ES2825576T3 - Neutralización de rutas inhibidoras en linfocitos - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo que neutraliza NKG2A humano para uso en el tratamiento de un cáncer en un paciente humano, comprendiendo el tratamiento administrar al paciente una cantidad eficaz de cada uno de: (a) un anticuerpo que neutraliza NKG2A humano, y (b) un anticuerpo que neutraliza PD-L1 humano.

Description

DESCRIPCIÓN
Neutralización de rutas inhibidoras en linfocitos
Esta invención se refiere al uso combinado de agentes neutralizantes de NKG2A y agentes neutralizantes de PD-1 para el tratamiento del cáncer.
Antecedentes de la invención
La actividad de las células NK está regulada por un mecanismo complejo que implica señales tanto activadoras como inhibidoras. Se han identificado varios receptores distintos específicos de NK que desempeñan un papel importante en el reconocimiento mediado por células NK y la destrucción de células diana deficientes en HLA de clase I. Receptores de citotoxicidad natural (NCR, por sus siglas en inglés) se refiere a una clase de proteínas receptoras activadoras, y a los genes que las expresan, que se expresan específicamente en las células NK. Ejemplos de NCRs incluyen NKp30, NKp44 y NKp46 (véase, por ejemplo, Lanier (2001) Nat Immunol 2:23-27, Pende et al. (1999) J. Exp. Med. 190:1505-1516, Cantoni et al. (1999) J. Exp. Med. 189:787-796, Sivori et al. (1997) J. Exp. Med. 186:1129-1136, Pessino et al. (1998) J. Exp. Med. 188(5):953-60; Mandelboim et al. (2001) Nature 409:1055-1060). Estos receptores son miembros de la superfamilia de Ig y su reticulación, inducida por AcMos específicos, conduce a una fuerte activación de las células NK que da lugar a un aumento de los niveles de Ca++ intracelular, desencadenando citotoxicidad y liberación de linfocinas, y una activación de la citotoxicidad de las NKs contra muchos tipos de células diana.
CD94/NKG2A es un receptor inhibidor que se encuentra en subconjuntos de linfocitos. CD94/NKG2A restringe la liberación de citocinas y las respuestas citotóxicas de ciertos linfocitos frente a células que expresan el ligando de CD94/NKG2A, HLA-E (véase, por ejemplo, el documento WO99/28748). También se ha observado que ciertas células tumorales secretan HLA-E en forma soluble (Derre et al., J Immunol 2006; 177:3100-7) y células endoteliales activadas (Coupel et al., Blood 2007; 109:2806-14). Los anticuerpos que inhiben la señalización de CD94/NKG2A pueden aumentar la liberación de citocinas y la actividad citolítica de los linfocitos frente a células diana positivas para HLA-E, tal como las respuestas de células NK positivas para CD94/NKG2A frente a células tumorales o células infectadas con virus que expresan HLA-E. Por lo tanto, los anticuerpos terapéuticos que inhiben CD94/NKG2A pero que no provocan la muerte de las células que expresan CD94/NKG2A (es decir, anticuerpos que no reducen el número) pueden inducir el control del crecimiento tumoral en pacientes con cáncer.
PD-1 es un miembro inhibidor de la familia de receptores CD28 que también incluye CD28, CTLA-4, ICOS y BTLA. PD-1 se expresa en linfocitos B activados, linfocitos T y células mieloides. Okazaki et al. (2002) Curr. Opin. Immunol.
14: 391779-82; Bennett et al. (2003) J Immunol 170:711-8). Se han identificado dos ligandos para PD-1, PD-L1 y PD-L2, que han mostrado regular negativamente la activación de los linfocitos T al unirse a PD-1 (Freeman et al. (2000) J Exp. Med. 192:1027-34; Latchman et al. (2001) Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. (2002) Eur J Immunol 32:634-43). PD-L1 es abundante en una variedad de cánceres humanos (Dong et al. (2002) Nat. Med. 8:787-9). La interacción entre PD-1 y PD-L1 da como resultado una disminución de los linfocitos que se infiltran en un tumor, una disminución de la proliferación mediada por el receptor de linfocitos T y una evasión de la respuesta inmune por parte de las células cancerosas. La inmunosupresión se puede revertir inhibiendo la interacción local de PD-1 con PD-L1, y el efecto es aditivo cuando también se bloquea la interacción de PD-1 con PD-L2.
El bloqueo de PD-1 ha dado lugar a respuestas antitumorales impresionantes en numerosos ensayos clínicos. Sin embargo, no todos los pacientes responden al tratamiento con respuestas antitumorales y, además, algunos pacientes tienen cánceres que tienen una recidiva después del tratamiento. En consecuencia, existe una necesidad en la técnica de una mejora de las ventajas que obtienen los pacientes tratados con inhibidores del eje PD-1.
Perez-Gracia et al. (2014, Current Opinion in Immunology, 27, 89-97) es una revisión científica que se refiere al bloqueo de los puntos de control inmunológico para una inmunoterapia contra el cáncer. Katou et al (2007, Cancer Research, 67, 11195-11201) se refiere a la determinación de la expresión de PD-1, NKG2A, NKG2D, CD69 y Ki-67 en linfocitos intraepiteliales y estromales en cáncer de lengua en estadio temprano.
Compendio de la invención
La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Cuando a continuación se usa la palabra invención y/o se presentan características como opcionales, esto debe interpretarse de manera que solo se busca protección para la invención tal y como se reivindica. El alcance de la presente invención está definido por las reivindicaciones y cualquier información que no se encuentre dentro de las reivindicaciones se proporciona únicamente a título informativo.
La presente descripción proporciona métodos mejorados para potenciar una respuesta inmune antitumoral a través de la neutralización combinada de los receptores inhibidores NKG2A y PD-1, por ejemplo, mediante el uso de anticuerpos. Si bien los linfocitos T CD8 y las células NK (en la periferia), no expresan ni NKG2A ni PD-1, se ha encontrado que los linfocitos que se infiltran en un tumor que median en la eliminación de células tumorales, son capaces de expresar tanto el receptor inhibidor PD-1 como el receptor inhibidor NKG2A. Además, el tratamiento con anti-PD1 puede provocar una regulación positiva de los receptores NKG2A en los linfocitos que se infiltran en un tumor, de modo que NKG2A puede estar restringiendo la eficacia de los agentes que bloquean el eje PD1. Dado que esos receptores pueden restringir ambos las actividades citotóxicas de los linfocitos que se infiltran en un tumor, una neutralización de la actividad inhibidora de esos dos receptores a través de anticuerpos, permite que los linfocitos NKG2A+PD1+ eliminen eficazmente las células cancerosas. En un aspecto, los linfocitos NKG2A+PD1+ son linfocitos citotóxicos, opcionalmente linfocitos T CD8+ o células NK.
La inhibición o neutralización de la actividad inhibidora de PD-1 puede implicar ventajosamente el uso de un polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo, un polipéptido fusionado con un dominio Fc, una inmunoadhesina, etc.) que evita la señalización de PD-1 inducida por PD-L1, por ejemplo, bloqueando la interacción con su ligando natural PD-L1 (y opcionalmente bloqueando adicionalmente la interacción entre PD-1 y PD-L2). En un aspecto, el polipéptido es un anticuerpo que se une a PD-1 (un anticuerpo anti-PD-1); un anticuerpo de ese tipo puede bloquear la interacción entre PD-1 y PD-L1 y/o entre PD-1 y PD-L2. En otro aspecto, el polipéptido es un anticuerpo que se une a PD-L1 (un anticuerpo anti-PD-L1) y bloquea la interacción entre PD-1 y PD-L1.
Por consiguiente, en un aspecto, se proporciona un método para tratar o prevenir un cáncer en un individuo, comprendiendo el método administrar a un individuo: (a) una cantidad terapéuticamente activa de un compuesto que inhibe un polipéptido NKG2A humano, y (b) una cantidad terapéuticamente activa de un compuesto que inhibe un polipéptido PD-1 humano. En un aspecto, el cáncer es un tumor sólido. En un aspecto, el compuesto que inhibe un polipéptido NKG2A humano es un anticuerpo que neutraliza la actividad inhibidora de NKG2A. En un aspecto, el compuesto que inhibe un polipéptido PD-1 humano es un anticuerpo anti-PD-1 o anti-PDL-1 que neutraliza la actividad inhibidora de PD-1. Se puede especificar que el individuo sea un ser humano.
En un aspecto, se proporciona un método para activar o potenciar la actividad de un linfocito T CD8+ que se infiltra en un tumor en un individuo, comprendiendo el método administrar a un individuo: (a) una cantidad terapéuticamente activa de un compuesto que inhibe un polipéptido NKG2A humano, y (b) una cantidad terapéuticamente activa de un compuesto que inhibe un polipéptido PD-1 humano. En un aspecto, se proporciona un método para activar o potenciar la actividad de una célula NK que se infiltra en un tumor en un individuo, comprendiendo el método administrar a un individuo: (a) una cantidad terapéuticamente activa de un compuesto que inhibe un polipéptido NKG2A humano, y (b) una cantidad terapéuticamente activa de un compuesto que inhibe un polipéptido PD-1 humano.
En un aspecto, se proporciona un tratamiento que comprende administrar una combinación de un anticuerpo que neutraliza la actividad inhibidora de NKG2A y un anticuerpo que neutraliza la actividad inhibidora de PD-1.
En un aspecto, se proporciona una composición que comprende un anticuerpo que inhibe un polipéptido NKG2A humano y un anticuerpo que inhibe un polipéptido PD-1 humano. En un aspecto, la composición es para uso en el tratamiento o la prevención de un cáncer, opcionalmente un tumor sólido, opcionalmente una neoplasia maligna hematológica.
En un aspecto, el anticuerpo anti-NKG2A se administra en una cantidad que da como resultado la neutralización de la actividad inhibidora de CD94/NKG2A humano en el paciente humano (in vivo), por ejemplo, una cantidad que da como resultado la neutralización de la actividad inhibidora de CD94/NKG2A humano en linfocitos T CD8 y células NK en el paciente humano. En un aspecto, la cantidad que da como resultado la neutralización de la actividad inhibidora de CD94/NKG2A humano en el paciente humano, es al menos 10 veces (por ejemplo, 10-20 veces, 10-50 veces, 10-100 veces, 20- 50 veces, 20-100 veces, 30-100 veces, 50-100 veces), opcionalmente al menos 50, 60, 80 o 100 veces, la concentración mínima requerida para saturar sustancialmente los receptores NKG2A en la superficie de células NKG2A+ (por ejemplo, en un ensayo de unión en donde se ajusta la dosis del anticuerpo sobre PBMC). En un aspecto, el anticuerpo anti-NKG2A compite con HLA-E en la unión a NKG2A humano.
En un aspecto, el anticuerpo anti-NKG2A se administra durante al menos un ciclo de administración, comprendiendo el ciclo de administración al menos un primera y una segunda administración (y opcionalmente una 3a, 4a, 5a, 6a, 7a y/o 8a o más) del anticuerpo anti-NKG2A, en donde el anticuerpo anti-NKG2A se administra en una cantidad eficaz para alcanzar una concentración en sangre continua (mínima) de anticuerpo anti-NKG2A de al menos 10 pg/ml (u, opcionalmente al menos 20, 30, 40 o 50 pg/ml) entre la primera y la segunda administración (y opcionalmente las posteriores). Alcanzar o mantener una concentración en sangre continua especificada significa que la concentración en sangre no desciende sustancialmente por debajo de la concentración en sangre especificada durante el período de tiempo especificado (por ejemplo, entre dos administraciones de anticuerpo, número de semanas), es decir, aunque la concentración en sangre puede variar durante el período de tiempo especificado, la concentración en sangre especificada representa una concentración mínima o "valle".
En un aspecto, el anticuerpo anti-NKG2A se administra en una cantidad eficaz para alcanzar una concentración máxima en sangre de aproximadamente o al menos aproximadamente 50, 60, 70 u 80 pg/ml, opcionalmente al menos aproximadamente 100 pg/ml, tras la administración (por ejemplo, 1 o 2 días después de la administración). En un aspecto, el anticuerpo anti-NKG2A se administra en una cantidad eficaz para alcanzar una concentración en sangre continua (mínima) de anticuerpo anti-NKG2A de aproximadamente o de al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 u 80 pg/ml, opcionalmente de al menos aproximadamente 100 pg/ml, durante al menos una semana, o al menos dos semanas, después de la administración del anticuerpo.
En un aspecto, el anticuerpo anti-NKG2A se administra en una cantidad eficaz para alcanzar una concentración en sangre continua (mínima) de anticuerpo anti-NKG2A de aproximadamente o de al menos aproximadamente 50, 60, 70 u 80 pg/ml, opcionalmente de al menos aproximadamente 100 pg/ml, entre dos administraciones sucesivas. En un aspecto, la primera y la segunda administración están separadas en el tiempo por aproximadamente dos semanas, opcionalmente por aproximadamente una semana.
El anticuerpo anti-NKG2A se puede administrar opcionalmente en una cantidad eficaz y de acuerdo con una frecuencia que alcance una concentración en sangre continua (mínima) tal y como se especifica para toda la duración de un ciclo de administración.
En un aspecto, el anticuerpo anti-NKG2A se administra en combinación con un anticuerpo que neutraliza un polipéptido PD-1 humano, para el tratamiento de un tumor sólido en un individuo, en donde el ciclo de administración comprende al menos dos administraciones del anticuerpo anti-NKG2A, en donde el anticuerpo anti-NKG2A se administra en una cantidad eficaz para alcanzar una concentración continua (mínima) en un tejido extravascular (por ejemplo, en el entorno del tumor) de al menos 4 pg/ml, opcionalmente de al menos 10 pg/ml entre dos administraciones sucesivas. Opcionalmente, el anticuerpo anti-NKG2A se administra en una cantidad eficaz para lograr una concentración continua (mínima) en un tejido extravascular (por ejemplo, en el entorno del tumor) de al menos 4 pg/ml, opcionalmente de al menos 10 pg/ml, para toda la duración del ciclo de administración. En un aspecto, el anticuerpo anti-NKG2A se administra en una cantidad eficaz para alcanzar una concentración en sangre continua (mínima) de anticuerpo anti-NKG2A de al menos 40 pg/ml, opcionalmente de al menos 100 pg/ml, entre dos administraciones sucesivas, o durante la duración del ciclo de administración.
En un aspecto, el anticuerpo que neutraliza un polipéptido PD-1 humano se administra en una cantidad que da como resultado la neutralización de la actividad inhibidora de PD-1 humano en el paciente humano (in vivo), por ejemplo, una cantidad que da como resultado la neutralización de la actividad inhibidora de PD-1 humano sobre linfocitos T CD8 y células NK en el paciente humano. En un aspecto, la combinación se administra (o es para una administración) de acuerdo con un régimen de dosificación clínico particular, en particular una cantidad de dosis particular y de acuerdo con una pauta de dosificación específica.
En un aspecto, un anticuerpo que neutraliza NKG2A es un anticuerpo que no reduce el número de células, por ejemplo, un anticuerpo que no destruye, elimina, lisa o induce esa destrucción, eliminación o lisis, de modo que afecte negativamente al número de células que expresan NKG2A presentes en una muestra o en un sujeto. En un aspecto, un anticuerpo que neutraliza PD-1 es un anticuerpo que no reduce el número de células. Un anticuerpo que no reduce el número de células puede, por ejemplo, carecer de un dominio Fc o tener un dominio Fc que se une de forma mínima o nula a uno o varios receptores de Fcy (por ejemplo, CD16). Ejemplos incluyen anticuerpos con regiones constantes del anticuerpo de isotipo IgG4 humano, anticuerpos con cualquier isotipo (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3) con regiones constantes modificadas para reducir o impedir la unión a uno o varios receptores de Fcy (por ejemplo, CD16).
En un aspecto, el cáncer es un tumor sólido avanzado y/o refractario. En un aspecto, el cáncer (por ejemplo, el tumor sólido refractario avanzado) se selecciona a partir del grupo que consiste en cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer de riñón, adenocarcinoma de páncreas o esófago, cáncer de mama, carcinoma de células renales (RCC), melanoma, cáncer colorrectal y cáncer de ovario.
El compuesto que inhibe un polipéptido NKG2A (agente anti-NKG2A) es un compuesto que aumenta la capacidad de las células NK y/o linfocitos T que expresan NKG2A para causar la muerte de la célula que expresa HLA-E. Opcionalmente, el compuesto que inhibe un polipéptido NKG2A es un polipéptido, opcionalmente un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal), que se une a un polipéptido NKG2A.
En un aspecto, el agente anti-NKG2A reduce la actividad inhibidora de NKG2A bloqueando la unión de su ligando, HLA-E, es decir, el agente anti-NKG2A interfiere en la unión de NKG2A con HLA-E. El anticuerpo que tiene la cadena pesada de cualquiera de SEQ ID NOS: 4-8 y la cadena ligera de SEQ ID NO: 9, es un ejemplo de un anticuerpo de ese tipo. En un aspecto, el agente anti-NKG2A reduce la actividad inhibidora de NKG2A sin bloquear la unión de su ligando, HLA-E, es decir, el agente anti-NKG2A es un antagonista no competitivo y no interfiere en la unión de NKG2A con HLA-E. El anticuerpo que tiene las regiones variables de la cadena pesada y ligera de SEQ ID NOS: 10 y 11, respectivamente, es un ejemplo de un anticuerpo de ese tipo.
En un aspecto, el agente anti-NKG2A es un anticuerpo que se une con una afinidad significativamente mayor a NKG2A, que a uno o varios receptores NKG2 activadores. Por ejemplo, en un aspecto, el agente es un anticuerpo que se une con una afinidad significativamente mayor a NKG2A que a NKG2C. En un aspecto adicional o alternativo, el agente es un anticuerpo que se une con una afinidad significativamente mayor a NKG2A que a NKG2E. En un aspecto adicional o alternativo, el agente es un anticuerpo que se une con una afinidad significativamente mayor a NKG2A que a NKG2H.
En un aspecto, el agente anti-NKG2A compite con el anticuerpo que tiene las cadenas pesada y ligera de SEQ ID NOS: 4-8 y 9, respectivamente, o el anticuerpo que tiene las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de SEQ ID NOS: 10 y 11, respectivamente, en la unión a CD94/NKG2A. El agente puede ser, por ejemplo, un anticuerpo anti-NKG2A humano o humanizado.
En un aspecto, el anticuerpo anti-NKG2A es un anticuerpo humanizado que tiene las CDRs de la cadena pesada de cualquiera de las cadenas pesadas de cualquiera entre SEQ ID NOS: 4-8 y las CDRs de la cadena ligera de la cadena ligera de SEQ ID NO: 9, respectivamente. En un aspecto, el anticuerpo anti-NKG2A es un anticuerpo humanizado que tiene la región variable de la cadena pesada de cualquiera de las cadenas pesadas de cualquiera de SEQ ID NOS: 4-8 y la región variable de la cadena ligera de la cadena ligera de SEQ ID NO: 9, respectivamente. Se proporcionan ejemplos de residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) o de secuencias y/o sitios para sustituciones de aminoácidos en la región estructural (FR) de esos anticuerpos humanizados que tienen propiedades mejoradas tales como, por ejemplo, menor inmunogenicidad, propiedades mejoradas de unión al antígeno u otras propiedades funcionales, y/o propiedades fisicoquímicas mejoradas tales como, por ejemplo, una mejor estabilidad.
En ciertos aspectos opcionales, los pacientes pueden ser identificados para el tratamiento con un agente anti-NKG2A y un agente neutralizante de PD1, evaluando la presencia en una muestra tumoral (por ejemplo, tejido tumoral y/o tejido adyacente al tumor) de ligandos de NKG2A, opcionalmente además un ligando de PD-1. En un aspecto de cualquiera de los usos terapéuticos o de métodos de prevención o tratamiento del cáncer de la presente memoria, el tratamiento o la prevención de un cáncer en un individuo comprende:
a) determinar el estado del polipéptido del HLA-E de las células malignas dentro del individuo que tiene cáncer, y
b) después de determinar que los polipéptidos del HLA-E se expresan de manera prominente (por ejemplo, en la superficie de) células malignas (por ejemplo, células tumorales), administrar al individuo un compuesto que neutraliza la actividad inhibidora de un polipéptido NKG2A humano y un agente que inhibe un polipéptido PD-1 humano.
En un aspecto de cualquiera de los usos terapéuticos o de métodos de prevención o tratamiento del cáncer de la presente memoria, el tratamiento o la prevención de un cáncer en un individuo comprende:
a) determinar el estado del polipéptido del HLA-E y el estado del polipéptido PD-L1 de las células malignas (por ejemplo, células tumorales) dentro del individuo que tiene cáncer, y
b) después de determinar que los polipéptidos del HLA-E y PD-L1 se expresan de manera prominente en la superficie de células malignas, administrar al individuo un compuesto que neutraliza la actividad inhibidora de un polipéptido NKG2A humano y un agente que inhibe un polipéptido PD-1 humano.
En un aspecto, la determinación de que una muestra biológica (por ejemplo, una muestra que comprende células tumorales, tejido tumoral y/o tejido adyacente al tumor) expresa de manera prominente el ácido nucleico o el polipéptido del HLA-E, indica que el individuo tiene un cáncer que se puede tratar con un agente que inhibe NKG2A en combinación con un agente que inhibe un polipéptido PD-1 humano.
En un aspecto de cualquiera de los métodos, determinar el estado del polipéptido de1HLA-E o determinar el nivel de expresión en la etapa (a), comprende determinar el nivel de expresión de un ácido nucleico o de un polipéptido del HLA-E de células malignas en una muestra biológica y comparar el nivel con un nivel de referencia (por ejemplo, un valor, una tinción débil o fuerte de la superficie celular, etc.). El nivel de referencia puede corresponder, por ejemplo, a un individuo sano, a un individuo que ha obtenido un beneficio clínico bajo o nulo de un tratamiento con un anticuerpo anti-NKG2A (opcionalmente en combinación con un agente que inhibe un polipéptido PD-1 humano), o a un individuo que ha obtenido un beneficio clínico sustancial de un tratamiento con un anticuerpo anti-NKG2A (opcionalmente en combinación con un agente que inhibe un polipéptido PD-1 humano). Una determinación de que una muestra biológica expresa el ácido nucleico o el polipéptido de HLA-E a un nivel que está incrementado (por ejemplo, un valor alto, una tinción fuerte de la superficie, un nivel que corresponde al de un individuo que obtiene un beneficio clínico sustancial de un tratamiento con un anticuerpo anti-NKG2A, un nivel que es más alto que el correspondiente a un individuo que obtiene un beneficio clínico bajo o nulo de un tratamiento con un anticuerpo anti-NKG2A, etc.), indica que el individuo tiene un cáncer que se puede tratar con un anticuerpo anti-NKG2A en combinación con un agente que inhibe un polipéptido PD-1 humano, por ejemplo, de acuerdo con los métodos de tratamiento descritos en esta memoria.
En un aspecto, se proporciona un método para identificar linfocitos que expresan PD-1 con NKG2A inhibido, comprendiendo el método:
a) determinar el estado del polipéptido NKG2A y PD-1 de las células NK y/o los linfocitos T CD8 en una muestra biológica, y
b) en donde una determinación de que los polipéptidos NKG2A y PD-1 se expresan en la superficie de una proporción significativa de los linfocitos, indica que los linfocitos son linfocitos que expresan PD-1 con NKG2A inhibido. Opcionalmente, los linfocitos son linfocitos que se infiltran en un tumor. Opcionalmente, la muestra biológica es una muestra que comprende tejido tumoral y/o tejido adyacente al tumor.
En un aspecto, se proporciona un método para identificar a un individuo que tiene un cáncer para el cual es adecuado un tratamiento con un agente anti-NKG2A, comprendiendo el método:
a) determinar el estado del polipéptido NKG2A y PD-1 de los linfocitos que se infiltran en un tumor procedentes del individuo, y
b) en donde una determinación de que los polipéptidos NKG2A y PD-1 se expresan en la superficie de una proporción significativa de los linfocitos que se infiltran en el tumor (TIL, por sus siglas en inglés) del individuo, opcionalmente TILs de un subconjunto predefinido (por ejemplo, linfocitos T CD8, células NK), indica que el tratamiento con un compuesto que neutraliza la actividad inhibidora de un polipéptido NKG2A humano y un agente que inhibe un polipéptido PD-1 humano, es adecuado para el individuo.
En un aspecto, se proporciona un método para el tratamiento o la prevención de un cáncer en un individuo que comprende:
a) determinar el estado del polipéptido NKG2A y PD-1 de los linfocitos que se infiltran en un tumor procedentes del individuo, y
b) después de determinar que los polipéptidos NKG2A y PD-1 se expresan en la superficie de una proporción significativa de los linfocitos que se infiltran en el tumor, opcionalmente TILs de un subconjunto predefinido (por ejemplo, linfocitos T CD8, células NK), del individuo, administrar al individuo un régimen terapéutico que comprende un compuesto que neutraliza la actividad inhibidora de un polipéptido NKG2A humano y un agente que inhibe un polipéptido PD-1 humano.
En un aspecto, los linfocitos que se infiltran en un tumor son linfocitos T CD8. En un aspecto, los linfocitos que se infiltran en un tumor son células NK. En un aspecto, al menos el 10, 15, 20, 25% de los linfocitos T CD8 son NKG2A+PD+. En un aspecto, al menos el 10%, 15%, 20% o 25% de los linfocitos T CD8 son NKG2A+PD-1+. En un aspecto, al menos el 20%, 25%, 30% o 35% de las células NK son NKG2A+PD-1+.
En otros aspectos, se proporcionan composiciones farmacéuticas y kits, así como métodos para usarlos. En un aspecto, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto que neutraliza la actividad inhibidora de un polipéptido NKG2A humano y un agente que inhibe un polipéptido PD-1 humano. En un aspecto, se proporciona un kit que comprende un compuesto que neutraliza la actividad inhibidora de un polipéptido NKG2A humano y un agente que inhibe un polipéptido PD-1 humano.
Breve descripción de los dibujos
Las Figuras 1A y 1B muestran que las células tumorales PD-L1+ Qa-1+ RMA-S Qa-1 Qdm B2m y A20 están infiltradas con células NK que expresan NKG2A y linfocitos T CD8 que expresan NKG2A y/o PD-1. Se sacrificaron ratones portadores de tumores RMA-S Qa-1 Qdm B2m (fila superior) y A20 (fila inferior) cuando los volúmenes tumorales eran de aproximadamente 500 mm3. Las células tumorales (Figura 1A) y los linfocitos infiltrantes de tumores -TIL-(Figura 1B) se analizaron mediante citometría de flujo respectivamente para estudiar la expresión de Qa-1 y PDL-1 en las células tumorales y NKG2A/C/E y PD-1 en los TIL. MFI: mediana de la intensidad de la fluorescencia.
La Figura 2 muestra la distribución de NKG2A y PD-1 en subconjuntos de células NK y linfocitos T en ratones. Se extrajeron linfocitos del bazo, de los ganglios linfáticos que drenan el tumor y del interior de masas tumorales sólidas. La expresión de PD-1 era poco frecuente o estaba ausente en todos los subconjuntos de células del bazo y los ganglios linfáticos, sin embargo, en los linfocitos que se infiltran en el tumor (TILs), todos los subconjuntos de células tenían porcentajes relativamente altos de células que expresaban PD-1. NKG2A, por otro lado, se encontró en las células NK pero no en los subconjuntos de linfocitos T en el bazo y los ganglios linfáticos, sin embargo, en el tumor se encontró un porcentaje significativo de TILs, con una media de más del 30% de células NK y más del 19% de los linfocitos T CD8 que eran doblemente positivos para NKG2A y PD-1.
Las Figuras 3A y 3B muestran la expresión de NKG2A y PD-1 en ratones portadores de tumores. Se sacrificaron los ratones portadores de tumores RMA Rae1 (fila superior), MC38 (fila media) y RMA (fila inferior) cuando sus tumores alcanzaron respectivamente los volúmenes de 500, 2000 y 800 mm3. Las células NK (Figura 3A) y los linfocitos T CD8 (Figura 3B) se analizaron mediante citometría de flujo en el bazo, un ganglio linfático que drena el tumor (LN, por sus siglas en inglés) y un tumor para estudiar la expresión de NKG2A/C/E y PD-1.
La Figura 4 muestra que el tratamiento de ratones con AcMo anti-PD-1 aumenta la frecuencia de linfocitos T CD8 que expresan NKG2A en tumores MC38. Se trataron ratones portadores de tumores MC38 con 200 gg de control de isotipo (IC) de IgG2a de rata o anticuerpos anti-PD-1 de ratón, los días 11, 14 y 17 después de injertar las células. Los ratones se sacrificaron el día 31 y los linfocitos T CD8 se caracterizaron mediante citometría de flujo en el bazo, el ganglio linfático que drena el tumor (LN) y el tumor.
La Figura 5 muestra la mediana del volumen tumoral a lo largo del tiempo en ratones tratados con control de isotipo, AcMo anti-NKG2A de ratón (200 pg, iv), AcMo anti-PD-LI de ratón (200 pg, ip) o una combinación de antimNKG2A/mPDL-1, los días 11, 14 y 18. Si bien el anti-NKG2A producía solo un efecto antitumoral modesto en comparación con el control del isotipo en este modelo y el anti-PD-L1 producía un efecto antitumoral sustancial pero con un aumento del volumen del tumor hacia el día 28, el tratamiento combinado con anti-NKG2A y anti-PD-L1 anulaba completamente el crecimiento tumoral, sin que se observara un crecimiento significativo en el volumen del tumor el día 28.
Descripción detallada
Definiciones
Tal y como se usa en la memoria descriptiva, "un" o "una" pueden significar uno/a o varios/as. Tal y como se usa en la(s) reivindicación(es), cuando se usa junto con la expresión "que comprende", las palabras "un" o "una" pueden significar uno/a o más de uno/a. Tal y como se usa en este documento, "otro" puede significar al menos un segundo o más.
Cuando se utiliza "que comprende", esto se puede sustituir opcionalmente por "que consiste esencialmente en" o por "que consiste en".
NKG2A (OMIM 161555) es un miembro del grupo de transcritos NKG2 (Houchins et al. (1991) J. Exp. Med.
173:1017-1020). NKG2A está codificado por 7 exones que abarcan 25 kb, mostrando cierto corte y empalme diferencial. Junto con CD94, NKG2A forma el receptor inhibidor heterodimérico CD94/NKG2A, que se encuentra en la superficie de subconjuntos de células NK, linfocitos T a/p, linfocitos T y/ó y células NKT. Similar a los receptores KIR inhibidores, posee un ITIM en su dominio citoplásmico. Tal y como se usa en este documento, "NKG2A" se refiere a cualquier variante, derivado o isoforma del gen NKG2A o de la proteína codificada. NKG2A humano comprende 233 aminoácidos en 3 dominios, con un dominio citoplasmático que comprende los residuos 1-70, una región transmembranal que comprende los residuos 71-93 y una región extracelular que comprende los residuos 94­ 233, con la siguiente secuencia:
MDNQGVIYSDLNLPPNPKRQQRKPKGNKSSILATEQEITYAELNLQKASQDFQGND-
KTYHCKDLPSAPEKLIVGILGIICLILMASVVTIVVIPSTLIQRHNNSSLNTRTQKARHCGHCP
EEWITYSNSCYYIGKERRTWEESLLACTSKNSSLLSIDNEEEMKFLSIISPSSWIGVFRNSS
HHPWVTMNGLAFKHEIKDSDNAELNCAVLQVNRLKSAQCGSSIIYHCKHKL (SEQ ID NO:1).
NKG2C (OMIM 602891) y NKG2E (OMIM 602892) son otros dos miembros del grupo de transcritos NKG2 (Gilenke et al. (1998) Immunogenetics 48:163-173). Los receptores CD94/NKG2C y CD94/NKG2E son receptores activadores que se encuentran en la superficie de subconjuntos de linfocitos tales como las células NK y los linfocitos T.
HLA-E (OMIM 143010) es una molécula del MHC no clásica que se expresa en la superficie celular y se regula mediante la unión de péptidos, por ejemplo, tales como fragmentos obtenidos a partir de la secuencia señal de otras moléculas del MHC de clase I. También se han identificado versiones solubles de1HLA-E. Además de sus propiedades de unión al receptor de linfocitos T, HLA-E se une a subconjuntos de células citotóxicas naturales (NK), linfocitos T citotóxicos naturales (NKT) y linfocitos T (a/p y y/ó), al unirse específicamente a CD94/NKG2A, CD94/NKG2B y CD94/NKG2C (véase, por ejemplo, Braud et al. (1998) Nature 391:795-799). La expresión superficial de HLA-E protege a las células diana de una lisis a través de clones de células NK, linfocitos T o NKT CD94/NKG2A+. Tal y como se usa en este documento, "HLA-E" se refiere a cualquier variante, derivado o isoforma del gen HLA-E o de la proteína codificada.
En el contexto de la presente descripción, "NKG2A" o "linfocito positivo para CD94/NKG2A" se refiere a células de la estirpe linfoide (por ejemplo, células NK, NKT y linfocitos T) que expresan CD94/NKG2A en la superficie celular, que pueden ser detectadas, por ejemplo, mediante citometría de flujo, usando anticuerpos que reconocen específicamente un epítopo combinado sobre CD94 y NKG2A o un epítopo solo sobre NKG2A. Un "linfocito positivo para NKG2A" también incluye líneas celulares inmortales de origen linfoide (por ejemplo, NKL, NK-92).
En el contexto de la presente descripción, "reduce la actividad inhibidora de NKG2A", "neutraliza NKG2A" o "neutraliza la actividad inhibidora de NKG2A" se refiere a un proceso en el que se inhibe CD94/NKG2A en su capacidad para afectar negativamente a procesos intracelulares que conducen a respuestas de linfocitos, tales como la liberación de citocinas y las respuestas citotóxicas. Esto se puede medir, por ejemplo, en un ensayo de citotoxicidad basado en células NK o linfocitos T, en el que se mide la capacidad de un compuesto terapéutico para estimular la destrucción de células positivas para HLA-E a través de linfocitos positivos para CD94/NKG2A. En un aspecto, una preparación de anticuerpo provoca al menos un aumento del 10% en la citotoxicidad de un linfocito restringido a CD94/NKG2A, opcionalmente un aumento de al menos un 40% o un 50% en la citotoxicidad de los linfocitos, opcionalmente un aumento de al menos un 70% en la citotoxicidad de las NK", y haciendo referencia a los ensayos de citotoxicidad descritos. Si un anticuerpo anti-NKG2A reduce o bloquea las interacciones de CD94/NKG2A con HLA-E, puede aumentar la citotoxicidad de los linfocitos restringidos a CD94/NKG2A. Esto se puede evaluar, por ejemplo, en un ensayo de citotoxicidad in vitro estándar, de 4 horas que utiliza, por ejemplo, células NK que expresan CD94/NKG2A y células diana que expresan HLA-E. Esas células NK no destruyen eficazmente las dianas que expresan HLA-E porque CD94/NKG2A reconoce HLA- E, lo que conduce al inicio y la propagación de una señalización inhibidora que evita la citólisis mediada por linfocitos. Un ensayo de citotoxicidad in vitro de ese tipo se puede llevar a cabo mediante métodos convencionales que son bien conocidos en la técnica, como se describen, por ejemplo, en Coligan et al., compiladores, Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993). La liberación de cromo y/u otros parámetros para evaluar la capacidad del anticuerpo para estimular a los linfocitos para destruir células diana, tales como las células P815, K562, o células tumorales apropiadas, también se describen en Sivori et al., J. Exp. Med. 1997; 186:1129-1136; Vitale et al., J. Exp. Med. 1998; 187:2065-2072; Pessino et al. J. Exp. Med. 1998; 188:953-960; Neri et al. Clin. Diag. Lab. Immun. 2001; 8:1131-1135; Pende et al. J. Exp. Med. 1999; 190:1505-1516. Las células dianas se marcan con 51Cr antes de la adición de las células NK, y a continuación se estima la destrucción como proporcional a la liberación de 51Cr desde las células al medio, como resultado de la destrucción. La adición de un anticuerpo que evita que CD94/NKG2A se una a HLA-E, da como resultado evitar el inicio y la propagación de una ruta de señalización inhibidora a través de CD94/NKG2A. Por lo tanto, la adición de tales agentes da como resultado un incremento de la destrucción de las células diana mediada por los linfocitos. Por tanto, esta etapa identifica agentes que evitan una señalización negativa inducida por CD94/NKG2A, por ejemplo, bloqueando la unión del ligando. En un ensayo particular de citotoxicidad con liberación de 51Cr, las células efectoras NK que expresan CD94/NKG2A pueden destruir células diana LCL 721.221 negativas para HLA-E, pero por células de control LCL 721.221-Cw3 que expresan HLA-E. Por el contrario, las células efectoras YTS que carecen de CD94/NKG2A destruyen ambas líneas celulares de forma eficaz. Por lo tanto, las células efectoras NK destruyen de manera menos eficaz las células LCL 721.221-Cw3 HLA-E+ debido a la ruta de señalización inhibidora inducida por HLA-E a través de CD94/NKG2A. Cuando las células NK se preincuban con anticuerpos bloqueantes anti-CD94/NKG2A de acuerdo con la presente descripción en un ensayo de citotoxicidad con liberación de 51Cr de ese tipo, las células LCL 721.221-Cw3 que expresan HLA-E se destruyen más eficazmente, de una manera dependiente de la concentración de anticuerpo. La actividad inhibidora (es decir, el potencial de mejora de la citotoxicidad) de un anticuerpo anti-NKG2A también se puede evaluar de varias otras formas, por ejemplo, mediante su efecto sobre el calcio libre intracelular, tal y como se describe, por ejemplo, en Sivori et al., J. Exp. Med. 1997; 186:1129-1136. La activación de la citotoxicidad de las células NK se puede evaluar, por ejemplo, midiendo un aumento en la producción de citocinas (por ejemplo, la producción de IFN-y) o con marcadores de la citotoxicidad (por ejemplo, movilización de CD107 o CD137). En un protocolo ejemplar, la producción de IFN-y a partir de PBMCs se evalúa mediante una tinción intracitoplasmática y de la superficie celular y un análisis mediante citometría de flujo después de 4 días de cultivo. En resumen, se añade Brefeldin A (Sigma Aldrich) hasta tener una concentración final de 5 pg/ml en las últimas 4 horas del cultivo. A continuación, las células se incuban con AcMo anti-CD3 y anti-CD56 antes de la permeabilización (IntraPrep™; Beckman Coulter) y la tinción con PE-anti-IFN-Y o PE-IgG1 (Pharmingen). La producción de GM-CSF e IFN-y a partir de células NK policlonales activadas se mide en el material sobrenadante usando ELISA (GM-CSF: DuoSet Elisa, R&D Systems, Minneapolis, MN, IFN-y: OptEIA set, Pharmingen).
Tal y como se usa en el presente documento, los términos "PD-1" se refieren a la proteína de muerte programada 1 (PD-1, por sus siglas en inglés) (también denominada "muerte celular programada 1"), un miembro inhibidor de la familia de receptores CD28, que también incluye CD28, CTLA-4, ICOS y BTLA. La secuencia completa de PD-1 humana se puede encontrar en GenBank con el número de orden U64863, que se muestra a continuación:
MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFFPALLVVTEGD-N A T F T C S F S N T SESFVLNW YRM SPSN QTDK LAA FPED RSQPG QD CRFRV TQ LPNG RD -F H M S V V R A R R N D SG T Y L C G A ISL A PK A Q IK E SLR A EL R V T E R R A E V PT A H P-SPSPR PA G Q FQ TLV V G V V G G LLG SLV LLV W V LA V IC SR A A RG TIG A R RTG Q PLK ED PSA V -P V F S V D Y G E L D F Q W R E K T P E P P V P C V P E Q T E Y A T IV F P S G M G T S S P A R R G -SADGPRSAQPLRPEDGHCSW PL (SEQ ID NO: 2).
"PD-1" también incluye cualquier variante, derivado o isoforma del gen PD-1 o de la proteína codificada. PD-1 se expresa en linfocitos B activados, linfocitos T y células mieloides. Okazaki et al. (2002) Curr. Opin. Immunol.
14:391779-82; Bennett et al. (2003) J Immunol 170:711-8). Los miembros iniciales de la familia, CD28 e ICOS, se descubrieron por los efectos funcionales sobre el aumento de la proliferación de linfocitos T tras la adición de anticuerpos monoclonales (Hutloff et al. (1999) Nature 397:263-266; Hansen et al. (1980) Inmunogenics 10:247-260). Se han identificado dos ligandos para PD-1, PD-L1 y PD-L2, que han mostrado regular negativamente la activación de los linfocitos T después de unirse a PD-1 (Freeman et al. (2000) J Exp. Med. 192:1027-34; Latchman et al. (2001) Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. (2002) Eur J Immunol 32 634-43). Tanto PD-L1 como PD-L2 son homólogos de B7 que se unen a PD-1, pero no a otros miembros de la familia CD28.
La secuencia completa de PD-L1 humano se puede encontrar en UniProtKB/Swiss-Prot, identificador Q9NZQ7-1, que se muestra a continuación:
MRIFAVFIFM TYWHLLNAFT VTVPKDLYVV EYGSNMTIEC KFPVEKQLDL
AALIVYWEME DKNIIQFVHG EEDLKVQHSS YRQRARLLKD QLSLGNAALQ ITDVKLQDAG VYRCMISYGG ADYKRITVKV NAPYNKINQR ILVVDPVTSE
HELTCQAEGY PKAEVIWTSS DHQVLSGKTT TTNSKREEKL FNVTSTLRIN
TTTNEIFYCT FRRLDPEENH TAELVIPELP LAHPPNERTH LVILGAILLC
LGVALTFIFR LRKGRMMDVK KCGIQDTNSK KQSDTHLEET (SEQ ID NO: 3)
PD-L1 es abundante en una variedad de cánceres humanos (Dong et al. (2002) Nat. Med. 8:787-9). La interacción entre PD-1 y PD-L1 da como resultado una disminución de los linfocitos que se infiltran en un tumor, una disminución de la proliferación mediada por el receptor de linfocitos T y una evasión de la respuesta inmune por parte de las células cancerosas (Dong et al. (2003) J. Mol. Med. 81:281- 7; Blank et al. (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54:307-314; Konishi et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:5094-100). La inmunosupresión se puede revertir inhibiendo la interacción local de PD-1 con PD-L1, y el efecto es aditivo cuando también se bloquea la interacción de PD-1 con PD-L2.
En el contexto de la presente descripción, "reduce la actividad inhibidora de PD-1 humana", "neutraliza la PD-1" o "neutraliza la actividad inhibidora de la PD-1 humana" se refiere a un proceso en el que se inhibe la capacidad de transducción de señales de PD-1 lo que es el resultado de la interacción de PD-1 con uno o varios de sus ligandos, tales como PD-L1 o PD-L2. Un agente que neutraliza la actividad inhibidora de PD-1 disminuye, bloquea, inhibe, anula o interfiere con la transducción de señales que es el resultado de la interacción de PD-1 con uno o varios de sus ligandos, como PD-L1, PD-L2. Un agente de este tipo puede reducir de este modo la señal coestimuladora negativa mediada por o a través de proteínas de la superficie celular, expresadas en linfocitos T, de modo que se potencian las funciones efectoras de los linfocitos T, tales como la proliferación, la producción de citocinas y/o la citotoxicidad.
Siempre que dentro de toda esta memoria descriptiva se mencione "tratamiento del cáncer" o algo similar, haciendo referencia a un agente de unión anti-NKG2A y anti-PD-1 o anti-PD-L1 (por ejemplo, un anticuerpo), se comprende: (a) un método de tratamiento del cáncer, en donde dicho método comprende la etapa de administrar (en al menos un tratamiento) un agente de unión a NKG2A y anti-PD-1 o anti-PD-L1, (por ejemplo, juntos o cada uno por separado en un material de soporte farmacéuticamente aceptable) a un individuo, un mamífero, especialmente un ser humano, que necesite ese tratamiento, en una dosis que permita el tratamiento del cáncer (una cantidad terapéuticamente eficaz), opcionalmente en una dosis (cantidad) tal como se especifica en esta memoria; (b) el uso de un agente de unión anti-NKG2A y anti-PD-1 o anti-PD-L1 para el tratamiento del cáncer, o un agente de unión anti-NKG2A, para uso en dicho tratamiento (especialmente en un ser humano); (c) el uso de un agente de unión anti-NKG2A y anti-PD-1 o anti-PD-L1 para la elaboración de una preparación farmacéutica para el tratamiento del cáncer, un método para emplear un agente de unión anti-NKG2A y anti-PD-1 o anti-PD-L1 para la elaboración de una preparación farmacéutica para el tratamiento del cáncer, que comprende mezclar por adición un agente de unión anti-NKG2A y anti-PD-1 o anti-PD-L1 con un vehículo farmacéuticamente aceptable, o una preparación farmacéutica que comprende una dosis eficaz de un agente de unión anti-NKG2A y anti-PD-1 o anti-PD-L1 que es apropiada para el tratamiento del cáncer; o (d) cualquier combinación de a), b) y c), de acuerdo con el tema permitido para patentar en un país en donde se presente esta solicitud.
El término "biopsia", tal y como se usa en el presente documento, se define como la extirpación de un tejido con el fin de examinar, tal como para establecer un diagnóstico. Ejemplos de tipos de biopsias incluyen la aplicación de succión, como a través de una aguja fijada a una jeringa; mediante una extracción instrumental de un fragmento de tejido; mediante una extracción con instrumentos adecuados a través de un endoscopio; mediante escisión quirúrgica, tal como una lesión completa; y similares.
El término "anticuerpo", tal y como se usa en el presente documento, se refiere a anticuerpos policlonales y monoclonales. Dependiendo del tipo de dominio constante en las cadenas pesadas, los anticuerpos se asignan a una de las cinco clases principales: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Varias de estas se dividen además en subclases o isotipos, tales como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 y similares. Una unidad estructural de inmunoglobulina (anticuerpo) ejemplar comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto por dos parejas idénticas de cadenas polipeptídicas, en donde cada pareja tiene una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). El extremo N-terminal de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos que es principalmente responsable del reconocimiento de antígenos. Las expresiones cadena ligera variable (VL) y cadena pesada variable (VH) se refieren a esas cadenas ligeras y pesadas respectivamente. Los dominios constantes de la cadena pesada que se corresponden con las diferentes clases de inmunoglobulinas, se denominan "alfa", "delta", "épsilon", "gamma" y "mu", respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. Las IgG son las clases ejemplares de anticuerpos empleadas en este documento porque son los anticuerpos más comunes en la situación fisiológica y porque se preparan más fácilmente en un entorno de laboratorio. Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. Ejemplos particulares de anticuerpos son anticuerpos humanizados, quiméricos, humanos o de otro modo adecuados para humanos.
"Anticuerpos" también incluye cualquier fragmento o derivado de cualquiera de los anticuerpos descritos en este documento.
La expresión "se une específicamente a" significa que un anticuerpo se puede unir preferiblemente en un ensayo de unión competitiva al ligando, por ejemplo, NKG2A, PD-1, PD-L1, según se determina usando formas recombinantes de las proteínas, epítopos de las mismas o proteínas naturales presentes en la superficie de las células diana aisladas. Los ensayos de unión competitiva y otros métodos para determinar una unión específica, son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la unión se puede detectar mediante radiomarcadores, métodos físicos como la espectrometría de masas o marcadores fluorescentes directos o indirectos, detectados utilizando, por ejemplo, un análisis citofluorométrico (por ejemplo, FACScan). Una unión que es superior a la cantidad observada con un agente de control, un agente no específico, indica que el agente se une a la diana. Un agente que se une específicamente a NKG2A puede unirse a NKG2A solo o a NKG2A como un dímero con CD94.
Cuando se dice que un anticuerpo "compite con" un anticuerpo monoclonal en particular, significa que el anticuerpo compite con el anticuerpo monoclonal en un ensayo de unión utilizando tanto moléculas recombinantes (por ejemplo, NKG2A, PD-1, PD-L1) como moléculas expresadas en la superficie (por ejemplo, NKG2A, PD-1, PD-L1). Por ejemplo, si un anticuerpo de prueba reduce la unión de un anticuerpo que tiene una cadena pesada de cualquiera de SEQ ID NO: 4-8 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 9 a un polipéptido NKG2A o a una célula que expresa NKG2A en un ensayo de unión, se dice que el anticuerpo "compite" respectivamente con ese anticuerpo.
El término "afinidad", tal y como se usa en este documento, significa la fuerza de la unión de un anticuerpo con un epítopo. La afinidad de un anticuerpo viene dada por la constante de disociación Kd, definida como [Ab] x [Ag] / [Ab-Ag], en donde [Ab-Ag] es la concentración molar del complejo anticuerpo-antígeno, [Ab] es la concentración molar del anticuerpo no unido y [Ag] es la concentración molar del antígeno no unido. La constante de afinidad Ka se define por 1/Kd. Los métodos para determinar la afinidad de los AcMos se pueden encontrar en Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988), Coligan et al., compiladores, Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. y Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993), y Muller, Meth. Enzymol. 92:589-601 (1983). Un método estándar bien conocido en la técnica para determinar la afinidad de los AcMos es el uso de un escrutinio mediante resonancia de plasmón superficial (SPR) (tal como mediante un análisis con un dispositivo analítico SPR BIAcore™).
Dentro del contexto de la presente memoria, un "determinante" designa un sitio de interacción o de unión en un polipéptido.
El término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico y es el área o la región en un antígeno a la que se une un anticuerpo. Un epítopo proteico puede comprender residuos de aminoácidos directamente implicados en la unión, así como residuos de aminoácidos que son bloqueados eficazmente por el péptido o el anticuerpo que se une al antígeno específico, es decir, residuos de aminoácidos dentro de la "huella" del anticuerpo. Es la forma más simple o el área estructural más pequeña de una molécula de antígeno compleja que se puede combinar, por ejemplo, con un anticuerpo o un receptor. Los epítopos pueden ser lineales o conformacionales/estructurales. La expresión "epítopo lineal" se define como un epítopo compuesto por residuos de aminoácidos que son contiguos en la secuencia lineal de aminoácidos (estructura primaria). La expresión "epítopo conformacional o estructural" se define como un epítopo compuesto por residuos de aminoácidos que no son todos contiguos y que, por lo tanto, representan partes distintas de la secuencia lineal de aminoácidos que se acercan entre sí mediante el plegamiento de la molécula (estructuras secundarias, terciarias y/o cuaternarias). Un epítopo conformacional depende de la estructura tridimensional. Por lo tanto, el término "conformacional" se usa a menudo de manera intercambiable con "estructural".
El término "agente" se utiliza en esta memoria para indicar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica o un extracto elaborado a partir de materiales biológicos. La expresión "agente terapéutico" se refiere a un agente que tiene actividad biológica.
Para los fines de la presente memoria, un anticuerpo "humanizado" o "humano" se refiere a un anticuerpo en el que la región estructural constante y variable de una o más inmunoglobulinas humanas se fusiona con la región de unión, por ejemplo, la CDR, de una inmunoglobulina animal. Esos anticuerpos están diseñados para conservar la especificidad de la unión del anticuerpo no humano a partir de la cual se obtienen las regiones de unión, pero para evitar una reacción inmune contra el anticuerpo no humano. Esos anticuerpos se pueden obtener a partir de ratones transgénicos u otros animales que han sido "manipulados genéticamente" para producir anticuerpos humanos específicos como respuesta a un estímulo antigénico (véase, por ejemplo, Green et al. (1994) Nature Genet 7:13; Lonberg et al. (1994) Nature 368:856; Taylor et al. (1994) Int Immun 6:579). También se puede construir un anticuerpo completamente humano mediante métodos de transfección genéticos o cromosómicos, así como mediante tecnología de presentación en fagos, todos ellos son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-553). Los anticuerpos humanos también se pueden generar mediante linfocitos B activados in vitro (véanse, por ejemplo, los documentos de patente de EE.UU. n° 5.567.610 y 5.229.275). Un "anticuerpo quimérico" es una molécula de anticuerpo en la que (a) la región constante, o una porción de la misma, se altera, se reemplaza o se intercambia, de modo que el sitio de unión al antígeno (región variable) se une a una región constante de una clase, función efectora y/o especie diferente o alterada, o una molécula completamente diferente que confiere nuevas propiedades al anticuerpo quimérico, por ejemplo, una enzima, toxina, hormona, factor de crecimiento, fármaco, etc.; o (b) la región variable, o una porción de la misma, se altera, se reemplaza o se intercambia con una región variable que tiene una especificidad antigénica diferente o alterada. Los términos "dominio Fc", "porción Fc" y "región Fc" se refieren a un fragmento C-terminal de una cadena pesada de anticuerpo, por ejemplo, desde aproximadamente el aminoácido (aa) 230 hasta aproximadamente el aa 450 de la cadena pesada y (gamma) humana o su secuencia homóloga en otros tipos de cadenas pesadas de anticuerpos (por ejemplo, a, 5, £ y p para anticuerpos humanos), o un alotipo de la misma que se produce naturalmente. A menos que se especifique lo contrario, la numeración de aminoácidos de Kabat comúnmente aceptada para las inmunoglobulinas se emplea a lo largo de esta descripción (véase Kabat et al. (1991) Sequences of Protein of Immunological Interest, 5a ed., United States Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD). Los términos "aislado", "purificado" o "biológicamente puro" se refieren a un material que está sustancial o esencialmente exento de componentes que normalmente lo acompañan tal cual se encuentra en su estado natural. La pureza y la homogeneidad se determinan normalmente usando técnicas de química analítica, tales como electroforesis en gel de poliacrilamida o cromatografía líquida de alta resolución. Una proteína que es la especie predominante presente en una preparación, se purifica sustancialmente.
Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o varios residuos de aminoácidos son una molécula mimética química artificial de un aminoácido natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural y a un polímero de aminoácidos de origen no natural.
El término "recombinante", cuando se usa haciendo referencia, por ejemplo, a una célula, o un ácido nucleico, una proteína o un vector, indica que la célula, el ácido nucleico, la proteína o el vector se han modificado mediante la introducción de un ácido nucleico o una proteína heteróloga, o la alteración de un ácido nucleico o proteína natural, o que la célula se ha obtenido a partir de una célula modificada de ese modo. Por tanto, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran en la forma natural (no recombinante) de la célula o expresan genes naturales que de otro modo se expresan de forma anormal, se expresan de forma disminuida o no se expresan en absoluto.
En el contexto de la presente memoria, la expresión anticuerpo que "se une" a un polipéptido o un epítopo indica un anticuerpo que se une a dicho determinante con especificidad y/o afinidad.
El término "identidad" o "idéntico", cuando se usa en una relación entre las secuencias de dos o más polipéptidos, se refiere al grado de relación de las secuencias entre los polipéptidos, según lo determinado por el número de coincidencias entre las cadenas de dos o más residuos de aminoácidos. La "identidad" mide el porcentaje de coincidencias idénticas entre la menor de dos o más secuencias con alineaciones de huecos (si los hay) dirigidas por un modelo matemático o un programa informático particular (es decir, "algoritmos"). La identidad de polipéptidos relacionados se puede calcular fácilmente mediante métodos conocidos. Esos métodos incluyen, pero no se limitan a, los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., compilador, Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., compilador, Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte 1, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., compiladores, Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., compiladores, M. Stockton Press, New York, 1991; y Carillo et al., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988).
Los métodos para determinar la identidad están diseñados para proporcionar la mayor coincidencia entre las secuencias analizadas. Los métodos para determinar la identidad se describen en programas informáticos disponibles públicamente. Los métodos de programas informáticos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen el paquete de programas GCG, incluyendo GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res. 12, 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BlAsTN y FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)). El programa BLASTX está disponible públicamente en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md.
20894; Altschul et al., supra). El bien conocido algoritmo de Smith Waterman también se puede utilizar para determinar la identidad.
Agentes terapéuticos que neutralizan NKG2A
El agente anti-NKG2A se une a una porción extracelular del receptor CD94/NKG2A humano y reduce la actividad inhibidora del receptor CD94/NKG2A humano expresado en la superficie de un linfocito positivo para CD94/NKG2A. En un aspecto, el agente compite con HLA-E en la unión a CD94/NKG2A, es decir, el agente bloquea la interacción entre CD94/NKG2A y su ligando HLA-E. En otro aspecto, el agente no compite con HLA-E en la unión a CD94/NKG2A; es decir, el agente es capaz de unirse a CD94/NKG2A simultáneamente con HLA-E. El anticuerpo se puede unir a un epítopo combinado sobre CD94 y NKG2A o a un epítopo sobre NKG2A solo.
En un aspecto, el agente anti-NKG2A es un anticuerpo seleccionado a partir de un anticuerpo completamente humano, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo quimérico. En un aspecto, el agente comprende un dominio constante obtenido a partir de un anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humano. En un aspecto, el agente es un fragmento de un anticuerpo seleccionado a partir de IgA, IgD, IgG, IgE e IgM. En un aspecto, el agente es un fragmento de anticuerpo seleccionado a partir de un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento Fab'-SH, un fragmento F(ab)2, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fv, una Ig de cadena pesada (una Ig de llama o camello), un fragmento Vhh, un dominio FV sencillo, un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla. En un aspecto, el agente es una molécula sintética o semisintética obtenida a partir de un anticuerpo seleccionada a partir de un scFV, un dsFV, un minicuerpo, un diacuerpo, un triacuerpo, un cuerpo kappa, un IgNAR; y un anticuerpo multiespecífico.
Opcionalmente, los anticuerpos anti-NKG2A no muestran una unión específica sustancial a los receptores de Fcy, por ejemplo, CD16. Esos anticuerpos pueden comprender regiones constantes de diversas cadenas pesadas que se sabe que no se unen a los receptores de Fc. Un ejemplo de ello es una región constante de IgG4 humana. En un aspecto, el anticuerpo IgG4 comprende una modificación para evitar la formación de medios anticuerpos (intercambio de los brazos fab) in vivo, por ejemplo, el anticuerpo comprende una cadena pesada de IgG4 que comprende una mutación de serina a prolina en el residuo 241, correspondiente a la posición 228 según el índice de UE (Kabat et al., "Sequences of proteins of immunological interest", 5a ed., NIH, Bethesda, ML, 1991). Esos anticuerpos IgG4 modificados permanecerán intactos in vivo y mantendrán una unión bivalente (de alta afinidad) a NKG2A, a diferencia de la IgG4 natural que experimentará un intercambio de brazos fab in vivo, de manera que se unen a NKG2A de forma monovalente, lo que puede alterar la afinidad de unión. Alternativamente, se pueden usar fragmentos de anticuerpos que no comprenden regiones constantes, tales como fragmentos Fab o F(ab’)2, para evitar la unión al receptor de Fc. La unión al receptor de Fc se puede evaluar según métodos conocidos en la técnica, que incluyen, por ejemplo, someter a ensayo la unión de un anticuerpo para la proteína del receptor de Fc en un ensayo BIACORE. Además, se puede usar cualquier tipo de anticuerpo humano (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4) en el que la porción Fc se modifica para minimizar o eliminar la unión a los receptores de Fc (véase, por ejemplo, el documento WO03101485). Los ensayos tales como, por ejemplo, los ensayos basados en células, para evaluar la unión al receptor de Fc son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en el documento WO03101485.
Por tanto, la presente descripción se refiere a anticuerpos u otros agentes que se unen a NKG2A. En un aspecto, el anticuerpo se une a NKG2A con una KD al menos 100 veces menor que a NKG2C y/o NKG2E humanos.
En un aspecto de la descripción, el agente reduce la inhibición mediada por CD94/NKG2A de un linfocito que expresa CD94/NKG2A al interferir con la señalización de CD94/NKG2A, por ejemplo, interfiriendo con la unión de HLA-E con NKG2A, evitando o induciendo cambios conformacionales en el receptor CD94/NKG2A y/o afectando a la dimerización y/o el agrupamiento del receptor CD94/NKG2A.
En un aspecto de la descripción, el agente se une a una porción extracelular de NKG2A con una KD al menos 100 veces menor que a NKG2C. En un aspecto preferido adicional, el agente se une a una porción extracelular de NKG2A con una KD al menos 150, 200, 300, 400 o 10.000 veces menor que la de NKG2C. En otro aspecto de la descripción, el agente se une a una porción extracelular de NKG2A con una KD al menos 100 veces menor que a las moléculas NKG2C, NKG2E y/o NKG2H. En un aspecto preferido adicional, el agente se une a una porción extracelular de NKG2A con una KD al menos 150, 200, 300, 400 o 10.000 veces menor que a las moléculas NKG2C, NKG2C y/o NKG2H. Esto se puede medir, por ejemplo, en experimentos BiaCore, en los que se mide y se compara la capacidad de los agentes para unirse a la porción extracelular de CD94/NKG2A inmovilizado (por ejemplo, purificado a partir de células que expresan CD94/NKG2 o producido en un biosistema), con la unión de agentes a CD94/NKG2C producidos de manera similar y/u otras variantes de CD94/NKG2 en el mismo ensayo. Alternativamente, la unión de los agentes a células que expresan naturalmente, o que sobreexpresan (por ejemplo, después de una transfección transitoria o estable) CD94/NKG2A, se puede medir y comparar con la unión de células que expresan CD94/NKG2C y/u otras variantes de CD94/NKG2. Los anticuerpos anti-NKG2A se pueden unir opcionalmente a NKG2B, que es una variante por corte y empalme de NKG2A que forma un receptor inhibidor junto con CD94. En un aspecto, la afinidad se puede medir usando los métodos descritos en el documento de patente de EE.UU. n° 8.206.709, evaluando por ejemplo la unión a la proteína de fusión NKG2A-CD94-Fc inmovilizada covalentemente mediante Biacore, como se muestra en el Ejemplo 8 del documento de patente de EE.UU. n° 8.206.709.
El anticuerpo anti-NKG2A puede ser un anticuerpo humanizado, por ejemplo, que comprende una estructura aceptora humana de VH procedente de una secuencia aceptora humana seleccionada, por ejemplo, a partir de VH1_18, VH5_a, VH5_51, VH1_f y VH1_46, y un segmento J de JH6, u otras secuencias estructurales de VH de la línea germinal humana, conocidas en la técnica. La secuencia aceptora humana de la región VL puede ser, por ejemplo, VKI_O2/JK4.
En un aspecto, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado basado en el anticuerpo Z270. Se muestran diferentes cadenas de Z270VH humanizadas en SEQ ID NOS: 4-8 (aminoácido del dominio de la región variable está subrayado). HumZ270VH6 (SEQ ID NO: 4) se basa en VH5_51; HumZ270VH1 (SEQ ID NO: 5) se basa en VH1_18; humZ270VH5 (SEQ ID NO: 6) se basa en VH5_a; humZ270VH7 (SEQ ID NO: 7) se basa en VH1_f; y humZ270VH8 (SEQ ID NO: 8) se basa en VH1_46; todos ellos con un segmento J de JH6. Cada uno de estos anticuerpos conserva una unión de alta afinidad a NKG2A, con baja probabilidad de una respuesta inmune del hospedador contra el anticuerpo, ya que los 6 residuos de los aminoácidos C-terminales de la CDR-H2 de Kabat de cada una de las estructuras artificiales humanizadas, son idénticos a la región estructural del aceptor humano. Utilizando el programa de alineación VectorNTI, se obtuvieron las siguientes identidades de secuencia entre humZ270VH1 y humZ270VH5, -6, -7 y -8: 78,2% (VH1 frente a VH5), 79,0% (VH1 frente a VH6), 88,7% (VH1 frente a VH7) y 96,0% (VH1 frente a VH8).
En un aspecto, el agente comprende (i) una región variable de la cadena pesada de cualquiera de las SEQ ID NOS: 4-8, o una secuencia de aminoácidos al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% idéntica a la misma, y (ii) una región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 9, o una secuencia de aminoácidos al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% idéntica a la misma. En un aspecto, el agente comprende (i) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NOS: 4-8, o una secuencia de aminoácidos al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% idéntica a la misma, y (ii) una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, o una secuencia de aminoácidos al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% idéntica la misma. El anticuerpo que tiene la cadena pesada de cualquiera de SEQ ID NOS: 4-8 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 9, neutraliza la actividad inhibidora de NKG2A, pero no se une sustancialmente a los receptores activadores NKG2C, NKGE o NKG2H. Además, ese anticuerpo compite con HLA-E para unirse a NKG2A en la superficie de una célula. En un aspecto, el agente comprende secuencias de HCDR1, HCDR2 y/o HCDR3 obtenidas a partir de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 4-8. En un aspecto de la descripción, el agente comprende secuencias de LCDR1, LCDR2 y/o LCDR3 obtenidas a partir de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.
Cadenas pesadas
VH6:
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWMNWVRQMPGKGLEWMGRIDPYD-SETHYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGGYDFDVGTLY-WFFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKP-SNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS-RTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAK-TKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEK-TISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN-NYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
(SEQ ID NO: 4)
VH1:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMNWVRQAPGQGLEWMGRIDPYDSETHYA-QKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGGYDFDVGTLYWFFDVWGQGTTVTVS SASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYS-LSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSLGK (SEQ ID NO: 5)
VH5:
EVQLVQSGAEVKKPGESLRISCKGSGYSFTSYWMNWVRQMPGKGLEWMGRIDPYD-SETHYSPSFQGHVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGGYDFDVGTLY-WFFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKP-SNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS
RTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSLGK (SEQ ID NO: 6)
VH7:
EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTSYWMNWVQQAPGKGLEWMGRIDPYDSETHY AEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATGGYDFDVGTLY-WFFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKP-
RTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSLGK (SEQ ID NO: 7)
VH8:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMNWVRQAPGQGLEWMGRIDPYDSETHY AQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYDFDVGTLYWFFDVWGQGTTVTVS SASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT-FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPE-FLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAK-TKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEK-TISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN-NYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO:
8)
Cadena ligera
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQKPGKAPKLLIYNAKTLAEGVPSRFSGS GSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVC LLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 9)
En un aspecto, el anticuerpo anti-NKG2A es un anticuerpo que comprende una CDR-H1 correspondiente a los residuos 31-35 de SEQ ID NOS: 4-8, una CDR-H2 correspondiente a los residuos 50-60 (opcionalmente 50-66 cuando se incluyen aminoácidos de origen humano) de SEQ ID NOS: 4-8, y una CDR-H3 correspondiente a los residuos 99-114 (95-102 según Kabat) de SEQ ID NOS: 4-8. En un aspecto, la CDR-H2 correspondiente a los residuos 50-66 de SEQ ID NOS: 4-8. Opcionalmente, una CDR puede comprender una, dos, tres, cuatro o más sustituciones de aminoácidos.
En un aspecto, el anticuerpo anti-NKG2A es un anticuerpo que comprende una CDR-L1 correspondiente a los residuos 24-34 de SEQ ID NO: 9, una CDR-L2 correspondiente a los residuos 50-56 de SEQ ID NO: 9 y una CDR-L3 correspondiente a los residuos 89-97 de SEQ ID NO: 9. Opcionalmente, una CDR puede comprender una, dos, tres, cuatro o más sustituciones de aminoácidos.
En un aspecto, el anticuerpo anti-NKG2A es un anticuerpo que comprende una CDR-H1 correspondiente a los residuos 31-35 de SEQ ID NOS: 4-8, una CDR-H2 correspondiente a los residuos 50-60 (opcionalmente 50-66) de SEQ ID NOS: 4-8, y una CDR-H3 correspondiente a los residuos 99-114 (95-102 según Kabat) de SEQ ID NOS: 4-8, una CDR-L1 correspondiente a los residuos 24-34 de SEQ ID NO: 9, una CDR-L2 correspondiente a los residuos 50-56 de SEQ ID nO: 9 y una CDR-L3 correspondiente a los residuos 89-97 de SEQ ID NO: 9.
En un aspecto, el agente comprende secuencias de HCDR1, HCDR2 y/o HCDR3 obtenidas a partir de VH que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. En un aspecto de la descripción, el agente comprende secuencias de LCDR1, LCDR2 y/o LCDR3 obtenidas a partir de VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11. En un aspecto, el agente comprende secuencias de HCDR1, HCDR2 y/o HCDR3 obtenidas a partir de VH que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, y secuencias de LCDR1, LCDR2 y/o LCDR3 obtenidas a partir de VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SeQ ID NO: 11. El anticuerpo que tiene la cadena pesada de SEQ ID NO: 10 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 11 neutraliza la actividad inhibidora de NKG2A, y también se une a los receptores activadores NKG2C, NKG2E o NKG2H. El anticuerpo no compite con HLA-E para unirse a NKG2A en la superficie de una célula (es decir, es un antagonista no competitivo de NKG2A).
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQSPEKRLEWVAEISSGGSYTYY PDTVTGRFTISRDNAKNTLYLEISSLRSEDTAMYYCTRHGDYPRFFDVWGAGTTVTVSS
(SEQ ID NO: 10)
QIVLTQSPALMSASPGEKVTMTCSASSSVSYIYWYQQKPRSSPKPWIYLTSNLASGVPAR FSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSGNPYTFGGGTKLEIKR
(SEQ ID NO: 11)
En un aspecto, el agente comprende los residuos de aminoácidos 31-35, 50-60, 62, 64, 66 y 99-108 del dominio variable-pesado (Vh) (SEQ ID NO: 10) y los residuos de aminoácidos 24-33, 49-55 y 88-96 del dominio variableligero (Vl) (SEQ ID n O: 11), opcionalmente con una, dos, tres, cuatro o más sustituciones de aminoácidos.
En un aspecto, el agente es un anticuerpo completamente humano que se ha producido contra el epítopo CD94/NKG2A al que se une cualquiera de los anticuerpos mencionados anteriormente.
Se apreciará que, aunque se pueden usar los anticuerpos mencionados anteriormente, otros anticuerpos pueden reconocer y generarse contra cualquier parte del polipéptido NKG2A, siempre que el anticuerpo provoque la neutralización de la actividad inhibidora de NKG2A. Por ejemplo, cualquier fragmento de NKG2A, preferible pero no exclusivamente, NKG2A humano, o cualquier combinación de fragmentos de NKG2A, se puede usar como agente inmunógeno para generar anticuerpos, y los anticuerpos pueden reconocer epítopos en cualquier ubicación dentro del polipéptido NKG2A, siempre que lo puedan hacer sobre células NK que expresan NKG2A, tal y como se describe en el presente documento. Opcionalmente, el epítopo es el epítopo reconocido específicamente por el anticuerpo que tiene la cadena pesada de SEQ ID NOS: 4-8 y la cadena ligera de SEQ ID NO: 9.
En un aspecto, el agente compite con el anticuerpo humZ270 descrito en el documento de patente de EE.UU. n° 8.206.709, por la unión a la porción extracelular del receptor CD94/NKG2A humano. Una unión competitiva se puede medir, por ejemplo, en experimentos BiaCore, en los que se mide la capacidad de los agentes, para unirse a la porción extracelular del receptor CD94/NKG2A inmovilizado (por ejemplo, purificado a partir de células que expresan CD94/NKG2, o producido en un biosistema) saturado con humZ270. Alternativamente, la unión de agentes a células se mide por la expresión de forma natural o sobreexpresada (por ejemplo, después de una transfección transitoria o estable), del receptor CD94/NKG2A, y que se han preincubado con dosis saturantes de Z270. En un aspecto, la unión competitiva se puede medir usando los métodos descritos en el documento de patente de EE.UU. n° 8.206.709, por ejemplo, evaluando la unión a células Ba/F3-CD94-NKG2A mediante citometría de flujo, tal y como se muestra en el Ejemplo 15 del documento de patente de EE.UU. n° 8.206.709.
Agentes terapéuticos neutralizantes de PD-1
Actualmente existen al menos seis agentes que bloquean la ruta PD-1/PD-L1 que están comercializados o se encuentran en evaluación clínica. Un agente es BMS-936558 (Nivolumab/ONO-4538, Bristol-Myers Squibb; anteriormente MDX-1106). Nivolumab, (nombre comercial Opdivo®) es un AcMo anti-PD-L1 de IgG4 totalmente humano aprobado por la FDA que inhibe la unión del ligando PD-L1 a PD-1 y CD80, y se describe como el anticuerpo 5C4 en el documento WO 2006/121168. Para los pacientes con melanoma, la Or más significativa se observó a una dosis de 3 mg/kg, mientras que para otros tipos de cáncer era de 10 mg/kg. Nivolumab generalmente se dosifica a 10 mg/kg cada 3 semanas hasta el avance del cáncer.
MK-3475 (AcMo anti-PD1 de IgG4 humano de Merck), también conocido como lambrolizumab o pembrolizumab (nombre comercial Keytruda®), ha sido aprobado por la FDA para el tratamiento del melanoma y se está probando en otros cánceres. El pembrolizumab se sometió a ensayo con 2 mg/kg o 10 mg/kg cada 2 o 3 semanas hasta el avance de la enfermedad. Las estructuras artificiales de ADN que codifican las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos humanizados h409AII, se han depositado en el Depósito de Patentes de la “American Type Culture Collection” (10801 University Blvd., Manassas, VA). El plásmido que contiene el ADN que codifica la cadena pesada de h409A-I 1 se depositó el 9 de junio de 2008 y se identificó como 081469_SPD-H y el plásmido que contiene el ADN que codifica la cadena ligera de h409AI 1 se depositó el 9 de junio de 2008 y se identificó como 0801470_SPD-LI 1. MK-3475, también conocido como Merck 3745 o SCH-900475, también se describe en el documento WO2009/114335.
MPDL3280A/RG7446 (anti-PD-L1 de Roche/Genentech) es un AcMo anti-PD-L1 humano que contiene un dominio Fc modificado genéticamente para optimizar la eficacia y la seguridad, minimizando la unión a FcyR y la consiguiente citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Se administraron dosis de <1, 10, 15 y 25 mg/kg de MPDL3280A cada 3 semanas durante un máximo de 1 año. En el ensayo de fase 3, MPDL3280A se administra a 1200 mg por infusión intravenosa cada tres semanas en NSCLC.
AMP-224 (Amplimmune y GSK) es una inmunoadhesina que comprende un dominio extracelular de PD-L2 fusionado a un dominio Fc. Otros ejemplos de agentes que neutralizan PD-1 pueden incluir un anticuerpo que se une a PD-L2 (un anticuerpo anti-PD-L2) y bloquea la interacción entre PD-1 y PD-L2.
Pidlizumab (CT-011; CureTech) (AcMo anti-PD1 de IgG1 humanizado de CureTech/Teva), Pidlizumab (CT-011; CureTech) (véase, por ejemplo, el documento WO2009/101611). Treinta pacientes con FL recidivante sensible a rituximab fueron tratados con 3 mg/kg de CT-011 intravenoso cada 4 semanas durante 4 infusiones en combinación con rituximab dosificado a 375 mg/m2 semanalmente durante 4 semanas, comenzando 2 semanas después de la primera infusión de CT-011.
Otros anticuerpos de PD-1 y otros inhibidores de PD-1 conocidos incluyen AMP-224 (una proteína de fusión B7-DC/IgG1 autorizada para GSK), AMP-514 descrito en el documento WO 2012/145493, el anticuerpo MEDI-4736 (un anti-PD-L1 desarrollado por AstraZeneca/Medimmune) descrito en el documento WO2011/066389 y US2013/034559, el anticuerpo YW243.55.S70 (un anti-PD-L1) descrito en el documento WO2010/077634, MDX-1105, también conocido como BMS-936559, es un anticuerpo anti-PD-L1 desarrollado por Bristol-Myers Squibb descrito en el documento WO2007/005874, y anticuerpos e inhibidores descritos en los documentos WO2006/121168, WO2009/014708, WO2009/114335 y WO2013/019906. Otros ejemplos de anticuerpos anti-PD1 se describen en el documento WO2015/085847 (Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co. Ltd.), por ejemplo, anticuerpos que tienen el dominio variable de la cadena ligera CDR1, 2 y 3 de SEQ ID NO: 6, SEQ ID nO: 7 y/o SEQ ID NO: 8, respectivamente, y el dominio variable de la cadena pesada de un anticuerpo CDR1,2 y 3 de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5, respectivamente, en donde las referencias a SEQ ID NO tienen la numeración según el documento WO2015/085847. También se pueden emplear anticuerpos que compiten con cualquiera de estos anticuerpos en la unión a PD-1 o PD-L1.
Un anticuerpo anti-PD-1 ejemplar es pembrolizumab (véase, por ejemplo, el documento WO 2009/114335). El anticuerpo anti-PD-1 puede ser el anticuerpo h409AI 1 en el documento WO 2008/156712, que comprende regiones variables de la cadena pesada codificadas por el ADN depositado en la ATCC como 081469_SPD-H y regiones variables de la cadena ligera codificadas por el ADN depositado en la ATCC como 0801470_SPD-LI 1. En otros aspectos, el anticuerpo comprende las CDRs de la cadena pesada y ligera o regiones variables de pembrolizumab. En consecuencia, en un aspecto, el anticuerpo comprende los dominios de CDR1, CDR2 y CDR3 de la VH de pembrolizumab codificados por el ADN depositado en la ATCC como 081469_SPD-H, y los dominios de CDR1, CDR2 y CDR3 de la VL de pembrolizumab codificados por el ADN depositado en la ATCC como 0801470_SPD-LI 1.
En algunos aspectos, el agente neutralizante de PD-1 es un AcMo anti-PD-L1 que inhibe la unión de PD-L1 a PD-1. En algunos aspectos, el agente neutralizante de PD-1 es un AcMo anti-PD1 que inhibe la unión de PD-1 a PD-L1. En algunos aspectos, el agente neutralizante de PD-1 es una inmunoadhesina (por ejemplo, una inmunoadhesina que comprende una porción extracelular o que se une a PD-1 de PD-L1 o PD-L2, fusionada con una región constante (por ejemplo, una región Fc de una secuencia de inmunoglobulina).
Otro anticuerpo anti-PD-1 ejemplar es nivolumab que comprende cadenas pesadas y ligeras que tienen las secuencias respectivas mostradas en SEQ ID NO: 12 y 13 o una secuencia de aminoácidos respectiva que son al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% idénticas a las mismas, o fragmentos que se unen a antígeno y variantes de los mismos. En otros aspectos, el anticuerpo comprende las CDRs de la cadena pesada y ligera o regiones variables de nivolumab. Por consiguiente, en un aspecto, el anticuerpo comprende los dominios de CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de nivolumab que tiene la secuencia indicada en SEQ ID NO: 12, y los dominios de CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de nivolumab que tiene la secuencia indicada en SEQ ID NO: 13.
QVQLVESGGGWQPGRSLRLDCKASGlTFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVrWY DGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVT VSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLV DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT TYTCNVDHKPSNTKVD RVES YGPPCPPCPAPEFLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSQEDPEVQFNWYYDGVEVHNA TKPREEQF NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKA GQPREPQVYTLPPSQ EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEKNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDK SRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
(SEQ ID NO: 12).
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQ PGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSG TDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEI RTVAAPSVFI FPPSDEQL SGTASVVCLLN
NFYPREA VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS DSTYSL SSTLLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS
PVTSFNRGEC
(SEG ID NO: 13).
Un anticuerpo anti-PD-LI ejemplar comprende regiones variables de la cadena pesada y ligera que tienen las secuencias respectivas mostradas en SEQ ID NOs: 14 y 15, o una secuencia de aminoácidos que es al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% idéntica, respectivamente, o fragmentos que se unen a antígeno y variantes de los mismos. En otros aspectos, el anticuerpo comprende las CDRs de la cadena ligera y pesada o regiones variables de MPDL3280A. En consecuencia, en un aspecto, el anticuerpo comprende los dominios de CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada que tiene la secuencia indicada en SEQ ID NO: 14, y los dominios de CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera que tiene la secuencia indicada en SEQ ID NO: 15.
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWIS PYGGSTY-YADSVKGRFTISADTSKNTAYLQ NSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWG QGTLVTVSS
(SEQ ID NO: 14)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQ PGKAPKLLIY SASF LYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR
(SEQ ID NO: 15)
El anticuerpo anti-PD-1 o anti-PD-L1 se puede seleccionar a partir de un anticuerpo completamente humano, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo quimérico. En un aspecto de la descripción, el agente comprende un dominio constante obtenido a partir de un anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humano. En un aspecto de la descripción, el agente es un fragmento de un anticuerpo seleccionado a partir de un anticuerpo de IgA, una IgD, una IgG, una IgE y una IgM. En un aspecto de la descripción, el agente es un fragmento de anticuerpo seleccionado a partir de un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento Fab'-SH, un fragmento F(ab)2, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fv, una Ig de cadena pesada (una Ig de llama o camello), un fragmento Vss, un FV de dominio sencillo y un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla. En un aspecto de la descripción, el agente es una molécula sintética o semisintética obtenida a partir de un anticuerpo, seleccionada a partir de un scFV, un dsFV, un minicuerpo, un diacuerpo, un triacuerpo, un cuerpo kappa, un IgNAR; y un anticuerpo multiespecífico.
El anticuerpo anti-PD-1 o anti-PD-L1 puede carecer de una unión específica sustancial a los receptores de Fcy, por ejemplo, CD16. Esos anticuerpos pueden comprender regiones constantes de diversas cadenas pesadas que se sabe que no se unen a los receptores de Fc. Un ejemplo de ello es una región constante de IgG4. IgG4 Alternativamente, se pueden usar fragmentos de anticuerpo que no comprenden regiones constantes, tales como fragmentos Fab o F(ab’)2, para evitar la unión al receptor de Fc. La unión al receptor de Fc se puede evaluar de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, que incluyen, por ejemplo, someter a ensayo la unión de un anticuerpo a una proteína del receptor de Fc en un ensayo BIACORE. Además, se puede utilizar cualquier tipo de anticuerpo humano (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4) en el que la porción Fc se modifica para minimizar o eliminar la unión a los receptores de Fcy. El anticuerpo anti-PD-1 o anti-PDL1, por lo tanto, normalmente tiene una función efectora reducida o mínima. En un aspecto, la función efectora mínima es el resultado de la producción en células procariotas. En un aspecto, la función efectora mínima es el resultado de una "mutación de Fc sin efector" o una aglicosilación. En otro aspecto adicional, la mutación de Fc sin efector es una sustitución de N297A o D265A/N297A en la región constante.
Formulaciones
Se puede incorporar un agente anti-NKG2A o anti-PD-1 o anti-PD-L1, tal como un anticuerpo, en una formulación farmacéutica que comprende una concentración de 1 mg/ml a 500 mg/ml, en donde dicha formulación tiene un pH de 2,0 a 10,0. La formulación puede comprender además un sistema tamponador, conservante(s), agente(s) de tonicidad, agente(s) quelante(s), estabilizantes y tensioactivos. En un aspecto, la formulación farmacéutica es una formulación acuosa, es decir, una formulación que comprende agua. Esa formulación es normalmente una solución o una suspensión. En un aspecto adicional, la formulación farmacéutica es una solución acuosa. La expresión "formulación acuosa" se define como una formulación que comprende al menos 50% de p/p de agua. Asimismo, la expresión "solución acuosa" se define como una solución que comprende al menos 50% de p/p de agua, y la expresión "suspensión acuosa" se define como una suspensión que comprende al menos 50% de p/p de agua.
En otro aspecto, la formulación farmacéutica es una formulación liofilizada, a la que el médico o el paciente añaden disolventes y/o diluyentes antes del uso.
En otro aspecto, la formulación farmacéutica es una formulación seca (por ejemplo, liofilizada o secada por pulverización) lista para el uso sin una disolución previa.
En un aspecto adicional, la formulación farmacéutica comprende una solución acuosa de ese anticuerpo y un tampón, en donde el anticuerpo está presente en una concentración de 1 mg/ml o superior, y en donde dicha formulación tiene un pH de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 10,0.
En otro aspecto, el pH de la formulación está en el intervalo seleccionado a partir de la lista que consiste en desde aproximadamente 2,0 a aproximadamente 10,0, de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 9,0, de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 8,5, de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 8,0 y de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 7,5.
En un aspecto adicional, el tampón se selecciona a partir del grupo que consiste en acetato de sodio, carbonato de sodio, citrato, glicilglicina, histidina, glicina, lisina, arginina, dihidrogenofosfato de sodio, hidrogenofosfato de disodio, fosfato de sodio y tris(hidroximetil)-aminometano., bicina, tricina, ácido málico, succinato, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido aspártico o mezclas de los mismos. Cada uno de esos tampones específicos constituye un aspecto alternativo de la descripción.
En un aspecto adicional, la formulación comprende además un agente conservante farmacéuticamente aceptable. En un aspecto adicional, la formulación comprende además un agente isotónico. En un aspecto adicional, la formulación comprende además un agente quelante. En un aspecto adicional de la descripción, la formulación comprende además un estabilizante. En un aspecto adicional, la formulación comprende además un tensioactivo. Para mayor comodidad, se hace referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a edición, 1995. Es posible que otros ingredientes puedan estar presentes en la formulación farmacéutica de péptidos de la presente descripción. Esos ingredientes adicionales pueden incluir agentes humectantes, emulsionantes, antioxidantes, agentes de carga, modificadores de la tonicidad, agentes quelantes, iones metálicos, vehículos oleaginosos, proteínas (por ejemplo, albúmina de suero humano, gelatina o proteínas) y un ion híbrido (por ejemplo, un aminoácido tal como betaína, taurina, arginina, glicina, lisina e histidina). Esos ingredientes adicionales, por supuesto, no deben afectar adversamente a la estabilidad general de la formulación farmacéutica de la presente descripción.
La administración de composiciones farmacéuticas de acuerdo con la descripción puede ser a través de varias vías de administración, por ejemplo, intravenosa. Las formulaciones de anticuerpos adecuadas también se pueden determinar examinando experiencias con otros anticuerpos monoclonales terapéuticos ya desarrollados. Se ha mostrado que varios anticuerpos monoclonales son eficaces en situaciones clínicas, tales como Rituxan (Rituximab), Herceptin (Trastuzumab), Xolair (Omalizumab), Bexxar (Tositumomab), Campath (Alemtuzumab), Zevalin, Oncolym y formulaciones similares se pueden usar con los anticuerpos de esta descripción. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal se puede suministrar con una concentración de 10 mg/ml en viales de un solo uso de 100 mg (10 ml) o 500 mg (50 ml), formulados para una administración intravenosa en 9,0 mg/ml de cloruro de sodio, 7,35 mg/ml de citrato de sodio dihidrato, 0,7 mg/ml de polisorbato 80 y agua estéril para preparaciones inyectables. El pH se ajusta a 6,5. En otro aspecto, el anticuerpo se suministra en una formulación que comprende aproximadamente citrato de sodio 20 mM, aproximadamente NaCl 150 mM, a un pH de aproximadamente 6,0.
También se proporcionan kits que incluyen una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo anti-NKG2A y un anticuerpo anti-PD-1 o anti-PD-L1, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en una cantidad terapéuticamente eficaz, adaptada para uso en los métodos anteriores. Los kits también pueden incluir opcionalmente instrucciones, por ejemplo, que comprenden pautas de administración, para permitir que un facultativo (por ejemplo, un médico, una enfermera o un paciente) administre la composición contenida en el mismo para administrar la composición a un paciente que tiene cáncer (por ejemplo, un tumor sólido). El kit también puede incluir una jeringa.
Opcionalmente, los kits incluyen múltiples envases de composiciones farmacéuticas de dosis única, en donde cada uno de los cuales contiene una cantidad eficaz del anticuerpo anti-NKG2A, anti-PD-1 o PD-L1 para una sola administración de acuerdo con los métodos proporcionados anteriormente. Los instrumentos o dispositivos necesarios para administrar la composición o composiciones farmacéuticas también pueden incluirse en los kits. Por ejemplo, un kit puede proporcionar una o varias jeringas precargadas que contienen una cantidad del anticuerpo anti-NKG2A, anti-PD-1 o anti-PD-L1.
En un aspecto, la presente descripción proporciona un kit para tratar un cáncer en un paciente humano, en donde el kit comprende:
(a) una dosis de un anticuerpo anti-NKG2A que comprende los dominios de CDR1, CDR2 y CDR3 de una cadena pesada que tiene la secuencia indicada en cualquiera de SEQ ID NOS: 4-8, y los dominios de CDR1, CDR2 y CDR3 de una cadena ligera que tiene la secuencia indicada en SEQ ID NO: 9;
(b) una dosis de un anticuerpo anti-PD-1 o un anticuerpo anti-PD-L1; y
(c) opcionalmente, instrucciones para usar el anticuerpo anti-NKG2A y el anticuerpo anti-PD-1 en cualquiera de los métodos descritos en este documento.
Diagnósticos, pronósticos y tratamiento de neoplasias
Se describen métodos útiles en el diagnóstico, pronóstico, seguimiento, tratamiento y prevención de un cáncer en un individuo. Si bien los regímenes y métodos de tratamiento descritos en este documento son particularmente útiles para el tratamiento de tumores sólidos, los regímenes y métodos de tratamiento descritos en este documento también se pueden usar para una variedad de cánceres hematológicos, así como para enfermedades infecciosas, trastornos inflamatorios y autoinmunes. Los métodos y las composiciones de la presente descripción se utilizan, por ejemplo, para el tratamiento de una variedad de cánceres y otras enfermedades proliferativas que incluyen, pero no se limitan a: carcinoma, que incluyen el de vejiga, mama, colon, riñón, hígado, pulmón, ovario, próstata, páncreas, estómago, cuello uterino, tiroides y piel; tumores hematopoyéticos de linaje linfoide, que incluyen leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de linfocitos B, linfoma de linfocitos T, linfoma de Hodgkin, linfoma de no Hodgkin, linfoma de células pilosas y linfoma de Burkett; tumores hematopoyéticos de linaje mieloide, que incluyen leucemias mielógenas agudas y crónicas, leucemia promielocítica y síndrome mielodisplásico; tumores de origen mesenquimatoso, que incluyen fibrosarcoma y rabdomioscarcoma; otros tumores, que incluyen melanoma, seminoma, teratocarcinoma, neuroblastoma y glioma; tumores del sistema nervioso central y periférico, que incluyen astrocitoma, neuroblastoma, glioma y schwannomas; tumores de origen mesenquimatoso, que incluyen fibrosarcoma, rabdomioscaroma y osteosarcoma; y otros tumores, que incluyen melanoma, xerodermia pigmentosa, queratoacantoma, seminoma y cáncer folicular de tiroides.
Las terapias de combinación para el tratamiento del cáncer proporcionadas en este documento implican la administración de un anticuerpo anti-NKG2A neutralizante y un agente neutralizante de PD-1, por ejemplo, el anticuerpo anti-PD-1 o anti-PD-L1 neutralizante, para tratar sujetos afectados por cáncer (por ejemplo, tumores sólidos refractarios avanzados). En un aspecto, la descripción proporciona un anticuerpo anti-NKG2A y un anticuerpo anti-PD-1 en combinación para tratar sujetos que tienen un tumor sólido (por ejemplo, un tumor sólido, un tumor sólido refractario avanzado) o sujetos que tienen un tumor hematológico. En un aspecto particular, el anticuerpo anti-NKG2A comprende una cadena pesada de cualquiera de SEQ ID NOS: 4-8 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 9. En un aspecto, el anticuerpo que neutraliza la actividad inhibidora de PD-1 se selecciona a partir del grupo que consiste en pembrolizumab, nivolumab, AMP-514, MEDI-4736, CT-011 y MPDL3280A.
Tal y como se usa en el presente documento, una administración complementaria o combinada (coadministración) incluye una administración simultánea de los compuestos en la misma forma o en una forma diferente de dosificación, o una administración por separado de los compuestos (por ejemplo, una administración secuencial). Por tanto, los anticuerpos anti-NKG2A y anti-PD-1 o anti-PD-L1 se pueden administrar simultáneamente en una única formulación. Alternativamente, los anticuerpos anti-NKG2A y anti-PD-1 o anti-PD-L1 se pueden formular para una administración por separado y se administran de forma concurrente o secuencial.
En un aspecto, el cáncer tratado con los métodos descritos en este documento es un cáncer que expresa HLA-E. En un aspecto, el cáncer se selecciona a partir del grupo que consiste en cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC, por sus siglas en inglés)), carcinoma de células renales (RCC, por sus siglas en inglés), melanoma, cáncer colorrectal y cáncer de ovario.
Un paciente que tiene cáncer se puede tratar con los agentes anti-NKG2A con o sin una etapa de detección previa para evaluar la expresión de HLA-E en la superficie de las células tumorales. Ventajosamente, los métodos de tratamiento pueden comprender una etapa de detección de un ácido nucleico o polipéptido de1HLA-E en una muestra biológica de un tumor (por ejemplo, en una célula tumoral) de un individuo. Los ejemplos de muestras biológicas incluyen cualquier fluido biológico adecuado (por ejemplo, suero, linfa, sangre), muestra de células o muestra de tejido. Por ejemplo, una muestra de tejido puede ser una muestra de tejido tumoral o de tejido adyacente al tumor. Opcionalmente, el polipéptido del HLA-E se detecta en la superficie de una célula maligna. Una determinación de que una muestra biológica expresa HLA-E (por ejemplo, lo expresa de manera prominente; expresa HLA-E con un nivel alto, con alta intensidad de una tinción con un anticuerpo anti-HLA-E, en comparación con una referencia), indica que el individuo tiene un cáncer que puede obtener un gran beneficio del tratamiento con un agente que inhibe NKG2A. En un aspecto, el método comprende determinar el nivel de expresión de un ácido nucleico o polipéptido del HLA-E en una muestra biológica y comparar el nivel con un nivel de referencia (por ejemplo, un valor, una tinción débil de la superficie celular, etc.) correspondiente a un individuo sano. Una determinación de que una muestra biológica expresa un ácido nucleico o polipéptido de1HLA-E con un nivel que ha aumentado en comparación con el nivel de referencia, indica que el individuo tiene un cáncer que se puede tratar con un agente que inhibe NKG2A.
En un aspecto, la determinación de que una muestra biológica (por ejemplo, una muestra que comprende células tumorales, tejido tumoral y/o tejido adyacente al tumor) expresa de manera prominente ácido nucleico o polipéptido del HLA-E, indica que el individuo tiene un cáncer que se puede tratar con un agente que inhibe NKG2A. "Expresado de manera prominente", cuando se refiere a un polipéptido del HLA-E, significa que el polipéptido de1HLA-E se expresa en una cantidad sustancial de células tumorales extraídas de un individuo dado. Si bien la definición de la expresión "expresado de manera prominente" no está limitada por un valor porcentual preciso, en algunos ejemplos, un receptor que se dice que está "expresado de manera prominente" estará presente en al menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o más de las células tumorales extraídas de un paciente (en una muestra).
Determinar si un individuo tiene células cancerosas que expresan un polipéptido de1HLA-E puede comprender, por ejemplo, obtener una muestra biológica (por ejemplo, realizando una biopsia) del individuo que comprende células cancerosas, poner dichas células en contacto con un anticuerpo que se une a un polipéptido de1HLA-E y detectar si las células expresan HLA-E en su superficie. Opcionalmente, determinar si un individuo tiene células cancerosas que expresan HLA-E, comprende realizar un ensayo inmunohistoquímico. Opcionalmente, determinar si un individuo tiene células cancerosas que expresan HLA-E, comprende realizar un ensayo de citometría de flujo.
En los métodos de tratamiento, el anticuerpo anti-NKG2A y los anticuerpos anti-PD-1 o anti-PD-L1 se pueden administrar por separado, juntos o secuencialmente, o en una mezcla. En algunos aspectos, el compuesto que se une al antígeno se administra antes de la administración de los anticuerpos anti-PD-1 o anti-PD-L1. Por ejemplo, el anticuerpo anti-NKG2A se puede administrar aproximadamente 0 a 30 días antes de la administración de los anticuerpos anti-PD-1 o anti-PD-L1. En algunos aspectos, se administra un anticuerpo anti-NKG2A de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 1 semana, aproximadamente 1 hora a aproximadamente 2 horas, aproximadamente 2 horas a aproximadamente 4 horas, aproximadamente 4 horas a aproximadamente 6 horas, aproximadamente 6 a aproximadamente 8 horas, aproximadamente 8 horas a 1 día, o de aproximadamente 1 a 5 días antes de la administración de los anticuerpos anti-PD-1 o anti-PD-L1. En algunos aspectos, se administra un anticuerpo anti-NKG2A simultáneamente con la administración de los anticuerpos anti-PD-1 o anti-PD-L1. En algunos aspectos, se administra un anticuerpo anti-NKG2A después de la administración de los anticuerpos anti-PD-1 o anti-PD-L1. Por ejemplo, se puede administrar un anticuerpo anti-NKG2A aproximadamente 0 a 30 días después de la administración de los anticuerpos anti-PD-1 o anti-PD-L1. En algunos aspectos, se administra un anticuerpo anti-NKG2A de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 1 semana, aproximadamente 1 hora a aproximadamente 2 horas, aproximadamente 2 horas a aproximadamente 4 horas, aproximadamente 4 horas a aproximadamente 6 horas, aproximadamente 6 horas a aproximadamente 8 horas, aproximadamente 8 horas a 1 día, o de aproximadamente 1 a 5 días después de la administración de los anticuerpos anti-PD-1 o anti-PD-L1.
Los protocolos de tratamiento adecuados para tratar a un ser humano que tiene cáncer incluyen, por ejemplo, administrar al paciente una cantidad eficaz de cada uno de un anticuerpo que inhibe NKG2A y un anticuerpo que neutraliza la actividad inhibidora de PD-1 humana, en donde el método comprende al menos un ciclo de administración en el que al menos una dosis del anticuerpo anti-NKG2A se administra a una dosis de 1-10 mg/kg de peso corporal y al menos una dosis del anticuerpo anti-PD-1 o anti-PD-L1 se administra a una dosis de 1 a 20 mg/kg de peso corporal. En un aspecto, el ciclo de administración es de entre 2 y 8 semanas.
En un aspecto, el método comprende al menos un ciclo de administración, en donde el ciclo es un período de ocho semanas o menos, en donde para cada uno de los, al menos un ciclo, se administran dos, tres o cuatro dosis del anticuerpo anti-NKG2A a una dosis de 1-10 mg/kg de peso corporal y dos, tres o cuatro dosis del anticuerpo anti-PD-1 o anti-PD-L1 a una dosis de 1-20 mg/kg de peso corporal.
El anticuerpo anti-NKG2A se puede administrar ventajosamente en una cantidad que logra una concentración en circulación que es al menos 10, 20 o 30 veces mayor que la concentración requerida para una saturación sustancialmente completa del receptor (por ejemplo, 90%, 95%) (por ejemplo, según se determina titulando el anticuerpo anti-NKG2A en células que expresan NKG2A, por ejemplo, en PBMCs), u opcionalmente en una cantidad que logra una concentración en un tejido extravascular (por ejemplo, el tejido tumoral o su entorno) que es al menos 10, 20, o 30 veces mayor que la concentración requerida para la saturación sustancialmente completa del receptor (por ejemplo, según se determina titulando el anticuerpo anti-NKG2A en células que expresan NKG2A, por ejemplo, en PBMCs).
La respuesta de las células NK NKG2A+ se puede evaluar usando un ensayo adecuado de la actividad citotóxica de células NK que expresan NKG2A frente a células diana que expresan HLA-E. Los ejemplos incluyen ensayos basados en marcadores de la activación de células NK, por ejemplo, la expresión de CD107 o CD137. La CE50 para la respuesta de las células NK NKG2A+ (p. ej., según se determina en un ensayo de movilización con CD107) del anticuerpo bloqueante anti-NKG2A, humZ270, utilizado en los Ejemplos de la presente memoria (p. ej., que tienen la cadena pesada de cualquiera de SEQ ID NOS: 4-8 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 9) es de aproximadamente 4 pg/ml, y la CE100 es de aproximadamente 10 pg/ml. Por tanto, se administra una cantidad de anticuerpo anti-NKG2A para mantener una concentración en sangre continua (mínima) de al menos 4 pg/ml. De manera ventajosa, se puede administrar una cantidad de anticuerpo anti-NKG2A para lograr y/o mantener una concentración en sangre continua (mínima) de al menos 10 pg/ml. Por ejemplo, la concentración en sangre que se debe alcanzar y/o mantener puede estar entre 10-12 pg/ml, 10-15 pg/ml, 10-20 pg/ml, 10-30 pg/ml, 10-40 pg/ml, 10-50 pg/ml, 10-70 pg/ml, 10-100 pg/ml, 10-150 pg/ml o 10-200 pg/ml. Cuando se dirige a dianas de tejidos fuera del sistema vascular (por ejemplo, en el tratamiento de tumores sólidos), se administra una cantidad de anticuerpo anti-NKG2A para lograr y/o mantener una concentración tisular de al menos 10 pg/ml; por ejemplo, se espera que administrando una cantidad de anticuerpo anti-NKG2A que alcance una concentración en sangre de al menos 100 pg/ml, se logre una concentración tisular de al menos 10 pg/ml. Por ejemplo, la concentración en sangre que se debe lograr y/o mantener para lograr/mantener 10 pg/ml en un tejido, puede estar entre 100-110 pg/ml, 100-120 pg/ml, 100-130 pg/ml, 100-140 pg/ml, 100-150 pg/ml, 100-200 pg/ml, 100-250 pg/ml o 100-300 pg/ml.
En algunos aspectos, se administra una cantidad de anticuerpo anti-NKG2A para obtener una concentración en sangre (por ejemplo, suero sanguíneo) que corresponda con al menos la CE50 para una respuesta celular de linfocitos NKG2A+ (por ejemplo, la respuesta de células NK NKG2A+), opcionalmente aproximadamente o al menos aproximadamente, la CE100. Una "CE50" (o "CE100") con respecto a la respuesta de las células NKG2A+ (por ejemplo, la respuesta de las células NK), se refiere a la concentración eficaz de anticuerpo anti-NKG2A que produce un 50% (o 100% cuando se refiere a la CE100) de su máxima respuesta o efecto con respecto a esa respuesta de las células NKG2A+ (por ejemplo, respuesta de las células NK). En algunos aspectos, particularmente para el tratamiento de tumores sólidos, la concentración alcanzada está diseñada para conducir a una concentración en los tejidos (fuera del sistema vascular, por ejemplo, en el entorno del tumor) que corresponde al menos a la CE50 para una respuesta de las células NK NKG2A+, opcionalmente aproximadamente, o al menos aproximadamente, la CE100 para la respuesta de las células NK NKG2 A+.
Los protocolos de tratamiento adecuados para un anticuerpo anti-NKG2A, tal como humZ270, usado en los Ejemplos en este documento que tienen una CE100 para la respuesta de las células NK NKG2A+ de aproximadamente 10 pg/ml, comprenden al menos un ciclo de administración en el que se administra al menos una dosis del anticuerpo anti-NKG2A a una dosis de 2-10 mg/kg, opcionalmente 4-10 mg/kg, opcionalmente 6-10 mg/kg, opcionalmente 2-6 mg/kg, opcionalmente 2-8 mg/kg u opcionalmente 2-4 mg/kg de peso corporal. Opcionalmente, se administran al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 dosis del anticuerpo anti-NKG2A. En un aspecto, el ciclo de administración es de entre 2 y 8 semanas. En un aspecto, el ciclo de administración es de 8 semanas. En un aspecto, el ciclo de administración es de 8 semanas y comprende administrar una dosis del anticuerpo anti-NKG2A cada dos semanas (es decir, un total de cuatro dosis).
En un aspecto de cualquiera de los aspectos de la presente memoria, el anticuerpo anti-NKG2A se administra una vez, aproximadamente cada dos semanas.
Los protocolos de tratamiento adecuados para el uso con un anticuerpo anti-NKG2A, en particular para el tratamiento de un tumor hematopoyético, incluyen, por ejemplo, administrar al paciente un anticuerpo anti-NKG2A dos veces al mes en una cantidad eficaz para mantener una concentración en sangre continua de anticuerpo anti-NKG2A de al menos 10 pg/ml entre al menos dos administraciones sucesivas del anticuerpo anti-NKG2A, de entre 2-10 mg/kg, opcionalmente 2-6 mg/kg, opcionalmente 2-8 mg/kg, opcionalmente 2-4 mg/kg, opcionalmente 2-6 mg/kg, opcionalmente 2-4 mg/kg, opcionalmente aproximadamente de 4 mg/kg de peso corporal. Esas dosis se pueden administrar opcionalmente para proporcionar una concentración en sangre continua de anticuerpo anti-NKG2A de al menos 10 pg/ml durante todo el ciclo de tratamiento. Lograr una concentración en sangre de anticuerpo anti-NKG2A de 10 pg/ml corresponde a la CE100 para un anticuerpo tal como Z270 humanizado.
Los protocolos de tratamiento adecuados para el uso con un anticuerpo anti-NKG2A, particularmente para el tratamiento de un tumor sólido en donde la concentración CE50 del anticuerpo anti-NKG2A se busca en el tejido extravascular (p. ej., en el tumor o en el entorno del tumor) incluyen, por ejemplo, administrar al paciente un anticuerpo anti-NKG2A dos veces al mes en una cantidad eficaz para mantener una concentración en sangre continua del anticuerpo anti-NKG2A de al menos 40 pg/ml entre al menos dos administraciones sucesivas del anticuerpo anti-NKG2A, de entre 2-10 mg/kg, opcionalmente 2-6 mg/kg, opcionalmente 2-4 mg/kg, opcionalmente aproximadamente 4 mg/kg de peso corporal. Esas dosis se pueden administrar opcionalmente para proporcionar una concentración en sangre continua de anticuerpo anti-NKG2A de al menos 40 pg/ml durante todo el ciclo de tratamiento. Se espera que conseguir una concentración en sangre de anticuerpo anti-NKG2A de 40 pg/ml proporcione una concentración tisular (por ejemplo, tejido extravascular, entorno tumoral) de aproximadamente 4 pg/ml, que a su vez corresponde a la CE50 para un anticuerpo tal como Z270 humanizado.
Los protocolos de tratamiento adecuados para el uso con un anticuerpo anti-NKG2A, particularmente para el tratamiento de un tumor sólido, en donde la concentración CE50 del anticuerpo anti-NKG2A se busca en un tejido extravascular (p. ej., en el tumor o el entorno del tumor) incluyen, por ejemplo, administrar al paciente una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-NKG2A, en donde el anticuerpo se administra 2 veces al mes y la cantidad eficaz para mantener una concentración en sangre continua de anticuerpo anti-NKG2A de al menos 100 pg/ml entre al menos dos administraciones sucesivas del anticuerpo anti-NKG2A, es de entre 4-10 mg/kg, opcionalmente 4-6 mg/kg, opcionalmente 4-8 mg/kg, opcionalmente aproximadamente 4 mg/kg, opcionalmente aproximadamente 6 mg/kg, opcionalmente aproximadamente 8 mg/kg u opcionalmente aproximadamente 10 mg/kg. Esas dosis se pueden administrar opcionalmente para proporcionar una concentración en sangre continua de anticuerpo anti-NKG2A de al menos 100 pg/ml durante todo el ciclo de tratamiento. Se espera que lograr una concentración en sangre de anticuerpo anti-NKG2A de 100 pg/ml, proporcione una concentración tisular (por ejemplo, extravascular, entorno tumoral) de aproximadamente 10 pg/ml, que a su vez corresponde a la CE100 para un anticuerpo tal como Z270 humanizado.
Otros protocolos de tratamiento adecuados para el uso con un anticuerpo anti-NKG2A incluyen regímenes que emplean un período de carga a una dosis más alta, seguido de un período de mantenimiento. Por ejemplo, un período de carga puede comprender administrar al paciente una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-NKG2A, en donde el anticuerpo se administra una o más veces en una cantidad eficaz para mantener una concentración en sangre continua de anticuerpo anti-NKG2A de al menos 100 pg/ml hasta la primera administración de anticuerpo anti-NKG2A en el régimen de mantenimiento. Por ejemplo, cuando se administra una vez, se puede administrar una dosis de carga de 10 mg/kg de anticuerpo anti-NKG2A, en donde la primera administración de anticuerpo anti-NKG2A dentro del régimen de mantenimiento tiene lugar aproximadamente dos semanas (o menos) después de la dosis de carga. El régimen de mantenimiento puede emplear entonces una dosis más baja y/o una frecuencia de administración más baja para mantener una concentración en sangre continua de anticuerpo anti-NKG2A de al menos 100 pg/ml entre las administraciones sucesivas dentro del régimen de mantenimiento. Por ejemplo, un régimen de mantenimiento puede comprender la administración de anticuerpo anti-NKG2A cada dos semanas a una dosis de entre 2-10 mg/kg, opcionalmente 4-10 mg/kg, opcionalmente 2-4 mg/kg, opcionalmente 4-6 mg/kg, opcionalmente 4-8 mg/kg, opcionalmente aproximadamente 4 mg/kg, opcionalmente aproximadamente 6 mg/kg, opcionalmente aproximadamente 8 mg/kg.
En ciertos aspectos, se administra una dosis (por ejemplo, cada dosis) del anticuerpo anti-NKG2A a 4, 6, 8 o 10 mg/kg. En ciertos aspectos, se administra una dosis (por ejemplo, cada dosis) del anticuerpo anti-PD-1 a 1-20 mg/kg, opcionalmente a 10 mg/kg. En ciertos aspectos, se administra una dosis (por ejemplo, cada dosis) del anticuerpo anti-PD-L1 a 10, 15, 20 o 25 mg/kg, opcionalmente a una dosis total de 1200 mg. En ciertos aspectos, la terapia combinada permite administrar el anticuerpo anti-PD-1 o PD-L1 a una dosis menor; en un aspecto, cada dosis del anticuerpo anti-PD-1 se administra a 2 o 3 mg/kg.
En un aspecto, el anticuerpo anti-NKG2A y el anticuerpo anti-PD-1 o anti-PD-L1 se administran con las siguientes dosis:
(a) 1-10 mg/kg de anticuerpo anti-NKG2A y (i) 1-10 mg/kg de anticuerpo anti-PD-1 o (ii) 1-20 mg/kg de anticuerpo anti-PD-L1;
(b) 4, 6, 8 o 10 mg/kg de anticuerpo anti-NKG2A y
Figure imgf000022_0001
anticuerpo anti-PD-1 o anti-PD-L1; (c) 4, 6, 8 o 10 mg/kg de anticuerpo anti-NKG2A y
Figure imgf000022_0002
3 mg/kg de anticuerpo anti-PD-1; o
(d) 4, 6, 8 o 10 mg/kg de anticuerpo anti-NKG2A y
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2 mg/kg de anticuerpo anti-PD-1.
En un aspecto de cualquiera de los aspectos de la presente memoria, el anticuerpo anti-NKG2A se administra una vez aproximadamente cada dos semanas. En un aspecto, el anticuerpo anti-PD-1 o anti-PD-L1 se administra una vez aproximadamente cada tres semanas. En un aspecto, el anticuerpo anti-PD-1 o anti-PD-L1 se administra una vez aproximadamente cada dos semanas. En un aspecto, el anticuerpo anti-PD-1 o anti-PD-L1 se administra una vez aproximadamente cada cuatro semanas.
En un aspecto, el anticuerpo anti-PD-1 o anti-PD-L1 y el anticuerpo anti-NKG2A se administran por vía i.v. En un aspecto, el anticuerpo anti-PD-1 o anti-PD-L1 y el anticuerpo anti-NKG2A se administran el mismo día, opcionalmente una vez adicionalmente cada dos semanas, opcionalmente de forma adicional por vía i.v.
En otros aspectos, se proporcionan métodos para identificar células NK y/o linfocitos T NKG2A+PD1+. La evaluación de la coexpresión de NKG2A y PD-1 en células NK y/o linfocitos T se puede usar en métodos de diagnóstico o pronóstico. Por ejemplo, se puede obtener una muestra biológica de un individuo (por ejemplo, a partir de un cáncer o tejido adyacente al cáncer obtenido a partir de un paciente con cáncer) y analizar la presencia de células NK y/o linfocitos T NKG2A+PD1+. La expresión tanto de NKG2A como de PD-1 en tales células se puede usar, por ejemplo, para identificar individuos que tienen células NK y/o linfocitos T que se infiltran en un tumor que son inhibidos por los polipéptidos tanto de NKG2A como de PD1. El método, por ejemplo, puede ser útil como pronóstico de una respuesta al tratamiento con un agente que neutraliza NKG2A, como pronóstico de una respuesta al tratamiento con un agente que neutraliza PD1, o como pronóstico de una respuesta a un tratamiento combinado con un agente que neutraliza NKG2A y un agente que neutraliza PD1.
En un aspecto, se proporciona un método para evaluar si un individuo es adecuado para el tratamiento con un agente que inhibe NKG2A y un agente que neutraliza la actividad inhibidora de PD-1 humana, comprendiendo el método la detección de una población de linfocitos (por ejemplo, linfocitos T CD8+) que expresan tanto un ácido nucleico o un polipéptido de NKG2A como un ácido nucleico o un polipéptido de PD-1 en una muestra biológica procedente de un individuo. Una determinación de que el individuo tiene una población de linfocitos que expresa tanto un ácido nucleico o polipéptido de NKG2A como un ácido nucleico o polipéptido de PD-1, indica que el paciente tiene un cáncer que se puede tratar con un agente que inhibe NKG2A en combinación con un agente que neutraliza la actividad inhibidora de PD-1 humana.
En otros aspectos, se proporcionan métodos para identificar células NK y/o linfocitos T NKG2A+PD1+. El hallazgo de que los linfocitos efectores que se infiltran en un tumor pueden expresar tanto receptores inhibidores de NKG2A como de PD-1, da lugar a métodos de tratamiento mejorados, así como a métodos para detectar esas células efectoras inhibidas/doblemente restringidas que pueden ser útiles en el diagnóstico y el pronóstico.
Por ejemplo, se puede obtener una muestra biológica de un individuo (por ejemplo, a partir de un cáncer o de tejido adyacente a un cáncer obtenido a partir de un paciente con cáncer) y analizar la presencia de células NK y/o linfocitos T NKG2A+PD1+. La expresión tanto de NKG2A como de PD-1 en esas células se puede usar, por ejemplo, para identificar individuos que tienen células NK y/o linfocitos T que se infiltran en un tumor que son inhibidas por polipéptidos tanto de NKG2A como de PD1. El método, por ejemplo, puede ser útil como pronóstico de una respuesta al tratamiento con un agente que neutraliza NKG2A, como pronóstico de una respuesta al tratamiento con un agente que neutraliza PD1, o como pronóstico de una respuesta al tratamiento combinado con un agente que neutraliza NKG2A y un agente que neutraliza PD1.
La detección de células NK y/o linfocitos T CD8 restringidos para NKG2A y PD-1 en muestras biológicas puede tener ventajas más generales para un uso en el estudio, la evaluación, el diagnóstico, el pronóstico y/o la predicción de patologías en las que es de interés una caracterización de las células NK y/o los linfocitos T CD8. Por ejemplo, se puede hacer un pronóstico de un cáncer favorable o desfavorable evaluando si el tumor o los tejidos adyacentes al tumor se caracterizan por infiltrar células NK y/o linfocitos T CD8 infiltrantes que expresan tanto NKG2A como PD-1. Por ejemplo, un cáncer en los pacientes se puede caracterizar o evaluar usando anticuerpos anti-NKG2A y anti-PD1 para evaluar si las células NK y/o los linfocitos T CD8 que se infiltran en un tumor son NKG2A+PD1+, incluyendo si tales células NK y/o linfocitos T CD8 están presentes en la periferia del tumor (en el tejido adyacente al cáncer). Los métodos pueden ser útiles para determinar si un paciente tiene una patología caracterizada por células NK y/o linfocitos T CD8 que podrían ser susceptibles de una modulación mediante agentes terapéuticos que actúan directamente sobre dichas células NK y/o linfocitos T CD8 (por ejemplo, uniéndose a NKG2A y/o a PD-1, o a sus respectivos ligandos HLA-E o PD-L1) o que actúan indirectamente sobre dichas células NK y/o linfocitos T CD8 (p. ej., produciendo citocinas u otras moléculas de señalización que pueden modular la actividad de las células NK y/o linfocitos T CD8). Opcionalmente, en cualquier aspecto, el paciente ha sido tratado con un agente que neutraliza PD-1. Los métodos descritos en el presente documento pueden comprender opcionalmente de forma adicional administrar a un individuo un agente terapéutico de ese tipo, si se determina que el individuo tiene una patología que podría ser susceptible de modulación por agentes terapéuticos que actúan sobre las células NK y/o linfocitos T CD8 que se infiltran en un tumor.
En un aspecto, los inventores proporcionan un método in vitro para detectar un linfocito NKG2A+ PD-1+, opcionalmente una célula NK o un linfocito T CD8+, en donde el método comprende proporcionar una muestra biológica que comprende linfocitos que se infiltran en un tumor y determinar si los linfocitos expresan NKG2A y PD-1.
En un aspecto, los inventores proporcionan un método in vitro para detectar linfocitos T CD8 o células NK que expresan NKG2A y PD-1 (es decir, doblemente positivas) dentro de una muestra de un individuo humano, comprendiendo dicho método proporcionar una muestra de un individuo, poner en contacto las células en dicha muestra usando un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un polipéptido NKG2A humano y un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un polipéptido PD-1 humano en las muestras, y detectar la unión de los anticuerpos a las células. En un aspecto, las células son linfocitos T CD8 y/o células NK.
En un aspecto, los inventores proporcionan un método in vitro para detectar linfocitos T CD8 y/o células NK humanas que se infiltran en un tejido que son inhibidas por NKG2A y PD-1 dentro de una muestra de un individuo humano, comprendiendo dicho método proporcionar una muestra de un individuo, y detectar linfocitos T CD8 y/o células NK que se infiltran en un tejido en dicha muestra usando un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un polipéptido de NKG2A humano y un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un polipéptido de PD-1 humana en las muestras, en donde una detección del polipéptido de NKG2A y PD-1 indica la presencia de linfocitos T CD8 y/o células NK que se infiltran en un tejido, inhibidos por NKG2A y PD-1. Opcionalmente, en cualquier aspecto, el paciente ha sido tratado con un agente que neutraliza PD-1. En un aspecto, la muestra comprende células tumorales, tejido tumoral o tejido adyacente al tumor. En un aspecto, los linfocitos T CD8 y/o las células NK se identifican usando métodos inmunohistoquímicos. En un aspecto, la muestra es una muestra incluida en parafina; opcionalmente, la muestra incluida en parafina se ha fijado, incluido en parafina, seccionado, desparafinizado y transferido a un portaobjetos antes de ponerla en contacto con el anticuerpo monoclonal. En un aspecto, los linfocitos T CD8 y/o las células NK se identifican usando métodos de citometría de flujo.
Ejemplos
Ejemplo 1 - Células tumorales RMA-S y A20 se infiltran con células NK que expresan NKG2A y linfocitos T CD8 que expresan NKG2A y/o PD-1
En general, no se observa que los linfocitos coexpresen NKG2A y PD-1. Para investigar la expresión de esos receptores en linfocitos que infiltran tumores, se estudió la distribución de NKG2A y PD-1 en subconjuntos de células NK y linfocitos T en tumores de ratones. Los linfocitos se extrajeron del bazo, de ganglios linfáticos que drenan los tumores, así como del interior de tumores sólidos.
Se injertaron ratones C57/BL6 (sc) con células PDL-1+ Qa-1+ RMA-S (Qa-1, Qdm, B2m) o con células tumorales A20. Se sacrificaron los ratones portadores de tumores RMA-S Qa-1 Qdm B2m (fila superior) y A20 (fila inferior) cuando los volúmenes tumorales eran de aproximadamente 500 mm3.
Los resultados se muestran en las Figuras 1A y 1B. Las células tumorales (Figura 1 A) y los linfocitos que infiltran tumores -TIL-(Figura 1 B) se analizaron respectivamente por citometría de flujo para estudiar la expresión de Qa-1 y PDL-1 en las células tumorales y NKG2A y PD-1 en los TIL. Se muestra un ratón representativo de cada 3. MFI: mediana de la intensidad de la fluorescencia.
Más de la mitad de las células NK infiltrantes procedentes de ambos tipos de tumores expresaban NKG2A, lo que sugiere que las células NK que infiltran un tumor están inhibidas por NKG2A. Las células NK NKG2A+ generalmente no expresaban cantidades significativas de PD-1. Sin embargo, se encontraron linfocitos T CD8 que eran positivos tanto para NKG2A como para PD-1, lo que sugiere que los linfocitos T CD8 pueden estar restringidos por ambos receptores inhibidores NKG2A y PD-1.
Ejemplo 2 - Subconjuntos de células NK y linfocitos T de ratones que son portadores de tumores rma-rae1 son capaces de coexpresar NKG2A y PD-1
Para investigar más a fondo la expresión de los receptores NKG2A y PD-1, se estudió la distribución de NKG2A y PD-1 en subconjuntos de linfocitos T y células NK en ratones. Los linfocitos se extrajeron del bazo, de ganglios linfáticos (LN) que drenan tumores, así como del interior de tumores sólidos.
A ratones C57/BL6 (sc) se les injertó el clon 6 de RMA- Rae (2 millones de células). Esas células tumorales expresan el ligando de CD94/NKG2A, Qa-1. Los ratones se sacrificaron el día 12 con un volumen tumoral medio: 723 mm3, SD: 161 mm3, n = 4. Después de la preparación de una suspensión celular a partir del bazo, los LN y el tumor, las células se tiñeron del modo siguiente: CD3e con PerCP Cy5.5, NKP46 con Alexa 647, NKG2A/C/E con FITC, PD1 con PE, CD8 con Pacific Blue.
Los resultados se muestran en la Figura 2 y las Tablas 1-3.
En el subconjunto de células NK, las células tanto en los ganglios linfáticos de drenaje como en el bazo eran aproximadamente la mitad positivas para NKG2A y la mitad negativas para NKG2A, sin embargo, en ninguno de los casos había una expresión significativa de PD1. Las células NK de los ganglios linfáticos eran NKG2A+ PD-1-(49,2%) y NKG2A- PD-1-(49,5%), y menos del 1% (media) de las células NK eran NKG2A+ PD-1+. Las células NK del bazo eran NKG2A+ PD-1-(44,1%) y NKG2A- PD-1-(55,7%) y una media del 0,1% (media) de las células NK eran NKG2A+ PD-1+.
En el subconjunto de linfocitos T, la mayoría de las células eran negativas para NKG2A (solo el 1,1% en los ganglios linfáticos y el 4,7% en el bazo eran NKG2A+), y una pequeña fracción de células eran PD-1+ (3,5% en los ganglios linfáticos y el 10% en el bazo eran PD-1+ NKG2A-), sin células doblemente positivas para NKG2A PD-1. Solo el 0,1% (media) de los linfocitos T en los ganglios linfáticos eran NKG2A+ PD-1+ y solo el 0,4% (media) de los linfocitos T en el bazo eran NKG2A+ PD-1+. El 95,1% de los linfocitos T de los ganglios linfáticos eran doblemente negativos y el 85,6% de los linfocitos T del bazo eran doblemente negativos.
En el subconjunto de linfocitos T CD8, la mayoría de las células volvieron a ser negativas para NKG2A (solo el 1,6% en los ganglios linfáticos y el 3,9% en el bazo eran NKG2A+), y una pequeña fracción de las células eran PD-1 (1,1% en los ganglios linfáticos y 2,5% en el bazo eran PD-1+ NKG2A-), sin células doblemente positivas para NKG2A PD-1 significativas. Solo el 0,2% (media) de los linfocitos T en los ganglios linfáticos eran NKG2A+ PD-1+ y solo el 0,3% (media) de los linfocitos T en el bazo eran NKG2A+ PD-1+. El 97,3% de los linfocitos T de los ganglios linfáticos eran doblemente positivos y el 93,6% de los linfocitos T del bazo eran doblemente negativos.
Sin embargo, entre los linfocitos que infiltran tumores (TIL), todos los subconjuntos de células tenían células que expresaban PD-1. Se observó que las células NK, que anteriormente no se encontraban en porcentajes significativos para expresar PD-1, eran positivas para PD-1 en el tumor, incluyendo dentro del subconjunto NKG2A+, con 31,8% (media) de células NK que eran NKG2A+PD-1+. Si bien casi ningún linfocito T CD8 fuera del tumor tenía expresión de NKG2A, los linfocitos T CD8 que expresaban PD-1 eran frecuentes en el tumor (el subconjunto de linfocitos T CD8 que infiltraba el tumor tenía una media de 26,3% de células positivas para NKG2A+). Además, dentro de este subconjunto de linfocitos T CD8 positivos para NKG2A, la mayoría de las células eran NKG2A+ PD-1 (19,4% (media). Sin embargo, entre el subconjunto de linfocitos T CD8-, se observó una ligera diferencia en la expresión de NKG2A entre los TILs y las células del bazo o de los ganglios linfáticos, ya que solo el 5,1% de los linfocitos T en el tumor expresaban NKG2A, y solo el 3,6% de los linfocitos T eran doblemente positivos para NKG2A y PD-1.
Tabla 1: Bazo
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Tabla 2: Ganglios linfáticos que drenan el tumor
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Tabla 3: Linfocitos que infiltran el tumor
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Ejemplo 3 - Expresión de NKG2A y PD-1 en ratones portadores de tumores
Para investigar más a fondo la expresión de NKG2A y PD-1 en ratones portadores de tumores, a ratones C57/BL6 (sc) se injertaron diferentes células tumorales, las líneas RMA- Rae1, MC38 o RMA. Para evaluar la influencia del volumen tumoral, los ratones se sacrificaron cuando sus tumores alcanzaron respectivamente los volúmenes de 500, 2000 y 800 mm3.
Los resultados se muestran en las Figuras 3A y 3B, con RMA Rae1 (fila superior), MC38 (fila media) y RMA (fila inferior). Las células NK (Figura 3A) y los linfocitos T CD8 (Figura 3B) se analizaron mediante citometría de flujo en el bazo, ganglio linfático que drena el tumor (LN) y tumor para estudiar la expresión de NKG2A y PD-1. Se muestra un ratón representativo de cada 2 a 4.
En el subconjunto de células NK, las células del tumor, los ganglios linfáticos y el bazo eran aproximadamente la mitad positivas para NKG2A y la mitad negativas para NKG2A. Ni las células NK (independientemente de su expresión de NKG2A) de los ganglios linfáticos de drenaje ni del bazo mostraban una expresión significativa de PD1. Sin embargo, las células NK que infiltraban el tumor, procedentes de RMA-Rae1 y RMA, expresaban niveles significativos tanto de NKG2A como de PD1. Las células NK que infiltraban el tumor procedentes de la línea tumoral MC38 que se sacrificaron con un volumen particularmente elevado (2000 mm3), expresaban NKG2A (50%) pero no expresaban PD1 significativamente (3%).
A diferencia de las células NK que expresaban NKG2A en aproximadamente la mitad de la población, los linfocitos T CD8 del bazo y los ganglios linfáticos generalmente no expresaban ni NKG2A ni PD1. Sin embargo, en los tumores, una proporción elevada de linfocitos T CD8 expresaban tanto NKG2A como PD1 (28% en RMA-Rae1,43% de MC38 y 40% de RMA eran doblemente positivos). Los resultados sugieren nuevamente que los linfocitos T CD8 que se infiltran en un tumor, así como las células NK, pueden ser capaces de estar restringidos tanto por el receptor inhibidor NKG2A como por PD1, además, a través de diferentes tipos de células tumorales.
Ejemplo 4 - Tratamiento con un AcMo anti-PD-1 aumenta la frecuencia de linfocitos T CD8 que expresan NKG2A en tumores
Para evaluar el efecto del tratamiento con un anticuerpo anti-PD1 en linfocitos T CD8, ratones portadores de tumor MC38 se trataron con 200 pg de control de isotipo (IC) de IgG2a de rata o anticuerpos monoclonales anti-PD-1 de ratón neutralizantes, los días 11, 14 y 17 después de injertar las células. Los ratones (n = 3/grupo) se sacrificaron el día 31 y los linfocitos T CD8 se caracterizaron mediante citometría de flujo en el bazo, el ganglio linfático que drena el tumor (NL) y el tumor. Se representan las medias /- SD (n = 3) de los porcentajes de CD8 NKG2A+ entre los linfocitos T CD8. P <0,005 (***), P <0,0005 (****), análisis estadístico realizado con ANOVA de dos vías seguido de una prueba de comparación múltiple de Tukey.
Los resultados se muestran en la Figura 4. De manera similar a lo observado en otros experimentos, los linfocitos T CD8 del bazo o de los ganglios linfáticos no expresaban significativamente NKG2A. La administración de un anticuerpo anti-PD1 no provocaba ningún cambio en el nivel de expresión de NKG2A en los linfocitos T del bazo o de los ganglios linfáticos. Sin embargo, en la población de linfocitos T CD8 que se infiltraban en un tumor, la administración de un anticuerpo anti-PD1 provocaba un aumento de más del 50% en los linfocitos T CD8 que expresaban NKG2A. Los resultados sugieren que después de un tratamiento con anticuerpo anti-PD1, el receptor NKG2A puede tener una mayor contribución a la inhibición de la respuesta de los linfocitos T CD8 frente a tumores in vivo. Por tanto, la neutralización de NKG2A puede ser útil para revertir la inhibición de los linfocitos T restringidos a NKG2A en individuos tratados con un agente que neutraliza el eje PD-1, tal como un anticuerpo anti-PD1 o PDL1. Ejemplo 5 - Bloqueo combinado con anti-NKG2A/anti-PD1 inhibe el crecimiento tumoral
Para evaluar el efecto de un tratamiento combinado con anticuerpo anti-PD1 neutralizante y anticuerpo anti-NKG2A neutralizante, en ratones C57BL/6 se injertaron (sc) células tumorales RMA-S Qa-1 Qdm B2m y se trataron con un agente anti-PD1 neutralizante (un anticuerpo anti-PD-L1 neutralizante) y un anticuerpo anti-NKG2A neutralizante. Brevemente, los ratones C57BL/6 se asignaron al azar el día 11 cuando el volumen del tumor RMA-S Qa-1 Qdm B2m era de aproximadamente 85 mm3 (n = 8 ratones/grupo) y se trataron con control de isotipo, AcMo anti-NKG2A de ratón (200 pg, iv), AcMo anti-PD-L1 de ratón (200 pg, ip) o una combinación de anti-mNKG2A/mPDL-1, los días 11, 14 y 18. El volumen del tumor se midió dos veces por semana con un calibrador. Los animales fueron sacrificados cuando el tumor creció (volumen >2000 mm3), se ulceró o se necrosó. Los datos representan la mediana del volumen tumoral por experimento.
La evolución de la mediana del volumen tumoral a lo largo del tiempo se muestra en la Figura 5. Mientras que anti-NKG2A producía solo un efecto antitumoral modesto en comparación con el control del isotipo en ese modelo y anti-PD-L1 producía un efecto antitumoral sustancial pero con un volumen tumoral que se incrementaba hacia el día 28, el tratamiento combinado con anti-NKG2A y anti-PD-L1 anulaba completamente el crecimiento tumoral, sin ningún crecimiento significativo del volumen del tumor observado el día 28.

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo que neutraliza NKG2A humano para uso en el tratamiento de un cáncer en un paciente humano, comprendiendo el tratamiento administrar al paciente una cantidad eficaz de cada uno de: (a) un anticuerpo que neutraliza NKG2A humano, y (b) un anticuerpo que neutraliza PD-L1 humano.
2. El compuesto para uso según la reivindicación 1, en el que al menos dos dosis del anticuerpo que neutraliza NKG2A humano se administran en una cantidad eficaz para lograr una concentración en sangre continua de anticuerpo anti-NKG2A de al menos 10 pg/ml durante al menos una semana después de su administración.
3. El compuesto para uso según las reivindicaciones 1 o 2, en donde el tratamiento comprende al menos un ciclo de administración, opcionalmente en donde el ciclo es un período de ocho semanas, en donde para cada ciclo, se administran dos, tres o cuatro dosis del anticuerpo que neutraliza NKG2A humano y se administran dos, tres o cuatro dosis del anticuerpo que neutraliza el anticuerpo de PD-L1.
4. El compuesto para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el anticuerpo que neutraliza NKG2A humano y el anticuerpo que neutraliza PD-L1 se formulan para una administración por separado y se administran de forma concurrente o secuencial.
5. El compuesto para uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el cáncer es un tumor sólido.
6. El compuesto para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el cáncer es un tumor hematológico.
7. El compuesto para uso según la reivindicación 5, en donde el cáncer se selecciona a partir del grupo que consiste en cáncer de pulmón, carcinoma de células renales (RCC), melanoma, cáncer colorrectal y cáncer de ovario.
8. El compuesto para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 5-7, en donde el cáncer es un cáncer que expresa HLA-E.
9. El compuesto para uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde un anticuerpo que neutraliza NKG2A comprende los dominios de CDR1, CDR2 y CDR3 de una cadena pesada que tiene la secuencia indicada en una cualquiera de SEQ ID NOS: 4-8, y los dominios de CDR1, CDR2 y CDR3 de una cadena ligera que tiene la secuencia indicada en SEQ ID NO: 9.
10. El compuesto para uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho anticuerpo que neutraliza NKG2A es un anticuerpo que no reduce el número de células.
11. El compuesto para uso según la reivindicación 10, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo IgG4, en donde dicho anticuerpo carece de un dominio Fc o en donde dicho anticuerpo comprende un dominio Fc que está modificado para reducir la unión entre el dominio Fc y un receptor de Fcy.
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