒト化抗体である。典型的には、ヒト化抗体は、CDR由来の残基が、当業者に公知の方法を使って、所望の特異性、親和性、および/または結合能を有する非ヒト種（例えばマウス、ラット、ウサギ、ハムスターなど）のCDR由来の残基で置き換えられているヒト免疫グロブリンである。いくつかの態様では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域残基を、非ヒト種由来の抗体における対応する残基で置き換える。いくつかの態様では、抗体の特異性、親和性、および/または能力を精密化し最適化するために、フレームワーク領域中および/または置き換えられた非ヒト残基内のさらなる残基の置換によって、ヒト化抗体をさらに修飾することができる。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに対応するCDRの全てまたは実質的に全てを含有する可変ドメイン領域を含むであろうが、その一方で、フレームワーク領域の全て、または実質的に全ては、ヒト免疫グロブリン配列のものである。いくつかの態様において、ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域または定常ドメイン（Fc）の少なくとも一部分（典型的にはヒト免疫グロブリンのもの）も含むことができる。一定の態様では、そのようなヒト化抗体が治療に使用される。なぜなら、それらはヒト対象に投与された場合の抗原性およびHAMA（ヒト抗マウス抗体）応答を低減しうるからである。
一定の態様では、Wnt経路インヒビターがヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野において公知のさまざまな技法を使って、直接的に調製することができる。いくつかの態様では、標的抗原に対する抗体を生産する、インビトロで免疫した、または免疫個体から単離した、不死化ヒトBリンパ球を、生成させることができる。いくつかの態様では、ヒト抗体を発現するファージライブラリーから、ヒト抗体を選択することができる。あるいは、免疫されていないドナーの免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子レパートリーから、ファージディスプレイ技術を使って、ヒト抗体および抗体フラグメントをインビトロで生産することもできる。抗体ファージライブラリーの生成と使用のための技法は、当技術分野において周知であり、抗体ファージライブラリーは市販されている。限定するわけではないが鎖シャフリングや部位指定変異導入などといった親和性成熟戦略は、当技術分野では公知であり、高親和性ヒト抗体の生成に使用することができる。
いくつかの態様では、ヒト免疫グロブリン座を持つトランスジェニックマウスにおいて、ヒト抗体を作ることができる。これらのマウスは、免疫すると、内在性免疫グロブリン生産の非存在下で、ヒト抗体の全レパートリーを生産する能力を有する。
本発明は、少なくとも1種のヒトFZDタンパク質または少なくとも1種のWntタンパク質を特異的に認識する二重特異性抗体も包含する。二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なるエピトープを特異的に認識し、それらに結合する能力を有する。異なるエピトープは同じ分子内にあってもよいし（例えばヒトFZD5上の2つの異なるエピトープ）、異なる分子上にあってもよい（例えばFZD5上の1つのエピトープと第2のタンパク質上の異なるエピトープ）。いくつかの態様では、二重特異性抗体はモノクローナルヒト抗体またはモノクローナルヒト化抗体である。いくつかの態様において、二重特異性抗体は、インタクトな抗体である。いくつかの態様において、二重特異性抗体は、抗体断片である。特定の態様において、抗体は多重特異性である。いくつかの態様において、抗体は、第1抗原標的を発現する細胞に細胞性防御機構を集中させるために、第1抗原標的（例えばFZDタンパク質）と、第2抗原標的、例えば白血球上のエフェクター分子（例えばCD2、CD3、CD28、CD80、またはCD86）またはFc受容体（例えばCD64、CD32、またはCD16）とを特異的に認識し、それらに結合することができる。いくつかの態様では、抗体を使って、細胞傷害性作用物質を、特定の標的抗原を発現する細胞に向かわせることができる。これらの抗体は、抗原結合アームと、細胞傷害性作用物質または放射性核種キレーター、例えばEOTUBE、DPTA、DOTA、またはTETAなどに結合するアームとを有する。二重特異性抗体および多重特異性抗体を作るための技法は、当業者には公知である。
一定の態様において、本明細書に記載する抗体（または他のポリペプチド）は、単一特異性であることができる。例えば、一定の態様では、抗体が含有する1つまたは複数の抗原結合部位のそれぞれが、異なるタンパク質上の相同エピトープを結合する能力を有する（または結合する）。
一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、抗原結合部位を含む抗体フラグメントである。抗体フラグメントは、インタクトな抗体とは異なる機能または能力を有しうる。例えば抗体フラグメントは増加した腫瘍浸透性を有しうる。抗体フラグメントを生産するための技法は、例えば限定するわけではないがインタクトな抗体のタンパク質分解消化を含めて、種々知られている。いくつかの態様において、抗体フラグメントには、抗体分子のペプシン消化によって生産されるF(ab')2フラグメントが含まれる。いくつかの態様において、抗体フラグメントには、F(ab')2フラグメントのジスルフィド橋を還元することによって生成するFabフラグメントが含まれる。別の態様において、抗体フラグメントには、抗体分子をパパインと還元剤で処理することによって生成するFabフラグメントが含まれる。一定の態様では、抗体フラグメントが組換え生産される。いくつかの態様において、抗体フラグメントには、Fvフラグメントまたは一本鎖Fv（scFv）フラグメントが含まれる。Fab、Fv、およびscFv抗体フラグメントは、大腸菌または他の宿主細胞中で発現させ、そこから分泌させることができ、それにより、これらのフラグメントを大量に生産することが可能になる。いくつかの態様では、抗体フラグメントが、本明細書において論じる抗体ファージライブラリーから単離される。例えば、FZDタンパク質もしくはWntタンパク質またはそれらの誘導体、フラグメント、類似体または相同体に対して所望の特異性を有するモノクローナルFabフラグメントの迅速かつ効果的な同定を可能にするために、Fab発現ライブラリーを構築するための方法を使用することができる。いくつかの態様では、抗体フラグメントが線状抗体フラグメントである。一定の態様では、抗体フラグメントが単一特異性または二重特異性である。一定の態様では、Wnt経路インヒビターがscFvである。1種もしくは複数種のヒトFZDタンパク質または1種もしくは複数種のヒトWntタンパク質に特異的な一本鎖抗体の生産には、さまざまな技法を使用することができる。
さらに、抗体をその血清中半減期を増加させるために修飾することが、抗体フラグメントの場合は特に、好ましい場合がある。これは、例えば、抗体フラグメント中の適当な領域への変異導入によって抗体フラグメントにサルベージ受容体結合エピトープを組み込むことによって、または前記エピトープをペプチドタグに組み込んでから、それを抗体フラグメントの一端または中央に（例えばDNA合成またはペプチド合成で）融合することによって、達成することができる。いくつかの態様において、抗体は、その血清中半減期が減少するように、修飾される。
ヘテロコンジュゲート抗体の使用も本発明の方法の範囲に含まれる。ヘテロコンジュゲート抗体は、共有結合で接合された2つの抗体から構成される。そのような抗体は、例えば免疫細胞を望まれない細胞にターゲティングするために提唱されている。ヘテロコンジュゲート抗体を、合成タンパク質化学における公知の方法、例えば架橋剤を必要とするものを使って、インビトロで調製することもできると考えられる。例えば、イムノトキシンは、ジスルフィド交換反応を使って、またはチオエーテル結合を形成させることによって、構築することができる。この目的に適した試薬の例には、イミノチオレートや、メチル-4-メルカプトブチルイミデートがある。
本発明の方法のために、修飾抗体が、抗体と標的（すなわちヒトFZDタンパク質またはヒトWntタンパク質）との会合をもたらす任意のタイプの可変領域を含みうることは、理解されるはずである。これに関連して、可変領域は、体液性応答の開始と所望の腫瘍関連抗原に対する免疫グロブリンの生成とを誘発することができる任意のタイプの哺乳動物を含みうる、またはその哺乳動物に由来しうる。したがって、修飾抗体の可変領域は、例えばヒト、マウス、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル、マカクなど）由来またはウサギ由来であることができる。いくつかの態様では、修飾免疫グロブリンの可変領域と定常領域がどちらもヒトの領域である。別の態様では、その分子の結合特性を改良し、または免疫原性を低減するために、適合する抗体（通常は非ヒト供給源に由来するもの）の可変領域を工学的に操作または特異的に加工することができる。この点で、可変領域は、ヒト化されたもの、またはインポートされたアミノ酸配列を含めることにより、他の形で改変されたものでありうる。
一定の態様では、重鎖および軽鎖の可変ドメインがどちらも、1つまたは複数のCDRの少なくとも部分的な置き換えによって、そして必要であれば、部分的なフレームワーク領域の置き換えならびに配列修飾および/または配列改変によって、改変される。CDRは、フレームワーク領域が由来する抗体と同じクラス、さらには同じサブクラスの抗体に由来しうるが、CDRは、好ましくは、異なる種からの抗体に由来するであろうと考えられる。一つの可変ドメインの抗原結合能をもう一つの可変ドメインに移すために、CDRの全てをドナー可変領域からのCDRの全てで置き換える必要はないであろう。むしろ、抗原結合部位の活性を維持するのに必要な残基を移す必要しかないであろう。
可変領域の改変とは別に、修飾抗体が、ネイティブの、すなわち改変されていない定常領域を含む、ほぼ同じ免疫原性の抗体と比較した場合に、所望の生化学的特徴、例えば増加した腫瘍局在および/または増加した血清中半減期が得られるように、定常領域ドメインの1つまたは複数の少なくとも断片が欠失しているかまたは他の形で改変されている抗体（例えば完全長抗体またはその免疫反応性フラグメント）を含むであろうことは、当業者には理解されるだろう。いくつかの態様では、修飾抗体の定常領域はヒト定常領域を含むであろう。本発明と適合する定常領域の修飾は、1つまたは複数のドメインにおける1つまたは複数のアミノ酸の付加、欠失または置換を含む。本明細書において開示する修飾抗体は、3つの重鎖定常ドメイン（CH1、CH2またはCH3）の1つまたは複数への、かつ/または軽鎖定常ドメイン（CL）への改変または修飾を含みうる。いくつかの態様では、1つまたは複数のドメインを、修飾抗体の定常領域から部分的にまたは完全に欠失させる。いくつかの態様では、修飾抗体が、CH2ドメイン全体が除去されたドメイン欠失コンストラクトまたはドメイン欠失変異体（ΔCH2コンストラクト）を含むであろう。いくつかの態様では、省かれた定常領域ドメインが、欠如している定常領域ドメインによって通例付与されている分子の可動性の一部を提供する短いアミノ酸スペーサー（例えば10アミノ酸残基）で置き換えられる。
いくつかの態様において、修飾抗体は、CH3ドメインを抗体のヒンジ領域に直接融合するように、工学的に操作される。別の態様では、ヒンジ領域と修飾CH2ドメインおよび/またはCH3ドメインの間にペプチドスペーサーが挿入される。例えば、CH2ドメインが欠失していて、残ったCH3ドメイン（修飾または無修飾）が5〜20アミノ酸のスペーサーでヒンジ領域に接合されているコンストラクトを、発現させることができる。そのようなスペーサーは、定常ドメインの調節要素が自由かつアクセス可能な状態を保っていることまたはヒンジ領域が可動性を保っていることを保証するために、付加することができる。しかし、アミノ酸スペーサーは、場合によっては、免疫原性であって、コンストラクトに対する望まれない免疫応答を誘発することになりうる点に注意すべきである。したがって一定の態様では、コンストラクトに付加されるスペーサーはいずれも、修飾抗体の望ましい生物学的品質が維持されるように、比較的非免疫原性であるだろう。
いくつかの態様では、修飾抗体が、定常ドメインの部分的でしかない欠失を有するか、小数の、あるいは一つだけのアミノ酸の置換を有しうる。例えば、CH2ドメインの選択された区域における単一アミノ酸の変異は、Fc結合を実質的に低減させ、よってがん細胞局在および/または腫瘍浸透を増加させるのに十分でありうる。同様に、1つまたは複数の定常領域ドメインのうち、特異的エフェクター機能（例えば補体C1q結合）を制御する部分を、単純に欠失させることが望ましい場合もありうる。そのような定常領域の部分的欠失は、対象定常領域ドメインに関連する他の望ましい機能を損なわずに残したまま、抗体の選ばれた特徴（血清中半減期）を改良しうる。そのうえ、上記で言及したように、本開示の抗体の定常領域は、結果として得られるコンストラクトのプロファイルを強化する1つまたは複数のアミノ酸の変異または置換によって修飾してもよい。この点で、修飾抗体の立体配置および免疫原性プロファイルを実質的に維持したまま、保存された結合部位が与える活性（例えばFc結合）を妨害することが可能になりうる。一定の態様では、修飾抗体が、エフェクター機能の減少または増加などといった望ましい特徴を強化するために、またはより多くの細胞毒もしくは糖質取り付け部位を設けるために、定常領域への1つまたは複数のアミノ酸の付加を含む。
定常領域が数種類のエフェクター機能を媒介することは、当技術分野において公知である。例えば（抗原に結合した）IgG抗体またはIgM抗体のFc領域への補体のC1構成要素の結合は、補体系を活性化する。補体の活性化は、細胞病原体のオプソニン化および溶解において重要である。補体の活性化は炎症応答も刺激し、自己免疫過敏症にも関与しうる。加えて、抗体のFc領域は、Fc受容体（FcR）を発現する細胞に結合することができる。IgG（ガンマ受容体）、IgE（イプシロン受容体）、IgA（アルファ受容体）およびIgM（ミュー受容体）など、異なる抗体クラスに特異的なFc受容体がいくつかある。細胞表面上のFc受容体への抗体の結合は、抗体被覆粒子の貪食と破壊、免疫複合体のクリアランス、キラー細胞による抗体被覆標的細胞の溶解、炎症性メディエーターの放出、胎盤移行、および免疫グロブリン生産の制御などといった、いくつかの重要で多様な生物学的応答を誘発する。
一定の態様において、Wnt経路インヒビターは、改変されたエフェクター機能を与える抗体である。これらの改変されたエフェクター機能は、投与された抗体の生物学的プロファイルに影響を及ぼしうる。例えば、いくつかの態様において、定常領域ドメインの欠失または（点変異もしくは他の手段による）不活化は、循環修飾抗体（例えば抗FZD抗体）のFc受容体結合を低減し、それによってがん細胞局在および/または腫瘍浸透を増加させうる。別の態様では、定常領域修飾が抗体の血清中半減期を増加または低減させる。いくつかの態様では、ジスルフィド連結またはオリゴ糖部分が排除されるように、定常領域が修飾される。本発明による定常領域の修飾は、当業者によく理解されている周知の生化学的技法または分子工学的手法を使って、容易に行うことができる。
一定の態様では、Wnt経路インヒビターが1つまたは複数のエフェクター機能を持たない抗体である。例えば、いくつかの態様では、抗体がADCC活性、および/またはCDC活性を持たない。一定の態様では、抗体がFc受容体および/または補体因子に結合しない。一定の態様では、抗体がエフェクター機能を持たない。
本発明の方法はさらに、本明細書に記載するキメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体、またはそれらの抗体フラグメントに実質的に相同な変異体および等価物を包含する。これらは、例えば保存的置換変異を含有することができる。
一定の態様では、本明細書に記載する抗体が単離されている。一定の態様では、本明細書に記載する抗体が実質的に純粋である。
本明細書に記載する方法のいくつかの態様では、Wnt経路インヒビターがポリペプチドである。ポリペプチドは、少なくとも1種のヒトFZDタンパク質または少なくとも1種のWntタンパク質に結合する、抗体またはそのフラグメントを含む、組換えポリペプチド、天然ポリペプチド、または合成ポリペプチドであることができる。本発明のいくつかのアミノ酸配列を、タンパク質の構造または機能に著しい影響を及ぼさずに変化させうることは、当技術分野では認識されるであろう。したがって本発明はさらに、ヒトFZDタンパク質またはWntタンパク質に対する抗体またはそのフラグメントの実質的活性を示すか、同抗体またはそのフラグメントの領域を含む、ポリペプチドのバリエーションを包含する。いくつかの態様では、FZD結合ポリペプチドまたはWnt結合ポリペプチドのアミノ酸配列バリエーションが、欠失、挿入、逆位、反復、および/または他のタイプの置換を含む。
ポリペプチド、その類似体および変異体はさらに、通常はポリペプチドの一部ではない追加の化学部分を含有するように修飾することができる。誘導体化された部分は、ポリペプチドの溶解度、生物学的半減期および/または吸収を改善することができる。これらの部分は、ポリペプチドおよび変異体の望ましくない任意の副作用を低減または排除することもできる。化学部分に関する総説は「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」22nd Edition, 2012, Pharmaceutical Press（ロンドン）に見いだすことができる。
本明細書に記載する単離されたポリペプチドは、当技術分野において公知の任意の適切な方法によって生産することができる。そのような方法は、直接タンパク質合成法から、ポリペプチド配列をコードするDNA配列を構築してその配列を適切な宿主中で発現させる方法まで、さまざまである。いくつかの態様では、関心対象の野生型タンパク質をコードするDNAを単離または合成することにより、組換え技術を使ってDNA配列を構築する。任意で、部位特異的変異導入法によって配列に変異を導入することで、その機能的類似体を得ることもできる。
いくつかの態様では、関心対象のポリペプチドをコードするDNA配列を、オリゴヌクレオチド合成装置を使って、化学合成によって構築することができる。オリゴヌクレオチドは、所望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づき、関心対象の組換えポリペプチドの生産を行う予定の宿主細胞において好まれるコドンを選択することによって設計される。標準的方法を適用することで、単離された関心対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を合成することができる。例えば、完全なアミノ酸配列を使って、逆翻訳遺伝子を構築することができる。さらに、特定の単離されたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するDNAオリゴマーを合成することができる。例えば、所望のポリペプチドの部分をコードするいくつかの小さなオリゴヌクレオチドを合成してから、それらをライゲートすることができる。個々のオリゴヌクレオチドは、典型的には、相補的アセンブリのために、5'または3'オーバーハングを含有する。
（合成、部位指定変異導入法、または他の方法による）アセンブリが終わったら、関心対象の特定ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、発現ベクターに挿入して、所望の宿主におけるタンパク質の発現に適した発現制御配列に作動的に連結することができる。適正なアセンブリは、ヌクレオチド配列決定、制限酵素マッピング、および/または適切な宿主における生物学的に活性なポリペプチドの発現によって確かめることができる。当技術分野においては周知であるように、宿主においてトランスフェクトされた遺伝子の高い発現レベルを得るには、選んだ発現宿主において機能的な転写および翻訳発現制御配列に遺伝子が作動的に連結されていなければならない。
一定の態様では、組換え発現ベクターを使って、ヒトFZDタンパク質またはWntタンパク質に結合する作用物質（例えば抗体または可溶性受容体）またはそのフラグメントをコードするDNAを増幅し、発現させる。例えば組換え発現ベクターは、哺乳動物遺伝子、微生物遺伝子、ウイルス遺伝子または昆虫遺伝子に由来する適切な転写および/または翻訳調節要素に作動的に連結された、FZD結合作用物質、Wnt結合作用物質、抗FZD抗体もしくはそのフラグメント、抗Wnt抗体もしくはそのフラグメント、またはFZD-Fc可溶性受容体のポリペプチド鎖をコードする、合成DNAフラグメントまたはcDNA由来のDNAフラグメントを有する、複製可能なDNAコンストラクトであることができる。転写単位は、一般に、（1）遺伝子発現において調節的役割を有する1つまたは複数の遺伝要素、例えば転写プロモーターまたはエンハンサー、（2）mRNAに転写され、タンパク質に翻訳される、構造配列またはコード配列、および（3）適当な転写および翻訳開始および終結配列のアセンブリを含む。調節要素には、転写を制御するためのオペレーター配列を含めることができる。通常は複製起点によって付与される宿主中で複製する能力と、形質転換体の認識を容易にする選択遺伝子を、さらに組み込むことができる。DNA領域は、それらが互いに機能的な関係にある場合に、「作動的に連結」されている。例えば、シグナルペプチド（分泌性リーダー）のDNAは、それがあるポリペプチドの分泌に関与する前駆体として発現するのであれば、そのポリペプチドのDNAに作動的に連結されており、プロモーターは、それがあるコード配列の転写を制御するのであれば、そのコード配列に作動的に連結されており、あるいはリボソーム結合部位は、それが翻訳を可能にするような位置にあるのであれば、コード配列に作動的に連結されている。いくつかの態様では、酵母発現系における使用を意図した構造要素が、宿主酵母細胞による翻訳されたタンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含む。組換えタンパク質がリーダー配列または輸送配列なしで発現される別の態様では、それはN末端メチオニン残基を含みうる。この残基は、任意で、発現された組換えタンパク質から引き続いて切り離すことで、最終産物を与えることもできる。
発現制御配列および発現ベクターの選択は、宿主の選択に依存する。多種多様な発現宿主/ベクターの組み合わせを使用することができる。真核宿主用の有用な発現ベクターとしては、例えばSV40、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス、およびサイトメガロウイルスからの発現制御配列を含むベクターが挙げられる。細菌宿主用の有用な発現ベクターとしては、公知の細菌プラスミド、例えばpCR1、pBR322、pMB9およびそれらの誘導体を含む大腸菌由来のプラスミド、およびそれより宿主域が広いプラスミド、例えばM13ファージおよび他の線維状一本鎖DNAファージが挙げられる。
FZD結合作用物質またはWnt結合作用物質（または抗原として使用するためのタンパク質）を発現させるための適切な宿主細胞としては、原核生物、酵母細胞、昆虫細胞、または高等真核細胞が挙げられる。原核生物としては、グラム陰性生物またはグラム陽性生物、例えば大腸菌またはバチルス（Bacillus）が挙げられる。高等真核細胞としては、後述する哺乳動物由来の樹立細胞株が挙げられる。無細胞翻訳系も使用しうる。細菌宿主、真菌宿主、酵母宿主、および哺乳動物細胞宿主と共に使用するための適当なクローニングベクターおよび発現ベクターは、当業者に公知である。
組換えポリペプチドの発現には、さまざまな哺乳類細胞培養系が使用される。哺乳動物細胞における組換えタンパク質の発現は、そのようなタンパク質が一般に正しくフォールディングされ、適切に修飾され、生物学的に機能的であることから、好まれ得る。適切な哺乳動物宿主細胞株の例として、COS-7（サル腎臓由来）細胞株、L-929（マウス線維芽細胞由来）細胞株、C127（マウス乳房腫瘍由来）細胞株、3T3（マウス線維芽細胞由来）細胞株、CHO（チャイニーズハムスター卵巣由来）細胞株、HeLa（ヒト子宮頸がん由来）細胞株、BHK（ハムスター腎臓線維芽細胞由来）細胞株、HEK-293（ヒト胎児腎臓由来）細胞株およびそれらの変異体が挙げられる。哺乳類発現ベクターは、非転写要素、例えば複製起点、発現させようとする遺伝子に連結された適切なプロモーターおよびエンハンサー、ならびに他の5'または3'隣接非転写配列、ならびに5'または3'非翻訳配列、例えば必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与部位およびスプライス受容部位、ならびに転写終結配列を含むことができる。
昆虫細胞培養系（例えばバキュロウイルス）における組換えタンパク質の発現も、正しくフォールディングされた生物学的に機能的なタンパク質を生産するためのロバストな方法になる。昆虫細胞において異種タンパク質を生産するためのバキュロウイルス系は、当業者に周知である。
したがって本発明は、本明細書に記載するFZD結合作用物質またはWnt結合作用物質を含む細胞を提供する。いくつかの態様では、細胞が、本明細書に記載する結合作用物質（例えば抗体または可溶性受容体）を生産する。一定の態様では、細胞が抗体を生産する。一定の態様では、細胞が抗体OMP-18R5を生産する。いくつかの態様では、細胞が可溶性受容体を生産する。いくつかの態様では、細胞がFZD-Fc可溶性受容体を生産する。いくつかの態様では、細胞がFZD8-Fc可溶性受容体を生産する。いくつかの態様では、細胞がFZD8-Fc可溶性受容体OMP-54F28を生産する。
形質転換宿主によって生産されるタンパク質は、任意の適切な方法に従って精製することができる。標準的方法としては、クロマトグラフィー（例えばイオン交換、アフィニティー、およびサイズ分画カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差（differential solubility）、または他の標準的なタンパク質精製技法による方法が挙げられる。適当なアフィニティーカラムを通すことによる安易な精製を可能にするために、ヘキサ-ヒスチジン、マルトース結合ドメイン、インフルエンザコート配列、およびグルタチオン-S-トランスフェラーゼなどのアフィニティータグをタンパク質に取り付けることができる。単離されたタンパク質は、タンパク質分解、質量分析（MS）、核磁気共鳴（NMR）、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、およびx線結晶解析などの技法を使って、物理的に特徴づけることもできる。
いくつかの態様では、培養培地中に組換えタンパク質を分泌する発現系からの上清を、まず、市販のタンパク質濃縮フィルタ、例えばAmiconまたはMillipore Pellicon限外濾過ユニットなどを使って濃縮することができる。濃縮工程に続いて、濃縮物を適切な精製マトリックスに適用することができる。いくつかの態様では、アニオン交換樹脂、例えばペンダントジエチルアミノエチル（DEAE）基を有するマトリックスまたは基材を使用することができる。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、またはタンパク質精製によく使用される他のタイプであることができる。いくつかの態様では、カチオン交換工程を使用することができる。適切なカチオン交換体として、スルホプロピル基またはカルボキシメチル基を含むさまざまな不溶性マトリックスが挙げられる。いくつかの態様では、例えば限定するわけではないがセラミックヒドロキシアパタイト（CHT）などのヒドロキシアパタイト媒体を使用することができる。一定の態様では、ペンダントメチルまたは他の脂肪族基を有するシリカゲルなどといった疎水性RP-HPLC媒体を使用する1つまたは複数の逆相HPLC工程を使って、結合作用物質をさらに精製することができる。均一な組換えタンパク質を得るために、前述の精製工程の一部または全部をさまざまな組合せで使用することもできる。
いくつかの態様では、細菌培養において生産された組換えタンパク質を、例えば細胞ペレットからの初回抽出後に、1つまたは複数の濃縮工程、塩析工程、水性イオン交換クロマトグラフィー工程、またはサイズ排除クロマトグラフィー工程などを行うことによって単離することができる。最終精製工程にはHPLCを使用することができる。組換えタンパク質の発現に使用される微生物細胞は、凍結融解サイクリング、超音波処理、機械的破砕、または細胞溶解剤の使用などといった任意の従来法で破砕することができる。
一定の態様では、Wnt経路インヒビターが小分子である。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、β-カテニンとCREB結合タンパク質（CBP）との間の相互作用を阻害する小分子である。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターがICG-001である。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、β-カテニンとT細胞因子（TCF）との間の相互作用を阻害する小分子である。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、iCRT-3、iCRT-5、またはiCRT-14である。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターがCPG049090である。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターがNC043である。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが第二世代バージョンのPRI-724である。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、porcupineと呼ばれるアシルトランスフェラーゼを阻害する小分子である。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターがLGK974である。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、IWP-1、IWP-2、IWP-3、またはIWP-4である。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、タンキラーゼ（例えばタンキラーゼ1またはタンキラーゼ2）を阻害する小分子である。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターがXAV939である。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターがJW55である。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターがIWRまたはIWR-1-endoである。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターがピルビニウムである。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターがCCT031374である。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターがSM04755である。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、XAV939、IWR1、IWP-1、IWP-2、JW74、JW55、オカダ酸、タウトマイシン、SB239063、SB203580、ADP-HPD、2-[4-(4-フルオロ-フェニル)ピペラジン-1-イル]-6-メチルピリミジン-4(3H)-オン、PJ34、ニクロサミド、カンビノール、スリンダク、3289-8625、J01-017a、NSC668036、フィリピン、IC261、PF670462、ボスチニブ、PHA665752、イマチニブ、ICG-001、エタクリン酸およびその誘導体、PKF115-584、PNU-74654、PKF118-744、CGP049090、PKF118-310、ZTM000990、BC21、GDC-0941、ならびにRp-8-Br-cAMPからなる群より選択される小分子である。
一定の態様では、結合作用物質を、いくつかのコンジュゲート（すなわちイムノコンジュゲートまたはラジオコンジュゲート）形態または非コンジュゲート形態のいずれか一つで使用することができる。一定の態様では、補体依存性細胞傷害および抗体依存性細胞傷害を含む対象の自然防御機構を利用して悪性細胞またはがん細胞を排除するために、抗体を非コンジュゲート形態で使用することができる。
いくつかの態様では、結合作用物質が、細胞傷害性作用物質にコンジュゲートされる。いくつかの態様では、細胞傷害性作用物質が化学療法剤、例えば限定するわけではないが、メトトレキサート、アドリアマイシン（adriamicin）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンC、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他の挿入剤である。いくつかの態様では、細胞傷害性作用物質が、細菌、真菌、植物、または動物由来の酵素的に活性な毒素、またはそのフラグメント、例えば限定するわけではないが、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、外毒素A鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、アルファ-サルシン、シナアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Phytolaca americana）タンパク質（PAPI、PAPII、およびPAP-S）、ニガウリ（Momordica charantia）インヒビター、クルシン、クロチン、サボウソウ（Sapaonaria officinalis）インヒビター、ゲロニン、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン、フェノマイシン（phenomycin）、エノマイシン（enomycin）、およびトリコテセン類である。いくつかの態様では、細胞傷害性作用物質が、ラジオコンジュゲートまたはラジオコンジュゲート抗体を生産するための放射性同位体である。ラジオコンジュゲート抗体の生産にはさまざまな放射性核種、例えば限定するわけではないが、90Y、125I、131I、123I、111In、131In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re、188Reおよび212Biなどを利用することができる。いくつかの態様では、抗体と、1つまたは複数の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド、トリコテン（trichothene）、およびCC1065、ならびに毒素活性を有するこれらの毒素の誘導体とのコンジュゲートを生産することができる。一定の態様では、抗体と細胞傷害性作用物質とのコンジュゲートが、さまざまな二官能性タンパク質カップリング剤、例えばN-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオール)プロピオネート（SPDP）、イミノチオラン（IT）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えばジメチルアジポイミデートHCL）、活性エステル（例えばスベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス-アジド化合物（例えばビス(p-アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス-ジアゾニウム誘導体（例えばビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン2,6-ジイソシアネート）、およびビス活性フッ素化合物（例えば1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン）を使って作られる。
一定の態様では、Wnt経路インヒビター（例えば抗体または可溶性受容体）が、少なくとも1種のWntタンパク質（すなわち1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10種のWntタンパク質）のアンタゴニストである。一定の態様において、Wnt経路インヒビターは、それが結合するWntタンパク質の活性を阻害する。一定の態様において、Wnt経路インヒビターは、それが結合するヒトWntタンパク質の活性を、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％、または約100％阻害する。
一定の態様では、Wnt経路インヒビター（例えば抗体または可溶性受容体）が、適当な受容体への少なくとも1種のヒトWntの結合を阻害する。一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、1種または複数種のヒトFZDタンパク質への少なくとも1種のヒトWntタンパク質の結合を阻害する。いくつかの態様では、少なくとも1種のWntタンパク質が、Wnt1、Wnt2、Wnt2b/13、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、およびWnt16からなる群より選択される。いくつかの態様では、1種または複数種のヒトFZDタンパク質が、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、およびFZD10からなる群より選択される。一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、および/またはFZD8への1種または複数種のWntタンパク質の結合を阻害する。一定の態様では、Wnt経路インヒビターによるFZDタンパク質への特定Wntの結合の阻害が、少なくとも約10％、少なくとも約25％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％、または少なくとも約95％である。一定の態様では、FZDタンパク質へのWntの結合を阻害するWnt経路インヒビターが、Wnt経路シグナル伝達も阻害する。一定の態様では、ヒトWnt経路シグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターが抗体である。一定の態様では、ヒトWnt経路シグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターが、抗Wnt抗体である。一定の態様では、ヒトWnt経路シグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターが、抗FZD抗体である。一定の態様では、ヒトWnt経路シグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターが、抗体OMP-18R5である。一定の態様では、ヒトWnt経路シグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターがFZD-Fc可溶性受容体である。一定の態様では、ヒトWnt経路シグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターが、FZD8-Fc可溶性受容体である。一定の態様では、ヒトWnt経路シグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターが、可溶性受容体OMP-54F28である。
一定の態様では、本明細書に記載するWnt経路インヒビター（例えば抗体または可溶性受容体）が、少なくとも1種のヒトWntタンパク質のアンタゴニストであり、Wnt活性を阻害する。一定の態様では、Wnt経路インヒビターがWnt活性を少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％、または約100％阻害する。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、1、2、3、4、5種、またはそれ以上のWntタンパク質の活性を阻害する。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、およびWnt16からなる群より選択される少なくとも1種のヒトWntタンパク質の活性を阻害する。いくつかの態様では、Wnt結合作用物質が、Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a、およびWnt10bからなる群より選択される少なくとも1種のWntタンパク質に結合する。一定の態様では、少なくとも1種のWntタンパク質が、Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a、およびWnt10bからなる群より選択される。一定の態様では、ヒトWnt活性を阻害するWnt経路インヒビターが抗体である。一定の態様では、ヒトWnt活性を阻害するWnt経路インヒビターが抗Wnt抗体である。一定の態様では、ヒトWnt活性を阻害するWnt経路インヒビターがFZD-Fc可溶性受容体である。一定の態様では、ヒトWnt活性を阻害するWnt経路インヒビターがFZD8-Fc可溶性受容体である。一定の態様では、ヒトWnt活性を阻害するWnt経路インヒビターが可溶性受容体OMP-54F28である。
一定の態様では、本明細書に記載するWnt経路インヒビターが、少なくとも1種のヒトFZDタンパク質のアンタゴニストであり、FZD活性を阻害する。一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、FZD活性を少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％、または約100％阻害する。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、1、2、3、4、5種、またはそれ以上のFZDタンパク質の活性を阻害する。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、およびFZD10からなる群より選択される少なくとも1種のヒトFZDタンパク質の活性を阻害する。一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、および/またはFZD8の活性を阻害する。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが抗FZD抗体である。一定の態様では、Wnt経路インヒビターが抗FZD抗体OMP-18R5である。
一定の態様では、本明細書に記載するWnt経路インヒビターが、少なくとも1種のヒトWntタンパク質のアンタゴニストであり、Wntシグナル伝達を阻害する。一定の態様では、Wnt経路インヒビターがWntシグナル伝達を少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％、または約100％阻害する。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、1、2、3、4、5種、またはそれ以上のWntタンパク質によるシグナル伝達を阻害する。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a、およびWnt10bからなる群より選択される少なくとも1種のWntタンパク質のシグナル伝達を阻害する。一定の態様では、Wntシグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターが抗体である。一定の態様では、Wntシグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターが抗Wnt抗体である。一定の態様では、Wntシグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターが可溶性受容体である。一定の態様では、Wntシグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターがFZD-Fc可溶性受容体である。一定の態様では、Wntシグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターがFZD8-Fc可溶性受容体である。一定の態様では、Wntシグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターが可溶性受容体OMP-54F28である。
一定の態様では、本明細書に記載するWnt経路インヒビターが、β-カテニンシグナル伝達のアンタゴニストである。一定の態様では、Wnt経路インヒビターがβ-カテニンシグナル伝達を少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％、または約100％阻害する。一定の態様では、β-カテニンシグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターが抗体である。一定の態様では、β-カテニンシグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターが抗Wnt抗体である。一定の態様では、β-カテニンシグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターが抗FZD抗体である。一定の態様では、β-カテニンシグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターが抗体OMP-18R5である。一定の態様では、β-カテニンシグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターが可溶性受容体である。一定の態様では、β-カテニンシグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターがFZD-Fc可溶性受容体である。一定の態様では、β-カテニンシグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターがFZD8-Fc可溶性受容体である。一定の態様では、β-カテニンシグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターが可溶性受容体OMP-54F28である。
一定の態様では、本明細書に記載するWnt経路インヒビターが、受容体への少なくとも1種のWntタンパク質の結合を阻害する。一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、少なくとも1種のヒトWntタンパク質の、1種または複数種のその受容体への結合を阻害する。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、少なくとも1種のFZDタンパク質への少なくとも1種のWntタンパク質の結合を阻害する。いくつかの態様では、Wnt結合作用物質が、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FDZ5、FDZ6、FDZ7、FDZ8、FDZ9、および/またはFZD10への少なくとも1種のWntタンパク質の結合を阻害する。一定の態様では、少なくとも1種のFZDタンパク質への少なくとも1種のWntの結合の阻害が、少なくとも約10％、少なくとも約25％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％、または少なくとも約95％である。一定の態様では、少なくとも1種のFZDタンパク質への少なくとも1種のWntの結合を阻害するWnt経路インヒビターがさらに、Wnt経路シグナル伝達および/またはβ-カテニンシグナル伝達を阻害する。一定の態様では、少なくとも1種のFZDタンパク質への少なくとも1種のヒトWntの結合を阻害するWnt経路インヒビターが抗体である。一定の態様では、少なくとも1種のFZDタンパク質への少なくとも1種のヒトWntの結合を阻害するWnt経路インヒビターが抗FZD抗体である。一定の態様では、少なくとも1種のFZDタンパク質への少なくとも1種のヒトWntの結合を阻害するWnt経路インヒビターが抗体OMP-18R5である。一定の態様では、少なくとも1種のFZDタンパク質への少なくとも1種のヒトWntの結合を阻害するWnt経路インヒビターが可溶性受容体である。一定の態様では、少なくとも1種のFZDタンパク質への少なくとも1種のヒトWntの結合を阻害するWnt経路インヒビターがFZD-Fc可溶性受容体である。一定の態様では、少なくとも1種のFZDタンパク質への少なくとも1種のヒトWntの結合を阻害するWnt経路インヒビターがFZD8-Fc可溶性受容体である。一定の態様では、少なくとも1種のFZDタンパク質への少なくとも1種のヒトWntの結合を阻害するWnt経路インヒビターがFZD8-Fc可溶性受容体OMP-54F28である。
一定の態様では、本明細書に記載するWnt経路インヒビターが、受容体への少なくとも1種のWntの結合を遮断する。一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、少なくとも1種のヒトWntタンパク質の、1種または複数種のその受容体への結合を遮断する。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、少なくとも1種のFZDタンパク質への少なくとも1種のWntの結合を遮断する。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FDZ5、FDZ6、FDZ7、FDZ8、FDZ9、および/またはFZD10への少なくとも1種のWntタンパク質の結合を遮断する。一定の態様では、少なくとも1種のFZDタンパク質への少なくとも1種のWntの結合の遮断が、少なくとも約10％、少なくとも約25％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％、または少なくとも約95％である。一定の態様では、少なくとも1種のFZDタンパク質への少なくとも1種のWntタンパク質の結合を遮断するWnt経路インヒビターがさらに、Wnt経路シグナル伝達および/またはβ-カテニンシグナル伝達を阻害する。一定の態様では、少なくとも1種のFZDタンパク質への少なくとも1種のヒトWntの結合を遮断するWnt経路インヒビターが、抗体である。一定の態様では、少なくとも1種のFZDタンパク質への少なくとも1種のヒトWntの結合を遮断するWnt経路インヒビターが、抗FZD抗体である。一定の態様では、少なくとも1種のFZDタンパク質への少なくとも1種のヒトWntの結合を遮断するWnt経路インヒビターが、抗体OMP-18R5である。一定の態様では、少なくとも1種のFZDタンパク質への少なくとも1種のヒトWntの結合を遮断するWnt経路インヒビターが、可溶性受容体である。一定の態様では、少なくとも1種のFZDタンパク質への少なくとも1種のヒトWntの結合を遮断するWnt経路インヒビターが、FZD-Fc可溶性受容体である。一定の態様では、少なくとも1種のFZDタンパク質への少なくとも1種のヒトWntの結合を遮断するWnt経路インヒビターが、FZD8-Fc可溶性受容体である。一定の態様では、少なくとも1種のFZDタンパク質への少なくとも1種のヒトWntの結合を遮断するWnt経路インヒビターが、可溶性受容体OMP-54F28である。
一定の態様では、本明細書に記載するWnt経路インヒビターが、Wnt経路シグナル伝達を阻害する。Wnt経路シグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターは、一定の態様では、Wntシグナル伝達経路中の1種または複数種の受容体によるシグナル伝達を阻害しうるが、必ずしも全ての受容体によるシグナル伝達を阻害しうるわけではないと理解される。一定の代替態様では、全てのヒト受容体によるWnt経路シグナル伝達が阻害されうる。一定の態様では、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FDZ5、FDZ6、FDZ7、FDZ8、FDZ9、およびFZD10からなる群より選択される1種または複数種の受容体によるWnt経路シグナル伝達が、阻害される。一定の態様では、Wnt経路インヒビターによるWnt経路シグナル伝達の阻害が、Wnt経路シグナル伝達のレベルの少なくとも約10％、少なくとも約25％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％、または少なくとも約95％の低減である。いくつかの態様では、Wnt経路シグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターが抗体である。いくつかの態様では、Wnt経路シグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターが抗FZD抗体である。いくつかの態様では、Wnt経路シグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターが抗体OMP-18R5である。いくつかの態様では、Wnt経路シグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターが可溶性受容体である。いくつかの態様では、Wnt経路シグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターがFZD-Fc可溶性受容体である。いくつかの態様では、Wnt経路シグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターがFZD8-Fc可溶性受容体である。いくつかの態様では、Wnt経路シグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターが可溶性受容体OMP-54F28である。
一定の態様では、本明細書に記載するWnt経路インヒビターが、β-カテニンの活性化を阻害する。β-カテニンの活性化を阻害するWnt経路インヒビターは、一定の態様では、1種または複数種の受容体によるβ-カテニンの活性化を阻害しうるが、必ずしも全ての受容体によるβ-カテニンの活性化を阻害しうるわけではないと理解される。一定の代替態様では、全てのヒト受容体によるβ-カテニンの活性化が阻害されうる。一定の態様では、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FDZ5、FDZ6、FDZ7、FDZ8、FDZ9、およびFZD10からなる群より選択される1種または複数種の受容体によるβ-カテニンの活性化が阻害される。一定の態様では、Wnt結合作用物質によるβ-カテニンの活性化の阻害が、β-カテニンの活性化のレベルの少なくとも約10％、少なくとも約25％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％、または少なくとも約95％の低減である。いくつかの態様では、β-カテニンの活性化を阻害するWnt経路インヒビターが抗体である。いくつかの態様では、β-カテニンの活性化を阻害するWnt経路インヒビターが抗FZD抗体である。いくつかの態様では、β-カテニンの活性化を阻害するWnt経路インヒビターが抗体OMP-18R5である。いくつかの態様では、β-カテニンの活性化を阻害するWnt経路インヒビターが可溶性受容体である。いくつかの態様では、β-カテニンの活性化を阻害するWnt経路インヒビターがFZD-Fc可溶性受容体である。いくつかの態様では、β-カテニンの活性化を阻害するWnt経路インヒビターがFZD8-Fc可溶性受容体である。いくつかの態様では、β-カテニンの活性化を阻害するWnt経路インヒビターが可溶性受容体OMP-54F28である。
Wnt経路インヒビターがWnt経路シグナル伝達を阻害するかどうかを決定するためのインビボアッセイおよびインビトロアッセイは、当技術分野において公知である。例えば、β-カテニンシグナル伝達レベルをインビトロで測定するには、ホタルルシフェラーゼリポーター遺伝子の上流に複数コピーのTCF結合ドメインを含有するTCF/Lucリポーターベクターを利用する、細胞に基づくルシフェラーゼレポーターアッセイを使用することができる（Gazit et al., 1999, Oncogene, 18;5959-66;TOPflash, Millipore、マサチューセッツ州ビルリカ）。1種または複数種のWntタンパク質（例えばトランスフェクト細胞が発現するWntまたはWnt条件培地によって提供されるWnt）の存在下、結合作用物質の存在下での、β-カテニンシグナル伝達のレベルを、結合作用物質が存在しない状態でのシグナル伝達のレベルと比較する。TCF/Lucリポーターアッセイに加えて、β-カテニンシグナル伝達に対する結合作用物質（または候補作用物質）の効果は、β-カテニンの調節を受ける遺伝子、例えばc-myc（He et al., 1998, Science, 281:1509-12）、サイクリンD1（Tetsu et al., 1999, Nature, 398:422-6）、および/またはフィブロネクチン（Gradl et al., 1999, Mol. Cell Biol., 19:5576-87）の発現のレベルに対する作用物質の効果を測定することにより、インビトロまたはインビボで測定することができる。一定の態様において、β-カテニンシグナル伝達に対する結合作用物質の効果は、ディシェベルド-1、ディシェベルド-2、ディシェベルド-3、LRP5、LRP6、および/またはβ-カテニンのリン酸化状態に対する作用物質の効果を測定することによって評価することもできる。
一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、以下の効果のうちの1つまたは複数を有する：腫瘍細胞の増殖を阻害する、腫瘍成長を阻害する、腫瘍サイズを低減する、腫瘍退縮を誘導する、腫瘍におけるがん幹細胞の頻度を低減する、腫瘍の腫瘍形成性を低減する、腫瘍におけるがん幹細胞の頻度を低減することによって腫瘍の腫瘍形成性を低減する、腫瘍細胞の細胞死を引き起こす、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する、腫瘍細胞の溶解を誘導する、腫瘍中の細胞の分化を誘発する、腫瘍形成性細胞を非腫瘍形成性状態へと分化させる、腫瘍細胞における分化マーカーの発現を誘導する、腫瘍細胞の転移を防止する、または腫瘍細胞の生存を減少させる。
一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、腫瘍成長を阻害する能力を有する。一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、インビボでの腫瘍成長を（例えば異種移植片マウスモデルにおいて、かつ/またはがんを有するヒトにおいて）阻害する能力を有する。いくつかの態様では、腫瘍が、結腸直腸腫瘍、結腸腫瘍、膵腫瘍、肺腫瘍、卵巣腫瘍、肝腫瘍、乳房腫瘍、腎臓腫瘍、前立腺腫瘍、胃腸腫瘍、メラノーマ、子宮頸部腫瘍、膀胱腫瘍、膠芽腫、および頭頸部腫瘍からなる群より選択される腫瘍である。一定の態様では、腫瘍が乳房腫瘍である。一定の態様では、腫瘍が卵巣腫瘍である。一定の態様では、腫瘍が肺腫瘍である。一定の態様では、腫瘍が膵腫瘍である。一定の態様では、腫瘍がWnt依存性腫瘍である。
一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、腫瘍の腫瘍形成性を低減する能力を有する。一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、動物モデル、例えばマウス異種移植モデルにおいて、がん幹細胞を含む腫瘍の腫瘍形成性を低減する能力を有する。一定の態様では、腫瘍におけるがん幹細胞の数または頻度が、少なくとも約2分の1、約3分の1、約5分の1、約10分の1、約50分の1、約100分の1、または約1000分の1に低減する。一定の態様では、がん幹細胞の数または頻度の低減が、動物モデルを使った限界希釈アッセイによって決定される。限界希釈アッセイを使って腫瘍におけるがん幹細胞の数または頻度の低減を決定する工程に関するさらなる例と指針は、例えば国際公開公報第2008/042236号ならびに米国特許公報第2008/0064049号および同第2008/0178305号に見いだすことができる。
一定の態様では、本明細書に記載するWnt経路インヒビターが、少なくとも1時間、少なくとも約2時間、少なくとも約5時間、少なくとも約10時間、少なくとも約24時間、少なくとも約2日、少なくとも約3日、少なくとも約1週間、または少なくとも約2週間は、インビボで活性である。一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、少なくとも1時間、少なくとも約2時間、少なくとも約5時間、少なくとも約10時間、少なくとも約24時間、少なくとも約2日、少なくとも約3日、少なくとも約1週間、または少なくとも約2週間は、インビボで活性なIgG（例えばIgG1またはIgG2）抗体である。一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、少なくとも1時間、少なくとも約2時間、少なくとも約5時間、少なくとも約10時間、少なくとも約24時間、少なくとも約2日、少なくとも約3日、少なくとも約1週間、または少なくとも約2週間は、インビボで活性な融合タンパク質である。
一定の態様では、本明細書に記載するWnt経路インヒビターが、マウス、カニクイザル、またはヒトにおいて、少なくとも約5時間、少なくとも約10時間、少なくとも約24時間、少なくとも約2日、少なくとも約3日、少なくとも約1週間、または少なくとも約2週間の循環半減期を有する。一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、マウス、カニクイザル、またはヒトにおいて、少なくとも約5時間、少なくとも約10時間、少なくとも約24時間、少なくとも約2日、少なくとも約3日、少なくとも約1週間、または少なくとも約2週間の循環半減期を有するIgG（例えばIgG1またはIgG2）抗体である。一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、マウス、カニクイザル、またはヒトにおいて、少なくとも約5時間、少なくとも約10時間、少なくとも約24時間、少なくとも約2日、少なくとも約3日、少なくとも約1週間、または少なくとも約2週間の循環半減期を有する融合タンパク質である。ポリペプチドおよび抗体などの作用物質の半減期を増加（または減少）させる方法は、当技術分野において公知である。例えば、IgG抗体の循環半減期を増加させる公知の方法として、新生児型Fc受容体（FcRn）への抗体のpH依存的結合を増加させるFc領域への変異の導入が挙げられる。Fc領域を欠く抗体フラグメントの循環半減期を増加させる公知の方法として、PEG化などの技法が挙げられる。
IV．有糸分裂インヒビター
本明細書に記載する方法は、腫瘍成長を阻害するため、腫瘍サイズを低減するため、および／またはがんの処置のための、有糸分裂インヒビターとの併用療法における使用のためのWnt経路インヒビターを含む。有糸分裂インヒビターまたは抗有糸分裂作用物質には、微小管結合剤、微小管酵素インヒビター、有糸分裂チェックポイントキナーゼ（CHK）インヒビター、および有糸分裂酵素インヒビターが含まれるが、それらに限定されるわけではない。微小管結合剤には、タキサン、タキソイド、ビンカアルカロイド、アルカロイド、エポチロン、およびハリコンドリンが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
いくつかの態様では、有糸分裂インヒビターが、タキサン、ビンカアルカロイド、エポチロン、またはハリコンドリンからなる群より選択される。いくつかの態様では、有糸分裂インヒビターがタキサンである。タキサンは、微小管脱重合の阻害（すなわち微小管ポリマーの安定化）を通して有糸分裂細胞周期遮断を誘発する。有糸分裂細胞周期遮断は、有糸分裂の阻止およびアポトーシスをもたらす。いくつかの態様では、タキサンが、パクリタキセル（TAXOL）、nab-パクリタキセル（ABRAXANE）、ドセタキセル（TAXOTERE）、カバジタキセル（JEVTANA）、テセタキセル、ラロタキセル、オルタタキセル、DHA-パクリタキセル、PG-パクリタキセル、およびそれらの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体からなる群より選択される。いくつかの態様では、有糸分裂インヒビターがビンカアルカロイドである。いくつかの態様では、ビンカアルカロイドが、ビンブラスチン（VELBAN）、ビンクリスチン（MARQIBO）、ビノレルビン（NAVELBINE）、ビンカジホルミン、ビンデシン、ビンフルニン、ミノビンシン、およびそれらの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体からなる群より選択される。いくつかの態様では、有糸分裂インヒビターが、ネオキサリンなどのアルカロイドである。いくつかの態様では、有糸分裂インヒビターがエポチロンである。いくつかの態様では、エポチロンがイクサベピロン（IXEMPRA）である。いくつかの態様では、有糸分裂インヒビターがハリコンドリンBである。いくつかの態様では、ハリコンドリンが類似体エリブリンメシラート（HALAVEN）である。いくつかの態様では、有糸分裂インヒビターが微小管酵素インヒビターである。いくつかの態様では、微小管酵素インヒビターが、ARQ 621、EMD 534085、およびLY2523355からなる群より選択される。いくつかの態様では、有糸分裂インヒビターが有糸分裂チェックポイントキナーゼインヒビターである。いくつかの態様では、有糸分裂チェックポイントキナーゼインヒビターがLY2603618である。いくつかの態様では、有糸分裂インヒビターが有糸分裂酵素インヒビターである。いくつかの態様では、有糸分裂酵素インヒビターがAurora AまたはPLK1のインヒビターである。いくつかの態様では、有糸分裂酵素インヒビターが、MLN8237、ENMD-0276、AZD1152、GSK1070916A、PHA-739358、SNS-314、CYC116、PF-03814735、AT9238、AS703569、およびBI 6727からなる群より選択される。
実施例1
化学療法剤と併用したFZD8-Fc可溶性受容体OMP-54F28のインビボでの活性
本明細書に記載するOncoMed異種移植モデルは、最小限継代された患者由来の腫瘍検体からOncoMed Pharmaceuticalsで確立された。腫瘍検体を、病理学者が検査し、特定の腫瘍タイプとして分類した。いずれかの特定の腫瘍に対してさらなる解析が行われ、再分類が必要であるとみなされない限り、OncoMedは、これらの分類に依拠する。
異種移植OMP-OV19卵巣腫瘍細胞（1×105細胞）の単一細胞懸濁液を、6〜8週齢のNOD/SCIDマウスに皮下注射した。腫瘍を、120mm3の平均体積に達するまで、28日成長させた。マウスを無作為化して（群あたりn＝9）、パクリタキセル、nab-パクリタキセル、カルボプラチン、カルボプラチンおよびパクリタキセルの併用、OMP-54F28およびパクリタキセルの併用、OMP-54F28およびnab-パクリタキセルの併用、OMP-54F28およびカルボプラチンの併用、OMP-54F28、カルボプラチン、およびパクリタキセルの併用、または対照抗体で処置した。マウスを、45mg/kgの用量の対照抗体またはOMP-54F28、10mg/kgの用量のパクリタキセル、7.5mg/kgの用量のnab-パクリタキセル、30mg/kgの用量のカルボプラチン、または5mg/kgの用量のパクリタキセルと併用した15mg/kgの用量のカルボプラチンで、3週間に1回処置した。すべての薬物を腹腔内投与した。腫瘍成長をモニタリングして、腫瘍体積を表示した時点に電子カリパスで測定した。データを平均±標準誤差として表す。
図1に示すように、化学療法剤のそれぞれと併用したOMP-54F28は、化学療法剤のみよりも大きい程度まで卵巣腫瘍OMP-OV19の成長を低減した。驚くべきことに、OMP-54F28と、タキサン化学療法剤のそれぞれ（パクリタキセル（図1A）、nab-パクリタキセル（図1B）、またはパクリタキセルおよびカルボプラチン（図1C））との併用は、OMP-54F28およびカルボプラチンの併用、またはカルボプラチンのみよりも大きな阻害を示した（図1D）。同様の結果が、他の腫瘍タイプにおいて得られている。
これらの結果は、OMP-54F28およびOMP-18R5などのWnt経路インヒビターが、他のクラスの化学療法剤よりもタキサンと併用して、より大きな活性を有し、かつ／またはより有効であるという仮説を支持する。
これらの結果についての可能な説明は、Wntおよびさまざまなクラスの化学療法剤による細胞周期阻害の異なる機序に集中する。Wntシグナル伝達は、細胞周期のG2/M期にピークに達し、有糸分裂の細胞分裂の調節において重要な役割を果たすことが示されている（Niehrs and Acebron, 2012, EMBO J, 31:2705-2713）。タキサンでの処置は、微小管安定化に対する効果を通して有糸分裂で細胞分裂を遮断することが、十分に確立されている。対照的に、他の化学療法剤、例えば、カルボプラチンなどの白金化合物またはゲムシタビンなどのヌクレオシド類似体は、DNA合成を阻害し、細胞周期をG1/S期で遮断する。
それゆえに、タキサンおよびWnt経路インヒビターは、細胞周期の有糸分裂期の間に細胞周期の進行を相乗的に抑制または遮断するように共に働くことができ、有糸分裂の分断および腫瘍細胞の死をもたらす。
実施例2
パクリタキセルと併用した抗FZD抗体OMP-18R5の活性に対する時間差投薬スケジュールの効果
異種移植UM-PE13乳房腫瘍細胞（20,000細胞）の単一細胞懸濁液を、6〜8週齢のNOD/SCIDマウスに皮下注射した。UM-PE13は三種陰性乳がんである。腫瘍を、80mm3の平均体積に達するまで、34日成長させた。マウスを無作為化して（群あたりn＝8）、パクリタキセル、同じ日に投与したOMP-18R5およびパクリタキセルの併用、パクリタキセルをOMP-18R5の3日前に投与したOMP-18R5およびパクリタキセルの併用、OMP-18R5をパクリタキセルの3日前に投与したOMP-18R5およびパクリタキセルの併用、または対照抗体で処置した。マウスを、25mg/kgの用量のOMP-18R5および20mg/kgの用量のパクリタキセルで、3週間に1回処置した。OMP-18R5およびパクリタキセルは、腹腔内投与した。腫瘍成長をモニタリングして、腫瘍体積を表示した時点に電子カリパスで測定した。データを平均±標準誤差として表す。
図2に示すように、OMP-18R5をパクリタキセルの投与の前に投与するOMP-18R5およびパクリタキセルの時間差投与は、他の投薬レジメンのいずれよりも、UM-PE13乳房腫瘍細胞の腫瘍成長の阻害が有意により良好であった。重要なことに、Wnt経路インヒビターをタキサンの2日前に投与した時には、個々のマウスのいくつかにおける腫瘍が、検出不可能なレベルまで退縮した。
これらの研究は、特に、Wnt経路インヒビターおよびタキサンの両方を間欠的に投与する場合に、投薬の順序およびタイミングが、腫瘍成長の阻害および／または退縮の程度に有意な影響を及ぼしうることを示唆する。
実施例3
パクリタキセルと併用したFZD8-Fc可溶性受容体OMP-54F28の活性に対する時間差投薬スケジュールの効果
異種移植OMP-OV38卵巣腫瘍細胞（1×105細胞）の単一細胞懸濁液を、6〜8週齢のNOD/SCIDマウスに皮下注射した。腫瘍を、140mm3の平均体積に達するまで、38日成長させた。マウスを無作為化して（群あたりn＝9）、パクリタキセル、同じ日に投与したOMP-54F28およびパクリタキセルの併用、パクリタキセルをOMP-54F28の2日前に投与したOMP-54F28およびパクリタキセルの併用、OMP-54F28をパクリタキセルの2日前に投与したOMP-54F28およびパクリタキセルの併用、または対照抗体で処置した。マウスを、25mg/kgの用量のOMP-54F28および20mg/kgの用量のパクリタキセルで、2週間に1回処置した。OMP-54F28およびパクリタキセルは、腹腔内投与した。腫瘍成長をモニタリングして、腫瘍体積を表示した時点に電子カリパスで測定した。データを平均±標準誤差として表す。
図3Aに示すように、OMP-54F28をパクリタキセルの投与の前に投与するOMP-54F28およびパクリタキセルの時間差投与は、他の投薬レジメンのいずれよりも、OMP-OV38卵巣腫瘍細胞の腫瘍成長の阻害が有意により良好であった。図3Bに示すように、同様の結果が、OMP-OV22卵巣腫瘍細胞を用いた第2の異種移植モデルにおいて観察された。
最適な時間差投薬レジメンを決定するために、追加の研究を実施した。OMP-54F28を、パクリタキセルの投与の1日前、パクリタキセルの投与の2日前、またはパクリタキセルの投与の4日前に、OV38腫瘍を有するマウスに投与した。図3Cに示すように、パクリタキセルの1または2日前のOMP-54F28の投与は、最大量の腫瘍成長阻害をもたらし、パクリタキセルの2日前のOMP-54F28の投与が、これらの研究における最適な投薬レジメンであった。
処置したOMP-OV38腫瘍を、組織像によって解析した。解析により、パクリタキセルの前にWnt経路インヒビターを使用する時間差投薬スケジュールは、腫瘍の組織像に対して劇的な効果を生じることが示された。このレジメンで処置した腫瘍は、多核細胞、巨大核を有する拡大した細胞、核濃縮、および明らかな細胞死を含む、有糸分裂の分断の証拠を有する多くの細胞を含有していた。対照的に、パクリタキセルのみで、同時に投与した時のWnt経路インヒビターおよびパクリタキセルで、またはパクリタキセルをWnt経路インヒビターの前に投与した時のWnt経路インヒビターおよびパクリタキセルで処置した腫瘍細胞は、これらの効果を示さなかった（データを示していない）。これらの結果は、OMP-18R5またはOMP-54F28などのWnt経路インヒビターの先行投薬が、有糸分裂のG2/M期での有糸分裂Wntシグナル伝達の遮断につながり、この活性が、タキサン処置に起因する有糸分裂阻害と相乗作用を示して、腫瘍における細胞死を促進するという仮説を支持する。
これらの異種移植の結果は、臨床における最良の併用活性が、タキサン含有化学療法レジメンを施行する前に（例えば2日前に）Wnt経路インヒビターを投与することによって達成されうることを示唆する。このスケジューリングは、タキサンが3週スケジュールで投与されるレジメンについて特に重要でありうる。
実施例4
非小細胞肺がんを有する患者におけるドセタキセルと併用したバンチクツマブ（OMP-18R5）の第1b相試験
この試験は、以前に処置された再発性または進行性非小細胞肺がん（NSCLC）を有する患者における、ドセタキセルと併用したバンチクツマブのオープンラベル第1b相用量漸増試験である。試験の主目的は、ドセタキセルと併用したバンチクツマブの安全性および最大耐用量を決定することである。ドセタキセルと併用したバンチクツマブについて推奨される第2相用量を特定するためである。副次的目的は、ドセタキセルと併用して投与した時のバンチクツマブの薬物動態（PK）を特徴決定すること、バンチクツマブの免疫原性を特徴決定すること、およびドセタキセルと併用して投与した時のバンチクツマブの有効性の予備的評価を行うことである。
バンチクツマブを、各21日サイクルの1日目に投与する。コホート1および2についてのバンチクツマブの用量レベルは、それぞれ、5mg/kgおよび10mg/kgであった。コホート1および2について、ドセタキセル（75mg/m2）を各サイクルの1日目にIV投与する。第1相プログラムにおいて観察された脆弱性骨折のために、コホート1および2におけるすべての患者についてバンチクツマブを中断した。コホート3および4の患者に、それぞれ、3週間に1回、2mg/kgおよび4mg/kgでバンチクツマブを投与することになる。用量コホート内で、バンチクツマブの用量漸増は許容されないことになる。時間差投薬レジメンを、コホート3および4において評定することになる。ドセタキセル（75mg/m2）を、各サイクルの3日目にIV投与することになる。
実施例5
卵巣がんを有する患者におけるパクリタキセルおよびカルボプラチンと併用したイパフリセプト（OMP-54F28）の第1b相試験
この試験は、再発性白金感受性卵巣がんを有する患者における、パクリタキセルおよびカルボプラチンと併用したイパフリセプトのオープンラベル第1b相用量漸増試験である。試験の主目的は、パクリタキセルおよびカルボプラチンと併用したイパフリセプトの安全性および最大耐用量を決定することである。パクリタキセルおよびカルボプラチンと併用したイパフリセプトについて推奨される第2相用量を特定するためである。副次的目的は、パクリタキセルおよびカルボプラチンと併用して投与した時のイパフリセプトの薬物動態（PK）を特徴決定すること、パクリタキセルおよびカルボプラチンと併用して投与した時のイパフリセプトの免疫原性を特徴決定すること、ならびに、パクリタキセルおよびカルボプラチンと併用して投与した時のイパフリセプトの有効性の予備的評価を行うことである。
イパフリセプトを、各21日サイクルの1日目に投与する。コホート1および2についてのイパフリセプトの用量レベルは、それぞれ、5mg/kgおよび10mg/kgであった。コホート1および2について、パクリタキセル（175mg/m2）およびカルボプラチン（AUC＝5mg/ml・分）を各サイクルの1日目にIV投与する。第1相プログラムにおいて観察された脆弱性骨折のために、コホート1および2におけるすべての患者についてイパフリセプトを中断した。コホート3および4の患者に、それぞれ、3週間に1回、2mg/kgおよび4mg/kgでイパフリセプトを投与することになる。用量コホート内で、イパフリセプトの用量漸増は許容されないことになる。時間差投薬レジメンを、コホート3および4において評定することになる。パクリタキセル（175mg/m2）およびカルボプラチン（AUC＝5mg/ml・分）を、各サイクルの3日目にIV投与することになる。
実施例6
肺腫瘍異種移植モデルにおけるパクリタキセルと併用した抗FZD抗体OMP-18R5の活性に対する時間差投薬スケジュールの効果
OMP-LU77は、患者由来の非小細胞肺（NSCLC）腫瘍である。異種移植OMP-LU77肺腫瘍細胞（50,000細胞）の単一細胞懸濁液を、NOD/SCIDマウスに皮下注射した。腫瘍を、およそ200mm3の平均体積に達するまで、37日成長させた。腫瘍を有するマウスを、無作為化して4群に分けた（群あたりn＝8〜9）。腫瘍を有するマウスを、パクリタキセルのみ、同じ日に投薬したバンチクツマブ（OMP-18R5）およびパクリタキセルの併用、抗体をパクリタキセルの2日前に投与したバンチクツマブおよびパクリタキセルの併用、または対照抗体で処置した。抗体は、25mg/kgで投薬し、1週間おきに投与した。パクリタキセルは、15mg/kgで、同じく1週間おきに投与した。腫瘍成長をモニタリングして、腫瘍体積を処置後の表示した日に測定した。データを平均±標準誤差として表す。
図4に示すように、バンチクツマブをパクリタキセルの投与の前に投与するバンチクツマブおよびパクリタキセルの時間差投与は、他の投薬レジメンのいずれよりも、OMP-LU77肺腫瘍細胞の腫瘍成長の阻害が有意に良好であった。
実施例7
OMP-LU77肺腫瘍中のがん幹細胞に対するOMP-18R5およびパクリタキセルの併用処置の効果
限界希釈アッセイ（LDA）を使用して、固形腫瘍がん幹細胞に対する、および／または腫瘍の腫瘍形成性に対するWnt経路インヒビターの効果を評価することができる。アッセイを使用して、Wnt経路インヒビターで処置した動物由来の腫瘍中のがん幹細胞の頻度を決定し、その頻度を、対照動物由来の腫瘍中のがん幹細胞の頻度と比較することができる。
上記（実施例6）のOMP-LU77異種移植モデル由来の対照および処置した腫瘍を、試験の終わりに回収した。腫瘍を加工処理して、単一細胞に分離した。磁石の力を借りてマウス細胞を除去するために、腫瘍細胞を、ビオチン化マウス抗体（抗マウスCD45-ビオチンおよびラット抗マウスH2Kd-ビオチン, BioLegend, San Diego, CA）と氷上で30分間インキュベートし、その後、ストレプトアビジン標識磁気ビーズ（Invitrogen, Carlsbad, CA）を添加した。
LDAのために、懸濁液中の腫瘍細胞を回収し、計数して、適当な細胞用量（50、150、および500細胞）をNOD/SCIDマウスに皮下注射した（処置群あたり細胞用量あたり10匹のマウス）。図5Aに示すように、腫瘍を79日間成長させた。図5A中の各記号は、個々のマウスの腫瘍体積に相当する。検出可能な腫瘍を有するマウスのパーセンテージを、すべての処置群において決定し、対照における検出可能な腫瘍を有するマウスのパーセンテージと比較した。腫瘍成長頻度を使用して、L-Calc（商標）ソフトウェアを用いてがん幹細胞頻度を算出した。処置群のそれぞれについて算出されたがん幹細胞頻度を、図5Bに示す。バンチクツマブ（OMP-18R5）がパクリタキセルの投与の前に投与されるバンチクツマブおよびパクリタキセルの時間差投与は、がん幹頻度を有意に減少させた。
実施例8
パクリタキセルと併用したOMP-54F28の活性に対する時間差投薬スケジュールの効果
異種移植OMP-OV19卵巣腫瘍細胞の単一細胞懸濁液を、6〜8週齢のNOD/SCIDマウスに皮下注射した。腫瘍を、120mm3の平均体積に達するまで成長させた。マウスを無作為化して（群あたりn＝8〜10）、パクリタキセル、同じ日に投与したOMP-54F28およびパクリタキセルの併用、OMP-54F28をパクリタキセルの2日前に投与したOMP-54F28およびパクリタキセルの併用、または対照抗体で処置した。マウスを、20mg/kgの用量のOMP-54F28および20mg/kgの用量のパクリタキセルで、2週間に1回処置した。OMP-54F28およびパクリタキセルは、腹腔内投与した。腫瘍成長をモニタリングして、腫瘍体積を表示した時点に電子カリパスで測定した。データを平均±標準誤差として表す。
図6に示すように、OMP-54F28をパクリタキセルの投与の2日前に投与するOMP-54F28およびパクリタキセルの時間差投与は、他の投薬レジメンのいずれよりも、OMP-OV19卵巣腫瘍細胞の腫瘍成長の阻害が有意により良好であった。図6において実証されるように、腫瘍成長が阻害されただけではなく、OMP-54F28およびパクリタキセルの時間差処置は、確立された卵巣腫瘍の退縮を誘発した。驚くべきことに、この腫瘍成長阻害／退縮は、170日よりも長く維持された。
実施例9
乳がん異種移植モデルにおけるパクリタキセルと併用したWntインヒビターの時間差投薬レジメン
異種移植OMP-B90乳房腫瘍細胞の単一細胞懸濁液を、6〜8週齢のNOD/SCIDマウスに皮下注射した。腫瘍を、およそ137mm3の平均体積に達するまで成長させた。マウスを無作為化して（群あたりn＝9）、パクリタキセル、同じ日に投与したOMP-18R5およびパクリタキセルの併用、OMP-18R5をパクリタキセルの2日前に投与したOMP-18R5およびパクリタキセルの併用、OMP-54F28、同じ日に投与したOMP-54F28およびパクリタキセルの併用、OMP-54F28をパクリタキセルの2日前に投与したOMP-54F28およびパクリタキセルの併用、または対照抗体で処置した。マウスを、25mg/kgの用量のOMP-18R5、OMP-54F28、または対照抗体で2週間に1回処置し、10mg/kgの用量のパクリタキセルで1週間に1回処置した。抗体およびパクリタキセルは、腹腔内投与した。腫瘍成長をモニタリングして、腫瘍体積を表示した時点に電子カリパスで測定した。データを平均±標準誤差として表す。
図7に示すように、Wnt経路インヒビターをパクリタキセルの投与の2日前に投与した、Wnt経路インヒビターOMP-18R5およびOMP-54F28、ならびにパクリタキセルの時間差投与は、他の投薬レジメンのいずれよりも、OMP-B90乳房腫瘍細胞の腫瘍成長の阻害が有意により良好であった。腫瘍成長が阻害されただけではなく、Wnt経路インヒビターおよびパクリタキセルの時間差処置は、確立された乳房腫瘍の退縮を誘発した。
実施例10
結腸がん異種移植モデルにおけるパクリタキセルと併用したWntインヒビターでの時間差投薬レジメン
異種移植OMP-C28結腸腫瘍細胞の単一細胞懸濁液を、6〜8週齢のNOD/SCIDマウスに皮下注射した。腫瘍を、およそ89mm3の平均体積に達するまで成長させた。マウスを無作為化して（群あたりn＝9）、nab-パクリタキセル、OMP-18R5、OMP-54F28、OMP-18R5をnab-パクリタキセルの2日前に投与したOMP-18R5およびnab-パクリタキセルの併用、OMP-54F28をnab-パクリタキセルの2日前に投与したOMP-54F28およびnab-パクリタキセルの併用、または対照で処置した。マウスを、25mg/kgの用量のOMP-18R5、OMP-54F28、または対照で2週間に1回処置し、15mg/kgの用量のnab-パクリタキセルで1週間に1回処置した。抗体およびnab-パクリタキセルは、腹腔内投与した。腫瘍成長をモニタリングして、腫瘍体積を表示した時点に電子カリパスで測定した。データを平均±標準誤差として表す。
図8に示すように、Wnt経路インヒビターをパクリタキセルの投与の2日前に投与した、Wnt経路インヒビターOMP-18R5（図8A）およびOMP-54F28（図8B）、ならびにnab-パクリタキセルの時間差投与は、Wnt経路インヒビターまたはnab-パクリタキセルのみのいずれかよりも大きい程度まで、OMP-C28結腸腫瘍細胞の腫瘍成長を阻害した。
実施例11
結腸がん異種移植モデルにおけるパクリタキセルと併用したWntインヒビターでの時間差投薬レジメン
異種移植OMP-OV40卵巣腫瘍細胞の単一細胞懸濁液を、6〜8週齢のNOD/SCIDマウスに皮下注射した。腫瘍を、およそ128mm3の平均体積に達するまで成長させた。マウスを無作為化して（群あたりn＝8）、パクリタキセル、OMP-18R5、OMP-54F28、OMP-18R5をnab-パクリタキセルの2日前に投与したOMP-18R5およびnab-パクリタキセルの併用、OMP-54F28をnab-パクリタキセルの2日前に投与したOMP-54F28およびnab-パクリタキセルの併用、または対照抗体で処置した。マウスを、25mg/kgの用量のOMP-18R5、OMP-54F28、または対照で2週間に1回処置し、20mg/kgの用量のパクリタキセルで2週間に1回処置した。抗体およびパクリタキセルは、腹腔内投与した。腫瘍成長をモニタリングして、腫瘍体積を表示した時点に電子カリパスで測定した。データを平均±標準誤差として表す。
図9に示すように、Wnt経路インヒビターをパクリタキセルの投与の2日前に投与した、Wnt経路インヒビターOMP-18R5（図9A）およびOMP-54F28（図9B）、ならびにパクリタキセルの時間差投与は、Wnt経路インヒビターまたはパクリタキセルのみのいずれかよりも大きい程度まで、OMP-OV40卵巣腫瘍細胞の腫瘍成長を阻害した。
これらの結果は、パクリタキセルと併用した抗FZD抗体OMP-18R5、およびパクリタキセルと併用した可溶性受容体OMP-54F28が、卵巣腫瘍の場合に腫瘍成長を阻害したことを示した。
本明細書に記載する実施例および態様は例示のために過ぎないこと、ならびに、それらに照らしてさまざまな変更または改変が当業者には示唆され、それらは本願の本旨および範囲内に含まれるべきものであることが、理解される。
本明細書において言及するすべての刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、ならびに、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列の両方を含むアクセッション番号／データベース配列は、各個々の刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、またはアクセッション番号／データベース配列が参照によりそのように組み入れられることを具体的にかつ個別に示した場合と同じ程度に、すべての目的でその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
以下の配列が、本願において開示される。
SEQ ID NO:1 18R5重鎖アミノ酸配列（下線部は予測シグナル配列）
Figure 2017526676
SEQ ID NO:2 18R5軽鎖アミノ酸配列（下線部は予測シグナル配列）
Figure 2017526676
SEQ ID NO:3 18R5重鎖アミノ酸配列（予測シグナル配列なし）
Figure 2017526676
SEQ ID NO:4 18R5軽鎖アミノ酸配列（予測シグナル配列なし）
Figure 2017526676
SEQ ID NO:5 18R5重鎖可変領域アミノ酸配列
Figure 2017526676
SEQ ID NO:6 18R5軽鎖可変領域アミノ酸配列
Figure 2017526676
SEQ ID NO:7 18R5重鎖CDR1
Figure 2017526676
SEQ ID NO:8 18R5重鎖CDR2
Figure 2017526676
SEQ ID NO:9 18R5重鎖CDR3
Figure 2017526676
SEQ ID NO:10 18R5軽鎖CDR1
Figure 2017526676
SEQ ID NO:11 18R5軽鎖CDR2
Figure 2017526676
SEQ ID NO:12 18R5軽鎖CDR3
Figure 2017526676
SEQ ID NO:13 ヒトFZD1 Friドメインアミノ酸配列（予測シグナル配列なし）
Figure 2017526676
SEQ ID NO:14 ヒトFZD2 Friドメインアミノ酸配列（予測シグナル配列なし）
Figure 2017526676
SEQ ID NO:15 ヒトFZD3 Friドメインアミノ酸配列（予測シグナル配列なし）
Figure 2017526676
SEQ ID NO:16 ヒトFZD4 Friドメインアミノ酸配列（予測シグナル配列なし）
Figure 2017526676
SEQ ID NO:17 ヒトFZD5 Friドメインアミノ酸配列（予測シグナル配列なし）
Figure 2017526676
SEQ ID NO:18 ヒトFZD6 Friドメインアミノ酸配列（予測シグナル配列なし）
Figure 2017526676
SEQ ID NO:19 ヒトFZD7 Friドメインアミノ酸配列（予測シグナル配列なし）
Figure 2017526676
SEQ ID NO:20 ヒトFZD8 Friドメインアミノ酸配列（予測シグナル配列なし）
Figure 2017526676
SEQ ID NO:21 ヒトFZD8 Friドメインアミノ酸配列（予測シグナル配列なし）
Figure 2017526676
SEQ ID NO:22 ヒトFZD9 Friドメインアミノ酸配列（予測シグナル配列なし）
Figure 2017526676
SEQ ID NO:23 ヒトFZD10 Friドメインアミノ酸配列（予測シグナル配列なし）
Figure 2017526676
SEQ ID NO:24 ヒトIgG1 Fc領域
Figure 2017526676
SEQ ID NO:25 ヒトIgG1 Fc領域
Figure 2017526676
SEQ ID NO:26 ヒトIgG1 Fc領域
Figure 2017526676
SEQ ID NO:27 ヒトIgG1 Fc領域
Figure 2017526676
SEQ ID NO:28 ヒトIgG2 Fc領域
Figure 2017526676
SEQ ID NO:29 FZD8-Fc 54F28アミノ酸配列（予測シグナル配列なし）
Figure 2017526676
SEQ ID NO:30 FZD8-Fc 54F28（下線部は予測シグナル配列）
Figure 2017526676
SEQ ID NO:31 ヒトWnt1 C末端システインリッチドメイン（aa 288〜370）
Figure 2017526676
SEQ ID NO:32 ヒトWnt2 C末端システインリッチドメイン（aa 267〜360）
Figure 2017526676
SEQ ID NO:33 ヒトWnt2b C末端システインリッチドメイン（aa 298〜391）
Figure 2017526676
SEQ ID NO:34 ヒトWnt3 C末端システインリッチドメイン（aa 273〜355）
Figure 2017526676
SEQ ID NO:35 ヒトWnt3a C末端システインリッチドメイン（aa 270〜352）
Figure 2017526676
SEQ ID NO:36 ヒトWnt7a C末端システインリッチドメイン（aa 267〜359）
Figure 2017526676
SEQ ID NO:37 ヒトWnt7b C末端システインリッチドメイン（aa 267〜349）
Figure 2017526676
SEQ ID NO:38 ヒトWnt8a C末端システインリッチドメイン（aa 248〜355）
Figure 2017526676
SEQ ID NO:39 ヒトWnt8b C末端システインリッチドメイン（aa 245〜351）
Figure 2017526676
SEQ ID NO:40 ヒトWnt10a C末端システインリッチドメイン（aa 335〜417）
Figure 2017526676
SEQ ID NO:41 ヒトWnt10b C末端システインリッチドメイン（aa 307〜389）
Figure 2017526676

Claims (24)

  1. 対象に、治療有効量のWnt経路インヒビターおよび治療有効量の有糸分裂インヒビターを投与する工程を含む、がんを処置するおよび／または腫瘍成長を阻害する方法であって、
    Wnt経路インヒビターおよび有糸分裂インヒビターが時間差投薬スケジュールを用いて投与され、Wnt経路インヒビターが最初に投与され、かつWnt経路インヒビターが、
    （a）少なくとも1種のヒトFrizzled（FZD）タンパク質に特異的に結合する抗体、または
    （b）ヒトFZDタンパク質のFriドメインを含む可溶性受容体
    である、方法。
  2. 有糸分裂インヒビターが、Wnt経路インヒビターの投与の約1、2、3、4、5、または6日後に投与される、請求項1記載の方法。
  3. Wnt経路インヒビターが3週間に1回投与される、請求項1または請求項2記載の方法。
  4. Wnt経路インヒビターが約4週間に1回投与される、請求項1または請求項2記載の方法。
  5. 有糸分裂インヒビターが、約1週間に1回、約2週間に1回、約3週間に1回、または4週間（28日）サイクルのうち3週間にわたって1週間に1回投与される、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
  6. Wnt経路インヒビターが、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8からなる群より選択される少なくとも1種のヒトFZDタンパク質に特異的に結合する抗体である、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
  7. 前記抗体が、
    （a）
    Figure 2017526676
    を含む重鎖CDR1、
    Figure 2017526676
    を含む重鎖CDR2、および
    Figure 2017526676
    を含む重鎖CDR3、ならびに
    （b）
    Figure 2017526676
    を含む軽鎖CDR1、DKSNRPSG（SEQ ID NO:11）を含む軽鎖CDR2、およびQSYANTLSL（SEQ ID NO:12）を含む軽鎖CDR3
    を含む、請求項6記載の方法。
  8. 前記抗体が、SEQ ID NO:5を含む重鎖可変領域とSEQ ID NO:6を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項6記載の方法。
  9. 前記抗体が、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗原結合部位を含む抗体フラグメント、単一特異性抗体、二重特異性抗体、IgG1抗体、またはIgG2抗体である、請求項6〜8のいずれか一項記載の方法。
  10. Wnt経路インヒビターがバンチクツマブである、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
  11. Wnt経路インヒビターが、ヒトFZDタンパク質のFriドメインを含む可溶性受容体である、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
  12. ヒトFZDタンパク質のFriドメインが、FZD8のFriドメインを含む、請求項11記載の方法。
  13. ヒトFZDタンパク質のFriドメインが、SEQ ID NO:20またはSEQ ID NO:21を含む、請求項11記載の方法。
  14. 可溶性受容体が非FZDポリペプチドを含む、請求項11〜13のいずれか一項記載の方法。
  15. 非FZDポリペプチドがヒトFc領域を含む、請求項14記載の方法。
  16. 可溶性受容体が、
    （a）SEQ ID NO:20またはSEQ ID NO:21、および
    （b）SEQ ID NO:27
    を含む、請求項11記載の方法。
  17. 可溶性受容体がSEQ ID NO:29を含む、請求項11記載の方法。
  18. Wnt経路インヒビターがイパフリセプト（ipafricept）である、請求項1〜5または11〜17のいずれか一項記載の方法。
  19. 有糸分裂インヒビターが、タキサン、ビンカアルカロイド、エポチロン、またはエリブリンメシラートである、請求項1〜18のいずれか一項記載の方法。
  20. 有糸分裂インヒビターが、パクリタキセル、nab-パクリタキセル、ドセタキセル、およびそれらの誘導体からなる群より選択されるタキサンである、請求項19記載の方法。
  21. 有糸分裂インヒビターが、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、およびそれらの誘導体からなる群より選択されるビンカアルカロイドである、請求項19記載の方法。
  22. がんまたは腫瘍が、乳がん／腫瘍、卵巣がん／腫瘍、肺がん／腫瘍、または膵臓がん／腫瘍である、請求項1〜21のいずれか一項記載の方法。
  23. 少なくとも1種の追加の治療剤を投与する工程をさらに含む、請求項1〜22のいずれか一項記載の方法。
  24. 追加の治療剤が化学療法剤である、請求項23記載の方法。
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