UA127050C2

UA127050C2 - Ahtи-lag-3 антитіло i композиція, що містить його

Info

Publication number: UA127050C2
Application number: UAA201904924A
Authority: UA
Inventors: Майкл Монрад Грандал; Вікрам Келлер Бхатіа; Викрам Кёллер Бхатиа; Торбен Геттінг; Торбен Геттинг; Камілла Фреліх; Камилла Фрелих; Гюнтер Роланд Галлер; Міхаель Крагх; Михаель Крагх; Іван Давід Хорак; Иван Давид Хорак; Томас БУКЕН; Міккель Вандаль Педерсен; Миккель Вандаль Педерсен
Original assignee: Чіа Тай Тяньцин Фармасьютікал Груп Ко., Лтд.
Priority date: 2016-10-13
Filing date: 2017-10-13
Publication date: 2023-03-29
Also published as: CN117567623A; PE20190911A1; KR20230136711A; AU2017342071A1; PH12019500668A1; TW201827462A; CA3039140A1; SA519401522B1; IL265844A; EA201990912A1; JP2020500006A; BR112019006876A2; RU2019113790A3; JP2023027199A; US20220056126A1; CN110062766A; US11834503B2; CO2019004003A2; CN117567621A; KR102583190B1

Description

СПИСОК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

ІО00О1) Дана заявка містить список послідовностей, який поданий в електронному вигляді у форматі АБСІЇ ії включений, таким чином, за допомогою посилання в повному об'ємі.

Електронна копія списку послідовностей, створена 5 жовтня 2017 року, названа 022675 М/0057-

ЗХ має розмір 64693 Б.

РІВЕНЬ ТЕХНІКИ

І0002| ГАС-3 (ген активації лімфоцитів 3), також відомий як СО223, являє собою білок суперродини імуноглобулінів, який виконує функцію рецептора контрольної точки імунітету.

Зрілий білок являє собою трансмембранний білок І типу з 503 амінокислот, що складається із чотирьох позаклітинних Ід-подібних доменів. Він експресується клітинами різних типів, у тому числі активованими Т-клітинами, регуляторними Т-клітинами (Тгед), природними кілерами, В- клітинами і плазмоцитоїдними дендритними клітинами. Інформація про послідовність, організацію екзонів/інтронів і розташування ГАС-3 на хромосомі вказує на його близьке споріднення з СО4. Як і СО4, ГАО-3 зв'язується з молекулами МНС класу ІІ, але з більш високою афінністю і на іншому сайті в порівнянні з СО4.

Ї000ОЗ3| ГАС-3 являє собою коінгібуючий рецептор, який приблизно регулює Т-клітинну проліферацію, активацію і гомеостаз подібним з СТГ А-4 і РО-1 чином. При зв'язуванні з позаклітинним доменом ліганду, ГАС-3 проявляє свій ефект за допомогою наступної передачі сигналу через цитоплазматичний домен. Найкраще охарактеризованим лігандом ГАс-3 є МНС класу ІІ (МНСЇЇ), але описані інші ліганди ГАС-3, у тому числі І ЗЕСІІп.

І0004| ГАС-3 не має класичних мотивів ІТІМ або ІТ5М, але має консервативний мотив

КІЕЕГЕ (ЗЕО ІЮ МО:73), який приблизно обов'язковий для прояву його інгібуючого ефекту на Т- клітинну активність. Точний механізм, за яким ГАС-3 впливає на Т-клітинну активність, слабко вивчений. І АО-3 інгібує розподіл Т-клітин за допомогою блокування входження активованих Т- клітин у фазу росту клітинного циклу, що веде до нагромадження клітин в 5-фазі. І АС-3 також приблизно відіграє роль у посиленні супресорної активності регуляторних Т-клітин і в модулюванні функції дендритних клітин. Злоякісні клітини мають здатність активувати експресію

МНС, який зв'язує ГАС-3, на ефекторних Т-клітинах, таким чином інгібуючи їх активність і індукуючи уникання пухлини від імунної відповіді.

Зо 0005) Через вирішальну роль І АС-3 як імунного модулятора, існує необхідність у новій і вдосконаленій імунній терапії, яка націлюється на ГАС-3, для лікування злоякісних пухлин і певних порушень імунної системи.

РОЗКРИТТЯ СУТІ ВИНАХОДУ

І0006| Даний винахід належить до нових рекомбінантних антитіл, націлених на І Ас-3, а також до фармацевтичних композицій, що містять одне або декілька таких антитіл, і до застосування антитіл і фармацевтичних композицій для посилення імунітету в пацієнта та для лікування злоякісних пухлин, що походять з таких тканин, як шкіра, легеня, кишечник, товста кишка, яєчник, головний мозок, передміхурова залоза, нирка, м'які тканини, гематопоетична система, голова і шия, печінка, сечовий міхур, молочна залоза, шлунок, матка і підшлункова залоза. У порівнянні з існуючими на даний час способами лікування таких злоякісних пухлин, включаючи терапію антитілами, передбачається, що антитіла за винаходом можуть забезпечувати високоефективне лікування як при самостійному застосуванні, так і в комбінації з іншим протираковим терапевтичним засобом, таким як антитіло, націлене на інший білок контрольної точки імунітету.

І0007| В одному з варіантів здійснення даний винахід належить до анти-І АС-3 антитіла або його антиген-зв'язувальної частини, де анти-і АС-3 антитіло являє собою будь-яке антитіло, зазначене в даному описі як антитіло 15646, 15532, 15723, 15595, 15431, 15572 або 15011, або його варіант, де варіант, наприклад, може належати до іншого ізотипу або ізотипового підкласу і/або містити певні мінімальні амінокислотні заміни щодо антитіла 15646, 15532, 15723, 15595, 15431, 15572 або 15011, не втрачаючи при цьому антиген-зв'язувальну специфічність батьківського антитіла. 0008) В одному з варіантів здійснення анти-І АСі-3 антитіло конкурує за зв'язування з | АС-3 людини з антитілом, у якого СОК1-3 важкого ланцюга (Н) і СОК1-3 легкого ланцюга (Н) такі ж як

Н-СОВ1-3 ї Г-СОВ81-3 антитіла 15646, 15532, 15723, 15595, 15431, 15572 або 15011, або отримані на основі цих антитіл. 0009) В одному з варіантів здійснення анти-І| АС-3 антитіло зв'язується з тим же епітопом

ГАСі-3 людини, що і антитіло, у якого СОК1-3 важкого ланцюга (Н) і СОК1-3 легкого ланцюга (Н) такі ж як Н-СОВ1-3 і І-СОВ1-3 антитіла 15646, 15532, 15723, 15595, 15431, 15572 або 15011, або отримані на основі цих антитіл.

0010) В одному з варіантів здійснення анти-І АС-3 антитіло містить Н-СОКЗ, що містить амінокислотну послідовність Н-СОКЗ антитіла 15646, 15532, 15723, 15595, 15431, 15572 або 15011. 0011) В одному з варіантів здійснення анти-І АС-3 антитіло містить Н-СОВ1-3, що містять послідовності Н-СОВ1-3, відповідно антитіла 15646, 15532, 15723, 15595, 15431, 15572 або 15011.

І0012| В одному з варіантів здійснення анти-І АС-3 антитіло містить Ї-СОКЗ, що містить амінокислотну послідовність Ї-СОРЗ антитіла 15646, 15532, 15723, 15595, 15431, 15572 або 15011. 0013) В одному з варіантів здійснення анти-І АС-3 антитіло містить Ї-СОВ1-3, що містять послідовності Ї-СОВ1-3, відповідно антитіла 15646, 15532, 15723, 15595, 15431, 15572 або 15011.

ІЇ0014| В одному з варіантів здійснення анти-ЇАС-3 антитіло містить амінокислотні послідовності Н-СОКЗ і І-СОКЗ антитіла 15646, 15532, 15723, 15595, 15431, 15572 або 15011.

ІЇО015| В одному з варіантів здійснення анти-ЇАС-3 антитіло містить амінокислотні послідовності Н-СОВ1-3 ії Г-СОА1-3 антитіла 15646, 15532, 15723, 15595, 15431, 15572 або 15011. 0016) В одному з варіантів здійснення анти-І АС-3 антитіло конкурує за зв'язування з | АС-3 людини з антитілом 15646, 15532, 15723, 15595, 15431, 15572 або 15011.

І0017| В одному з варіантів здійснення анти-І| АС-3 антитіло зв'язується з тим же епітопом

ГАС-3 людини, що і антитіло 15646, 15532, 15723, 15595, 15431, 15572 або 15011.

ЇО018| В одному з варіантів здійснення анти-ЇАсС-3 антитіло містить визначальну комплементарність ділянку важкого ланцюга (Н-СОК) 3, що містить амінокислотну послідовність

ЗЕО ІЮ МО:37, 43, 46, 50, 55, 58 або 64. 0019) В одному з варіантів здійснення анти-І АС-3 антитіло містить Н-СОВ1-3, що містять амінокислотні послідовності відповідно з БЕО ІЮ МО:35-37; 41-43; 35, 42, і 46; 48-50; 53-55; 56- 58; або 62-64.

І0020| В одному з варіантів здійснення анти-ІЇ АС-3 антитіло має варіабельний домен важкого ланцюга (МН), послідовність якого щонайменше на 90 95 (наприклад, щонайменше на

Зо 92 96, щонайменше на 95 95, щонайменше на 98 95 або щонайменше на 99 95) ідентична амінокислотній послідовності МН з ЗЕО ІО МО:3, 7, 11, 15, 19, 23 або 27. 0021) В одному з варіантів здійснення анти-І| АС-3 антитіло має МН, який містить ЗЕО ІЮ

МО:3, 7, 11, 15, 19, 23 або 27. 00221) В одному з варіантів здійснення анти-І АС-3 антитіло має важкий ланцюг (НС), який містить МН з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ МО:3, 7, 11, 15, 19, 23 або 27 і константну ділянку важкого ланцюга з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІО МО:30.

ІЇ0023| В одному з варіантів здійснення анти-ЇАсС-3 антитіло містить визначальну комплементарність ділянку легкого ланцюга (І-СОК) 3, що містить амінокислотну послідовність

ЗЕО ІЮ МО:40, 52, 61 або 67. (0024) В одному з варіантів здійснення анти-І АС-3 антитіло містить Ї-СОВ1-3, що містять амінокислотні послідовності 5ЗЕО ІЮ МО:38-40; 44, 45 і 40; 44, 47 і 40; 51, 47 і 52; 59-61; або 65- 67, відповідно. 0025) В одному з варіантів здійснення анти-Ї АС-3 антитіло має варіабельний домен легкого ланцюга (М), послідовність якого щонайменше на 90 95 (наприклад, щонайменше на 92 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 98 95 або щонайменше на 99 95) ідентична амінокислотній послідовності МІ з БЕО ІЮ МО 4, 8, 12, 16, 20, 24 або 28. 0026) В одному з варіантів здійснення анти-І| АС-3 антитіло має МІ, який містить ЗЕО ІЮ

МО 4, 8, 12, 16, 20, 24 або 28.

І0027| В одному з варіантів здійснення анти-І АС-3 антитіло має легкий ланцюг (І С), який

БО містить МІ. з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО:4, 8, 12, 16, 20, 24 або 28 і константну ділянку легкого ланцюга з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО:32 або 34. (0028) В одному з варіантів здійснення анти-І АС-3 антитіло містить Н-СОКЗ і І-СОКЗ з амінокислотними послідовностями 5ЕО ІЮО МО:37 і 4043140; 46140; 501 52; 551 40; 581 61; або 64 і 67; відповідно.

І0029| У певних варіантах здійснення анти-І АСі-3 антитіло або антиген-зв'язувальна частина за винаходом містить Н-СОВ1-3 і І-СОВ1-3 з амінокислотними послідовностями: а) 5ЕО ІО МО:35, 36, 37, 38, 39 і 40, відповідно;

В) ЗЕО ІЮ МО 41, 42, 43, 44, 45 і 40, відповідно; с) ЗЕО ІО МО:35, 42, 4Аб, 44, 47 і 40, відповідно; 60 9) ЗЕО ІЮ МО:48, 49, 50, 51, 47 і 52, відповідно;

е) ЗЕО ІЮО МО:53, 54, 55, 44, 45 і 40, відповідно;

У 5ЕО ІО МО:56, 57, 58, 59, 60 і 61, відповідно; або 9) ЗЕО ІЮ МО:62, 63, 64, 65, 66 і 67, відповідно. 0030) У певних варіантах здійснення анти-І! АС-З3 антитіло або його антиген-зв'язувальна частина за винаходом: а) має МН, послідовність якого щонайменше на 90 95 (наприклад, щонайменше на 92 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 98 95 або щонайменше на 99 95) ідентична амінокислотній послідовності БЕО ІО МО:3, і МІ, послідовність якого щонайменше на 90 95 (наприклад, щонайменше на 92 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 98 95 або щонайменше на 99 95) ідентична амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮ МО:4;

БЮ) має МН, послідовність якого щонайменше на 90 95 (наприклад, щонайменше на 92 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 98 95 або щонайменше на 99 95) ідентична амінокислотній послідовності БЕО ІО МО:7, і М, послідовність якого щонайменше на 90 905 (наприклад, щонайменше на 92 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 98 95 або щонайменше на 99 95) ідентична амінокислотній послідовності зЕО ІЮ МО:8; с) має МН, послідовність якого щонайменше на 90 95 (наприклад, щонайменше на 92 965, щонайменше на 95 95, щонайменше на 98 95 або щонайменше на 99 95) ідентична амінокислотній послідовності БЕО ІО МО:11, ії МІ, послідовність якого щонайменше на 90 95 (наприклад, щонайменше на 92 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 98 95 або щонайменше на 99 95) ідентична амінокислотній послідовності зЗЕО ІЮ МО:12;

Я) має МН, послідовність якого щонайменше на 90 95 (наприклад, щонайменше на 92 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 98 95 або щонайменше на 99 95) ідентична амінокислотній послідовності БЕО ІЮО МО:15, і МІ, послідовність якого щонайменше на 90 905 (наприклад, щонайменше на 92 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 98 95 або щонайменше на 99 95) ідентична амінокислотній послідовності зЕО ІЮ МО:16; е) має МН, послідовність якого щонайменше на 90 95 (наприклад, щонайменше на 92 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 98 95 або щонайменше на 99 95) ідентична амінокислотній послідовності БЕО ІО МО:19, ї МІ, послідовність якого щонайменше на 90 95 (наприклад, щонайменше на 92 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 98 95 або щонайменше на 99 95) ідентична амінокислотній послідовності зЕО ІЮ МО:20;

І) має МН, послідовність якого щонайменше на 90 95 (наприклад, щонайменше на 92 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 98 95 або щонайменше на 99 95) ідентична амінокислотній послідовності БЕО ІЮ МО:23, ії МІ, послідовність якого щонайменше на 90 905 (наприклад, щонайменше на 92 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 98 95 або щонайменше на 99 95) ідентична амінокислотній послідовності ХЕО ІЮ МО:24; або 9) має МН, послідовність якого щонайменше на 90 95 (наприклад, щонайменше на 92 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 98 95 або щонайменше на 99 95) ідентична амінокислотній послідовності БЕО ІЮО МО:27, і МІ, послідовність якого щонайменше на 90 95 (наприклад, щонайменше на 92 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 98 95 або щонайменше на 99 95) ідентична амінокислотній послідовності зЕО ІЮ МО:28.

І0031| У певних варіантах здійснення анти-І АС-3 антитіло або антиген-зв'язувальна частина за винаходом: а) має МН, що містить або складається з амінокислотної послідовності ЗЕО ІЮ МО:3, і МІ, що містить або складається з амінокислотної послідовності ЗЕО ІЮ МО:4; р) має МН, що містить або складається з амінокислотної послідовності ФЕО ІЮ МО:7, і МІ, що містить або складається з амінокислотної послідовності ЗЕО ІЮ МО:8; с) має МН, що містить або складається з амінокислотної послідовності зЗЕО ІЮ МО:11, і МІ, що містить або складається з амінокислотної послідовності ФЕО ІЮ МО:12; а) має МН, що містить або складається з амінокислотної послідовності ЗЕО ІЮ МО:15, і МІ,

БО що містить або складається з амінокислотної послідовності ФЕО ІЮ МО:16; е) має МН, що містить або складається з амінокислотної послідовності зЗЕО ІЮ МО:19, і МІ, що містить або складається з амінокислотної послідовності ФЕО ІЮ МО:20;

І) має МН, що містить або складається з амінокислотної послідовності 5ЕО ІЮ МО:23, і МІ., що містить або складається з амінокислотної послідовності зЕО ІЮ МО:24; або 9) має МН, що містить або складається з амінокислотної послідовності ЗЕО ІЮ МО:27, і МІ, що містить або складається з амінокислотної послідовності ЗЕО ІЮ МО:28. 00321 У певних варіантах здійснення анти-І| АС-3 антитіло: а) має ГІ С, що містить або складається з амінокислотних послідовностей ЗЕО ІЮ МО:4 і 34; і

НС, що містить або складається з амінокислотних послідовностей 5ЕО ІЮ МО:З і 30;

р) має І С, що містить або складається амінокислотних з послідовностей 5ЕО ІЮ МО:8 і 34; і

НС, що містить або складається з амінокислотних послідовностей 5ЕО ІЮ МО:7 і 30; с) має І С, що містить або складається з амінокислотних послідовностей ЗЕО ІЮ МО:12 і 34; і

НС, що містить або складається з амінокислотних послідовностей 5ЕО ІЮ МО':11 і 30; а) має І С, що містить або складається з амінокислотних послідовностей ЗЕО ІЮ МО:16 і 34; і

НС, що містить або складається з амінокислотних послідовностей ЗЕО ІЮ МО:15 і 30; е) має І С, що містить або складається з амінокислотних послідовностей ЗЕО ІЮ МО:20 і 34; і

НС, що містить або складається з амінокислотних послідовностей 5ЕО ІЮ МО:19 і 30;

І) має ГІ С, що містить або складається з амінокислотних послідовностей 5ЕО ІЮО МО:24 і 34; і

НС, що містить або складається з амінокислотних послідовностей 5ЕО ІЮ МО:23 і 30; або 9) має І С, що містить або складається з амінокислотних послідовностей ЗЕО ІЮ МО:28 і 32; і

НС, що містить або складається з амінокислотних послідовностей ЗЕО ІЮ МО:27 і 30. 00331) У деяких варіантах здійснення анти-Ї АС-3 антитіло або антиген-зв'язувальна частина за винаходом має щонайменше одну з наступних властивостей: а) при концентрації 20 мкг/мл більш ніж на 85 95 знижує зв'язування ГАС-3 людини з МНС класу ІЇ людини на клітинах АЗ75 у порівнянні з антитілом негативного контролю, як визначено конкурентним аналізом на основі проточної цитометрії;

Юр) у концентрації 20 мкг/мл знижує зв'язування ГАС-3 людини з МНС класу ІІ людини на клітинах АЗ75 до 35-85 95 у порівнянні з антитілом негативного контролю, як визначено конкурентним аналізом на основі проточної цитометрії; с) блокує зв'язування ГАС-3 людини, що експресується на клітинах Чигкаї, і МНС класу ІЇ людини, що експресується на клітинах Каїї; а) зв'язується з ГАС-3 людини при ЕС5о 0,1 нМ або менше, як виміряно проточною цитометрією; е) зв'язується з ГАС-3 яванського макака при ЕС5о 0,3 нМ або менше, як виміряно проточною цитометрією; 7 зв'язується з ГАС-3 людини при Ко 3,0х108 або менше, як виміряно поверхневим плазмонним резонансом; 9) зв'язується з | АС-3 яванського макака з Ко 1,5х10-7 або менше, як виміряно поверхневим

Зо плазмонним резонансом;

МР) зв'язується з | АС-3 миші з Ко 3,5х108 або менше, як виміряно поверхневим плазмонним резонансом; ї) стимулює продукцію 1-2 мононуклеарними клітинами периферичної крові людини (РВМО), обробленими стафілококовим ентеротоксином В (5ЕВ); )) знижує клітинні рівні ГАС-3 в Т-клітинах людини;

К) знижує розчинні рівні ГАС-3 у культурі Т-клітин людини;

І) індукує регресію пухлинного росту іп мімо; т) затримує пухлинний ріст іп мімо; і п) не зв'язується з тим же епітопом ГАС-3 людини, що і антитіло 25Е7-І ад3.5.

І0034| Приклади такого антитіла включають, без обмеження, антитіло 15646 (щонайменше із властивостями Б, с, 4, е, і та п), антитіло 15532 (щонайменше із властивостями а, с, 4, е, ї, 9, і, |,

К, т ї п), антитіло 15723 (щонайменше із властивостями Б, с, й, е, і та п), антитіло 15595 (щонайменше із властивостями а, с, с, е, і і п), антитіло 15431 (щонайменше із властивостями а, с, а, е, її, 9, і ї п), антитіло 15572 (щонайменше із властивостями р, с, Я, е, Її, дЧ, їі п) і антитіло 15011 (щонайменше із властивостями а, с, й, е, Її, 9, НП, і, ), К, Ї, т ї п). У деяких варіантах здійснення анти-ІЇАСі-3 антитіло або антиген-зв'язувальна частина за винаходом має щонайменше 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 або 1 із зазначених властивостей. У деяких варіантах здійснення анти-І АС-3 антитіло або антиген-зв'язувальна частина за винаходом має щонайменше властивості Б, с, й, е, і та п; щонайменше властивостіа, с, а, е, її, 9, ії, ),К, ті п; щонайменше властивості а, с, а, е, і та п; щонайменше властивості а, с, й, е, її, 9, і та п; щонайменше властивості БМ, с, й, є, ї, д, і та п; або щонайменше властивостіа, с, д, е, 9, В, і, |,

К.І, тіп.

І0035)| У деяких варіантах здійснення анти-Ї АС-3 антитіло або антиген-зв'язувальна частина за винаходом конкурує за зв'язування з І АС-3 людини з антитілом 15011, 15572 і/або 15431. 0036) У деяких варіантах здійснення анти-Ї АС-3 антитіло або антиген-зв'язувальна частина за винаходом зв'язується з епітопом ГАС-3 людини, що має: а) амінокислотні залишки Н85, Р8б, А87, Р89, 591, ММ92 і 593 з БЕО ІЮ МО:68;

Б) амінокислотні залишки А40, 241, Р43, Р46, Р49, 052, 162, 0964, Нб5, 066, Рб7, 068, (93,

РО4, РОб, 898, 99, Т100, М101, РІТОб6, 107, В119, Е124, В129, 2130, 0131, 5133, В137, Р1З38, 60 р1і143, К148 ї К163 з 5ЕО ІЮ МО:68;

с) амінокислотні залишки А40, 041, РАЗ, Р46, Р49, 052, 162, 064, Нб5, 066, Рб7, 068, РО9б,

У99, Т100, М101, РІОб6, 2107, 8119, Е124, К129, 5130, 0131, 5133, К137, Р138, 0143, К148 і

К163 з ЗЕО ІЮ МО:68; або а) амінокислотні залишки 5107, 1109, К110 і 5111 з БЕО І МО:68.

І0037| У деяких варіантах здійснення анти-Ї АС-3 антитіло або антиген-зв'язувальна частина за винаходом зв'язується з епітопом, що має амінокислотні залишки 98-105 5ЕО ІЮ МО:68.

Приклади такого антитіла включають, без обмеження, антитіла 15532, 15431, 15572 і 15011. 0038) У деяких варіантах здійснення анти-Ї АС-3 антитіло або антиген-зв'язувальна частина за винаходом зв'язується з епітопом, що має: а) амінокислотні залишки 78-105 і 123-131 5ЕО І МО:68; р) амінокислотні залишки 23-30, 40-66, 88-105, 123-137 і 148-152 5ЕО ІЮ МО:68; або с) амінокислотні залишки 23-30, 40-66, 98-105, 118-137 і 148-161 5ЕО ІЮ МО:68 0039) У деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом належить до ізотипу Ідс, наприклад, підкласу Ідс1 або Ідс2 ізотипу дО. У певних варіантах здійснення антитіло містить щонайменше одну мутацію в Ес-ділянці. У конкретних варіантах здійснення антитіло містить мутацію в одному або декількох амінокислотних положеннях важкого ланцюга 228, 234 і 235, які пронумеровані згідно зі схемою нумерації ІМСТФ. Наприклад, один або обидва амінокислотних залишки в положеннях 234 і 235 можуть бути мутовані з І еи в Аа і/або амінокислотний залишок у положенні 228 може бути мутований з 5ег в Рго. (0040) В іншому аспекті даний винахід належить до фармацевтичних композицій, що містять щонайменше одне (наприклад, одне) анти-І А(С-3 антитіло або його антиген-зв'язувальну частину, як розкрито в даному описі, і фармацевтично прийнятний ексципієнт, необов'язково з додатковим терапевтичним засобом, таким як протиракове терапевтичне антитіло.

І0041| Даний винахід додатково належить до виділених молекул нуклеїнової кислоти, що містять нуклеотидну послідовність, яка кодує важкий ланцюг або його антиген-зв'язувальну частину, нуклеотидну послідовність, яка кодує легкий ланцюг або його антиген-зв'язувальну частину, або обидва ланцюги, анти-І АС-3 антитіла, як розкрито в даному описі. Винахід також належить до векторів, що містять таку виділену молекулу нуклеїнової кислоти, де зазначений вектор може додатково містити послідовність, що контролює експресію.

Зо Ї0042| Даний винахід також належить до клітин-хазяїв, що містять нуклеотидну послідовність, яка кодує важкий ланцюг або його антиген-зв'язувальну частину, нуклеотидну послідовність, яка кодує легсий ланцюг або його антиген-зв'язувальну частину, або обидва ланцюги, анти-І АС-3 антитіла, як розкрито в даному описі. 0043) Даний винахід також належить до способу одержання антитіла або його антиген- зв'язувальної частини, як розкрито в даному описі, який включає наявність клітини-хазяїна, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує важкий ланцюг або його антиген-зв'язувальну частину, і нуклеотидну послідовність, яка кодує легкий ланцюг або його антиген-зв'язувальну частину, анти-І АС-3 антитіла, як розкрито в даному описі, культивування зазначеної клітини- хазяїна в умовах, що підходять для експресії антитіла або його частини, і виділення отриманого антитіла або його частини.

І0044| Даний винахід також належить до поліспецифічної (наприклад, біспецифічної) зв'язувальної молекули, що містить антиген-зв'язувальну частину анти-ЇАС-3 антитіла, описаного в даному описі, і антиген-зв'язувальну частину іншого відмінного антитіла, такого як інше анти-І АС-3 антитіло (наприклад, як розкрито в даному описі) або антитіло, яке націлене на інший білок, такий як інший білок контрольної точки імунітету, раковий антиген або іншу молекулу клітинної поверхні, активність якого опосередковує патологічний стан, такий як злоякісна пухлина. 0045) Даний винахід також належить до способу лікування пацієнта з пов'язаним з І АС-3 порушенням, який включає введення зазначеному пацієнтові анти-І АС-3 антитіла або його антиген-зв'язувальної частини, фармацевтичної композиції або біспецифічної зв'язувальної молекули, як розкрито в даному описі. Якщо не зазначене інше, пацієнтом у даному описі є людина.

І0046| Даний винахід також належить до способу посилення імунітету в пацієнта, який включає введення зазначеному пацієнтові анти-І АС-3 антитіла або його антиген-зв'язувальної частини, фармацевтичної композиції або біспецифічної зв'язувальної молекули, як розкрито в даному описі.

І0047| Даний винахід також належить до способу лікування злоякісної пухлини в пацієнта, який включає введення зазначеному пацієнтові анти-ЇАС-3 антитіла або його антиген- зв'язувальної частини, фармацевтичної композиції або біспецифічної зв'язувальної молекули, бо як розкрито в даному описі. У деяких варіантах здійснення злоякісна пухлина походить із тканини, вибраної зі шкіри, легені, кишечнику, товстої кишки, яєчника, головного мозку, передміхурової залози, нирки, м'яких тканин, гематопоетичної системи, голови і шиї, печінки, сечового міхура, молочної залози, шлунка, матки і підшлункової залози. У певних варіантах здійснення злоякісна пухлина являє собою фібросаркому, недрібноклітинний рак легенів, меланому, гліобластому, гліосаркому або рак товстої кишки. (0048) Будь-який з вищевказаних способів додатково може включати введення, наприклад, хіміотерапевтичного засобу, антинеопластичного засобу, антиангіогенного засобу, інгібітора тирозинкінази, інгібітора шляху ГАС-3 або променевої терапії. У деяких варіантах здійснення спосіб додатково включає введення ретиноєвої кислоти, фенілбутирату, повністю транс- ретиноєвої кислоти і/або активної форми вітаміну 0.

І0049| Даний винахід додатково належить до застосування композиції антитіл, що містить анти-ЇАС-3 антитіло або антиген-зв'язувальну частину, як розкрито в даному описі, для виготовлення лікарського засобу для лікування пацієнта з пов'язаним з ГАС-3 порушенням, лікування злоякісної пухлини в пацієнта і/або посилення імунітету у хворого.

І0О50)| Даний винахід додатково належить до анти-! АС-3 антитіла або антиген-зв'язувальної частини, як розкрито в даному описі, для лікування пацієнта з пов'язаним з ГАС-3 порушенням, лікування злоякісної пухлини в пацієнта і/або посилення імунітету у хворого.

І0ОО51| Даний винахід додатково належить до виробу, що містить анти-І АС-3 антитіло або антиген-зв'язувальну частину, як розкрито в даному описі, де зазначений виріб підходить для лікування пацієнта з пов'язаним з ГАС-3 порушенням, лікування злоякісної пухлини в пацієнта і/або посилення імунітету у хворого.

КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ

0052) На фіг. 1А-1С. представлені репрезентативні точкові діаграми проточної цитометрії антитіл, отриманих, як описано в прикладі 2. Фіг. 1А: клон антитіла, що специфічно зв'язується із трансфікованими клітинами ІГАС-3 людини. Фіг. 18: клон антитіла, що зв'язується неспецифічно із клітинами СНО-5. Фіг. 1С: клон антитіла, який не зв'язується з жодною популяцією клітин, використовуваних при скринінгу. 0053) На фіг. 2 представлений рівень продукції І -2 5ЕВ-стимульованими РВМС після обробки моноклональними анти-І АСі-3 антитілами.

Зо І0054| На фіг. 3 представлений рівень продукції І -2 5ЕВ-стимульованими РВМС після обробки моноклональними анти-І| АСі-3 антитілами. Кожна точка представляє рівень секреції ЇЇ - 2 в одного донора РВМС.

І0055| На фіг. 4 представлений рівень люмінесценції в аналізі блокування І АС-3-МНС класу

ЇЇ після лікування моноклональними анти-ІАсС-3 антитілами. Дані представлені у вигляді середнє - ЕМ.

І0О56)| На фіг. 5 представлені рівні ГАС-3 у лізатах і супернатантах трансфікованої І АО-3 Т- клітинної лінії після обробки моноклональними анти-І| АС-3 антитілами. Дані представлені у вигляді середнє - ЗЕМ. Зірочки позначають статистично значиму відмінність між 15532 і аналогами еталонного антитіла ( р«0,05, и ро оот1 и р«0,0001).

І0057| На фіг. 6 представлений ефект антитіла 15011 іп ммо у двох моделях сингенних пухлин на мишах.

І0О58І| На фіг. 7 представлений ефект антитіла 15532 іп мімо у моделі напівгуманізованої ксенотрансплантованої пухлини, де імунну систему мишей МОЄ відновлювали з використанням

РВМС людини і мишам пересаджували клітини меланоми людини АЗ75.

І0059| На фіг. 8 представлений огляд груп епітопів (епітопних груп), ідентифікованих в аналізі конкурентного зв'язування на панелі з 13 анти-І АС-3 антитіл. Антитіла, з'єднані чорними лініями, позначають перехресну блокувальну активність в обох орієнтаціях (ліганд і аналіт).

Антитіла, з'єднані штриховими лініями, позначають односпрямоване блокування, де антитіло блокують при тестуванні тільки як аналіт. Антитіла групують відповідно до патернів конкуренції з іншими анти-І! АС-3 антитілами.

І0ОО60І На фіг. 9 представлений кластерний аналіз різноманітності епітопів антитіл-лігандів.

Антитіла із точками розгалуження при значеннях по осі х вище 0 мають епітопи, які відрізняються за конкурентним зв'язуванням з І АС-3 з іншими антитілами в панелі.

ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

ЇОО61| Даний винахід належить до нових анти-іЇАсС-3 антитіл людини, які можна використовувати для посилення імунної системи в людини, такої як хвора на злоякісну пухлину.

Якщо не зазначене інше, як використовують у даному описі, "(АС-3" належить до ІГдо-3 людини. Поліпептидна послідовність Г(АС-3 людини доступна за номером доступу ОпіРгої

РІ8627 (І АСЗ НОМАМ) (5ЕО 10 МО:68).

00621 Термін "антитіло" (АБ) або "імуноглобулін" (Ід), як використовують у даному описі, належить до тетрамеру, що містить два важкі (Н) ланцюги (приблизно 50-70 кДа) і два легкі (І) ланцюги (приблизно 25 кДа), з'єднані один з одним дисульфідними зв'язками. Кожний важкий ланцюг складається з варіабельного домену важкого ланцюга (МН) і константної ділянки важкого ланцюга (СН). Кожний легкий ланцюг складається з варіабельного домену легкого ланцюга (МІ) і константної ділянки легкого ланцюга (СІ). Домени МН і М можна додатково підрозділити на гіперваріабельні ділянки, називані "визначальними комплементарність ділянками" (СОМ), які чергуються з ділянками, які більш консервативні і називаються "каркасними ділянками" (ЕК). Кожний УН і МІ. складається із трьох СОК (Н-СОК у даному описі позначає СОК важкого ланцюга; і Ї-СОМК у даному описі позначає СОК легкого ланцюга) і чотири ЕК, які розташовані від амінокінця до карбоксикінця в наступному порядку: ЕК1, СОК'І,

ЕК2, СОК2, ЕКЗ, СОЗ3, ЕК4. Присвоєння номерів амінокислотам у важкому або легкому ланцюзі може відбуватися згідно визначеннями ІМОСТФ (І еїйапс єї аі., Оем Сотр Іттипої 27(1):55-77 (2003)); або визначеннями Кабаї, Зедиепсев5 ої Ргоїеіп5 ої Іттипоїодіса! Іпіегеві (Майбопаї Іпзійшез ої Неайй, Веїпезаа, МО (1987 ї 1991)); Споївіа 8. І ез5К, 9. Мої. Віої. 196:901-917 (1987); або Споїіа еї аі., Майшге 342:878-883 (1989). 0063) Термін "рекомбінантне антитіло" належить до антитіла, яке експресує клітина або клітинна лінія, що містить нуклеотидну послідовність(і), яка кодує антитіло, де зазначена нуклеотидна послідовність) не пов'язана із клітиною в природі. (0064) Термін "виділений білок", "виділений поліпептид" або "виділене антитіло" належить до білка, поліпептиду або антитіла, яке за своїм походженням або джерелом одержання (1) не пов'язане із природними компонентами, які супроводжують його в його нативному стані, (2) вільне від інших білків того ж біологічного виду, (3) експресується клітиною іншого біологічного виду і/або (4) не є природним. Таким чином, поліпептид, який синтезують хімічно або синтезують у клітинній системі, відмінній від клітини, з якою він природним чином зв'язаний, буде "виділеним" з його природних компонентів. Білок також може бути по суті вільним від природних компонентів за допомогою виділення, використовуючи прийоми очищення білків, добре відомих у даній галузі.

ЇОО65| Як використовують у даному описі, термін "зародкова лінія" належить до нуклеотидних і амінокислотних послідовностей генів антитіл і сегментів генів, у тому вигляді як вони передаються від батьків потомству через статеві клітини. Послідовності зародкової лінії відрізняються від нуклеотидних послідовностей, що кодують антитіла в зрілих В-клітинах, які змінені за допомогою подій рекомбінації і гіпермутації в ході дозрівання В-клітин. Антитіло, яке "використовує" конкретну послідовність зародкової лінії, має нуклеотидну або амінокислотну послідовність, яку можна вирівняти з нуклеотидною послідовністю або амінокислотною послідовністю зазначеної зародкової лінії більш точно, ніж з будь-який нуклеотидною або амінокислотною послідовністю іншої зародкової лінії. 0066) Термін "афінність" належить до ступеня спорідненості антигену і антитіла. Властиву спорідненість антитіла до антигену зазвичай виражають у вигляді рівноважної константи зв'язування (афінності) (Ко) для конкретної взаємодії антитіло-антиген. Говорять, що антитіло специфічно зв'язується з антигеном, якщо Ко становить « 1 мМ, переважно « 100 нМ. Константу (афінності) зв'язування Ко можна вимірювати, наприклад, за допомогою поверхневого плазмонного резонансу (ВіАсоге"М) або Віо-І ауег Іпіепеготеїгу, наприклад, з використанням системи ІВІ5 МХ9б6 5РЕ Бр ІВІ5 Тесппоїодієз або системи Осієї М з Ропевіо.

І0067| Термін "Ком" належить до константи швидкості дисоціації конкретної взаємодії антитіла і антигену. Константу швидкості дисоціації Когє можна вимірювати, наприклад, за допомогою ЗРК (поверхневий плазмонний резонанс), наприклад, з використанням системи ІВІ5 МХ9О9б6.

І0О68| Термін "епітоп", як використовують у даному описі, належить до частини (детермінанти) антигену, яка специфічно зв'язується з антитілом або відповідною молекулою, такою як біспецифічна зв'язувальна молекула. Епітопні детермінанти в цілому складаються з хімічно активних поверхневих груп молекул, таких як амінокислоти або вуглеводні, або цукрові бічні ланцюги, і в цілому мають конкретні характеристики тривимірної структури, а також конкретні характеристики заряду. Епітоп може бути "лінійним" або "конформаційним". У лінійному епітопі всі точки взаємодії між білком (наприклад, антигеном) і взаємодіючою молекулою (наприклад, антитілом) розташуванні за лінією первинної амінокислотної послідовності білка. У конформаційному епітопі точки взаємодії перебувають в амінокислотних залишках білка, які розділені один від одного в первинній амінокислотній послідовності. Якщо визначений бажаний епітоп на антигені, то можна створювати антитіла до цього епітопу, використовуючи прийоми, добре відомі в даній галузі. Наприклад, антитіло до лінійного епітопу 60 можна створювати, наприклад, за допомогою імунізації тварини пептидом, що мають амінокислотні залишки лінійного епітопу. Антитіло до конформаційного епітопу можна створювати, наприклад, за допомогою імунізації тварини з використанням мінідомену, що містить релевантні амінокислотні залишки конформаційного епітопу. Антитіло до конкретного епітопу також можна створювати, наприклад, за допомогою імунізації тварини цільовою молекулою, що представляє інтерес, (наприклад, ГАС-3) або її релевантною частиною, з наступним скринінгом на зв'язування з епітопом.

Ї0069| Можна визначити, чи зв'язується антитіло з тим же епітопом або конкурує за зв'язування з анти-іАСб-3 антитілом за винаходом, використовуючи відомі в даній галузі способи, включаючи, без обмеження, конкурентний аналіз, епітопні групи і сканування аланіном.

В одному з варіантів здійснення забезпечують зв'язування анти-І| АС-3 антитіла за винаходом з

ГАСб-З при умовах, що насичують, і потім вимірюють здатність тестованого антитіла зв'язуватися з ГАО-3. Якщо тестоване антитіло здатне зв'язуватися з ГАС-3 одночасно з еталонним антитілом проти ГАС-3, то тестоване антитіло зв'язується з іншим епітопом, ніж еталонне анти-І АС-3 антитіло. Однак, якщо тестоване антитіло не здатне зв'язуватися з | АО-3 одночасно, то тестоване антитіло зв'язується з тим же епітопом, епітопом, що перекривається, або епітопом, який перебуває в безпосередній близькості від епітопу, що зв'язується антитілом проти ГАО-3 за винаходом. Цей експеримент можна здійснювати з використанням, наприклад,

ЕПІБА, ВІА, ВІАсоге"М, РАВ, Віо-І ауег Іпіепеготеїйгу або проточної цитометрії. Для того щоб тестувати, чи проявляє анти-І АС-3 антитіло перехресну конкуренцію з іншим антитілом проти

ГАС-3, можна використовувати конкурентний спосіб, описаний вище, у двох напрямках, тобто визначати, чи забезпечує відоме антитіло блокування тестованого антитіла і навпаки. Такі експерименти перехресної конкуренції можна здійснювати, наприклад, з використанням приладу ІВІ5 МХ96 5РЕ або системи Осівї М, 0070) Антитіло, яке зв'язується з тим же епітопом або конкурує за зв'язування з антитілом за винаходом, переважно володіє блокувальною МНЄСЇІЇ активністю, наприклад, як визначають конкурентним аналізом на основі проточної цитометрії, описаним у прикладі 6. Антитіло, яке зв'язується з тим же епітопом або конкурує за зв'язування з антитілом за винаходом, може знижувати зв'язування щонайменше, наприклад, на 35 Фо, 40 95, 45 95, 50 Уо, 55 90, 60 Уо, 65 бо, 70 90, 75 У, або 80 95, або переважно щонайменше на 85 95, 86 90, 87 9, 88 90, 89 Фо, 90 Ов, 91 зо, 92 о, 93 90, 94 90, 95 90, 96 9о, 97 о, 98 95, 99 90 або 100 95. 0071) Термін "химерне антитіло" належить в широкому сенсі слова до антитіла, яке містить одну або декілька ділянок з одного антитіла і одну або декілька ділянок з одного або декількох інших антитіл, зазвичай до антитіла, яке частково походить від людини і частково походить від не приналежного до людини виду, тобто отримане частково від приналежної до людини тварини, наприклад, миші, щура або іншого гризуна або птаха, такого як курка. Химерні антитіла переважніше не приналежних людині антитіл для зниження ризику відповіді на антитіло в людини, наприклад, відповіді на антитіло миші в людини у випадку мишачого антитіла.

Прикладом типового химерного антитіла є те, у якому послідовності варіабельних доменів належать до миші, тоді як послідовності константних ділянок належать до людини. У випадку химерного антитіла частини, що не належать до людини, можна піддавати додатковій зміні для того, щоб гуманізувати антитіло. Химерні антитіла, описані в даному описі, можуть мати, наприклад, послідовності варіабельних доменів курки і послідовності константних ділянок людини.

І0072| Термін "гуманізувати" належить до того факту, що коли антитіло має походження повністю або частково не від людини (наприклад, антитіло миші або курки, отримане шляхом імунізації мишей або курей, відповідно, з використанням антигену, що представляє інтерес, або химерне антитіло на основі такого антитіла миші або курки), можливо здійснювати заміну певних амінокислот, зокрема, у каркасних ділянках і константних ділянках важких і легких ланцюгів, для запобігання або для мінімізації імунної відповіді в людини. Незважаючи на те, що для конкретного антитіла неможливо точно передбачити імуногенність і, тим самим, відповідь на антитіло в людини, антитіла, що не належать людині, схильні бути більш імуногенними в людини, ніж антитіла людини. Показано, що химерні антитіла, у яких чужорідні константні ділянки (наприклад, гризуна або птаха) замінені на послідовності, що походять від людини, на менш імуногенні, ніж антитіла повністю чужорідного походження, і серед терапевтичних антитіл тенденція спрямована убік гуманізованих антитіл або повністю антитіл людини. Химерні антитіла або інші антитіла не приналежного до людини походження, таким чином, можна гуманізувати для того, щоб знижувати ризик відповіді на антитіло в людини.

І0073)| Для химерних антитіл гуманізація зазвичай включає модифікацію каркасних ділянок послідовностей варіабельних доменів. Амінокислотні залишки, які є частиною визначальних бо комплементарність ділянок (СОК), найбільш часто не піддають змінам у зв'язку з гуманізацією,

хоча в певних випадках може бути бажано змінювати індивідуальні амінокислотні залишки СОК, наприклад, щоб видаляти ділянку глікозилювання, ділянку дезамідування, ділянку ізомеризації аспартату або небажаний залишок цистеїну або метіоніну. М-зв'язане глікозилювання відбувається за допомогою прикріплення олігосахаридного ланцюга до залишку аспарагіну в трипептидній послідовності Абп-Х-Зег або Авбп-Х-ТІг, де Х може являти собою будь-яку амінокислоту, за винятком Рго. Видалення ділянки М-глікозилювання можна домагатися за допомогою мутації залишку Абп або Зег/Тйг в інший залишок, переважно за допомогою консервативної заміни. Дезамідування залишків аспарагіну і глутаміну може відбуватися залежно від таких факторів, як рН і експозиція на поверхні. Залишки аспарагіну особливо сприйнятливі до дезамідування, у першу чергу коли присутні в послідовності Азп-Сіу і меншому ступені в інших дипептидних послідовностях, таких як Азп-Айа. Коли така ділянка дезамідування, зокрема Авп-с1у, є присутньою у послідовності СОК, то може бути бажано видаляти цю ділянку, зазвичай за допомогою консервативної заміни для того, щоб видаляти один із залучених залишків.

І0074| Багато способів гуманізації послідовності антитіла відомі в даній галузі; див., наприклад, огляд АЇтадго й Егапз5зоп, Егопі Віозсі. 13:1619-1633 (2008). Один широко використовуваний спосіб являє собою пересадження СОК, що, наприклад, для химерного антитіла мишачого походження, включає ідентифікацію аналогів у генах зародкової лінії людини для генів варіабельних доменів миші і пересадження послідовностей СОК миші в цей каркас.

Специфічність взаємодії антитіла із цільовим антигеном у першу чергу полягає в амінокислотних залишках, розташованих у шести СОК у важкому і легкому ланцюзі. Отже, амінокислотні послідовності в СОК значно більш варіабельні між індивідуальними антитілами, ніж послідовності поза СОВ. Оскільки послідовності СОЕ. відповідають за більшість взаємодій антитіло-антиген, можливо експресувати рекомбінантні антитіла, які імітують властивості конкретного антитіла, що зустрічається в природі, або, у більш загальному сенсі, будь-якого специфічного антитіла з даною амінокислотною послідовністю, наприклад, за допомогою конструювання експресуючих векторів, які експресують послідовності СОК зі специфічного антитіла, пересаджені в каркасні послідовності від іншого антитіла. Як результат, можна "гуманізувати" не приналежне людині антитіло і усе ще по суті зберігати специфічність

Зо зв'язування і афінність вихідного антитіла. Пересадження СОМ може відбуватися на основі визначень СОК за КаБваї, хоча в більш новій публікації (МадаеїЇаіпе-Веи?зеїнп еї а!., Стї Нем.Опсої

Нетаїй!. 64:210-225 (2007)) зроблене припущення про те, що визначення ІМСТФ (міжнародна інформаційна система ІтМипосСепетТіс5Ф, м/лмим.йтоСог9) може вдосконалити результат гуманізації (див. І еїтапс еї аІ., Оєм. Сотр Іттипої. 27:55-77 (2003)). 0075) У деяких випадках пересадження СОК може знижувати специфічність зв'язування і афінність і, таким чином, біологічну активність антитіла з пересадженням СОК у порівнянні з батьківським антитілом, з якого одержують СОМ. Зворотні мутації (іноді позначувані як "репарація каркаса" можна вводити в вибрані положення антитіла з пересадженням СОК, зазвичай в каркасні ділянки, щоб відновлювати специфічність зв'язування і афінність батьківського антитіла. Положення для можливих зворотних мутацій можна ідентифікувати з використанням інформації, доступної в літературі та у базах даних про антитіла.

Амінокислотними залишками, які є кандидатами для зворотних мутацій, звичайно є ті, які розташовані на поверхні молекули антитіла, тоді як занурені залишки або ті, які мають малий ступінь експозиції на поверхні, зазвичай не піддають змінам. Альтернативним прийомом гуманізації для пересадження СОБЕ і зворотної мутації є зміна поверхні, при якій зберігають не експоновані на поверхні залишки не приналежного до людини походження, тоді як поверхневі залишки змінюють на залишки людини.

Ї0076| У певних випадках також може бути бажано змінювати один або декілька амінокислотних залишків СОК для того, щоб удосконалити афінність зв'язування із цільовим епітопом. Це відомо як "дозрівання афінності" і необов'язково може бути виконане у зв'язку з гуманізацією, наприклад, у ситуаціях, коли гуманізація антитіла веде до зниження специфічності зв'язування або афінності і неможливо в достатньому ступені вдосконалити специфічність або афінність зв'язування за допомогою тільки зворотних мутацій. Різні способи дозрівання афінності відомі в даній галузі, наприклад, спосіб сканувального мутагенезу, що насичує, іп міго, описаний в Вигк5 еї аїЇ., Ргос Май Асай 5сі ОБА, 94:412-417 (1997), і спосіб поступового дозрівання афінності іп міго з УМи еї а!., Ргос Майї! Асай 5сі ОБА 95:6037-6042 (1998).

І0077| Термін "антиген-зв'язувальна частина" антитіла (або просто "частина антитіла"), як використовують у даному описі, належить до однієї або декількох частин або фрагментів антитіла, які зберігають здатність до специфічного зв'язування з антигеном (наприклад, І АС-3 бо людини або його частиною). Показано, що певні фрагменти повнорозмірного антитіла можуть виконувати антиген-зв'язувальну функцію антитіла. Приклади зв'язувальних фрагментів, охоплених терміном "антиген-зв'язувальна частина", включають () фрагмент Рар: одновалентний фрагмент, що складається з доменів МІ, МН, СІ ї СНТІ; (ії) фрагмент Е(ар)»: двовалентний фрагмент, що містить два фрагменти Раб, зв'язаних дисульфідним містком у шарнірній ділянці; (іїї) фрагмент Ба, що складається з доменів МН ії СНІ; (ім) фрагмент Ем, що складається з доменів МІ. і МН з одного плеча антитіла, (м) фрагмент ДАБ, який складається з домену МН; і (м) виділену визначальну комплементарність ділянку (СОК), здатну специфічно зв'язуватися з антигеном. Крім того, незважаючи на те, що окремі гени кодують два домени фрагмента Ем, МІ і МН, їх можна поєднувати, використовуючи рекомбінантні способи, за допомогою синтетичного лінкеру, який дозволяє створювати їх у вигляді єдиного білкового ланцюга, у якому домени МІ і МН утворюють пари для того, щоб формувати одновалентні молекули (відомі як одноланцюговий Ем (5сЕм)). Також у винахід включені антиген-зв'язувальні молекули, що містять МН і/або МІ. У випадку МН, молекули також можуть містити одну або декілька з ділянок СНІ, шарніра, СН2 або СНЗ. Передбачено, що такі одноланцюгові антитіла також включені в термін "антиген-зв'язувальна частина" антитіла. Інші форми одноланцюгових антитіл, такі як діатіла, також включені. Діатіла являють собою двовалентні біспецифічні антитіла, у яких домени МН і МІ експресовані в одному поліпептидному ланцюзі, але з використанням лінкеру, який занадто короткий, щоб уможливити утворення пар між двома доменами в одному і тому ж ланцюзі, тим самим примушуючи домени утворювати пару з комплементарними доменами іншого ланцюга і створювати дві антиген-зв'язувальні ділянки. (0078) Части антитіл, такі як фрагменти Раб і Е(ар)г2, можна одержувати із цілих антитіл, використовуючи загальноприйняті способи, такі як розщеплення цілих антитіл папаїном або пепсином. Крім того, антитіла, частини антитіл і молекули імуноадгезії можна одержувати з використанням стандартних способів рекомбінантної ДНК, наприклад, як розкрито в даному описі.

І0079| Клас (ізотип) і підклас анти-І АС-3 антитіл можна визначати будь-яким відомим у даній галузі способом. У цілому, клас і підклас антитіла можна визначати з використанням антитіл, які мають специфічність до конкретного класу і підкласу антитіл. Такі антитіла доступні комерційно.

Клас і підклас можна визначати за допомогою ЕГІЗА, вестерн-блотингу, а також іншими прийомами. Альтернативно, клас і підклас можна визначати за допомогою повного або часткового секвенування константних ділянок важких і/або легких ланцюгів антитіл, порівняння їх амінокислотних послідовностей з відомими амінокислотними послідовностями різних класів і підкласів імуноглобулінів, і визначення класу і підкласу антитіл.

І0080| Якщо не зазначене інше, усі номери амінокислотних залишків антитіл, що згадуються в цьому розкритті, наведені відповідно до схеми нумерації ІМТ Ф).

Анти-І АО-3 антитіла 0081) Даний винахід належить до антитіл, націлених на ГГ Ас-3, і їх антиген-зв'язувальних частин. У конкретному варіанті здійснення антитіла, розкриті в даному описі, являють собою антитіла людини, створені в трансгенних щурів, які здатні створювати антитіла з ідіотипами людини. В іншому варіанті здійснення антитіла являють собою отримані в курки химерні антитіла, що містять послідовності СОК курки їі каркасні ділянки людини, де каркасні ділянки піддавали гуманізації.

І0082| Одна перевага нових анти-І! АС-3 антитіл за винаходом полягає в тому, що вони здатні підсилювати активність Т-клітин, як вимірюють за збільшеним продукуванням ІІ-2; див., наприклад, приклад 7. Не бажаючи обмежуватися якою-небудь конкретною теорією, вважають, що анти-ЇАС-З антитіла за винаходом здатні блокувати взаємодію 1АС-3 з його передбачуваними лігандами, такими як МНСЇЇ ї І 5ЕСІіп. Антитіла можуть виконувати це безпосередньо через блокування ділянки зв'язування ліганду, як продемонстровано, наприклад, у прикладі 6, або через індукування інтерналізації ГАС-3, яка передбачена як можливий механізм дії що лежить в основі результатів, представлених у прикладі 9. Інша можлива перевага анти-І АС-3 антитіл за винаходом полягає в низькому рівні вторинних ефекторних функцій в антитіл, що мають мутації "ГАГА" (1234А//235А), які перешкоджають значимому зв'язуванню антитіла з ЕСдК людини (рецептори Есу), і, таким чином, виснаженні ефекторних Т- клітин. 0083) В одному з варіантів здійснення анти-І АС-3 антитіло має СОКЗ важкого ланцюга (Н-

СОКЗ), яка щонайменше на 90 95 ідентична за послідовністю з будь-якою з 5ЕО ІЮ МО:37, 43, 46, 50, 55, 58 і 64, наприклад, щонайменше на 92 95 ідентична, наприклад, щонайменше на 95

Фо, 96 96, щонайменше на 97 95, щонайменше на 98 95 або щонайменше на 99 95 ідентична будь- якій з «ЕО ІЮ МО:37, 43, 46, 50, 55, 58 і 64.

І0084| В одному з варіантів здійснення анти-ІЇ АС-3 антитіло має варіабельний домен важкого ланцюга (МН), який щонайменше на 90 95 ідентичний за послідовністю з будь-якою з

ЗЕО ІО МОЗ, 7, 11, 15, 19, 23 або 27, наприклад, щонайменше на 92 95 ідентичний, наприклад, щонайменше на 95 95, 96 96, щонайменше на 97 95, щонайменше на 98 95 або щонайменше на 99 95 ідентичний будь-якій з ЗЕО ІЮ МО:3, 7, 11, 15, 19, 23 або 27. 0085) В іншому варіанті здійснення анти-| АС-3 антитіло має варіабельний домен важкого ланцюга (МН), який щонайменше на 90 95 ідентичний за послідовністю будь-якій з зЗЕО ІО МО:3, 7, 11, 15, 19, 23 або 27, наприклад, щонайменше на 92 95 ідентичний, наприклад, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 95, щонайменше на 98 95 або щонайменше на 99 95 ідентичний будь-якій з БЕ ІЮ МО:3, 7, 11, 15, 19, 23 або 27; і константну ділянку важкого ланцюга, яка щонайменше на 90 95 ідентична за послідовністю з ЕС ІЮ МО:30, наприклад, щонайменше на 92 95 ідентична, наприклад, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 965, щонайменше на 97 95, щонайменше на 98 95 або щонайменше на 99 95 ідентична з ЗЕО

ІО МО:30.

І0086)| В іншому варіанті здійснення анти-Ї АС-3 антитіло має важкий ланцюг (НС), який містить амінокислотну послідовність МН із будь-якою з 5ЕО ІЮ МО:3, 7, 11, 15, 19, 23 або 27 і амінокислотну послідовність константної ділянки важкого ланцюга з БЕО ІЮ МО:30.

І0087| В одному з варіантів здійснення анти-І АС-3 антитіло має СОКЗ легкого ланцюга (І -

СОКЗ), яка щонайменше на 90 95 ідентична за послідовністю будь-якої з зЗЕО ІЮ МО:40, 52,61 67, наприклад, щонайменше на 92 95 ідентична, наприклад, щонайменше на 95 95, 96 95, щонайменше на 97 95, щонайменше на 98 95 або щонайменше на 99 95 ідентична будь-якій з

ЗЕО ІЮ МО:40, 52,61167. (0088) В іншому варіанті здійснення анти-І АС-3 антитіло має варіабельний домен легкого ланцюга (МІ), який щонайменше на 90 95 ідентичний за послідовністю з амінокислотною послідовністю МІ. з будь-якою з 5ЕО ІЮ МО:4, 8, 12, 16, 20, 24 або 28, наприклад, щонайменше на 92 95 ідентичний, наприклад, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 95, щонайменше на 98 95 або щонайменше на 99 95 ідентичний будь-якій з БЕО ІЮ МО 4, 8, 12, 16, 20, 24 або 28. 0089) В іншому варіанті здійснення анти-І АС-3 антитіло має варіабельний домен легкого

Зо ланцюга (М), який щонайменше на 90 до ідентичний за послідовністю з амінокислотною послідовністю МІ. з будь-якою з 5ЕО ІЮО МО 4, 8, 12, 16, 20 або 24, наприклад, щонайменше на 92 95 ідентичний, наприклад, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 до, щонайменше на 98 95 або щонайменше на 99 95 ідентичний будь-якій з ЗЕО ІЮ МО:4, 8, 12, 16, 20 або 24; і амінокислотну послідовність константної ділянки легкого ланцюга, яка щонайменше на 90 95 ідентична за послідовністю з 5ЕО ІЮ МО:34, наприклад, щонайменше на 92 95 ідентична, наприклад, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 95, щонайменше на 98 95 або щонайменше на 99 95 ідентична з БЕО ІЮ МО:34. 0090) В іншому варіанті здійснення анти-І АС-3 антитіло має варіабельний домен легкого ланцюга (МІ), який щонайменше на 90 95 ідентичний за послідовністю з амінокислотною послідовністю МІ з 5ЕО ІЮ МО:28, наприклад, щонайменше на 92 95 ідентичний, наприклад, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 95, щонайменше на 98 95 або щонайменше на 99 95 ідентичний з 5ЕО ІЮ МО:С28; і амінокислотну послідовність константної ділянки легкого ланцюга, яка щонайменше на 90 95 ідентична за послідовністю з БЕО ІЮ МО:32, наприклад, щонайменше на 92 95 ідентична, наприклад, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 965, щонайменше на 97 95, щонайменше на 98 95 або щонайменше на 99 95 ідентична з 5ЕО

ІО МО:32.

І0091| В іншому варіанті здійснення анти-І АС-3 антитіло має легкий ланцюг, який містить будь-яку ЗЕО ІО МО :4, 8, 12, 16, 20 або 24, і ЗЕО ІЮ МО:34. 00921) В іншому варіанті здійснення анти-І АС-3 антитіло має легкий ланцюг, який містить 5ЕО ІЮ МО:28 і БЕО ІЮО МО:32.

Ї0093| У певних варіантах здійснення анти-І АС-3 антитіло містить будь-який з описаних вище важких ланцюгів і будь-який з описаних вище легких ланцюгів.

І0094| У деяких варіантах здійснення анти-Ї АС-3 антитіло або антиген-зв'язувальна частина за винаходом містить амінокислотні послідовності Н-СОН1-3 і Г-СОВ1-3 з: а) ЗЕО ІЮО МО:35, 36, 37, 38, 39 і 40, відповідно;

Б) 5ЕО ІО МО:41, 42, 43, 44, 45 і 40, відповідно; с) ЗЕО ІЮ МО:35, 42, 46, 44, 47 і 40, відповідно; а) 5ЕО ІЮ МО:48, 49, 50, 51, 47 і 52, відповідно; е) ЗЕО ІЮО МО:53, 54, 55, 44, 45 і 40, відповідно; бо У 5ЕО ІО МО:56, 57, 58, 59, 60 і 61, відповідно; або

9) ЗЕО ІЮ МО:62, 63, 64, 65, 66 і 67, відповідно. 0095) У деяких варіантах здійснення анти-Ї АС-3 антитіло або антиген-зв'язувальна частина за винаходом містить Н-СОКЗ і ап І-СОКЗ, які на 80 95, 85 95, 90 95, 91 95, 92 95, 93 95, 94 95, 95 оо, 96 905, 97 90, 98 95 або 99 95 ідентичні амінокислотним послідовностям: а) ЗЕО ІЮО МО:37 і 40, відповідно;

В) ЗЕО ІЮО МО:43 і 40, відповідно; с) ЗЕО ІЮ МО:46 і 40, відповідно; 9) 5ЕО ІЮО МО:50 і 52, відповідно; е) ЗЕО ІЮО МО:55 і 40, відповідно;

У 5ЕО ІЮО МО:58 і 61, відповідно; або 9) ЗЕО ІЮ МО:64 і 67, відповідно. 0096) У деяких варіантах здійснення анти-Ї АС-3 антитіло або антиген-зв'язувальна частина за винаходом містить МН і М, які на 80 95, 85 95, 90 95, 91 95, 92 95, 93 95, 94 905, 95 95, 96 95, 97 оо, 98 95 або 99 95 ідентичні амінокислотним послідовностям: а) 5ЕО ІЮО МОЗ і 4, відповідно;

В) ЗЕО ІО МО:7 і 8, відповідно; с) ЗЕО ІЮ МО:11 і 12, відповідно; а) 5ЕО ІЮО МО:15 і 16, відповідно; е) ЗЕО ІЮО МО:19 і 20, відповідно;

У 5ЕО ІЮ МО:23 і 24, відповідно; або 9) ЗЕО І МО:27 і 28, відповідно.

І0097| У деяких варіантах здійснення анти-Ї АС-3 антитіло або антиген-зв'язувальна частина за винаходом містить УН і МІ., які мають амінокислотні послідовності: а) 5ЕО ІЮО МОЗ і 4, відповідно;

У 5ЕО ІЮ МО:23 і 24, відповідно; або 9) ЗЕО І МО:27 і 28, відповідно. 0098) У деяких варіантах здійснення анти-Ї АС-3 антитіло містить: а) НС з амінокислотними послідовностями ЗЕО ІЮ МО:З ії 30 ї С з амінокислотними послідовностями 5ЕО ІЮ МО 4 і 34;

БЮ) НС з амінокислотними послідовностями 5ЕО ІЮ МО:7 ії 30 ії С з амінокислотними послідовностями 5ЕО ІЮ МО:8 і 34; с) НС з амінокислотними послідовностями ЗЕО ІЮО МО:11 ї 30 ї С з амінокислотними послідовностями 5ЕО ІЮ МО:12 і 34; 4) НС з амінокислотними послідовностями ЗЕО ІЮО МО:15 ї 30 ї С з амінокислотними послідовностями 5ЕО ІЮ МО:16 і 34; е) НС з амінокислотними послідовностями 5ЕО ІО МО:19 їі 30 їі С з амінокислотними послідовностями 5ЕО ІЮ МО:20 і 34;

У НС з амінокислотними послідовностями 5ЕО ІЮ МО:23 ї 30 ії С з амінокислотними послідовностями 5ЕО ІЮО МО:24 і 34; або 9) НС з амінокислотними послідовностями 5ЕБЕО ІЮО МО:27 ї 30 ї С з амінокислотними послідовностями 5ЕО ІЮ МО:28 і 32.

І0099| У деяких варіантах здійснення анти-Ї АС-3 антитіло або антиген-зв'язувальна частина за винаходом містить амінокислотні послідовності Н-СОВ1-3 і Г-СОВ1-3 антитіла 15646, 15532, 15723, 15595, 15431, 15572 або 15011.

ІО1001| У деяких варіантах здійснення анти-Ї АС-3 антитіло або антиген-зв'язувальна частина за винаходом містить МН і Мі, які щонайменше на 90 95 ідентичні за амінокислотною послідовністю МН і МІ., відповідно, антитіла 15646, 15532, 15723, 15595, 15431, 15572 або 15011.

ІО101| У деяких варіантах здійснення анти-Ї АС-3 антитіло або антиген-зв'язувальна частина за винаходом містить МН і МІ, які являють собою УН і МІ, відповідно, антитіла 15646, 15532, 15723, 15595, 15431, 15572 або 15011.

ІО102| У деяких варіантах здійснення анти-(ЇАС-3 антитіло за винаходом являє собою антитіло 15646, 15532, 15723, 15595, 15431, 15572 або 15011 або антитіло з тими ж амінокислотними послідовностями, що і у зазначеного антитіла.

ІЇО103| Винахід також належить до анти-ІАС-3 антитіла або його антиген-зв'язувальної частини, яке зв'язується з епітопом ГАС-3 людини, що має:

а) 1, 2, 3, 4, 5, 6 або всі 7 амінокислотних залишків, вибраних з Н85, Р8б, А87, Р89, 591, М/92 і 593 з БЕО ІЮ МО:68 (наприклад, антитіло 15532);

Б)1,2,3,4,5,6, 7,8,9, 10,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 або всі 32 амінокислотних залишки, вибраних з А40, 241, Р43, Р46, Р49, 052, Т62,

О64, Нб5, 066, Рб7, 068, 293, РО4, РОб, ВО98, М99, Т100, М101, РІОб6, 1107, В119, Е124, В129, 130, 0131, 5133, К137, Р1І38, 0143, К148 і К163 з БЕО ІЮ МО:68 (наприклад, антитіло 15431); с)1,2,3,4,5,6, 7,8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 або всі 29 амінокислотних залишків, вибраних з А40, 241, Р43, Р4Аб6, Р49, 052, 162, 064, Нб5,

О6б, Рб7, 068, РОб, 99, Т100, М101, Р1О6, 107, 8119, Е124, 129, 2130, 0131, 5133, В137,

Р138, 0143, К148 і К163 з БЕО ІЮ МО:68 (наприклад, антитіло 15572); або

Я) 1, 2, З або всі 4 амінокислотних залишки, вибраних з 5107,1109, К110 ї 5111 з 5ЕО ІЮ

МО:68 (наприклад, антитіло 15011). 0104) Винахід також належить до моноклонального антитіла або його антиген-зв'язувальної частини, які зв'язуються з епітопом ГАС-3 людини, що має залишки 98-105. У деяких варіантах здійснення антитіло або антиген-зв'язувальна частина зв'язується з епітопом ГАС-3 людини, що має: а) 2 або З амінокислотних сегмента, вибраних із залишків 78-105 і 123-131 з БЕО ІЮ МО:68 (наприклад, антитіло 15532);

Б) 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних сегментів, вибраних із залишків 23-30, 40-66, 88-105, 123- 137 і 148-152 з БЕО ІО МО:68 (наприклад, антитіло 15431); с) 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних сегментів, вибраних із залишків 23-30, 40-66, 98-105, 118- 137 ії 148-161 з БЕО ІО МО:68 (наприклад, антитіло 15572); або а) амінокислотні залишки 98-105 з БЕО ІЮ МО:68 (наприклад, антитіло 15011).

ІО105) Винахід також належить до моноклонального антитіла або його антиген-зв'язувальної частини, які зв'язуються з епітопом ГАС-3 людини, що мають залишки 23-30 і 40-66 з 5ЕО ІЮ

МО:68. У деяких варіантах здійснення епітоп додатково має залишки 88-105, 123-137 і/або 148- 152 з БЕО ІЮ МО:68. У деяких варіантах здійснення епітоп додатково має залишки 98-105, 118- 137 і 148-161 з БЕО ІЮ МО:68.

І0106| Винахід також належить до анти-ІАС-3 антитіла або його антиген-зв'язувальної

Зо частини, яке конкурує або перехресно конкурує за зв'язування або зв'язується з тим же епітопом, що і антитіло, вибране із групи, що складається з 15532, 15646, 15723, 15595, 15431, 15572 і 15011.

І0107| У деяких варіантах здійснення анти-І АС-3 антитіло або його антиген-зв'язувальна частина за винаходом не зв'язуються з тим же епітопом ГАС-3 людини, що і антитіло 25Е7-

Ї аа3.5. 0108) У деяких варіантах здійснення в анти-І АС-3 антитілі або його антиген-зв'язувальній частині за винаходом використовують ген важкого ланцюга зародкової лінії людини, вибраний із групи, що складається з І(ЗНМУ4-34, ІЗНМ1-24, ІВСНМ6-1, ІЗНМ4-39 і ІЗНМУЗ3-23. У певних варіантах здійснення ген важкого ланцюга зародкової лінії щонайменше на 75 95, 80 95, 82 95, 85 95, 86 9б, 87 95,88 95,89 95, 90 95, 91 95, 92 95, 93 95, 94 95, 95 95, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичний відповідній послідовності важкого ланцюга в антитілі проти Г(АСЗ або антиген- зв'язувальної частини. У певних варіантах здійснення послідовності каркасних ділянок зазначеного гена важкого ланцюга зародкової лінії щонайменше на 75 95, 80 95, 82 9о, 85 95, 86 то, 87 У, 88 Фо, 89 90, 90 90, 91 90, 92 У, 93 Зо, 94 95, 95 90, 96 90, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичні відповідним послідовностям каркасних ділянок важких ланцюгів в антитілі проти | АОЗ або антиген-зв'язувальної частини. 01091 У деяких варіантах здійснення в анти-| АС-3 антитілі або його антиген-зв'язувальної частини за винаходом використовують ген легкого ланцюга зародкової лінії людини, вибраний із групи, що складається з (ЗКМ3-11, (ЗКМ1-12, ІСКМ1-5 і ІСІ М3-19. У певних варіантах здійснення

БО ген легкого ланцюга зародкової лінії щонайменше на 75 90, 80 Фо, 82 95, 85 Ус, 86 95, 87 Ус, 88 Фо, 89 95,90 95, 91 95, 92 95, 93 95, 94 95, 95 95, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичний відповідній послідовності легкого ланцюга в антитілі проти ГАЗ або антиген-зв'язувальної частини. У певних варіантах здійснення послідовності каркасних ділянок зазначеного гена легкого ланцюга зародкової лінії щонайменше на 75 905, 80 95, 82 905, 85 95, 86 905, 87 95, 88 95, 89 оо, 90 95, 91 95, 92 95, 93 95, 94 95, 95 905, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичні відповідним послідовностям легких ланцюгів каркасних ділянок в антитілі проти ГАЗ або антиген- зв'язувальної частини.

ІЇО110| У конкретних варіантах здійснення в анти-/ЇАС-3 антитілі або його антиген- зв'язувальній частині за винаходом використовують будь-яку комбінацію вищевказаних генів 60 важких ланцюгів зародкової лінії людини і генів легких ланцюгів зародкової лінії людини

(наприклад, ІСНМ4-34 і ІЗКМ3-11, ІЗНМ1-24 їі ІСКМ1-12, ІЗНМВб6-1 і І5КМ3-11, ІЗНМ4-39 і ІЄКМ1-5 або ІСНМ3-23 і ІБІ М3-19)3. У деяких варіантах здійснення гени важких і легких ланцюгів зародкової лінії щонайменше на 75 95, 80 95, 82 95, 85 95, 86 95, 87 95, 88 905, 89 905, 90 95, 91 90, 92 о, 93 90, 94 95, 95 95, 96 95, 97 90, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичні відповідним послідовностям важких і легких ланцюгів, відповідно, в антитілі проти І АСЗ або антиген-зв'язувальної частини.

У певних варіантах здійснення послідовності каркасних ділянок зазначених генів важких і легких ланцюгів зародкової лінії щонайменше на 75 905, 80 95, 82 905, 85 95, 86 905, 87 90, 88 95, 89 905, 90 90, 91 96,92 95, 93 Ов, 94 965, 95 95, 96 95, 97 90, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичні відповідним послідовностям важких і легких ланцюгів каркасних ділянок, відповідно, в антитілі проти ГАЗ або антиген-зв'язувальної частини. 0111) У деяких варіантах здійснення будь-які анти-І АС-3 антитіла або антиген-зв'язувальні частини, описані в даному описі, можуть зв'язуватися з ГАС-3 людини з ЕСво, наприклад, 0,2 нм або менше, 0,15 нМ або менше, 0,1 нМ або менше, 0,09 нМ або менше, 0,08 нМ або менше, 0,07 нМ або менше, 0,06 нМ або менше, 0,05 нМ або менше або 0,04 нМ або менше. У деяких варіантах здійснення будь-які з анти-І АС-3 антитіл або антиген-зв'язувальних частин, описаних у даному описі, можуть зв'язуватися з | АС-3 яванського макака, наприклад, з ЕСвхо 0,4 нМ або менше, 0,3 нМ або менше, 0,2 нМ або менше, 0,1 нМ або менше, 0,09 нМ або менше, 0,08 нм або менше, 0,07 нМ або менше, 0,06 нМ або менше, 0,05 нМ або менше, 0,04 нМ або менше або 0,03 нМ або менше.

ІЇО112| У деяких варіантах здійснення будь-які з анти-ІА(С-3 антитіл або антиген- зв'язувальних частин, описаних у даному описі, можуть зв'язуватися з ГАС-3 людини з ЕСбво, наприклад, 0,1 нМ або менше. У деяких варіантах здійснення будь-які з анти-І АС-3 антитіл або антиген-зв'язувальних частин, описаних у даному описі, можуть зв'язуватися з ГАО-3 яванського макака, наприклад, з ЕСхо 0,3 НМ або менше. У конкретних варіантах здійснення будь-які з анти- АС-3 антитіл або антиген-зв'язувальних частин, описаних у даному описі, можуть зв'язуватися з І АО-3 людини, наприклад, з ЕСво 0,1 нМ або менше і ГАС-3 яванського макака, наприклад, з ЕСзхо 0,3 нМ або менше.

ЇО113| У деяких варіантах здійснення будь-яке анти-ЇАсС-3 антитіло або антиген- зв'язувальна частина, описана в даному описі, може інгібувати зв'язування лігандів, таких як

Зо МНС класу ІІ (МНС) або І 5ЕСіп, з | АС-3. Наприклад, при 20 мкг/мл, анти-| АС-3 антитіло або антиген-зв'язувальна частина може знижувати зв'язування ГГ АС-3 з МНСІЇ щонайменше на 35 95, щонайменше на 40 95, щонайменше на 45 95, щонайменше на 50 95, щонайменше на 55 95, щонайменше на 60 95, щонайменше на 65 9565, щонайменше на 70 95, щонайменше на 75 95, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 89 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 91 95, щонайменше на 92 95, щонайменше на 93 956, щонайменше на 94 9б, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 9565, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95 або на 100 95 у порівнянні з зв'язуванням у присутності антитіла негативного контролю. В одному з варіантів здійснення анти-І! АС-3 антитіло або антиген- зв'язувальний білок може знижувати зв'язування І АС-3 з МНОЇЇ більше ніж на 85 95 у порівнянні з негативним контролем. В одному з варіантів здійснення анти-І! АС-3 антитіло або антиген- зв'язувальний білок може знижувати зв'язування ГАС-3 з МНОСЇЇ приблизно на 35-85 95 у порівнянні з негативним контролем.

ІЇО114| У деяких варіантах здійснення будь-які з анти-ІА(С-3 антитіл або антиген- зв'язувальних частин, описаних у даному описі, можуть блокувати зв'язування між ГАс-3 і МНС класу ІЇ, наприклад, ГАС-3 людини, що експресується на клітинах Уигкаї, і МНС класу ІЇ людини, що експресується на клітинах Каїі (наприклад, у концентрації 0,1 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 1 мкг/мл, 5 мкг/мл, 10 мкг/мл, 20 мкг/мл, 30 мкг/мл, 40 мкг/мл або 50 мкг/мл).

ІЇО115| У деяких варіантах здійснення будь-які з анти-ІА(С-3 антитіл або антиген- зв'язувальних частин, описаних у даному описі, можуть зв'язуватися з ГАС-3 людини з Ко

БО 5,0х108 або менше, 4,0х108 або менше, 3,0х108 або менше, 2,0х108 або менше, 1,0х108 або менше, 9,0х109 або менше, 8,0х109 або менше, 7,0х109 або менше, 6,0х109 або менше, 5,0х109 або менше, 4,0х109 або менше, 3,0х109 або менше, 2,0х109 або менше або 1,0х10- або менше, як виміряно поверхневим плазмонним резонансом.

ІЇО116| У деяких варіантах здійснення будь-які з анти-ІА(С-3 антитіл або антиген- зв'язувальних частин, описаних у даному описі, можуть зв'язуватися з Г АС-3 яванського макака з Ко 1,5х10-7 або менше, 1,0х10-7 або менше, 9,0х108 або менше, 8,0х108 або менше, 7,0х108 або менше, 6б,0х108 або менше, 5,0х108 або менше, 4,0х108 або менше, 3,0х108 або менше, 2,0х108 або менше або 1,0х1058 або менше, як виміряно поверхневим плазмонним резонансом.

ІЇО117| У деяких варіантах здійснення будь-які з анти-ІА(С-3 антитіл або антиген- бо зв'язувальних частин, описаних у даному описі, можуть зв'язуватися з ГАС-3 миші з Ко 5,0х108 або менше, 4,5х108 або менше, 4,0х109 або менше, 3,5х105 або менше або 3,0х108 або менше, як виміряно поверхневим плазмонним резонансом.

ІЇО118| У деяких варіантах здійснення будь-які з анти-ІА(С-3 антитіл або антиген- зв'язувальних частин, описаних у даному описі, можуть стимулювати продукцію 1-2, наприклад,

ЗЕВ-стимульованими РВМС.

ІЇО119| У деяких варіантах здійснення будь-які з анти-ІА(С-3 антитіл або антиген- зв'язувальних частин, описаних у даному описі, можуть знижувати клітинні і/або розчинні рівні

Г АС-3, наприклад, у лінії Т-клітин людини (такій як лінія Т-клітин людини з надекспресією І Ас-

З).

ІО120| У деяких варіантах здійснення будь-які з анти-ІА(С-3 антитіл або антиген- зв'язувальних частин, описаних у даному описі, можуть індукувати регресію пухлинного росту і/або затримувати пухлинний ріст іп мімо.

ІЇО121| У деяких варіантах здійснення будь-які з анти-ІА(С-3 антитіл або антиген- зв'язувальних частин, описаних у даному описі, можуть зв'язуватися з іншим епітопом ГАО-3 людини, ніж антитіло 25Е7-І ад3.5. 0122) В одному з варіантів здійснення введення анти-Ї АС-3 антитіла за винаходом або його антиген-зв'язувальної частини може активувати Т-клітини, викликаючи посилену протипухлинну активність. 01231 Клас анти-І АС-3 антитіла, одержуваного за допомогою способів, описаних у даному описі, можна змінювати або перемикати на інший клас або підклас. В одному з аспектів винаходу молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує МІ або МН, виділяють із використанням способів, добре відомих у даній галузі, так, що вона не містить послідовності нуклеїнової кислоти, що кодують Сі або СН, відповідно. Потім молекули нуклеїнової кислоти, що кодують

МІ. або МН, функціонально зв'язують із послідовністю нуклеїнової кислоти, що кодує Сі. або СН, відповідно, з молекули імуноглобуліну іншого класу. Цього можна досягати з використанням вектора або молекули нуклеїнової кислоти, що містить ланцюг Сі або СН, як описано вище.

Наприклад, клас анти-ІЇАС-3 антитіла, яке з самого початку являло собою ІЗ9М, можна перемикати на Ідс. Крім того, перемикання класу можна використовувати для того, щоб перетворювати Ідс одного підкласу в інший, наприклад, з їДсС1 на Ідо2. Константну ділянку

Зо легкого ланцюга к можна міняти, наприклад, на константну ділянку легкого ланцюга А.

Переважний спосіб одержання антитіла за винаходом бажаного ізотипу Ід включає стадії виділення молекули нуклеїнової кислоти, що кодує важкий ланцюг анти-І|Асй-3 антитіла, і молекули нуклеїнової кислоти, що кодує легкий ланцюг анти-І!АсС-3 антитіла, одержання варіабельного домену важкого ланцюга, лігування варіабельного домену важкого ланцюга з константною ділянкою важкого ланцюга бажаного ізотипу, експресії легкого ланцюга і лігованого важкого ланцюга в клітині і збору анти-І АС-3 антитіла бажаного ізотипу. (0124) Анти-І АС-3 антитіло за винаходом може являти собою молекулу Ідс, ІМ, ЧЕ, ІдА або дО, але зазвичай належить до ізотипу Ідс, наприклад, дос підкласу ІДдС1, Їдс2а або Ідса26,

ІЧО3З або Ідс4. В одному з варіантів здійснення антитіло являє собою Ідс1. В іншому варіанті здійснення антитіло являє собою Ідс2. У певних варіантах здійснення антитіла Їдс1 за даним винаходом, які зв'язуються з епітопом ГАС-3, описаним у даному описі, дають переважаючу активність при модулюванні (наприклад, інгібуванні) функцій ГАС-3, щоб домагатися лікування злоякісних пухлин або імуностимулювальних ефектів. 0125) В одному з варіантів здійснення анти-І АС-3 антитіло може містити щонайменше одну мутацію в Ес-ділянці. Відома множина різних мутацій Ес, де ці мутації забезпечують змінену ефекторну функцію. Наприклад, у багатьох випадках буде бажано знижувати або усувати ефекторну функцію, наприклад, коли взаємодії ліганд/рецептор небажані або у випадку кон'югатів антитіло-лікарський засіб.

І0126| В одному з варіантів здійснення анти-ІЇАС-3 антитіло містить щонайменше одну мутацію в Ес-ділянці, яка знижує ефекторну функцію. Положення амінокислот в Ес-ділянці, які можуть бути корисними для мутацій, щоб знижувати ефекторну функцію, включають одне або декілька з положень 228, 233, 234 і 235, де положення амінокислот нумерують відповідно до схеми нумерації ІМТ Ф.

ІО127| В одному з варіантів здійснення один або обидва з амінокислотних залишків у положеннях 234 і 235 можна мутувати, наприклад, з Геи в Аа (І234А//235А). Ці мутації знижують ефекторну функцію Ес-ділянки антитіл ІдС1. Додатково або альтернативно, амінокислотний залишок у положенні 228 можна мутувати, наприклад, в Рго. У деяких варіантах здійснення амінокислотний залишок у положенні 233 можна мутувати, наприклад, в Рго, амінокислотний залишок у положенні 234 можна мутувати, наприклад, в Ма! і/або амінокислотний залишок у положенні 235 можна мутувати, наприклад, в Аїа. Положення амінокислот нумерують відповідно до схеми нумерації ІМТ Ф. 0128) У деяких варіантах здійснення, де антитіло належить до підкласу ІдДс4, воно може містити мутацію 5228Р, тобто мати пролін у положенні 228, де положення амінокислоти нумерують відповідно до схеми нумерації ІМОТФ. Відомо, що ця мутація знижує небажаний обмін плечима Га. 0129) У певних варіантах здійснення антитіло або його антиген-зв'язувальна частина за винаходом може бути частиною більш крупної молекули імуноадгезії, утвореної за допомогою ковалентного або нековалентного зв'язку антитіла або частини антитіла з одним або декількома іншими білками або пептидами. Приклади таких молекул імуноадгезії включають використання ділянки серцевини стрептавідину для одержання тетрамерної молекули 5сЕм (Кіргіуапом еї аї.,

Нитап Апііродіез апа Нубгідотазх 6:93-101 (1995)) і використання залишку цистеїну, маркерного пептиду і С-кінцевої полігістидинової мітки для одержання двовалентних і біотинільованих молекул 5сЕм (Кіргіуапом еї аї., Мої. Іттипої. 31:1047-1058 (1994)). Інші приклади включають, де одну або декілька СОК з антитіла вбудовують у молекулу, ковалентно або нековалентно, щоб робити її імуноадгезином, який специфічно зв'язується з антигеном, що представляють інтерес.

У таких варіантах здійснення СОК можна вбудовувати як частину більш крупного поліпептидного ланцюга, можна ковалентно зв'язувати з іншим поліпептгидним ланцюгом або можна вбудовувати нековалентно. 0130) В іншому варіанті здійснення можна створювати злите антитіло або імуноадгезин, які містять повністю або частину анти-іЇАС-3 антитіла за винаходом, яке зв'язане з іншим поліпептидом. У певних варіантах здійснення тільки варіабельні домени анти-І АС-3 антитіла зв'язують із поліпептидом. У певних варіантах здійснення домен МН анти-І|Аай-3 антитіла зв'язують із першим поліпептидом, тоді як домен Мі. анти-І АС-3 антитіла зв'язують із другим поліпептидом, який асоціюється з першим поліпептидом таким чином, що домени МН і МІ. можуть взаємодіяти один з одним для того, щоб формувати антиген-зв'язувальну ділянку. В іншому переважному варіанті здійснення домен УН відокремлюють від домену МІ за допомогою лінкеру так, що домени МН і МІ. можуть взаємодіяти один з одним (наприклад, одноланцюгові антитіла). Потім антитіло МН-лінкер-М!. зв'язують із поліпептидом, що представляє інтерес. Крім

Зо того, можна створювати злиті антитіла, у яких два (або більше) одноланцюгових антитіла зв'язують один з одним. Це можна використовувати при бажанні створювати двовалентне або полівалентне антитіло на одному поліпептидному ланцюзі або при бажанні створювати біспецифічне антитіло.

ІО131| Для того щоб створювати одноланцюгове антитіло (5сЕм), МН- і МІ-кодуючі фрагменти

ДНК функціонально зв'язують із іншим фрагментом, що кодує гнучкий лінкер, наприклад, що кодує амінокислотну послідовність (сіІу4 5ег)3 (ЗЕО ІО МО:74), так, що послідовності МН і МІ. можна експресувати у вигляді безперервного одноланцюгового білка, з доменами Мі і МН, з'єднаними гнучким лінкером. Див., наприклад, Віга еї аї., Зсіепсе 242:423 426 (1988); Низіоп еї а!І,, Ргос. Маї!. Асайд. 5сі. ОБА 85:5879 5883 (1988); і МсСапйегіу еї аї., Маїшге 348:552 554 (1990).

Одноланцюгове антитіло може бути одновалентним, якщо тільки використовують одну МН і Мі; двовалентним, якщо використовують дві МН і Мі; або полівалентним, якщо використовують більше ніж два МН і МІ. Наприклад, можна створювати біспецифічні або полівалентні антитіла, які специфічно зв'язуються з | АО-3 людини і іншою молекулою.

І0132| В інших варіантах здійснення можна одержувати інші модифіковані антитіла з використанням молекул нуклеїнової кислоти, що кодують анти-І! АС-3 антитіло. Наприклад, "каппа-тіла" (І еї аї., Ргоїєїп Епо. 10:949-57 (1997)), "мініантитіла" (Мапіп еї аІ., ЕМВО 9. 13:5303- 9 (1994)), "діатіла" (Ноїїдег еї аї., Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА 90:6444-6448 (1993)) або "янусини" ((ТгайпескКег єї аІ., ЕМВО 4). 10:3655-3659 (1991) і ТгаипескКег еї аї., Іпі. У. Сапсег (Зиррі.) 7:51-52 (1992)) можна одержувати з використанням стандартних молекулярно-біологічних прийомів, дотримуючись вказівок з опису. 0133) В анти-І АС-3 антитіло або антиген-зв'язувальну частину за винаходом можна ввести функціональні групи або зв'язати з іншою молекулою (наприклад, іншим пептидом або білком).

У цілому, в антитіла або їх частини вводять такі функціональні групи, які при одержанні похідних або введенні мітки на зв'язування з ГАС-3 не виявляють небажаного впливу. Відповідно, передбачається, що антитіла і частини антитіл за винаходом включають як інтактні, так і модифіковані форми анти-І АСі-3 антитіл людини, описаних у даному описі. Наприклад, антитіло або частину антитіла за винаходом можна функціонально зв'язувати (шляхом хімічного кон'югування, генетичного злиття, нековалентної асоціації або іншим способом) з одним або декількома іншими молекулярними об'єктами, такими як інше антитіло (наприклад, 60 біспецифічне антитіло або діатіло), засіб детекції, фармацевтичний засіб і/або білок або пептид,

який може опосередковувати зв'язування антитіла або частини антитіла з іншою молекулою (такою як ділянка серцевини стрептавідину або полігістидинова мітка). 0134) Один тип похідних антитіла одержують за допомогою перехресного зв'язування двох або декількох антитіл (того самого типу або різних типів, наприклад, для створення біспецифічних антитіл). Придатні агенти перехресного зв'язування включають гетеробіфункціональні агенти і агенти, що мають дві окремі реакційноздатні групи, розділені придатним спейсером (наприклад, складний ефір м-малеїмідобензоїл-М-гідроксисукциніміду) або гомобіфункціональним (наприклад, дисукцинімідилсуберат). Такі лінкери доступні, наприклад, в Рієгсе Спетіса! Сотрапу, Коскога, ЇЇ. 0135) В анти-ІАС-3 антитіло також можна ввести функціональну хімічну групу, таку як поліетиленгліколь (РЕС), метильна або етильна група, або вуглеводна група. Ці групи можна використовувати для поліпшення біологічних характеристик антитіла, наприклад, для підвищення часу напівжиття в сироватці.

І0О136)| В антитіло за даним винаходом також можна вводити мітку. Як використовують у даному описі, терміни "введення мітки" або "мічене" належать до вбудовування іншої молекули в антитіло. В одному з варіантів здійснення мітка являє собою маркер, що піддається виявленню, наприклад, вбудовування радіоактивно-міченої амінокислоти або приєднання до поліпептиду біотинільних фрагментів, які можна виявляти за допомогою позначеного авідину (наприклад, стрептавідину, що містить флуоресцентний маркер або ферментативну активність, які можна виявляти оптичними або колориметричними способами) В іншому варіанті здійснення мітка або маркер можуть бути терапевтичними, наприклад, кон'югат лікарського засобу або токсин. У даній галузі відомі різні способи мічення поліпептидів і глікопротеїнів, які можна використовувати. Приклади міток для поліпептидів включають, але не обмежуючись ними, наступне: радіоіїзотопи або радіонукліди (наприклад, ЗН, 70, 79М, 355, 90, 99Тс, Пл, 125І, 1911), флуоресцентні мітки (наприклад, РІТС, родамін, лантаноїдні люмінофори), ферментативні мітки (наприклад, пероксидазу хріну, В-галактозидазу, люциферазу, лужну фосфатазу), хемілюмінесцентні маркери, біотинільні групи, попередньо обумовлені поліпептидні епітопи, розпізнавані вторинним репортером (наприклад, пари послідовностей лейцинової блискавки, сайти зв'язування для вторинних антитіл, металзв'язувальні домени, епітопні мітки), магнітні засоби, такі як хелати гадолінію, токсини, такі як токсин коклюшу, таксол, цитохалазин В, граміцидин ОО, бромистий етидій, еметин, мітоміцин, етопозид, тенопозид, вінкристин, вінбластин, колхіцин, доксорубіцин, даунорубіцин, дигідроксіантрациндіон, мітоксантрон, мітраміцин, актиноміцин 0, 1-дегідротестостерон, глюкокортикоїди, прокаїн, тетракаїн, лідокаїн, пропранолол і пуроміцин і їх аналоги або гомологи. У деяких варіантах здійснення мітки прикріплюють за допомогою спейсерних плечей різної довжини для того, щоб знижувати потенційні стеричні утруднення.

ІО137| У певних варіантах здійснення антитіла за винаходом можуть бути присутніми у нейтральній формі (включаючи цвітер-іонні форми) або у вигляді позитивно або негативно заряджених частинок. У деяких варіантах здійснення антитіла можуть утворювати комплекси із протийоном для того, щоб формувати фармацевтично прийнятну сіль. (0138) Термін "фармацевтично прийнятна сіль" належить до комплексу, що містить одне або декілька антитіл і один або декілька протийонів, де протийони походять із фармацевтично прийнятних неорганічних і органічних кислот і основ.

Біспецифічні зв'язувальні молекули

І0139| У додатковому аспекті винахід належить до біспецифічної зв'язувальної молекули, що володіє специфічністю зв'язування (наприклад, що містить антиген-зв'язувальні частини) анти-

ІГАС-3 антитіла, описаного в даному описі, і специфічністю зв'язування іншого анти-І АСі-3 антитіла (наприклад, іншого анти-І АС-3 антитіла, описаного в даному описі) або антитіла, яке спрямоване на інший білок, такий як інший білок контрольної точки імунітету, антиген злоякісної пухлини або інша молекула клітинної поверхні, активність якої опосередковує патологічний стан, такий як злоякісна пухлина. Такі біспецифічні зв'язувальні молекули відомі в даній галузі, і приклади біспецифічних зв'язувальних молекул інших типів наведені в іншому місці в даному описі.

Молекули нуклеїнової кислоти і вектори (0140) Даний винахід також належить до молекул нуклеїнової кислоти і послідовностей, що кодують анти-І АС-3 антитіла або їх антиген-зв'язувальні частини, описані в даному описі. У деяких варіантах здійснення різні молекули нуклеїнової кислоти кодують амінокислотні послідовності важкого ланцюга і легкого ланцюга анти-| АС-3 антитіла або його антиген- зв'язувальної частини. В інших варіантах здійснення та сама молекула нуклеїнової кислоти кодує амінокислотні послідовності важкого ланцюга і легкого ланцюга анти-І АС-3 антитіла або його антиген-зв'язувальної частини. (0141) Вказівка нуклеотидної послідовності включає її комплементарний варіант, якщо не зазначене інше. Таким чином, слід розуміти, що вказівка на нуклеїнову кислоту з конкретною послідовністю, включає її комплементарний ланцюг з комплементарною послідовністю. Термін "полінуклеотид", як позначають у даному описі, позначає полімерну форму нуклеотидів щонайменше в 10 основ у довжину, рибонуклеотидів або дезоксинуклеотидів, або модифіковану форму нуклеотиду будь-якого типу. Термін включає одно- і дволанцюгові форми. (0142) Винахід також належить до нуклеотидних послідовностей, які щонайменше на 70 95, 75 95, 80 95, 85 95, 90 95, 95 95, 97 95, 98 95 або 99 95 ідентичні одній або декільком нуклеотидним послідовностям, перерахованим у даному описі, наприклад, до нуклеотидної послідовності, вибраної із групи, що складається з ЗЕО ІЮ МО:1, 2, 5, 6, 9, 10, 13, 14, 17, 18, 21, 22, 25 і 26, або до нуклеотидної послідовності, що кодує амінокислотну послідовність, вибрану із групи, що складається з 5ЕО ІЮО МОЗ, 4, 7, 8, 11, 12, 15, 16, 19, 20, 23, 24, 27 і 28. Термін "відсоток ідентичності послідовностей" у контексті послідовностей нуклеїнової кислоти належить до залишків у двох послідовностях, які являють собою те саме при вирівнюванні для максимальної відповідності. Відрізок порівняння ідентичності послідовностей може охоплювати фрагмент щонайменше приблизно в 9 нуклеотидів, зазвичай щонайменше приблизно 18 нуклеотидів, більш зазвичай щонайменше приблизно 24 нуклеотиди, зазвичай щонайменше приблизно 28 нуклеотидів, більш зазвичай щонайменше приблизно 32 нуклеотиди і переважно щонайменше приблизно 36, 48 або більше нуклеотидів. Існує множина різних алгоритмів, відомих у даній галузі, які можна використовувати для того, щоб вимірювати ідентичність нуклеотидних послідовностей. Наприклад, полінуклеотидні послідовності можна порівнювати з використанням

ЕА5ТА, Сар або Везінйї, які являють собою програми в Умізсопзіп РасКкаде версії 10.0, Сепеїїіс5

Сотршег сгоиМир (С), Мадізоп, Умізсопвзіп. ЕА5ТА, яка включає, наприклад, програми ЕАЗТА?2 і

ЕА5ЗТАЗ, надає вирівнювання і відсоток ідентичності послідовностей для ділянок найкращого перекриття між запитуваною і пошуковою послідовностями (див., наприклад, Реагзоп, Меїйодз

Епгутої. 183:63-98 (1990); Реагзоп, Меїйод5 Мої. ВіоІ. 132:185-219 (2000); Реаг5оп, МеїШтодв

Епгутої. 266:227-258 (1996); і Реагзоп, У. Мої. Віої. 276:71-84 (1998) включені в даний опис за допомогою посилання). Якщо не зазначене інше, використовують параметри за замовчуванням для конкретної програми або алгоритму. Наприклад, відсоток ідентичності послідовностей між послідовностями нуклеїнової кислоти можна визначати з використанням ЕАБТА з її параметрами за замовчуванням (розмір слова 6 і коефіцієнт МОРАМ для вагової матриці) або з використанням Сар з її параметрами за замовчуванням, як надано в Со версії 6.1, включеному в даний опис за допомогою посилання. 0143) В одному з аспектів, винахід належить до молекули нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність, вибрану із групи, що складається з ЗЕО ІЮ МО:1, 2, 5, 6, 9, 10, 13, 14, 17, 18, 21, 22, 25 і 26. У певних варіантах здійснення молекула нуклеїнової кислоти містить нуклеотидні послідовності з «ЕО ІЮ МО і 2, БЕО ІЮО МО:5 і 6, 5ЕО ІЮО МО:9 ї 10, БЕО ІЮ МО:13 і 14, ЗЕО ІО МО:17 і 18, ЗЕО ІЮ МО:21 і 22 або ЗЕО ІО МО:25 і 26. 0144) У будь-якому з наведених вище варіантів здійснення, молекули нуклеїнової кислоти можуть бути виділеними.

І0145| У додатковому аспекті, даний винахід належить до вектора, що підходить для експресії одного з ланцюгів антитіла або його антиген-зв'язувальної частини, як розкрито в даному описі. Термін "вектор", як використовують у даному описі, позначає молекулу нуклеїнової кислоти, здатну транспортувати іншу нуклеїнову кислоту, з якою вона зв'язана. У деяких варіантах здійснення вектор являє собою плазміду, тобто круглий дволанцюговий фрагмент ДНК, у який можна лігувати додаткові сегменти ДНК. У деяких варіантах здійснення вектор являє собою вірусний вектор, де додаткові сегменти ДНК можна лігувати у вірусний геном. У деяких варіантах здійснення вектори здатні до автономної реплікації в клітині-хазяїні, у яку їх вводять (наприклад, бактеріальні вектори, що мають бактеріальну ділянку початку реплікації, і епісомні вектори ссавців). В інших варіантах здійснення вектори (наприклад, не епісомні вектори ссавців) можна вбудовувати в геном клітини-хазяїна після введення в клітину- хазяїна і тим самим реплікувати поряд з геномом хазяїна. Крім того, певні вектори здатні управляти експресією генів, з якими вони функціонально зв'язані. Такі вектори позначають у даному описі як "рекомбінантні експресуючі вектори" (або просто "експресуючі вектори"). (0146) Винахід належить до векторів, що містять молекули нуклеїнової кислоти, які кодують важкий ланцюг анти-ІАС-3 антитіла за винаходом або його антиген-зв'язувальної частини, легкий ланцюг анти-І А(-3 антитіла за винаходом або його антиген-зв'язувальної частини або як 60 важкий, так і легкий ланцюги анти-і АС-3 антитіла за винаходом або його антиген-зв'язувальної частини. Винахід додатково передбачає вектори, що містять молекули нуклеїнової кислоти, що кодують злиті білки, модифіковані антитіла, фрагменти антитіл і їх зонди.

І0147| Молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує важкий і/або легкий ланцюг анти-ІАсй-З3 антитіла або його антиген-зв'язувальної частини за винаходом, можна виділяти з будь-якого джерела, яке продукує таке антитіло або частину. У різних варіантах здійснення молекули нуклеїнової кислоти виділяють із В-клітин, експресуючих анти-І АС-3 антитіло, які виділені у тварини, імунізованої з використанням антигену ГАО-3 людини, або з імморталізованої клітини, отриманої з такої В-клітини. Способи виділення нуклеїнових кислот, що кодують антитіло, добре відомі в даній галузі мРНК можна виділяти і використовувати для одержання кКДНК для використання в полімеразній ланцюгової реакції (ПЛР) або клонуванні кДНК генів антитіла. У певних варіантах здійснення молекулу нуклеїнової кислоти за винаходом можна синтезувати, а не виділяти. 0148) У деяких варіантах здійснення молекула нуклеїнової кислоти за винаходом може містити нуклеотидну послідовність, що кодує домен МН анти-ІЇАС-3 антитіла або антиген- зв'язувальної частини за винаходом, з'єднаний зі збереженням рамки зчитування з нуклеотидною послідовністю, що кодує константну ділянку важкого ланцюга, з будь-якого джерела. Аналогічним чином, молекула нуклеїнової кислоти за винаходом може містити нуклеотидну послідовність, що кодує домен МІ. анти-І АС-3 антитіла або антиген-зв'язувальної частини за винаходом, з'єднану зі збереженням рамки зчитування з нуклеотидною послідовністю, що кодує константну ділянку легкого ланцюга, з будь-якого джерела.

І0149| У додатковому аспекті винаходу, молекули нуклеїнової кислоти, що кодують варіабельний домен важких (МН) і/або легких (МІ) ланцюгів, можна "перетворювати" у повнорозмірні гени антитіл. В одному з варіантів здійснення молекули нуклеїнової кислоти, що кодують домени УН або М/,, перетворюють у повнорозмірні гени антитіл за допомогою інсерції в експресуючий вектор, що вже кодує константну ділянку важкого ланцюга (СН) або константну ділянку легкого ланцюга (С!) відповідно так, що сегмент МН функціонально зв'язують із сегментом(ами) СН у векторі і/або сегмент МІ функціонально зв'язують із сегментом СІ. у векторі. В іншому варіанті здійснення молекули нуклеїнової кислоти, що кодують домени УН іабо МІ, перетворюють у повнорозмірні гени антитіл за допомогою зв'язування, наприклад,

Зо лігування, молекули нуклеїнової кислоти, що кодує домени МН і/або Мі, з молекулою нуклеїнової кислоти, що кодує ділянку СН і/або Сі, використовуючи стандартні прийоми молекулярної біології. Молекули нуклеїнової кислоти, що кодують повнорозмірні важкі і/або легкі ланцюги, потім можна експресувати у клітині, у яку їх ввели, і виділяти анти-! АС-3 антитіло.

І0150| Молекули нуклеїнової кислоти можна використовувати для рекомбінантної експресії великих кількостей анти-ЇАС-3 антитіл. Молекули нуклегтової кислоти також можна використовувати для одержання химерних антитіл, біспецифічних антитіл, одноланцюгових антитіл, імунсадгезинів, діатіл, мутантних антитіл і похідних антитіл, як розкрито в даному описі.

ІЇО151| В іншому варіанті здійснення молекулу нуклеїнової кислоти за винаходом використовують як зонд або ПЛР праймера для специфічної послідовності антитіла. Наприклад, нуклеїнову кислоту можна використовувати як зонд в діагностичних способах або як ПЛР праймера для ампліфікації ділянок ДНК, що можна використовувати, іпіег аа, для виділення додаткових молекул нуклеїнової кислоти, що кодують варіабельні домени анти-Ї АС-3 антитіл. У деяких варіантах здійснення молекули нуклеїнової кислоти являють собою олігонуклеотиди. У деяких варіантах здійснення олігонуклеотиди походять із високо варіабельних доменів важких і легких ланцюгів антитіла, що представляє інтерес. У деяких варіантах здійснення олігонуклеотиди кодують повністю або частково одну або декілька СОК анти-Ї АС-3 антитіл або їх антиген-зв'язувальних частин за винаходом, як розкрито в даному описі.

І0152| В іншому варіанті здійснення молекули нуклеїнової кислоти і вектори можна використовувати для одержання мутантних анти-І АС-3 антитіл. У варіабельні домени важких і/або легких ланцюгів антитіла можна вводити мутації, наприклад, щоб змінювати зв'язувальну властивість антитіла. Наприклад, мутацію можна створювати в одній або декількох з СОК для того, щоб збільшувати або зменшувати Ко анти-І АС-3 антитіла, збільшувати або зменшувати

Конг або змінювати специфічність зв'язування антитіла. В іншому варіанті здійснення одну або декілька мутацій створюють в амінокислотному залишку, який достеменно підлягає зміні в порівнянні із зародковою лінією в моноклональному антитілі за винаходом. Мутації можна створювати в СОМ або каркасній ділянці варіабельного домену або в константній ділянці. У переважному варіанті здійснення мутації виконують у варіабельному домені. У деяких варіантах здійснення одну або декілька мутацій виконують в амінокислотному залишку, який достеменно підлягає зміні в порівнянні із зародковою лінією в СОК або каркасній ділянці варіабельного домену антитіла або його антиген-зв'язувальної частини за винаходом. 0153) В іншому варіанті здійснення в каркасну ділянку(и) вводять мутацію для того, щоб одержувана каркасна ділянка(и) мала амінокислотну послідовність відповідного гена зародкової лінії. Мутацію можна створювати в каркасній ділянці або константній ділянці для збільшення часу напівжиття анти-Ї| АС-3 антитіла. Див., наприклад, публікацію РСТ УМО 00/09560. Мутацію в каркасній ділянці або константній ділянці також можна виконувати для того, щоб змінювати імуногенність антитіла і/або надавати ділянку для ковалентного або нековалентного зв'язування з іншою молекулою. Відповідно до винаходу одне антитіло може мати мутації в будь-який одній або декількох СОК або каркасних ділянках варіабельного домену, або в константній ділянці. 0154) У деяких варіантах здійснення анти-І АС-3 антитіла за винаходом або їх антиген- зв'язувальні частини експресують за допомогою вбудовування ДНК, що кодує часткові або повнорозмірні легкі і важкі ланцюги, отримані як описано вище, в експресуючі вектори так, що гени функціонально зв'язують із необхідними керуючими експресією послідовностями, такими як транскрипційні і трансляційні керуючі послідовності. Експресуючі вектори включають плазміди, ретровіруси, аденовіруси, аденоасоційовані віруси (ААМ), віруси рослин, такі як вірус мозаїки цвітної капусти, вірус тютюнової мозаїки, косміди, АС, епісоми, отримані з ЕВМ тощо. Кодуючу послідовність антитіла можна лігувати у вектор так, що транскрипційні і трансляційні керуючі послідовності у векторі виконують свою передбачувану функцію регуляції транскрипції та трансляції кодуючої послідовності антитіла. Експресуючий вектор і керуючі експресією послідовності можна вибирати так, щоб вони були сумісними з вибраною експресійною клітиною-хазяїном. Кодуючу послідовність легкого ланцюга антитіла і кодуючу послідовність важкого ланцюга антитіла можна вставляти в окремі вектори і можна функціонально зв'язувати з тими самими або різними керуючими експресією послідовностями (наприклад, промоторами).

В одному з варіантів здійснення обидві послідовності, що кодують, вставляють у той самий експресуючий вектор і можна функціонально зв'язувати з тими самими керуючими експресією послідовностями (наприклад, звичайний промотор), з окремими ідентичними керуючими експресією послідовностями (наприклад, промоторами) або з різними керуючими експресією послідовностями (наприклад, промоторами). Кодуючі послідовності антитіла можна вставляти в

Зо експресуючий вектор стандартними способами (наприклад, лігуванням комплементарних ділянок рестрикції на фрагменті гена антитіла і векторі або лігуванням тупих кінців, якщо ділянки рестрикції відсутні). 0155) Зручним вектором є той, який кодує функціонально повну послідовність СН або СІ. імуноглобуліну людини з придатними ділянками рестрикції, розробленими для того, щоб будь- яку послідовність МН або Мі. можна було легко вставляти і експресувати, як описано вище. Нес- і

ЇС-кодуючі гени в таких векторах можуть містити послідовності інтронів, які будуть вести до збільшеного загального виходу білків антитіл за допомогою стабілізації відповідної мРНК.

Послідовності інтронів фланкують за допомогою ділянок донорів сплайсингу і акцепторів сплайсингу, які визначають, де буде відбуватися сплайсинг РНК. Місце розташування послідовностей інтронів може перебувати у варіабельних або константних ділянках ланцюгів антитіл, або як у варіабельних, так і в константних ділянках, коли використовують декілька інтронів. Поліаденілювання і терминація транскрипції можуть відбуватися в нативних хромосомних ділянках нижче за напрямком зчитування від ділянок, що кодують.

Рекомбінантний експресуючий вектор також може кодувати сигнальний пептид, який полегшує секрецію ланцюга антитіла клітиною-хазяїном. Ген ланцюга антитіла можна клонувати у вектор так, що сигнальний пептид зв'язують зі збереженням рамки зчитування з амінокінцем ланцюга імуноглобуліну. Сигнальний пептид може являти собою сигнальний пептид імуноглобуліну або гетерологічний сигнальний пептид (тобто сигнальний пептид з неімуноглобулінового білка).

ІЇО156| На додаток до генів ланцюгів антитіл, рекомбінантні експресуючі вектори за винаходом можуть нести регуляторні послідовності, які управляють експресією генів ланцюгів антитіл у хазяїні. Фахівці в даній галузі візьмуть до уваги, що розробка експресуючого вектора, включаючи вибір регуляторних послідовностей, може залежати від таких факторів як вибір клітини-хазяїна, що підлягає трансформації, бажаний рівень експресії білка тощо. Переважні регуляторні послідовності для експресії в клітині-хазяїні ссавця включають вірусні елементи, які задають високі рівні експресії білка в клітинах ссавців, такі як промотори і/або енхансери, отримані з ретровірусних ІТК, цитомегаловірусу (СММУ) (такі як промотор/енхансер СММУ), вірусу мавп 40 (5М40) (такі як промотор/енхансер 5М40), аденовірусу (наприклад, головний пізній промотор аденовірусу (АамгР)), поліоми і сильні промотори ссавців, такі як нативні промотори імуноглобулінів і актину. Додатковий опис вірусних регуляторних елементів і їх послідовностей 60 див., наприклад, у патентах США 5168062, 4510245 і 4968615. Способи експресії антитіл у рослин, включаючи опис промоторів і векторів, а також трансформації рослин відомі в даній галузі. Див., наприклад, патент США 6517529. Способи експресії поліпептидів у бактеріальних клітинах або грибкових клітинах, наприклад, дріжджових клітинах, також добре відомі в даній галузі.

І0157| На додаток до генів ланцюгів антитіл і регуляторних послідовностей, рекомбінантні експресуючі вектори за винаходом можуть нести додаткові послідовності, такі як послідовності, які регулюють реплікацію вектора в клітинах-хазяїнах (наприклад, ділянки початку реплікації), і гени селективних маркерів. Ген селективного маркера полегшує відбір клітин-хазяїв, у які введений вектор (див., наприклад, патенти США 4399216, 4634665 і 5179017). Наприклад, зазвичай ген селективного маркера надає стійкість до лікарських засобів, таких як 0418, гігроміцин або метотрексат, клітині-хазяїнові у яку введений вектор. Наприклад, гени селективних маркерів включають ген дигідрофолатредуктази (ОНЕК) (для використання в апіт- клітинах-хазяїнах з відбором/ампліфікацією на метотрексаті), ген пео (для відбору на 5418) і ген глутаматсинтетази.

ІО158| Термін "керуюча експресією послідовність", як використовують у даному описі, позначає полінуклеотидні послідовності, які необхідні для того, щоб викликати експресію і процесінг послідовностей, що кодують, з якими їх лігують. Керуючі експресією послідовності включають придатні послідовності ініціації транскрипції, термінації, промоторні і енхансерні послідовності; ефективні сигнали процесінгу РНК, такі як сигнали сплайсингу і поліаденілювання; послідовності, які стабілізують цитоплазматичну мРНК; послідовності, які збільшують ефективність трансляції (тобто консенсусну послідовність Козак); послідовності, які збільшують стабільність білка; і, за бажанням, послідовності, які підсилюють секрецію білка.

Властивості таких керуючих послідовностей різняться залежно від організму-хазяїна; у прокаріотів такі керуючі послідовності в цілому включають промотор, ділянку зв'язування рибосоми і послідовність термінації транскрипції; в еукаріотів у цілому такі керуючі послідовності включають промотори і послідовність термінації транскрипції. Термін "керуючі послідовності" призначений включати, як мінімум, усі компоненти, присутність яких необхідна для експресії і процесінгу, і також може включати додаткові компоненти, присутність яких сприятлива, наприклад, лідерні послідовності і послідовності партнерів злиття.

Зо Клітини-хазяї і способи одержання антитіл і композицій антитіл

І0159| Додатковий аспект винаходу належить до способів одержання композицій антитіл і антитіл, і їх антиген-зв'язувальних частин за винаходом. Один з варіантів здійснення цього аспекту винаходу належить до способу одержання антитіла, як визначено в даному описі, який включає надання рекомбінантної клітини-хазяїна, здатної експресувати антитіло, культивування зазначеної клітини-хазяїна в умовах, що підходять для експресії антитіла, і виділення одержуваного антитіла. Антитіла, одержувані за допомогою такої експресії в таких рекомбінантних клітинах-хазяїнах, позначають у даному описі як "рекомбінантні антитіла".

Винахід також належить до клітин потомства таких клітин-хазяїв і антитіл, що продукуються ними.

ІЇО160| Термін "рекомбінантна клітина-хазяїн" (або просто "клітина-хазяїн"), як використовують у даному описі, позначає клітину, у яку введений рекомбінантний експресуючий вектор. Винахід належить до клітин-хазяїв, які можуть містити, наприклад, вектор відповідно до винаходу, описаний вище. Винахід також належить до клітин-хазяїв, які містять, наприклад, нуклеотидну послідовність, що кодує важкий ланцюг або його антиген-зв'язувальну частину, нуклеотидну послідовність, що кодує легкий ланцюг або його антиген-зв'язувальну частину, або обидва анти-І АС-3 антитіла, або його антиген-зв'язувальної частини за винаходом. Слід розуміти, що "рекомбінантна клітина-хазяїн" і "клітина-хазяїн" позначають не тільки конкретну розглянуту клітину, але також потомство такої клітини. Оскільки певні модифікації можуть відбуватися в наступних поколіннях через мутаційні або середовищних впливів, таке потомство фактично може не бути ідентичним батьківській клітині, але усе ще бути включеним в об'єм терміна "клітина-хазяїн" як використовують у даному описі.

І0161| Молекули нуклеїнової кислоти, що кодують анти-Ї АС-3 антитіла, і вектори, що містять ці молекули нуклеїнової кислоти, можна використовувати для трансфекції придатної клітини- хазяїна ссавця, рослини, бактерії або дріжджів. Трансформацію можна здійснювати будь-яким відомим способом введення полінуклеотидів у хазяїна. Способи введення гетерологічних полінуклеотидів у клітини ссавців добре відомі в даній галузі і включають опосередковану декстраном трансфекцію, преципітацію з фосфатом кальцію, опосередковану полібреном трансфекцію, злиття протопластів, електропорацію, інкапсулювання полінуклеотиду(ів) У ліпосоми і пряму мікроін'єкцію ДНК у ядра. Крім того, молекули нуклеїнової кислоти можна бо вводити в клітини ссавців за допомогою вірусних векторів. Способи трансформації клітин добре відомі в даній галузі. Див., наприклад, патенти США 4399216, 4912040, 4740461 і 4959455.

Способи трансформації клітин рослини добре відомі в даній галузі і включають, наприклад, опосередковану Адгобасіегішт трансформацію, біолістичну трансформацію, пряму ін'єкцію, електропорацію і вірусну трансформацію. Способи трансформації бактеріальних і дріжджових клітин також добре відомі в даній галузі. 0162) Клітинні лінії ссавців, доступні як хазяї для експресії, добре відомі в даній галузі і включають багато ліній імморталізованих клітин, доступні в Атегісап Туре Сийиге СоПесійоп (АТСС). Вони включають, іпіег аа, клітини яєчника китайського хом'яка (СНО), клітини М50О, клітини 5Р2, клітини НЕК-293Т, клітини 293 Егеезіуе (Іпмігодеп), клітини МІН-3Т3, клітини Нег/ а, клітини нирки новонародженого хом'яка (ВНК), клітини нирки африканської зеленої мавпи (СО5), клітини гепатоцелюлярної карциноми людей (наприклад, Нер 02), клітини А5Б49 і множину інших клітинних ліній. Клітинні лінії, яким віддають конкретну перевагу, вибирають за допомогою визначення того, які клітинні лінії мають високі рівні експресії. Інші клітинні лінії, які можна використовувати, являють собою лінії клітин комах, такі як клітини 519 або 5121. Коли рекомбінантні експресуючі вектори, що кодують гени антитіл, вводять у клітини-хазяї ссавців, антитіла одержують за допомогою культивування клітин-хазяїв протягом певного періоду часу, достатнього для того, щоб уможливити експресію антитіла в клітинах-хазяях або, більш переважно, секрецію антитіла в середовище для культивування, у якій ростять клітини-хазяї.

Антитіла можна вилучати із середовища для культивування з використанням стандартних способів очищення білка. Клітини-хазяї рослин включають, наприклад, Місойапа, Агарідорвів, ряску, кукурудзу, пшеницю, картоплю тощо. Бактеріальні клітини-хазяї включають Е. соїї і види зігеріотусев. Клітини-хазяї дріжджів включають 5спігозасспаготусе5 ротбе, Засспаготусев сегемізіає і Ріспіа разіогів.

ІО163| Крім того, експресію антитіл за винаходом або їх антиген-зв'язувальних частин продукуючими клітинними лініями можна підсилювати з використанням множини відомих прийомів. Наприклад, система експресії гена глутамінсинтетази (система 5) являє собою звичайний підхід для посилення експресії за певних умов. Система 5 розглянута в цілому або частково у зв'язку з патентами ЕР 0216846, 0256055, 0323997 і 0338841. 0164) Імовірно антитіла, що експресуються різними клітинними лініями або трансгенними тваринами, будуть мати патерни глікозилювання, відмінні друг від друга. Однак, усі антитіла, що кодуються молекулами нуклеїнової кислоти, передбаченими в даному описі, або що містять амінокислотні послідовності, передбачені в даному описі, являють собою частину даного винаходу, незалежно від стану глікозилювання антитіл і, у більш загальному сенсі, незалежно від присутності або відсутності посттрансляційної модифікації(й).

Фармацевтичні композиції

І0165| Інший аспект винаходу належить до фармацевтичної композиції, що містить як активний інгредієнт (або як єдиний активний інгредієнт) анти-І АС-3 антитіло або його антиген- зв'язувальну частину, біспецифічну зв'язувальну молекулу або композицію антитіл за винаходом. Фармацевтична композиція може містити будь-яке анти-І АС-3 антитіло або його антиген-зв'язувальну частину, біспецифічну зв'язувальну молекулу або композицію антитіл як розкрито в даному описі. У деяких варіантах здійснення фармацевтичні композиції призначені для поліпшення, запобігання і/або лікування пов'язаного з ГАС-3 порушення і/або злоякісної пухлини. Як використовують у даному описі, | АС-З3-зв'язане або -опосередковане порушення належить до порушення, захворювання або стану, який поліпшують або в якого сповільнюють прогресування за допомогою модуляції активності ГАС-3. У деяких варіантах здійснення композиції призначені для активації імунної системи. У певних варіантах здійснення композиції призначені для поліпшення, запобігання і/або лікування злоякісної пухлини, що походить з таких тканин, як шкіра, легеня, кишечник, ободова кишка, яєчник, головний мозок, передміхурова залоза, нирка, м'які тканини, гематопоетична система, голова і шия, печінка, сечовий міхур, молочна залоза, шлунок, матка і підшлункова залоза. У певних варіантах здійснення злоякісна пухлина являє собою фібросаркому, карциному легенів або меланому. У певних варіантах здійснення злоякісна пухлина являє собою гліобластому, гліосаркому або рак товстої кишки. У певних варіантах здійснення фармацевтичні композиції за винаходом призначені для лікування псоріазу. 0166) У цілому, антитіла, антиген-зв'язувальні частини і біспецифічні зв'язувальні молекули за винаходом підходять для введення у вигляді складу у зв'язку з одним або декількома фармацевтично прийнятними ексципієнтами, наприклад, як описано нижче.

І0167| Фармацевтичні композиції за винаходом повинні містити одне або декілька анти-Ї АС-

З антитіл, зв'язувальних частин або біспецифічних зв'язувальних молекул за винаходом, 60 наприклад, одне або два анти-ІЇ АС-3 антитіла, зв'язувальних частини або біспецифічних зв'язувальних молекули. В одному з варіантів здійснення композиція містить одне анти-І АСі-3 антитіло за винаходом або його зв'язувальну частину. (0168) В іншому варіанті здійснення фармацевтична композиція може містити щонайменше одне анти-І АС-3 антитіло або його антиген-зв'язувальну частину, наприклад, одне анти-І АС-3 антитіло або частину, і одне або декілька додаткових антитіл, які спрямовано на один або декілька релевантних рецепторів клітинної поверхні, наприклад, один або декілька релевантних рецепторів злоякісних пухлин.

І0169| Термін "ексципієнт" використовують у даному описі для того, щоб описувати будь- який інгредієнт, відмінний від сполук(и) за винаходом. Вибір ексципієнта(ів) у значному ступені залежить від таких факторів, як конкретний спосіб введення, ефект, надаваний ексципієнтом на розчинність і стабільність, і властивості дозованої форми. Як використовують у даному описі, "фармацевтично прийнятний ексципієнт" включає будь-які і усі розчинники, дисперсійні середовища, покриття, антибактеріальні і протигрибкові засоби, ізотонічні і затримуючі абсорбцію засоби та т. п., які фізіологічно сумісні. Деякі приклади фармацевтично прийнятних ексципієнтів являють собою воду, сольовий розчин, фосфатно-сольовий буфер, декстрозу, гліцерин, етанол і т. п., а також їх комбінації. У багатьох випадках у композицію переважно включати ізотонічні засоби, наприклад, цукри, багатоатомні спирти, такі як маніт, сорбіт або хлорид натрію. Додаткові приклади фармацевтично прийнятних речовин являють собою змочувальні засоби або незначні кількості допоміжних речовин, таких як змочувальні або емульгуючі засоби, консерванти або буфери, які збільшують строк зберігання або ефективність антитіла.

І0170| Фармацевтичні композиції за даним винаходом і способи їх одержання будуть без труда видні фахівцям у даній галузі. Такі композиції і способи їх одержання можна знайти, наприклад, в Кетіпдіоп'є Рнаптасешіса! бсіепсев, 19-е вид. (Маск Рибіїзпіпд Сотрапу, 1995).

Фармацевтичні композиції переважно виготовляють за умовами СМР (Соой Мапшиїасіигіпу

Ргасіісе).

ІО171| Фармацевтичну композицію за винаходом можна одержувати, упаковувати або продавати партіями, у вигляді одиничної стандартної дози або у вигляді множини одиничних стандартних доз. Як використовують у даному описі, "стандартна доза" являє собою дискретну

Зо кількість фармацевтичної композиції, що містить попередньо визначувану кількість активного інгредієнта. Кількість активного інгредієнта в цілому дорівнює дозі активного інгредієнта, яку слід вводити суб'єктові, або зручній частці від такої дози, наприклад, такій як половина або третина такої дози.

І0172| Будь-який спосіб введення пептидів, білків або антитіл, прийнятий у даній галузі, можна придатним чином використовувати для антитіл і антиген-зв'язувальних частин за винаходом.

І0173| Фармацевтичні композиції за винаходом зазвичай підходять для парентерального введення. Як використовують у даному описі, "парентеральне введення" фармацевтичної композиції включає будь-який шлях введення, що відрізняється фізичним порушенням цілісності тканини суб'єкта і введенням фармацевтичної композиції через пролом у тканині, що таким чином у цілому веде до безпосереднього введення в кровотік, у м'яз або у внутрішній орган.

Парентеральне введення, таким чином, включає, але не обмежуючись цим, введення фармацевтичної композиції за допомогою ін'єкції композиції, за допомогою внесення композиції через хірургічний розріз, за допомогою внесення композиції через проникаюче не хірургічне поранення тканини тощо. Зокрема, передбачено, що парентеральне введення включає, але не обмежуючись цим, підшкірну, внутрішньочеревинну, внутрішньом'язову, інтрастернальну, внутрішньовенну, внутрішньоартеріальну, інтратекальну, внутрішньошлуночкову, внутрішньоуретральну, внутрішньочерепну, внутрішньопухлинну і інтрасиновіальну ін'єкцію або інфузію; і прийоми інфузії при нирковому діалізі Також передбачені регіонарні перфузії.

Конкретні варіанти здійснення включають внутрішньовенні і підшкірні шляхи.

І0174| Склади фармацевтичної композиції, що підходять для парентерального введення, зазвичай містять активний інгредієнт у комбінації з фармацевтично прийнятним носієм, таким як стерильна вода або стерильний ізотонічний сольовий розчин. Такі склади можна одержувати, упаковувати або продавати у формі, що підходить для болюсного введення або для безперервного введення. Склади, що ін'єкуються, можна одержувати, упаковувати або продавати в стандартній дозованій формі, наприклад, в ампулах або в контейнерах декількох доз, що містять консервант. Склади для парентерального введення включають, але не обмежуючись цим, суспензії, розчини, емульсії в масляних або водних носіях, пасти тощо. Такі склади додатково можуть містити один або декілька додаткових інгредієнтів, включаючи як 60 необмежуючі приклади суспендуючий, стабілізуючий або диспергуючий засіб. В одному з варіантів здійснення складу для парентерального введення активний інгредієнт надають у сухій (тобто порошковій або гранульованій) формі для відновлення з використанням прийнятного носія (наприклад, стерильної апірогенної води) перед парентеральним введенням відновленої композиції. Парентеральні склади також включають водні розчини, які можуть містити ексципієнти, такі як солі, вуглеводи і буферні засоби (переважно при рН від З до 9), але для деяких застосувань їх можна більш придатним чином формулювати у вигляді стерильного неводного розчину або у вигляді висушеної форми, що підлягає використанню в комбінації з прийнятним носієм, таким як стерильна апірогенна вода. Зразкові форми для парентерального введення включають розчини або суспензії в стерильних водних розчинах, наприклад, водних розчинах пропіленгліколю або декстрози. При бажанні, такі дозовані форми можна придатним чином забуферити. Інші склади, що вводяться парентерально, які можна використовувати, включають ті, які містять активний інгредієнт у мікрокристалічній формі або в ліпосомному препараті. Склади для парентерального введення можна формулювати для негайного і/або модифікованого вивільнення. Склади з модифікованим вивільненням включають відстрочене, уповільнене, імпульсне, контрольоване, спрямоване і програмувальне вивільнення. 0175) Наприклад, в одному з аспектів стерильні розчини, що ін'єкуються, можна одержувати за допомогою вбудовування анти-ІЇАсС-3 антитіла, його антиген-зв'язувальної частини, біспецифічної зв'язувальної молекули або композиції антитіл у необхідній кількості в прийнятний розчинник з одним або комбінацією інгредієнтів, перерахованих вище, при необхідності, після чого випливає стерилізація фільтруванням. У цілому, дисперсії одержують за допомогою вбудовування активної сполуки в стерильний носій, який містить основне дисперсійне середовище і необхідні інші інгредієнти з тих, що перераховані вище. У випадку стерильних порошків для одержання стерильних розчинів, що ін'єкуються, переважні способи одержання являють собою вакуумне сушіння і ліофілізацію, яка дає порошок активного інгредієнта плюс будь-який додатковий бажаний інгредієнт із його розчину, попередньо стерилізованого фільтруванням. Належну текучість розчину можна підтримувати, наприклад, за допомогою покриття, такого як лецитин, за допомогою підтримки необхідного розміру частинок у випадку дисперсії, і за допомогою поверхнево-активних засобів. Пролонговану абсорбцію композицій, що ін'єкуються, можна забезпечувати за допомогою включення в композицію засобу, який

Зо затримує абсорбцію, наприклад, солей моностеаратів і желатину, ійабо за допомогою використання покриттів з модифікованим вивільненням (наприклад, покриттів з повільним вивільненням).

ІО176| Антитіла за винаходом також можна вводити інтраназально або за допомогою інгаляції, зазвичай у формі сухого порошку (окремо, у вигляді суміші або у вигляді змішаних частинок компонентів, наприклад, змішаних з придатним фармацевтично прийнятним ексципієнтом) з інгалятора сухого порошку, у вигляді аерозольного спрея з контейнера під тиском, насоса, спрея, атомізатора (переважно атомізатора, що використовує електрогідродинаміку для одержання дрібнодисперсного туману) або небулайзера, з використанням або без використання придатного пропеленту, або у вигляді назальних крапель.

І0177| Контейнер під тиском, насос, спрей, атомізатор або небулайзер у цілому містить розчин або суспензію антитіла за винаходом, які містять, наприклад, придатний засіб для диспергування, солюбілізації або продовження вивільнення активного засобу, пропелент(и) як розчинник.

І0178| Перед використанням у сухому порошковому або суспензійному складі, лікарський продукт у цілому мікронізують до розміру, що підходить для доставки за допомогою інгаляції (зазвичай менше 5 мкм). Цього можна досягати будь-яким придатним способом здрібнювання, таким як розмел на спіральному струминному млині, розмел на струминному млині з киплячим шаром, обробка надкритичної текучої речовини для формування наночастинок, гомогенізація високого тиску або розпилювальне сушіння.

ІЇ0179| Для використання в інгаляторі або інсуфляторі можна формулювати капсули, блістери і картриджі, що містять порошкову суміш сполуки за винаходом, придатної порошкової основи і модифікатора експлуатаційних характеристик.

ІО180| Придатний склад розчину для використання в атомізаторі з використанням електрогідродинаміки для одержання дрібнодисперсного туману може містити придатну дозу антитіла за винаходом на приведення в дію і об'єм приведення в дію, наприклад, може варіювати від 1 мкл до 100 мкл.

І0181| Можна формулювати склади для інгаляційного/інтраназального введення з негайним іМабо модифікованим вивільненням. Склади з модифікованим вивільненням включають відстрочене, уповільнене, імпульсне, контрольоване, спрямоване і програмувальне бо вивільнення.

0182) У випадку інгаляторів сухого порошку і аерозолів, одиницю дозування визначають за допомогою клапана, який доставляє відміряну кількість. Одиниці відповідно до винаходу зазвичай влаштовують так, щоб вводити відміряну дозу або "пшик" антитіла за винаходом.

Загальну добову дозу звичайно вводять в однократній дозі або, більш звичайно, у вигляді розділених доз на всьому протязі доби. (0183) Антитіла і частини антитіл за винаходом також можна формулювати для введення через оральний шлях. Оральне введення може включати проковтування для того, щоб сполука попадала в шлунково-кишковий тракт, і/або букальне, лінгвальне або сублінгвальне введення, за допомогою якого сполука попадає в кровотік безпосередньо з рота. (0184) Склади, що підходять для орального введення, включають тверді, напівтверді і рідкі системи, такі як таблетки; м'які або тверді капсули, що містять мульти- або наночастинки, рідини або порошки; пастилки (у тому числі заповнені рідиною); жуйки; гелі; дозовані форми, що швидко диспергуються; плівки; супозиторії; спреї; і букальні/мукоадгезивні пластири. 0185) Рідкі склади включають суспензії, розчини, сиропи і міцні настої. Такі склади можна використовувати як наповнювачі у м'яких або твердих капсулах (виконаних, наприклад, з желатину або гідроксипропілметилцелюлози), і зазвичай вони містять носій, наприклад, воду, етанол, полієтиленгліколь, пропіленгліколь, метилцелюлозу або придатну олію, і один або декілька емульгуючих засобів і/або суспендуючих засобів. Рідкі склади також можна одержувати за допомогою відновлення твердої речовини, наприклад, із саше.

Терапевтичне застосування антитіл і композицій за винаходом 0186) В одному з аспектів, анти-І АС-3 антитіла і їх антиген-зв'язувальні частини, композиції проти ГАС-3 і біспецифічні зв'язувальні молекули за винаходом використовують для посилення або активації імунної системи в людини, що потребує цього. У деяких варіантах здійснення пацієнт має імунну супресію. Наприклад, лікар може підвищувати активність власної імунної системи пацієнта проти злоякісної пухлини за допомогою введення анти-ІАс(-3 антитіла за даним винаходом, окремо або в комбінації з іншими терапевтичними засобами (послідовно або паралельно). Антитіло до ГАС-3 модулює активність ГАс-3 у клітинах імунної системи, що веде до посилення імунітету проти злоякісної пухлини.

ІО187| У певних варіантах здійснення антитіло або його антиген-зв'язувальна частина,

Зо композиція або біспецифічна зв'язувальна молекула призначені для використання в лікуванні злоякісної пухлини, наприклад, злоякісних пухлин, які походять із тканин, таких як шкіра, легеня, кишечник, ободова кишка, яєчник, головний мозок, передміхурова залоза, нирка, м'які тканини, гематопоетична система, голова і шия, печінка, сечовий міхур, молочна залоза, шлунок, матка і підшлункова заліза і будь-які злоякісні пухлини або інші стани, які залежать від активності І АОс-3 і/або при яких пацієнт експресує або надекспресує ліганд ГАС-3 (наприклад, МНЄСЇІЇ, І ЗЕСТіп або обидва).

ІО188) У деяких варіантах здійснення злоякісні пухлини, які лікують антитілами проти ІГ Ао-3, антиген-зв'язувальними частинами, біспецифічними зв'язувальними молекулами і/або композиціями антитіл за винаходом, можуть включати, наприклад, меланому (наприклад, поширену або »метастатичну меланому), недрібноклітинний рак легенів, плоскоклітинну злоякісну пухлину голови і шиї, нирковоклітинну карциному, лімфому Ходжкіна, неходжкінську лімфому, гліобластому, гліому, плоскоклітинну злоякісну пухлину легенів, дрібноклітинну злоякісну пухлину легенів, гепатоцелюлярну карциному, злоякісну пухлину сечового міхура, злоякісну пухлину верхніх сечових шляхів, злоякісну пухлину стравоходу, злоякісну пухлину гастроезофагеального переходу, злоякісну пухлину шлунка, злоякісну пухлину печінки, рак товстої кишки, карциному товстої кишки, множинну мієлому, саркоми, гострий мієлолейкоз, хронічний мієлолейкоз, мієлодиспластичний синдром, назофарингеальну злоякісну пухлину, хронічний лімфоцитарний лейкоз, гострий лімфобластний лейкоз, дрібноклітинну лімфоцитарну лімфому, злоякісну пухлину яєчників, злоякісну пухлину шлунково-кишкового тракту, первинну перитонеальну злоякісну пухлину, злоякісну пухлину фаллопієвої труби, уротеліальну злоякісну пухлину, НТІМ-асоційований Т-клітинний лейкоз/лімфому, злоякісну пухлину передміхурової залози, урогенітальну злоякісну пухлину, менінгіому, адренокортикальну злоякісну пухлину, гліосаркому, фібросаркому, злоякісну пухлину нирки, злоякісну пухлину молочної залози, злоякісну пухлину підшлункової залози, злоякісну пухлину ендометрія, базальноклітинну злоякісну пухлину шкіри, злоякісну пухлину апендикса, злоякісну пухлину жовчних шляхів, злоякісну пухлину слинних залоз, поширену злоякісну пухлину із клітин Меркеля, дифузійну крупноклітинну В-клітинну лімфому, фолікулярну лімфому, мезотеліому або солідні пухлини.

Злоякісна пухлина може бути, наприклад, на ранній, проміжній, пізній або метастатичній стадії.

ІО189)| У деяких варіантах здійснення злоякісні пухлини, які лікують антитілами проти ГАО-3, бо антиген-зв'язувальними частинами, композиціями і/або біспецифічними зв'язувальними молекулами за винаходом, можуть включати, наприклад, гематологічні злоякісні новоутворення, гліобластому (наприклад, гліобластому, що рецидивує), гліосаркому, недрібноклітинний рак легенів (наприклад, поширений недрібноклітинний рак легенів), рак товстої кишки і солідні пухлини. 0190) В одному з аспектів анти-І| АС-3 антитіла і їх антиген-зв'язувальні частини, композиції антитіл або біспецифічні зв'язувальні молекули за винаходом можна використовувати для лікування імунно-опосередкованого порушення, такого як псоріаз, системний червоний вовчак,

МІ 5 (склероз), хвороба Крона, цукровий діабет і/або виразковий коліт. 0191) У деяких варіантах здійснення анти-Ї АС-3 антитіла і їх антиген-зв'язувальні частини, композиції антитіл або біспецифічні зв'язувальні молекули за винаходом можна використовувати для лікування вірусних і/або паразитарних інфекцій, наприклад, при яких патогени пригнічують імунну відповідь хазяїна. Наприклад, патогеном може бути НІМ, гепатит (А, В або С), вірус папіломи людини (НРМ), вірус лімфоцитарного хоріоменінгіту (СММ), аденовірус, флавівірус, еховірус, риновірус, вірус Коксакі, коронавірус, респіраторний синцитіальний вірус, вірус паротиту, ротавірус, вірус кору, вірус краснухи, парвовірус, вірус вісповакцини, людина Т-лімфотропний вірус людини (НТІМ), вірус денге, вірус молюска, поліовірус, вірус сказу, вірус Джона Каннінгема (С), вірус арбовірусного енцефаліту, вірус імунодефіциту мавп (5ІМ), грип, герпес, лямблія, малярія, лейшманія, Харпуіососси5 айгеци5 або

Рзейдотопаз аегидіпоза. 01921 У деяких варіантах здійснення анти-Ї АС-3 антитіла і їх антиген-зв'язувальні частини, композиції антитіл або біспецифічні зв'язувальні молекули за винаходом можна використовувати для лікування пацієнта з ослабленим імунітетом або в якого є ризик ослабленого імунітету (наприклад, через хіміотерапію або променеву терапію). 0193) У деяких варіантах здійснення анти-Ї АС-3 антитіла і їх антиген-зв'язувальні частини, композиції антитіл або біспецифічні зв'язувальні молекули за винаходом можна використовувати для активації і розподілу антиген-специфічних Т-клітин ех мімо. (0194) "Лікувати", "лікуючий" і "лікування" належать до способу полегшення або усунення біологічного порушення і/або щонайменше одного із супутніх йому симптомів. Як використовують у даному описі, "полегшувати" захворювання, порушення або стан позначає

Зо знижувати тяжкість і/або частоту виникнення симптомів захворювання, порушення або стану.

Крім того, у даному описі відсилання до "лікування" включають відсилання до такого, що виліковує, паліативного і профілактичного лікування. (0195) "Терапевтично ефективна кількість" належить до кількості терапевтичного засобу, що вводиться, який буде полегшувати деякою мірою один або декілька симптомів порушення, що підлягає лікуванню. Терапевтично ефективна кількість терапевтичного засобу проти злоякісної пухлини, наприклад, веде до зменшення розмірів пухлини, збільшеної виживаності, елімінації клітин злоякісної пухлини, зниженого прогресування захворювання, зворотності метастазів або інших клінічних кінцевих точок, які бажані для працівників охорони здоров'я.

І0196| Анти-І АС-3 антитіла або їх антиген-зв'язувальні частини, композиції антитіл або біспецифічні зв'язувальні молекули за винаходом можна вводити окремо або в комбінації з одним або декількома іншими лікарськими засобами або антитілами (або у вигляді будь-якої їх комбінації). Фармацевтичні композиції, способи і використання за винаходом, таким чином, також охоплюють варіанти здійснення комбінацій (спільне введення) з іншими активними засобами, як докладно викладено далі.

ІЇО197| Як використовують у даному описі, терміни "спільне введення", "що спільно вводиться" і "у комбінації 3", щодо анти-ІЇАС-3 антитіл і їх антиген-зв'язувальних частин, композицій антитіл і біспецифічних зв'язувальних молекул за винаходом з одним або декількома іншими терапевтичними засобами, призначений для того, щоб позначати і посилатися на і включати наступне: а) одночасне введення такої комбінації антитіла/антиген-зв'язувальної частини/композиції антитіл/біспецифічної зв'язувальної молекули за винаходом і терапевтичного засобу(ів) хворому, коли такі компоненти формулюють разом в одній дозованій формі, яка вивільняє зазначені компоненти зазначеному пацієнтові по суті одночасно,

Б) по суті одночасне введення такої комбінації антитіла/антиген-зв'язувальної частини/композиції антитіл/біспецифічної зв'язувальної молекули за винаходом («і терапевтичного засобу(ів) хворому, коли такі компоненти формулюють окремо друг від друга в окремих дозованих формах, які зазначений пацієнт приймає по суті одночасно, після чого відбувається по суті одночасне вивільнення зазначених компонентів зазначеному пацієнтові, с) послідовне введення такої комбінації антитіла/антиген-зв'язувальної частини/композиції бо антитіл/біспецифічної зв'язувальної молекули за винаходом і терапевтичного засобу(ів)

хворому, коли такі компоненти вводять до складу окремо друг від друга в дозовані лікарські форми, які зазначений пацієнт приймає послідовно в часі зі значним часовим інтервалом між кожним введенням, у зв'язку із чим відбувається надходження зазначених компонентів зазначеному пацієнтові по суті в різні моменти часу; і а) послідовне введення такої комбінації антитіла/антиген-зв'язувальної частини/композиції антитіл/біспецифічної зв'язувальної молекули за винаходом і терапевтичного засобу(ів) хворому, коли такі компоненти вводять разом до складу загальної дозованої лікарської форми, яка вивільняє зазначені компоненти контрольованим чином, після чого відбувається їх паралельне, послідовне і/або що перекривається надходження зазначеному пацієнтові в один і той ж і/або різні моменти часу, де кожну частину можна вводити одним і тим же або відмінним шляхом.

І0198| Анти-ІАС-3 антитіла і їх антиген-зв'язувальні частини, композиції антитіл або біспецифічні зв'язувальні молекули за винаходом можна вводити без додаткового терапевтичного лікування, тобто, у вигляді самостійно застосовуваної терапії (монотерапії).

Альтернативно, лікування антитілами проти ГАС-3 і їх антиген-зв'язувальними частинами, композиціями антитіл або біспецифічними зв'язувальними молекулами за винаходом може включати щонайменше одне додаткове терапевтичне лікування (комбінована терапія), наприклад, інший імуностимулювальний засіб, засіб проти злоякісної пухлини, противірусний засіб або вакцину (наприклад, протипухлинну вакцину).

І0199| У деяких варіантах здійснення антитіло або його антиген-зв'язувальну частину, композицію антитіл або біспецифічну зв'язувальну молекулу можна спільно вводити або формулювати з іншими ліками/лікарським засобом для лікування злоякісної пухлини. Додаткове терапевтичне лікування може включати, наприклад, хіміотерапевтичний, антинеопластичний або антиангіогенний засіб, інше антитіло проти злоякісної пухлини і/або променеву терапію.

І0200| За допомогою об'єднання антитіл або їх антиген-зв'язувальних частин, композицій антитіл або біспецифічних зв'язувальних молекул за винаходом із засобами, які достеменно індукують термінальне диференціювання клітин злоякісної пухлини, ефект можна вдосконалити додатково. Такі сполуки, наприклад, можна вибирати із групи, що складається з ретиноєвої кислоти, транс-ретиноєвих кислот, цис-ретиноєвих кислот, фенілбутирату, фактора росту

Зо нервів, диметилсульфоксиду, активної форми вітаміну Оз, активованого проліфератором пероксисом рецептора у, 12-О-тетрадеканоїлфорбол-13-ацетату, гексаметилен-біс-ацетамід, трансформувального фактора росту В, масляної кислоти, циклічного АМР і веснарінону. У деяких варіантах здійснення сполуку вибирають із групи, що складається з ретиноєвої кислоти, фенілбутирату, повністю транс-ретиноєвої кислоти і активної форми вітаміну 0.

І0201| Фармацевтичні вироби, що містять анти-ЇАС-3 антитіло або його антиген- зв'язувальну частину, композицію антитіл або біспецифічну зв'язувальну молекулу за винаходом і щонайменше один інший засіб (наприклад, хіміотерапевтичний, антинеопластичний або антиангіогенний засіб) можна використовувати як комбіноване лікування для одночасного, роздільного або послідовного введення при терапії злоякісної пухлини. Інший засіб може являти собою будь-який засіб, що підходить для лікування конкретної розглянутої злоякісної пухлини, наприклад, засіб, вибраний із групи, що складається з алкілувальних засобів, наприклад, похідних платини, таких як цисплатин, карбоплатин і/або оксаліплатин; рослинних алкалоїдів, наприклад, паклітакселу, доцетакселу і/або іринотекану; протипухлинних антибіотиків, наприклад, доксорубіцину (адріаміцину), даунорубіцину, епірубіцину, ідарубіцину, мітоксантрону, дактиноміцину, блеоміцину, актиноміцину, лутеоміцину і/або мітоміцину; інгібіторів топоізомерази, таких як топотекан; і/або антиметаболітів, наприклад, фторурацилу іабо інших фторпіримідинів. У деяких варіантах здійснення іншим засобом є дакарбазин або гемцитабін. (02021 Анти-І АС-3 антитіло або його антиген-зв'язувальну частину, композицію антитіл або біспецифічну зв'язувальну молекулу за винаходом також можна використовувати в комбінації з іншою терапією проти злоякісної пухлини, такою як вакцини, цитокіни, інгібітори ферментів, імуностимулювальні сполуки і Т-клітинна терапія. У випадку вакцини, наприклад, вона може являти собою білкову, пептидну або ДНК вакцину, що містить один або декілька антигенів, які релевантні для злоякісної пухлини, що підлягає лікуванню, або вакцину, що містить дендритні клітини поряд з антигеном. Придатні цитокіни включають, наприклад, 1-2, ІЕМ-у ії ЗМ-С5БЕ.

Прикладом типу інгібітора ферменту, який має активність проти злоякісної пухлини, є інгібітор індоламін-2,3-діоксигенази (БО), наприклад, 1-метил-О-триптофан (1-0-МТ). Адоптивна Т- клітинна терапія належить до різних імунотерапевтичних прийомів, які включають розмноження або зміну власних Т-клітин пацієнтів для того, щоб вони розпізнавали і атакували свої пухлини.

І0203| Також передбачено, що анти-| АС-3 антитіло або його антиген-зв'язувальну частину, композицію антитіл або біспецифічну зв'язувальну молекулу за винаходом можна використовувати в суміжній терапії у зв'язку з інгібіторами тирозинкінази. Вони являють собою синтетичні молекули низької молекулярної маси, переважно похідні хіназоліну, які взаємодіють із внутрішньоклітинним доменом тирозинкінази рецепторів і інгібують індуковане лігандом фосфорилювання рецептора за допомогою конкуренції за внутрішньоклітинний сайт зв'язування

Ма-АТР.

І0204| У деяких варіантах здійснення антитіло або його антиген-зв'язувальну частину, композицію антитіл або біспецифічну зв'язувальну молекулу можна використовувати в комбінації з іншими ліками/лікарським засобом, який опосередковує активацію імунної системи, включаючи як необмежуючі приклади, засіб, який модулює експресію або активність А2АК,

ВТІА, В7-НЗ, В7-Н4, СТІ А-4, 6027, бргв, 0040, 0р47, 6055, 0073, 00122, 00137, С0160,

СаєМ-15049, СНКІ, СНК2, СТІ А-3, СЕАСАМ (наприклад, СЕАСАМ-1 і/або СЕАСАМ-5), САГ 9,

СІТА, НМЕМ, ІМ108, ГАІВІ, ІСОБ5, ІрО, КІВ, ГАІВІ, РО-1/РО-І1/РО-12, ОХ40, ТІСІТ, ТІМ-3,

ТОаЕВ-В, МІБТА, ГІ/'ЕВ2, СМТМ6 і/або 284. У певних варіантах здійснення засобом є антитіло або його антиген-зв'язувальний фрагмент, який зв'язується з однією з вищевказаних молекул.

Також передбачено, що анти-ЇАС-З3 антитіло або його антиген-зв'язувальну частину, композицію антитіл або біспецифічну зв'язувальну молекулу за винаходом можна використовувати в комбінації із цитокіном (наприклад, 1-1, 1-2, 1-12, 1/-15 або ІІ-21), інгібітором ЕСЕРБЕ, інгібітором МЕСЕ тощо. 0205) У певних аспектах антитіла і антиген-зв'язувальні частини, композиції антитіл або біспецифічні зв'язувальні молекули за винаходом можна вводити в комбінації з іншим інгібітором шляху ГАС-3, який може бути спрямовано на ГАС-3 або один або декілька його лігандів. Приклади таких інгібіторів включають інші анти-І АС-3 антитіла, антитіла проти МНС, антитіла проти галектину-3 і антитіла проти І ЗЕСІіп. У деяких варіантах здійснення анти-І АС-3 антитіло або його антиген-зв'язувальну частину, біспецифічне антитіло або композицію антитіл за винаходом можна вводити в комбінації з ВМ5-986016, 55К2831781, КЕОМ3767, ВАРОБО або

ВАРОБО-сПі, або І Ас525.

І0206| Зрозуміло, що антитіла і їх антиген-зв'язувальні частини, композиції антитіл і

Зо біспецифічні зв'язувальні молекули за винаходом можна використовувати в способі лікування, як розкрито в даному описі, можуть бути для використання в лікуванні, як розкрито в даному описі, і/або можуть бути для використання у виготовленні лікарського засобу для лікування, як розкрито в даному описі. Винахід також належить до наборів і промислових виробів, що містять антитіла і їх антиген-зв'язувальні частини, композиції антитіл і біспецифічні зв'язувальні молекули, описані в даному описі.

Доза і шлях введення

І0207| Антитіла або їх антиген-зв'язувальні частини, композиції антитіл або біспецифічні зв'язувальні молекули за винаходом слід вводити в ефективній кількості для лікування розглянутого стану, тобто в дозах і протягом періодів часу, які необхідні для досягнення бажаного результату. Терапевтично ефективна кількість може варіювати відповідно до таких факторів, як конкретний стан, що підлягає лікуванню, вік, стать і маса пацієнта, і чи вводять антитіла як відособлене лікування або в комбінації з одним або декількома додатковими лікуваннями проти злоякісних пухлин.

І0208| Схеми дозування можна коректувати для того, щоб забезпечувати оптимальну бажану відповідь. Наприклад, можна вводити один болюс, можна вводити декілька розділених доз із часом або дозу можна пропорційно зменшувати або збільшувати, як то вказують потреби терапевтичної ситуації. Зокрема, сприятливо формулювати парентеральні композиції у формі одиниці дозування для полегшення введення і однорідності дози. Форма одиниці дозування, як використовують у даному описі, належить до фізично дискретних одиниць, що підходять як одинарних доз для пацієнтів/суб'єктів, що підлягають лікуванню; кожна одиниця містить попередньо обумовлену кількість активної сполуки, яку обчислюють для одержання бажаного терапевтичного ефекту, у комбінації з необхідним фармацевтичним носієм. Опис для форм одиниць дозування за винаходом в цілому продиктований і безпосередньо залежить від (а) унікальних характеристик хіміотерапевтичного засобу і конкретного терапевтичного або профілактичного ефекту, якого потрібно досягти, і (Б) обмежень, властивих ділянці компаундування такої активної сполуки для лікування чутливості в індивідуумів.

І0209| Таким чином, фахівець у даній галузі візьме до уваги, на основі розкриття, наданого в даному описі, що дозу і схему дозування коректують відповідно до способів, загальновідомих галузі терапії. Тобто, можна легко встановлювати максимальну дозу, що переноситься, а також бо можна визначати ефективну кількість, що забезпечує терапевтичний ефект, який піддається виявленню у пацієнта, як дозволяють часові вимоги для введення кожного засобу, щоб забезпечувати терапевтичний ефект, що піддається виявленню у пацієнта. Відповідно, хоча певна доза і схеми введення наведені як приклад у даному описі, ці приклади ні яким чином не обмежують дозу і схему введення, які можна надавати пацієнтові при практичному здійсненні даного винаходу.

І0210| Слід зазначити, що значення доз можуть варіювати разом з типом і тяжкістю стану, що підлягає полегшенню, і можуть включати однократні і багаторазові дози. Крім того, слід розуміти, що в будь-якого конкретного суб'єкта конкретні схеми дозування слід коректувати із часом відповідно до індивідуальних потреб і професійних суджень людини, що здійснює введення або спостереження за введенням композицій, і що діапазони доз, наведені в даному описі, є лише зразковими і не призначені для того, щоб обмежувати об'єм або практику здійсненої композиції. Крім того, схема дозування композицій за даним винаходом може бути заснована на різних факторах, включаючи тип захворювання, вік, масу, стать, медичний стан пацієнта, тяжкість стану, шлях введення і конкретне використовуване антитіло. Таким чином, схема дозування може варіювати широко, але її можна визначати звичайним чином, використовуючи стандартні способи. Наприклад, дози можна коректувати на основі фармакокінетичних або фармакодинамічних параметрів, які можуть включати клінічні ефекти, такі як токсичні ефекти, і/або лабораторні значення. Таким чином, даний винахід належить до індивідуального збільшення дози, як визначає фахівець у даній галузі. Визначення придатних доз і схем загальновідомо в релевантній галузі і фахівцеві в даній галузі буде зрозуміло, що воно включене в надані положення, розкриті в даному описі. (02111) Передбачено, що придатна доза антитіла, антиген-зв'язувальної частини, композиції антитіл або біспецифічної зв'язувальної молекули за винаходом перебуває в діапазоні 0,1-100 мг/кг, такому як приблизно 0,5-50 мг/кг, наприклад, приблизно 1-20 мг/кг. Антитіло, антиген- зв'язувальну частину, композицію антитіл або біспецифічну зв'язувальну молекулу, наприклад, можна вводити в дозі щонайменше 0,25 мг/кг, наприклад, щонайменше 0,5 мг/кг, наприклад, щонайменше 1 мг/кг, наприклад, щонайменше 1,5 мг/кг, наприклад, щонайменше 2 мг/кг, наприклад, щонайменше З мг/кг, наприклад, щонайменше 4 мг/кг, наприклад, щонайменше 5 мг/кг; і, наприклад, аж до якнайбільше 50 мг/кг, наприклад, аж до якнайбільше 30 мг/кг, наприклад, аж до якнайбільше 20 мг/кг, наприклад, аж до якнайбільше 15 мг/кг. Введення зазвичай повторюють із придатними інтервалами, наприклад, один раз на тиждень, один раз на два тижні, один раз на три тижні або один раз на чотири тижні і доти, поки це вважатиме придатним відповідальний лікар, який може необов'язково збільшувати або зменшувати дозу в міру необхідності. (02121) Ефективну кількість терапії пухлини можна вимірювати за її здатністю стабілізувати прогресування захворювання і/або поліпшувати симптоми в пацієнта і переважно обертати прогресування захворювання, наприклад, за допомогою зменшення розміру пухлини. Здатність антитіла, антиген-зв'язувальної частини, композиції антитіл або біспецифічної зв'язувальної молекули за винаходом інгібувати злоякісну пухлину можна оцінювати за допомогою аналізів іп міго, наприклад, як описано в прикладах, а також у придатних моделях на тваринах, які дозволяють передбачити ефект, надаваний на пухлини людини. Придатні схеми дозування слід вибирати для того, щоб забезпечувати оптимальну терапевтична відповідь у кожній конкретній ситуації, наприклад, введення у вигляді одного болюса або у вигляді безперервної інфузії і з можливим коректуванням дози, як то вказують потреби кожного випадку.

Діагностичне застосування і композиції

І0213| Антитіла за даним винаходом також можна використовувати в діагностичних процесах (наприклад, іп міо, ех мімо). Наприклад, антитіла можна використовувати для того, щоб виявляти і/або вимірювати рівень ГАс-3 у зразку від пацієнта (наприклад, зразку тканини або зразку текучої речовини організму, такого як запальний ексудат, кров, сироватка, текуча речовина кишечнику, слина або сеча). Придатні способи виявлення і виміру включають такі імунологічні способи, як проточна цитометрія, твердофазний імуносорбентний аналіз (ЕГІЗА), хемілюмінесцентний аналіз, радіоїмунологічний аналіз і імуногістологія. Винахід додатково включає набори (наприклад, діагностичні набори), що містять антитіла, описані в даному описі. (0214) Якщо не визначене інше в даному описі, наукові і технічні терміни, використовувані у зв'язку зі даним винаходом, повинні мати значення, у яких їх зазвичай розуміють середні фахівці в даній галузі. Зразкові способи і матеріали описані далі, хоча способи і матеріали, подібні або еквівалентні тим, що описані в даному описі, також можна використовувати при практичній реалізації або тестуванні даного винаходу. У випадку протиріччя, даний опис, включаючи визначення, має вирішальне значення.

І0215| У цілому, використовувана номенклатура і прийоми з культур клітин і тканин, молекулярної біології, імунології, мікробіології, генетики, аналітичної хімії, синтетичної органічної хімії, медичної і фармацевтичної хімії, а також хімії білків і нуклеїнових кислот і гібридизації, які описані в даному описі, є загальновідомими і широко використовуваними в даній галузі. Ферментативні реакції і прийоми очищення здійснюють відповідно до описів виробників, як зазвичай виконують у даній ділянці або як розкрито в даному описі. (0216) Крім того, поки іншого не вимагає контекст, форми однини включають множину і форми множини включають однину. На всьому протязі цього опису і варіантів здійснення, слова "мати" і "містити" або варіації, такі як "має", "що має", "містить" або "що містить", слід розуміти як такі, що мають на увазі включення зазначеного цілого або групи цілих, але не виключення будь- якого іншого цілого або групи цілих. 02171) Усі публікації та інші джерела, згадані в даному описі, включені в даний опис за допомогою посилання в повному об'ємі. Незважаючи на те, що в даному описі процитована множина документів, це цитування не становить допущення того, що будь-який із цих документів утворює частину загальних звичайних пізнань у даній галузі.

І0218| Для кращого розуміння цього винаходу наведені наступні приклади. Ці приклади служать лише ілюстративній меті і їх не слід тлумачити як обмеження об'єму винаходу яким- небудь чином.

ПРИКЛАДИ

Приклад 1: створення і скринінг репертуарів анти-І АС-3 антитіл

І0219| Два репертуари анти-ЇАС-3 антитіл створювали за допомогою імунізації позаклітинним доменом І Аа-3 (ЕСО) або злитим білком ГАС-3 ЕСО Ес. Одну бібліотеку антитіл одержували з одноклітинних сортованих В-клітин від імунізованих щурів ОтпікКа з використанням технології виявлення антитіл Зутріехтм (Оврот еї аї!., / Іттипої!. 190(4): 1481-90 (2013); Меїег еї а!., У Мої Віої. 358(3): 764-72 (2006)). Експресійні конструкції із цього репертуару антитіл кодували повністю імуноглобуліни людини у форматі Ідс1, що несуть дві мутації (Г234А/ 235А), які свідомо знижують ефекторну функцію Ес-ділянка антитіл Їдо1 (Негаген еї аї.,

У Мігої. 75(24):12161-8 (2001)). Другий репертуар антитіл конструювали з використанням одноклітинних сортованих В-клітин, що походять з лімфоїдних органів імунізованих курей дикого

Зо типу (Саїїиз дав). (0220) Клоновані антитіла з обох репертуарів проти ГАС-3 індивідуально трансфікували і експресували в клітинах НЕК293 з використанням трансфекційного реактиву 293Гесііп'тм (Іпмійгодеп, Мо за каталогом 12347-019) в 384-лунковому форматі і збирали антитіловмісні супернатанти в добу 6 після трансфекції.

І0221| Для клітинного скринінгу антитіл клітини СНО-5 трансфікували в 384-лунковому форматі для того, щоб експресувати СРІ-заякорений ГАС-3 людини з використанням реактиву

Егеебіуієїм МАХ (Іпмйгодеп, Мо за каталогом 16447-100), а клітини, трансфіковані нерелевантним ОСРІ-заякореним контрольним білком, використовували як негативний контроль.

Для того, щоб уможливлювати проведення мультиплексного скринінгу, контрольні клітини мітили з використанням складного ефіру карбоксифлуоресцеїнсукцинімідилу (СЕЗЕ) і змішували з неміченими ІГАс-3-трансфікованими клітинами у співвідношенні 1 до 1 при густині 1х106 клітин на мл. В 384-лункових планшетах 40 мкл ці суміші клітин змішували з 10 мкл антитіловмісного супернатанту, і антитіло, зв'язане із клітинами, виявляли за допомогою додавання вторинного антитіла АЕб47 кози проти ЇдДО людини (На) (МоїІесшіаг Ргобе5, Мо за каталогом А21445). Паралельно здійснювали скринінг антитіл на зв'язування з ГАс-3 яванського макака в схожій постановці. Зразки одержували з використанням високопропускної проточної цитометрії ()цеФф 5осгеепег, ІпіеїППсу) і аналізували дані з використанням програмного забезпечення ЕБогеСуїФф за допомогою побудови графіка СЕБЕ залежно від зв'язування Ід людини (АЕб647). ГАОс-3-специфічні первинні влучення ідентифікували як клони антитіл, що зв'язуються клітинами, трансфікованими ГАС-3 як людини, так і яванського макака (С5ЕЕ- негативні), але не з контрольними клітинами (С5ЕЕ-позитивні), і збирали номера планшетів і координати планшетів для вилучення влучень і наступного аналізу послідовностей. (0222) Послідовності ДНК варіабельних ділянок важких і легких ланцюгів і білків шести функціональних отриманих від ОтпікКаєю анти-ІЇАсС-3 антитіл (15646, 15532, 15723, 15595, 15431 і 15572) і одного функціонального отриманого від курки анти-І АС-3 антитіла (15011; див. приклад 2) надані далі в розділі зі списком послідовностей. Огляд ЗЕО ІЮ МО:послідовностей

ДНК варіабельних і константних ділянок і білків наведено в таблицях 8 і 9. БЕО ІЮ МО:для СОК перебувають у таблиці 9. Послідовності СОК у даному описі визначали відповідно до визначень

ІМаТФ для СОКІ ії СОМК2. Для СОКЗ важких і легких ланцюгів визначення в даному описі 60 включають один додатковий амінокислотний залишок вище за напрямком зчитування від ІМОТ -

Зо

СОЗ (Суз) і один додатковий амінокислотний залишок нижче за напрямком зчитування (Тгр для Н-СОКЗ, Рпе для Г-СОКЗ). Використання генів зародкової лінії в шести отриманих від

ОтпіВаїФ антитілах показано в таблиці 10.

Приклад 2: гуманізація отриманих у курки анти-І| А(-3 антитіл

І0223| Гуманізацію каркасних ділянок отриманих у курки анти-І АС-3 антитіл здійснювали для того, щоб одержувати молекули антитіл, які мають мінімальну імуногенність при введенні людині, при цьому по суті зберігаючи специфічність і афінність батьківських антитіл курки.

І0224| Гуманізацію отриманого в курки антитіла здійснювали з використанням підходу "пересадження СОК", спосіб з самого початку описаний у за допомогою допех еї аї., Машге 321(6069):522-5 (1986). Спочатку варіабельні ділянки важких (МН) і легких (МІ) ланцюгів антитіл порівнювали програмою ВІ АБТ з базами даних про Їдб людини для того, щоб знаходити найближчі гени зародкової лінії людини. Так ідентифікували гени ІЗНМ3-23701 (М99660) і ІСІ М3- 19701 (Х56178) людини як найближчі до генів МН і МІ. курки, відповідно. Аналогічним чином, вибрані амінокислотні послідовності людини для гуманізації ділянки У-гена вилучали з ІЗІНО1701 (900256) і ІСІ 96701 (М18338) для МН і Мі, відповідно. Потім гени МН і МІ. антитіл вирівнювали з генами зародкової лінії імуноглобулінів курки для того, щоб ідентифікувати соматичні мутації в каркасних ділянках, які можуть відігравати роль у функції і/або структурі антитіл. Нарешті, певні амінокислотні положення, так звані "залишки Мегпієг" (Мізпіброгі еї аї., Мої Іттипої. 43(6):634-42 (2006)), які достеменно відіграють важливу роль у структурі, стабільності і функції антитіл, враховували при генерації альтернативних варіантів гуманізованих антитіл, що містять залишки людини або курки з відповідних зародкових ліній. (0225) Складання СОК курки і каркасних ділянок людини здійснювали іп 5іїсо, а синтетичні гени, що кодують гуманізовані МН і МІ, замовляли в Сепвзосгірі Іпс. Гени МН їі МІ. клонували в експресуючі вектори (плазміди), що несуть константні ділянки легкого ланцюга і важкого ланцюга антитіла людини. Зокрема, МІ. з'єднували з константною А ІСІ С1701 людини (900252).

Для того щоб підвищувати правильне відщіплення сигнального пептиду вище від ланцюга А, другу амінокислоту (зег) у гені А ІСІ М3.19 заміняли на іншу амінокислоту (Туг), яка присутня в інших зародкових лініях людини, наприклад, ІСІ М3.25. (0226) Репрезентативні точкові діаграми проточної цитометрії для клонів антитіл, створених

Зо як описано в цьому прикладі, представлені на фіг. ТА-С: (А) клон антитіла, що специфічно зв'язується із трансфікованими ГАС-3 людини клітинами, (В) клон антитіла, що зв'язується неспецифічно із клітинами СНО-5, і (С) клон антитіла, який не зв'язується з якими-небудь із популяцій клітин, використовуваних у скринінгу.

Приклад 3: клонування аналогів еталонного анти-Ї АС-3 антитіла (0227| Амінокислотні послідовності, що кодують варіабельні домени важких і легких ланцюгів аналогів антитіл 25Е7-іад3.5 і ВАРОБО, одержували з публікації патентної заявки США 2014/0093511 А1 (ЗЕО ІЮ МО:12 і 14) і публікації патентної заявки РСТ УМО 2015/138920 А! (5ЕО

ІО МО:6 і 16), відповідно. Послідовності білків піддавали зворотній трансляції в послідовності

ДНК із використанням кодонів людини. Відповідні послідовності ДНК після цього синтезували і клонували в експресуючі вектори, що містять послідовність, що кодує, для константного домену важкого ланцюга або легкого к ланцюга Їд54 людини, що вело до експресії повнорозмірних антитіл. Для того щоб запобігати обміну плечима ЕБаб, залишок серину в положенні 228 заміняли на пролін (Апааї еї аї., Мої. Іттипої. 30:105-108 (1993)). Клітини СНО трансфікували одержуваними експресуючими плазмідами з використанням стандартної експресуючої білок системи. Відповідні антитільні супернатанти очищали з використанням стандартного хроматографічного очищення на колонку з білком А.

Приклад 4: скринінг панелі ГАС-3-специфічних тАб в ЗЕВА-РВМС аналізі

І0228| Здатність великої панелі І АсС-3-специфічних тАр стимулювати секрецію 1-2 обробленими стафілококовим ентеротоксином В (5ЕВ) мононуклеарними клітинами периферичної крові (РВМС) оцінювали з використанням РВМС одного донора. 5ЕВ являє собою суперантиген, який зв'язується з молекулами МНС класу ІІ і специфічними ділянками В

Т-клітинних рецепторів (ТОК) і забезпечує неспецифічну стимуляцію Т-клітин. Це веде до активації/проліферації поліклональних Т-клітин і вивільненню цитокінів, включаючи ІІ -2. РВМСО людини, виділені з лейкотромбоцитарних шарів від здорових донорів, висівали в 384-лункові планшети і залишали без обробки або обробляли з використанням 10 нг/мл ЗЕВ і 10 мкг/мл антитіл. Після 48 годин у зволоженому інкубаторі при 37 "С, супернатанти видаляли і аналізували в них рівні 1І--2 з використанням набору 1-2 ЕГІ5А (те Тесппоіодієв). (0229) Збільшення секреції І--2 після обробки репертуарами тАБ проти ГАО-3 або аналогом 25Е7-Іад3.5 презентовано на фіг. 2. Очевидно, що рівні ІІ -2 після обробки різними тАб проти бо ГАС-3 значно варіювали, що показує, що деякі антитіла в репертуарі не мали функціональності в цьому аналізі, тоді як інші антитіла індукували секрецію 1-2 до рівнів, схожих з аналогом 25Е7-

Ї аа3.5.

Приклад 5: зв'язування антитіл з ГАС-3 людини або яванського макака, що експресується клітинами (0230| Для того щоб визначати значення ЕСво для зв'язування антитіл за допомогою проточної цитометрії, клітини СНО-тимчасово трансфікували для того, щоб експресувати І АС-3 людини або яванського макака з використанням реактиву Ргеесіуіїе"м МАХ (Іпмйгодеп, Мо за каталогом 16447-100). Антитіла титрували в З-кратних розведеннях від 10 до 0,05 мкг/мл у забарвлювальному буфері (РВ5; 295 ЕВ5; МамМ») і змішували і інкубували із клітинами, трансфікованими ГАС-3 людини або яванського макака. Після двох промивань у забарвлювальному буфері, пов'язане із клітиною антитіло виявляли за допомогою додавання вторинного антитіла кози АЕб47 проти дО людини (Неї) (МоїІесшаг Ргобе5, Мо за каталогом

А21445). Зразки одержували з використанням високопропускної проточної цитометрії (Оцет

Зсгеепег, ІпіеїйПсу!) і аналізували дані з використанням програмного забезпечення ЕогеСуїФ за допомогою побудови графіка концентрації антитіла залежно від середньої інтенсивності флуоресценції (МЕЇ) для АЕб647. Значення ЕСво обчислювали з використанням функції "дозе гезропзе дгарп" в РогеСуїФ

ІО231| Зведення із зв'язувальних властивостей антитіл, які вимірювали за допомогою титрування, перебуває далі в таблиці 1, де пис АС-3 і су АС-3 являють собою клітини, трансфіковані ГАС-3 людини і яванського макака, відповідно. Як показано в таблиці 1, антитіла 15646, 15532, 15723, 15595, 15431 і 15572 зв'язуються з ГАС-3 як людини, так і яванського макака.

Таблиця 1

Приклад 6: Проточний цитометричний аналіз анти-і АС-3 антитіл на блокувальну МН активність (0232) Цей приклад ілюструє, як анти-І АС-3 антитіла тестували на блокувальну головний комплекс гістосумісності Ії (МНСЇЇ) активність за допомогою виконання конкурентним аналізом на основі проточної цитометрії з використанням клітин АЗ75 з позитивною за МНС поверхнею і

Зо міченого флуорохромом розчинного ГАс-3. (0233) Блокувальну МН активність вивчали в клітинному аналізі з використанням клітинної лінії АЗУ5 меланоми людини (АТССФ СВІ -16191м). Д-РЕ-мічений химерний білок з ГАО-3 людини і Ес може специфічно зв'язуватися з МНОСЇЇ, що експресується на поверхні АЗ75, що уможливлює кількісне визначення цієї взаємодії за допомогою проточної цитометрії. Комерційно доступний рекомбінантний химерний білок з ГАС-3 людини і Ес (КО Зузіет5, Ш5БА) кон'югували з К-РЕ, використовуючи Гіднпіпіпд-ійкФ В-Рпусоегуїйгіп Сопідайоп Кії (Іппома

Віозсіепсе5, ОК). Клітини АЗ375 збирали з використанням Сеї! рібзосіайоп Вийег, що не містить ферменти (сірсо"м), промивали і ресуспендували в холодному забарвлювальному буфері (РВ5, 2 У ЕВ5, Мамз»з). Анти-І АС-3 антитіла, що підлягають тестуванню, наносили на планшет в 96- лунковому форматі і коректували до 20 мкг/мл в 50 мкл забарвлювального буфера. На лунку додавали 1 мкл ГАС-3-Ес-РЕ (відповідає приблизно 0,17 мкг ГАС-3-Ес), змішували і інкубували планшети при 4 "С протягом 30 хв. для того, щоб уможливити утворення комплексу ГАс-3- антитіло. У ході інкубації 1х105 клітин АЗ75 (в 100 мкл забарвлювального буфера) висівали в 96- лунковому форматі, осаджували за допомогою центрифугування і ресуспендували клітинні осадки в попередньо інкубованих сумішах ГАсС-З3/антитіло. Клітини інкубували протягом додаткових 20 хв. при 4 "С, промивали їх в 200 мкл холодного забарвлювального буфера, і ресуспендували в 100 мкл забарвлювального буфера для реєстрації.

І0234| Із семи тестованих анти-І АСі-3 антитіл (при 20 мкг/мл), чотири, 15532, 15595, 15431 і 15011, індукували зниження зв'язування І АС-3 з МНОЇІЇ (МЕЇ) приблизно на 90 95 у порівнянні зі зв'язуванням у присутності антитіла негативного контролю, і, таким чином, вважалися ефективними блокаторами взаємодії. Інші три антитіла, 15646, 15723 і 15572, виявляли тільки обмежений ефект на зв'язування ГАС-3-МНСЇЇ і могли вважатися слабкими блокаторами.

Аналог еталонного антитіла 25Е7-іа93.5 демонстрував проміжну блокувальну активність.

Результати зведено в таблиці 2.

Таблиця 2

Блокування зв'язування І АС-3 з МНС на клітинах АЗ75 у присутності анти-І АС-3 антитіл 00121558211Ї111111111111111111111111111178811111111111111111 "Медіана, нормалізована за зв'язуванням ГАС-3 у присутності антитіла негативного контролю.

Приклад 7: Ефект моноклональних анти-І АС-3 антитіл в ЗЕВАРВМС аналізі (0235) Оцінювали здатність семи тАб проти (ГАС-3 стимулювати секрецію 1-2 обробленими стафілококовим ентеротоксином В (ЗЕВ) мононуклеарними клітинами периферичної крові (РВМСОС). У цьому прикладі описаний ефект семи тАБбБ проти ГАС-3, надаваний на РВМС декількох донорів. Крім того, описаний ефект чотирьох тАб проти ГАС-3 з інших кластерів послідовностей. Номера кластерів послідовностей наведені в дужках після номерів антитіл і додатково описано в прикладі 13. Анти-І АС-3 антитіла тестували в концентраціях 10 або 12,5 мкг/мл в ЗЕВА-РВМС аналізі, як описано в прикладі 4.

І0236| Збільшення секреції ІЇ/-2 після обробки з використанням тАб проти ГАС-3 15431, 15532, 15572, 15595, 15646, 15723 і 15011 або аналога 25Е7-І ад3.5 показано на фіг. 3. Кожна точка представляє рівень секреції І--2 в РВМС одного донора. Очевидно, що рівні І--2 після обробки з використанням тАб проти ГАС-3 варіювали серед різних донорів РВМС, але всі сім тАб проти ГАС-3 стимулювали продукцію 1-2 на схожих рівнях. Це відрізняється від тАбр проти

ГАС-3 15445, 15429 і 15491, які не збільшують продукцію ЇЇ -2.

Приклад 8: ефект моноклональних анти-Ї АСі-3 антитіл у клітинному аналізі блокування І АС-

Зо З3-МНС класу ІІ

І(0237| Щоб додатково охарактеризувати сім тАбБ проти ГАС-3, у клітинному аналізі тестували здатність блокувати взаємодію між (ГАс-3 і МНС класу ІІ. (02381) Клітини Чигкаї, що несуть ген люциферази під керуванням МЕАТ-КЕ і експресуючі модифікований ТСК і ГАо-3 (Рготеда), інкубували із клітинною лінією Каїі, експресуючої МНС класу І, 50 нг/мл стафілококового ентеротоксину ОО (5ЕО) і різними концентраціями моноклональних антитіл, як зазначено на фіг. 4. Після 6 годин у зволоженому інкубаторі при 37 "б, додавали субстрат люциферази (Рготеда) і вимірювали люмінесценцію. Люмінесценція являє собою міру експресії люциферази, яку контролюють за допомогою передачі сигналу ТОК і інгібують за допомогою передачі сигналу ГАС-3. Таким чином, менша передача сигналу ГАС-3, наприклад, за допомогою блокування взаємодії (АС-3 з МНОСЇЇ, буде вести до підвищеної люмінесценції.

І0239| Збільшення люмінесценції після обробки з використанням тАБб проти ГАс-3 15431, 15532, 15572, 15595, 15646, 15723 і 15011 або аналога 25Е7-І ад3.5 презентовано на фіг. 4.

Виявляли, що всі тестовані анти-І АС-3 антитіла збільшують люмінесценцію до схожих рівнів.

Приклад 9: ефект моноклональних анти-І АСі-3 антитіл, надаваний на клітинні рівні ГАс-3 (0240 Щоб додатково охарактеризувати вибрані тАбБ проти ГАС-3, здатність до понижувальної регуляції рівнів ГАС-3 тестували в лінії Т-клітин зі надекспресією І АО-3.

02411) Клітини дигкаї, що експресують модифікований ТС і ГАС-3 (Рготеда), інкубували з 25 мг/мл моноклональних антитіл, як зазначено на фіг. 5. Після 24 годин у зволоженому інкубаторі при 37 "С, збирали супернатанти і здійснювали лізис клітин. Рівні ГАС-3 у клітинах оцінювали з використанням ідентифікуючого анти-І| АС-3 антитіла (Момив ВіоіодісаІ5) і прийоми зітріє Ууезїе тп (зЗаїІу Зице, Ргоїеіпзітріеє). Рівні ГАС-3 у супернатанті оцінювали з використанням

ЕПІЗА проти І АОо-3 (КО Зузіетв5). Дослідження конкурентного зв'язування підтверджували, що тестовані анти-І АС-3 антитіла не конкурують із ідентифікуючим антитілом ЕГГ ІЗА за зв'язування з розчинним ГАС-3. Статистичний аналіз здійснювали з використанням однофакторного дисперсійного аналізу з корекцією для множинних порівнянь, після чого слідував апостеріорний критерій Ст'юдента з виправленням Бонферроні. (02421 Рівні клітинного і розчинного ГАС-3 після обробки з використанням тАБб проти І АС-3 15431, 15532, 15011, аналога 25Е7-І ад3.5 або аналога ВАРО5БО представлені на фіг. 5. 15532, 15011, аналог 25Е7-ІГад3.5 і аналог ВАРОБ5О знижували клітинні і розчинні рівні ГАО-3. 15532 знижувало клітинні рівні ГАС-3 до більш низького рівня, ніж аналог 25Е7-І а93.5, зі статистичною значимістю і знижувало розчинні рівні ГАС-3 до більш низького рівня, ніж аналог 25Е7-І ад3.5 і аналог ВАРО5БО, зі статистичною значимістю. 15431 не знижувало ні клітинні, ні розчинні рівні

ГАС-3.

Приклад 10: ефект антитіла 15011 іп мімо, надаваний у двох моделях сингенних пухлин на мишах (0243) Цей приклад демонструє ефект антитіла 15011 іп мімо, надаваний у двох моделях сингенних пухлин на мишах.

Способи (0244| 2х107 клітин ЗаїМ (фібросаркома) і 5х106 клітин АЗВ- ХІМ (карцинома легенів) інокулювали підшкірно в бік самок мишей А/) (За1!М) або ВАЇ В/сАпМК) (АЗВ-ХІМ) у віці 6-8 тижнів. Пухлини вимірювали три рази на тиждень штангенциркулем за двома вимірами і об'єм пухлини в мм? обчислювали відповідно до формули: (ширина)? х довжина х 0,5. На добу 5-7 після інокуляції, при усередненому розмірі пухлини 30-50 мм, мишей рандомізували у дві групи по 10 тварин і починали лікування. Мишей лікували три рази на тиждень із використанням усього шести лікувань за допомогою інтраперитонеальної ін'єкції буфера-носія або

Зо моноклонального антитіла 15011, після чого слідував період спостереження. Лікування антитілами дозували по 10 мг/кг. Двофакторний дисперсійний аналіз із використанням критерію множинного порівняння Бонферроні застосовували для того, щоб порівнювати об'єми пухлин у кожний момент часу між групами лікування. Статистичний аналіз здійснювали з використанням

СгарпРаа Ргіхт версії 5.0 (сгарпРаа Зоїгмаге, Іпс.).

Результати (0245) Результати показували виражений ефект інгібування пухлини антитілом 15011 у тестованих моделях сингенних пухлин ("Р«е0,001) (фіг. 6). 15011 індукувало регресію пухлинного росту в 50 96 мишей з пересадженими пухлинами заї1М і вело до затримки пухлинного росту в моделі сингенної пухлини АЗВ-ХІМ.

Приклад 11: ефект антитіла 15532 іп мімо у мишей МО, яких відновлювали з використанням

РВМС людини і яким пересаджували клітини меланоми людини АЗ375

І0246| У цьому прикладі продемонстрований ефект антитіла 15532 іп мімо у моделі напівгуманізованої ксенотрансплантованої пухлини, де імунну систему мишей МОЄ відновлювали з використанням РВМС людини, і мишам пересаджували клітини меланоми людини АЗ75.

Способи

І0247| У добу дослідження 0 мишам МОСС підшкірно ін'єкували 2-4,5х105 клітин меланоми

АЗ75 і інтраперитонеально вводили 9 або 12х106 РВМС у добу дослідження 2. У кожному експерименті використовували РВМС від одного донора. Лікування ініціювали в добу інокуляції

РВМС, і мишей лікували три рази на тиждень із використанням усього шести або дев'яти лікувань за допомогою інтраперитонеальної ін'єкції буфера-носія або моноклонального антитіла 15532 (10 мг/кг), після чого слідував період спостереження. Пухлини вимірювали три рази на тиждень штангенциркулем за двома вимірами і обчислювали об'єм пухлини мм3 відповідно до формули: (ширина)? х довжина х 0,5. Двофакторний дисперсійний аналіз із використанням критерію множинного порівняння Бонферроні застосовували для того, щоб порівнювати об'єми пухлин у кожний момент часу між групами лікування. Статистичний аналіз здійснювали з використанням СсгарпРавй Ргізт версії 5.0 (сгарпРаа 5оїмаге, Іпо.).

Результати (02481 На фіг. 7 представлені результати із двох експериментів з використанням РВМС двох бо різні донорів-людей, які відповідали на лікування проти ГАС-3. Лікування з використанням 15532 вело до значної затримки пухлинного росту в порівнянні із групою лікування носієм ІР«0,05 (донор 1) і Р«0,001 (донор 2).

Приклад 12: вимірювання афінностей моноклональних анти-іЇ АС-З3 антитіл щодо ГАс-3 людини, яванського макака і миші

І(0249| У цьому прикладі продемонстроване зв'язування анти-Ї АС-З3 антитіл. з позаклітинними доменами ГАС-3 людини, яванського макака і миші, як виміряно поверхневим плазмонним резонансом (5РЕ). Послідовність білка ГАС-3 людини доступна за Мо доступу

ОпіРгої Р1І8627 (ЗЕО ІЮ МО:68). Послідовність білка ГАС-3 яванського макака доступна за Мо доступу МСВІ ХР. 005570011.1 (ЗЕО ІО МО:69). Послідовність білка І АС-3 миші доступна за Мо доступу ОпіРгої 061790 (ЗЕО ІЮ МО:72).

Матеріали і способи (0250) Кінетичний аналіз зв'язування здійснювали за допомогою поверхневого плазмонного резонансу (РЕ), використовуючи Сопіїпиои5 Ріом/ Місгозроцег (СЕМ, Умазаїсп МісгоПиіаісв, заї

Іаке Сйу, О5) у комбінації із приладом ІВІ5 МХ9б6 5РК (ІВІ5 Тесппоодіє5, Тне Мем Шепапав5).

І0251| Раб анти-ЇАС-3 антитіла створювали за допомогою розщеплення антитіл ІДС з використанням ферменту сіпдізКНАМ, використовуючи набір, надаваний в Сепомі5 (Зу/едеп). (0252) Синтезували КДНК ГАС-3, що кодує позаклітинні домени ГАС-3 людини і яванського макака, і кожну клонували у вектор, що містить промотор СММУ і послідовність Ес ЇД01 людини (АА РІО1-К330), що вело до злиття Ес ІдС1 С-кінцем із клонованим ЕСО ГАОС-3. Злиті конструкції ГАС-3 Ес створювали за допомогою стандартної ПЛР їі приймань конструювання, і білок тимчасово експресували в 2 мл культурі з використанням експресуючої системи

ЕхрібНоО м, Після 9 доби збирали злиті конструкції ГАС-3 людини Ес і супернатанти тестували на афінність зв'язування з Раб антитілами до ГАС-3 за допомогою ЗРК. Антигени очищали з використанням стандартних процедур і захоплювали на б-а-пи-ІдСс Ес ЗепзЕуєдт (5з5еп5 ВУ,

Тпе Меїйепапаз) протягом 15 хвилин з використанням Сопііїпиои5 Біом/ МісгозроЦег (СЕМ,

Умазаїсп МісгоПиїдісє, зак їаке Спйу, 05). Після точкового нанесення, Зеп5ЕуеєтФ поміщали в біосенсор ІВІЗ МХОУ9б і захоплюючі ділянки, що залишилися, блокували. Кінетичний аналіз здійснювали за допомогою застосування так званого ряду кінетичного титрування (Кагіз5зоп К. 2006), де мономерні Баб фрагменти антитіл за винаходом впорскували в концентраціях, що

Зо збільшуються, від 1 нМ до 1000 нМ без застосування стадій регенерації поверхні після кожного упорскування ЕРар. Зв'язування Бар здійснювали протягом 15 хвилин і дисоціацію антигену здійснювали протягом 15 хвилин. Зареєстровані сигнали зв'язування апроксимували до простої моделі зв'язування Ленгмюра 1:1 з використанням програмного забезпечення 5сгирбрег 2 для обчислення констант швидкості асоціації (Коп або Ка), швидкості дисоціації (Кок або Ка) і афінності (Кб).

Результати (0253) Результати виміру афінності показують, що оцінювані антитіла 15532, 15431, 15572, 15011 і аналог еталонного антитіла 25Е7-І ад3.5 зв'язують ГАО-3 людини і яванського макака з різними афінностями. 15011 являє собою єдине антитіло з перехресною реактивністю до І Ас-3 миші. Подробиці про кінетику зв'язування наведені далі в таблиці 3.

Таблиця З

Кінетика зв'язування Бар фрагментів проти ГАС-3 з ГАС-3 людини, яванського макака і миші ЕСО, як вимірюють за допомогою ЗРК

Таблиця З

Кінетика зв'язування Бар фрагментів проти ГАС-3 з ГАС-3 людини, яванського макака і миші ЕСО, як вимірюють за допомогою ЗРК "МВ: зв'язування відсутнє

Приклад 13: групування епітопів анти-І АС-3 антитіл (0254| Цей приклад ілюструє, як анти-Ї АС-3 антитіла групували за групами епітопів на основі патернів парної конкуренції в сендвіч-аналізі. Антитіла, що належать до різних груп епітопів, розпізнають різні епітопи на ЕСО І АО-3.

Матеріали і способи

І0255| Дослідження парної конкуренції антитіл здійснювали за допомогою аналізу поверхневого плазмонного резонансу (ЗРК) з використанням Сопіїписи5 Біом/ Місгозронег (СЕМ) (Умазаїсп Місгойчідієє, 05) у комбінації із приладом ІВІЗ МХ9б 5РЕ (ІВІ5 Тесппоїодіев,

Те МеїШПепапав5). Аналіз візуалізації поверхневого плазмонного резонансу здійснювали на ЗРК датчику Соаї-Апіі-Нитап-Ідс Ес Зеп5ЕуефФ (5веп5 ВМ, Те Меїйпепапа5). Усього 13 анти-І АСі-3 антитіл, включаючи еталонне антитіло 25Е7-І ад3.5, розводили до 7,5 мкг/мл у буфері РВ5, що містить 0,05 9о Тмеєп 20 (РВ5-Т), рН 7,0. Антитіла захоплювали на поверхні датчика проти Ес за допомогою точкового нанесення протягом 15 хвилин з використанням Сопііпиои5 ЕІоОм/

Місгозроцег. Після точкового нанесення, Зеп5ЕуеФ поміщали в біосенсор ІВІЗ МХ9О6б і ділянки, що залишилися, проти Ес блокували за допомогою упорскування 30 мкг/мл неспецифічного

Ід901 людини. Захоплені антитіла кон'югували з поверхнею з використанням набору Ріїхії (55еп

ВМ, Тпе Меїпегіапа5). Після підготовки датчика іммобілізовані антитіла (ліганди) використовували для захоплення одновалентного антигену ГАС-3 (50 нМ, Асго Віозуєгепт»в»,

Спіпа) у розчині, коли впорскували на датчик. Потім панель антитіл до ГАс-3, розведених до 15 мкг/мл у буфері РВ5З-Т, впорскували як аналізовані речовини одна за одною на датчик і тестували на зв'язування із захопленим ГАС-3 у сендвіч-аналізі, щоб установлювати патерни конкуренції антитіл. Після упорскування кожного антитіла, поверхню датчика регенерували з використанням 100 мМ НзРО» буфера, рН 3,0.

Результати (0256) Патерн конкуренції 13 анти-І АС-3 антитіл представлений на фіг. 8. Антитіла названі відповідно до їх ідентифікаційного номера, а кластерні групи перераховані в дужках. Очікують,

Зо що тАБб з ідентичних кластерних груп зв'язують ідентичні групи епітопів, оскільки білкові послідовності елементів кластерів є близькоспорідненими і різняться тільки декількома положеннями.

І0257| Усі антитіла успішно проходили групування за епітопами; однак антитіла 15595 (52), 15613 (33) і 15431 (38) не працюють при використанні як ліганди і можуть тестуватися тільки як аналізовані речовини. Антитіла 15646 (15) і 15011 (94) тестували тільки як ліганди. (0258) Аналіз конкуренції показував, що панель антитіл до (| АС-3 охоплює 6 основних груп епітопів (фіг. 8). Антитіло 15011 (94) зв'язувалося з унікальним епітопом, який не піддавався перехресному блокуванню будь-якими іншими антитілами з панелі, і, отже, це антитіло присвоювали групі епітопів 1. Група епітопів 2 містить 7 антитіл, які перехресно конкурували з деякими іншими тАб із групи, і ці антитіла додатково ділили на підгрупи. тАб 15584 (54) відрізнялося перехресним блокуванням 15532 (17) і 15595 (52) при тестуванні як ліганд або аналізовану речовину, але його не блокувало еталонне тАр 25Е7-ІГад3.5 при тестуванні як аналізовану речовину. тАр 15613 (33) тестували тільки як аналізовану речовину і показували, що його блокують 15723 (39), 15532 (17) і 15646 (15), але не 25Е7-І ад3.5. Отже, незважаючи на те, що 15532 (17) зв'язувало епітоп, що перекривається з 25Е7-І ад3.5, епітоп 15532 (17) відрізняється від такого для 25Е7-І ад3.5 через відмінності у конкуренції з 15584 (84) і 15613 (33), і, отже, ці антитіла присвоювали різним підгрупам. Аналогічним чином, інші тАб у групі епітопів 2 присвоювали підгрупам на основі патернів конкуренції з іншими антитілами в групі 2 (фіг. 8). (0259) В тАбБ 15572 (91) виявляли тільки перехресну конкуренцію з тАб 15584 (54), і його відносили до окремої групи 3. Аналогічним чином, тАбр 15431 (83) відносили до окремої групи 4, оскільки це антитіло перехресно конкурує тільки з тАб 15723 (39). Нарешті, ідентифікували дві окремі групи епітопів, що містять антитіла з нефункціональною активністю. Група епітопів 5 містила перехресно блокувальні антитіла 15445 (70) і 15491 (84) і група епітопів 6 містила тАБ 15429 (72), яке не демонструє перехресного блокування будь-якого з антитіл з панелі. Антитіла групи 5 також блокували антитіла 25Е7-іад3.5, 15532 (17) і 15723 (39) із групи 2, коли їх тестували як аналізовані речовини (фіг. 8). Зведення за патернами конкуренції для антитіл- лігандів наведена на фіг. 9, де споріднення епітопів для тАбБ показане на основі кластеризації з використанням евклідової відстані. У кластерній діаграмі можна спостерігати, що антитіла із точками розгалуження при значеннях по осі х вище нуля мають інші епітопи в порівнянні з іншими антитілами в тестованій панелі ГАС-3. У кластерний аналіз не включали тАБ 15595 (52), 15613 (33) і 15431 (38), оскільки вони не працюють як ліганди.

Приклад 14: картування епітопів антитіл до ГАс-3 за допомогою мутагенезу ГГ АО-3 (0260) Епітопи антитіл у цілому можна охарактеризувати як лінійні епітопи (також називані безперервними епітопами) або конформаційні епітопи (також називані переривчастими епітопами). Лінійні епітопи визначають на основі однієї безперервної амінокислотної послідовності, тоді як конформаційні епітопи можуть складатися з декількох більш дрібних не безперервних лінійних послідовностей або окремих контактних залишків. Сукупність контактних залишків, які утворюють кластер у міжмолекулярному білковому інтерфейсі між антитілом і антигеном, також називають гарячою точкою (Могеїга еї аї., Ргоївіп5 68(4):803-12 (2007)). Зараз загальновизнаним є те, що більшість епітопів В-клітин є не безперервними за природою (Зімайпдат апа 5Пперпега, Мої Іттипої. 51(3-4):304-92012 (2012), КіїпдеЇшт еї аї., Мої ІттипоЇ. 53(1-2):24-34 (2013)), причому усереднений епітоп охоплює 15-22 амінокислотних залишків, з яких 2-5 амінокислот вносять основний вклад у зв'язування (5імайпдат апа Зперпега, вище). (0261) За допомогою ранжирування афінності зв'язування зі 108 різними мутантами ГГ Ас-3, цей приклад ілюструє, що як зв'язувальні епітопи анти-І АС-3 антитіл 15532, 15431, 15572 і 15011 можна ділити на лінійні епітопи і гарячі точки, які відрізняються від епітопу, розпізнаваного аналогом еталонного антитіла 25Е7-І ад3.5.

Способи

І0262| Рецептор, ГАС-3 людини (СО223) являє собою трансмембранний білок з 525 амінокислот (АА), який містить позаклітинний домен (ЕСО) з 427 амінокислот (залишки 23-450), після якого слідує трансмембранний домен (залишки 451-471) і цитоплазматичний домен

Зо (залишки 472-525). ЕСО І ДО-3 містить 4 імуноглобулінових домени (01-04), де перший домен, домен типу ІдМ, бере участь у зв'язуванні ліганду (зв'язуванні МНЄОІЇ), а інші три домени являють собою домени типу Ід9Сб2. Окремо перших двох М-кінцевих доменів (01-02) досить для зв'язування ліганду і показано, що 02 необхідний для коректного представлення рецептора (Ниага еї а!., Ргос Маї! Асай 5сі ОА 94:5744-5749 (1997), Апагемув вї аї., Іттипої! Веу. 276(1):80- 96 (2017)). Домен 1 містить додатковий унікальний фрагмент із 30 амінокислот (додаткова петля), який не знаходять в інших ІдМм-доменах і який, як показано, важливий для зв'язування ліганду. Амінокислоти (АА) 99, 110, 125, 131 ї 137 також ідентифіковані як важливі для зв'язування ліганду (77, 88, К103, 0109, К115 у зрілому білку) (Ниага еї аї., вище; Апагему5 еї аІ., вище). Структура ГАО-3 не опублікована. Однак установлені послідовність і еволюційна гомологія між ГАс-3 і СО4, що, таким чином, уможливлює доступ до структурної інформації про

Г АС-3 на основі моделювання за гомологією з СО4 (Ниага еї аї., вище; Апагемуз єї аї., вище). 0263) Білкові послідовності ГАС-3 людини і ортологи завантажували з ОпіРгої або МСВІ: людина (Р18627; 5ЕО ІЮ МО:68), яванський макак (Масаса Газсісціагі5, ХР. 005570011.1; 5ЕО І

МО:69), щур (Кайих погмедіси5, О5ВК54; 5ЕО ІО МО:70) і собака (Сапів І ири5 Ратіїйагі5, Е1Р 77273;

ЗЕБЕО ІЮ МО:71). Ідентичності послідовностей для різних амінокислотних послідовностей позаклітинних доменів ГАС-3 представлені далі в таблиці 4.

Таблиця 4

Список амінокислотних відмінностей і ідентичність послідовностей з ГАС-3 людини в позаклітинному домені І АС-3 від трьох різних біологічних виглядів ковтяннннних відмінності послідовностей

І0264| Для картування лінійних епітопів у контексті нативної структури ГАС-3 людини розробляли 35 химерних білків, де 10 амінокислот в послідовності ЕСО ГАС-3 людини послідовно заміняли на послідовність щура в сегментах, які перекривалися на 5 амінокислот, і з додаванням версій собаки і яванського макака в ділянках особливого інтересу (наприклад, критичні АА вставні послідовності і фрагменти петель). Заміни послідовностей здійснювали в домені 1 ГАС-3 людини, що охоплює амінокислоти 23-170. За сконструйованою гомологічною моделлю на основі кристалічних структур СО4 (Т1УМО, ТУМО) ії вирівнюванням амінокислотних послідовностей ідентифікували амінокислоти, експоновані на поверхні, і розробляли 80 індивідуальних замін у домені 1 ГАОс-3 людини. Введені точкові мутації в першу чергу являли собою аланінові заміни. Коли експонований на поверхні залишок представляв аланін, це положення міняли на серин. (0265) КДНК ГАО-3, що кодує домени 1 і 2 позаклітинного домену ГАС-3 людини (АА 1-266), синтезували і клонували у вектор, що містить промотор СММ і послідовність Ес ЇдДО1 людини (АА РІ101-КЗ330), що вело до експресії злитого білка з доменів 1-2 ГАС і Ес. Злиті конструкції мутантного ГАС-3 людини і Ес створювали за допомогою стандартної ПЛР і приймань конструювання, і білок тимчасово експресували в 2 мл культурі з використанням експресуючої системи ЕхрісНоО м, Злиті конструкції з ГАС-3 людини і Ес збирали, очищали і тестували на афінність зв'язування з тАб проти ГАС-3 за допомогою поверхневого плазмонного резонансу (ЗРК). Злиті білки ГАС-3 іммобілізували на с-а-пи-Іда Ес 5епзЕуефФ (55епо ВУ, Те МеїпепапаФв) протягом 15 хвилин з використанням Сопіїписи5 БіІом/ Місгозхробйег (СЕМ, УмМазаїсп МісгоПиіаісв, зак аке Сйу, 05). Після точкового нанесення, Зеп5хЕуеєФ поміщали в біосенсор ІВІ5 МХ9О6 і оцінювали афінність зв'язування захоплених білків. Кінетичний аналіз здійснювали за допомогою застосування так званого ряду кінетичного титрування (Кагіз5оп К. 2006), де мономерні Бар фрагменти антитіл за винаходом впорскували в концентраціях, що збільшуються, від 0,4 нМ до 300 нМ без застосування стадій регенерації поверхні після кожного упорскування ЕРар. Зв'язування Бар здійснювали протягом 15 хвилин і дисоціацію антигену здійснювали протягом 15 хвилин. Зареєстровані сигнали зв'язування апроксимували до простої моделі зв'язування Ленгмюра 1:1 з використанням програмного забезпечення Зсгирбег 2 для обчислення констант швидкості асоціації (Коп або Ка), швидкості дисоціації (Кок або Ка) і афінності (Кб).

Результати

Зо (0266) Афінності зв'язування Раб фрагментів анти-І АС-3 антитіл 15532, 15431, 15572, 15011 і аналога еталонного антитіла 25Е7-їад3.5 оцінювали відносно зміненого зв'язування з конструкціями мутантного ГАС-3. Афінності зв'язування Бар фрагментів, що зв'язуються з конструкціями мутантного ГАС-3, експресували у вигляді співвідношення Ко мутанта/Ко дикого типу (нормалізована афінність зв'язування). Далі в таблицях 5 і 6 представлені нормалізовані афінності зв'язування з усіма тестованими химерними білками і для експериментів сканування аланіном, відповідно. Поріг щонайменше 5-кратного зниження афінності використовували як критерій для виявлення значно зниженої афінності зв'язування з конструкціями мутантного ГАс- 3. У деяких випадках не можна виявляти зв'язування зі специфічними антитілами. Ці конструкції перераховані як "зв'язування відсутнє" (3.8.). (0267| Аналіз показував, що зв'язувальні епітопи анти-І АС-3 антитіл 15532, 15431, 15572, 15011 відрізняються від таких для аналога еталонного антитіла 25Е7-І ад3.5. Зв'язувальний епітоп для 15532 був очевидний з химерних білків з АА, вставленими в положеннях 78-87, 84- 92, 88-97 - сукупний амінокислотний фрагмент в ГАС-3, який перебуває в межах додаткової петлі домену 1. Однак, на відміну від 25Е7-І ад3.5, лінійні епітопи для 15532 виходять за межі цього фрагмента, включаючи АА 895-100, АА 98-105 і АА123-131. Цікаво, що ключові амінокислоти для лігандних взаємодій ідентифіковано в сегменті 99-131 (у99, К125 і 0131;

Ниага еї аї., вище). Аналог 25Е7-Ііад3.5 не демонструє яку-небудь чутливість до мутацій в ділянки, критичної для зв'язування ліганду. Контактні залишки 15532, як вимірюють за допомогою аланінових замін, ідентифікували як Н85, Р8б, А87, Р8О, 591, УМ92 і 593, тоді як аналог 25Е7-Іад3.5 не демонструє чутливість до Р8Фб і 591, що ілюструє диференційовані контактні залишки в ділянки АА 85-93. 15532 здатний зв'язувати химерну конструкцію Мо 28 зі зворотними мутаціями АА яванського макака (РВАН; Н8В5Е; 590), тоді як аналог 25Е7-І ад3.5 не здатний, що знову відбиває диференційований тонкий епітоп в ділянки АА 84-90. (0268) Було виявлено, що два антитіла 15431 і 15572 зв'язують лінійні епітопи в сегментах

АА 23-30 і 40-66. Крім того, аланінове сканування ілюструвало, що обидва антитіла мали ідентичні контактні залишки в положеннях А40, 041, Р43, Р46, Р49, 052, 162, 064, Нб5, 066,

Рб?7 і 068. Крім того, 15431 чутливий до химерних конструкцій 88-97, 95-100 і 98-105 (сегмент АА 88-105). Доведено, що АА ділянка 98-105 є унікальним загальним епітопом для 15532, 15431, 15572 і 15011. Аналог 25Е7-І ад3.5 не зв'язує цей епітоп. Аланінове сканування показувало, що 60 15431 і 15572 ділили контактні залишки РОб, 99, Т100, М101, Р106 ії 2107, тоді як 15431 мало унікальні контакти в положеннях (593, РО4 і К98. Антитіло 15431 також мало лінійний епітоп у сегментах АА 123-131, 128-137 і 148-154. Цікаво, що попередньо показано, що положення 125, 131 ії 137 важливі для зв'язування ліганду (Ниага еї аї., вище). Ці сегменти (АА 123-131, 128-137 і 148-154) також важливі для 15572, яке розпізнавало лінійні епітопи в сегментах АА 118-137 і 148-161. Крім того, аланінове сканування показувало, що 15431 і 15572 ділили контактні залишки в положеннях К119, Е124, К129, 5130, 0131, 5133, К137, Р1ІЗ38, 0143, К148 і К163, тоді як аналог 25Е7-Іад3.5 не демонструє чутливість до будь-якої із цих ділянок епітопів або амінокислотних положень.

І0269| Антитіло 15011 містило лінійний епітоп, обумовлений химерною конструкцією з мутаціями в діапазоні АА 98-105, і аланінове сканування додатково розширювало унікальний епітоп на контактні залишки в положеннях 107, 1109, К110 ї 5111. Цікаво, що показано, що

К110 важливий для зв'язування ліганду (Ниаго еї аїІ., вище). Амінокислотна послідовність високо консервативна в цій ділянці (АА 98-113) між ортологами людини, яванського макака, миші і щура, що пояснює перехресну реактивність цього антитіла до ГАС-3 миші і яванського макака (приклад 12). Зведення зібраних знахідок при картуванні епітопів представлена далі в таблиці 7. 0270 Коротко, автори винаходу показали на розрізненні в одну амінокислоту, за допомогою аналізу зв'язування з панеллю зі 108 мутантів ГАС-3, що чотири антитіла 15532, 15431, 15572 і 15011 розпізнають унікальні, але, що частково перекриваються, епітопи в домені 1 ГАС-3. Ця знахідка відповідає аналізу групування епітопів у прикладі 13, який показує, що 15532 перехресно конкурує з аналогом 25Е7-І ад3.5, але має диференційований патерн конкуренції з іншими антитілами до ГАО-3 і, таким чином, інший епітоп (таблиця 7). 15431, 15572 і 15011 не конкурують за зв'язування з 15532 або 25Е7-І ад3.5 і мають унікальні патерни конкуренції з окремими антитілами групи епітопів 2. Привласнені групи епітопів (приклад 13) добре збігаються з картуванням епітопом, яке виявляло, що кожне антитіло демонструвало унікальні диференційовані епітопи (таблиця 7). Дані про епітопи, включаючи химерну конструкцію Ме28, також добре підтверджуються аналізом афінності зв'язування (приклад 12), у якому 15532 демонструвало значиме зв'язування з | АС-3 яванського макака, а 25Е7-І ад3.5 - ні, що відбиває різні властивості антитіл через диференційовані контактні залишки.

Таблиця 5

Зведення з аналізу афінності зв'язування для Бар фрагментів анти-І АС-3 антитіл, що зв'язують конструкції мутантного ЕСО ГАС-3 із вставленими сегментами послідовностей щура, собаки або яванського макака. Нормалізоване зв'язування наведене у вигляді Ко мутанта/Ко дикого типу

Номер Сканована Мутантна Введені 1553 | 1543 | 1557 | 1501 Аналог химерної ділянка Пи ділянка Пи мутації від 2 1 2 1 25Е7- конструкції Гда-3 Гда-3 інших видів Ї ад3.5 ' АА23-32 | АА23-30 | 1235; 32 |88 55 05 |З

Ого; с дотк; п. 29. с

РЗОЗ о

РЗО5 с одн о 4 АА 38-47 | АА40-47 АаОУ; 39 | 98 ЗВ 05 |З он; с

Раб; с

ТА7Е о 5 АА43-52 | АА4б-БІ | РАБ; 27 | 38 58 105 |З

ТАТЕ ВЕ; с

ІБОН; с

ОБ. о

АА4В-57 | АА4В-оБ | 8 ІОН: 34 ЗВ ОБ 05 |14 о; с

І 5ЗР; о 554; я

Таблиця 5

БЕ 11 Її с7 АА 53-62 | ААБ3-60 | І5ЗР; 34 88 38 05 |14

БМ; с

І5БЕ; ос

АОС п. абому с

ААБВ-67 | ААБО-66 | АБОО; 27 |В ЗВ 05 | 13 вом; с

ОббА в ДГ

АА 63-72 АА 66-71 Об66бА; 3,9 0,4 1,1 0,7 1,3 а700;

РО

АА 68-77 АА 70-77 а700; 11 1,1 0,7 1,68 1,0

О710;

А745;

А75І;а77А 11 АА 73-82 АА 74-82 А745; 1,5 0,4 0,5 1,1

А?75БІ;

С77А;

Н7ІВІ;

Р790;

АВ;

РВ2гО 12 АА 78-87 | АА 78-87 | Н7ВІ; В. В.

Р790; о с

АВТ: с с

РВ2О; о с деіРВА-АВІ с с 13 АА83-92 | ААВАЯ2 | аеіРвЯ. | В. м 18

АВ7АВЯМІ С с вот; о с му92в о о 14 АА 88-97 | АА88-97 | АВМ; 5 КИ В вит с о мая с с везв; 111 о

Ран |. о вас с о7н и п во85; с

ТтооМ о 16 ААЗ8-107 | АА98-105 / НОВО; ва | яв 80780117 том; о. 51ІОЗМ; о. мод с

СТОБА І

0117. 18 АА 113-122 | АА 114-119 | 11140; 11 21

О1171;

РІ185;

ВІт9Нн

Таблиця 5

Зведення з аналізу афінності зв'язування для Бар фрагментів анти-І АС-3 антитіл, що зв'язують конструкції мутантного ЕСО ГАС-3 із вставленими сегментами послідовностей щура, собаки або яванського макака. Нормалізоване зв'язування наведене у вигляді Ко мутанта/Ко дикого типу 19 АА 118-127 | АА 118-127 | РІ1185; 0,5 б5 ав. вен; о рт; о

Е124К: о

В127Р о. 20. |ААТ23132 ААУ 023; БА 6800103 |З

Е1245; с ві; | 0

В127Р; с віт с девіз ії р131 п 21 АА 128-137 | АА 128-137 | О128Т; 47 58 8804 1,4 деїс1 30- с 131; с

ММ1ЗБА; с

В1370 о своя же ду вв

А142К 23 АА 143-152 | АА 148-152 | ВІ48Н; 25 35 | 58 20

АТБОЕ; о нНіБ2гА о 24 АА 148-156 | АА 148-154 | НІТа8Н; 26 106985 1,9 0,7

АБО; о нІі52в; о

В15аАР а.

АА 153-160 | ДА 154-158 | ВБР; т 8819 107

А1570; о

ІГ15В8Е о 26 АА 157-165 | АА 157-161 | А1570; 11 35 ЩО

І1БВЕ; о

В1615 п

От дв МІЙ ІМ 166 28 АА 83-92 АА 84-90 | РВАН; 48 | | 05 В. нев; с 90У о о Є БЮ ВВ 2 ЖХ1 5 кратназміна Ко,химерні мутанти.

Таблиця 6

Зведення з аналізу афінності зв'язування для Рар фрагментів анти-І АС-3 антитіл, що зв'язують сканованих точковими мутаціями ГАС-3 людини.

Нормалізоване зв'язування представляли у вигляді Ко мутанта/Ко дикого типу мутація Мо пи ГАС-3 25Е7-І аа3.5 7711 .| люз | 44 | ЗБ 8 1106 М 7793 | РІЗА | 38 | З ЗБ 1 06 | 72 74 | 5БА | 17 | 04 | 06 | 07 | 10

Таблиця 6

Нормалізоване зв'язування представляли у вигляді Ко мутанта/Ко дикого типу 1776 | ТАТА 1715 | 09 | 06 | 09 08 7271 РІЯА 17/17 ЗВ 08111 778 | ОМА | 09 | 07 | 06 1 08 08 7779 | рБ2А 17 ВС 36107 1.08 710 | 5ЩА | 07 | 05 | 07 | 08 | 08 71111171 БбА77171711 12 | 03 | 07 | 07 |ДЮЙюБ 08 712. .| ВА 17/11 | 06 | 08 | 07 .ДЮЙюБ оо 7713 | вВА 17708 | ї2 | 08 | 17 | Д НОб 7714. .| тва 11142 | 95В 0811106 113 715... | ОбА | 29 | ЗБ 38 1 06 | (13 7717... О6вА11127 |В 61107 14.08 7718 | РБУА 38 | 9580038 11106 1. 719 | оба 34 | 5365 381 06 | щДщ кК098 720. | АЗшЗ | 07 | 06 | 06 | 07 | 08 721... | Ам | 10 | 08 | 07 | 08 | Юющ ж 098 22 | АТЗ | 09 | 08 | 07 | 08 | 098 7.23 | РА | 10 | 07 | 06 | 08 | 098 7.24 | амтА | 10 | 07 | 07 | 08 | 170 725 | НУВА | 09 | 04 | 05 | 07 | 08 7.26 | РА | 09 | 04 | 04 | 06 | 08 727. | 8В0А 1706 | 05 | 06 | 08 ЮюДж 07 728 юю | АВІЗ | 06 | 06 | 06 | 08 | 07 7729 | РА | 10 | 10 | 08 | 09 | Ююж ж 098 7781 | РА 05 | 11 | 09 | 10 | 06 7732 | НА 701776 1 08 | 07 | 09 733 | РА бі 1 06 | 07 | 07 |юж щ2/ 734 | А ВУЗ 0096 10 | 09 | 10 а. | АВВЗ | 37 | 06 | 06 | 09 35 Фюж жКяІ 736 | РА 1425 3) 08 | 08 | 09 В 737 | в8ЮА | 06 | 09 | 08 | 09 | 10 738 | МА 538 | 07 | 07 | 08 | ще. 77407. 934.11 61108 | 106 41111111 РОМА 1/7 08 | 38106 | 07 .|ДЮюБиьл 08 7742 | ВеБА 17/37 | 19 1 06 М 07 1 19 743 | РА | 14 | З 381 06 | 0 7.44 | вВоА 1709 | 13 1 06 | 07 Дю 08 7.45 | ВВА 17716 | В 009 | 12 .ДЙБК 098 747 | плобА7 177 39 | 63611106 111712 511111 27А.17171 2 1 Би 08 7852 | СВА 710 | 03 | 04 | 05 1 09 753 | ШОЗА 1 | 10 | ї0 | 82 098 7.54 | ВПОА 09 | 09 | 06 | 958 08 855 | 8ІА | 10 | 08 | 07 | 84 098 1756 | сблгА | 10 | 05 | 05 | з | 098

Таблиця 6

Зведення з аналізу афінності зв'язування для Раб фрагментів анти-І АС-3 антитіл, що зв'язують сканованих точковими мутаціями ГАС-3 людини.

Нормалізоване зв'язування представляли у вигляді Ко мутанта/Ко дикого типу 757 | ВИЗА | 06 | 09 | 07 | 33 | 08 7759 | ОМА | 08 | 04 | 05 | 07 | 08 17760177 РИВА | 07 | 10 | 09 | 12 | 08 76117711 вАИА | 32 8 938106 | п 7762 |. ОА | 09 | 10 | 06 | 09 | 09 7763 17 о123А | 10 | 09 | 05 | 08 | 10 77.64 1 в А | 18 ЗВ 5808 | ли 765 ю|Др С ВАІ2БА | 09 | 11 | 71 | 11 | 098 7.66 | сібА | 09 | 09 | 09 | 09 | 09 767 | віА | 06 | 09 | 05 | 09 | 07 7768 р|Др ОА | 07 | 08 | 09 | 10 | 07 77769 | ВІЗА | 30 В 008107 | 12 1770.17....17рДр аіз0А | 44 В 038106 | їз 11171111 О13А ЇЇ 42361106 | 12 772......17.ю. 5ІЗЗА | 22 (ЗВ 8 1 06 | п 1773 1771 ВІЗА | 36 58081106 | 10 1775... |. ВІМА | 07 | 10 | 09 | 11 | 08 778...юЮю.|17юрюр р вІБА | 08 | 10 | 08 | 12 | 08 77779....17.7. 5ІБ9А | 07 | 09 | 03 | 07 | 08 780 | вВІбвЗА | 25 ЗВ 587 06 | 10 000 | «Б,кратназмінаКо,точковімутанти.їд//-/://::/ССС/:

Таблиця 7

Зведення зі зв'язувальних епітопів, які ідентифікували для тестованих анти-Ї ДИ-3 антитіл епітопів епітопи 131 88-105, 123- Нб5, 066, РБ7, Ю68, 193, РО4, РОб, НОВ, 137, 148-152 У89, Т100, М101, Р1Т1О6, 107, В119, Е124, 8129, 2130, 0131, 5133, А137, Р138,, 0143, 8148, 8163 98-105, 118- Нб5, 066, Рб7, О68, РОб, 99, Т100, М101, 137, 148-161 РІ106, 107, В119, Е124, 8129, 1130, 0131, 5133, 137, Р1І38,, 0143, Н148, Н163 аналог

Таблиця 8 5ЕО ІЮ МО послідовностей ДНК і білків МН, МІ, НСС 77171176 | 15532послідовнсть ДНКМ.ЙДГГ/://.СССССССССС777777777777777711111 77171178 | 155ЗапослідовністьбілкаМЇГ-/-:/ б: 77777771 77717179 | 1572Зпослідовнсть ДНКМН./Г/:К/СССССССС7777777777777777711111111111111

Таблиця 9 5ЕО ІЮ МО послідовностей ДНК і білка УН і Мі, і амінокислотних послідовностей

Н-СОН1-3 і Г-СОВ1-3 анти-І АС-3 антитіл тіло (ДНЮ (ДНК) (білок) (білок) сон сОоВ'!іСОоВ/!|СОоВ)сСОовВ/|сСОоВв 1 2 З 1 2 З 15532 | 5 | 6 | 7 | 8 | | 42| 43 | 44|5 15723 | 9 | 10 | 711 | 12 | 35 | 42 | 46 | 44 | 77 | « 15572 | 21 | 22 | 23 | 24 | 56 | 57 | 58 | 59 | 60 | 61 15011 | 25 | 26 | 27 | 28 | 62| 63 | 64 | 65 | 66 | 67

Таблиця 10

Визначальні комплементарність ділянки (СОК) анти-І АС-3 антитіл і походження генів зародкової лінії для антитіл, отриманих в ОМТ щурів антитіла

МЕМ

А

У ЇМ

Т АМу антитіла "Гени, що використовуються для гуманізації, див. приклад 2.

Список послідовностей

Послідовності ДНК і білка МН і МІ.

ЗЕО ІЮ МО:1 (15646 послідовність ДНК МН) сасатасластаса,аСсАасастассасатасссатстастаААасстСсТаАААСтоТа,атстотТад сттатассатстТАтаатТацпАТСАТТСсАаСвастАСТАТТаСТОСТОСАТСАСсОаСАаСооосСтТОась

САдасасстасАаа,атаавАтсааосАсаАТСААССАССасапасСтоТАССААСТАСААТОССТСТСТа

ААдсСАаасАа,асатаАССАТСТоСатТацпАСАСАТСТААЧЙААТСАСТТсАаСсСтаддастаАасСТоСа таАСССЯСсСаСтТаАТАСАа,ССа,ТатАСТАТТаСАСААХССЯСОСпАас,СсААтТасаАаТСАСТаТтТттстТтТ тТаАТТАСТОСОСОСаСАсСа,аааАСАСТасаТСАСсАатТСстоаАатТт

ЗЕО ІЮ МО:2 (15646 послідовність ДНК МІ) вАААТСОИЯТОоСстТаАССсСсАа тессоСсСасСсАсоставаассталасосСасАаААдАадасССсАССо татостасбадасСААдаССАаТоСАТтСАастосСтТАТСТОСССТасСтТАТСАаСАСАААССАавассА састоссосасастастаАтТстТАСса,ааСассСстоСААСАаДасСтТАСАааААтосСА,асоСа,асттсАа ссестоссастотаайСАСАСаАСТТТАСССТаАСААТСТСТАаСсСТасааостада,ааАттсасс астатАСТАТТАССАаСАсСАсСАТСТААТтТааССАСТОАСАТТССССССОСосСаСАСсАСсвСаватацАаА

ТСАДОа

ЗЕО ІЮ МО:З (15646 послідовність білка УН)

ОМОГ ООМ САС І КРОЗЕТІ 5І ТСАУМааЕЗаУМММІВОРРОКаИї ЕМО ЕІМНАавтмМУмМРБІ.

КЗАМТІЗМОТ5КМОЕ5І КІ 55УТААОТАУУУСТАСЕЕМЕБІ ЕЕОУУУСОСЄТІ МТУ

ЗЕО ІЮ МО:4 (15646 послідовність білка МІ)

ЕІМГТО5РАТІ 5І 5РОЕВАТІ 5СВАБОБІЗОЗМ АММООКРООАРАВ ІМ АЗМАВАТаІРАНЕЗОаБа

ЗаТОгТІ ТЗІ ЕРЕОЕАМУМСООВОММ РІ ТРОС ТАМБІК

ЗЕО ІЮ МО:5 (15532 послідовність ДНК МН)

САССТТсАаСсТасаасАаатассаСасСсвасстастаАдаАССАдасСаАсАсоСстаТатосста

АсАТаОСОССОТатТАТаСССЯАСАаСсТТотТоСвасТтАТТАСТасААСТОСАТоСВвИаСА,оСстосСОа аСАДсСсасстасаатавАтТоаасцпАпАТСААТСАСТОСИааСТоСАССААТТАСААСССАТОССТ вААДОаОтТотТосСастаАСААтТоАа,аСсатацпАТАСААаСААаАСсССАаттсАасстаАластаАастос атАСсАааСстасссаАТАССЯСсСсататАТТАСТаСОаССАсСАсастасоАсстастацАтТТасААТ вСАСТАСТОаАСААТОАСаТАСТОСССаСсСАсаааАсоСстаатаАсСатстосАатТ

ЗЕО ІЮ МО:6 (15532 послідовність ДНК МІ) сАдадтсатастаасСсСсАстосостассассстатттатсосстаасадаСсавасССАССС татостатдада,астсотоаа,атоса7ататстсстТАсСстаасттааТАСсСсАаСАпААаССАааАСА васССССААаАСсТастаАТСТАТаАСасСтТТоСААТСОСОЯЯасСТАССЯаСАТСОССАССТСИСТТТАсаС

Б асастоссастоСсааСАССОАСТТСАСССТаАСААтТсАаастосстасаасСАаАдааАТТтОаСс статАТТАСТатТсАаСАсСАаатоСААТТааССАСТаАСАТТТОсСОССсСаСпасСАСАААДСаТттадаА

ТСАДОа

ЗЕО ІЮ МО:7 (15532 послідовність білка УН)

ОМОГ ООМ САС І АРБЗЕТІ БІ ТСАММОЕЗЕБОМ УМ МУМІВОРРОКаИї ЕМО БІМНЗавтмМУмМРБІ К

ЗАМТІЗМОТЗКТОЕ5І КІ 5544 ТААОТАУУУСАВСМ І ОМ МОМУМЕУУУСОСТІ МТУ

ЗЕО ІЮ МО:8 (15532 послідовність білка МІ)

ЕІМГТО5РАТІ 5І 5РОЕВАТІ БСВАБОБЗУЗЗМІ АММООКРООАРА ІМОАЗМААТИа!РАНЕЗИО5 азатоеТТІЗЗІ ЕРЕОЕАУУМСООВЗМУУРІ ТРаССИТКУБЇІК

ЗЕО ІЮ МО:9 (15723 послідовність ДНК МН)

САССТІсАаСстасаасСсАаастассоасастаасстастаддассстотаАаАсостатстстахд сстатассатТатТАТОССООсССсАсССсТІотТоСаастАТТАСТОаСААСТааАтоСсасСсАаасоососса аСАДССсСОССТаСАа,атТасвАтТосвсасцАпАТСААССАСТОСасСтТоТАССААСТАСААТОСТТСТСТ вАДСТОоСАсСаатТаАСААтТоАа,аСатавАСАССАаСААСпААСсСАатттАасстаАдАластатсСАас стаАдсдастасСсаАТАСАааСсСсататАТТАСТасСассАааАлассвАасалтаасаасаАаАасСстТТо тПтаАТТАСТаСОСс!СоСАсСсапАсоСстТастаАсСса,тотса,аАат

ЗЕО Ю МО:10 (15723 послідовність ДНК МІ) сАдадтсатастаасСсСсАстосостассассстатсттатссстаассвсАХхаСсавассСАссс тадастатоссаасстосСсАаатосаталдастстТАсСстТаасттасайТАТСАССАаААдассАааАсСА сасссСАдаАСстТа|астаАТСстТАСсаССасСТСсСААТСОЯСОССАССсаасСсАТоСССассСАаАТТТТОС авесттвастосавасСсАСССАТТТСсАСССТОАСААтТоАХастосСстасаасСАаадсаАсттсасс статАСТАСТаСсСсАааСАсСАс,СатстТААтаасССАСТаАСАТ ТОССОаСсааСАССААдС,СТТаАсА

ТСАДОа

ЗЕО ІЮ МО:11 (15723 послідовність білка МН)

ОМОГ ООМ САС І КРОЗЕТІ 5І ТСАУМааЗЕБаУУММУМВОРРОаКаИа ЕМІСЕІМНЗавтмМимМРБІ.

КЗАМТІЗМОТЗКМОНГБІ КІ ББМТААОТАУУУСАВСЕОМСЕЗЕЕОУМУСОЮСТІ МТУ

ЗЕО ІЮ МО:12 (15723 послідовність білка МІ)

ЕІМГТО5РАТІ 5І 5РОЕВАТІ БСВАБОБЗУЗЗМУ АМУУООКРООАРА ПМААЗМААТИа!РАНЕЗО5 азатоеТТІЗЗІ ЕРЕОЕАУУМСООВЗМУУРІ ТРаССИТКУБЇІК

ЗЕО ІЮ МО:13 (15595 послідовність ДНК МН) сАсатсАасстаатасаатоСс,ассастаАсатаААаАдасставАастСстатаААваТтт сстТатАадааттоСаастТАТАаССтТаАССаАвАТСТСТАТИаСАСТОССОСТтАСссСаСАдасоооСась

СААСЬХОССТООСАСТОаАтТасасаасттадССсСАсасАавАтааСОАаАССАТСТАСастоАСАс атттслдаасавабабаТАТСАТаАССаАасАТАССАаСАССВАТАССаССтТАСАТОСАа,СТатос дасСстТаАаАтТоСаАдапАтТАсСсасССа,ататАТттАСТОаСОЯСстТАСТОСТОССТОСО,ДаССССААТТОИТ тЄаАТОСТОСОсСасСсСАа,асасосаАссстастаассатстоаАат

ЗЕО Ю МО:14 (15595 послідовність ДНК МІ) вАСАТССАСАТаАСАСАССТОТОСТТОоСТОТатаАла,асасстотаТатавассАсСасСаТаАССАТ

САСАТОССОЯСОЯСТТоССАсСССЯСАТоТСТОСТОСТЯаСттаатТАСсСАааСАасААаасссвасАА сассСССАДастастаатстТАТастассаласаасстасалатсассатасстоСАасатттАас авестосасстоСааСАССОаАСТТТАСАСТаАСААтТоАастооСстасалассСсвАаалдттТассА

ССТАТТАСТИАТСсАСаСАСасСсААТТССТТОССТТ ТТАСАТТсСаасССстааСАССААСОИТТаАТАТС

АдДС

ЗЕО ІЮ МО:15 (15595 послідовність білка МН)

ОМОЇ МОБІАЕУККРОАБУКУЗСКУВИМУ5І ТЕІЗМНУУВОАРОКаї ЕМ МасСЕОРЕРСЕТІМАОВ

ЕОСАМІМТЕОТЗТОТАММЕЇ 551 ВА5ЕОТАМУУСАТаСШХУаРМУЕОРУССОСТІ МТУ

ЗЕО ІЮ МО:16 (15595 послідовність білка МІ)

РПІОМТО5РОБУБЗАВУМИаОВМТІТСВАБОСІЗБЗУМ АМУУООКРОКАРКІ ІМААБЗБІ ОБаУРОВЕЗО5 сеБатТОвРТІ ТІ ОРЕОРАТУУСООАМЗЕРЕТРОРИТКМОІК

ЗЕО ІЮ МО:17 (15431 послідовність ДНК МН)

САССТІсАаСстТтасаасАастосасасоссасоСстастаААдасСсСАлдасСсАаАСосСстаТатстотад

СсАТОСЯССАТСТОССОССОСОАаСАИ,аСсататостсТААСТОСЯССОЯСТТааААТТасАтоСсаасАсто

ТоСАТССАСАСЬССТОСАСТОИОСсТапасСАСААССТАТТАССИаТтОСААИаТасаТАСААСС,АТТАТ соеататоСатаААаАаСАСААТСАССАТСААСССТаАТАССАаСААпААСсСсА,аттоАассСсТас асСстТаААТТоСИаИТаАССССАсСАсааАтТАСАаСсСа7татАТтТАСТаТаСстА,аасАСсАТаАТТацАА во таАдстСадттАстТаасассАааасаАсостаатадсАаатстсаАат

ЗЕО ІЮ МО:18 (15431 послідовність ДНК МІ) сАдадтсатастаАССсСАстосССАастТАСАСТОТОССТОТСоТОССОСаСсвСАаСасвассСсАсос таадастатАасАаастсосСсАстоса7ататстссСтТАТСТааСсТ,еаТАТСсАааСАпАдасСсСАааАСА саббССААДС,!СсТастаАТСТАСВАСассСтТоСААТАСАаССАССааСАТСССАаСТАСАТТТТСТ аа,ЙстосвастоСаасСАСССАТТТСАСАСТаАССАТСТОТАаСсСсТавАасССАаАааАтТтТа|аста

ТАТАТТАСТИССАсССАаа,аСасСсАасСААСстТааССССсТаАСАТТТаа,сСса,ааОсаСАССААасТТаАсАТ

САДОа

ЗЕО ІЮ МО:19 (15431 послідовність білка МН)

ОМОГ ОО5аРИЇ МКРБОТІ 5І ТСАІЗСТОБУЗЗМЗААМММІВОЗРЗВа ЕМ САТ УУАЗКУМУММОМ

АМ5УКОЗВІТІМРОТ5КМОЕ5І ОЇ МЗЕМТРЕОТАМУУУСАВОООМУМОгОМмУСОСТІ МТУ

ЗЕО ІЮ МО:20 (15431 послідовність білка МІ)

ЕІМГТО5РАТІ 5І 5РОЕВАТІ БСВАБОБЗУЗЗМУ АМУУООКРООАРА ПУВАЗМААТаІРАВЕбИа5 азатоеТТІЗЗІ ЕРЕОЕАУУМСООВЗМУУРІ ТРаССИТКУБЇІК

ЗЕО ІЮ МО:21 (15572 послідовність ДНК МН)

СсаластасластасаасАдаасаасососасостастаАласостталАссстаТатосстТад

СсАТОСАССОСЯТОАХаСсаасаАТТоСАТтсАХастоттоСАастАТТАСТОСВЯ,СТасСАТОоСсвеСсАасСо сссбааСААлсааоставсАаставАтТопасСАасСАТСТТСТАСТОСОааСААТАСАТАТТАТААТОСТТ

СстТотТаААдваАда,асСАаа,аааТаАСААтТСАаСатацпАТАССТОСААЧААТтСАатттАаССтТаАдАластаАа стосатаАСсАа,аСтТассцпАТАСАаССсСсаТтатАТТАСТаСЯСтТАасасАааАСсАТТоТаАССаАТ тТАТАССсСССОаСтТТТопАСсАТСТОСОСИ,оСАсСсацпАСААТтааТаАСАа,тСстосАатТ

ЗЕО ІЮ МО:22 (15572 послідовність ДНК МІ) вАТАТССАСАТаАСССАатСсТоСААасСАСсСсСс ТавАаСсассєьтатавсасавАтааатаАССА тТсАСАТОТСССОаСТТоТСАатТоСАТСАССАСОССТООССТООаСттааТтАТСАаСАСААаСССсасСАА сассСсСАддастастаАТСТАСААсСасстоттоСсАаасаАдсАаасСсасассатассСАтТоСсАаатттАас 285 авестосасстоСбааСАСсСсаАатТТтТАСССТОАССАТСТСОТтоСсСТаСсАаассСадтадстТассСА

ССТАСТАСТатТСсАаСАаТтАСААТТССТАТСТОАСАТТСССССОСОВСсСИ,ВаСАССААСаттаАпАТСААС

ЗЕО ІЮ МО:23 (15572 послідовність білка МН)

ОГО ОЕБаРИЇ МКРЗЕТІ БІ ТТ УЗОа05І5555У ММ СМІВОРРОаКаї ЕУЛавІєМамтимиМРБІ

КЗАМТІЗМОТ5КМОЕ5І КІ 55УТААОТАУУУСАВЕОВОБІ ТОМУСАРОМ аОСТМУТУ5о

Зо ЗЕО ІЮ МО:24 (15572 послідовність білка МІ)

РІОМТО5РБОТІ БАБМОаОАМТІТ СВАБОБІЗЗУМ АМУООКРИОКАРКИ ІМКАЗОЗЗЕЗОаУРЗАЕбИа5 аБаИатТЕНТТІЗБІ ОРООРАТУУСООМУМБУТРацваткМЕїКк

ЗЕО ІЮ МО:25 (15011 послідовність ДНК МН) саастасластастацпААтТоСа,асАасАаасАстаатоСАаасСАасатачАатосстасаАста з; дастассссастстаастСаАСТТАпАддастТАСасСААТаАТатТасатобасСАаасСАССАс впАДАСОСсСАСТасАатасатасаАвпавАТСААСа,стаААатоааТайсТСсТААТАСАТАСТАТО

СсАССТаССатТтСсАд,аасвАда,асвастТАСТАТТАИаТСсСацАСААСТСААААААТАСССТатАТСТасСАА

АТтТаААСсАатстада,асвсассвАааАТАсСассататАСТАТТаСОСТтаААдАасатаСтасасСасСАТас сасСАТСТатТААТаАСаАТАТТаАТасСсАТОСОСпАСАсавапАсоСстаатаАСА,атотса,Аат

ЗЕО ІЮ МО:26 (15011 послідовність ДНК МІ) даттТАТаАдасСстТаАСстсАаа,ааАссСА,САаататса,атсасоставасСАспАСАаТаАпААТСА сттасла,атасааСсТасгСАТАТИаОСАСаСТоСтТАСТАТТАСЯСАТтТааСАСсСсАаСАаААаСССва

АСАсСасАССТатаАСАаТСАТСТАСОСАСААСИ,АТААААааССААаСААТАТТСССОАССИаТТСТ ставатоСсАдастотаатТААСАсСсасстоссСтТаАасСсСАТТАСТОИССЯсСОоСсСсАаВоСстадасАСаААс

СтТаАТТАТТАСТаТааСТСТАСААДАСОСАТААТаАСаАтТассоскАста7аттаастоСапААСТАда аТСАССатосСтТА

ЗЕО ІЮ МО:27 (15011 послідовність білка МН)

ЕМО ГЕЗСОСИЇ МОРОСБІ ВІ ЗСААБИБЕОЕВЗУАММУ УВОАРОКаї ЕУУМаСІМСЕУМСИЗМТ МУ

АРАУКОаВАТІЗАОМОЗКМТІ М ОММ5І ВАЕОТАУУУСУКОАСАСИІСМОПІВАМССОСТІ МТУ

ЗЕО ІЮ МО:28 (15011 послідовність білка МІ)

ЗУЕГ ТООРАУБМАЇ СОТУВІТОЗОАлИаБУАИаБВУУМУСУНООКРИОаОАРУТМІМОМОКАРЗМІРОВЕ5 а5ОЗБОаМТАБІ ТІТаАОАЕОЕАрУУСсИаЗТМОоМрраа;и газатТкмМтмМІ.

Послідовності ДНК та білка константної ділянки

ЗЕО ІЮ МО:29 (послідовність ДНК константної ділянки ЧНО) есоСсСтТоСАССААДССССССАТСССТСоТТОоСсСССсТОаасСАСССТОоСТоСААдСсАасСАСсСсТоТасава вСАСАЛАсССсСОвсоостТтавастасстааСААдааАСТАСТТоСССадАссваталссвсататсатааА

АСсСТсАдсааСсассСстаАсСАаа,аСсассатасСАСАССТТОоССЯСЯССсТатосСтТАСсАатостоАасАСТОСТА стосстсАда,асаасатааталссатассстосдасаастасвасСАСССАСаАССТАСАТСТасААС аТаААТСАСААлаСССАаСААСАССААДаатацпАСААаАаАа ГТ ТаАаСССАААТСТТатаАСААдАА 60 СтТоСАСАСАТИСССАСсСсатТаСсССАсСАсСстадалассассавс,скасАссатсАатстостостос

ССССАДААСССААласпАСАСССТСАТОАТСТОССОСО4ГіАССССТОаАсСатТСАСсАТасатТаатастааА са,атадасСсАСадАааАссСстадааТСААатТСААСсТеаатАсатавАсассатацАастасСАТАА тасСсСсААДСАСАдАаасСсСсаСсасвад,цсАаСАатТАСААСАаасСАСсатАссататаатАасСИТостСАС са,атостТасАССсАаасаАСстааСстТадатаасСААдааАаТАСААдатасАдаа ТСсТоСААСАААасссто

ССАаСССССАТСОСАЧААААССАТСТССАААасСсСААдАдсаасаасссстАаААССАСАаИ ТатАСА состТассосССАТоССОСсСаАдапАаАТалдСсСААаААССАсИа тсдасстаадсстаТасстастСАААс еСсТстТАТСССАССаАСАТСЯСССЯТОаСсСАаатасадаАасСААтТасасАаССацпАпААСААСТАСА

АдаАссАсасстоссатастасАстСсадсаасТсстСсТоСТСстТАТАаСАдастоАССсатааА

СААССКССАСССТОССАаСАаасаААСатсТсТсАТастТосатаадтасСсАтТаАа,СстСстТасСАСААС 1) СсСАСТАСАСОаСАаААсаАаасстотосстаТатоосСаааТААА

ЗЕО ІЮ МО:30 (послідовність білка константної ділянки ІЧНС)

АЗТКОаРБМЕРІ АРІБКОТЗСОаСТААГаСІ МКОМЕРЕРУТУБМ МЗСОАЇ ТЗаУНТЕРАМІ О550І1 5.

ЗМУ ГУРБЗБЗІ ТО ТМІСМУМНКРОМТКУМОКАМЕРКЗСОКТНТСРРОРАРЕААДСИОРБЗУГРІ ЕРРКРКО

ТЕМІЗАТРЕУТСУММОУМЗНЕОРЕУКЕММ УМО МЕМНМАКТКРАЕЕОУМЗТУВУМУМІ ТМІ НОБУМІ М

ЯКЕМКОСКМУ5МКАЇ РАРІЕКТІЗКАКОИОРАЕРОМУМТІ РРОВЕЕМТКМОМУ5І ТСІ УКЕЕМРЗОІАМЕМЕЗ

МаоРЕММУКТТРРМІ О5ООаЗЕРІ ЗК ТМОКЗАМОСОаММЕЗСЗУМНЕАІ НМНУТОКОБІ 5І РОК

ЗЕО ІЮ МО:31 (послідовність ДНК константної ділянки Ід.) сассАдассСсААлдаасССААССССАСсТатсАсттатсссеасосстосттадааАдасСТССАДИа

ССААСААдаасССАСАСТАатататотадтАаатаАдстстТАссСсоса!пАХастатаАдсАа,стаасста аддааСсАаАтТааСАаоСССаТСААлааСсасасатапАаАССАССАААСССТОСАААСАаласАА

СсСААСААСТАСОЯСОСасСАасасСАастАассталассталсасссвАаасСсАаа тапААаТСССАСАСАДаИ

СстТАСАССТаССАСИатСАСасСсАТаААааацсАасСАсСатасАаААдадсАаа ТтапйссССтТАСАСААТа

ТТСА

ЗЕО ІЮ МО:32 (послідовність білка константної ділянки Іді С)

СОРКАМРТМТІ ЕРРРЗБЗЕБЕЇ ОАМКАТІ УСІ ІЗОЕМРЕАМТМАМУКАразРУКАСМЕТТКРОКОВММ

КМААБ5ЗМІ Б. ТРЕОМКЗНАЗУЗСОМТНЕСЗТМЕКТМАРТЕСО

ЗЕО ІЮ МО:33 (послідовність ДНК константної ділянки ДКС) сатаса,аатаастасСАССАТСТаТСТТСсАТСТТСоССасССАТСТОАТтаАдаСАСТТОаАААТСТОаС

ААСТаССТОТОТТатТатассСстастаААТААСТТСТАТОССАСАсСАсааССАААдатАСАатацпААса зо тТааАТААСаСССТоСААтТовастТААСТоОССАаасАвАаТаТСсАСАЧпАааСАааАСАаСААааАсСА

ВсСАССТАСАЛАСаССТоАааСАаСАСсСстадсастаАасСАААаСАаАСТАСаАаАААСАСАдАаИТтстА сасстасапАдатСАСССАТСАСЯСсОоСсТвАаСстоассСатСсАСААдадасСТТСсААСАасвсИасАаА стат

ЗЕО ІЮ МО:34 (послідовність білка константної ділянки ІЗКС)

АТУМААРБЗУРІЕРРБЗОЕОЇ КЗатАБУМСЇ І ММЕМРАЕАКМОМКМОМАГ ОБОаМЗОЕЗУТЕООБКО

ТУБІ З5ТІ ТІ ЗКАОМЕКНКУМАСЕМУТНОІ 55РУТКОЗЕМНИаЕС

ЗЕО ІЮ МО:35 (15646/15723 Н-СОВІ1) савЕБахму

ЗЕО ІЮ МО:36 (15646 Н-СОН2г)

Ічмнвавзт

ЗЕО ІЮ МО:37 (15646 Н-СОВЗ)

СТВАВОаЕЄЕМЕ5БІ ЕРОУМУ

ЗЕО ІЮ МО:38 (15646 І -СОВІ1)

О5ІЗБУ

ЗЕО ІЮ МО:39 (15646 І - СОН)

А

ЗЕО ІЮ МО:40 (15646/15532/15723/15431 І -СОВЗ)

СООВБММ/РІТЕ

ЗЕО ІЮ МО:41 (15532 Н-СОВІ1)

СЕБЕБОМУ

ЗЕО ІЮ МО:42 (15532/15723 Н-СОН2)

ІМмнБазт

ЗЕО ІЮ МО:43 (15532 Н-СОВЗ)

САВСМ ОГП ОМ МОМ МЕМУУ

ЗЕО ІЮ МО:44 (15532/15723/154311-СОВ1)

Оо5БУ5БУ

ЗЕО ІЮ МО:45 (15532/15431 І -7О82) рда

ЗЕО ІЮ МО:46 (15723 Н-СОВЗ) 60 САВСЕОМСЕЗЕБОМУУ

ЗЕО ІЮ МО:47 (15723/15595 І -СО82)

АА5

ЗЕО ІЮ МО:48 (15595 Н-СОВІ1)

СУБІ ТЕ

ЗЕО ІЮ МО:49 (15595 Н-СОНВ2)

ЕОРЕОСЕТ

ЗЕО ІЮ МО:50 (15595 Н-СОВЗ)

САТаСУаРМУУБОРМУ

ЗЕО ІО МО:51 (15595 І -СОВІ1)

ОСІЗБМУ

ЗЕО ІЮ МО:52 (15595 І -СОВЗ)

СООАМ5ЕРЕТЕ

ЗЕО ІЮ МО:53 (15431 Н-СОВІ1) вО5У55М5А

ЗЕО ІЮ МО:54 (15431 Н-СОНВ2)

ТУУВБКУУ

ЗЕО ІЮ МО:55 (15431 Н-СОВЗ)

САВОООММОБОММУ

ЗЕО ІЮ МО:56 (15572 Н-СОВІ1) 0515555 У

ЗЕО ІЮ МО:57 (15572 Н-СОНВ2)

ІРУБОМТ

ЗЕО ІЮ МО:58 (15572 Н-СОВЗ)

САВЕООРГТОУМСАЕОІМУ

ЗЕО ІЮ МО:59 (15572 І-СОВІ1)

ОБІБОМУ

ЗЕО ІЮ МО:60 (15572 І1-СОНВ2)

КА5

ЗЕО ІЮ МО:61 (15572 І-СОВЗ)

СсООУМ5У ТЕ

ЗЕО ІЮ МО:62 (15011 Н-СОВІ1)

СЕРОГВ5УА

ЗЕО ІЮ МО:63 (15011 Н-СОВ2)

ІМаєЕУСсазмМтТ

ЗЕО ІЮ МО:64 (15011 Н-СОВЗ)

СУКОАСАССІСМОПІОСАМ

ЗЕО ІО МО:65 (15011 І-СОВІ1) аБУдаву

ЗЕО ІЮ МО:66 (15011 І-СОВ2) рмМмо

ЗЕО ІЮ МО:67 (15011 І-СОВЗ) сазтМмоМмрораа г

ЗЕО ІЮ МО:68 (І АС-3 людини)

МУ/ЕАОН Иап ГОРІ МУМАРУКР ОРОАЕМРУМУМАОЕСАРАОІ РОБРТІРІ О0І БІГ АВВАСМТМ

ОНОРОБОаРРАДАРОНРІ АРаРНРААРБЗБУОРАРАВУТМІ БМОаРОСІ АБОВІ Р ОРАМОГ ОЕНОВО

ВООЕБІ МІ АРАВВАСАСЕУВААМНІ НОВА СВІ ВІ ВІ ОАЗМТАБРРОИбБІ ВАБОМ/МІІ МОЗЕЗА Р

ОАРАБУНМРЕАМАСОСАУРУВЕ5РНННІ АЕБРІ РЕГРОУМЗРМОЗОРУУССІ ТУВОСЕМУБІМУМІТМІ.

СГЕРРТРІ ЛУУАВАСЗАМИІ РСВІ РАСМОатА5БРІ ТАКМУТРРОСОаРОГІ УТаОМОаОгТІАГЕОМБОА

ОАДСТУТСНІНІ ОБООІ МАТМТІ АПТУТРК5БРОаЗРОБІ ОК СЕМТРУИБСООЕВЕММУЗ5І ОТРБООВОЕБ аРМГЕАОЕАОЇ ЇЇ 5ЗОРМОСОЇ МОСЕВІ І СААМУЄТЕЇ 5БРИАДОВНЗаВАРСАЇ РАСНІ І ЕП ОМІ БІ.

ПІМТОаАРСЕНІ М/АВОМАРАВЕЗАЇ ЕОСІНРРОАОБКІЕЕЇ ЕОЕРЕРЕРЕРЕРЕРЕРЕРЕРЕОЇІ.

ЗЕО ІО МО:69 (І АС-3 яванського макака)

МУ/ЕАОН СГРГОРІ МИУМАРУИКРРОРСОАЕБІЗМУМАОЕСАРАОІ РСОБ5РТІРГОВІ БІ І ВВС

НОРОБаРРАХАРЕНРРУРОНАРААРУБУМСРАРАВУТМІ БМОРОСІ АБОВІ Р ОРАМОГОЕНО ВО

ВарЕБІМІ АВРАВВАВАСЕМУВАТУНІ ВОВАЇ ЗСВІ ВІ ВМАОАЗМТАБРРаИабвІ АТЗОМУМІІ МОЗЕЗАР

ОАВРАБУНМЕВЗВИаСавВУРМОСЗРНННІ АЕЗРІ РІГ РНУМаРМО5ЗСГ Мас тиврагєммивІМУМІтМІ.

СГЕРАТРІ ЛМУУДСАСЗАМЕЇ РОВІ РРАМаТО5РІЇ ТАКМАРРОСОРОЇ ЇЇ МАСОМООБТІ ВГЕОУБОА

ОАДСТМІСНІВ ОСООЇ МАТМТІ АПТУТРКБРОБРИаБІ СК СЕМТРАБСООЕНЕММУ5РІ МТРІОВЗЕБ

СРУЛ ЕАОЕАЛОГ І БОРУМОСОЇ НОСЕВІ І СААМУЕТЕЇ 55РИАДОВНБЗавВАРСАЇ ВАСНІ РІ ЕП ОМІ РІ 600 ПМТаАРСЕНІ М/АВОМ/АРАВЕ5ЗАГЕОСІНРРОАОБКІЕЕЇ ЕОЕРЕГЕРЕРЕЇГ ЕВЕ ЯРЕРЕРОРЕР

ЕРЕОГ.

ЗЕО ІЮ МО:70 (І АИ-3 щура)

МАООГРОГ ОМ ЕАРУУЗЗаРОКЕЇ ЗБМУМАОБЕСАРУНІ РОБІ ЕЕРН ОРМЕГ А ВОМ МП

ОНАРОБОРОРАБІРА ОЇ ОСМРЗОТАВАВНРРНАУТМІ БМАРОСІ Аа ВОРІЇ ЗНМОЇ ЕК РОВОаОЕ5

ГМГАРАТАКОАСЕМНАЕМВІ РОВОЕЗСО5І ВІ АМЕОАЗМІАЗРРОТІ КРОВУМУМІ МСЗЕЗА!АРОВРУБЗМ

НУРОСОБАУРУНМ5РАНМІ АЕЗЕП ЇЇ РОМОРІ ОС ТУ,аСМІ ТУАрагмМммвіІг МІ кМОаГЕРМАРІ Т

МУААЕгСЗВАМЕЇ РСНІ РРУМаТРБІ ПАКУТРРИаСОаРЕЇ РУТаКЗОМЕТІ ОЇ ЕМУМаВАСАаИТМТО5ІН

ГОС,ВОЇ ЗААМТІ АМІТМТРКО5ЕРСЇ РаЗРОКІ ЇЇ СЕМУРАБОЕСАВЕММ АРІ 50І З5А55І С РМІ ЕГОЄБАКІ

ГАЕОУМОСОЇ МЕСОКИ САТММТАЕЗБЗЗСОАМУЗАКВІЗИаОІ КОаСНІ РІ ЗП САГАГЕ ГТ УТаАваТагнім

ВАВРОЇГ ААРЕЗАГЕНИвРРРУМОЗКІЕЄЕЕЄ ЕВЕРЕТЕМЕРЕТЕРОРЕРОРЕРЕГЕРЕБЗНОЇ.

ЗЕО І МО:71 (І АИ-3 собаки)

МУМУЕМОР М ОЇ М МАРУААРИЗИатТЕМОМУМАОЕСАРМОЇ РОБРТІР ОБУ АМАСМУ ГУМУ

НГЕРЕБОаРААРАЇ 5І ВРААРБАВИРОЕРАБЗУУМІ МААРССІ АЗІЇ МРТУМАЇГ АЇ М5РОРТАЕБІ АГОТМІ

ЗІ РНЗУ/Л ЕРЕРБЗБІ РООРІ АБСМУУРЗРНУСМУССУСЕНРРРЕЇНІ ТІ РАВО5РІЇ РІ РБІ ОРОСЗАБІ.

МІ БІ ЗА5ОТІ АБ5ЕРОЇ ЕРБОаРІ ТУУТадИавзАМаї РОВІ РРОМаАТО5ЕЇ ТАКУТРРОСОРОЇ І МАС ОО

СМЕТ ОГЕУММОАОАСИ ТУТ СНІНІ ОСООЇІ ЗТТМТІ АМІТУТРКЗБаЇ РОМІ ВК Г СЕМТРАБИОЕВЕМ

М/5РІ ОКОМ ВИаЗРОРОСЇ ЕМОЕТАВІ І ЗОРМУОСНУМОАЕВІ І ЯТАУМ ІПРАСРОАЗОВНЗИВАССМІ К

ТанНІБІ СИ ЕС МТаАРСРОЇ МАВОМАРАВЕЗАГЕЇ ТНРРОАОБЗКІСЕЇ ЕОЕРЕЇ ЕГЕРЕРЕ

ГЕРЕРЕРЕ

ЗЕО ІЮ МО:72 (миші Г АС-3)

МАЕ ЯР СІ М ЕАРУМ5БЗаРОКЕЇ РУММАОЕСАРУНІ РОЗІ КОРМІ ОРМЕ вам

НОРОБООРТРІРАГОЇ НОСМРОРВОРАРОЕВУТМІ БМАРССІ ВЗаВОРІ НРНМОЇ ЕЕНИГ ОВИаОЕБІ.

МІ АРА АТОАСЕМУНАТУВІ РМААЇ 5С5І ВІ АМООАЗМІАЗРБОМІ КІ БОМУМІ І МОЗЕЗАРОВРУБУН

МРОСОМАУРУМУМЗРАНЕГАЕЄЕТЕ ПІ РОМ5РІ ОЗБСТУаСМІ ТУАВрагмМуУвіІ МКМ СГЕРМАРІ ТУ

УААЕСЗАМЕЇ РСНІ РРОМатТРБОІ ПАКУТРРаСОаРЕЇ РУДИКЗОИМЕТІ НІ ЕАМаГ АОдИаИтмТо5ІНІ

ОСООІ МАТМТІ АМІТУТРКБ5ЕРОЇ РаЗВОКІ ЇЇ СЕМТРАБИОКЕВЕММ/ АРІ ММІ БАЗСРОРМІ ЕІОЕАВІ

АЕВУМОСОЇ ХМЕСОВІИЇ САТУМААЕЗЗЗСИАНЗАВНІЗИОарІ КОСНІ МІ МОП СА БІ Р І МАСА, ЕНУУМ

АКОПІ АВЕЗАГЕНСИЇОРЕРАОВКІЕЕГ ЕВЕГЕТЕМЕОЕРЕРЕРЕРОГ ЕРЕРНВОЇ..

Claims

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Анти-І АС-3 антитіло або його антигензв'язувальна частина, де зазначене антитіло містить амінокислотні послідовності Н-СОВ1-3 і Г-СОВ1-3 5ЕО ІЮ МО: 41, 42, 43, 44, 45 і 40, відповідно.

2. Анти-І АДС-3 антитіло або його антигензв'язувальна частина, де зазначене антитіло містить варіабельний домен важкого ланцюга і варіабельний домен легкого ланцюга з амінокислотними послідовностями 5ЕО ІЮ МО: 7 і 8, відповідно.

3. Анти-І АО-3 антитіло за п. 1 або 2, де антитіло належить до ізотипу до.

4. Анти-І ДО-3 антитіло за п. 3, де антитіло належить до підкласу Ідс1 ізотипу до.

5. Анти-І АС-3 антитіло за п. 3, де антитіло містить щонайменше одну мутацію в Ес-ділянці.

6. Анти-ЇАС-3 антитіло за п. 5, де (1) антитіло являє собою ІдС1, і один або обидва амінокислотні залишки в положеннях 234 і 235 мутовані з І еи в АЇа; або (2) антитіло являє собою Ідся4, і амінокислотний залишок у положенні 228 мутований з Зег в Рго.

7. Анти-І ДО-3 антитіло або антигензв'язувальна частина за будь-яким із пп. 1-6, де антитіло або антигензв'язувальна частина має щонайменше одну властивість, вибрану з таких: а) у концентрації 20 мкг/мл знижує зв'язування І АОС-3 людини з МНС класу ІЇ людини на клітинах АЗ75 більше ніж на 85 95 порівняно з антитілом негативного контролю, як визначено конкурентним аналізом на основі проточної цитометрії; р) у концентрації 20 мкг/мл знижує зв'язування І АС-3 людини з МНС класу ІІ людини на клітинах АЗ75 до 35-85 95 порівняно з антитілом негативного контролю, як визначено конкурентним аналізом на основі проточної цитометрії; с) блокує зв'язування між ГАС-3 людини, що експресується на клітинах Уигкаї, і МНС класу ІЇ людини, що експресується на клітинах Каїї; а) зв'язується з | АС-3 людини при ЕСзо 0,1 нМ або менше, як виміряно проточною цитометрією; е) зв'язується з ГАС-3 яванського макака при ЕСво 0,3 нМ або менше, як виміряно проточною цитометрією; Ї) зв'язується з ГАС-3 людини при Ко 3,0х109 М або менше, як виміряно поверхневим плазмонним резонансом; 9) зв'язується з ГАС-3 яванського макака при Ко 1,5х107 М або менше, як виміряно поверхневим плазмонним резонансом;

М) зв'язується з | АС-3 миші при Ко 3,5х109 М або менше, як виміряно поверхневим плазмонним резонансом; ї) стимулює продукцію ІЇ-2 у мононуклеарних клітинах периферичної крові людини (РВМО), оброблених стафілококовим ентеротоксином В (ЗЕВ); |) знижує клітинні рівні ГАС-3 в Т-клітинах людини; К) знижує розчинні рівні ГАС-3 у культурі Т-клітин людини; І) індукує регресію пухлинного росту /и м/мо; т) затримує пухлинний ріст /и умо і п) не зв'язується з тим самим епітопом ГАС-3 людини, що і антитіло 25Е7-І ад3.5.

8. Анти-І АО-3 антитіло, яке містить важкий ланцюг з амінокислотними послідовностями ЗЕО ІЮ МО: 7 і 30 і легкий ланцюг з амінокислотними послідовностями ЗЕО ІЮ МО: 8 і 34.

9. Фармацевтична композиція, яка містить анти-І АС-3 антитіло або його антигензв'язувальну частину за будь-яким із пп. 1-8 і фармацевтично прийнятний ексципієнт.

10. Виділена молекула нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує важкий ланцюг або його антигензв'язувальну частину, або нуклеотидну послідовність, яка кодує легкий ланцюг або його антигензв'язувальну частину, або обидва ланцюги, анти-І АС-3 антитіла або антигензв'язувальної частини за будь-яким із пп. 1-8.

11. Вектор, який містить виділену молекулу нуклеїнової кислоти за п. 10, де зазначений вектор додатково містить послідовність, яка контролює експресію.

12. Клітина-хазяїн, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує важкий ланцюг або його антигензв'язувальну частину, і нуклеотидну послідовність, яка кодує легкий ланцюг або його антигензв'язувальну частину, анти-І АС-3 антитіла або антигензв'язувальної частини за будь- яким із пп. 1-8.

13. Спосіб одержання анти-ІЇАсС-3 антитіла або його антигензв'язувальної частини, який передбачає надання клітини-хазяїна за п. 12, культивування зазначеної клітини-хазяїна в умовах, придатних для експресії антитіла або частини, і виділення отриманого антитіла або частини.

14. Спосіб лікування пацієнта з пов'язаним з ГАС-3 порушенням, який передбачає введення зазначеному пацієнту анти-І АС-3 антитіла або антигензв'язувальної частини за будь-яким із пп. Зо 1-8 або фармацевтичної композиції за п. 9.

15. Спосіб лікування злоякісної пухлини у пацієнта, який передбачає введення зазначеному пацієнту антитіла або антигензв'язувальної частини за будь-яким із пп. 1-8 або фармацевтичної композиції за п. 9.

16. Спосіб за п. 15, де злоякісна пухлина походить із тканини, вибраної із групи, що складається зі шкіри, легені, кишечнику, товстої кишки, яєчника, головного мозку, передміхурової залози, нирки, м'яких тканин, гематопоетичної системи, голови і шиї, печінки, сечового міхура, молочної залози, шлунка, матки і підшлункової залози.

17. Спосіб за п. 15, де злоякісна пухлина являє собою фібросаркому, недрібноклітинний рак легенів, меланому, гліобластому, гліосаркому або рак товстої кишки.

18. Спосіб посилення імунітету у пацієнта, який цього потребує, що передбачає введення зазначеному пацієнту анти-І АС-3 антитіла або антигензв'язувальної частини за будь-яким із пп. 1-8 або фармацевтичної композиції за п. 9.

19. Спосіб за будь-яким із пп. 14-18, який додатково передбачає введення пацієнту імуностимулювального засобу, вакцини, хіміотерапевтичного засобу, антинеопластичного засобу, антиангіогенного засобу, інгібітора тирозинкінази, інгібітора шляху ГАС-3 або променевої терапії.

20. Спосіб за будь-яким із пп. 14-18, який додатково передбачає введення пацієнту сполуки, вибраної із групи, яка складається з ретиноєвої кислоти, фенілбутирату, повністю транс- ретиноєвої кислоти і активної форми вітаміну 0.

21. Застосування анти-І АС-3 антитіла або антигензв'язувальної частини за будь-яким із пп. 1-8 для виготовлення лікарського засобу для: а) лікування пацієнта із пов'язаним з ГАС-3 порушенням; р) лікування злоякісної пухлини у пацієнта або с) посилення імунітету у пацієнта, який цього потребує.

, х ж ! Сканування лунок (1) 4 РО і синглети зв й с І ЕН че ! Гвания ї ї Ж сови 7 І кої КО : ! ій Нет Кей щи і 1 Усик, оди ре совок п Ж - ЖЕО ов они ря ' УНН зи 00.1 МИ: 1 г ж й г, комах су МЮЮ З і ' Ж | КТ ОЕМ і т їх її ' «іх зак Обя ле. ' КУ | з рт ХЕ " - і ; бе З

ФуК. 1А і . і і х. х : Н - Сканування лунок (1) «4 КОЗ і синглети зе ! ї | 1 . | . І чи і ко Н Н У їх , . Я , Ки : х Ки 5 4 Ї дню я : ще боях щу хх 4 , і З ! ЛЬ о, тиж, і Н Ж овал; ТНК прое т хви Сини ий ї ; ша сту Оу їх. -ї Ї бю ІК опа; | 3

Фо. Мак их ов ОА Е ее и и У і і : і А Мету и є і і Жов ит и пи і !

ЩО . : й ру ЕН. ж и ши ве ї що і Е : і ку ї | і -к ї , | і Шо о : - Ї . : тт | | ! ї і | ! : : ай ! 4 | 7 і ! 1 і : : ' те ї ; я і у . Я книжні ! СНО ПАС ГОНО-Ь контроль | іш : ЕТ нн !

Р. преевненнанрввя ну ееввкевеаьфесв нирки реюннньяї 8 х и 4 5 з т І т т не т т ча? ее я) СЕБЕ (ЕН ! І «ФІГ. їв

Сканування лунок (1) 4 М'2 і синглети їн 47 няття еттеттрттюртетр терте отрут юл пт- ор ши бо ' 10 ї і З жо ; Ми ов | | | : о А ОО ЕииаЯ лля, і РО у. па

Ж о. НА. : во 1 ід» УА: Як і Оля ЕН ' Я і оз ІД Є ух І ОЖ оз ро ПЕ і т буки и М, ЩІ їв З я | : : , ! Ж Е : ет У ат ши бля ГОНО-5 пе АВ-З 1 1 СНО-5 юнтроль ! У - зання фон рняйня че Ж деовинні зн ! зо? че т й ки Не та з СЕЗЕ (ЕН)

Фіг. с Репертуар Репертуар са курки Отпікаї дрова тт пня ритятнтятнятиттяяяжитятятятятят тя тт тт пашЦІИ Днапог 25ЕТ-1.893.5 о 480 І ше чи ціВ

ФІГ. 7 я . , птн ж з е по о и - те М шк " ке т т ? " ч -ш ОЇ). ж ж з сх, с я к Б.Я кю що а і т М з. - те о т мох тв я з Ф -- я к же. ЩЕ ЕЕ о ке ж --ко... ФО ОД те вані зводити пр рн жея няно Пі. А її (з Б.Я т що х я , --- а з ж жом . х ово з пізоях : : : : -- т СЯ хо оф г зх з УААН Ко «ЕЕ -е ки я м Щі ді - - - ий й Ф я Ку М о Ко ши я ше У кА З ак що й «оУ

ФІГ. З ЗО - сен пад наг, контролю о ОяО а 0 Анапог25Р7-мад3 5 ї5 су "ку ж др -е- 185646 5079 Я сяк 45832 ден с й до шт БВ с ; -- 15595 Ж 5 АЮ я я, « ВИНИК сс сфтолв тя Тіні 5АЗЯ ЕЕ -іке 15579 т 50 ЗЕ же ЗБОЇ 0 0,001 дО 04 1 10 т Концентрація антитіла (мкг мл)

г. 4

КУ бе |і осо ння В ння се і дп Ж ж Зх пе га 1063 т а р ж х 5 - т ш Е що - ВЕ во ж 850 ос Ж ВЕ ш- ЛО збо ЕХ: З щі о ши 5 о у в ю Янв? У ко о ваш -Яї г щи ся ак Я КЗ Кк є КЕ ся ю К «Фо и? в А не ех зі ОсЯ м и ху по с щу ще 5 «й т КЗ С Є т У я

Ір. 5 БЗа!М, фібросаркома АЗБ-ХМУ, легеня за00 ати ШИ УК ит ню ПпПЕИИМЬЙИМНИТ І ДИНИ ТИЙ ж Фо Еш теза КЯ пе ся ЗЕ еВ пеня Я ПЕН ТМ жо и що бо по Е не я е ае Я ш чю пи х 0 Х 5 пи и Що пкнАА-НАЇ З о п вк а 1 В фія Ин ВІ нн ДАМ ннннннтння З 30 то зи 40 Й 5 1 15 20 Доба після інокуляції пухлини Доба після інокуляції пухлини ФІЖК. 5 Ксенотрансппантат АЗ75 меланоми людини ВО спосте Я пох строю пф в отит о що пт, Носій шах 0005 до | жк КАСІ Е РОКУ - зво о -- РОК Ж РО ОБООе ев Кв РО кЕоон Кия пе ДИУ сок вт АКЯ шою 5005 Ж ши З РО подо овя т 2 ЩО о И Ї ж ж РОШЕН КИ КИИКИИ / СПИНКИ ПК ПЕК ЖК де РОСшО ее ; Мово Кв о ж Ен вин Боно А о ТЕ ща РО ОДН есе М ДЕ ЕК я бою и Вк в. А я ЗЕ оролтлттутннннннння 0 НК АКА а в я 2008 й 53820 Доба після інокуляції пухлини Доба після інокуляції пухлини РВМС донор З РОМЕО донор 7

ІТ. т

ГРУПА 7 ГРУПА З пеня Ов ще зу паБита ЕК ТРУПА є ІРУпАА ЗК Ж со сова і і бій. ця Нефункціональні Б ще ' тА туп! х ! нн кі х я й є вача Сова ху ЛЕМАЮ з но и Ким, З ГРУП АЗ 15035 (ОХ : я 0 ХО ЛЕБЯА пе НААН сто ев У, ГРУПА Є і ВЕД пт жу : що «МЕТ Ех ОМА о ту 1БКВОЯ Щ АББАЗ З тт рН Ж ПяБА ВИ: к ГРУДАСЕ М я " » ч с сих ке за ще Є ай. деюошкю ак Мая щі) ГРУПА 4

ФІГ. 8

15723 (38) нн НЄ ФАЕТТАСЗ В о енвинх 15553 Кл птенюнтееетететенттетененння ЗБНВА ГБ) 15445 (70) 15491 (84) ШИ ВИН (8 1897 рення БУ (ВИ ПЕС ооо ее ДРОВ В рі е ет еееечя, 238 85 18 17 14 19 10 07 05 05 00

ФІГ. З