CN114214430A - Nkg2a在检测小鼠人源肿瘤模型中人nk细胞中的应用 - Google Patents

Nkg2a在检测小鼠人源肿瘤模型中人nk细胞中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了NKG2A在检测小鼠人源肿瘤模型中人NK细胞中的应用，属于生物技术领域。NKG2A在检测小鼠人源肿瘤模型中人NK细胞中的应用。采用NKG2A片段作为检测靶点，可在小鼠荷瘤肿瘤模型中区分人NK细胞)和人肿瘤细胞，具有检测时间短、检测效率和检测灵敏度高的特点，有利于非临床药代动力学的研究，特别是动物实验，在细胞治疗研发的过程中探究其体内的动态，预测治疗方案，对降低细胞治疗的不确定性、增加疗效和减少毒副作用，有很大的帮助，具有重要的临床指导意义。

Description

NKG2A在检测小鼠人源肿瘤模型中人NK细胞中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及NKG2A在检测小鼠人源肿瘤模型中人NK细胞中的应用。
背景技术
NK细胞一般指自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)，是机体重要的免疫细胞，其胞浆丰富，含有较大的嗜天青颗粒，颗粒的含量与NK细胞的杀伤活性呈正相关，以分泌穿孔素及肿瘤坏死因子，摧毁目标细胞。NK细胞不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生，能够识别靶细胞、杀伤介质。常见的NK细胞有外周血来源的NK细胞、脐血来源的NK细胞以及hPSC分化而来的NK细胞等。
NK细胞不表达基因重排的抗原特异性受体，而是依赖一系列种系基因编码的受体。NK细胞表面活化性受体(NKp46，NKp44、NKp30、NKG2D等)或抑制性受体(NKG2A、TIGIT、人抑制性KIR、小鼠Ly49受体等)。NKG2家族蛋白是复杂的受体-配体信号网络中的一类受体，兼具抑制性和激活性，是开发免疫检查点抑制剂非常有吸引力的靶点。NKG2蛋白是C型凝集素，可与细胞表面的CD94二聚。NKG2A是NKG2家族中的“抑制性”成员，表达在CD56hi NK细胞、NKT细胞和CD8+αβT细胞一个亚群中。
随着NK细胞研究的不断深入，近年来NK细胞已逐渐广泛应用到临床，但是目前现有技术研究领域中，众多研究主要集中在如何获得有活性的NK细胞、NK功能研究、NK细胞扩增等方面，而对于获得的NK细胞输注入治疗体后，在生物体组织中检测NK细胞的方法却少有报道，因此研究输注体内的治疗性NK细胞的存留时间、体内组织分布等药物代谢研究内容也就很少。
细胞治疗类药物，研究其在体内药代动力学是判断其疗效和毒副作用必不可少的环节。不同于传统的药物，对于细胞治疗药物进入体内后的动态变化规律，包括吸收、分布、代谢和排泄的过程和特征，目前国际上也未建立明确的体内药代动力学研究方法。
非临床药代动力学研究，特别是动物实验，在新药研发的评价过程中通过研究其在体内的动态，预测治疗方案，对降低细胞治疗的不确定性、增加疗效和减少毒副作用，都有很大的帮助。NK细胞是一种治疗性细胞药物，因此在药物开发中要明确药物代谢动力学等相关研究资料，因此需要研究药物进入生物体后分布。NK细胞是淋巴细胞中的免疫细胞之一，是一种具有强大细胞杀伤能力的细胞。通常NK细胞在人体内巡逻，发现癌细胞或被病毒感染的异常细胞时就会发动攻击，给T细胞等其他细胞攻击癌细胞争取时间。但是NK细胞仅占10％，所以可以通过增加NK细胞的数量来控制癌细胞的增长。目前NK细胞疗法是最被看好的种子选手，并且科学家们不断研究、拓展NK细胞疗法。NK细胞作为机体固有免疫系统中重要的组成部分，在肿瘤免疫方面发挥重要作用。现在研究领域中，已经有了即用型的NK细胞药物，但是更多的研究还需要开展，目前研究的还不彻底，部分在临床阶段。
探究输注生物体内的NK细胞的组织分布、动态变化对后续科学研究及其临床具有重要意义。因此建立检测生物体组织中异体NK细胞的方法对NK细胞及其临床研究具有重要意义。
目前，研究细胞在实验动物中非临床药代动力学研究的方法主要有动物活体成像(如荧光蛋白标记，荧光素、Fe离子等标记细胞)、免疫组化、qPCR等。其中荧光蛋白标记细胞在动物活体成像中应用比较广泛，但在非临床评价中需使用与临床用相同生产工艺的细胞，无法使用荧光蛋白标记的细胞；NK细胞进入小鼠体内后，会持续扩增比较长的时间，荧光素、Fe离子等方法标记细胞后，会随着细胞的扩增而逐渐稀释，且细胞死亡后残留的荧光素、Fe离子会在体内残留比较长的时间，因此无法真实的反映细胞在体内的存留情况。而相比于免疫组化，qPCR法通过在实验中检测受试体的血液或组织中的DNA或RNA表达来实现人源细胞在动物中的更高灵敏度的限量分析，操作相对简单、省时。虽然现有技术中报道过一些区分人与不同动物的DNA序列，但无法应用于无基因编辑的人源细胞在有人源肿瘤动物体内的组织分布研究，因为这些人特异性的DNA序列无法区分治疗用人源细胞和人源肿瘤细胞。因此需要建立一种灵敏度更高、准确性更高，更广泛适合于NK细胞治疗中非临床药代动力学研究的方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种NKG2A在检测小鼠人源肿瘤模型中人NK细胞中的应用，NKG2A能够区分小鼠荷瘤肿瘤模型中人源细胞(NK细胞)和人源肿瘤细胞，更有利于非临床药代动力学的研究，且检测方法更准确，灵敏度高、检测时间短。
本发明提供了NKG2A在检测小鼠人源肿瘤模型中人NK细胞中的应用。
优选的，所述NKG2A包括NKG2A蛋白、NKG2A基因和NKG2A的编码序列中任意一种。
优选的，所述NKG2A的编码序列的核苷酸序列包括以下一种DNA片段；
1)核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的DNA片段；
2)在SEQ ID NO:1的基础上截取15％以上长度的DNA片段。
优选的，所述NKG2A的编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
优选的，所述检测包括利用qPCR技术检测NKG2A基因表达水平和利用免疫印迹检测NKG2A蛋白表达水平。
优选的，所述利用qPCR技术检测NKG2A基因表达水平的试剂包括特异性扩增NKG2A基因的引物对NKG2A-F1/NKG2A-R1。
优选的，所述NKG2A-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
所述NKG2A-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明提供了检测NKG2A表达量的试剂在制备区分人NK细胞和人肿瘤细胞的试剂盒中的应用。
本发明提供了一种用于检测小鼠荷瘤肿瘤模型中人NK细胞的试剂盒，包括特异性扩增NKG2A基因的引物对NKG2A-F1/NKG2A-R1或能特异性结合NKG2A蛋白的抗体或适配体。
本发明提供了一种适合于NK细胞治疗中非临床药代动力学研究的方法，包括以下步骤：
以NKG2A蛋白、NKG2A基因和NKG2A的编码序列中任意一种作为检测靶点，检测待测样品的表达量。
优选的，采用所述应用中特异性扩增NKG2A基因的引物对通过qPCR技术检测待测样品中NKG2A基因的表达量。
本发明提供了NKG2A在检测小鼠人源肿瘤模型中人NK细胞中的应用。本发明首先检测候选特异性基因CD2、NKG2A、NKp46在NK细胞、MOLM13细胞中的表达水平，结果表明NKG2A和NKp46仅在人NK细胞中表达，而不会在MOLM13细胞中表达。进一步筛选发现，NKG2A和NKp46在小鼠组织和MOLM13中均不表达，NKG2A仅在人NK细胞中表达，并且NKG2A比NKp46的检测灵敏度更低。可见，采用NKG2A片段作为检测靶点，可以在实验小鼠荷瘤肿瘤模型中区分人源细胞(NK细胞)和人源肿瘤细胞，有利于非临床药代动力学的研究。
进一步的，本发明提供的应用具体限定了检测方法。所述应用能够在短时间内进行检测，检测时间可以缩短为5-6小时即可完成，大大提高了检测效率、准确度和灵敏度(0.01％)；本发明在检测时，仅需要编码序列提取、反转录以及qPCR试剂，成本低；并且由于NKG2A是NK细胞特异表达的基因，使本发明的检测方法具有准确性高的特点；同时本发明提供的应用为非临床药代动力学研究，特别是动物实验，在细胞治疗研发的过程中探究其体内的动态，预测治疗方案，对降低细胞治疗的不确定性、增加疗效和减少毒副作用，有很大的帮助，具有重要的临床指导意义。
附图说明
图1为含有NKG2A、NKp46标记基因的质粒DNA标准品的结构图；
图2为质粒标准品ΔCT平均值线性分析图；
图3为细胞标准品ΔCT平均值线性分析图。
具体实施方式
本发明提供了NKG2A在检测小鼠人源肿瘤模型中人NK细胞中的应用。
在本发明中，所述NKG2A优选包括NKG2A蛋白、NKG2A基因和NKG2A的编码序列中任意一种。本发明对所述NKG2A蛋白、NKG2A基因的序列没有特殊限制，采用本领域所熟知的NKG2A蛋白、NKG2A基因的序列即可。所述NKG2A的编码序列的核苷酸序列优选包括以下一种DNA片段；
1)核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的DNA片段；
2)在SEQ ID NO:1的基础上截取15％以上长度的DNA片段。在本发明实施例中，通过检测SEQ ID NO:2(AGCTCCATTTTAGCAACTGAACAGGAAATAACCTATGCGGAATTAAACCTTCAAAAAGCTTCTCAGGATTTTCAAGGGAATGACAAAACCTATCACTGCAAAGATTTACCATCAGCTCCAGAGAAGCTCATTGTTGGGATCCTGGGAATTATCTGTCTTATCTTAATGGCCTCTGTGGTAACGATAGTTG)所示的NKG2A编码序列的表达量来说明NKG2A在人NK细胞中高特异性表达。
在本发明中，所述检测优选包括利用qPCR技术检测NKG2A基因表达水平和利用免疫印迹检测NKG2A蛋白表达水平。所述利用qPCR技术检测NKG2A基因表达水平的试剂优选包括特异性扩增NKG2A基因的引物对NKG2A-F1和NKG2A-R1。所述NKG2A-F1核苷酸序列如SEQID NO:3(AGCTCCATTTTAGCAACTGAACA)所示；NKG2A-R1核苷酸序列如SEQ ID NO:4(CAACTATCGTTACCACAGAGGC)所示。引物对NKG2A-F1/NKG2A-R1所得扩增片段如SEQ ID NO:2所示。所述qPCR技术检测程序优选如下：94℃30s；94℃5min，60℃15s，72℃10s，40循环。所述免疫印迹检测蛋白表达水平的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的免疫印迹方法即可。在qPCR检测时，内参基因优选为GAPDH。所述GAPDH的扩增引物优选包括GAPDH-F1和GAPDH-R1。GAPDH-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。GAPDH-R1的核苷酸序列如SEQ IDNO:6所示。
本发明实施例中，采用qPCR技术检测NKG2A基因表达水平证明NKG2A基因仅在人NK细胞中表达，而不在人肿瘤细胞中表达，因此，可以作为区分人NK细胞和人肿瘤细胞的检测靶点。鉴于qPCR技术检测NKG2A基因仅特异性在人NK细胞中表达，能够合理推知基因表达的产物蛋白仅在人NK细胞中表达，不在人肿瘤细胞中表达，因此，通过检测NKG2A蛋白的表达量也能够实现区分人NK细胞和人肿瘤细胞的目的。
本发明提供了检测NKG2A表达量的试剂在制备区分人NK细胞和人肿瘤细胞的试剂盒中的应用。所述试剂包括特异性扩增NKG2A基因的引物或特异性结合NKG2A蛋白的抗体或适配体。在本发明实施例中，以特异性扩增NKG2A基因的引物为例加以说明，但不能理解为对本发明的限制。
本发明提供了一种用于检测小鼠荷瘤肿瘤模型中人NK细胞的试剂盒，包括特异性扩增NKG2A基因的引物对NKG2A-F1和NKG2A-R1或特异性结合NKG2A蛋白的抗体或适配体。所述引物对NKG2A-F1和NKG2A-R1同上述记载，在此不做赘述。本发明对所述特异性结合NKG2A蛋白的抗体或适配体的来源不做特殊限制，采用本领域所熟知的能够特异性结合NKG2A蛋白的抗体或适配体即可。所述试剂盒根据检测原理的不同包括不同种类的试剂。当试剂盒包括引物对NKG2A-F1和NKG2A-R1时，所述试剂盒优选还包括qPCR扩增用试剂和反转录试剂。当试剂盒包括NKG2A蛋白的抗体，所述试剂盒包括免疫印迹用试剂。本发明对所述试剂盒的使用方法没有特殊限制，按照本领域所熟知的qPCR法操作或根据常规的免疫印迹检测方法即可。
本发明提供了一种适合于NK细胞治疗中非临床药代动力学研究的方法，包括以下步骤：
以NKG2A蛋白、NKG2A基因和NKG2A的编码序列中任意一种作为检测靶点，检测待测样品的表达量。
在本发明中，经检测NKG2A基因的检测灵敏度为0.01％(NK细胞数占比)。
在本发明中，所述检测待测样品的表达量的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的基于蛋白、基因以及编码序列的表达量的检测方法即可，例如RT-qPCR、免疫印迹或酶联免疫法等。当检测NKG2A基因表达量时，优选构建含NKG2A基因片段的重组载体。本发明对构建NKG2A基因片段的重组载体的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的重组载体的构建方法即可。
在本发明中，NKp46(基因、编码序列或蛋白)在仅在人NK细胞中表达，不在人肿瘤细胞和小鼠体内表达，因此，本发明将NKG2A联合NKp46在区分人NK细胞和人肿瘤细胞中应用，用于非临床药代动力学的研究。NKp46基因表达量的扩增引物对包括NKp46-F1/NKp46-R1和NKp46-F2/NKp46-R2。所述NKp46-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO:7(TGGACCCGAAGTGATCTCG)所示。NKp46-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO:8(TCCTTGAGCAGTAAGAACATGC)所示。所述NKp46-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO:9(CCACCGAGGGACATACCGAT)所示。NKp46-R2的核苷酸序列如SEQ ID NO:10(GTGCAAGGCTGGTGTTCTCA)所示。其中引物对NKp46-F1/NKp46-R1扩增NKp46基因所得扩增片段如SEQ ID NO:11(TGGACCCGAAGTGATCTCGGGAGAGAAGGTGACCTTCTACTGCCGTCTAGACACTGCAACAAGCATGTTCTTACTGCTCAAGGA)所示。NKp46-F2/NKp46-R2扩增NKp46基因所得扩增片段如SEQ ID NO:12(CCACCGAGGGACATACCGATGTTTTGGCTCCTATAACAACCATGCCTGGTCTTTCCCCAGTGAGCCAGTGAAGCTCCTGGTCACAGGCGACATTGAGAACACCAGCCTTGCAC)所示。将NKG2A联合NKp46在区分人NK细胞和人肿瘤细胞中应用，有利于提高区分的准确性，同时为非临床药代动力学研究提供了重要指导意义。
下面结合实施例对本发明提供的NKG2A基因在检测小鼠人源肿瘤模型中人NK细胞中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。除非另有限定，本文中所使用的的所有技术和科学术语具有与本发明所述技术领域的普通技术人员通常理解相同的含义。如本文所述的术语‘DNA序列’中是指编码蛋白的DNA序列，例如，但不限于，存在于细胞基因组中的编码蛋白的DNA序列。
以下实施例中，总mRNA的提取方法，总mRNA的逆转录以及qPCR检测涉及的试剂，RNA抽提试剂盒购自Tiangen生物公司；RNA逆转录试剂盒购自：Vazyme(诺唯赞)公司；qPCR试剂盒购自：Transgene(北京全式金生物技术有限公司)。MOLM13细胞购自于南京科佰生物科技有限公司。PBNK、iNK来自于安徽中盛溯源生物科技有限公司，其中iNK参见CN202010153358.3制备方法，PBNK来自于本领域常规制备方法获得。其中本发明所述的小鼠荷瘤肿瘤模型中检测人NK细胞方法不仅适用于上述制备方法获得的PBNK/iNK细胞，还适用于本领其他方法获得的PBNK/iNK细胞。小鼠购自于北京维通利华实验动物技术有限公司。实施例中涉及的引物在南京金斯瑞公司合成。质粒来自南京金斯瑞公司合成，其合成方法为本领域技术常规技术。
其中本申请中所述的人胚胎干细胞来源的NK细胞，如涉及人胚胎干细胞，其是未经过体内发育的受精14天以内的人类胚胎分离或者获取干细胞，以及是经过商业化获批的胚胎干细胞或干细胞。
实施例1
候选基因的筛选
1、筛选候选基因：通过NCBI官方网址，检索NK细胞和MOLM13细胞的表达谱，筛选一系列基因在人体NK细胞中高表达，MOLM13细胞(人肿瘤细胞)不表达或者极少数细胞中表达的基因。
检测候选特异性基因CD2、NKG2A、NKp46在NK细胞、MOLM13细胞中的表达水平。
首先利用Tiangen RNA抽提试剂盒(RNAprep Pure Cell/Bacteria Kit，#DP403)对NK细胞、MOLM13细胞样本进行总mRNA的提取；按照2ug RNA的量，通过Vazyme RNA逆转录试剂盒(HiScript II Q RT SuperMix for Qprc，#R223-01)将mRNA逆转录为cDNA，最后按照Transgege qPCR试剂盒(
Figure BDA0003420022500000082
Top Green qPCR SuperMix，#AQ131)，通过RT-qPCR检测方法检测NK细胞、MOLM13细胞中CD2、NKG2A、NKp46基因的表达，反应体系见表1。用于扩增三个基因的引物序列见表2。
表1 RT-qPCR反应体系
Figure BDA0003420022500000081
Figure BDA0003420022500000091
表2设计引物序列表
引物名称 序列 序列编号
CD2-F1 TCAAGAGAGGGTCTCAAAACCA SEQ ID NO:13
CD2-R1 CCATTCATTACCTCACAGGTCAG SEQ ID NO:14
CD2-F2 ACCTGTGAGGTAATGAATGGAAC SEQ ID NO:15
CD2-R2 GTGGTCCACTTGTGTGTGATG SEQ ID NO:16
CD2-F3 AGCCTGAGTGCAAAATTCAAGT SEQ ID NO:17
CD2-R3 AAAACGAGCAGTGCCACAAAG SEQ ID NO:18
NKG2A-F1 AGCTCCATTTTAGCAACTGAACA SEQ ID NO:3
NKG2A-R1 CAACTATCGTTACCACAGAGGC SEQ ID NO:4
NKp46-F1 TGGACCCGAAGTGATCTCG SEQ ID NO:7
NKp46-R1 TCCTTGAGCAGTAAGAACATGC SEQ ID NO:8
NKp46-F2 CCACCGAGGGACATACCGAT SEQ ID NO:9
NKp46-R2 GTGCAAGGCTGGTGTTCTCA SEQ ID NO:10
使用qPCR试剂盒(TransGene，#AQ131)进行qPCR，所有操作在冰上进行。反应体系为每孔10μl，具体反应体系配制如表1，每个样本设3个复孔，qPCR条件：94℃30s；94℃5s,60℃15s，72℃10，40循环，记录CT值。
通过RT-qPCR检测结果如表3所示，可以看出：NKG2A和NKp46-1和NKp46-2在MOLM13上没有扩增，在iNK和PBNK中均有扩增；虽然CD2的3对引物也在MOLM13中没有扩增，但在PBNK和iNK中的扩增CT值差异太大。
表3 RT-qPCR检测结果
Figure BDA0003420022500000092
Figure BDA0003420022500000101
实施例2
将筛选获得的基因NKG2A和NKp46在小鼠组织、MOLM13细胞和NK细胞中的表达情况。
小鼠组织制备：提前准备好研钵和液氮；将新鲜试验小鼠脾脏取出后直接放在倒有液氮的研钵中，边研磨边加液氮，保持液氮一直存在；将研磨好的脾脏组织粉末分装到2个1.5ml EB管中；立即一支加入1ml Trizol，另一支加入700μl DP430试剂盒的裂解液，充分涡旋裂解，5min(2种RNA提取方法)，两种提取方法如表4。
表4小鼠组织2种RNA提取方法
样本 提取方法 洗脱体积 洗脱浓度(ng/μl) 260/280 260/230
1/2小鼠脾脏粉末 DP430 30μl 1239.4 2.14 2.02
1/2小鼠脾脏粉末 Trizol 50μl 1304 2.05 2.05
然后按照上述方法进行RNA抽提、逆转录为cDNA和RT-qPCR操作。使用引物与上述对应引物相同。
通过RT-qPCR检测结果如表5所示，通过表5可知，确定三对引物都是能够扩增NK细胞的特异性引物，且在小鼠组织和MOLM13中均不表达。
表5 RT-qPCR检测结果
Figure BDA0003420022500000102
Figure BDA0003420022500000111
备注：CT值大于/等于35视为不表达。
实施例3
质粒标准品、细胞标准品制备及检测限确定
1.质粒标准品的配制
本实施例中，载体质粒为pUC57；pUC57作为一种常用的载体质粒，其不与NKG2A、NKp46等基因引物产生特异性结合，使检测更准确。采用载体质粒制备含有NKG2A、NKp46标记基因结构的质粒DNA作为标准品，该标准品的结构如图1所示。质粒合成3对引物的扩增序列如表6所示。
表6质粒合成3对引物
Figure BDA0003420022500000112
Figure BDA0003420022500000121
将三对引物扩增序列首尾相连形成融合基因(SEQ ID NO:19，AGCTCCATTTTAGCAACTGAACAGGAAATAACCTATGCGGAATTAAACCTTCAAAAAGCTTCTCAGGATTTTCAAGGGAATGACAAAACCTATCACTGCAAAGATTTACCATCAGCTCCAGAGAAGCTCATTGTTGGGATCCTGGGAATTATCTGTCTTATCTTAATGGCCTCTGTGGTAACGATAGTTGTGGACCCGAAGTGATCTCGGGAGAGAAGGTGACCTTCTACTGCCGTCTAGACACTGCAACAAGCATGTTCTTACTGCTCAAGGACCACCGAGGGACATACCGATGTTTTGGCTCCTATAACAACCATGCCTGGTCTTTCCCCAGTGAGCCAGTGAAGCTCCTGGTCACAGGCGACATTGAGAACACCAGCCTTGCAC)克隆到PUC57载体质粒中(南京金斯瑞公司)：
标准溶液的制备：取出pUC57-NK质粒(注:pUC57-NK储存浓度为100ng/μL)。将质粒稀释成6.79ng/uL的浓度。再按表7将pUC57-NK质粒用Nuclease-free H2O稀释成浓度梯度，作为质粒标准品样本，并做好标记：“质粒标准品溶液#1-8”。注：质粒拷贝数是根据pUC57-NK质粒碱基数(3097bp)按以下公式I计算得出：
(6.02×1023)×(ng×10-9)/(DNA length×660)＝copies 公式I
表7质粒标准品样本的准备
Figure BDA0003420022500000131
按表8将对照组小鼠组织cDNA和NK细胞cDNA混合成相应百分比的细胞标准品样本，并做好标记：“细胞标准品溶液#1-5”。
表8细胞标准品样本的准备
样品编号 NK比例 对照组小cDNA体积 NK细胞cDNA体积
#1 0.001％ 90μl 10μl#2
#2 0.01％ 90μl 10μl#3
#3 0.1％ 90μl 10μl#4
#4 1％ 99μl 1μl#5
#5 100％ - 100μl
按表9将各cDNA样本分别稀释成最终RT-qPCR模板。
表9样品模板的准备
Figure BDA0003420022500000132
Figure BDA0003420022500000141
使用qPCR试剂盒(TransGene，#AQ131)对上述表9试样进行qPCR，所有操作在冰上进行。反应体系为每孔10μl，具体反应体系配制如表1，每个样本设3个复孔，引物信息见表10。GADPH为本领域常规应用内参基因。
表10引物信息
Figure BDA0003420022500000142
表11质粒标准品、细胞标准品qPCR检测结果
Figure BDA0003420022500000143
Figure BDA0003420022500000151
Figure BDA0003420022500000161
根据表11中qPCR检测结果的CT值，质粒标准品ΔCT平均值计算如表12，同时针对不同浓度下对应的ΔCT做线性分析，结果如图2所示，当选用6个及以上梯度浓度的质粒标准品做线性分析时，其线性R2总是小于0.99(图2)，当选用5个及以下梯度浓度的质粒标准品做线性分析时，其线性R2可以呈现大于0.99(见图3)，因此选用质粒标准品#4时的ΔCT作为判断NKG2A引物的最低检测量的标准，即为ΔCT值<19.55时，判定有NK细胞存在并可被检测。
表12质粒标准品ΔCT
名称 ΔCT
质粒标准品#1(0) 21.95
质粒标准品#2(10) 21.26
质粒标准品#3(100) 20.51
质粒标准品#4(10<sup>3</sup>) 19.55
质粒标准品#5(10<sup>4</sup>) 17.405
质粒标准品#6(10<sup>5</sup>) 14.10667
质粒标准品#7(10<sup>6</sup>) 10.84667
质粒标准品#8(10<sup>7</sup>) 7.58
细胞标准品ΔCT平均值计算如表13，根据ΔCT值<19.55，得出NK细胞检测下限是细胞标准品#2(0.01％)。
表13细胞标准品ΔCT
细胞标准品 ΔCT
细胞标准品#1(0.001％) 20.55
细胞标准品#2(0.01％) 19.32
细胞标准品#3(0.1％) 16.323
细胞标准品#4(1％) 12.382
细胞标准品#5(100％) 5.777
实施例4
小鼠荷瘤肿瘤模型各部位组织中人NK细胞检测
注入人NK细胞的小鼠荷瘤肿瘤模型，利用RT-qPCR方法检测NKG2A基因的表达来检测人NK细胞。实验组中设置荷瘤小鼠对照组和荷瘤小鼠治疗组，并在注入NK细胞治疗后的4h、2d取小鼠肝、脾、肺，分别检测这些组织中人NK细胞的分布情况。
按照实施例2记载方法制备质粒标准品和细胞标准品。
小鼠组织准备(制备方法参见实施例1)，抽提RNA并逆转成cDNA，与H2O按1:1混合，见表9(#10，#11，#12)，检测方法参见实施例2。
通过RT-qPCR检测方法(方法参见实施例1)检测细胞中NKG2A基因的表达，反应体系见表1。所用的NKG2A引物同实施例2，每个样本重复检测3次，结果见表14。标准品实验数据参见实施例2表11结果，试验在同一条件下同一次进行。
表14待测样品RT-qPCR检测结果
Figure BDA0003420022500000171
Figure BDA0003420022500000181
备注：ΔCT值<19.55时，判定有NK细胞存在并可被检测。或者检测CT值判断，当实验组小于对照组时，也可认为NK细胞被检测，有NK细胞存在。
由上述实验结果得出：荷瘤小鼠在注射人NK细胞后，4h时在肝和肺检测不到，治疗2天后能在肝脏和肺脏中检测到NK细胞；而在小鼠的脾4h时可以检测到人NK，2天后未检测到人NK细胞。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 安徽中盛溯源生物科技有限公司
<120> NKG2A在检测小鼠人源肿瘤模型中人NK细胞中的应用
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggataacc aaggagtaat ctactcagac ctgaatctgc ccccaaaccc aaagaggcag 60
caacgaaaac ctaaaggcaa taaaagctcc attttagcaa ctgaacagga aataacctat 120
gcggaattaa accttcaaaa agcttctcag gattttcaag ggaatgacaa aacctatcac 180
tgcaaagatt taccatcagc tccagagaag ctcattgttg ggatcctggg aattatctgt 240
cttatcttaa tggcctctgt ggtaacgata gttgttattc cctcacgtca ttgtggccat 300
tgtcctgagg agtggattac atattccaac agttgttact acattggtaa ggaaagaaga 360
acttgggaag agagtttgct ggcctgtact tcgaagaact ccagtctgct ttctatagat 420
aatgaagaag aaatgaaatt tctgtccatc atttcaccat cctcatggat tggtgtgttt 480
cgtaacagca gtcatcatcc atgggtgaca atgaatggtt tggctttcaa acatgagata 540
aaagactcag ataatgctga acttaactgt gcagtgctac aagtaaatcg acttaaatca 600
gcccagtgtg gatcttcaat aatatatcat tgtaagcata agctttag 648
<210> 2
<211> 190
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agctccattt tagcaactga acaggaaata acctatgcgg aattaaacct tcaaaaagct 60
tctcaggatt ttcaagggaa tgacaaaacc tatcactgca aagatttacc atcagctcca 120
gagaagctca ttgttgggat cctgggaatt atctgtctta tcttaatggc ctctgtggta 180
acgatagttg 190
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agctccattt tagcaactga aca 23
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caactatcgt taccacagag gc 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caccatcttc caggagcgag 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gactccacga cgtactcagc 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tggacccgaa gtgatctcg 19
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tccttgagca gtaagaacat gc 22
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccaccgaggg acataccgat 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gtgcaaggct ggtgttctca 20
<210> 11
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tggacccgaa gtgatctcgg gagagaaggt gaccttctac tgccgtctag acactgcaac 60
aagcatgttc ttactgctca agga 84
<210> 12
<211> 113
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ccaccgaggg acataccgat gttttggctc ctataacaac catgcctggt ctttccccag 60
tgagccagtg aagctcctgg tcacaggcga cattgagaac accagccttg cac 113
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tcaagagagg gtctcaaaac ca 22
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ccattcatta cctcacaggt cag 23
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
acctgtgagg taatgaatgg aac 23
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gtggtccact tgtgtgtgat g 21
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
agcctgagtg caaaattcaa gt 22
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
aaaacgagca gtgccacaaa g 21
<210> 19
<211> 387
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
agctccattt tagcaactga acaggaaata acctatgcgg aattaaacct tcaaaaagct 60
tctcaggatt ttcaagggaa tgacaaaacc tatcactgca aagatttacc atcagctcca 120
gagaagctca ttgttgggat cctgggaatt atctgtctta tcttaatggc ctctgtggta 180
acgatagttg tggacccgaa gtgatctcgg gagagaaggt gaccttctac tgccgtctag 240
acactgcaac aagcatgttc ttactgctca aggaccaccg agggacatac cgatgttttg 300
gctcctataa caaccatgcc tggtctttcc ccagtgagcc agtgaagctc ctggtcacag 360
gcgacattga gaacaccagc cttgcac 387

Claims (10)

1.NKG2A在检测小鼠人源肿瘤模型中人NK细胞中的应用。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述NKG2A包括NKG2A蛋白、NKG2A基因和NKG2A的编码序列中任意一种。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述NKG2A的编码序列的核苷酸序列包括以下一种DNA片段；
1)核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的DNA片段；
2)在SEQ ID NO:1的基础上截取15％以上长度的DNA片段。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述NKG2A的编码序列的核苷酸序列如SEQID NO:2所示。
5.根据权利要求2～4任意一项所述应用，其特征在于，所述检测包括利用qPCR技术检测NKG2A基因表达水平和利用免疫印迹检测NKG2A蛋白表达水平。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述利用qPCR技术检测NKG2A基因表达水平的试剂包括特异性扩增NKG2A基因的引物对NKG2A-F1/NKG2A-R1；
所述NKG2A-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
所述NKG2A-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
7.检测NKG2A表达量的试剂在小鼠人源肿瘤模型中检测人NK细胞的试剂盒中的应用。
8.一种用于检测小鼠荷瘤肿瘤模型中人NK细胞的试剂盒，其特征在于，包括特异性扩增NKG2A基因的引物对NKG2A-F1/NKG2A-R1或能特异性结合NKG2A蛋白的抗体或适配体。
9.一种适合于NK细胞治疗中非临床药代动力学研究的方法，其特征在于，包括以下步骤：
以NKG2A蛋白、NKG2A基因和NKG2A的编码序列中任意一种作为检测靶点，检测待测样品的表达量。
10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，采用权利要求7所述应用中特异性扩增NKG2A基因的引物对、权利要求6所述应用的试剂或权利要求8所述试剂盒通过qPCR技术检测待测样品中NKG2A基因的表达量。
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