CN112639133A - Hla-j和其医疗/诊断应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及核酸分子：(a)其编码包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由其组成的多肽，(b)其由SEQ ID NO:2的核苷酸序列组成，(c)其编码与SEQ ID NO:1的氨基酸序列至少70％，优选至少80％相同，更优选至少90％相同，和最优选至少95％相同的多肽；(d)其由与SEQ ID NO:2的核苷酸序列至少70％相同，优选至少80％相同，更优选至少90％相同，和最优选至少95％相同的核苷酸序列组成；(e)其由与(d)的核酸分子简并的核苷酸序列组成；(f)(a)‑(e)中任一项的核酸分子片段，所述片段包括至少150个核苷酸，优选至少300个核苷酸，更优选至少450个核苷酸，和最优选至少600个核苷酸；或(g)对应于(a)‑(f)中任一项的核酸分子，其中T由U取代。

Description

HLA-J和其医疗/诊断应用

本发明涉及核酸分子：(a)其编码包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由其组成的多肽，(b)其由SEQ ID NO:2的核苷酸序列组成，(c)其编码其与SEQ ID NO:1的氨基酸序列至少70％，优选至少80％相同，更优选至少90％相同，和最优选至少95％相同的多肽，；(d)其由与SEQ ID NO:2的核苷酸序列至少70％相同，优选至少80％相同，更优选至少90％相同，和最优选至少95％相同的核苷酸序列组成；(e)其由与(d)的核酸分子简并的核苷酸序列组成；(f)(a)-(e)中任一项的核酸分子片段，所述片段包括至少150个核苷酸，优选至少300个核苷酸，更优选至少450个核苷酸，最优选至少600个核苷酸；或(g)对应于(a)-(f)中任一项的核酸分子，其中T由U取代。

本申请文件中，引用了一些文献，包括专利申请和厂商手册。这些文献的公开内容尽管不视作与本发明专利性相关，但通过引用全文纳入本文。更特定地，所有引用的文献通过引用纳入，程度与各单独文献特定且独立提及通过引用纳入相同。

人白细胞抗原(HLA)系统或复合体是编码人中主要组织相容性复合体(MHC)蛋白的基因复合体。这些细胞表面蛋白负责调节人的免疫系统。HLA基因复合体位于染色体6p21内的3Mbp延伸段。此复合体中的基因分入3个基本组：I类、II类和III类。

人具有3个主要MHC I类基因，称为HLA-A、HLA-B和HLA-C。从这些基因生成的蛋白存在于几乎所有细胞表面。在细胞表面上，这些蛋白结合从细胞内输出的蛋白片段(肽)。MHC I类蛋白将这些肽展示给免疫系统。如果免疫系统将所述肽识别为外来(如病毒或细菌肽)，其通过激发感染细胞自毁来响应。

人中有6个主要MHC II类基因：HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA和HLA-DRB1。MHC II类基因提供制备蛋白的说明，所述蛋白几乎完全在某些免疫系统细胞表面上。如同MHC I类蛋白，这些蛋白将肽展示给免疫系统。

生成自MHC III类基因的蛋白具有一些不同功能；其参与炎症和其他免疫系统活性。一些MHC基因的功能未知。

HLA基因有许多可能的变异，允许每个人的免疫系统针对大范围的外来入侵物质反应。一些HLA基因具有数以百计的鉴定形式(等位基因)，其各自以特定数字(如HLA-B27)给出。密切相关的等位基因分类到一起；例如至少40个极类似等位基因是HLA-B27亚型。这些亚型命名为HLA-B*2701-HLA-B*2743。

超过100种疾病与HLA基因的不同等位基因相关。例如，HLA-B27等位基因增加发展称为强直性脊柱炎的炎性关节疾病的风险。涉及异常免疫功能和一些癌症形式的许多其他疾病也与特定的HLA等位基因相关。然而，关于HLA基因在发展这些疾病的风险中发挥何种作用通常不清楚。

紧挨着3个主要MHC I类基因，非经典MHC I类分子HLA-E、HLA-F HLA-G由HLA I类区编码。HLA-G、-E和-F过表达在多种恶性肿瘤中普遍存在(Kochan等,Oncoimmunology.2013年11月1日；2(11):e26491.)。HLA-G和HLA-E被报告为癌症生物标志物且也与癌症不良临床结果正相关。

此外，报道HLA I类区包括I类假基因(Hughes,Mol Biol Evol.1995年3月；12(2):247-58)以及基因片段。例如，HLA-H、J、K和L归类为I类假基因且HLA-N、S和X归类为基因片段。特别地，Messer等,J Immunol.1992年6月15日；148(12):4043-53报道HLA-J是假基因，这归因于在外显子2或外显子4中生成翻译终止的有害突变。

US 9,353,416B2讨论了HLA-J能用作受乳腺癌影响的患者术后预后的标志物。更特定地，在过表达时，HLA-J与多种其他标志物共同提供良好预后。关于HLA-J序列性质，US9,353,416B2推定由Messer等,J Immunol.1992年6月15；148(12):4043-53报道的HLA-J序列是正确的。此外且与HLA-J是良好预后标志物的推断一致，US 9,353,416 B2对HLA-J作为肿瘤疫苗的潜在用途只字未提。

因此，人白细胞抗原(HLA)基因作为生物医学科学和治疗的重要靶标的研究历史很长。然而，鉴于HLA系统的临床重要性，仍需要将研究集中于HLA基因，尤其是基于HLA系统来鉴定用于生物医学科学和治疗的更多靶标。此需求由本发明满足。与本发明相关，意外发现HLA-J不是假基因，但包括编码HLA-J蛋白的功能性开放阅读框，并且HLA J是用于治疗和检测疾病尤其是肿瘤的靶标。

因此，本发明第一方面涉及核酸分子：(a)其编码包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由其组成的多肽，(b)其由SEQ ID NO:2的核苷酸序列组成，(c)其编码与SEQ ID NO:1的氨基酸序列至少70％，优选至少80％相同，更优选至少90％相同，和最优选至少95％相同的多肽；(d)其由与SEQ ID NO:2的核苷酸序列至少70％相同，优选至少80％相同，更优选至少90％相同，和最优选至少95％相同的核苷酸序列组成；(e)其由与(d)的核酸分子简并的核苷酸序列组成；(f)(a)-(e)中任一项的核酸分子片段，所述片段包括至少150个核苷酸，优选至少300个核苷酸，更优选至少450个核苷酸，最优选至少600个核苷酸；或(g)对应于(a)-(f)中任一项的核酸分子，其中T由U取代。。

本发明所述术语“核酸分子”包括DNA(如cDNA或者双链或单链基因组DNA)和RNA。就此而言，“DNA”(脱氧核糖核酸)指称为核苷酸碱基的化学构件腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)的任何链或序列，所述化学构件在脱氧核糖糖骨架结构上连接在一起。DNA可以具有1条核苷酸碱基链，或可形成双螺旋结构的2条互补链。“RNA”(核糖核酸)指称为核苷酸碱基的化学构件腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)的任何链或序列，所述化学构件在核糖糖骨架结构上连接在一起。RNA通常具有1条核苷酸碱基链，如mRNA。还包括单和双链杂交分子，即DNA-DNA,DNA-RNA和RNA-RNA。核酸分子还可通过本领域已知的许多方式修饰。这类修饰的非限制性示例包括甲基化、“帽”、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸以及核苷酸间修饰例如用不带电连接(如甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酰胺、氨基甲酸酯等)和带电连接(如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些。核酸分子，下文也称为多核苷酸，可包含一个或多个额外共价连接部分，例如蛋白(如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)、嵌入剂(如吖啶、补骨脂素等)、螯合剂(如金属、放射性金属、铁、氧化金属等)和烷化剂。多核苷酸可通过形成甲基或乙基磷酸三酯或烷基磷酰胺酯连接来衍生化。还包括本领域已知的核酸模拟分子，如DNA或RNA的合成或半合成衍生物以及混合聚合物。本发明所述的这类核酸模拟分子或核酸衍生物包括硫代磷酸酯核酸、磷酰胺酯核酸、2’-O-甲氧乙基核糖核酸、吗啉代核酸、己糖醇核酸(HNA)、肽核酸(PNA)和锁核酸(LNA)(参见Braasch和Corey,Chem Biol 2001,8:1)。LNA是RNA衍生物，其中核糖环受2’-氧与4’-碳之间的亚甲基连接约束。还包括含修饰碱基的核酸，例如硫-尿嘧啶、硫-鸟嘌呤和氟-尿嘧啶。核酸分子通常携带遗传信息，包括由细胞机器使用以制备蛋白和/或多肽的信息。本发明的核酸分子可额外包括启动子、增强子、反应元件、信号序列、聚腺苷酸化序列、内含子、5'-和3'-非编码区等。

本发明所述核酸分子编码多肽或其片段，其衍生自SEQ ID NO:1的HLA-J蛋白。因此，优选本发明的核酸分子是基因组DNA或mRNA。在mRNA的情况中，核酸分子可另外包括poly-A尾。

本文所用术语“蛋白”可与术语“多肽”互换使用，描述氨基酸的线性分子链，包括单链蛋白或其片段，含有至少50个氨基酸。本文所用术语“肽”描述由多至49个氨基酸组成的一组分子，而本文所用术语“多肽”(也称为“蛋白”)描述由至少50个氨基酸组成的一组分子。本文所用术语“肽”描述由至少15个氨基酸，至少20个氨基酸，至少25个氨基酸和至少40个氨基酸(偏好增加)组成的一组分子。用术语“(多)肽”指肽和多肽一起的组。(多)肽还可形成由至少2个相同或不同分子组成的寡聚物。这类多聚体的对应的更高级结构相应地称为同或异二聚体、同或异三聚体等。SEQ ID NO:1的HLA-J蛋白在139、175和189位包括半胱氨酸，并因而包括潜在的二聚化位点。此外，本发明也涵盖这种蛋白/(多)肽的模拟肽，其中氨基酸和/或肽键由功能类似物取代。这种功能类似物包括20种基因编码氨基酸以外的所有已知氨基酸，如硒代半胱氨酸。术语“(多)肽”和“蛋白”也指天然修饰的(多)肽及蛋白，其中修饰通过例如糖基化、乙酰化、磷酸化和本领域熟知的类似修饰实现。

根据本发明，术语“序列相同性百分比(％)”描述相较于构成模板核酸或氨基酸序列全长的核苷酸或氨基酸残基数目，2个或多个所比对的核酸或氨基酸序列中相同核苷酸/氨基酸的匹配(“命中”)数。换言之，当比较(子)序列并以比较窗口或指定区域中的最大对应性(如用本领域已知的序列比较算法所测)进行比对时，或当手工比对和目测时，利用针对2种或更多序列或子序列的比对，可确定相同(如70％、75％、80％、85％、90％或95％相同性)氨基酸残基或核苷酸的百分比。此定义也适用于待比对的任何序列互补。

与本发明有关的核苷酸和氨基酸序列分析及比对优选用NCBI BLAST算法完成(Stephen F.Altschul,Thomas L.Madden,Alejandro A.

Jinghui Zhang,ZhengZhang,Webb Miller和David J.Lipman(1997),Nucleic Acids Res.25:3389-3402)。BLAST能用于核苷酸序列(核苷酸BLAST)和氨基酸序列(蛋白BLAST)。技术人员知道其他适当程序可比对核酸序列。

如本文所定义，本发明设想至少70％相同，优选至少80％相同，更优选至少90％相同，最优选至少95％相同的序列相同性。然而，本发明还设想至少97.5％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％和100％(偏好增加)的序列相同性。

此外，优选在与SEQ ID NO:2的核苷酸序列有至少70％相同性，或优选的更高相同性的任意一种的核苷酸序列内，存在SEQ ID NO:2的16核苷酸“TCACACATTTCTGGAA”(SEQ IDNO:3)且保持不变。由图2可明显看出，SEQ ID NO:3对应16核苷酸的插入突变，其仅能在SEQID NO:2的HLA-J核酸分子中找到，但无法在其他HLA种类的核酸分子中找到。因此，该16核苷酸插入是HLA-J核酸分子独有的。此外，该核苷酸插入导致移码，从而从插入直至SEQ IDNO:2中3’末端的完整核酸序列-除了终止密码子“TAG”-编码独特的肽。因此，更优选在与SEQ ID NO:2的核苷酸序列有至少70％相同性，或优选的更高相同性的任意一种的核苷酸序列内，存在SEQ ID NO:2的核苷酸“TCACACATTTCTGGAAACTTCTCAAGGTTCCAAGACTAGGAGGTTCCTC”(SEQ ID NO:4)且保持不变。由SEQ ID NO:4编码的氨基酸是“HTFLETSQGSKTRRFL“(SEQ ID NO:5)。因此，更优选与SEQ ID NO:2的核苷酸序列有至少70％相同性，或优选的更高相同性的任意一种的核苷酸序列编码含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，优选在C-末端。

MHC I类分子一般包括2条链：MHCα链(重链)和β2-微球蛋白链(轻链)。仅α链跨膜。α链具有3个胞外结构域(命名为α1、2和3，α1位于N-末端)。认为HLA-J的α链结构域α1和α3主要决定HLA-J的免疫抑制能力，其中结构域α3最重要。SEQ ID NO6和7的核苷酸序列分别编码HLA-J的结构域α1和α3。SEQ ID NO 8和9的氨基酸序列分别是HLA-J结构域α1和α3的氨基酸序列。因此，优选与SEQ ID NO:2的核苷酸序列有至少70％相同性，或优选的更高相同性的任意一种的核苷酸序列包括与SEQ ID NO:7至少97.5％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％和100％(偏好增加)相同的核苷酸序列。还优选与SEQ ID NO:2的核苷酸序列有至少70％相同性，或优选的更高相同性的任意一种的核苷酸序列编码与SEQ IDNO:9至少97.5％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％和100％(偏好增加)相同的氨基酸序列。更优选与SEQ ID NO:2的核苷酸序列有至少70％相同性，或优选的更高相同性的任意一种的核苷酸序列包括与SEQ ID NO:7至少97.5％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％和100％(偏好增加)相同的核苷酸序列，和/或包括与SEQ ID NO:6至少97.5％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％和100％相同(偏好增加)的核苷酸序列。还优选与SEQ ID NO:2的核苷酸序列有至少70％相同性，或优选的更高相同性的任意一种的核苷酸序列编码与SEQ ID NO:9至少97.5％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％和100％(偏好增加)相同的氨基酸序列，和/或编码与SEQ ID NO:8至少97.5％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％和100％(偏好增加)相同的氨基酸序列。

最优选，与SEQ ID NO:2的核苷酸序列有至少70％相同性，或优选的更高相同性的任意一种的核苷酸序列包括以下2种或所有3种：(i)SEQ ID NO:3，优选SEQ ID NO:4的核苷酸序列，其中SEQ ID NO:4优选位于3’-末端，(ii)与SEQ ID NO:7至少97.5％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％和100％(偏好增加)相同的核苷酸序列，和(iii)与SEQID NO:6至少97.5％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％和100％(偏好增加)相同的核苷酸序列。在(i)-(iii)中2种的情况中，所述2种优选(i)和(ii)。

本发明所述术语“简并”指遗传密码的简并性。产生简并性是因为三联体密码指定20种氨基酸和终止密码子，并且由于存在4种碱基用于编码遗传信息，需要三联体密码生成至少21个不同密码。就三联体中碱基而言可能的43可能性产生64种可能的密码子，意味着一些简并性必须存在。因此，一些氨基酸由多于一种三联体编码，即多至6个。简并性主要由三联体中第三位置的改变引起。这意味着具有与上面所规定的不同的核苷酸序列、但仍编码相同多肽的核酸分子在本发明范围之内。关于本发明的第一方面，技术人员因而理解如条款(e)记载的“(e)由与(d)的核酸分子简并的核苷酸序列组成”指定某一核酸分子，其编码的氨基酸序列与条款(d)所述的核酸分子相同。此氨基酸序列是SEQ ID NO:1的氨基酸序列或从其衍生的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1相同的程度至少如主要实施方式条款(d)列举的序列相同性值所需要和暗示的。

本发明所述(a)-(f)中任一项的核酸分子片段包括至少150个核苷酸。就此而言，优选地(偏好增加)，本发明所述的片段是至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450、至少500、至少550、至少600或至少650个核苷酸的多核苷酸，和最优选地，所述片段是仅缺乏5’-ATP起始密码子和/或3’-TAG终止密码子的片段。此外，优选地，所述片段包括SEQ ID NO:3，优选SEQ ID NO:4，最优选编码SEQ ID NO:5的核苷酸序列。编码SEQ ID NO:5的核苷酸序列优选在片段的3’-末端发现，后面没有其他核苷酸或终止密码子。同样优选的是，所述片段包括与SEQ ID NO:7至少97.5％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％和100％(偏好增加)相同的核苷酸序列，或编码与SEQ ID NO:9至少97.5％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％和100％(偏好增加)相同的氨基酸序列。优选地，所述片段包括与SEQ ID NO:7至少97.5％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％和100％(偏好增加)相同的核苷酸序列，和/或与SEQ ID NO:6至少97.5％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％和100％(偏好增加)相同的核苷酸序列。类似地，更优选所述片段编码与SEQ ID NO:9至少97.5％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％和100％(偏好增加)相同的氨基酸序列，和/或编码与SEQ ID NO:8至少97.5％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％和100％(偏好增加)相同的氨基酸序列。最优选所述片段包括以下2种或所有3种：(i)SEQ ID NO:3，优选SEQ ID NO:4的核苷酸序列，其中SEQ ID NO:4优选位于3’-末端，(ii)与SEQ ID NO:7至少97.5％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％和100％(偏好增加)相同的核苷酸序列，和(iii)与SEQ IDNO:6至少97.5％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％和100％(偏好增加)相同的核苷酸序列。在(i)-(iii)中2种的情况中，所述2种优选(i)和(ii)。

Messer等在1992年(J Immunol.1992年6月15日；148(12):4043-53.)报道HLA-J是假基因，这是因为在外显子2或外显子4中此时翻译终止的有害突变。自此本领域坚信HLA-J是假基因。从下文实施例明显看出，现在才意外发现HLA-J核苷酸序列包括功能性开放阅读框(本文中命名为“开放阅读框3”或“ORF3”)，可靠地推定其编码HLA-J蛋白。功能性开放阅读框的序列如SEQ ID NO:2所示，由此编码的HLA-J蛋白如SEQ ID NO:1所示。因此，在超过25年之后，出乎意料地揭示了HLA-J不是假基因，而是功能基因；参见实施例1。

值得进一步注意的是ORF3包括HLA-J独有的16核苷酸插入。没有其他HLA包括类似序列。由于此插入，HLA-J缺乏HLA-G外显子4的同源物，该外显子编码α结构域结构2。α2样结构域对肽呈递重要。甚至更重要的是，所述插入导致ORF3的独特3-末端，其编码肽“HTFLETSQGSKTRRFL(-终止)”(SEQ ID NO:5)。由于此肽内的多个带电氨基酸和芳族氨基酸，可以可靠地排除HLA-J蛋白包括跨膜区或锚。因此，新鉴定的HLA-J蛋白是分泌蛋白，特征与HLA-G类似，但缺乏肽呈递能力，这归因于缺乏α2样结构域；参见实施例1。

根据本发明第一方面的一个优选实施方式，所述核酸分子融合异源核苷酸序列，优选可操作连接异源启动子。

异源核苷酸序列能直接或间接融合本发明核酸分子。在间接融合的情况中，优选编码肽接头的核苷酸序列用于融合，如GS-接头(如Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n(SEQ ID NO:54)，其中n是1-3)。

本文所用的异源核苷酸序列是无法天然发现融合SEQ ID NO:2的核苷酸序列的序列。应注意SEQ ID NO:2来自人，优选所述异源核苷酸序列也衍生自人。

因此，异源启动子是无法天然发现可操作连接SEQ ID NO:2的核苷酸序列的启动子。所述异源启动子优选来自人。

启动子是起始特定基因转录的核酸序列，所述基因根据本发明衍生自SEQ ID NO:2的HLA-J基因或者是SEQ ID NO:2。有鉴于此，“可操作连接”应指异源启动子融合本发明的核酸分子，从而本发明的核酸分子的转录能通过启动子在例如原核或真核细胞中起始。异源启动子可以是组成型活性启动子、组织特异性或发育阶段特异性启动子、诱导型启动子或合成启动子。组成型启动子在几乎所有组织中指导表达且很大程度上(即使不是全部)不依赖环境和发育因素。由于其表达通常不受内源因子调节，组成型启动子经常跨物种甚至跨生物界具有活性。组织特异性或发育阶段特异性启动子在特定组织或某些发育阶段中指导基因表达。诱导型启动子的活性通过有或没有生物或非生物因素来诱导。诱导型启动子在基因工程中是非常强大的工具(tool)，因为与其可操作连接的基因的表达能按需打开或关闭。通过使不同来源的启动子区域的基本元件集合在一起，构建合成启动子。

本领域为异源表达基因而使用的异源启动子的非限制性示例是SV40、CMV、HSV、UBC、EF1A、PGK、Vlambda1、RSV和CAGG(用于哺乳动物系统)；COPIA和ACT5C(用于果蝇系统)以及GAL1、GAL10、GAL7、GAL2(用于酵母系统)，且还能用于本发明。

或者或另外，异源核酸序列可以是编码序列，从而本发明的核酸序列产生融合蛋白。这类融合蛋白如下文更详细讨论。

如果核酸分子不融合异源启动子，则出于表达目的，其融合自身启动子。

在第二方面，本发明涉及含第一方面的核酸分子的载体。

本发明所述术语“载体”优选指携带本发明的核酸分子的质粒、粘粒、病毒、噬菌体或例如常规用于基因工程的另一载体。本发明的核酸分子可例如插入数个市售可得载体。非限制性示例包括原核质粒载体，如pUC系列、pBluescript(Stratagene)、pET表达载体系列(Novagen)或pCRTOPO(英杰公司(Invitrogen))，和与哺乳动物细胞中表达相容的载体如pREP(英杰公司)、pcDNA3(英杰公司)、pCEP4(英杰公司)、pMC1neo(Stratagene)、pXT1(Stratagene)、pSG5(Stratagene)、EBO-pSV2neo、pBPV-1、pdBPVMMTneo、pRSVgpt、pRSVneo、pSV2-dhfr、pIZD35、pLXIN、pSIR(克隆泰克(Clontech))、pIRES-EGFP(克隆泰克)、pEAK-10(Edge生物系统公司(Edge Biosystems))、pTriEx-Hygro(Novagen)和pCINeo(普洛麦格(Promega))。适合巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)的质粒载体示例包括例如质粒pAO815、pPIC9K和pPIC3.5K(全都是英杰公司)。

插入载体的核酸分子能例如通过标准方法合成，或分离自天然来源。编码序列与转录调节元件和/或其他氨基酸编码序列的连接还能用已建立的方法完成。确保原核或真核细胞中表达的转录调节元件(表达盒的部分)为本领域技术人员所熟知。这些元件包括确保转录起始的调节序列(如翻译起始密码子、启动子如天然相关或异源启动子和/或绝缘子；见上)，内部核糖体进入位点(IRES)(Owens,Proc.Natl.Acad.Sci.USA98(2001),1471-1476)和任选地，确保转录终止及转录物稳定的poly-A信号。额外的调节元件可包括转录以及翻译增强子。优选地，编码本发明的多肽/蛋白或融合蛋白的多核苷酸可操作连接这类表达控制序列，允许在原核或真核细胞中表达。载体还可包括编码分泌信号的核酸序列，如更多调节元件。这种序列为本领域技术人员所熟知。此外，根据所用的表达系统，能指导表达多肽到细胞区室的前导序列可加入本发明多核苷酸的编码序列。这种前导序列为本领域所熟知。

此外，优选载体包括选择性标记。选择性标记示例包括编码新霉素、氨苄青霉素、潮霉素和卡那霉素抗性的基因。特别设计的载体允许DNA在不同宿主之间穿梭，如细菌-真菌细胞或细菌-动物细胞(如可获自英杰公司的Gateway系统)。本发明所述表达载体能指导本发明的多核苷酸和所编码的肽或融合蛋白的复制及表达。除了经载体如噬菌体载体或病毒载体(例如腺病毒、逆转录病毒)引入，上文所述核酸分子可设计用于直接引入或经脂质体引入细胞。另外，杆状病毒系统或基于牛痘病毒或西门利克森林病毒的系统能用作本发明核酸分子的真核表达系统。

在第三方面，本发明涉及用第二方面的载体转化、转导或转染的宿主细胞。

术语“宿主细胞”指任何生物的任何细胞，以任何方式选择、修饰、转化、生长或使用或操作，用于通过细胞生成本发明的蛋白或肽或融合蛋白。

本发明的宿主细胞通常如下生成：将本发明的核酸分子或载体引入宿主细胞，其存在可介导编码本发明的蛋白或肽或融合蛋白的本发明的核酸分子表达。从其衍生或分离宿主细胞的宿主可以是原核或真核细胞或生物，优选除了通过破坏人胚胎直接获得的人胚胎干细胞之外。

例如，用于本发明的合适原核生物(细菌)是一般用于克隆和/或表达的那些，如大肠杆菌(E.coli)(例如大肠杆菌株BL21、HB101、DH5a、XL1 Blue、Y1090和JM101)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、水稻细菌性谷枯病菌(Burkholderia glumae)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、包皮垢分支杆菌(Mycobacterium smegmatis)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。用于上述宿主细胞的合适培养基和条件为本领域所熟知。

合适的真核宿主细胞可以是脊椎动物细胞、昆虫细胞、真菌/酵母细胞、线虫细胞或植物细胞。真菌/酵母细胞可以是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞或曲霉属真菌(Aspergillus)细胞。待用本发明的核酸分子或载体遗传改造的宿主细胞优选示例是酵母、大肠杆菌和/或芽孢杆菌(Bacillus)属物种(例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis))的细胞。在一个优选实施方式中，所述宿主细胞是酵母细胞(如酿酒酵母(S.cerevisiae))。

在一个不同的优选实施方式中，所述宿主细胞是哺乳动物宿主细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小鼠骨髓瘤类淋巴母细胞、人胚胎肾细胞(HEK-293)、人胚胎视网膜细胞(Crucell’s Per.C6)或人羊水细胞(Glycotope和CEVEC)。所述细胞在本领域常用于生成重组蛋白。CHO细胞是最常用的哺乳动物宿主细胞，用于工业生产用于人的重组蛋白治疗剂。

在第四方面，本发明涉及由第一方面的核酸分子编码的蛋白或肽。

术语“蛋白”和“肽”及其优选实施方式在上文中结合本发明的第一方面定义。这些定义和优选实施方式适用于本发明的第四方面。根据第四方面的肽优选与SEQ ID NO:1的子序列至少80％，优选至少90％且最优选至少95％相同。最优选所述肽包括SEQ ID NO:5或由其组成。

本发明的蛋白或肽可通过本领域熟知的分子克隆技术产生。例如，重组表达能用上文所述的载体和宿主细胞实现。

在来自癌症患者的血液和组织样品中检测本发明的蛋白或肽如实施例4所示。

根据一个优选实施方式，本发明的蛋白或肽是融合蛋白。

本发明所述“融合蛋白”包含至少一种额外的异源氨基酸序列。通常但不必然，这些额外的序列会位于(多)肽的N-或C-末端。其可以例如方便地将所述多肽开始表达为融合蛋白，能从其移除额外的氨基酸残基，如通过能特异性修剪融合蛋白并释放本发明的(多)肽的蛋白酶移除。氨基酸序列化合物可直接或间接融合本发明的核酸分子。在间接融合的情况中，肽接头一般可用于融合，如GS-接头(如Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n(SEQ ID NO:54)，其中n是1-3)。

所述融合蛋白的至少一种额外异源氨基酸序列包括赋予所需特性的氨基酸序列，如改良/增强的稳定性、改良/增强的溶解度和/或靶向一种或多种特定细胞类型的能力。例如，与抗体的融合蛋白。术语抗体在下文中进一步定义且包括抗体片段和衍生物。例如，抗体可特异于细胞表面标记或可以是所述抗体的抗原识别片段。本发明的蛋白或肽能融合抗体轻和/或重链的N-末端或C-末端。本发明的蛋白或肽优选融合抗体轻和/或重链的N-末端，从而抗体的Fc部分游离以结合Fc-受体。

融合蛋白也可包括蛋白结构域，其已知在信号转导中发挥功能和/或已知参与蛋白-蛋白相互作用。这类结构域示例是锚蛋白重复序列；arm、Bcl-同源物、Bromo、CARD、CH、Chr、C1、C2、DD、DED、DH、EFh、ENTH、F-盒、FHA、FYVE、GEL、GYF、hect、LIM、MH2、PDZ、PB1、PH、PTB、PX、RGS、RING、SAM、SC、SH2、SH3、SOCS、START、TIR、TPR、TRAF、tsnare、Tubby、UBA、VHS、W、WW和14-3-3结构域。关于这些和其他蛋白结构域的进一步信息可获自数据库InterPro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/,Mulder等,2003,Nucl.Acids.Res.31:315-318),Pfam(http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/,Bateman等,2002,Nucleic Acids Research30(1):276-280)和SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/,Letunic等,2002,NucleicAcids Res.30(1),242-244)。

本发明所述融合蛋白的至少一种额外异源氨基酸序列可包括以下或由其组成：(a)细胞因子，(b)趋化因子，(c)促凝因子，(d)毒性蛋白化合物，和/或(e)用于前体药物激活的酶。

细胞因子优选选自IL-2、IL-12、TNF-α、IFNα、IFNβ、IFNγ、IL-10、IL-15、IL-24、GM-CSF、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-13、LIF、CD80、B70、TNFβ、LT-β、CD-40配体、Fas-配体、TGF-β、IL-1α和IL-1β。由于其为本领域熟知，细胞因子可有利于免疫系统的促炎或抗炎反应。因此，根据待治疗的疾病，与促炎细胞因子或抗炎细胞因子的融合蛋白是有利的。例如，对于治疗炎性疾病，一般优选含抗炎细胞因子的融合构建体，而对于治疗癌症，一般优选含促炎细胞因子的融合构建体。

趋化因子优选选自下组：IL-8、GROα、GROβ、GROγ、ENA-78、LDGF-PBP、GCP-2、PF4、Mig、IP-10、SDF-1α/β、BUNZO/STRC33、I-TAC、BLC/BCA-1、MIP-1α、MIP-1β、MDC、TECK、TARC、RANTES、HCC-1、HCC-4、DC-CK1、MIP-3α、MIP-3β、MCP-1-5、嗜酸细胞活化趋化因子、嗜酸细胞活化趋化因子-2、I-309、MPIF-1、6Ckine、CTACK、MEC、淋巴细胞趋化因子和不规则趋化因子。趋化因子的主要作用是用作化学引诱物以引导细胞迁移。受趋化因子吸引的细胞跟随趋化因子浓度增加的信号，趋向趋化因子来源。结果是，在融合蛋白内，趋化因子能用于引导本发明的蛋白或肽迁移，例如到特定细胞类型或身体位点。

促凝因子优选是组织因子。促凝因子促进血液从液体变成凝胶、形成血块的过程。促凝因子可例如协助伤口愈合。

毒性蛋白化合物优选是蓖麻毒蛋白-A链、莫迪素、截短的假单胞菌外毒素A、白喉毒素和重组白树毒素。毒性化合物能对整个生物机体以及生物结构如特定细胞类型产生毒性作用。毒性化合物常用于治疗肿瘤。肿瘤细胞一般生长快于正常体细胞，从而其优选积聚毒性化合物且量更高。

用于前体药物激活的酶优选是选自羧肽酶、葡萄糖醛酸酶和葡糖苷酶的酶。在就肿瘤疗法评估的大量基因中，编码前体药物激活酶的那些尤其有吸引力，因为其直接补足正在进行中的临床化疗方案。这些酶能激活固有毒性低的前体药物，使用细菌和酵母酶，或通过哺乳动物酶增强前体药物激活。

根据一个优选实施方式，所述蛋白或肽融合异源非蛋白化合物。

本文所用的异源化合物是天然无法发现融合SEQ ID NO:1的氨基酸序列的化合物。

异源非蛋白化合物能直接或间接融合本发明核酸分子。例如，可使用化学接头。化学接头可包含不同官能团，如伯胺、巯基、酸、醇和溴化物。许多我们的交联剂用与胺反应的马来酰亚胺(巯基反应性)和琥珀酰亚胺酯(NHS)或异硫氰酸酯(ITC)基团功能化。

异源非蛋白化合物优选是药物活性化合物或诊断活性化合物。药物活性化合物或诊断活性化合物优选选自(a)荧光染料、(b)光敏剂、(c)放射性核素、(d)用于医学成像的造影剂、(e)毒性化合物或(f)ACE抑制剂、肾素抑制剂、ADH抑制剂、醛固酮抑制剂、血管紧张素受体封闭剂、TSH-受体、LH-/HCG-受体、雌激素受体、孕酮受体、雄激素受体、GnRH-受体、GH(生长激素)受体或者IGF-I或IGF-II的受体。

荧光染料优选是选自Alexa Fluor或Cy染料的组分。

光敏剂优选是光毒性红色荧光蛋白KillerRed或血卟啉。

放射性核素优选选自发射γ的同位素，更优选^99mTc、¹²³I、¹¹¹In，和/或选自正电子发射体，更优选¹⁸F、⁶⁴Cu、⁶⁸Ga、⁸⁶Y、¹²⁴I，和/或选自β发射体，更优选¹³¹I、⁹⁰Y、¹⁷⁷Lu、⁶⁷Cu、⁹⁰Sr，或选自α发射体组，优选²¹³Bi、²¹¹At。

本文所用造影剂是用于在医学成像中提高体内结构或液体对比的物质。常见造影剂基于X射线衰减和磁共振信号增强而运作。

毒性化合物优选是小有机化合物，更优选选自卡奇霉素、美登素、新制癌菌素、埃斯佩拉霉素、dynemicin、可达菌素、maduropeptin、阿霉素、道诺霉素和auristatin的毒性化合物。与上文所述毒性蛋白化合物相反，这些毒性化合物是非蛋白的。

在第五方面，本发明涉及第一方面的核酸分子的抑制剂和/或结合分子，优选第四方面的蛋白的抑制剂，其中(i)本发明第一方面核酸分子的抑制剂优选选自小分子、适体、siRNA、shRNA、miRNA、核酶、反义核酸分子、基于CRISPR-Cas9的构建体、基于CRISPR-Cpf1的构建体、大范围核酸酶、锌指核酸酶和转录激活因子样(TAL)效应物(TALE)核酸酶，和/或(ii)本发明第四方面的蛋白的结合分子优选抑制剂，优选选自小分子、抗体或抗体模拟物和适体，其中抗体模拟物优选选自亲和体、adnectin、抗运载蛋白(anticalin)、DARPin、avimer、nanofitin、affilin、Kunitz结构域肽、

三特异结合分子和probody。

第四方面的蛋白的结合分子是能够结合第四方面的蛋白的化合物。结合分子优选特异性结合第四方面蛋白。特异性结合是指结合分子基本上不结合第四方面蛋白以外的其他蛋白或肽。具体地，优选结合分子不能结合HLA-J以外的其他HLA蛋白。结合分子优选结合HLA-J的C-末端部分，即如Messer等,J Immunol.1992Jun 15；148(12):4043-53所报道的错误推断为终止的C-末端。错误推断终止的实际位置如图1所示且进一步讨论于实施例1。例如，第四方面的蛋白的结合分子适合研究目的。例如，结合第四方面的蛋白的抗体能用于免疫测定，如ELISA或Western印迹。这由实施例4阐明。免疫测定是生化检验，其能测量样品(如溶液)中的第四方面的蛋白的存在或浓度。第四方面的蛋白的结合分子优选能够抑制第四方面的蛋白。此情况中，结合分子是指定的抑制剂。

抑制本发明的核酸分子和/或蛋白表达的化合物根据本发明是(i)降低或妨碍编码本发明核酸分子和/或蛋白的基因转录的化合物，或(ii)降低或妨碍编码本发明蛋白的mRNA翻译的化合物。(i)的化合物包括干扰转录机器和/或其与所述基因的启动子和/或远离启动子的表达控制元件如增强子相互作用的化合物。(ii)的化合物包括干扰翻译机器的化合物。抑制本发明的核酸分子和/或蛋白表达的化合物特异性抑制本发明的核酸分子和/或蛋白表达，例如通过特异性干扰控制表达的启动子区。优选地，本发明的核酸分子和/或蛋白的转录或者本发明的蛋白的翻译(如与没有所述化合物情况下的相同实验设置相比)降低至少50％，更优选至少75％，如至少90％或95％，甚至更优选至少98％，最优选约100％。

根据本发明，抑制本发明的核酸分子和/或蛋白活性的化合物导致所述核酸分子和/或蛋白行使其功能的效率降低。抑制本发明的核酸分子和/或蛋白活性的化合物特异性抑制所述核酸分子和/或蛋白的活性。如下文进一步详述，抑制本发明的核酸分子和/或蛋白活性的化合物可特异性抑制所述核酸分子和/或蛋白的活性，这是通过与核酸分子和/或蛋白本身相互作用或者特异性抑制(优选杀伤)细胞进行的，该细胞生成所述核酸分子和/或生成所述蛋白和/或结合所述蛋白。优选地，本发明核酸分子和/或蛋白活性(如与没有所述化合物情况下的相同实验设置相比)降低至少50％，更优选至少75％，如至少90％或95％，甚至更优选至少98％，最优选约100％。

根据本发明，本发明的核酸分子和/或蛋白的活性优选能在癌症患者中诱导对化疗的抗性和/或减少癌症患者的无进展生存以及总体生存(也参见所附实施例)。本文所指化疗可以是辅助化疗或新辅助化疗，优选新辅助化疗。化疗采用药物来破坏癌细胞，停止其生长，或改善症状。在新辅助(也称为手术前或初始)化疗中，药物治疗在手术摘除肿瘤前进行。这与辅助化疗(其是手术后的药物治疗)不同。用于测定此活性的手段和方法在本领域建立并阐述于下文的实施例。因此，根据本发明的医学方面，本发明的核酸分子和/或蛋白的这些活性受抑制。

抑制剂的抑制效率能通过比较抑制剂存在下的活性水平与没有抑制剂时的活性水平的方法定量。例如，所形成的本发明的核酸分子和/或蛋白的量的改变可用于测量。可在高通量模式中同时测定若干抑制剂的效率。高通量测定与是否是生化、细胞或其他测定无关，一般可在微量滴定板的孔中进行，其中各平板可包含96、384或1536个孔。处理平板优选通过包含移液器的一个或多个计算机控制机器人系统实现，所述处理包括在环境温度以外的温度孵育，和使测试化合物接触试验混合物。在测试化合物待筛选和/或筛选在短时间内实现的大库中，可向各孔加入例如10、20、30、40、50或100种测试化合物的混合物。如果孔显示预期活性，所述测试化合物的混合物可去卷积以在所述混合物中鉴定产生所述活性的一种或多种测试化合物。

抑制本发明的核酸分子和/或蛋白表达和/或活性的化合物可配制为小泡，如脂质体或外来体。脂质体引起了极大的兴趣，因为其从药物递送角度提供特异性和作用持续时间。脂质体细胞类型递送系统用于体内有效递送核酸如siRNA到细胞(Zimmermann等.(2006)Nature,441:111-114)。脂质体是单层或多层小泡，其具有形成自亲脂性材料和水性内部的膜。水性部分包含待递送的组合物。阳离子脂质体具有能够融合细胞壁的优势。尽管非阳离子脂质体无法与细胞壁有效融合，但其通过巨噬细胞或其他细胞体内吞噬。外来体是脂质包装，能携带包括RNA在内的多种不同分子(Alexander等.(2015),Nat Commun；6:7321)。其中含分子的外来体能被受体细胞摄取。因此，外来体是细胞通讯的重要调节物以及细胞定位(niche)的调节物。外来体用于诊断和治疗目的，因为其能用作递送载剂，例如用于造影剂或药物。

抑制本发明的核酸分子和/或蛋白表达和/或活性的化合物能以适当剂量和/或治疗有效量给予对象。这会在下文中结合本发明药物组合物进一步讨论。

观察变化所需的治疗长度和治疗后出现反应的间隔根据所需效果而变化。具体量可通过本领域技术人员熟知的常规试验确定。例如，合适的试验描述于Tamhane和Logan(2002),“用于鉴定药物最小有效和最大安全剂量的多种试验程序(Multiple TestProcedures for Identifying the Minimum Effective and Maximum Safe Doses of aDrug)”,Journal of the American statistical association,97(457):1-9。

抑制本发明的核酸分子和/或蛋白表达和/或活性的化合物优选混合药学上可接受载体或赋形剂以形成药物组合物。合适的药学上可接受载体或赋形剂以及药物组合物配制会在下文中结合本发明的药物组合物讨论。

本文所用的“小分子”优选是有机分子。有机分子涉及或属于有碳基础的化合物种类，碳原子通过碳-碳键连接在一起。术语有机的初始定义涉及化合物来源，有机化合物是获自植物或动物或微生物源的那些含碳化合物，而无机化合物获自矿源。有机化合物可以是天然或合成的。有机分子优选是芳族分子，更优选是芳杂环分子。在有机化学中，术语芳香性用于描述环(环型)、平面(平坦)的分子，其具有共振键的环，显示稳定性大于和相同原子组的其他几何或连接排列。芳族分子非常稳定，且不易分裂开与其他物质反应。在芳杂环分子中，芳环内的至少一个原子是碳以外的原子，如N、S或O。对于所有上述有机分子，分子量优选处于200Da-1500Da范围，更优选处于300Da-1000Da范围。

或者，本发明所述“小分子”可以是无机化合物。无机化合物获自矿源且包括所有无碳原子的化合物(除了二氧化碳、一氧化碳和碳酸盐)。优选地，小分子的分子量小于约2000Da，或小于约1000Da如小于约500Da，甚至更优选小于约Da amu。小分子的大小能通过本领域熟知方式确定，如质谱。小分子可例如基于靶分子晶体结构来设计，其中推定负责生物活性的位点能在体内试验中鉴定和确认，如体内高通量筛选(HTS)试验。

根据本发明所用术语“抗体”包括例如多克隆或单克隆抗体。此外，术语“抗体”包括其衍生物或片段，其仍保留与靶标如SEQ ID NO:1的HLA-J蛋白的结合特异性。抗体片段或衍生物包括Fab或Fab’片段、Fd、F(ab')2、Fv或scFv片段、单域VH或V样结构域如VhH或V-NAR-结构域，以及多聚形式如微抗体(minibody)、双抗体(diabody)、三抗体(tribody或triplebody)、四抗体(tetrabody)或化学缀合的Fab’-多聚体(参见例如Harlow和Lane"抗体，实验室手册(Antibodies,A Laboratory Manual)",冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbor Laboratory Press),198；Harlow和Lane“使用抗体：实验室手册(UsingAntibodies:A Laboratory Manual)”冷泉港实验室出版社,1999；Altshuler EP,Serebryanaya DV,Katrukha AG.2010,Biochemistry(Mosc).,卷75(13),1584；HolligerP,Hudson PJ.2005,Nat Biotechnol.,卷23(9),1126)。多聚形式具体包括能同时结合2种不同类型抗原的双特异抗体。第一抗原能在本发明的蛋白上找到。第二抗原可以是例如在癌细胞或某一类型癌细胞上特异表达的肿瘤标志物。双特异抗体形式的非限制性示例是Biclonics(双特异，全长人IgG抗体)、DART(双亲和性再靶向抗体)和BiTE(由不同抗体的2个单链可变片段(scFvs)组成)分子(Kontermann和Brinkmann(2015),Drug DiscoveryToday,20(7):838-847)。

术语“抗体”也包括实施方式如嵌合(人恒定结构域、非人可变结构域)、单链和人源化(人抗体，除了非人CDR)抗体。

用于生成抗体的各种技术为本领域熟知且描述于例如Harlow和Lane(1988)及(1999)和Altshuler等,2010，其在上述引文中。因此，多克隆抗体能获自用抗原与添加剂和佐剂混合物免疫后的动物血液，单克隆抗体能通过提供抗体的任何技术生成，所述技术提供由连续细胞系培养物产生的抗体。这类技术的示例描述于例如Harlow E和Lane D,冷泉港实验室出版社,1988；Harlow E和Lane D,《使用抗体：实验室手册》,冷泉港实验室出版社,1999且包括最初由

和Milstein,1975描述的杂交瘤技术、三源杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(参见例如Kozbor D,1983,Immunology Today,卷4,7；Li J等.2006,PNAS,卷103(10),3557)和EBV-杂交瘤技术以生成人单克隆抗体(Cole等,1985,Alan R.Liss,Inc,77-96)。此外，重组抗体可获自单克隆抗体或能从头制备，使用多种展示方法如噬菌体、核糖体、mRNA或细胞展示。用于表达重组(人源化)抗体的合适系统可选自例如细菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞系或者转基因动物或植物(参见例如美国专利6,080,560；Holliger P,Hudson PJ.2005,Nat Biotechnol.,卷23(9),11265)。此外，就单链抗体生成描述的技术(参见美国专利4,946,778)能适应生成特异于HLA-J表位的单链抗体。BIAcore系统采用的表面等离子体共振能用于增加噬菌体抗体的效率。

本文所用术语“抗体模拟物”指能如抗体一样特异性结合抗原如在本案中的SEQID NO:1的HLA-J蛋白的化合物，但结构上与抗体不相关。抗体模拟物通常是人工肽或蛋白，摩尔质量为约3-20kDa。例如，抗体模拟物可选自下组：亲和体、adnectin、抗运载蛋白、DARPin、avimer、nanofitin、affilin、Kunitz结构域肽、

三特异结合分子和probody。这些多肽为本领域熟知且在下文中进一步详述。

本文所用术语“亲和体”指衍生自葡萄球菌蛋白A的Z结构域的抗体模拟物家族。在结构上，亲和体基于三螺旋束结构域，其也能纳入融合蛋白。本质上，亲和体具有约6kDa的分子质量且在高温和酸性或碱性条件下稳定。通过13个氨基酸的随机随机化获得靶特异性，所述13个氨基酸位于亲代蛋白结构域的结合活性中涉及的2个α螺旋中(Feldwisch J,Tolmachev V.；(2012)Methods Mol Biol.899:103-26)。

本文所用术语“adnectin”(也称为“单体(minibidy)”)涉及基于人纤连蛋白III第10胞外结构域(10Fn3)的分子，其采用94个残基的Ig样β-夹心折叠，有2-3个外露的环，但缺乏中央二硫键(Gebauer和Skerra(2009)Curr Opinion in Chemical Biology 13:245-255)。有所需靶特异性即针对HLA-J的Adnectin能通过在特定蛋白环引入修饰来遗传改造。

本文所用术语“抗运载蛋白”指衍生自脂质运载蛋白的工程化的蛋白(Beste G,Schmidt FS,Stibora T,Skerra A.(1999)Proc Natl Acad Sci U S A.96(5):1898-903；Gebauer和Skerra(2009)Curr Opinion in Chemical Biology 13:245-255)。抗运载蛋白具有八链β-桶，其形成脂质运载蛋白中的高度保守核心单元且通过开口端的4个结构可变环而天然形成配体的结合位点。抗运载蛋白尽管与IgG超家族不同源，显示的特征迄今为止被视作就抗体结合位点而言典型：(i)序列变化引起的高结构可塑性和(ii)构象柔性提高，允许诱导契合不同形状的靶标。

本文所用术语“DARPin”指设计的锚蛋白重复结构域(166个残基)，其提供由典型三重复β-转角引起的刚性界面。DARPin通常携带对应于人工共有序列的三个重复，其中每个重复有6个位置随机化。因此，DARPin缺乏结构灵活性(Gebauer和Skerra,2009)。

本文所用术语“avimer”指一类抗体模拟物，其由各带30-35个氨基酸的2或多个肽序列组成，其衍生自各种膜受体的A-结构域并通过接头肽连接。靶分子的结合通过A-结构域发生，且有所需结合特异性即针对HLA-J的特异性的结构域能通过例如噬菌体展示技术选择。Avimer所含不同A-结构域的结合特异性可以但不必须相同(Weidle UH等,(2013),Cancer Genomics Proteomics；10(4):155-68)。

“nanofitin”(也称为“affitin”)是一种抗体模拟蛋白，其衍生自嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)的DNA结合蛋白Sac7d。Nanofitin通常具有约7kDa的分子量并通过氨基酸在结合表面随机化设计成特异性结合靶分子如HLA-J(Mouratou B,Béhar G,Paillard-Laurance L,Colinet S,Pecorari F.,(2012)Methods Mol Biol.；805:315-31)。

本文所用术语“affilin”指抗体模拟物，其用γ-B结晶或泛素作为支架开发并通过随机突变修饰这些蛋白表面上的氨基酸。选择有所需靶即HLA-J特异性的affilin通过例如噬菌体展示或核糖体展示技术实现。根据支架，affilins具有约10或20kDa的分子量。本文所用术语affilin也指二聚或多聚形式的affilin(Weidle UH等,(2013),CancerGenomics Proteomics；10(4):155-68)。

“Kunitz结构域肽”衍生自Kunitz型蛋白酶抑制剂的Kunitz结构域，如牛胰蛋白酶抑制剂(BPTI)、淀粉样前体蛋白(APP)或组织因子途径抑制物(TFPI)。Kunitz结构域具有约6kDA的分子量，有所需靶特异性即针对HLA-J的结构域能通过展示技术如噬菌体展示来选择(Weidle等,(2013),Cancer Genomics Proteomics；10(4):155-68)。

本文所用术语

指衍生自人Fyn SH3结构域的非免疫球蛋白衍生的结合多肽。Fyn SH3-衍生的多肽为本领域熟知且描述于例如Grabulovski等.(2007)JBC,282,第3196-3204页,WO 2008/022759,Bertschinger等(2007)Protein Eng Des Sel 20(2):57-68,Gebauer和Skerra(2009)Curr Opinion in Chemical Biology 13:245-255或Schlatter等.(2012),MAbs 4:4,1-12)。

本文所用术语“三特异结合分子”指具有三个结合域并因而能结合，优选特异性结合三个不同表位的多肽分子。这三个表位中的至少一个是本发明第四方面的蛋白的表位。2个其他表位也可以是本发明第四方面的蛋白的表位或可以是1或2个不同抗原的表位。三特异结合分子优选是TriTac。TriTac是用于实体瘤的T细胞衔接器(engager)，其包括三个结合域，设计成具有延长的血清半衰期且为单克隆抗体大小的约三分之一。

本文所用术语“probody”指蛋白酶可激活的抗体前体药物。Probody由原来的IgG重链和经修饰的轻链组成。掩蔽肽经肽接头融合轻链，所述接头可由肿瘤特异性蛋白酶切割。掩蔽肽防止probody结合健康组织，从而尽可能减少毒性副作用。

适体是结合特定靶分子的核酸分子或肽分子。适体经常通过从大随机序列池选择来产生，但天然适体也在核糖开关中存在。适体能作为大分子药物用于基础研究和临床目的。适体能与核酶组合以在其靶分子存在下自切割。这些化合物分子有另外的研究、工业和临床应用(Osborne等.(1997),Current Opinion in Chemical Biology,1:5-9；Stull&Szoka(1995),Pharmaceutical Research,12,4:465-483))。

核酸适体是通常由(经常是短的)寡核苷酸链组成的核酸种类。一般，其通过反复多轮的体外选择或等同的SELEX(指数富集的配体系统进化技术)进行工程化，以结合多个分子靶标如小分子、蛋白、核酸且甚至细胞、组织和生物体。

肽适体通常是设计成干扰细胞内其他蛋白相互作用的肽或蛋白。其由附于蛋白支架2个末端的可变肽环组成。此双重结构限制大幅增加肽适体的结合亲和性水平到相当于抗体(纳摩尔范围)。可变肽环通常包括10-20个氨基酸，支架可以是有良好溶解性质的任何蛋白。目前，细菌蛋白硫氧还蛋白-A是最常用的支架蛋白，可变肽环插入氧化还原活性位点，其在野生型蛋白中是-Cys-Gly-Pro-Cys-环(SEQ ID NO:55)，2个半胱氨酸侧链能够形成二硫键。肽适体选择能用不同系统进行，但目前最广泛使用的是酵母双杂交系统。

适体提供生物技术和治疗应用的功用，因为他们提供的分子识别特性比得上那些常用生物分子尤其是抗体。除了区别性识别，适体提供相对于抗体的优势在于其能在试管中完全改造，易通过化学合成产生，具备所需储存特性，在治疗应用中引起很少或不引起免疫原性。非修饰适体迅速从血流中清除，半衰期从数分钟到数小时，主要归因于核酸酶降解和通过肾从体内清除，这是适体固有低分子量的结果。未修饰适体应用目前集中于治疗短暂病症如血液凝结，或治疗器官如局部递送可行的眼部。此迅速清除可能在诸如体内诊断成像等应用中具有优势。科学家可用数种修饰如2'-氟取代嘧啶、聚乙二醇(PEG)连接、融合白蛋白或其他半衰期延长蛋白等，从而适体的半衰期能增加数天或甚至数周。

如所讨论，上述小分子、抗体或抗体模拟物和适体能特异性结合本发明第四方面的蛋白。此结合可阻断本发明第四方面的蛋白的免疫抑制特性，优选其能在癌症患者中诱导对化疗的抗性和/或减少癌症患者的无进展生存以及总体生存。此情况中，小分子、抗体或抗体模拟物和适体也称为阻断小分子、抗体或抗体模拟物和适体。阻断小分子、抗体或抗体模拟物和适体可阻断本发明第四方面的蛋白与其他细胞组分的相互作用，所述细胞组分例如通常与本发明第四方面的蛋白相互作用的配体和受体。

小分子、抗体或抗体模拟物和适体也能以药物-缀合物形式产生。此情况中，小分子、抗体或抗体模拟物和适体本身可不具有抑制效果，而抑制效果仅由药物赋予。小分子、抗体或抗体模拟物和适体赋予药物对细胞的位点特异性结合，所述细胞生成和/或结合本发明的蛋白。药物优选能杀伤生成和/或结合本发明蛋白的细胞。因此，通过组合本发明蛋白结合分子的靶向能力与药物的细胞杀伤能力，药物缀合物成为允许区分健康与病理组织和细胞的抑制剂。用于设计药物缀合物的可切割和非可切割接头为本领域熟知。能够杀伤细胞的药物非限制性示例是细胞抑制药和直接递送辐射到癌细胞的放射性同位素。

此外，能将小分子、抗体或抗体模拟物和适体的结合和/或抑制活性限制到某些组织或细胞类型，尤其是病理组织或细胞类型。例如，可设计probody。在probody中，小分子、抗体或抗体模拟物或适体结合掩蔽肽，所述掩蔽肽限制或防止结合本发明的蛋白且能通过蛋白酶切割。蛋白酶是通过切割称为底物的特定氨基酸序列而消化蛋白成为较小片段的酶。在正常的健康组织中，蛋白酶活性严格受控。在癌细胞中，蛋白酶活性上调。在蛋白酶活性受调节且极小的健康组织或细胞中，probody的靶结合区域保持遮蔽，因而无法结合。另一方面，在蛋白酶活性上调的病理组织或细胞中，probody的靶结合区域无遮蔽，因而能够结合和/或抑制。

根据本发明，术语“小干扰RNA(siRNA)”也称为短干扰RNA或沉默RNA，指18-30，优选19-25，最优选21-23或甚至更优选21核苷酸长度的双链RNA分子，其在生物学中发挥多种作用。最突出的，siRNA参与RNA干扰(RNAi)通路，其中siRNA干扰特定基因表达。除了其在RNAi通路中的作用，siRNA也作用于RNAi相关通路，如作为抗病毒机制或使基因组染色质结构成形。

自然界中天然发现的siRNA具有明确定义的结构：短双链RNA(dsRNA)，在任一末端有2-nt 3'突出。各链有5'磷酸基和3'羟基(-OH)。此结构是由dicer加工的结果，dicer是将长dsRNA或小发夹RNA转变成siRNA的酶。siRNA也能外部(人工)引入细胞以带来感兴趣基因的特异性敲减。因此，基本上任何序列已知的基因能在序列互补性基础上用适当修剪的siRNA靶向。双链RNA分子或其代谢加工产物能够调节靶特异核酸修饰，尤其是RNA干扰和/或DNA甲基化。外源引入的siRNA可在其3'和5'末端没有突出，然而，优选至少一条RNA链具有5'-和/或3'-突出。优选地，双链的一个末端具有1-5个核苷酸，更优选1-3个核苷酸且最优选2个核苷酸的3'-突出。另一末端可以是钝端或具有多至6个核苷酸的3'-突出。一般，本发明设想适合用作siRNA的任何RNA分子。迄今最有效的沉默用siRNA双链体获得，其由21-nt有义和21-nt反义链构成，配对的方式可具有2-nt 3'-突出。2-nt 3'-突出的序列对限于第一碱基对毗邻未配对核苷酸的靶识别特异性做出小贡献(Elbashir等.2001)。3'突出中的2'-脱氧核苷酸与核糖核苷酸一样有效，但通常合成更便宜且可能更抗核酸酶。siRNA递送可用任何本领域已知方法实现，例如通过组合siRNA与盐水以及静脉内或鼻内给予组合或者在葡萄糖(例如5％葡萄糖)中配制siRNA，或阳离子脂质和聚合物能用于体内siRNA递送，这是通过静脉内(IV)或腹膜内(IP)的系统性路径(Fougerolles等.(2008),CurrentOpinion in Pharmacology,8:280-285；Lu等.(2008),Methods in Molecular Biology,卷437:《药物递送系统-第3章：递送小分子干扰RNA用于新型治疗》(Drug Delivery Systems–Chapter 3:Delivering Small Interfering RNA for Novel Therapeutics))。

小发夹RNA(shRNA)是形成紧密发卡环的RNA序列，其能用于经RNA干扰使基因表达沉默。shRNA使用引入细胞的载体，采用U6启动子以确保shRNA总是表达。此载体通常传递到子细胞上，允许基因沉默被遗传。shRNA发夹结构通过细胞机器切割成siRNA，随后结合RNA诱导沉默复合体(RISC)。此复合体结合并切割mRNA，该mRNA与结合其的siRNA匹配。待用于本发明的si/shRNA优选用适当保护的核糖核苷亚磷酰胺和常规DNA/RNA合成仪化学合成。RNA合成试剂的供应商是Proligo(德国汉堡),Dharmacon Research(美国科罗拉多州拉斐特),皮尔斯化学公司(Pierce Chemical)(部分Perbio Science,美国伊利诺伊州罗克福德),Glen Research(美国弗吉尼亚州斯特林),ChemGenes(美国马萨诸塞州阿什兰)和Cruachem(英国格拉斯哥)。最方便地，siRNA或shRNA获自商业RNA oligo合成供应商，其销售不同品质和价格的RNA合成产品。一般，本发明可应用的RNA常规合成且以适合RNAi的品质容易地提供。

影响RNAi的其他分子包括例如微RNA(miRNA)。所述RNA种类是单链RNA分子。内源存在的miRNA分子通过结合互补mRNA转录物和引发所述mRNA转录物降解，经过与RNA干扰类似的过程调节基因表达。因此，外源miRNA在引入各细胞后可用作HLA-J抑制剂。

核酶(来自核糖核酸酶(ribonucleic acid enzyme)，也称为RNA酶(RNA enzyme)或催化RNA)是催化化学反应的RNA分子。许多天然核酶催化其自身切割或切割其他RNA，但也发现其催化核糖体的转氨酶活性。良好鉴定的自身切割小RNA的非限制性示例是锤头、发夹、丁型肝炎病毒和体外选定前导序列依赖性核酶，而I组内含子是较大核酶的示例。催化自切割的原理在近年来变得完善。在有核酶活性的RNA中锤头核酶表征得最好。因为显示锤头结构能整合入异源RNA序列且核酶活性因而能转移到这些分子，看来可产生用于几乎所有靶序列的催化反义序列，只要靶序列含有潜在的匹配切割位点。构建锤头状核酶的基本原理如下：选择感兴趣的RNA区域，其包含GUC(或CUC)三联体。采用通常各有6-8个核苷酸的2条寡核苷酸链，在其之间插入催化锤头序列。最佳结果经常用短核酶和靶序列获得。

近期发展是识别小化合物的适体与锤头核酶的组合，其也用于本发明。结合靶分子后在适体中诱导的构象变化能调节核酶的催化功能。

本文所用术语“反义核酸分子”指与靶核酸互补的核酸。本发明所述反义分子能够与靶核酸相互作用，更特定地，其能够与靶核酸杂交。由于形成杂交体，靶基因的转录和/或靶mRNA的翻译减少或阻断。描述了涉及反义技术的标准方法(参见例如Melani等,CancerRes.(1991)51:2897-2901)。

CRISPR/Cas9以及CRISPR-Cpf1技术在几乎所有细胞/模式生物可应用，且能用于敲除突变、染色体缺失、DNA序列编辑和基因表达调节。基因表达调节可用催化无活性的Cas9酶(dCas9)操纵，dCas9与转录抑制子缀合以阻遏特定基因转录，在此是HLA-J基因。类似地，催化失活的“死”Cpf1核酸酶(来自普氏菌(Prevotella)和弗朗西斯氏菌(Francisella-1)的CRISPR)能融合合成的转录抑制子或激活因子从而下调内源启动子，如控制HLA-J表达的启动子。或者，锌指核酸酶(ZFN)或转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)的DNA结合域能设计成特异性识别HLA-J基因或其启动子区或其5`-UTR，从而抑制HLA-J基因表达。

本文也设想作为抑制核酸分子提供的抑制剂，其靶向HLA-J基因或参与HLA-J表达的调控分子。这类降低或消除HLA-J或调控分子表达的分子包括但不限于大范围核酸酶、锌指核酸酶和转录激活因子样(TAL)效应物(TALE)核酸酶。这些方法描述于Silva等,CurrGene Ther.2011；11(1):11-27；Miller等,Nature biotechnology.2011；29(2):143-148,和Klug,Annual review of biochemistry.2010；79:213-231。

在第六方面，本发明涉及生成第四方面的蛋白或肽的方法，包括(a)培养第三方面的宿主细胞和(b)分离第四方面的蛋白或肽。

术语“培养”是指宿主细胞在受控条件下生长的过程。这些条件可根据所用宿主细胞而变化。技术人员非常清楚建立优化培养条件的方法。此外，本领域广泛描述了建立、维持和操作细胞培养物。

分离所生成的(多)肽的方法为本领域熟知，包括但步限于诸如离子交换层析、凝胶过滤层析(尺寸排阻层析)、亲和层析、高压液相层析(HPLC)、反相HPLC、圆盘凝胶电泳或免疫沉淀等方法步骤，参见例如Sambrook,2001,《分子克隆：实验室手册》(MolecularCloning:A laboratory manual),第3版,纽约冷泉港实验室出版社。

本发明所述术语“所生成的蛋白或肽”指某一各过程的产物，意味着可以在宿主细胞中已到一个过程，通过所述过程，来自(多)肽编码核酸分子的信息用于合成本发明的(多)肽。此过程的数个步骤可通过本领域已知方法调节，包括转录、RNA剪接、翻译和本发明的肽的翻译后修饰。因此，这类修饰可允许控制所生成的(多)肽的时间、位置和量。

在第七方面，本发明涉及组合物，优选药物或诊断组合物，包括本发明的核酸分子、载体、宿主细胞、蛋白或肽、结合分子，优选抑制剂，或其组合。

本文所用术语“组合物”指含至少一种核酸分子、载体、宿主细胞、蛋白或肽、结合分子优选本发明第五方面的抑制剂或其组合的组合物，其也在以下统称为化合物。

根据本发明，术语“药物组合物”涉及给予患者，优选人患者的组合物。本发明的药物组合物包括上面列举的化合物。其可以任选地包括能够改变本发明化合物特征的更多分子，从而例如稳定、调整和/或激活其功能。组合物可以是固体、液体或气体形式，且可以采用粉末、片剂、溶液或气溶胶形式。本发明的药物组合物可任选地且额外地包括药学上可接受的载体。适当的药物载体的示例为本领域熟知且包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液如油/水乳液、多种类型的湿润剂、无菌溶液、包括DMSO的有机溶剂等。含这样的载体的组合物能通过熟知的常规方法配制。这些药物组合物能以适当剂量给予对象。给药方案由主治医生和临床因素确定。如医学领域熟知的，用于任何一个患者的剂量取决于许多因素，包括患者的尺寸、体表面积、年龄、待给予的具体化合物、性别、给药时间和途径、总体健康状况和同时给予的其他药物。用于给定情况的治疗有效量易通过常规实验确定且在普通临床医生或医生的技术和判断范围内。一般，作为药物组合物常规给药的方案应在每天1μg-5g单位的范围内。然而，更优选的剂量范围可以是每天0.01mg-100mg，甚至更优选0.01mg-50mg且最优选0.01mg-10mg。此外，如果例如所述化合物是iRNA剂如siRNA，给予的药物组合物的总药学有效量通常是小于约75mg/kg体重，例如小于约70、60、50、40、30、20、10、5、2、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001或0.0005mg/kg体重。更优选地，所述量会小于2000nmol iRNA剂(如约4.4x 10¹⁶拷贝)/kg体重，例如小于1500、750、300、150、75、15、7.5、1.5、0.75、0.15、0.075、0.015、0.0075、0.0015、0.00075或0.00015nmol iRNA剂/kg体重。治疗后就反应发生而言观察变化和间隔所需的治疗长度根据所需效果而变化。具体可通过本领域技术人员熟知的常规测试确定。

如下文进一步详述，本发明的药物组合物能用于例如治疗肿瘤(尤其是癌)以及作为疫苗或免疫抑制剂。然而，药物组合物也可用于治疗或防止其他疾病。例如，在本发明的蛋白或肽是融合蛋白的情况中，融合伴侣可赋予对炎性疾病的治疗特异性。如上文所讨论，细胞因子用作融合伴侣可产生适合治疗炎性疾病的融合蛋白。将特定细胞因子引入临床试验以治疗中风、阿尔茨海默病、自身免疫病、伤口愈合和肌萎缩性脊髓侧索硬化症，能利用局部或全身递送细胞因子或炎性细胞因子拮抗剂以治疗慢性疼痛。也如上文所讨论，促凝因子用作融合伴侣可产生适合伤口愈合的融合蛋白。因此，通过融合蛋白，本发明蛋白或肽的治疗应用能经融合伴侣赋予的额外治疗用途而补充，可能甚至引起协同治疗效果。

上文还讨论了放射性核酸金属化物作为本发明蛋白或肽的融合伴侣。含放射性核酸金属化物的融合蛋白可用于放射性配体治疗。在放射性配体治疗中，放射性药物(通常用β发射体标记，如镥-177)特异性结合肿瘤靶结构(通常是表面分子)。例如，放射性药物还可包括抗体，其赋予对肿瘤靶标的特异性结合，从而使放射性核酸金属化物靶向肿瘤。放射性配体治疗一般是用于转移疾病的耐受良好的全身治疗。放射性药物一般灌注或注入待治疗患者的外周静脉。

还可能HLA-J核酸分子、载体、宿主细胞、蛋白或肽、结合分子优选本发明第五方面的抑制剂或其组合本身提供进一步的治疗选择。例如，HLA区域编码在免疫系统中发挥关键作用的数个分子。HLA区域与自身免疫病(AID)之间的强关联已确立超过50年(Gough和Simmons,Curr Genomics.2007Nov；8(7):453–465)。sic AID的非限制性示例是1型糖尿病(T1D)、多发性硬化(MS)、类风湿性关节炎(RA)、格雷夫斯病(GD)、强直性脊柱炎(AS)和全身性红斑狼疮(SLE)。

骨髓移植或器官移植的成功很大程度上取决于受体HLA表型与供体的匹配，以防止移植物抗宿主病(GVHD)。关于哪个HLA基因座临床相关是一个长期争论。随着临床结果数据积累，显然所有HLA基因座相关。因此，能可靠地推断HLA-J也发挥作用。在受体HLA-J表型不能针对供体HLA-J表型匹配的情况中，本发明药物组合物的抑制可以是防止GVHD的方法。

本发明所述的化妆品组合物用于非治疗应用。化妆品组合物也可通过其预期应用定义，作为计划擦、倒、撒或喷涂，或另外施用于人体以清洁、美化、提高吸引力或改变外观的组合物。本发明所述化妆品组合物的具体制剂不受限。设想的制剂包括冲洗液、乳液、乳膏、乳状物、凝胶如水凝胶、油膏、悬液、分散液、粉末、固体胶、泡沫、喷雾和香波。为此，本发明所述化妆品组合物还可包括化妆方面可接受的稀释剂和/或载体。根据所需制剂选择合适的载体和稀释剂在技术人员技术范围内。合适的化妆方面可接受稀释剂和/或载体为本领域熟知且包括Bushell等.(WO 2006/053613)所提及的物质。用于所述化妆品组合物的优选制剂是冲洗溶液和乳膏。待施用于单一应用的本发明所述化妆品组合物的优选量是0.1-10g，更优选0.1-1g，最优选0.5g。待施用的量也取决于待处理的区域且必须适合区域的尺寸。

在第八方面，本发明涉及核酸分子、载体、宿主细胞、蛋白或肽、结合分子优选本发明第五方面抑制剂或其组合作为药物的应用，优选作为免疫抑制剂、作为疫苗或作为怀孕促进剂。

如上文已提及，免疫抑制剂是能够抑制免疫应答的药物。其可用于免疫抑制疗法，例如(i)防止移植器官和组织(如骨髓、心脏、肾、肝)的排异，(ii)治疗自身免疫病或最可能成为自身免疫来源的疾病(如类风湿性关节炎、多发性硬化、重症肌无力、牛皮癣、白癜风、全身性红斑狼疮、结节病、局灶性节段性肾小球硬化、克罗恩氏病、白塞氏病、天疱疮、硬皮病和溃疡性结肠炎)，和/或(iii)治疗非自身免疫性炎症性疾病(如长期过敏性哮喘控制和强直性脊柱炎)。

疫苗优选是能用于治疗现有肿瘤或防止肿瘤发展的肿瘤疫苗。治疗现有癌的疫苗也称为治疗性癌症疫苗。疫苗可以是“自体的”，即制备自取自患者且特异于该患者的样品。癌疫苗接种的方法一般是从癌细胞中分离蛋白并针对这些作为抗原的蛋白来免疫患者，旨在刺激免疫系统从而杀伤癌细胞。本发明所述抗原获自HLA-J蛋白/肽。

因此，本发明还涉及制备肿瘤疫苗的方法，包括将本发明的核酸分子、载体、宿主细胞、蛋白或肽、结合分子优选抑制剂或其组合与至少一种药学上可接受赋形剂、载体和/或稀释剂混合。

实施例2和图4/5显示高水平的HLA-J表达与卵巢癌患者显著减少的无进展生存以及总体生存相关。因此，能可靠地推断HLA-J表达有助于肿瘤避开免疫系统。这进而显示HLA-J用作免疫抑制剂。尽管HLA-J用作免疫抑制剂在肿瘤背景下有害，其在上述本领域通过免疫抑制剂治疗的疾病中可能有利。这也使得用HLA-J疫苗接种肿瘤患者可有助于来抑制或消除肿瘤通过HLA-J表达避开免疫系统至少看起来可行(plausible)。由此，核酸分子、载体、宿主细胞、或本发明蛋白或肽或其组合能用作药物，优选作为免疫抑制剂或疫苗。所述核酸分子优选是第一方面条款(g)的核酸分子。另一方面且如下文进一步详述，结合分子优选本发明第五方面的抑制剂能用于例如治疗肿瘤。

怀孕促进剂是增加怀孕可能性且尤其是胚胎着床可能性的化合物。着床是受精卵贴附子宫壁的妊娠阶段。通过此贴壁，胚胎接受来自母亲的氧气和营养物，从而能够生长。在人中，受精卵的贴壁和着床最可能于排卵后约5-6天发生。认为着床失败在三分之二病例中由不恰当的子宫内膜容受性导致，在三分之一病例中由胚胎本身的问题导致。这也取决于母亲年龄。不恰当的子宫内膜容受性在年轻的母亲中更常见，而胚胎本身的问题(如染色体畸变)在年长的母亲中更频繁(尤其是35岁以上)。不恰当的子宫内膜容受性可能由异常细胞因子和激素信号转导以及表观遗传学变化导致。反复着床失败是女性不孕症的原因。因此，受孕率能通过优化着床的子宫内膜容受性来提高。推断核酸分子、载体、宿主细胞、蛋白或肽或其组合能用于优化着床的子宫内膜容受性，从而促进怀孕。所述核酸分子是第一方面条款(g)的核酸分子。这是因为认为HLA-G在着床中发挥关键作用，其通过调节细胞因子分泌以控制滋养层细胞侵入和维持局部免疫耐受(参见Roussev和Coulam，J AssistReprod Genet.2007Jul；24(7):288–295)。此外，已知着床前胚胎表达可溶性HLA-G和可溶性HLA-F。可溶性HLA-G和可溶性HLA-F的表达水平越高，胚胎的着床率越高。因此预期高水平HLA-J表达也与着床成功同时发生，而低水平HLA-J表达与着床失败同时发生。核酸分子、载体、宿主细胞、蛋白或肽、结合分子优选本发明第五方面抑制剂或其组合因而能用于例如体外受精，其中卵母细胞在核酸分子、载体、宿主细胞、蛋白或肽或其组合存在下培养，然后受精并植入母亲体内。

在第九方面，本发明涉及本发明的结合分子优选抑制剂在药物方面的应用，优选在肿瘤治疗方面的应用。

第九方面还涉及结合分子优选本发明抑制剂作为免疫激活剂的应用，优选在肿瘤治疗方面的应用。

免疫激活剂是能够促进免疫应答的药物。免疫激活剂能用于免疫激活治疗，例如促进和/或起始针对病理细胞的免疫应答。免疫应答优选是针对病理细胞的细胞毒性免疫应答和/或T细胞反应。

如所述，免疫激活剂优选用于肿瘤治疗背景。从所附实施例明显看出，HLA-J在肿瘤中表达。HLA-J是分泌蛋白且下文实施例的数据显示HLA-J由肿瘤细胞分泌，其中HLA-J蛋白“云”最可能在肿瘤细胞周围形成，该云保护肿瘤细胞免于被免疫系统识别并移除。本发明的结合分子优选抑制剂从肿瘤细胞去除此保护云，从而促进和/或起始针对肿瘤细胞的免疫应答。此免疫激活机制适用于肿瘤细胞以外的其他病理细胞。

肿瘤是组织的异常良性或恶性新生长，其不具备生理功能并由不受控且通常快速的细胞增殖引起。肿瘤优选是癌症。癌症是组织的异常恶性新生长，其不具备生理功能并由不受控且通常快速的细胞增殖引起。癌症优选选自乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、阴道癌、女阴癌、膀胱癌、唾液腺癌、胰腺癌、甲状腺癌、肾癌、肺癌、涉及上消化道的癌、结肠癌、结直肠癌、前列腺癌、头颈部鳞状细胞癌、宫颈癌、成胶质细胞瘤、恶性腹水、淋巴瘤和白血病。此癌症列表中，优选妇科癌症(即宫颈癌、卵巢癌、子宫癌、阴道癌和外阴癌)，最优选乳腺癌和卵巢癌。此癌症列表中，还优选膀胱癌。

肿瘤或癌症优选是实体瘤或癌症。实体瘤或癌症是异常组织团块，通常不含囊肿或液体区域，与液体瘤不同。

如实施例2所证明和图4及5所示，高水平HLA-J mRNA表达与卵巢癌患者显著减少的无症状生存以及总体生存相关。类似地，实施例3和图10显示化疗前测得高水平HLA-J的乳腺癌患者不太响应化疗。最后，实施例5和图18显示膀胱癌患者的高水平HLA-J mRNA表达。因此结合本发明意外发现，抑制HLA-J如HLA-J的表达和/或翻译适用于肿瘤治疗。

在第十方面，本发明涉及获自对象的样品中第一方面条款(g)的核酸分子或第四方面的蛋白或肽，用于诊断肿瘤和/或分级肿瘤和/或肿瘤预后和/或肿瘤分类为HLA-J低表达肿瘤或HLA-J高表达肿瘤和/或诊断和/或诊断着床失败。

如所述，肿瘤优选是癌症。同样如所述，也结合本发明的这一方面，肿瘤或癌症优选是实体瘤或癌症。

样品可以是对象体液或来自对象器官的组织样品。体液的非限制性示例是全血、血浆、血清、尿、腹膜液和胸膜液、脑脊髓液、泪液或从中溶于溶液的细胞。组织的非限制性示例是结肠、肝、乳房、卵巢和睾丸。组织样品可通过抽吸或穿刺、切除或者通过产生活检或切除细胞材料的任何其他手术方法采集。样品可以是经加工的样品，如经冷冻、固定、包埋等的样品。优选样品类型是甲醛固定石蜡包埋(FFPE)样品。制备FFPE样品是标准医疗操作且这些样品能长期保存。

本文所用术语“诊断”涉及在受疾病症状影响的对象中鉴定疾病。根据本发明，所述疾病是肿瘤或着床失败。本文所用术语“分级”涉及在诊断具有肿瘤的对象中鉴定肿瘤细胞的细胞间变程度。用于分级肿瘤的最常见系统是根据美国癌症联合委员会指南的系统。依据这些指导方针，区分下列分级类别：GX(级别无法评定)、G1(高分化，低级别)、G2(中度分化，中级别)、G3(低分化，高级别)、G4(未分化，高级别)。本文所用术语“预后”涉及从疾病如肿瘤恢复的前景或机会和/或疾病如肿瘤存活的前景或机会。在肿瘤的情况中，预后可包括靶样病变肿瘤尺寸变化、疾病特异性生存率(DSS)、无复发生存率(RFS)、无进展生存率(PFS)和远期无复发生存率的一种或多种，其中优选DSS。

本发明所述术语“对象”指哺乳动物，优选家畜或宠物如马、牛、猪、绵羊、山羊、狗或猫，最优选人。

如上所讨论，肿瘤患者的HLA-J表达水平增加与肿瘤患者显著减少的无进展生存率以及总生存率相关。因此，更高水平的HLA-J表达也与更高肿瘤等级同时发生。在所有肿瘤样品发现HLA-J表达的实施例中进一步证明，HLA-J表达不能仅用作预后标志物，而且也作为肿瘤的诊断标志物。

在上面的应用中，可纳入阳性和/或阴性样品以及预定标准品。对照可获自一个或多个对象的样品，如至少5、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1000、至少1500或至少2000个对象。预定标准制定先前从阳性和/或阴性样品获得的值。

对于肿瘤诊断，认为完全不需要标准品，因为预期健康对象不表达HLA-J。此外，实施例显示在所有研究的肿瘤患者中检测到HLA-J表达。然而，阳性和/或阴性样品以及预定标准可纳入本发明的诊断肿瘤应用。对于诊断，阳性样品来自已知具有肿瘤的一个或多个对象，优选与待诊断的身体位置相同处的肿瘤。类似地，阴性样品来自已知没有肿瘤的一个或多个对象。如果样品中第一方面的核酸分子或第四方面的蛋白或肽的表达水平相较于阴性对照或从其获得的预定标准品增加至少1.5倍、2倍、3倍、4倍(偏好增加)，则对象诊断为具有肿瘤。如果样品中第一方面核酸分子或第四方面蛋白或肽的表达水平与阳性对照或从中所获得预定标准的不同小于50％、小于25％和小于10％(偏好增加)，则对象诊断为具有肿瘤。例如，如果阳性对照设为100％，展示150％-50％，优选125％或75％的患者诊断为具有肿瘤。

同样对于诊断着床失败，可使用阳性和/或阴性样品以及预定标准品。对于诊断，阳性样品来自一个或多个女性对象，所述对象有至少1次着床失败，优选至少2次着床失败且最优选至少3次着床失败。2次或更多着床失败也称为重复或反复着床失败。类似地，阴性样品来自一个或多个女性对象，所述对象有至少1次成功怀孕，优选至少2次成功怀孕且最优选至少3次成功怀孕。如果样品中第一方面的核酸分子或第四方面的蛋白或肽的表达水平相较于阴性对照或从其获得的预定标准品减少至少1.5倍、2倍、3倍、4倍(偏好增加)，则女性对象诊断为有着床失败。如果样品中第一方面核酸分子或第四方面蛋白或肽的表达水平与阳性对照或从中所获得预定标准的不同(即更高或更低)小于50％、小于25％和小于10％(偏好增加)，则对象诊断为有着床失败。例如，若阳性对照设为100％，展示125％或75％值的患者诊断为有着床失败。

关于肿瘤分类为HLA-J低表达肿瘤或HLA-J高表达肿瘤，应注意不是每一个肿瘤预期表达或表达大量HLA-J。因此，为了揭示在肿瘤对象中结合分子优选本发明第五方面抑制剂是否可以是治疗选择，肿瘤能分类为HLA-J低表达肿瘤或HLA-J高表达，其中仅在后一种情况中，结合分子或抑制剂是一个选择。对于分类，对照可来自一个或多个对象，所述对象已知具有表达HLA-J的肿瘤且优选已知具有可通过结合分子优选本发明第五方面抑制剂治疗的肿瘤。在待分类肿瘤的HLA-J表达相较于对照减少至少2倍、至少3倍、至少3倍、至少4倍和至少5倍(偏好增加)的情况中，肿瘤是HLA-J低表达肿瘤。另一方面，在待分类肿瘤的HLA-J表达相较于对照增加至少2倍、至少3倍、至少3倍、至少4倍和至少5倍(偏好增加)的情况中，肿瘤是HLA-J高表达肿瘤。

对于预后，阳性对照可来自一个或多个死于肿瘤(优选与待预测身体位置相同的肿瘤)的对象，阴性样品可来自一个或多个在肿瘤情况下存活大量时间而无肿瘤发展(优选与待预测相同身体位置的肿瘤)的对象。大量指定至少1年、至少2年、至少3年、至少4年和至少5年(偏好增加)。如果样品中第一方面的核酸分子或第四方面的蛋白或肽的表达水平相较于阳性对照或从中获得的预定标准减少至少1.5倍、2倍、3倍、4倍(偏好增加)，则对象的预后良好。如果样品中第一方面的核酸分子或第四方面的蛋白或肽的表达水平与阴性对照或从其获得的预定标准品的不同(偏好如下增加)小于50％、小于25％和小于10％，则对象同样预后良好。如果样品中第一方面核酸分子或第四方面蛋白或肽的表达水平相较于阴性对照或从其获得的预定标准品增加至少1.5倍、2倍、3倍、4倍(偏好增加)，则对象的预后不良。如果样品中第一方面的核酸分子或第四方面的蛋白或肽的表达水平与阳性对照或从其获得预定标准品的不同小于50％、小于25％和小于10％(偏好增加)，则对象同样预后不良。关于预后方面，应注意实施例3和图9及10显示乳腺癌患者的HLA-J表达水平对预测化疗期间的响应有指示作用。管腔乳腺癌患者具有最高HLAJ表达水平且这些患者几乎不响应化疗。由此，预后优选是预测肿瘤治疗的预期治疗成功，其中抗肿瘤治疗优选是化疗和/或待诊断患者优选具有乳腺癌。

对于分级，阳性样品可来自分级到G1-G4类别之一的一个或多个对象。对于分级，能使用一个以上的阳性样品，其中阳性样品来自2个，优选3个且最优选所有4个G1-G4类别。如果样品中第一方面核酸分子或第四方面蛋白或肽的表达水平与阳性G1对照或从其获得的预定标准品的不同小于50％、小于25％和小于10％(偏好增加)，则对象分级为具有G1肿瘤。这加以必要的变通适用于G2-G4期。

本领域建立了用于获得第一方面的核酸分子或第四方面的蛋白或肽水平的方法。

例如，第一方面的核酸分子的水平可通过实时定量PCR(RT-qPCR)、电泳技术或DNA微阵列(Roth(2002),Curr.Issues Mol.Biol.,4:93-100)获得，其中优选RT-qPCR。在这些方法中，表达水平可针对样品中一个或多个参考基因(平均)表达水平标准化。本文所用术语“参考基因”意在指某一基因，其在检测体系即癌中具有相对不变水平的RNA转录物表达/mRNA水平。这类基因可称为管家基因。参考基因的非限制性示例是CALM2、B2M、RPL37A、GUSB、HPRT1和GAPDH，优选CALM2和/或B2M。本领域技术人员已知其他合适的参考基因。

RT-qPCR由实施例阐明。RT-qPCR在热循环仪中完成，其能够用至少一种指定波长的光束照射各样品并检测由激发荧光团发射的荧光。热循环仪还能迅速加热和冷却样品，从而利用核酸和DNA聚合酶的物理化学性质。在实时qPCR中检测PCR产物的2种常用方法是：(1)插入任何双链DNA的非特异荧光染料和(2)序列特异性DNA探针，其由荧光报告子标记的寡核苷酸组成，这允许仅在探针与其互补序列(如TaqMan探针)杂交后检测。后一种检测方法用于下文的实施例。探针一般是荧光标记探针。优选地，荧光标记探针由荧光报告染料和淬灭染料标记(＝双重标记探针)的寡核苷酸组成。合适的荧光报告子和淬灭染料/部分为本领域技术人员已知，包括但不限于报告染料/部分6-FAMTM、JOETM、

和淬灭染料/部分dabcyl、TAMRATM、BHQTM-1、-2或-3。根据本发明使用的引物优选具有15-30核苷酸的长度，尤其是脱氧核苷酸。在一个实施方式中，引物设计成(1)特异于HLA-J的靶mRNA-序列或从其衍生，(2)提供小于120bp(优选小于100bp)的扩增子尺寸，(3)mRNA-特异的(考虑外显子/内含子；优选不扩增基因组DNA)，(4)没有二聚化的趋势和/或(5)退火温度T_m范围为58℃-62℃(优选T_m是约60℃)。更优选一种或多种引物和探针特异性结合HLA-J的HLA-J特异外显子4/外显子5连接(图3)。甚至更优选一种或多种如实施例表1所示引物和探针用于RT-qPCR，更优选一种特异引物对可选与各探针联用。如所示，(2)所述RT-qPCR需要探针，但在(1)所述RT-qPCR的情况中，探针能由嵌入染料如SYBR绿取代。表1的正向引物对应SEQID NO 12-25，探针对应SEQ ID NO 26-39的探针，反向引物对应SEQ ID NO 40-53。SEQ IDNO:12的正向引物和SEQ ID NO:40的反向引物是引物对且SEQ ID NO:26是对应探针，SEQID NO:13的正向引物和SEQ ID NO:41的反向引物是引物对且SEQ ID NO:27是对应探针等。最优选SEQ ID NO 18和46的引物对，任选地，与SEQ ID NO:32的探针一起使用。此引物对特异于HLA-J的HLA-J特异外显子4/外显子5连接。

作为qPCR的替代方式，电泳技术或DNA微阵列可用于获得本发明第一方面核酸分子的水平。鉴定和定量mRNA的常规方法是通过凝胶电泳与序列特异性探针检测的组合，凝胶电泳提供关于尺寸的信息。Northern印迹是此类中最常应用的技术。开发核糖核酸酶保护试验(RPA)作为Northern印迹的更灵敏和更不费力的替代选择。杂交用经标记核糖核苷酸探针在溶液中进行，之后未杂交样品和探针用选择性降解单链RNA的核糖核酸酶混合物(如RNase A和RNase T1)消化。随后的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳提供定量方法并且还给出探针杂交的区域大小。对于Northern印迹和RPA，定量的精确度和准确度是检测方法及所采用参照或标准的函数。最常见地，探针用32P或33P进行放射性标记，该情况中最终凝胶暴露于X射线胶片或荧光屏，各带的强度分别用比重计或磷光成像仪定量。在2种情况中，曝光时间能调整以适合所需灵敏度，但基于磷的技术一般更灵敏且有更大的动态范围。作为使用放射性的替代方式，探针能用抗原或半抗原标记，其随后由辣根过氧化物酶-或碱性磷酸酶-缀合抗体结合，并在加入底物后通过胶片或荧光成像仪上的化学发光定量。在所有这些成像应用中，应从无探针的凝胶相邻区减去背景。凝胶模式的巨大优势在于任何参照标准能与样品同步成像。同样，检测管家基因在对所有样品相同的条件下进行。

对于DNA微阵列构建，出现了2种技术。一般，就阵列设计而言，各情况中的起始点是对应待探测基因或假定基因的序列组。第一种方法中，从玻璃基底开始化学合成寡核苷酸探针。由于寡核苷酸与cDNA探针杂交的效率可变，合成与各感兴趣基因互补的多种寡核苷酸探针。此外，对于阵列上的各完全互补寡核苷酸，构建在单核苷酸位置有错配的寡核苷酸并用于标准化。寡核苷酸阵列以约10⁴-10⁶探针/cm²的密度常规产生。用于DNA微阵列构建的第二种主要技术是cDNA探针机器打印到载玻片或其他适当基底上。就各感兴趣基因获得DNA克隆，纯化，通过PCR用通用引物从共同载体扩增。探针以50-200μm尺寸顺序机器沉积在点中。此间隔中，能实现例如约10³探针/cm²的密度。

可测定第四方面的蛋白或肽的水平，例如使用“结合蛋白或肽的分子”且优选“特异性结合蛋白或肽的分子”。结合蛋白或肽的分子指定在已知条件下主要结合蛋白或肽的分子。可使用上文所述结合分子之一的“结合蛋白或肽的分子”，优选第四方面的蛋白或肽的抑制剂，如抗体、适体等。还可获得第四方面的蛋白或肽的水平，使用Western印迹分析、质谱分析、FACS分析和ELISA。这些技术是可用于定性、半定量和/或定量检测蛋白或肽的方法非限制性示例。

Western印迹分析是广泛使用和熟知的分析技术，用于检测给定样品例如组织匀浆或身体提取物中的特异蛋白或肽。其采用凝胶电泳以通过(多)肽长度(变性条件)或蛋白3-D结构(天然/非变性条件)分离天然或变性蛋白或肽。蛋白或肽随后移至膜(硝化纤维素或PVDF)，其在该处用特异于靶蛋白的抗体探测(检测)。

质谱(MS)分析也是广泛使用和熟知的分析技术，其中测量带电粒子的质荷比。质谱用于测定粒子质量，确定样品或分子的元素组成，阐明分子的化学结构如蛋白、肽和其他化合物。MS原理由电离化合物以产生带电分子或分子片段，测量其质荷比组成。

荧光激活的细胞分选(FACS)分析是广泛使用和熟知的分析技术，其中生物细胞基于各细胞荧光特征的特定光散射分选。细胞可固定于4％甲醛，用0.2％Triton-X-100透化，并用荧光团标记抗体(如单或多克隆HLA-J抗体)孵育。

酶联免疫吸附试验(ELISA)是广泛使用和熟知的灵敏的分析技术，其中酶连接抗体或抗原，作为检测特定蛋白或肽的标记。

紧接着第一方面的核酸分子或第四方面的蛋白或肽，获自对象的样品中的一个或多个更多化合物可用于诊断肿瘤和/或分级肿瘤和/或肿瘤预后。用于诊断肿瘤和/或分级肿瘤和/或肿瘤预后的大量标志物为本领域已知，且可与第一方面的核酸分子或第四方面的蛋白或肽联用。数个肿瘤标志物指示特定肿瘤，如乳腺癌或结肠癌。例如，肿瘤标志物列于美国国家癌症研究所(https://www.cancer.gov/about-cancer/diagnosis-staging/diagnosis/tumor-markers-fact-sheet)或癌基因和标志物CGMD的综合数据库(http://cgmd.in/)。使用一个或多个其他标志物通常提高诊断、分级或预后的可靠性。

在第十一方面，本发明涉及诊断肿瘤的方法，包括检测在获自对象的样品中是否存在第一方面条款(g)的核酸分子和/或第四方面的蛋白或肽，其中存在第一方面条款(g)的核酸分子和/或第四方面的蛋白或肽则指示对象中的肿瘤。

在第十二方面，本发明涉及分级肿瘤和/或肿瘤预后的方法，包括确定在获自对象的样品中第一方面条款(g)的核酸分子和/或第四方面的蛋白或肽的水平，其中第一方面条款(g)的核酸分子和/或第四方面的蛋白或肽相较于对照水平增加，与肿瘤级别更高和/或肿瘤预后不良正相关。

本发明第十一和第十二方面的方法实现了本发明第十方面在方法模式上的应用。因此，上文结合本发明第十方面提供的定义和优选实施方式，可等同应用于本发明第十一和第十二方面。

在第十三方面，本发明涉及诊断肿瘤和/或分级肿瘤和/或肿瘤预后的试剂盒，包括(a)检测和/或定量在获自对象的样品中第一方面条款(g)的核酸分子和/或第四方面的蛋白或肽的工具(means)，和(b)使用试剂盒的说明。

本发明第十三方面的试剂盒实现以试剂盒模式实施本发明第十方面应用所需的方法。出于此原因，上文结合本发明第十方面提供的定义和优选实施方式可等同应用于本发明第十三方面的试剂盒。

用于检测和/或定量第一方面核酸分子的工具(means)优选是用于RT-qPCR的实施例表1所示一个或多个引物和探针，更优选可选与各探针联用的特定引物对之一。用于检测第四方面的蛋白或肽的工具(means)优选是上文所述抗体和/或抗体模拟物。对于检测和/或定量，抗体和/或抗体模拟物可通过例如荧光染料或放射性同位素标记。荧光染料和放射性同位素的示例也如上文所述。

试剂盒的各个组分可包装入一个或多个容器，如一个或多个小瓶。除了所述组分，小瓶可包括存储用防腐剂或缓冲液。试剂盒可包括如何使用试剂盒的说明，优选告知如何使用试剂盒组分以诊断肿瘤和/或分级肿瘤和/或肿瘤预后。

在第十四方面，本发明涉及监测在具有肿瘤的对象中肿瘤治疗无功效的方法，包括(a)确定在治疗开始前获自对象的样品中的第一方面的核酸分子和/或第四方面的蛋白或肽的量；和(b)确定在治疗开始后的一个或多个时间获自对象的样品中的第一方面的核酸分子和/或第四方面的蛋白或肽的量，其中b)的量相较于a)增加则指示肿瘤治疗无功效和/或b)的量相较于a)减少则指示肿瘤治疗有功效。

类似地，在第十五方面，本发明涉及监测在需要免疫抑制治疗的对象中这种治疗无功效的方法，包括(a)确定在治疗开始前获自对象的样品中的第一方面的核酸分子和/或第四方面的蛋白或肽的量；和(b)确定在治疗开始后的一个或多个时间获自对象的样品中的第一方面的核酸分子和/或第四方面的蛋白或肽的量，其中b)的量相较于a)减少则指示免疫抑制治疗无功效和/或b)的量相较于a)增加则指示免疫抑制治疗有功效。

上文对于本发明其他方面提供的定义和优选实施方式可等同应用于本发明第十四和第十五方面。例如，用于确定第一方面的核酸分子和/或第四方面的蛋白或肽含量的手段和方法如上文结合本发明第十方面所述。这些手段和方法同样能与本发明第十四和第十五方面联用。

肿瘤治疗可以是任何肿瘤治疗，例如手术、放疗或化疗。肿瘤治疗优选是化疗。化疗包括施用化疗剂。能根据本发明使用的化疗剂包括细胞抑制性化合物和细胞毒性化合物。传统化疗剂通过杀伤迅速分裂的细胞来发挥作用，迅速分裂是大部分癌细胞的主要特性之一。化疗剂包括但不限于紫杉烷、核苷类似物、喜树碱类似物、蒽环类和蒽环类似物、依托泊苷、博来霉素、长春瑞滨、环磷酰胺、抗代谢物、抗有丝分裂剂和烷化剂。化疗还可以是基于铂的，即包括施用基于铂的化合物，如顺铂。化疗剂通常以组合形式给予，经常用于3-6个月。一种最常见治疗包括施用环磷酰胺加多柔比星(阿霉素；属于蒽环类和蒽环类似物的组)，称为AC。有时，加入紫杉烷药物如多西他赛，那么方案称为CAT；紫杉烷攻击癌细胞中的微管。另一产生等同结果的常见治疗包括施用环磷酰胺、氨甲蝶呤和氟尿嘧啶(CMF)，氨甲蝶呤是抗代谢物，氟尿嘧啶是核苷类似物。另一标准化疗治疗包括施用氟尿嘧啶、表柔比星和环磷酰胺(FEC)，其可补充以紫杉烷如多西他赛或长春瑞滨。

第十四方面所述的肿瘤优选是非管腔肿瘤。非管腔肿瘤是激素-受体(雌激素-受体和/或孕酮-受体)阴性肿瘤或表达低水平激素-受体(雌激素-受体和/或孕酮-受体)的肿瘤。在乳腺肿瘤的情况中，管腔A肿瘤是激素-受体阳性、Her2阴性，且表达低水平Ki-67，管腔B肿瘤是(i)激素-受体阳性、Her2阴性，且表达高水平Ki-67，或(ii)雌激素-受体阳性、孕酮-受体阴性、Her2阴性，且表达低水平Ki-67。非管腔肿瘤能分成HER2阳性肿瘤和TNBC(三阴乳腺癌)，其是HER2阴性和激素-受体(雌激素-受体和/或孕酮-受体)阴性。

同样，免疫抑制治疗可以是任何免疫抑制疗法。例如，免疫抑制治疗可包括施用一种或多种免疫抑制药物，如选自糖皮质激素、细胞抑制剂和抗体的免疫抑制药物。根据第十五方面，对象可接受移植器官或组织(如骨髓、心、肾、肝)，或可患有自身免疫疾病或最可能有自身免疫来源的疾病(如类风湿性关节炎、多发性硬化、重症肌无力、牛皮癣、白癜风、全身性红斑狼疮、结节病、局灶性节段性肾小球硬化、克罗恩氏病、白塞氏病、天疱疮、强制性脊柱炎和溃疡性结肠炎)或另一非自身免疫性炎症性疾病(如长期过敏性哮喘控制或强直性脊柱炎)。

在实施例2和图4及5中，证明卵巢癌组织暴露于化疗后，HLA-J表达增加8倍。类似地，乳腺癌患者中，发现化疗期间的HLA-J表达显著上调与部分化疗反应小计正相关；参见实施例3和图12。HLA-J表达增加越高，各肿瘤患者的无进展生存和总体生存越差。具体地，至少2倍，优选至少3倍，更优选至少4倍，甚至更优选至少6倍且最优选至少8倍增加指示预后较差。

在第十六方面，本发明涉及预测在患有肿瘤的对象中肿瘤治疗功效的方法，包括确定在肿瘤治疗开始前获自对象的样品中的第一方面条款(g)的核酸分子和/或第四方面的蛋白或肽的水平，其中第一方面条款(g)的核酸分子和/或第四方面的蛋白或肽相较于阴性对照水平减少，与肿瘤治疗功效正相关，和/或第一方面条款(g)的核酸分子和/或第四方面的蛋白或肽相较于阳性对照水平未显著不同，与肿瘤治疗功效正相关。

上文对于本发明其他方面提供的定义和优选实施方式可等同应用于本发明第十六方面。例如，用于确定第一方面的核酸分子和/或第四方面的蛋白或肽含量的手段和方法结合本发明第十方面如上文所述。这些手段和方法同样能与本发明第十六方面联用。

在第十六方面，阴性对照可来自不响应肿瘤治疗的一个或多个对象。阳性对照可来自确实响应肿瘤治疗的一个或多个对象。同样就对照而言，一个或多个对象的样品在肿瘤治疗开始前获得。阴性和/或阳性对照的一个或多个对象优选接受与待用于所研究对象相同的肿瘤治疗，和/或这些一个或多个对象与所研究对象具有相同身体位置/器官的肿瘤。

如果样品中第一方面核酸分子或第四方面蛋白或肽的表达水平相较阴性对照或从中获得的预定标准品减少至少1.5倍、2倍、3倍、4倍(偏好增加)，则预期对象响应肿瘤治疗。如果样品中第一方面的核酸分子或第四方面的蛋白或肽的表达水平与阳性对照或从其获得预定标准品的不同小于50％、小于25％和小于10％(偏好增加)，则也预期对象响应肿瘤治疗。

肿瘤治疗优选是化疗。肿瘤优选如上文所定义且最优选结合第十六方面是乳腺癌。实施例3和图9及10显示，乳腺癌患者的HLA-J表达水平指示化疗期间的响应预测。

在第十七方面，本发明涉及预测对象的肿瘤是否是管腔肿瘤的方法，包括在获自对象的样品中确定第一方面条款(g)的核酸分子和/或第四方面的蛋白或肽的水平，其中第一方面条款(g)的核酸分子和/或第四方面的蛋白或肽相较于阴性对照水平，和/或第一方面条款(g)的核酸分子和/或第四方面的蛋白或肽相较于阳性对照水平未显著不同，指示肿瘤是管腔肿瘤。

上文对于本发明其他方面提供的定义和优选实施方式可等同应用于本发明第十七方面。例如，用于确定第一方面核酸分子和/或第四方面蛋白或肽含量的手段和方法结合本发明第十方面如上文所述。这些手段和方法同样能与本发明第十七方面联用。

管腔肿瘤是雌激素受体(ER)阳性的，而非管腔肿瘤是ER阴性的。管腔肿瘤优选是管腔乳腺癌。管腔乳腺癌是ER阳性和Her2阴性的。尽管辅助内分泌治疗和化疗治疗，但ER阳性患者具有高复发风险；早期和晚期复发都可能出现。因此鉴别ER阳性患者是重要的，因为在这些患者中，由于所述患者会更好受益于扩大的辅助激素治疗，辅助化疗可以是备用的。

在第十七方面，阴性对照可来自有非管腔肿瘤的一个或多个对象。阳性对照可来自有管腔肿瘤的一个或多个对象。阴性和/或阳性对照的一个或多个对象优选与所研究对象具有相同身体位置的肿瘤。

如果样品中第一方面的核酸分子或第四方面的蛋白或肽的表达水平相较于阴性对照或从其获得的预定标准品增加至少1.5倍、2倍、3倍、4倍(偏好增加)，则预期对象有管腔肿瘤。如果样品中第一方面的核酸分子或第四方面的蛋白或肽的表达水平与阳性对照或从其获得的预定标准品的不同小于50％、小于25％和小于10％(偏好增加)，也预期对象有管腔肿瘤。

在预测对象的肿瘤是否是管腔肿瘤的方法中，可研究管腔肿瘤的更多标志物，这预计增加方法的灵敏度和特异性。更多标志物的非限制性示例是ESR1、PGR和ERBB2。雌激素受体α(ERα)由ESR1基因编码，从而ESR1的表达指示管腔肿瘤。PgR基因编码孕酮受体，其一般也在管腔肿瘤中表达。最后，基因ERBB2编码HER2。缺乏ERBB2表达则指示管腔肿瘤。

由于实施例3显示管腔乳腺癌患者具有最高的HLA-J表达水平，来自乳腺癌患者的样品中的高HLA-J表达指示乳腺癌是管腔乳腺癌。发现HLA-J是管腔肿瘤的优秀标志物。

在第十八方面，本发明涉及预测对象的肿瘤是非管腔肿瘤或是管腔肿瘤的方法，包括(a)确定在化疗前获自对象的样品中第一方面条款(g)的核酸分子和/或第四方面的蛋白或肽的水平，(b)确定在化疗开始后(优选在化疗完成后)获自对象的样品中第一方面条款(g)的核酸分子和/或第四方面的蛋白或肽的水平，其中第一方面条款(g)的核酸分子和/或第四方面的蛋白或肽相较于(a)水平增加可指示非管腔肿瘤，而第一方面条款(g)的核酸分子和/或第四方面的蛋白或肽相较于(a)水平未显著不同可指示管腔肿瘤。

上文对于本发明其他方面提供的定义和优选实施方式可等同应用于本发明第十八方面。例如，用于确定第一方面核酸分子和/或第四方面蛋白或肽含量的手段和方法结合本发明第十方面如上文所述。这些手段和方法同样能与本发明第十八方面联用。

当比较(b)的水平与(a)的水平时，如果样品中第一方面核酸分子或第四方面蛋白或肽的表达水平增加至少1.5倍、2倍、3倍、4倍(偏好增加)，则预期对象有非管腔肿瘤。当比较(b)的水平与(a)的水平时，如果样品中第一方面核酸分子或第四方面蛋白或肽的表达水平的不同(即更高或更低)小于50％、小于25％和小于10％(偏好增加)，也预期对象有管腔肿瘤。

非管腔和管腔肿瘤优选是非管腔和管腔乳腺癌。

实施例3显示化疗后，非管腔乳腺癌患者中的HLA-J表达水平增加，而其在管腔乳腺癌患者中基本不受化疗影响。

在最后一方面，本发明涉及鉴定第一方面的核酸分子和/或第二方面的蛋白或肽的抑制剂的方法，包括(a)在免疫活性细胞存在下，在生长条件下，(i)在测试剂存在下和(ii)在所述测试剂不存在下培养肿瘤细胞，所述肿瘤细胞表达第一方面的核酸分子和/或生成第二方面的蛋白或肽；(b)确定a)i)和a)ii)的肿瘤细胞生长；(c)比较步骤b)中就a)i)确定的生长与步骤b)中就a)ii)确定的生长，其中a)i)的生长相较于a)ii)的生长减少可指示测试剂是第一方面的核酸分子和/或第二方面的蛋白或肽的抑制剂。

各细胞类型的生长条件差异巨大，但培养细胞的人工环境总是由含以下的适当容器组成：(i)供应基本营养物(氨基酸、碳水化合物、维生素、矿物质)的基质或培养基，(ii)生长因子，(iii)激素，(iv)气体(O₂、CO₂)，(v)受调控的理化环境(pH、渗透压、温度)。因此，即使尚未确立用于任何特定肿瘤细胞的生长条件，但鉴定肿瘤细胞生长的合适条件是常规的。

建立了用于确定所测定细胞生长的技术。细胞生长能通过多种方法检测。可测量细胞数目增加，例如通过在显微观察下手工计数细胞，使用染料排斥法(即台盼蓝)以仅计数活细胞。不太挑剔的可扩展方法包括采用血细胞计数器，而流式细胞术允许组合细胞计数(‘事件’)与其他特定参数：用于膜、细胞质或核的荧光探针允许区分死/活细胞、细胞类型、细胞分化、生物标志物如Ki67的表达。

小分子、抗体或抗体模拟物、适体、siRNA、shRNA、miRNA、核酶或反义核酸分子可用作测试剂。这些化合物的性质结合本发明第十五方面如上文所详述。根据本发明第十五方面使用的抑制剂已知是第一方面的核酸分子和/或第四方面的蛋白或肽的抑制剂，测试剂在本发明最后一方面的方法中检测作为这种抑制剂的能力。例如，根据本发明第十五方面，使用已知抑制第一方面的核酸分子和/或第四方面的蛋白或肽的小分子，而根据本发明最后一方面，在未知是否能抑制第一方面的核酸分子和/或第四方面的蛋白或肽的方法中应用小分子。在本发明最后一方面的方法中检测小分子作为这种抑制剂的能力。

免疫活性细胞是在体内暴露于抗原后能够体内产生免疫应答的细胞。免疫活性细胞优选是巨噬细胞或淋巴细胞，更优选淋巴细胞且最优选自然杀伤(NK)细胞。淋巴细胞且尤其NK细胞能够特异性识别和杀伤肿瘤细胞。

数种测试剂的效率可以高通量模式同时测定，该模式结合本发明第五方面如上文更详细所述。

如上所讨论且可获自下面的实施例，第一方面的核酸分子和/或第四方面的蛋白或肽通过保护肿瘤细胞免于免疫活性细胞识别来促进肿瘤细胞生长，从而可预期抑制第一方面的核酸分子和/或第四方面的蛋白或肽可导致肿瘤细胞生长减少，因为免疫活性细胞能更好地识别然后抑制或杀伤肿瘤细胞。如果a)i)的生长相较于a)ii)的生长减少至少10％、至少20％、至少50％、至少75％、至少90％和至少95％(偏好增加)，则测试剂适合作为抑制剂。最优选测试剂完全或基本完全消除肿瘤细胞的细胞生长。

为了确保测试剂针对第一方面的核酸分子和/或第四方面的蛋白或肽的特异性，最后一方面的方法优选包括确定a)i)中第一方面的核酸分子和/或第四方面的蛋白或肽的量(与a)ii)相比)的额外步骤。含量或活性在测试剂存在下相较于没有时降低可指示测试剂针对第一方面的核酸分子和/或第四方面的蛋白或肽的特异性。

关于本申请文件尤其是权利要求中表征的实施方式，目的是从属权利要求中提及的各实施方式联合各权利要求(独立或从属)的各实施方式，所述从属权利要求从属于所述各权利要求。例如，如果独立权利要求1列举3个替代选择A、B和C，从属权利要求2列举3个替代选择D、E和F且权利要求3从属于权利要求1和2并列举3个替代选择G、H和I，应理解，除非另有特别说明，本申请文件明确公开了对应组合A、D、G；A、D、H；A、D、I；A、E、G；A、E、H；A、E、I；A、F、G；A、F、H；A、F、I；B、D、G；B、D、H；B、D、I；B、E、G；B、E、H；B、E、I；B、F、G；B、F、H；B、F、I；C、D、G；C、D、H；C、D、I；C、E、G；C、E、H；C、E、I；C、F、G；C、F、H；C、F、I的实施方式。

类似地，在独立和/或从属权利要求不列举替代选择的那些情况中，应理解如果从属权利要求重新提及多个前述权利要求，由此覆盖的任何主题组合被视作明确公开。例如，在独立权利要求1、从属权利要求2重新提及权利要求1以及从属权利要求3重新提及权利要求1和2的情况中，推定权利要求3和1的主题组合清晰明确地公开，权利要求3、2和1的主题组合亦如此。如果存在提及权利要求1-3中任一项的进一步从属权利要求4，推定权利要求4和1，权利要求4、2和1，权利要求4、3和1以及权利要求4、3、2和1的主题组合被清晰明确地公开。

附图显示

图1.HLA-A1、HLA-A2、HLA-G、HLA-F1、HLA-F2和HLA-F3在可能翻译起始位点的序列比对。潜在起始密码子由浅灰色背景表示。起始密码子处与已发表共有序列的差异用黄色背景标记。剪接位点由灰色背景表示。所述HLA-J提前终止密码子用灰色背景和灰色字母标记。

图2.HLA-A1、HLA-A2、HLA-G、HLA-F1、HLA-F2和HLA-F3在过渡到跨膜结构域处的序列比对。剪接位点由灰色背景表示。外显子5–外显子6供体受体位点之间的延长的跨度源于HLA-J独特序列的插入。在此公开的HLA-J新终止密码子用灰色背景和灰色字母标记。

图3.HLA-J mRNA表达由RT-qPCR试验在HLA-J特异外显子4/外显子5连接处定量。相对mRNA表达由40-DCT法确定，使用CALM2作为参照基因。40-DCT值越高，基因表达越高。由于PCR法的指数性质，每增加1意味着基因表达翻倍。增加3DCT值意味着HLA-J mRNA表达提高8倍。

图4.Kaplan Meier图展示新辅助疗法治疗的卵巢癌患者的无进展生存概率，这基于由RT-qPCR试验在HLA-J特异外显子4/外显子5连接处定量的HLA-J mRNA表达分级。相对mRNA表达由40-DCT法确定，使用CALM2作为参照基因。治疗前后的表达水平差异在40-DCT计算基础上测定(见上)。大于2DCT变化(即>＝2.1)反映卵巢癌组织暴露于化疗后，HLA-J增加>8倍。

图5.Kaplan Meier图展示新辅助疗法治疗的卵巢癌患者的总体生存概率，这基于由RT-qPCR试验在HLA-J特异外显子4/外显子5连接处定量的HLA-J mRNA表达分级。相对mRNA表达由40-DCT法确定，使用CALM2作为参照基因。治疗前后的表达水平差异在40-DCT计算基础上测定(见上)。大于2.1DCT变化反映卵巢癌组织暴露于化疗后，HLA-J增加>8倍。

图6.由RT-qPCR试验在HLA-J特异外显子4/外显子5连接处定量的HLA-J mRNA表达。相对mRNA表达由40-DCT法确定，使用CALM2作为参照基因。40-DCT值越高，基因表达越高。

图7.在乳腺癌组织的未经历化疗的治疗前芯针活检中，HLA-J mRNA表达与乳腺癌亚型的关键标志物之间的相关性。

图8.在化疗治疗后剩余乳腺癌组织的手术标本中，HLA-J mRNA表达与乳腺癌亚型的关键标志物之间的相关性。

图9.在来自乳腺癌患者的治疗前芯针活检样本中，HLA-J、ESR1、ERBB2和KRT5mRNA的肿瘤消退分级(TRG)状态及mRNA表达水平的数据分布。

图10.TRG状态与在来自乳腺癌患者的预处理芯针活检样本中，HLA-J、ESR1、ERBB2和KRT5 mRNA的mRNA表达水平的斯皮尔曼相关性(Spearman correlation)。

图11.在新辅助化疗后，TRG状态与乳腺肿瘤中HLA-J、ESR1、ERBB2和KRT5 mRNA的mRNA表达水平的数据分布。对新辅助化疗响应有限的肿瘤组织以深灰色突出。

图12.在新辅助化疗后，TRG状态与来自乳腺癌患者的肿瘤组织中HLA-J、ESR1、ERBB2和KRT5 mRNA的mRNA表达水平的斯皮尔曼相关性。

图13.在新辅助化疗之前(左幅)和之后(右幅)，来自乳腺癌患者的肿瘤组织中HLA-J mRNA表达(y轴)根据TRG状态(x轴)的散布图。

图14.在来自乳腺癌患者的肿瘤组织中，化疗前后HLA-J mRNA表达差异(y轴)根据TRG状态(x轴)的散布图。

图15.Kaplan Meier图展示新辅助疗法治疗的乳腺癌患者的无进展生存概率，这基于由RT-qPCR试验在HLA-J特异外显子4/外显子5连接处定量的HLA-J mRNA表达分级。相对mRNA表达由40-DCT法确定，使用CALM2作为参照基因。治疗前后的表达水平差异在40-DCT计算基础上测定(见上)。大于3.5DCT变化反映乳腺癌组织暴露于化疗后，HLA-J增加>16倍。

图16.在α2和α3结构域、跨膜结构域和与胞质区的对应连接肽的区域中，HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F亚型、HLA-G、HLA-H和HLA-J的蛋白序列汇总。共有序列在上面比对的序列中以灰色突出。HLA肽序列差异也以灰色突出。预测的HLA-Jα3结构域不同于其他HLA基因的这些结构域，且以灰色突出。用于产生HLA-J特异抗体的肽序列以箭头表示，称为“JULY抗体”。

图17.(A)在来自患有化疗耐药性肿瘤患者(n＝4；患者ID:107、114、116和128)的卵巢癌组织中，通过western印迹分析证明HLA-J蛋白表达。对于各患者，评估新辅助化疗之前(前)和之后(后)的HLA-J蛋白表达。(B)在卵巢癌(“OC”)、乳腺癌(“BC”)、尿路上皮/膀胱癌(“UC”)和胎盘(plazental)组织(“Pl”)中，通过western印迹分析证明HLA-J蛋白表达。

图18.在来自新辅助化疗后3个癌症患者的囊切除标本(CYS)活检样品中的HLA-J肿瘤特异性表达，而在化疗治疗前的匹配经尿道切除术(TUR)活检样品以及来自正常组织的“作图”阴性对照样品中，没有检测到表达。

实施例阐述本发明。

实施例1：鉴定HLA-J为非假基因和在各外显子/外显子边界确定HLA-J特异区。

基因组分析和序列比对如下完成：登陆UCSC基因组浏览器(https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway)和下载HLA-A1(NM_002116.7),HLA-A2(NM_001242758.1),HLA-G(NM_002127.5),HLA-F1(NM_001098479.1),HLA-F2(NM_018950.2),HLA-F3(NM_001098478.1)基因组序列，其带有HLA-J推定序列(NR_024240.1)。初始比对分析集中于潜在翻译起始区和从胞外α结构域到跨膜区内的潜在转移。根据Messer等的先前出版物(Messer G,Zemmour J,Orr HT,Parham P,Weiss EH,Girdlestone J.《HLA-J,涉及HLA-G和HLA-A的第二失活I类HLA基因。对HLA-A相关基因进化的意义。》(HLA-J,a secondinactivated class I HLA gene related to HLA-G and HLA-A.Implications for theevolution of the HLA-A-related genes.)J Immunol.1992年6月15；148(12):4043-53.)，认为HLA-J是假基因，因为有害突变在外显子2或外显子4产生翻译终止。为分析潜在读框，分析起始密码子，这是核糖体所翻译的信使RNA(mRNA)转录物的第一密码子。Messer等的序列解读是基于如下共有起始位点ATG-GGG-GTC-ATG-GCG-CCC-CGA-ACC-C(SEQ IDNO:10)(图1，ATG在HLA-G序列中带有浅灰色背景)。根据他们对他们的团队克隆的HLA-J的序列分析，能在核苷酸位置4处观察到有害点突变，其中G缺失(图1，HLA-J序列中的灰色“-“)，这确实导致移码ATG-GGG-TCA-TGG-CGC-CCC-GAA-CCC(SEQ ID NO:11)。如Messer等所述，这导致外显子2中的蛋白序列早期终止。然而，本文所述更多研究意外揭示了位置10处有第二潜在起始位点。序列分析显示在5’和3’末端处第二ATG的周围核苷酸与Kozak序列要求一致。此外，当比较公开的起始密码子共有序列时，HLA-F漏掉Messer等所述共有起始密码子，但确实有第二起始位点，这根据本发明是HLA-J的真实翻译起始位点。分析序列比对，发现在位置10处开始和第二ATG位点处具有翻译起始密码子时，HLA-J没有导致任何提前终止的移码缺失，而有与HLA-G基本类似的蛋白。鉴定共有序列比对的“开放阅读框3”(ORF3)是相关读框，其使得公开的“假基因”变成真实的基因序列。

HLA-A1、HLA-A2、HLA-G、HLA-F1、HLA-F2、HLA-F3和HLA-J在从α结构域到跨膜结构域转移处的序列比对如图2所示。根据NCBI命名法，外显子5编码HLA-s的α23结构域且外显子6编码跨膜结构域。当观察外显子5与外显子6之间连接处的剪接位点(图2中灰色背景色表示，根据采用灰色字母的HLA-G序列)时，显然在HLA-J内插入16核苷酸会破坏此剪接供体和受体位点，而产生对HLA-J而言独特的序列。没有其他HLA在此位置或全序列他处有类似序列。重要的是，此区域源自真实外显子区，内含子长度为约570bp，在用于剪接的HLA-J特异供体和受体位点之间。因而，选择的此区域让人尤其感兴趣，用于证实分泌型HLA-J mRNA在肿瘤和正常组织样品中存在(参见实施例2)。

当比较非假基因HLA-J与HLA-G的外显子结构时，显然HLA-J特别缺乏编码α结构域结构2的外显子4同源物并用作HLA-G的基因组测定剪接变体同源物。甚至更重要的是，推测的氨基酸序列是基于ORF3，即“HTFLETSQGSKTRRFL(-终止)”(SEQ ID NO:5)(包含多个带电氨基酸(如E、K、R)和芳族氨基酸(F)，这排除此序列成为跨膜区或锚。由此，新鉴定的HLA-J明显是分泌型蛋白，特征类似HLA-G，但缺乏对肽呈递重要的α2样结构域。

实施例2：通过反转录(RT)定量PCR(RT-qPCR)在新辅助疗法治疗的卵巢癌患者群中确定HLA-J mRNA表达水平

所述研究在2004年9月到2007年12月间招募45个新诊断患者，其在组织学上证实有FIGO III–IV期卵巢上皮或腹膜癌、不适合直接手术且是新辅助化疗候选者(所述癌下文也称为卵巢癌)。其他纳入标准是年龄>18岁，血液学、肾、肝和心功能适合以铂类药物为基础的化疗。排除标准是卡氏功能状态评分(Karnofsky performance status，KPS)低于70％，有其他恶性肿瘤和手术禁忌症史。通过开放性腹腔镜检查在基线排除最优减瘤手术的可能性。在排除活检样本不适合微阵列分析的9个患者和由于组织学修正后诊断腹膜间皮瘤而发现不合格的1个患者后，45个患者的初始研究群限制到35人。每3周卡铂AUC 5和紫杉醇175mg/m2 Q3 3h以上的标准方案作为新辅助治疗施用6个周期。在大于75岁的3个患者和功能状态评分差(KPS 70％)的1个患者中，单一剂卡铂优于联合化疗。

手术后用手术样本分析评估病理组织学响应。迄今为止，没有稳固确立的组织病理学标准来描述新辅助化疗后卵巢癌中的治疗响应。根据涉及卵巢癌(Le等.2007,Sassen等.2007)和乳腺癌(Ogston等.2003)中初始化疗响应的文献，手术标本中没有癌细胞，视作完全病理缓解，仅存留小团簇(<1cm)或个体癌细胞且手术后没有肉眼可见剩余物，视作非常好的部分缓解。部分病理缓解定义为相较于初始腹腔镜检查，肿瘤负荷在手术时减少30％-90％，而稳定疾病定义为手术时没有肿瘤负荷减少或减少低于30％。仅完全和非常好的部分缓解患者被视作病理响应者，而所有其他病例被视作病理无应答者。对于生存分析，从最初诊断直至进展(PFS)或直至死亡(OS)的时间或者进展与死亡间的时间(PDT)用于Kaplan Meier生存评估和cox回归分析。完整生存数据可获自40个患者。在数据关闭时，中值PFS是14.7个月，中值OS是33.5个月，考虑到研究开始时疾病的极晚期(不可切除的FIGOIII–IV)，所述值高。

对于mRNA检测，收集的组织速冻并保存于液氮，直至分析。约20–100mg冷冻卵巢肿瘤组织在液氮中压碎。RNA用商业试剂盒(凯杰(Qiagen))提取，RNA完整性在Agilent 2100生物分析仪(安捷伦科技(Agilent Technologies),美国加利福尼亚州帕洛阿尔托)上评估，用Invitrogen试剂盒(英杰公司(Invitrogen Corp.))从1mg总RNA合成cDNA并在Affymetrix HG-U133A微阵列(昂飞公司(Affymetrix Inc.),美国加利福尼亚州圣克拉拉)上分析，如他处所述(Ihnen等.2008)。

出于验证目的，向上述分离自相同新鲜组织活检的总RNA实施RT-qPCR，以通过独立技术方法验证阵列数据。使用基因特异性、基于TaqMan的引物/探针组，以评估HLA-J表达。对于通过RT-qPCR方法的基因表达详细分析，采用在感兴趣区域侧翼的引物和在中间杂交的荧光标记探针。选择靶特异引物和探针，使用NCBI引物设计工具(tool)(www.ncbi.nlm.nih.go)。RNA特异引物/探针序列用于通过跨外显子/外显子边界定位引物/探针序列来使RNA特异测量可行。此外，引物/探针选择成不结合有已知多态性(SNP)的序列区域。如果存在同一基因的多种亚型，引物酌情选择成扩增所有相关或选定剪接变体。通过常规PCR反应检查所有引物对的特异性。进一步优化引物/探针后，表1所列引物和探针给出最佳结果。这些引物/探针优于本领域已知引物/探针，如在特异性和扩增效率方面。为使样品RNA的量标准化，选择CALM2作为参照基因，因为其在所分析样品中未差异调节。排除具有低RNA含量(即CALM2的原始CT值小于22)的成对样品(治疗前活检或治疗后切除物)。

表1.HLA-J mRNA定量所用的引物和探针

进行

验证实验，显示靶标和对照扩增的效率大致相等，这是通过比较ΔCT法相对定量基因表达的先决条件。为在生物样品内进行感兴趣基因的表达分析，通过混合2种特异试验的各自引物/探针来制备4x双重试验-混合物。对于CT值的分开检测，试验探针用不同荧光探针修饰。各4x试验-混合物包含2μM未修饰正向和反向引物以及1.2μM探针。对于各反应，提取自FFPE切片的2.5μl总RNA(见上)在96孔光反应板的1个孔中混合2.5μl试验-混合物，2.5μl酶-混合物和2.5μl水。PCR反应测量根据厂商说明书在适当条件(5min 50℃，1个循环；20s 95℃，1个循环；15s 95℃，1min 60℃，40个循环)下完成，采用VersantqPCR循环仪(西门子(Siemens))或Light Cycler 480(罗氏(Roche))。

如图3所示，所有卵巢癌样品确实表达HLA-J。HLA-J mRNA表达的动态范围包括5DCT值，这意味着多至2⁵(即30倍)上调的卵巢癌特异HLA-J表达。重要的是，此上调经常在晚期卵巢癌新辅助化疗后出现(比较新辅助化疗之前HLA-J mRNA水平的浅色柱与之后HLA-J mRNA水平的深色柱)。在26个匹配样品对的14个(～50％)中，观察到化疗后的显著HLA-J上调，而仅就患者#107能观察到下调。此外，HLA-J表达大幅增加与预后不良相一致。例如，HLA-J mRNA增加最高(即大于8倍)的3个患者即患者#106、患者#108和患者#112分别具有8.7个月、9.2个月和7.9个月的无进展生存区间。类似地，从最初诊断到死亡时间的总体生存分别是10.6个月、12.5个月和10.3个月。相反，表现出HLA-J mRNA表达明显减少的患者#107具有15.1个月的无进展生存区间和43.0个月的总体生存。为了对比，中值PFS是14.7个月且中值OS是33.5个月。

接下来分析当观察到化疗后切除物的HLA-J mRNA表达增加>4倍时，HLA-J mRNA表达变化是否在新辅助治疗卵巢癌患者中具有预后价值。在此预定设置内，16％肿瘤确实表现出HLA-J表达明显提高。实际上，这类患者的无进展生存以及总体生存显著更差，如图4和5所示。

这些数据证明分泌型HLA-J在卵巢癌中过表达。进一步证明其表达经常在卵巢癌暴露于化疗药物后增加(超过50％患者)。此外，这些数据证明极端上调(大于8倍)始终与化疗耐药性以及无进展和总体生存降低相关联。

根据预定义假设，研究者能证明以前错误分类的“假基因”表达在癌症中具有功能和预后价值，如就卵巢癌所证明。新辅助治疗对癌消退的效果一直是争论焦点。推断破坏赘生性细胞导致抗原和新抗原暴露于免疫系统，从而激发全身中期到长期抗肿瘤应答，最终使得存活延长。肿瘤如何逃离这些抗肿瘤作用和逃离免疫细胞诱导的消除，至今仍然未得到解答。

这里显示，一种机制是分泌的HLA-J亚型上调。这些小HLA-G样蛋白缺乏α2结构域，因而显然不能结合肽以呈递和激活细胞毒性及抗肿瘤免疫细胞(如T细胞)。然而，分泌缺乏抗原呈递功能但能够结合免疫细胞的蛋白可干扰免疫细胞激活过程并从而通过诱导免疫耐受来使得肿瘤细胞逃逸可行。

由于分泌亚型不是膜结合，其建立了免疫活性配体结合浸润免疫细胞的梯度，这改良其效应物活性。在极端情况中，免疫细胞可从抗肿瘤转换到肿瘤促进活性。由于尺寸小，这些分泌的HLA亚型在旁分泌以及远程方式中具有活性。在血液中检测这类片段能够在出现抗性的情况中监测抗肿瘤活性和各治疗变化。此外，通过阻断免疫活性配体，常规和/或其他抗肿瘤治疗的效果可增加，包括但不限于免疫治疗剂(如检查点抑制剂)。

实施例3：通过反转录(RT)定量PCR(RT-qPCR)在新辅助疗法治疗的乳腺癌(BC)患者群中确定HLA-J mRNA表达水平

新诊断早期/局部晚期BC患者符合研究，所述患者就化疗和乳腺手术而言有适当医疗状况。寡转移性BC患者也符合，只要治疗方案包括化疗后乳腺手术。组织学诊断BC通过芯针活检确认。在所有患者中于基线获得身体检查、乳腺X光摄影检查、乳腺超声、乳腺MRI、胸腹部CT扫描、骨扫描和18F-FDG-PET/CT研究。在2个PCT(术前化疗)周期后和手术前重复身体检查、乳腺X光摄影检查、乳腺超声和18F-FDG-PET/CT研究。

患者接受6-8个周期基于蒽环类和基于紫杉烷的PCT。在PCT完成后开展手术(包括腋窝淋巴结清除术)。经历保乳手术的患者随后接受放疗。

化疗后所得新鲜手术标本(乳腺和腋淋巴结)由有经验的乳腺癌病理学家评估。米勒佩恩分类是用于评估对PCT组织学反应的分级系统。雌激素受体(ER)、孕酮受体(PR)和人类表皮生长因子受体2(HER2)是检测的分子标记。免疫组织化学(IHC)用于评估ER和PR，为了呈阳性，必须染色超过10％的肿瘤细胞核。HER2状态用IHC评估；HER2阳性(HER2+ive)由IHC定义为3+或2+IHC，通过荧光原位杂交(FISH)有基因扩增。另外，基于RT-qPCR评价ESR1和ERBB2状态以获得乳腺癌生物学关键参数的定量评估，以确定HLA基因表达与独特乳腺癌亚型的关联。

从2004年7月到2011年3月招募60个新诊断BC患者，其主要特征如表2所列。PCT由以下组成：9名患者(15％)中持续6个周期的基于蒽环类和基于紫杉烷的方案和45名患者(75％)中基于蒽环类和基于紫杉烷的连续4个周期方案，持续总共8个周期。在来自最后化疗周期的31天(d)(范围11–52 d)中值间隔处，所有(除了2个)患者经历手术。化疗完成后，在13名患者(22％)中观察到总体最优病理响应(pR)，47名患者(78％)中出现病理无响应(pNR)。

表2.乳腺癌群的患者特征

患者特征(n＝60) n(％)

年龄(中值范围) 49(31-72％)

阶段n

(％)II A/B 30(50％)

III A/B 23(38％)

IV寡转移性 7(12％)

受体状态

ER+ive/HER2_ive 31(52％)

ER_ive/HER2_ive 15(25％)

HER2+ive(+3 IHC或2+IHC,有扩增的FISH) 14(23％)

化疗

蒽环类/紫杉烷方案(6个周期) 9(15％)

基于蒽环类/紫杉烷的连续方案(8个周期) 45(75％)

紫杉烷-曲妥单抗(4-8个周期) 6(10％)

手术

保乳手术+腋窝淋巴结清除术 34(57％)

乳房切除术+腋窝淋巴结清除术 24(40％)

对于mRNA检测，收集的组织速冻并保存于液氮，直至分析。治疗前芯针活检和治疗后组织切除物在液氮中压碎。RNA用商业试剂盒(凯杰)提取，RNA完整性在Agilent2100生物分析仪(安捷伦科技,美国加利福尼亚州帕洛阿尔托)上评估，用Invitrogen试剂盒(英杰公司)从1mg总RNA合成cDNA并在Affymetrix HG-U133A微阵列(昂飞公司,美国加利福尼亚州圣克拉拉)上分析，如他处所述(Ihnen等,Breast Cancer Res Treat.2008,卷112,期号3,第419–427页)。

出于验证目的，向上述分离自相同新鲜组织活检和组织切除物的总RNA施用RT-qPCR，以通过独立技术方法验证阵列数据。使用基因特异性、基于TaqMan的引物/探针组，以评估HLA-J表达。对于通过RT-qPCR方法的基因表达详细分析，采用在感兴趣区域侧翼的引物和在中间杂交的荧光标记探针。为使样品RNA的量标准化，选择CALM2、RPL37A和/或GAPDH作为参照基因，因为其在所分析样品中未差异调节。排除具有低RNA含量(即CALM2的原始CT值小于22)的成对样品(治疗前活检或治疗后切除物)。总体上，有足够RNA品质的成对治疗前和治疗后样品可获自19个患者。重要的是，除了HLA-J RT-qPCR试验，完成额外RT-qPCR检测以定量亚型特异标志物如ESR1，MLPH，ERBB2，KRT5以及表2所示侵入标志物MMP1和MMP7，以评估肿瘤浸润性。ESR1状态定义和亚型确定如先前所述类似进行(Pentheroudakis等.Breast Cancer Res Treat.2008年7月31；Koutoula等,Virchows Arch.2013年2月；462(2):141-54,Noske等,Breast Cancer Res Treat.2011年2月；126(1):109-17,Wirtz等,Breast Cancer Res Treat.2016年6月；157(3):437-46.)。

表3.用于亚型分析和确定侵入特性的所用引物和探针。

基因符号	探针_序列	For_序列	Rev_序列
				RPL37A	TGGCTGGCGGTGCCTGGA	TGTGGTTCCTGCATGAAGACA	GTGACAGCGGAAGTGGTATTGTAC
GAPDH	AAGGTGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTG	GCCAGCCGAGCCACATC	CCAGGCGCCCAATAG
				ESR1	ATGCCCTTTTGCCGATGCA	GCCAAATTGTGTTTGATGGATTAA	GACAAAACCGAGTCACATCAGTAATAG
ESR1	CTGGAGATGCTGGACGCCC	CGTGGTGCCCCTCTATGAC	GGCTAGTGGGCGCATGTAG
				MLPH	CCAAATGCAGACCCTTCAAGTGAGGC	TCGAGTGGCTGGGAAACTTG	AGATAGGGCACAGCCATTGC
MLPH	CGGGCGTCTTCTGAGAGTCAGATCTTTG	CGATGTGGACACCTCTGATGA	AGGCATTCCACAGCTGAAATATG
				ERBB2	AGGCCAAGTCCGCAGAAGCCCT	TCTGGACGTGCCAGTGTGAA	CCTGCTCCCTGAGGACACAT
ERBB2	TGATCATGGTCAAATGTTGGATGATTGACTC	CCATCTGCACCATTGATGTCTAC	CGGAATCTTGGCCGACATT
				MMP1	AGAGAGTACAACTTACATCGTGTTGCGGCTCA	AGATGAAAGGTGGACCAACAATTT	CCAAGAGAATGGCCGAGTTC
MMP1	ACAGAGATGAAGTCCGGTTTTTCAAAGGGA	TTGAAGCTGCTTACGAATTTGC	GTCCCTGAACAGCCCAGTACTTA
				MMP7	CAGTCTAGGGATTAACTTCCTGTATGCT	GAACGCTGGACGGATGGTA	GAATGGCCAAGTTCATGAGTTG
MMP7	AGTGGGAACAGGCTCAGGACTATCTCAAGAG	CGGGAGGCATGAGTGAGCTA	GGCATTTTTTGTTTCTGAGTCATAGA
				KRT5	TGGAGGGCGAGGAATGCAGACTCA	CGCCACTTACCGCAAGCT	ACAGAGATGTTGACTGGTCCAACTC

表3的探针对应SEQ ID NO 56-68，正向引物对应SEQ ID NO 69-81且反向引物对应SEQ ID NO 82-94。例如，用于RPL37A的探针和引物是SEQ ID NO 56,69和82，用于GAPDH的探针和引物是SEQ ID NO 57,70和83。进行

验证实验，显示靶标和对照扩增的效率大致相等，这是通过比较ΔCT法相对定量基因表达的先决条件。为在生物样品内进行感兴趣基因的表达分析，通过混合2种特异试验的各自引物/探针来制备4x双重试验-混合物。对于CT值的分开检测，试验探针用不同荧光探针修饰。各4x试验-混合物包含2μM未修饰正向和反向引物以及1.2μM探针。对于各反应，提取自冷冻组织和福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)切片的2.5μl总RNA(见上)在96孔光反应板的1个孔中混合2.5μl试验-混合物、2.5μl酶-混合物和2.5μl水。PCR反应测量根据厂商说明书在适当条件(5min 50℃，1个循环；20s95℃，1个循环；15s 95℃，1min 60℃，40个循环)下完成，采用Versant qPCR循环仪(西门子)或Light Cycler 480(罗氏)。

如图6所示且与卵巢癌结果类似(见图3)，所有乳腺癌样品确实表达HLA-J。HLA-JmRNA表达的动态范围也广泛，包括7DCT值，这意味着多至2⁷(即128倍)上调的乳腺癌特异HLA-J表达。重要的是，此上调经常在晚期乳腺癌新辅助化疗后出现(比较新辅助化疗之前HLA-J mRNA水平的浅色柱与之后HLA-J mRNA水平的深色柱)。在19个匹配样品对的10个(～50％)中，观察到化疗后的显著HLA-J上调，而仅患者#25和#29能观察到下调。

ESR1 mRNA状态通过预定义截止设置确定并与此组的半定量IHC测定良好相关。如所预期，ESR1 mRNA状态与三阴乳腺癌(TNBC)标志物MMP7逆相关(斯皮尔曼Rho 0.3656；p＝0.0498)，MMP7是参与WNT依赖性侵入过程的基质金属蛋白酶。另外，ESR1 mRNA与ERBB2mRNA过表达不相关，如所预期，一半ERBB2阳性肿瘤确实过表达ESR1，而另一半没有。这证明所分析乳腺癌群的有效性和代表性。

非参数斯皮尔曼相关性分析揭示，在新辅助化疗前的芯针活检样品的HLA-J表达与ESR1 mRNA状态显著相关(斯皮尔曼Rho 0.5679；p＝0.0090)，用ES1 mRNA的定量检测趋向显著(斯皮尔曼Rho 0.4436；p＝0.0501)。

重要的是，治疗前的HLA-J mRNA表达也与KRT5 mRNA强相关(斯皮尔曼Rho0.6121；p＝0.0041)。认为KRT5与TNBC、ERBB2和管腔B型肿瘤中出现的乳腺癌基础样特征相关。这表明携带基底样特征的晚期管腔肿瘤在化疗初治情况中主要表达HLA-J，指示从头HLA-J表达参与控制浸润淋巴细胞。

接下来，研究用于分子亚型分析的治疗前生物标志物与新辅助化疗后肿瘤组织中HLA-J mRNA表达的关联性，这是根据剩余肿瘤组织的病理组织学反应进行的。

出人意料地，观察到亚型特异标志物基因表达关于治疗后HLA-J mRNA表达水平的治疗前关联完全转变。例如，不仅去除未经化疗的组织的HLA-J mRNA表达与治疗前ESR1mRNA状态较强和显著关联(斯皮尔曼Rho 0.5679；p＝0.0090)，而且在相反方向中几乎达到显著(斯皮尔曼Rho-0.4163；p＝0.0679)。类似地，治疗前HLA-J mRNA表达与KRT5 mRNA表达的强关联(斯皮尔曼Rho 0.6121；p＝0.0041)在体内化疗治疗乳腺癌组织后倒转，而在此相当地小的患者群中未达到显著(斯皮尔曼Rho-0.3392；p＝0.01434)。这些发现证明非管腔和三阴乳腺癌在化疗治疗后大幅上调HLA-J mRNA表达，而HLA-J mRNA表达在管腔肿瘤中未同样增加并保持不受影响。这是高度重要的，因为证明管腔肿瘤和三阴性肿瘤中的亚型特异性从头表达以及管腔肿瘤中没有上调，这已知具有减少的肿瘤细胞浸润(Schmidt等,Cancer Res.2008年7月1日；68(13):5405-13)。与这些先前仅集中于治疗前样品的研究相反，本文采用的独特方法阐明治疗后肿瘤驱动免疫细胞调节的动力学。重要的是，肿瘤组织的抗调节在肿瘤亚型中尤其明显，在未治疗背景中没有此动力。

其次，HLA-J表达的治疗前水平与化疗反应相关联，这是根据“肿瘤退行分级(Tumor Regression Grade)”(TRG),Ogston等,Breast.2003年10月；12(5):320-7。此TRG系统在治疗后定量肿瘤尺寸降低程度，肿瘤退行分级如下：

TRG 1:个体恶性肿瘤细胞有一些改变，但总体细胞性没有减少。

TRG 2:肿瘤细胞损失较少，但总体细胞性仍较高；<30％损失。

TRG 3:肿瘤细胞减少30％-90％。

TRG 4:肿瘤细胞损失>90％。

如图9所示，根据米勒佩恩分类不显示任何减少迹象的乳腺肿瘤(即TRG1&TRG2；由深灰色突出)同时展现出最高HLA-J mRNA表达。另外，这些肿瘤确实有更高水平的ESR1mRNA和更低水平的ERBB2 mRNA。这证明几乎不响应新辅助化疗的管腔肿瘤具有管腔特征和最高的治疗前HLA-J mRNA水平。因此，推断治疗前HLA-J mRNA水平预测化疗响应。

为比较特定生物标志物和/或靶基因的mRNA表达与化疗反应评估之间的关联，用各连续变量实施斯皮尔曼相关分析。迄今为止，已知ESR1 mRNA和ERBB2是预测乳腺癌中乳腺肿瘤对新辅助化疗响应的一些最佳响应标志物，如多个大型新辅助治疗试验所回顾性与前瞻性验证的(Denkert等,Annals of Oncology 2012)。此样品组的斯皮尔曼相关性表明，ESR1与肿瘤退行分级逆相关，高ESR1 mRNA水平与低肿瘤退行分级相关。这与先前的报道一致，尽管在此样品设置中没有达到统计显著性(斯皮尔曼Rho-0.2272；p＝0.3495)。如所预期，ERBB2 mRNA表达与肿瘤退行分级正相关，高ERBB2 mRNA水平与高肿瘤退行分级相关。这与先前的报道一致，尽管在此样品设置中没有达到统计显著性(斯皮尔曼Rho 0.2751；p＝0.2543)。相反，HLA-J mRNA表达与肿瘤退行分级逆相关，有高显著性(斯皮尔曼Rho-0.6094；p＝0.0056)。这证明就预测新辅助化疗响应而言，治疗前HLA-J mRNA水平优于常规乳腺癌标志物，治疗前芯针活检中的高水平HLA-J指示不响应化疗。

接下来，分析驻留肿瘤组织中HLA-J mRNA的化疗后mRNA水平是否与新辅助化疗反应相关联。

有趣的是，对新辅助化疗没有响应或响应极小的乳腺肿瘤的mRNA水平显示具有相似水平的ESR1和HLA-J mRNA表达(与图9比较)。相反，化疗方案攻击的肿瘤(浅灰色)显示HLA-J表达明显增加。应注意50％肿瘤的HLA-J mRNA水平高于治疗前的最高值。同时，肿瘤具有低水平HLA-J的频率大幅下降。

值得注意的是，肿瘤退行分级3和4与原发位点肿瘤负荷显著下降(尽管没有完全降低)相关联。然而，针对化疗仅有部分或不完全响应的肿瘤不具有更好的生存率，因为仅完全响应与出众的无进展和总体生存相关联。

有趣的是，当观察生物标志物的治疗后mRNA水平和/或靶基因表达时，就同时显示HLA-J mRNA大幅上调的驻留基底样肿瘤细胞富集对化疗不完全响应的肿瘤。KRT5和HLA-J的治疗后mRNA表达提升与高TRG状态相关联(分别为斯皮尔曼Rho 0.5239；p＝0.0256和斯皮尔曼Rho 0.5821；p＝0.0089)。

通过基于TRG状态的HLA-J mRNA表达的散布图分析，进一步研究此发现。如图13所示，当在新辅助化疗前比较TRG2与TRG3和TRG4肿瘤时，芯针活检的中值HLA-J mRNA表达逐步下降。相反，化疗后，剩余原发性疾病在新辅助化疗后的中值HLA-J mRNA表达逐步增加。

总之，化疗后在免疫浸润提高的非管腔肿瘤中HLA-J mRNA表达增加4倍-32倍(如Schmidt等,Clin Cancer Res 2008所述)，这另外与响应程度线性相关。这可视为肿瘤组织对压倒性免疫应答的逆反应，所述免疫应答由大量肿瘤细胞破坏和肿瘤抗原通过浸润树突状细胞或巨噬细胞而展示来激发。

化疗后HLA-J mRNA表达变化的最外预测价值(outmost predictive value)能如下展示：从用于个体肿瘤对的治疗后HLA-J mRNA水平减去治疗前水平(参见图14)。

最后，研究HLA-J mRNA表达变化与乳腺癌患者无进展生存的相关性。KaplanMeier分析揭示HLA-J mRNA表达增加大于3.5DDCT值，表明无进展生存较差(p＝0.0096)。

总之，这些结果证明治疗前HLA-J mRNA表达可预测乳腺癌的治疗结果和化疗功效。此外且与卵巢癌情况类似(参见实施例1)，化疗后的HLA-J表达有动态差异，证明肿瘤组织的逆反应，用于防止化疗后免疫浸润增加诱导肿瘤细胞破坏和后续肿瘤病变识别引起的消除。与卵巢癌情况类似，逆反应程度与预后较差相关联。由此，鉴定了肿瘤逃离免疫识别和破坏诱导的治疗的一般机制。此机制的确定减少到一个易适应临床常规设置的简单、高度可重复试验系统。此外，此一般机制的肿瘤特异性差异通过显示管腔肿瘤之间差异来证明，所述差异是通过例如且不限于测定ESR1、ERBB2和/或KRT5表达水平鉴定的。之前显示，示范性减少到ESR1 mRNA测定的分子亚型分析也在所有肿瘤种类的治疗效果方面具有预后以及预测价值，如乳腺癌(PCT/EP2014/067675；EP20140755642)、卵巢癌(WO2009068655A1；PCT/EP2008/066449)、膀胱癌(WO 2016/131875 A1；PCT/EP 2016/053372)和肺癌(US 9,683,229 B2；EP10721373.8)。因此，通过举例方式阐明且不限于乳腺癌的本发明也在源自其他原发性肿瘤位点的管腔和非管腔基底肿瘤方面有相关性，这归因于潜在的相似的肿瘤生物学。因此，本文所公开的逃逸机制的抑制在多种癌适应症中也是目前疗法的重要辅助。

实施例4：在癌症患者样品中经HLA-J抗体检测HLA-J蛋白

采用Geneious软件以Geneious比对模式分析经典(HLA-A到C)、非经典(HLA-E到G)和假基因(HLA-J和H)的肽序列同源物。共有序列在上面所有分析序列中以灰色突出。肽序列与共有序列的差异也以灰色突出。可观察到HLA-J的α3结构域、连接肽和其对应的跨膜结构域几乎连续以灰色突出，显示相较于假基因HLA-H以及经典和非经典HLA肽序列，这些区域是HLA-J独有的。由于此独特性，针对HLA-J独特α3结构域的C末端和跨膜结构域(图16)产生了HLA-J抗体。肽序列包括横跨α3结构域、连接肽和跨膜结构域N末端的22个氨基酸。

为证明所预测的HLA-J蛋白的存在，在来自患者(n＝4；患者ID:107、114、116、128)的卵巢癌组织中进行western印迹分析，所述患者不响应化疗(图17A)。对于各患者，评估化疗之前(前)和之后(后)的HLA-J蛋白表达。15μg蛋白组织裂解物在变性条件下于10％SDS-PAGE凝胶中分开，并且湿转移至硝酸纤维膜。与特异性HLA-J抗体“JULY”孵育后，在与偶联HPR的抗兔抗体孵育，然后施用TMB底物后观察到紫色沉淀物。Western印迹分析揭示HLA-J蛋白的存在，观察到的尺寸是约55kDa。关于样品107后，能在约100kDa检测到另外的条带。HLA-J的计算蛋白尺寸是约26.7kDa。这些发现表明HLA-J主要以二聚体和四聚体构型存在，其由可产生二硫键的半胱氨酸残基引起。令人意外的是，在患者107、116和128内，在化疗之前(前)与之后(后)的组织间能观察到蛋白表达变化。在患者#107和#116中，蛋白表达从治疗前样品到治疗后样品略有增加。在患者#128中，从新辅助治疗癌组织的治疗前样品到化疗后样品，能观察到HLA-J蛋白表达强增加。此结果表明HLA-J有助于免疫逃逸，尤其是新辅助化疗后，导致对化疗的响应不足。为确定HLA-J蛋白是否在其他癌症类型以及在着床前或后期存在，来自多种癌适应症和人胎盘组织的妊娠蛋白质裂解物通过与上述类似的western印迹技术分析(图17B)。重要的是，HLA-J蛋白能在卵巢癌(“OC”)、乳腺癌(“BC”)、尿路上皮/膀胱癌(“UC”)和胎盘组织(“Pl”)中测得。这证明HLA-J蛋白表达在非生理条件(如癌)和限定的生理情况(如“怀孕”)下出现。

实施例5：HLA-J表达在非妇科癌症中的预测价值

为评估化疗后HLA-J上调是否也在非妇科癌症中出现，在化疗前(“TUR”；经尿道活检)和化疗后(“CYS”；囊切除术组织)收集来自晚期、肌层浸润性膀胱癌患者(两个性别都有)的组织样品。另外，为证明HLA-J的肿瘤特异性表达，从囊切除术的切除物中收集非肿瘤组织(“作图”,来自相同患者的正常组织样品)。初始群由来自20个患者的匹配组织组成，所述患者在组织学上确认MIBC、UICC II和III期(cT2-3和cN0或cN+M0)。所有患者经历3个新辅助治疗周期的吉西他滨1250mg/m²(d1；d8)顺铂70mg/m²(d1)，然后是根治性膀胱切除术(RC)。对于经尿道切除(“TUR”)活检和囊切除术标本(“CYS”样品)，选择有至少50％肿瘤含量(最小肿瘤尺寸5x5 mm)的代表性甲醛固定石蜡包埋(FFPE)块，选择划定良好的侵入边界，且没有坏死区或肉芽肿性炎症。对于正常组织对照，选择来自同一囊切除术标本的组织病理学确认的无肿瘤区域以制备代表性FFPE块(“作图”样品)。从FFPE组织提取RNA，采用10-μm区段，其通过市售可得的基于珠的提取方法处理(XTRACT试剂盒；STRATIFYER分子病理学有限公司(STRATIFYER Molecular Pathology GmbH),德国科隆)。用100μl洗脱缓冲液洗脱RNA，分析RNA洗脱物。应用RT-qPCR以相对定量HLA-J mRNA以及CALM2(管家基因)表达，使用上述基因特异性基于

的试验。实验在Roche Light Cycler LC480(德国罗氏)上根据下列操作运转：5min,50℃，20s,95℃，然后是40个循环的15s,95℃和60s,60℃。实施40个扩增循环，用于各样品的3个标志物和1个参照基因的循环量化阈值(Ct)评估为一式三份测量的均值。从靶基因的Ct值减去管家基因CALM2的Ct值(ΔCt)，使Ct值标准化。HLA-J特异mRNA表达通过重复测量确定，采用单步式RT-qPCR，来自上述匹配TUR活检、CYS样品和作图样品。相对基因表达用上述40-DCT法测定。

重要的是，没有一个作图样品显示HLA-J表达，证明HLA-J的肿瘤特异性表达。然而，在20个患者中的3个，HLA-J的肿瘤特异性表达能在新辅助化疗后的CYS样品中检测到，而在化疗前的匹配TUR活检样品中无法测得表达(图18)。这表明肿瘤特异性HLA-J表达由化疗诱导，有助于这些肿瘤的化疗耐药性表型。这证明新辅助化疗后HLA-J表达增加不仅在乳腺和卵巢癌中出现，而且也在非妇科癌症如膀胱癌中出现。因此，可推断HLA-J表达是众多妇科和非妇科肿瘤中存在的更普遍的抗性机制。

Claims (14)

1.一种核酸分子、载体、宿主细胞、或蛋白或肽、或其组合，用作免疫抑制剂、肿瘤疫苗或怀孕促进剂，其中

(I)所述核酸分子

(a)编码包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由其组成的多肽，或

(b)由SEQ ID NO:2的核苷酸序列组成，或

(c)编码与SEQ ID NO:1的氨基酸序列至少70％，优选至少80％相同，更优选至少90％相同，且最优选至少95％相同的多肽；或

(d)由与SEQ ID NO:2的核苷酸序列至少70％相同，优选至少80％相同，更优选至少90％相同，且最优选至少95％相同的核苷酸序列组成；或

(e)由与(d)的核酸分子简并的核苷酸序列组成；或

(f)(a)-(e)中任一项的核酸分子的片段，所述片段包含至少150个核苷酸，优选至少300个核苷酸，更优选至少450个核苷酸，且最优选至少600个核苷酸；

或

(g)对应于(a)-(f)中任一项的核酸分子，其中T由U取代；

(II)所述载体包含(I)的核酸分子；

(iii)所述宿主细胞用(II)的载体转化、转导或转染；和

(iv)所述蛋白或肽由(I)的核酸分子编码。

2.一种如权利要求1所定义的核酸分子的抑制剂和/或如权利要求1所定义的蛋白的结合分子，优选如权利要求1所定义的蛋白的抑制剂，其用作免疫激活剂，优选用于肿瘤治疗。

3.如权利要求2所述的结合分子，优选抑制剂，其中

(i)所述核酸分子的抑制剂选自小分子、适体、siRNA、shRNA、miRNA、核酶、反义核酸分子、基于CRISPR-Cas9的构建体、基于CRISPR-Cpf1的构建体、大范围核酸酶、锌指核酸酶和转录激活因子样(TAL)效应物(TALE)核酸酶，和/或

(ii)所述蛋白的结合分子，优选所述蛋白的抑制剂选自小分子、抗体或抗体模拟物、适体，其中所述抗体模拟物优选选自亲和体、adnectin、抗运载蛋白、DARPin、avimer、nanofitin、affilin、Kunitz结构域肽、

三特异结合分子和probody。

4.获自对象的样品中的如权利要求1(I)(g)所定义的核酸分子和/或如权利要求1所定义的蛋白或肽用于诊断肿瘤和/或分级肿瘤和/或肿瘤预后和/或将肿瘤分类为HLA-J低表达肿瘤或HLA-J高表达肿瘤和/或诊断着床失败的应用。

5.一种诊断肿瘤的方法，所述方法包括检测获自对象的样品中的如权利要求1(I)(g)所定义的核酸分子和/或如权利要求1所定义的蛋白或肽的存在，其中如权利要求1(I)(g)所定义的核酸分子和/或如权利要求1所定义的蛋白的存在指示对象中的肿瘤。

6.一种分级肿瘤和/或肿瘤预后的方法，所述方法包括确定获自对象的样品中的如权利要求1(I)(g)所定义的核酸分子和/或如权利要求1所定义的蛋白或肽的水平，其中如权利要求1(I)(g)所定义的核酸分子和/或如权利要求1所定义的蛋白或肽与对照相比水平增加与肿瘤级别更高和/或肿瘤预后不良相关。

7.一种诊断肿瘤和/或分级肿瘤和/或肿瘤预后的试剂盒，所述试剂盒包括

(a)检测和/或定量获自对象的样品中的如权利要求1(I)(g)所定义的核酸分子和/或如权利要求1所定义的蛋白或肽的工具，和

(b)使用试剂盒的说明。

8.一种在具有肿瘤的对象中监测肿瘤治疗无功效的方法，所述方法包括(a)确定在治疗开始前获自对象的样品中的如权利要求1(I)(g)所定义的核酸分子和/或如权利要求1所定义的蛋白或肽的量；和(b)确定在治疗开始后的一个或多个时间获自对象的样品中如权利要求1(I)(g)所定义的核酸分子和/或如权利要求1所定义的蛋白或肽的量，其中b)的量相较于a)增加则指示肿瘤治疗无功效和/或b)的量相较于a)减少则指示肿瘤治疗有功效。

9.一种监测在需要免疫抑制治疗的对象中这种治疗无功效的方法，所述方法包括(a)确定在治疗开始前获自对象的样品中的如权利要求1(I)(g)所定义的核酸分子和/或如权利要求1所定义的蛋白或肽的量；和(b)确定在治疗开始后的一个或多个时间获自对象的样品中的如权利要求1(I)(g)所定义的核酸分子和/或如权利要求1所定义的蛋白或肽的量，其中b)的量相较于a)减少则指示免疫抑制治疗无功效和/或b)的量相较于a)增加则指示免疫抑制治疗有功效。

10.如权利要求1所述的核酸分子、载体、宿主细胞和/或蛋白或肽或其组合，如权利要求2或3所述的结合分子、优选抑制剂，如权利要求4所述的应用，如权利要求5、6或8所述的方法，或如权利要求7所述的试剂盒，其中所述肿瘤是癌症。

11.如权利要求10所述的核酸分子、载体、宿主细胞和/或蛋白或肽或其组合，结合分子、优选抑制剂，应用，方法或试剂盒，其中所述癌症选自乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、阴道癌、女阴癌、膀胱癌、唾液腺癌、胰腺癌、甲状腺癌、肾癌、肺癌、涉及上消化道的癌、结肠癌、结直肠癌、前列腺癌、头颈部鳞状细胞癌、宫颈癌、成胶质细胞瘤、恶性腹水、淋巴瘤和白血病。

12.如权利要求10所述的核酸分子、载体、宿主细胞和/或蛋白或肽或其组合，结合分子、优选抑制剂，应用，方法或试剂盒，其中所述癌症是妇科癌症。

13.如权利要求10所述的核酸分子、载体、宿主细胞和/或蛋白或肽或其组合，结合分子、优选抑制剂，应用，方法或试剂盒，其中所述癌症是乳腺癌或卵巢癌。

14.前述利要求中任一项所述的核酸分子、载体、宿主细胞和/或蛋白或肽或其组合，结合分子、优选抑制剂，应用，方法或试剂盒，其中所述样品是体液或来自器官的组织样品。

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