KR20210005186A

KR20210005186A - Hla-j 및 이의 의료/진단 용도

Info

Publication number: KR20210005186A
Application number: KR1020207034161A
Authority: KR
Inventors: 볼프강 뷔르펠; 랄프 마르쿠스 비어츠; 크리스토프 빈터할터; 프란치스카 뷔르펠
Original assignee: 인텔렉슨 게엠베하
Priority date: 2018-04-26
Filing date: 2019-04-25
Publication date: 2021-01-13
Also published as: AU2019258527A1; JP2021522337A; US20230374609A1; EP3784803A1; CN112639133A; CA3097352A1; US20210238690A1; WO2019207039A1

Abstract

본 발명은 (a) SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열로 이루어지거나 이를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하고, (b) SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 서열로 이루어지며, (c) SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 70 %, 바람직하게는 적어도 80 %의 상동성, 더욱 바람직하게는 적어도 90 %의 상동성, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 95 %의 상동성인 폴리펩타이드를 암호화하고; (d) SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 70 %의 상동성, 바람직하게는 적어도 80 %의 상동성, 더욱 바람직하게는 적어도 90 %의 상동성, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 95 %의 상동성인 뉴클레오티드 서열로 이루어지며; (e) (d)의 핵산분자에 대하여 축퇴되는 뉴클레오티드 서열로 이루어지고; (f) (a) 내지 (e) 중 어느 하나의 핵산분자의 단편으로, 상기 단편은 적어도 150 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 300 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 적어도 450 뉴클레오티드, 및 가장 바람직하게는 적어도 600 뉴클레오티드를 포함하거나; 또는 (g) (a) 내지 (f) 중 어느 하나의 핵산분자에 해당하며, 여기서 T는 U로 치환된 핵산분자에 관한 것이다.

Description

HLA-J 및 이의 의료/진단 용도

본 명세서에는 특허 출원서 및 제조업제 설명서를 포함한 많은 문서가 인용된다. 이들 문서의 개시는 본 발명의 특허성에 관련되지는 않으나 그 전체가 참조로 여기에 포함된다. 보다 구체적으로, 모든 참조 문서는 각각의 개별 문서가 참조로서 구체적이고 개별적으로 통합된 것으로 표시된 것과 동일한 정도로 참조로서 포함된다.

인간 백혈구 항원 (HLA) 시스템 또는 복합체는 인간의 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 단백질을 암호화하는 유전자 복합체이다. 이러한 세포 표면 단백질은 인간의 면역 체계 조절을 담당한다. HLA 유전자 복합체는 염색체 6p21 내의 3Mbp 스트레치 상에 있다. 이 복합체의 유전자는 세 가지 기본 그룹으로 분류된다: 클래스 I, 클래스 II 및 클래스 III.

인간은 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C로 알려진 세 가지 주요 MHC 클래스 I 유전자를 가지고 있다. 이 유전자에서 생성된 단백질은 거의 모든 세포의 표면에 존재한다. 세포 표면에서 이들 단백질은 세포 내에서 내보내어진 단백질 단편 (펩타이드)에 결합된다. MHC 클래스 I 단백질은 이러한 펩타이드를 면역 시스템에 제시한다. 면역 시스템이 이 펩타이드를 외래물질(예: 바이러스 또는 박테리아 펩타이드)로 인식하는 경우, 감염된 세포를 자가-파괴하도록 촉발하는 반응을 한다.

인간에는 6 개의 주요 MHC 클래스 II 유전자가 있다: HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRA 및 HLA-DRB1. MHC 클래스 II 유전자는 특정 면역계 세포의 표면에 거의 독점적으로 존재하는 단백질을 만들기 위한 명령을 제공한다. MHC 클래스 I 단백질과 마찬가지로, 이 단백질은 면역 시스템으로 펩타이드를 제시한다.

MHC 클래스 III 유전자에서 생산된 단백질은 다소 다른 기능을 갖는다; 그들은 염증 및 기타 면역 시스템 활동에 관여한다. 일부 MHC 유전자의 기능은 알려져 있지 않다.

HLA 유전자는 가능한 많은 변이를 가지고 있어, 각각의 사람의 면역 시스템이 다양한 외부 침입자에 반응할 수 있게 한다. 일부 HLA 유전자는 수백 개의 규명된 버전 (대립 유전자)을 가지며, 각 버전에는 특정 번호가 부여된다 (예: HLA-B27). 밀접하게 관련된 대립 유전자는 함께 분류된다; 예를 들어, 적어도 40개의 매우 유사한 대립 유전자는 HLA-B27의 아형이다. 이러한 하위 유형은 HLA-B*2701 내지 HLA-B*2743으로 지정된다.

100 개 이상의 질병이 HLA 유전자의 다른 대립 유전자와 관련되어 있다. 예를 들어 HLA-B27 대립 유전자는 강직성 척추염이라는 염증성 관절 질환이 발생할 위험을 증가시킨다. 비정상적인 면역 기능 및 일부 형태의 암과 관련된 다른 많은 장애도 특정 HLA 대립 유전자와 관련이 있다. 그러나, HLA 유전자가 이들 질병의 발병 위험에 어떤 역할을 하는지는 종종 불분명하다.

세 개의 주요 MHC 클래스 I 유전자 옆에 비-고전적 MHC 클래스 I 분자인 HLA-E, HLA-F HLA-G가 HLA 클래스 I 영역에 의해 암호화된다. HLA-G, -E, 및 -F의 과발현은 다양한 악성 종양에서 흔히 발견된다 (Kochan et al., Oncoimmunology. 2013 Nov 1; 2 (11): e26491.). HLA-G 및 HLA-E는 암 바이오 마커로 보고되었으며 암의 불량한 임상결과와 양의 상관관계가 있는 것으로 보고되었다.

HLA 클래스 I 영역은 또한 클래스 I 유사유전자 (pseudogene) (Hughes, Mol Biol Evol. 1995 Mar; 12 (2): 247-58) 및 유전자 단편을 포함하는 것으로 보고되었다. 예를 들어, HLA-H, J, K 및 L은 클래스 I 유사유전자로 분류되고 HLA-N, S 및 X는 유전자 단편으로 분류된다. 특히, HLA-J가 엑손 2 또는 엑손 4에서 번역 종결을 생성하는 해로운 돌연변이에 의한 유사유전자라는 사실이 Messer et al., J Immunol에 의해 보고되었다. 1992 Jun 15; 148 (12): 4043-53.

US 9,353,416 B2는 HLA-J가 유방암을 앓고있는 환자의 수술 후 예후에 마커로 사용될 수 있다고 논의한다. 보다 구체적으로, HLA-J는 다양한 다른 마커와 함께 과발현 될 때 좋은 예후를 제공한다. HLA-J 서열의 특성과 관련하여, US 9,353,416 B2에서는 Messer et al., J Immunol. 1992 Jun 15; 148(12):4043-53에 의해 보고된 HLA-J 서열이 정확하가도 가정한다. 더욱이 HLA-J가 좋은 예후의 지표라는 가정에 따라, US 9,353,416 B2는 암 백신으로서 HLA-J의 잠재적 용도에 대하여 침묵한다.

따라서, 인간 백혈구 항원 (HLA) 유전자는 생물 의학 및 치료에서 중요한 표적으로서 오랜 연구 역사를 갖는다. 그러나 HLA 시스템의 임상적 중요성을 고려할 때, HLA 유전자에 대한 연구에 집중할 필요, 특히 HLA 시스템을 기반으로 생물 의학 및 치료에 대한 추가 표적을 찾을 필요가 여전히 존재한다. 이러한 필요성은 본 발명에 의해 해결된다. 본 발명과 관련하여 놀랍게도 HLA-J는 유사유전자가(pseudogene) 아니라 HLA-J 단백질을 암호화하는 기능적 오픈 리딩 프레임을 포함하고 HLA J는 질병, 특히 종양의 치료 및 검출을 위한 표적이라는 것이 발견되었다.

따라서, 제1 측면에서, (a) SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열로 이루어지거나 이를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하고, (b) SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 서열로 이루어지며, (c) SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 70 %, 바람직하게는 적어도 80 %의 상동성, 더욱 바람직하게는 적어도 90 %의 상동성, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 95 %의 상동성인 폴리펩타이드를 암호화하고; (d) SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 70 %의 상동성, 바람직하게는 적어도 80 %의 상동성, 더욱 바람직하게는 적어도 90 %의 상동성, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 95 %의 상동성인 뉴클레오티드 서열로 이루어지며; (e) (d)의 핵산분자에 대하여 축퇴되는 뉴클레오티드 서열로 이루어지고; (f) (a) 내지 (e) 중 어느 하나의 핵산분자의 단편으로, 상기 단편은 적어도 150 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 300 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 적어도 450 뉴클레오티드, 및 가장 바람직하게는 적어도 600 뉴클레오티드를 포함하거나; 또는 (g) (a) 내지 (f) 중 어느 하나의 핵산분자에 해당하며, 여기서 T는 U로 치환된 핵산분자에 관한 것이다.

본 발명에 따른 용어 "핵산분자"는 cDNA 또는 이중 또는 단일 가닥 게놈 DNA 및 RNA와 같은 DNA를 포함한다. 이와 관련하여, "DNA"(데옥시리보 핵산)는 데옥시리보스 당 백본에 함께 연결된 뉴클레오티드 염기라고하는 화학적 빌딩 블록인 아데닌 (A), 구아닌 (G), 시토신 (C) 및 티민 (T)의 모든 사슬 또는 서열을 의미한다. DNA는 한 가닥의 뉴클레오티드 염기를 가지거나 이중 나선 구조를 형성할 수 있는 두 개의 상보 가닥을 가질 수 있다. "RNA"(리보 핵산)는 리보스 당 백본에 함께 연결된 뉴클레오티드 염기라고하는 화학적 빌딩 블록인 아데닌 (A), 구아닌 (G), 시토신 (C) 및 우라실 (U)의 모든 사슬 또는 서열을 의미한다. RNA는 일반적으로 mRNA와 같은 한 가닥의 뉴클레오티드 염기를 갖는다. 단일-가닥 및 이중-가닥 하이브리드 분자, 즉 DNA-DNA, DNA-RNA 및 RNA-RNA도 포함된다. 핵산분자는 또한 당업계에 공지된 많은 수단으로 변형될 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예는 메-틸화, "캡 (cap)", 하나 이상의 천연 뉴클레오티드의 유사체 (analog)로의 치환, 및 뉴클레오티드간 변형, 예를 들어 비-전하성 결합을 갖는 변형 (예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 및 전하성 결합을 갖는 변형 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)을 포함한다. 다음에서 폴리뉴클레오티드라고도 지칭되는 핵산분자는 추가의 공유 결합된 모이어티를 하나 이상 포함할 수 있고, 예를 들어 단백질 (예: 뉴클레아 제, 독소, 항체, 신호 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 인터칼레이터 (intercalator) (예: 아크리딘 (acridine), 소랄렌 (psoralen) 등), 킬레이터 (chelator) (예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬레이터를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 메틸 또는 에틸 포스포트리에스테르 또는 알킬 포스포아미데이트 결합의 형성에 의해 유도체화될 수 있다. DNA 또는 RNA의 합성 또는 반합성 유도체 및 혼합 중합체와 같은 당업계에 공지된 핵산 모방 분자 (mimicking molecule)가 추가로 포함된다. 본 발명에 따른 이러한 핵산 모방 분자 또는 핵산 유도체는 포스포로티오에이트 핵산(phosphorothioate nucleic acid), 포스포아미데이트 핵산 (phosphoramidate nucleic acid), 2'-O-메톡시에틸 리보 핵산 (2'-O-methoxyethyl ribonucleic acid), 모르폴리노 핵산 (morpholino nucleic acid), 헥시톨 핵산 (hexitol nucleic acid, HNA), 펩타이드 핵산 (PNA) 및 잠금 핵산 (locked nucleic acid, LNA)을 포함한다 (Braasch and Corey, Chem Biol 2001, 8: 1 참조). LNA는 2'-산소와 4'-탄소 사이의 메틸렌 결합에 의해 리보스 고리가 속박된 RNA 유도체이다. 변형된 염기, 예를 들어 티오-우라실, 티오-구아닌 및 플루오로-우라실을 포함하는 핵산도 포함된다. 핵산분자는 일반적으로 단백질 및/또는 폴리펩타이드를 만들기 위해 세포 시스템 (cellular machinery)에 의해 사용되는 정보를 포함한 유전 정보를 전달한다. 본 발명의 핵산분자는 추가적으로 프로모터, 인핸서, 반응 요소, 신호 서열 (signal sequence), 폴리아데닐화 서열 (polyadenylation sequence), 인트론, 5'- 및 3'- 비-코딩 영역 등을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 핵산분자는 SEQ ID NO: 1의 HLA-J 단백질로부터 유래된 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 암호화한다. 따라서 본 발명의 핵산분자는 게놈 DNA 또는 mRNA 인 것이 바람직하다. mRNA의 경우, 핵산분자는 추가로 폴리-A 테일을 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어 "단백질"은, 용어 "폴리펩타이드"와 상호 교환적으로 사용되며, 적어도 50 개의 아미노산을 포함하는 단일 사슬 단백질 또는 이들의 단편을 포함하는 아미노산의 선형 분자 사슬을 나타낸다. 본원에서 사용된 용어 "펩타이드"는 최대 49 개의 아미노산으로 구성된 분자 그룹을 나타내는 반면, 본원에서 사용된 용어 "폴리펩타이드"("단백질"이라고도 지칭됨)는 적어도 50 개의 아미노산으로 구성된 분자 그룹을 나타낸다. 본원에서 사용된 용어 "펩타이드"는 아미노산의 증가된 선호도로 적어도 15 개의 아미노산, 적어도 20 개의 아미노산, 적어도 25 개의 아미노산 및 적어도 40 개의 아미노산으로 구성된 분자의 그룹을 나타낸다. 펩타이드 및 폴리펩타이드 그룹은 용어 "(폴리)펩타이드"를 사용하여 함께 지칭된다. (폴리)펩타이드들은 적어도 2 개의 동일하거나 상이한 분자로 구성된 올리고머를 추가로 형성할 수 있다. 이러한 다량체 (multimer)에 상응하는 고차 구조는 동종 또는 이종이량체, 동종 또는 이종삼량체 등으로 그에 상응하여 불린다. SEQ ID NO: 1의 HLA-J 단백질은 139, 175 및 189 위치에 시스테인을 포함하고 따라서 잠재적 이량체화 부위이다. 더욱이, 아미노산(들) 및/또는 펩타이드 결합(들)이 기능적 유사체 (analogue)로 대체 된 이러한 단백질/(폴리)펩타이드의 펩타이드모방체(peptidomimetic)도 본 발명에 포함된다. 이러한 기능적 유사체(analogue)에는 셀레노시스테인 (selenocysteine)과 같은 20 개의 유전자-코딩 아미노산 이외에도 모든 알려진 아미노산이 포함된다. 용어 "(폴리)펩타이드" 및 "단백질"은 또한 자연적으로 변형된 (폴리)펩타이드 및 단백질을 지칭하며, 상기 변형은 예를들어 글리코실화, 아세틸화, 인산화 및 당업계에 잘 알려진 유사한 변형에 의한 것이다.

본 발명에 따르면, 용어 "서열 상동성 백분율 (%)"은 주형 핵산 또는 아미노산 서열의 전체 길이를 구성하는 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 수 대비 둘 이상의 정렬된 핵산 또는 아미노산 서열의 동일한 뉴클레오티드/아미노산의 일치 ("히트") 수를 나타낸다. 즉, (부분)서열이 비교 창에 걸쳐 또는 당업계에 공지된 서열 비교 알고리즘을 사용하여 측정된 지정된 영역에 걸쳐 최대 상응하도록 비교되고 정렬될 때, 또는 수동으로 정렬되고 육안으로 검사할 때, 정렬을 사용하면 둘 이상의 서열 또는 부분서열 (subsequence)에 대해 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 백분율 (예: 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % 또는 95 % 동일성)이 결정될 수 있다. 이러한 정의는 또한 정렬되는 모든 서열의 보완체(complement)에도 적용된다.

본 발명과 관련된 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 분석 및 정렬은 바람직하게는 NCBI BLAST 알고리즘을 사용하여 수행된다 (Stephen F. Altschul, Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), Nucleic Acids Res. 25:3389-3402). BLAST는 뉴클레오티드 서열 (nucleotide BLAST) 및 아미노산 서열 (protein BLAST)에 사용될 수 있다. 통상의 기술자는 핵산 서열을 정렬하는데 적절한 추가의 프로그램을 알고 있다.

본원에 정의된 바와 같이, 적어도 70 % 동일, 바람직하게는 적어도 80 % 동일, 더 바람직하게는 적어도 90 % 동일, 가장 바람직하게는 적어도 95 % 동일의 서열 상동성이 본 발명에 의해 구상된다. 그러나, 또한, 점차 증가하는 선호도로써, 적어도 97.5 %, 적어도 98.5 %, 적어도 99 %, 적어도 99.5 %, 적어도 99.8 % 및 100 %의 서열 상동성이 본 발명에 의해 구상된다.

더욱이, SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 서열과 적어도 70 %의 상동성 또는 바람직하게 더 높은 상동성 중 어느 하나의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열 내에 SEQ ID NO: 2의 16개의 뉴클레오티드 "TCACACATTTCTGGAA" (SEQ ID NO: 3)는 존재하며 변경되지 않은 채로 남아있는 것이 바람직하다. 도 2에서 명백한 바와 같이, SEQ ID NO: 3은 SEQ ID NO: 2의 HLA-J 핵산분자에서만 발견될 수 있지만 다른 HLA의 핵산분자에서는 발견될 수 없는 16 개 뉴클레오티드의 삽입 돌연변이에 해당한다. 따라서, 16 개 뉴클레오티드 삽입은 HLA-J 핵산분자에 대해 고유한 것이다. 더욱이, 뉴클레오티드 삽입은 프레임 이동을 야기하여, 삽입부터 SEQ ID NO: 2의 3'-말단까지 전체 핵산 서열 (종결코돈 "TAG" 제외)이 고유한 펩타이드를 암호화한다. 따라서, SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 서열과 적어도 70 %의 상동성 또는 바람직하게 더 높은 상동성 중 어느 하나의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열 내에 SEQ ID NO: 2의 "TCACACATTTCTGGAAACTTCTCAAGG TTCCAAGACTAGGAGGTTCCTC" (SEQ ID NO: 4)가 존재하며 변경되지 않은 채로 남아있는 것이 더 바람직하다. SEQ ID NO: 4에 의해 암호화되는 아미노산은 "HTFLETSQGSKTRRFL" (서열 번호 5)이다. 그러므로 SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 서열과 적어도 70 %의 상동성 또는 바람직하게 더 높은 상동성 중 어느 하나의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 5을 포함하는 아미노산 서열을 암호화, 바람직하게는 C-말단에 암호화하는 것이 더 바람직하다.

MHC 클래스 I 분자는 일반적으로 두 개의 사슬을 포함한다: MHC 알파 사슬 (중쇄) 및 베타 2- 마이크로 글로불린 사슬 (경쇄). 알파 사슬 만이 막에 걸쳐 있다. 알파 사슬은 3 개의 세포 외 도메인을 갖는다 (알파 1, 2 및 3으로 지칭되며 알파 1은 N-말단에 있음). HLA-J의 알파 사슬 도메인 알파 1 및 알파 3은 주로 HLA-J의 면역억제 능력을 결정하며, 여기서 도메인 알파 3이 가장 중요한 것으로 알려져있다. SEQ ID NO 6과 7의 뉴클레오티드는 각각 HLA-J의 도메인 알파 1과 알파 3을 암호화한다. SEQ ID NO 8 및 9의 아미노산 서열은 각각 HLA-J의 도메인 알파 1 및 알파 3의 아미노산 서열이다. 따라서, SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 서열과 적어도 70 %의 상동성 또는 바람직하게 더 높은 상동성 중 어느 하나의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열은, 점차 증가되는 선호도로써, SEQ ID NO: 7와 적어도 97.5 %, 적어도 98.5 %, 적어도 99 %, 적어도 99.5 %, 적어도 99.8 %, 및 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 또한, SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 서열과 적어도 70 %의 상동성 또는 바람직하게 더 높은 상동성 중 어느 하나의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열은, 점차 증가되는 선호도로써, SEQ ID NO: 9와 적어도 97.5 %, 적어도 98.5 %, 적어도 99 %, 적어도 99.5 %, 적어도 99.8 %, 및 100% 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 것이 바람직하다. SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 서열과 적어도 70 %의 상동성 또는 바람직하게 더 높은 상동성 중 어느 하나의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열은, 점차 증가되는 선호도로써, SEQ ID NO: 7와 적어도 97.5 %, 적어도 98.5 %, 적어도 99 %, 적어도 99.5 %, 적어도 99.8 %, 및 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함; 및/또는 점차 증가되는 선호도로써, SEQ ID NO: 6와 적어도 97.5 %, 적어도 98.5 %, 적어도 99 %, 적어도 99.5 %, 적어도 99.8 %, 및 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이 더 바람직하다. 또한, SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 서열과 적어도 70 %의 상동성 또는 바람직하게 더 높은 상동성 중 어느 하나의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열은, 점차 증가되는 선호도로써, SEQ ID NO: 9와 적어도 97.5 %, 적어도 98.5 %, 적어도 99 %, 적어도 99.5 %, 적어도 99.8 %, 및 100% 동일한 아미노산 서열을 암호화; 및/또는 점차 증가되는 선호도로써, SEQ ID NO: 8과 적어도 97.5 %, 적어도 98.5 %, 적어도 99 %, 적어도 99.5 %, 적어도 99.8 %, 및 100% 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 것이 더욱 바람직하다.

SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 서열과 적어도 70 %의 상동성 또는 바람직하게 더 높은 상동성 중 어느 하나의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열은 다음 중 2개 또는 3개 모두 포함하는 것이 가장 바람직하다: (i) SEQ ID NO: 3, 바람직하게는 SEQ ID NO: 4의 뉴클레오티드 서열, 여기서 SEQ ID NO: 4는 3'-말단에 있는 것이 바람직하다; (ii) 점차 증가되는 선호도로써, SEQ ID NO: 7과 적어도 97.5 %, 적어도 98.5 %, 적어도 99 %, 적어도 99.5 %, 적어도 99.8 % 및 100 % 동일한 뉴클레오티드 서열; 및 (iii) 점차 증가되는 선호도로써, SEQ ID NO: 6과 적어도 97.5 %, 적어도 98.5 %, 적어도 99 %, 적어도 99.5 %, 적어도 99.8 % 및 100 % 동일한 뉴클레오티드 서열. (i) 내지 (iii) 중 2 개인 경우, 두 개는 바람직하게 (i) 및 (ii)이다.

본 발명에 따른 용어 "축퇴하다 (degenerate)"는 유전 암호 (genetic code)의 축퇴성 (degeneracy)을 의미한다. 삼중자코드 (triplet code)는 20 개의 아미노산과 하나의 정지 코돈을 지정하고 유전 정보를 암호화하는데 사용되는 4 개의 염기가 존재하기 때문에, 삼중자코돈은 적어도 21 개의 서로 다른 코드를 생성하는데 필요하다. 3개의 염기에 대한 가능한 4³가능성은 64 개의 가능한 코돈을 제공하며, 이는 일부 축퇴성이 존재해야 함을 의미한다. 결과적으로 일부 아미노산은 하나 이상의 삼중자, 즉 최대 6 개 삼중자에 의해 암호화된다. 축퇴성은 대부분 삼중자에서 세 번째 위치의 변경으로 인해 발생한다. 이는 상기 명시된 것과는 다른 뉴클레오티드 서열을 갖지만 여전히 동일한 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산분자가 본 발명의 범위 내에 있음을 의미한다. 본 발명의 제1 측면과 관련하여, 따라서 통상의 기술자는 (e)에 언급된 "(e) (d)의 핵산분자에 대해 축퇴된 뉴클레오티드 서열로 구성된"이 항목 (d)에 따른 핵산분자와 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 핵상분자를 지칭히는 것을 이해한다. 이러한 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열이거나 그로부터 유도되며, 상기 후자의 아미노산 서열은 적어도 항목 (d)의 주요 구체예에서 언급된 서열 상동성 값에서 요구하고 암시하는 정도로 SEQ ID NO: 1과 동일하다.

본 발명에 따른 (a) 내지 (f) 중 어느 하나의 핵산분자의 단편은 적어도 150 개의 뉴클레오티드를 포함한다. 이와 관련하여, 점차 증가하는 선호도로써, 본 발명에 따른 단편은 적어도 200 개, 적어도 250 개, 적어도 300 개, 적어도 350 개, 적어도 400 개, 적어도 450 개, 적어도 500 개, 적어도 550 개, 적어도 600 개 또는 적어도 650 개의 뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드인 것이 바람직하고, 가장 바람직하게 상기 단편은 5'-ATP 개시코돈 및/또는 3'-TAG 종결코돈만 결여된 단편이다. 더욱이, 상기 단편은 SEQ ID NO: 3, 바람직하게는 SEQ ID NO: 4, 그리고 가장 바람직하게 SEQ ID NO: 5를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. SEQ ID NO:5를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 뒤에 추가의 뉴클레오티드(들)이 없거나 종결코돈이 뒤 따르는 단편의 3'-말단 (3'-end)에서 발견된다. 마찬가지로, 상기 단편은, 점차 증가되는 선호도로써, SEQ ID NO: 7과 적어도 97.5 %, 적어도 98.5 %, 적어도 99 %, 적어도 99.5 %, 적어도 99.8 % 및 100 % 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나; 점차 증가되는 선호도로써, SEQ ID NO: 9와 적어도 97.5 %, 적어도 98.5 %, 적어도 99 %, 적어도 99.5 %, 적어도 99.8 % 및 100 % 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 것이 바람직하다. 상기 단편은, 점차 증가되는 선호도로써, SEQ ID NO: 7과 적어도 97.5 %, 적어도 98.5 %, 적어도 99 %, 적어도 99.5 %, 적어도 99.8 % 및 100 % 동일한 뉴클레오티드 서열; 및/또는 점차 증가되는 선호도로써, SEQ ID NO: 6과 적어도 97.5 %, 적어도 98.5 %, 적어도 99 %, 적어도 99.5 %, 적어도 99.8 % 및 100 % 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 유사하게, 상기 단편은, 점차 증가되는 선호도로써, SEQ ID NO: 9와 적어도 97.5 %, 적어도 98.5 %, 적어도 99 %, 적어도 99.5 %, 적어도 99.8 % 및 100 % 동일한 아미노산 서열을 암호화; 및/또는 점차 증가되는 선호도로써, SEQ ID NO: 8과 적어도 97.5 %, 적어도 98.5 %, 적어도 99 %, 적어도 99.5 %, 적어도 99.8 % 및 100 % 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 것이 더욱 바람직하다. 상기 단편은 바람직하게 다음 중 2 개 또는 3개 모두를 포함하는 것이 가장 바람직하다: (i) SEQ ID NO: 3, 바람직하게는 SEQ ID NO: 4의 뉴클레오티드 서열, 여기서 SEQ ID NO: 4는 3'-말단에 있는 것이 바람직하다; (ii) 점차 증가되는 선호도로써, SEQ ID NO: 7과 적어도 97.5 %, 적어도 98.5 %, 적어도 99 %, 적어도 99.5 %, 적어도 99.8 % 및 100 % 동일한 뉴클레오티드 서열; 및 (iii) 점차 증가되는 선호도로써, SEQ ID NO: 6과 적어도 97.5 %, 적어도 98.5 %, 적어도 99 %, 적어도 99.5 %, 적어도 99.8 % 및 100 % 동일한 뉴클레오티드 서열. (i) 내지 (iii) 중 2 개인 경우, 두 개는 바람직하게 (i) 및 (ii)이다.

1992 년에 Messer et al.에 의하여 HLA-J는 엑손 2 또는 엑손 4에서 번역 종결을 생성하는 유해한 돌연변이에 의한 유사유전자 (pseudogene)임이 보고되었다 (J Immunol. 1992 Jun 15; 148 (12): 4043-53.). 그 이후로 HLA-J는 유사유전자라는 확고한 믿음이 당업계에서 지속되었다. 아래의 실시예에서 명백히 나타내는 바와 같이, HLA-J 뉴클레오티드 서열이 HLA-J 단백질을 암호화 한다고 안전하게 가정할 수 있는 기능적 오픈 리딩 프레임 (본원에서 "오픈 리딩 프레임 3" 또는 "ORF3"로 지칭됨)을 포함한다는 것이 놀랍게도 이제야 발견되었다. 상기 기능적 오픈 리딩 프레임의 서열은 SEQ ID NO: 2에 나타내었고 이에 의해 암호화된 HLA-J 단백질은 SEQ ID NO: 1에 제시된다. 따라서, 25 년 이상이 지난 후에 HLA-J가 유사유전자가 아니고 기능적 유전자라는 사실이 예기치 않게 밝혀졌다; 실시예 1 참조.

ORF3은 HLA-J에 고유한 16 개 뉴클레오티드의 삽입을 포함한다는 점이 추가로 주목된다. 유사한 서열을 포함하는 다른 HLA는 없다. 이러한 삽입으로 인해 HLA-J는 HLA-G의 엑손 4의 상동체 (homolog)가 결여되어 있으며, 이는 엑손이 알파 도메인 구조 2를 코딩한다. 알파 2 유사 도메인은 펩타이드 제시에 중요하다. 더욱 중요한 것은, 상기 삽입은 펩타이드 "HTFLETSQGSKTRRFL(-종결)" (SEQ ID NO: 5)를 암호화하는 ORF3의 고유한 3-말단을 초래한다는 것이다. 이 펩타이드 내의 다중 하전된 아미노산 및 방향족 아미노산으로 인해, HLA-J 단백질이 막관통 횡단 영역 (transmembrane spanning region) 또는 앵커 (anchor)를 포함한다는 사실을 안전하게 배제할 수 있다. 따라서 새롭게 확인된 HLA-J 단백질은 HLA-G와 유사한 특징을 갖는 분비 단백질이지만 알파 2 유사 도메인 (alpha 2 like domain)의 결핍 때문에 펩타이드 제시 능력이 결여된다; 실시예 1 참조.

본 발명의 제 1 측면의 바람직한 실시예에 따르면, 핵산분자는 이종 뉴클레오티드 서열에 융합되고, 바람직하게는 이종 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.

상기 이종 뉴클레오티드 서열은 본 발명의 핵산분자에 직접 또는 간접적으로 융합될 수 있다. 간접 융합의 경우, 바람직하게는 펩타이드 링커를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 GS-링커 (예: (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n, (SEQ ID NO: 54), 상기 n은 1 내지 3)이 융합에 사용된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 이종 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 서열에 융합된 자연에서 발견될 수 없는 서열이다. SEQ ID NO: 2가 인간 유래임 주목하고, 이종 뉴클레오티드 서열은 또한 인간으로부터 유래되는 것이 바람직하다.

따라서, 이종 프로모터는 SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 자연에서 발견할 수 없는 서열이다. 상기 이종 프로모터는 바람직하게 인간 유래이다.

프로모터는 특정 유전자의 전사를 개시하는 핵산 서열이며, 상기 유전자는 SEQ ID NO: 2의 HLA-J 유전자로부터 유래된 본 발명에 따른 것 또는 SEQ ID NO: 2이다. 이와 관련하여 "작동 가능하게 연결된"은 이종 프로모터가 본 발명의 핵산분자에 융합되어 프로모터를 통해 본 발명의 핵산분자의 전사가, 예를 들어 원핵 생물 또는 진핵 세포에서 시작될 수 있음을 의미할 것이다. 상기 이종 프로모터는 구성적 활성 프로모터 (constitutively active promoter), 조직-특이적 또는 발달-단계-특이적 (development-stage-specific) 프로모터, 유도성 (inducible) 프로모터 또는 합성 프로모터 일 수 있다. 구성적 프로모터 (Constitutive promoter)는 사실상 모든 조직에서 발현을 지시하며, 전적으로는 아니지만 대체로 환경 및 발달 요인과 거의 무관하다. 그들의 발현은 일반적으로 내인성 요인에 의해 조절되지 않기 때문에, 구성적 프로모터는 일반적으로 종 (species)에 걸쳐서, 계 (kingdom) 전체에 걸쳐서도 활성이다. 조직-특이적 또는 발달-단계-특이적 프로모터는 특정 조직(들) 또는 특정 발달 단계에서 유전자의 발현을 지시한다. 유도성 프로모터의 활성은 생물적 또는 비생물적 요인의 존재 또는 부재에 의해 유도된다. 유도성 프로모터는 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 필요에 따라 켜거나 끌 수 있기 때문에 유전 공학에서 매우 강력한 도구이다. 합성 프로모터는 다양한 기원으로부터 프로모터 영역의 주요 요소를 결합하여 구성된다.

유전자를 이종적으로 발현하기 위해 당업계에서 사용되는 이종 프로모터의 비-제한적인 예는 SV40, CMV, HSV, UBC, EF1A, PGK, Vlambda1, RSV 및 CAGG (포유류 시스템의 경우); COPIA 및 ACT5C (초파리 (Drosophila) 시스템의 경우) 및 GAL1, GAL10, GAL7, GAL2 (효모 시스템의 경우) 이고 또한 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.

대안적으로 또는 추가로, 이종 핵산 서열은 본 발명의 핵산 서열이 융합단백질을 생성하도록하는 암호화 서열 일 수 있다. 이러한 융합단백질은 아래에서 더 자세히 논의된다.

핵산분자가 이종 프로모터에 융합되지 않은 경우, 발현 목적을 위해 자체 프로모터에 융합된다.

제 2 측면에서, 본 발명은 제 1 측면의 핵산분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다.

본 발명에 따른 용어 "벡터"는 바람직하게는 플라스미드, 코스미드 (cosmid), 바이러스, 박테리오파지 또는 다른 벡터 (예를 들어 본 발명의 핵산분자를 운반하는 유전 공학에서 통상적으로 사용되는)를 의미한다. 본 발명의 핵산분자는, 예를 들어, 상업적으로 이용 가능한 여러 벡터에 삽입될 수 있다. 비-제한적인 예로는 pUC-시리즈, pBluescript (Stratagene), 발현 벡터의 pET 시리즈 (Novagen) 또는 pCRTOPO (Invitrogen)와 같은 원핵 플라스미드 벡터; 그리고 pREP (Invitrogen), pcDNA3 (Invitrogen), pCEP4 (Invitrogen), pMC1neo (Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2neo, pBPV-1, pdBPVMMTneo, pRSVgpt, pRSVneo, pSV2-dhfr, pIZD35, pLXIN, pSIR (Clontech), pIRES-EGFP (Clontech), pEAK-10 (Edge Biosystems) pTriEx-Hygro (Novagen) 및 pCINeo (Promega)와 같은 포유류 세포에서의 발현과 호환되는 벡터를 포함한다. 피히아 파스토리스 (Pichia pastoris)에 적합한 플라스미드 벡터의 예는 예를 들어 플라스미드 pAO815, pPIC9K 및 pPIC3.5K (모두 Invitrogen)를 포함한다.

벡터에 삽입된 핵 분자는, 예를 들어, 표준 방법으로 합성되거나 자연에서 분리될 수 있다. 암호화 서열을 전사 조절 요소 및/또는 다른 아미노산 암호화 서열에 결찰시키는 것 또한 확립된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 원핵 생물 또는 진핵 생물 세포에서의 발현을 보장하는 전사 조절 요소 (발현 카세트의 일부)는 당업자에게 잘 알려져 있다. 이들 요소는 전사의 개시를 보장하는 조절 서열 (예를 들어, 번역 개시 코돈, 자연적으로 관련되거나 이종 프로모터와 같은 프로모터 및/또는 인슐레이터; 상기 참조), 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) (Owens, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (2001), 1471-1476) 및 선택적으로 전사의 종결 및 전사물의 안정화를 보장하는 폴리-A 신호를 포함한다. 추가 조절 요소는 전사 및 번역 인핸서를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩타이드/단백질 또는 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 원핵생물 또는 진핵생물 세포에서의 발현을 허용하는 이러한 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된다. 벡터는 추가 조절 요소로서 분비 신호를 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 서열은 당업자에게 잘 알려져 있다. 또한, 사용된 발현 시스템에 따라, 발현된 폴리펩타이드를 세포 내 구획 (cellular compartment)으로 유도할 수 있는 리더 서열이 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 암호화 서열에 추가될 수 있다. 이러한 리더 서열은 당업계에 잘 알려져 있다.

또한, 상기 벡터는 선택 가능한 마커를 포함하는 것이 바람직하다. 선택 가능한 마커의 예로 네오마이신, 암피실린, 히그로마이신 및 카나마이신에 대한 내성을 암호화하는 유전자를 포함한다. 특별히-설계된 벡터는 박테리아-진균 세포 또는 박테리아-동물 세포 (예: Invitrogen에서 이용 가능한 게이트웨이 시스템)와 같은 서로 다른 숙주 사이의 DNA 이동을 허용한다. 본 발명에 따른 발현 벡터는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 코딩된 펩타이드 또는 융합 단백질의 복제 및 발현을 지시할 수 있다. 파지 벡터 또는 바이러스 벡터 (예를 들어, 아데노바이러스, 레트로바이러스)와 같은 벡터를 통한 도입과는 별개로, 본원에 기재된 바에 따른 핵산분자는 직접 도입 또는 리포좀을 통한 세포로의 도입을 위해 설계될 수 있다. 추가로, 배큘로 바이러스 시스템 또는 백시니아 바이러스 또는 셈리키 포레스트 바이러스에 기초한 시스템은 본 발명의 핵산분자에 대한 진핵 발현 시스템으로 사용될 수 있다.

본 발명의 제 3 측면은 제 2 측면의 벡터로 형질 전환, 형질 도입 또는 형질 감염된 숙주 세포에 관한 것이다.

용어 "숙주 세포"는 세포에 의한 본 발명의 단백질 또는 펩타이드 또는 융합 단백질의 생산을 위해, 임의의 방식으로 선택, 변형, 형질 전환, 성장, 또는 사용 또는 조작된 임의의 유기체의 임의의 세포를 의미한다.

본 발명의 숙주 세포는 전형적으로 본 발명의 핵산분자 또는 벡터(들)를 숙주 세포에 도입함으로써 생산되며, 이는 그/그들의 존재 시에 본 발명의 단백질 또는 펩타이드 또는 융합단백질을 암호화하는 본 발명의 핵산분자의 발현을 매개한다. 숙주 세포가 유래되거나 분리되는 숙주는 원핵 생물 또는 진핵 생물 세포 또는 유기체 일 수 있고, 바람직하게는 인간 배아의 파괴에 의해 직접적으로 유래된 인간 배아 줄기 세포를 제외할 수 있다.

본 발명의 숙주로서 유용한 적합한 원핵 생물 (박테리아)은, 예를 들어, 대장균 (예: E coli 균주 BL21, HB101, DH5a, XL1 Blue, Y1090 및 JM101), 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세센스 (Serratia marcescens), 버크홀데리아 글루메 (Burkholderia glumae), 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida), 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 스투체리 (Pseudomonas stutzeri), 스트렙토마이세스 리비던스 (Streptomyces lividans), 락토코커스 락티스 (Lactococcus lactis), 마이코박테리움 스메그마티스 (Mycobacterium smegmatis), 스트렙토마이세스 코엘리칼라 (Streptomyces coelicolor) 또는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)와 같은 클로닝 및/또는 발현에 일반적으로 사용되는 것들이다. 전술한 숙주 세포에 대한 적절한 배양 배지 및 조건은 당업계에 잘 알려져 있다.

적합한 진핵 숙주 세포는 척추동물 세포, 곤충 세포, 진균/효모 세포, 선충 세포 또는 식물 세포 일 수 있다. 진균/효모 세포는 Saccharomyces cerevisiae 세포, Pichia pastoris 세포 또는 Aspergillus 세포 일 수 있다. 본 발명의 핵산분자 또는 벡터(들)로 유전적으로 조작되는 숙주 세포의 바람직한 예는 효모, 대장균 및/또는 바실러스 속의 종 (예: B. subtilis)의 세포이다. 하나의 바람직한 구체예에서 숙주 세포는 효모 세포 (예: S. cerevisiae)이다.

다른 바람직한 구체예에서 숙주 세포는 포유동물 숙주 세포, 예컨대 CHO (Chinese Hamster Ovary) 세포, 마우스 골수종 림프종 (mouse myeloma lymphoblastoid), 인간 배아 신장 세포 (HEK-293), 인간 배아 망막 세포 (Crucell's Per.C6), 또는 인간 양수 세포 (글리코토프 (Glycotope) 및 CEVEC)이다. 상기 세포는 재조합 단백질 생산을 위해 당업계에서 자주 사용된다. CHO 세포는 인간을 위한 재조합 단백질 치료제의 산업적 생산을 위해 가장 일반적으로 사용되는 포유류 숙주 세포이다.

본 발명의 제 4 측면은 제 1 측면의 핵산분자에 의해 암호화되는 단백질 또는 펩타이드에 관한 것이다.

용어 "단백질" 및 "펩타이드" 및 이의 바람직한 실시예는 본 발명의 제 1 측면과 관련하여 상기에서 정의되었다. 이들 정의 및 바람직한 실시예는, 필요한 부분만 수정되어 (mutatis mutandis), 본 발명의 제 4 측면에 준용된다. 제 4 측면에 따를 펩타이드는 바람직하게는 SEQ ID NO: 1의 부분 서열 (subsequence)과 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 90 %, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 95 % 동일하다. 가장 바람직하게, 상기 펩타이드는 SEQ ID NO: 5를 포함하거나 이로 구성된다.

본 발명의 단백질 또는 펩타이드는 당업계에 잘 알려진 분자 클로닝 기술에 의해 제조될 수 있다. 재조합 발현은 예를 들어, 본원의 상기에서 기재된 벡터 및 숙주 세포를 사용하여 달성될 수 있다.

암 환자의 혈액 및 조직 시료에서 본 발명의 단백질 또는 펩타이드의 검출이 실시예 4에 개시되어 있다.

바람직한 실시예에 따르면, 본 발명의 단백질 또는 펩타이드는 융합 단백질이다.

본 발명에 따른 "융합 단백질"은 적어도 하나의 추가적 이종 아미노산 서열을 포함한다. 종종, 반드시 그런 것은 아니지만, 이러한 추가 서열은 (폴리)펩타이드의 N- 또는 C-말단에 위치 할 것이다. 예를 들어, 추가 아미노산 잔기가, 예를 들어, 본 발명의 융합 단백질을 특이적으로 트리밍하고 (폴리)펩타이드를 방출할 수 있는 프로테이나제 (proteinase)에 의하여 제거될 수 있는 융합 단백질로서 폴리펩타이드를 초기에 발현하는 것이 편리할 것이다. 상기 아미노산 서열 화합물은 본 발명의 핵산분자에 직접 또는 간접적으로 융합될 수 있다. 간접 융합의 경우, 일반적으로 펩타이드 링커, 예를 들어 GS-링커 (예: Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n (SEQ ID NO: 54), 여기서 n은 1 내지 3), 가 융합에 사용될 수 있다.

상기 융합 단백질의 적어도 하나의 추가 이종 아미노산 서열은 변형/향상된 안정성, 변형/향상된 용해도 및/또는 하나 이상의 특정 세포 유형을 표적화하는 능력과 같은 원하는 특성을 부여하는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 항체를 갖는 융합 단백질. 상기 용어 항체는 아래에서 추가로 정의되며, 특히 항체 단편 및 유도체를 포함한다. 상기 항체는, 예를 들어, 세포 표면 마커에 특이적일 수 있거나 상기 항체의 항원-인식 단편 일 수 있다. 본 발명의 단백질 또는 펩타이드는 항체의 경쇄 및/또는 중쇄(들)의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다. 본 발명의 단백질 또는 펩타이드는 바람직하게는 항체의 경쇄 및/또는 중쇄(들)의 N-말단에 융합되어, 항체의 Fc 부분이 Fc 수용체에 자유롭게 결합할 수 있도록한다.

융합 단백질은 또한 신호 전달에서 기능하는 것으로 알려진 및/또는 단백질-단백질 상호작용에 관여하는 것으로 알려진 단백질 도메인을 포함할 수 있다. 이러한 도메인의 예는 안키린 (Ankyrin) 반복이다; arm, Bcl-homology, Bromo, CARD, CH, Chr, C1, C2, DD, DED, DH, EFh, ENTH, F-box, FHA, FYVE, GEL, GYF, hect, LIM, MH2, PDZ, PB1, PH, PTB, PX, RGS, RING, SAM, SC, SH2, SH3, SOCS, START, TIR, TPR, TRAF, tsnare, Tubby, UBA, VHS, W, WW, 및 14-3-3 도메인. 이들 및 기타 단백질 도메인에 대한 추가 정보는 데이터베이스 InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/, Mulder et al., 2003, Nucl. Acids. Res. 31: 315-318), Pfam (http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/, Bateman et al., 2002, Nucleic Acids Research 30(1): 276-280) 및 SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/, Letunic et al., 2002, Nucleic Acids Res. 30(1), 242-244)로부터 얻을 수 있다.

본 발명에 따른 융합 단백질의 상기 적어도 하나의 추가 이종 아미노산 서열은 (a) 사이토카인, (b) 케모카인, (c) 응고 촉진 인자 (pro-coagulant), (d) 단백성 독성 화합물 및/또는 (e) 전구-약물 (pro-drug) 활성화를 위한 효소를 포함하거나 이로 구성될 수 있다.

상기 사이토카인은 IL-2, IL-12, TNF-알파, IFN 알파, IFN 베타, IFN 감마, IL-10, IL-15, IL-24, GM-CSF, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-13, LIF, CD80, B70, TNF 베타, LT-베타, CD-40 리간드, Fas-리간드, TGF-베타, IL-1 알파 및 IL-1 베타로 이루어진 군에서 선탁되는 것이 바람직하다. 당업계에 잘 알려진 바와 같이, 사이토카인은 면역계의 전-염증 (pro-inflammatory) 또는 항-염증 반응을 선호할 수 있다. 따라서 치료될 질병에 따라 전-염증 또는 항 염증 사이토카인을 갖는 융합 단백질이 선호될 수 있다. 예를 들어, 염증성 질환의 치료를 위해서는 항-염증성 사이토카인을 포함하는 일반적인 융합 구조물이 바람직한 반면, 암의 치료를 위해서는 전-염증성 사이토카인을 포함하는 일반적인 융합 구조물이 선호된다.

상기 케모카인은 바람직하게는 IL-8, GRO 알파, GRO 베타, GRO 감마, ENA-78, LDGF-PBP, GCP-2, PF4, Mig, IP-10, SDF-1 알파/베타, BUNZO/STRC33, I-TAC, BLC/BCA-1, MIP-1 알파, MIP-1 베타, MDC, TECK, TARC, RANTES, HCC-1, HCC-4, DC-CK1, MIP-3 알파, MIP-3 베타, MCP-1-5, 에오탁신 (eotaxin), 에오탁신-2 (Eotaxin-2), I-309, MPIF-1, 6Ckine, CTACK, MEC, 림포탁틴 (lymphotactin) 및 프렉탈카인 (fractalkine)으로 구성된 군에서 선택된다. 케모카인의 주요 역할은 세포 이동을 안내하는 화학유인 물질 (chemoattractant) 역할을 하는 것이다. 케모카인에 유인되는 세포는 케모카인의 공급원을 향해 케모카인 농도가 증가하는 신호를 따른다. 그것은 융합 단백질 내에서 케모카인 (chemokin)은, 예를 들어, 특정 세포 유형 또는 신체 부위로, 본 발명의 단백질 또는 펩타이드의 이동을 안내하는데 사용될 수 있다는 것이다.

상기 응고 촉진 인자는 바람직하게는 조직 인자이다. 응고 촉진 인자는 혈액이 액체에서 젤로 바뀌는 과정을 촉진하고 혈전을 형성한다. 예를 들어, 응고 촉진 인자는 상처 치유에 도움이될 수 있다.

상기 단백성 독성 화합물 (proteinaceous toxic compound)은 바람직하게는 리신-A 사슬, 모데신 (modeccin), 절단된 슈도모나스 외독소 A (truncated Pseudomonas exotoxin A), 디프테리아 독소 및 재조합 젤로닌 (gelonin)이다. 독성 화합물은 특정 세포 유형과 같은 유기체의 하위 구조뿐만 아니라 유기체 전체에 독성 영향을 미칠 수 있다. 독성 화합물은 종양 치료에 자주 사용된다. 종양 세포는 일반적으로 정상 체 세포보다 빠르게 성장하므로 독성 화합물을 우선적으로 더 많이 축적한다.

상기 전구-약물 활성화를 위한 효소는 바람직하게는 카르복시-펩티다제 (carboxy-peptidase), 글루쿠로니다제 (glucuronidase) 및 글루코시다제 (glucosidase)로 이루어진 군에서 선택되는 효소이다. 종양 치료를 위해 평가된 다양한 유전자 중에서, 전구-약물 활성화 효소를 코딩하는 유전자는 진행중인 임상적 화학치료 요법을 직접적으로 보완하기 때문에 특히 매력적이다. 이러한 효소는 박테리아와 효모 효소를 모두 사용하여 내재 독성이 낮은 전구약물을 활성화하거나 포유류 효소로 전구약물 활성화를 향상시킬 수 있다.

바람직한 실시예에 따르면, 단백질 또는 펩타이드는 이종 비-단백성 화합물에 융합된다.

본원에서 사용된 이종 화합물은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열에 융합된 자연에서 찾을 수 없는 화합물이다.

상기 이종 비-단백성 화합물은 본 발명의 핵산분자에 직접 또는 간접적으로 융합될 수 있다. 예를 들어, 화학적 링커가 사용될 수 있다. 화학적 링커는 1 차 아민, 설프히드릴 (sulfhydryl), 산, 알코올 및 브롬화물 (bromide)과 같은 다양한 작용기를 포함할 수 있다. 많은 가교제는 아민과 반응하는 말레이미드 (설프하이드랄 반응성; sulfhydral reactive) 및 숙신이미딜에스테르 (NHS) 또는 이소티오시아네이트 (ITC) 그룹으로 기능화된다.

상기 이종 비-단백성 화합물은 바람직하게는 약학적 활성 화합물 또는 진단적 활성 화합물이다. 약학적 활성 화합물 또는 진단적 활성 화합물은 바람직하게는 (a) 형광 염료, (b) 감광제, (c) 방사성 핵종, (d) 의료 영상용 조영제, (e) 독성 화합물, 또는 (f) ACE 저해제, 레닌 저해제, ADH 저해제, 알도스테론 저해제, 안지오텐신 수용체 차단제, TSH-수용체, LH-/HCG 수용체, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 안드로겐 수용체, GnRH-수용체, GH (성장 호르몬) 수용체 또는 IGF-I 또는 IGF-II에 대한 수용체로 이루어진 군에서 선택된다.

상기 형광 염료는 바람직하게는 Alexa Fluor 또는 Cy 염료로부터 선택되는 성분이다.

상기 감광제는 바람직하게는 광독성 적색 형광 단백질 킬러레드 (KillerRed) 또는 헤마토포르피린 (haematoporphyrin)이다.

상기 방사성 핵종은 바람직하게는 감마-방출 동위원소 군, 더욱 바람직하게는 ^99mTc, ¹²³I, ¹¹¹In 으로부터, 및/또는 양전자 방출체 (positron emitter) 군, 더욱 바람직하게는 ¹⁸F, ⁶⁴Cu, ⁶⁸Ga, ⁸⁶Y, ¹²⁴I 으로부터, 및/또는 베타-방출체 (beta-emitter) 군, 더욱 바람직하게는 ¹³¹I, ⁹⁰Y, ¹⁷⁷Lu, ⁶⁷Cu, ⁹⁰Sr 으로부터 선택되거나, 알파-방출체 (alpha-emitter) 군, 바람직하게는 ²¹³Bi, ²¹¹At로부터 선택된다.

본 명세서에서 사용되는 조영제는 의료 영상에서 체내 구조 또는 체액의 대비를 향상시키는 데 사용되는 물질이다. 일반적인 조영제는 X-선 감쇠 및 자기 공명 신호 향상을 기반으로 작동한다.

상기 독성 화합물은 바람직하게는 작은 유기 화합물, 보다 바람직하게는 칼리키아마이신 (calicheamicin), 메이탄시노이드 (maytansinoid), 네오카르지노스타틴 (neocarzinostatin), 에스페라마이신 (esperamicin), 다네마이신 (dynemicin), 케다르시딘 (kedarcidin), 마두로펩틴 (maduropeptin), 독소루비신 (doxorubicin), 다우노루비신 (daunorubicin), 및 아우리스타틴 (auristatin)으로 이루어진 군에서 선택된 독성 화합물이다. 본원에서 전술된 단백성 독성 화합물과 대조적으로 이러한 독성 화합물은 비-단백성이다.

제 5 측면에서, 본 발명은 제 1 측면의 핵산분자 및/또는 결합분자의 저해제에 관한 것이고, 바람직하게는 제 4 측면의 단백질의 저해제에 관한 것으로, 여기서 (i) 상기 본 발명 제 1 측면의 핵산분자의 저해제는 바람직하게는 소분자 (small molecule), 압타머, siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임, 안티센스 핵산분자, CRISPR-Cas9-기반 구조체, CRISPR-Cpf1-기반 구조체, 메가뉴클레아제, 징크핑거 뉴클레아제, 및 전사 활성화제-유사 (TAL) 이펙터 (transcription activator-like effector; TALE) 뉴클레아제로부터 선택되고, 및/또는 (ii) 결합분자, 바람직하게는 본 발명의 제 4 측면의 단백질의 저해제는 바람직하게는 소분자 (small molecule), 항체 또는 항체 유사체 (antibody mimetic), 압타머로부터 선택되고, 상기 항체 유사체는 바람직하게 애피바디 (affibody), 애드넥틴(adnectin), 안티칼린 (anticalin), 다핀(DARPin), 아비머 (avimer), 나노피틴 (nanofitin), 아피린 (affilin), 쿠니츠 도메인 펩타이드 (Kunitz domain peptides) 피노머스 (Fynomers®), 삼중 특이적 결합분자 (trispecific binding molecule) 및 프로바디 (probody)로부터 선택된다.

제 4 측면의 단백질의 결합분자는 제 4 측면의 단백질에 결합할 수 있는 화합물이다. 상기 결합분자는 바람직하게는 제 4 측면의 단백질에 특이적으로 결합한다. 특이적 결합은 결합분자가 본질적으로 제 4 측면의 단백질 이외의 단백질 또는 펩타이드에 결합하지 않거나 본질적으로 결합하지 않음을 나타낸다. 특히, 상기 결합 분자는 HLA-J 이외의 다른 HLA 단백질에 결합할 수 없는 것이 바람직하다. 결합 분자는 바람직하게는 HLA-J의 C-말단 부분, 즉, Messer at al., J Immunol. 1992 Jun 15; 148 (12): 4043-53에 보고된 바와 같이, 잘못 추정된 종결부의 C-말단 (C-terminally)에 결합한다. 잘못 추정된 종결부의 정확한 위치는 도 1에 보여지면, 실시예 1에서 추가로 논의된다. 제 4 측면의 단백질의 결합분자는, 예를 들어, 연구 목적에 적합하다. 예를 들어, 제 4 측면의 단백질에 결합하는 항체는 ELISA 또는 웨스턴 블롯 (Western Blot)과 같은 면역 분석에 사용될 수 있다. 이는 실시예 4에서 예시된다. 면역 분석은 시료 (예: 용액)에서 제 4 측면의 단백질의 존재 또는 농도를 측정할 수 있는 생화학 시험이다. 제 4 측면의 단백질의 결합분자는 바람직하게는 제 4 측면의 단백질을 저해할 수 있다. 이 경우 상기 결합분자는 저해제를 의미한다.

본 발명의 핵산분자 및/또는 단백질의 발현을 억제하는 화합물은 본 발명에 따라 (i) 본 발명의 핵산분자 및/또는 단백질을 암호화하는 유전자의 전사를 저하하거나 막는 화합물이거나, 또는 (ii) 본 발명의 단백질을 암호화하는 mRNA의 전사를 저하하거나 막는 화합물이다. (i)의 화합물은 전사 시스템 (transcriptional machinery) 및/또는 상기 유전자의 프로모터와의 상호 작용 및/또는 인핸서와 같은 프로모터로부터 멀리 떨어진 발현 조절 요소와의 상호 작용에 간섭하는 화합물을 포함한다. (ii)의 화합물은 번역 시스템 (translational machinery)에 간섭하는 화합물을 포함한다. 본 발명의 핵산분자 및/또는 단백질의 발현을 억제하는 화합물은, 예를 들어, 발현을 제어하는 프로모터 영역에 특이적으로 간섭하여, 본 발명의 핵산분자 및/또는 단백질의 발현을 특이적으로 저해한다. 바람직하게는, 본 발명의 핵산분자 및/또는 단백질의 전사 또는 본 발명의 단백질의 번역은 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 75 %, 예컨대 적어도 90 % 또는 적어도 95 % 감소되고, 보다 더 바람직하게는 적어도 98 %, 그리고 가장 바람직하게는 약 100 % 감소된다 (예를 들어, 상기 화합물의 부재 하에서 동일한 실험 설정과 비교하여).

본 발명에 따른 본 발명의 핵산분자 및/또는 단백질의 활성을 저해하는 화합물은 상기 핵산분자 및/또는 단백질이 감소된 효율로 그 기능을 수행하게 한다. 본 발명의 핵산분자 및/또는 단백질의 활성을 저해하는 상기 화합물은 상기 핵산분자 및/또는 단백질의 활성을 특이적으로 억제한다. 아래에서 더 상세히 설명되는 바와 같이, 본 발명의 핵산분자 및/또는 단백질의 활성을 저해하는 화합물은, 상기 핵산분자 및/또는 단백질 자체와 상호 작용하거나 상기 핵산분자를 생산 및/또는 상기 단백질을 생산 및/또는 상기 단백질에 결합하는 세포를 특이적으로 억제 (바람직하게는 사멸)하여 상기 핵산분자 및/또는 단백질의 활성을 특이적으로 억제할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 핵산분자 및/또는 단백질의 활성은 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 75 %, 예컨대 적어도 90 % 또는 적어도 95 % 감소되고, 보다 더 바람직하게는 적어도 98 %, 그리고 가장 바람직하게는 약 100 % 감소된다 (예를 들어, 상기 화합물의 부재 하에서 동일한 실험 설정과 비교하여).

본 발명의 핵산분자 및/또는 단백질의 활성은 본 발명에 따르면 바람직하게는 암환자에서 화학요법에 대한 내성을 유도하고/하거나 암 환자의 무진행 생존 기간 (progression free)과 전체 생존 기간 (overall survival)을 감소시키는 것이 그것/그것들의 능력이다 (첨부된 실시예 참조). 본 명세서에서 언급되는 상기 화학요법은 보조화학요법 (adjuvant chemotherapy)이거나 보조화학요법 (neoadjuvant chemotherapy) 일 수 있고, 바람직하게는 보조화학요법이다. 화학요법은 약물을 사용하여 암세포를 파괴하거나 성장을 멈추게 하거나, 증상을 완화시킨다. 신보조 화학요법 (또한, 수술 전 또는 일차라고도 지칭됨)에서, 약물 치료는 종양을 외과적으로 적출하기 전에 이루어진다. 이것은 수술 후 약물 치료를 하는 보조화학요법과는 대조적이다. 이러한 활성을 결정하기 위한 수단 및 방법은 당업계에 확립되어 있으며 아래의 실시예에서 설명된다. 따라서, 본 발명의 의학적 측면에 따르면, 본 발명의 핵산분자 및/또는 단백질의 이러한 활성은 억제된다.

저해제의 억제 효율은 저해제 존재 시의 활성 수준과 저해제 부재 시의 활성 수준을 비교하는 방법으로 정량화될 수 있다. 예를 들어, 형성된 본 발명의 핵산분자 및/또는 단백질의 양의 변화는 측정에 사용될 수 있다. 여러 저해제의 효율은 대량신속처리 (high-throughput) 체재에서 동시에 결정될 수 있다. 대량신속처리 분석은, 생화학, 세포 또는 기타 분석과는 별도로, 통상적으로 미세 역가 플레이트 (microtiter plate)의 웰에서 수행될 수 있으며, 여기서 각 플레이트는 96, 384 또는 1536 웰을 포함할 수 있다. 플레이트를 다루는 것, 주변 온도 (ambient temperature) 이외의 온도에서의 배양을 포함하는 것, 및 시험 화합물을 분석 혼합물과 접촉시키는 것은 바람직하게는, 피펫팅 장치를 포함하는 하나 이상의 컴퓨터-제어 로봇 시스템에 의해 영향을 받는다. 시험 화합물의 큰 라이브러리가 스크리닝되고/거나 스크리닝이 단시간 내에 수행되어야하는 경우, 시험 화합물의 혼합물, 예를 들어 10, 20, 30, 40, 50 또는 100 개의 시험 화합물, 이 각 웰에 첨가될 수 있다. 예상된 활성을 나타내는 웰의 경우, 상기 혼합물에서 상기 활성을 유발하는 하나 이상의 시험 화합물을 확인하기 위해 상기 시험 화합물의 혼합물이 분석 (de-convoluted)될 수 있다.

본 발명의 핵산분자 및/또는 단백질의 발혐 및/또는 활성을 저해하는 화합물은 리포좀 또는 엑소좀과 같은 소포 (vesicle)로 제형화될 수 있다. 리포좀은 약물 전달의 관점에서 리포좀이 제공하는 특이성과 작용 기간 때문에 큰 관심을 끌었다. 리포좀형 세포-유형 전달 시스템은 생체 내에서 siRNA와 같은 핵산을 세포로 효과적으로 전달하는데 사용되었다 (Zimmermann et al. (2006) Nature, 441:111-114). 리포좀은 친유성 물질과 수성 내부로 형성된 막을 갖는 단층 또는 다층 소포이다. 수성 부분은 전달될 조성물을 포함한다. 양이온성 리포좀은 세포벽에 융합할 수 있다는 장점을 갖는다. 비-양이온성 리포솜은, 세포벽에 효율적으로 융합할 수 없지만, 생체 내에서 대식세포 및 기타 세포에 의해 식균된다. 엑소좀은 RNA를 포함한 다양한 분자를 운반할 수 있는 지질 패키지이다 (Alexander et al. (2015), Nat Commun; 6:7321). 그 안에 포함된 분자를 포함하는 엑소좀은 수용세포에 의해 흡수될 수 있다. 따라서, 엑소좀은 세포 간 통신의 중요한 매대상체이자 세포 간 틈새 (cellular niche)의 조절자이다. 엑소좀은, 예를 들어 조영제 또는 약물을 위한 전달 수단으로 사용할 수 있기 때문에, 진단 및 치료 목적에 유용하다.

본 발명의 핵산분자 및/또는 단백질의 발현 및/또는 활성을 저해하는 화합물은 적절한 용량 및/또는 치료적 유효량으로 대상체에게 투여될 수 있다. 이는 본 발명의 약학적 조성물과 관련하여 아래에서 추가로 논의 될 것이다.

변화를 관찰하는데 필요한 치료 기간 및 치료 후 응답이 발생하는 간격은 원하는 효과에 따라 달라진다. 특정 양은 당업자에게 잘 알려진 통상적인 시험에 의해 결정될 수 있다. 적절한 시험은, 예를 들어, Tamhane and Logan (2002), "약물의 최소 유효량 및 최대 안전 용량을 확인하기 위한 다중 테스트 절차", Journal of the American statistics Association, 97 (457):1-9에 기술되어 있다.

본 발명의 핵산분자 및/또는 단백질의 발현 및/또는 활성을 저해하는 화합물은 바람직하게는 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 혼합되어 약학적 조성물을 형성한다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제뿐만 아니라 약학적 조성물의 제형은 본 발명의 약학적 조성물과 관련하여 아래에서 논의 될 것이다.

본원에서 사용되는 "소분자"는 바람직하게는 유기 분자이다. 유기 분자는 탄소 기반, 탄소-탄소 결합에 의해 서로 연결된 탄소 원자를 갖는 화학적 화합물의 부류에 속하거나 관련된다. 용어 유기의 원래 정의는 화학 화합물의 공급원과 관련되며, 무기 화합물은 광물 공급원에서 얻은 것인 반면에, 유기 화합물은 식물 또는 동물 또는 미생물 공급원에서 얻은 탄소-함유 화합물이다. 유기 화합물은 천연 또는 합성 일 수 있다. 유기 분자는 바람직하게는 방향족 분자이고 더욱 바람직하게는 헤테로 방향족 분자이다. 유기 화학에서, 상기 용어 방향족이란 동일한 원자 세트를 가진 다른 기하학적 또는 결합 배열보다 더 높은 안정성을 나타내는 공명 결합 고리를 갖는 사이클릭(고리-모양의), 평면 (평평) 분자를 설명하는데 사용된다. 방향족 분자는 매우 안정적이며, 쉽게 분해되어 다른 물질과 반응하지 않는다. 헤테로 방향족 분자에서, 방향족 고리의 원자 중 적어도 하나는 탄소 이외의 원자, 예를 들어 N, S, 또는 O이다. 전술한 모든 유기 분자에 대해 분자량은 바람직하게는 200 Da 내지 1500 Da 범위이고, 더욱 바람직하게는 300 Da 내지 1000 Da 범위이다.

또한, 본 발명에 따른 "소분자"는 무기 화합물 일 수 있다. 무기 화합물은 광물 공급원으로부터 유래되며 탄소 원자가 없는 모든 화합물 (이산화탄소, 일산화탄소 및 탄산염 제외)을 포함한다. 바람직하게는, 소분자는 약 2000 Da 미만, 또는 약 1000 Da 미만, 예컨대 약 500 Da 미만, 그리고 더욱더 바람직하게는 약 Da 원자질량단위 (Da amu) 미만의 분자량을 갖는다. 소분자의 크기는 당업계에 잘 알려진 방법, 예를 들어 질량 분석법에 의해 결정될 수 있다. 소분자는, 예를 들어, 표적 분자의 결정 구조를 기반으로 설계될 수 있으며, 여기서 생물학적 활성을 담당 할 것으로 추정되는 부위는 생체 내 대량 처리량 스크리닝 (HTS) 분석과 같은 생체 내 분석을 통해 확인 및 검증될 수 있다.

본 발명에 따라 사용되는 용어 "항체"는, 예를 들어, 다클론 또는 단클론 항체를 포함한다. 또한, 표적, 예를 들어 SEQ ID NO: 1의 HLA-J 단백질에 대한 결합 특이성을 여전히 유지하는 이들의 유도체 또는 단편은 상기 용어 "항체"에 포함된다. 항체 단편 또는 유도체는, 특히, Fab 또는 Fab' 단편, Fd, F(ab')2, Fv 또는 scFv 단편, 단일 도메인 VH 또는 V-유사 도메인, 예컨대 VhH 또는 V-NAR- 도메인인 뿐 아니라 미니바디, 디아바디, 트리바디 또는 트리플바디, 테트라 바디 또는 화학적으로 접합된 Fab'-멀티머를 포함한다 (예를 들어, Harlow 및 Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 198; Harlow 및 Lane "Using Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999; Altshuler EP, Serebryanaya DV, Katrukha AG. 2010, Biochemistry (Mosc)., vol. 75(13), 1584; Holliger P, Hudson PJ. 2005, Nat Biotechnol., vol.23(9), 1126 참조). 특히 다량체 형태는 2 개의 상이한 유형의 항원에 동시에 결합할 수 있는 이중 특이적 항체를 포함한다. 제 1 항원은 본 발명의 단백질에서 찾을 수 있다. 제 2 항원은, 예를 들어, 암 세포 또는 특정 유형의 암 세포에서 특이적으로 발현되는 종양 마커 일 수 있다. 이중 특이적 항체 형패의 비-제한적 예는 Biclonic (이중 특이적, 전장 인간 IgG 항체), DART (Dual-affinity Re-targeting 항체) 및 BiTE (다른 항체의 두 개의 단일-사슬 가변 단편 (scFv)으로 구성됨) 분자이다 (Kontermann 및 Brinkmann (2015), Drug Discovery Today, 20(7): 838-847).

상기 용어 "항체"는 또한 키메라 (인간 불변 도메인, 비-인간 가변 도메인), 단일 사슬 및 인간화 항체 (비-인간 CDR을 제외한 인간 항체)와 같은 구체예를 포함한다.

항체 생산을 위한 다양한 기술은 당업계, 예를 들어, Harlow and Lane (1988) 및 (1999) 및 Altshuler et al., 2010, loc. cit.에 잘 알려져 있다. 따라서, 다클론 항체는 첨가제 및 아쥬반트와 혼합된 항원으로 면역화 한 후 동물의 혈액에서 얻을 수 있으며, 단클론 항체는 연속 세포주 배양에 의해 생산된 항체를 제공하는 모든 기술에 의해 생산될 수 있다. 이러한 기술에 대한 예가 Harlow E 및 Lane D, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Harlow E 및 Lane D, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999 에 설명되고; K

hler 및 Milstein (1975)에 의해 처음 기술된 하이브리도마 (hybridoma) 기술, 트리오마 (trioma) 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술 (예: Kozbor D, 1983, Immunology Today, vol.4, 7; Li J, et al. 2006, PNAS, vol. 103(10), 3557 참조) 및 인간 단클론 항체 EBV-하이브리도마 기술 (Cole et al., 1985, Alan R. Liss, Inc, 77-96)을 포함한다. 또한, 재조합 항체는 단클론 항체로부터 얻거나 파지, 리보솜 (ribosomal), mRNA 또는 세포 제시 (cell display)와 같은 다양한 제시 방법을 사용하여 신규하게 (de novo) 제조될 수 있다. 재조합 (인간화) 항체의 발현에 적합한 시스템은, 예를 들어, 박테리아, 효모, 곤충, 포유류 세포주 또는 유전자 이식 동물 또는 식물로부터 선택될 수 있다 (예: 미국 특허 6,080,560; Holliger P, Hudson PJ. 2005, Nat Biotechnol., 23(9), 11265 참조). 또한, 단일 사슬 항체의 생산에 대해 기술된 기술 (특히, 미국 특허 4,946,778 참조)은 HLA-J의 에피토프에 특이적인 단일 사슬 항체를 생산하도록 개조될 수 있다. BIAcore 시스템에 사용된 표면 플라즈몬 공명은 파지 항체의 효율을 높이기 위해 사용될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "항체 유사체 (antibody mimetic)"는 항체와 같이 항원, 예를 들어 본원의 경우 SEQ ID NO: 1의 HLA-J 단백질, 에 특이적으로 결합할 수 있는 화합물을 의미하나, 항체와 구조적 관련은 없다. 항체 유사체는 일반적으로 몰질량이 약 3 내지 20kDa 인 인공 펩타이드 또는 단백질이다. 예를 들어, 항체 유사체는 애피바디 (affibody), 애드넥틴 (adnectin), 안티칼린 (anticalin), 다핀 (DARPin), 아비머 (avimer), 나노피틴 (nanofitin), 아피린 (affilin), 쿠니츠 도메인 펩타이드 (Kunitz domain peptides) 피노머스 (Fynomers®), 삼중 특이적 결합 분자 (trispecific binding molecule) 및 프로바디 (probody)로부터 선택될 수 있다. 이들 폴리펩타이드는 당업계에 잘 알려져 있으며, 이하에서 더욱 상세하게 설명된다.

본원에서 사용된 용어 "애피바디 (affibody)"는 포도상구균 (staphylococcal) 단백질 A의 Z-도메인으로부터 유래된 항체 유사체 패밀리를 지칭한다. 구조적으로, 애피바디 분자는 삼중-나선 (three-helix) 다발 도메인을 기반으로하며, 이는 또한 융합 단백질에 통합될 수 있다. 애피바디는 그 자체로 약 6kDa의 분자량을 가지며 고온과 산성 또는 알칼리성 조건에서 안정적이다. 표적 특이성은 모 단백질 도메인의 결합 활성에 관여하는 두 개의 알파-나선에 위치한 13 개 아미노산의 무작위화에 의해 획득된다 (Feldwisch J, Tolmachev V.;(2012) Methods Mol Biol. 899: 103-26).

본원에서 사용된 용어 "애드넥틴 (adnectin)"("단일체 (monobody)"라고도 함)은 인간 피브로넥틴 III (10Fn3)의 10 번째 세포 외 도메인을 기반으로하는 분자에 관한 것으로, 이는 2 내지 3 개의 노출된 루프를 갖는 94 개의 잔기의 Ig-유사 β-샌드위치 폴드를 채택하지만, 중앙 이황화 다리가 없다 (Gebauer and Skerra (2009) Curr Opinion in Chemical Biology 13: 245-255). 원하는 표적, 즉 HLA-J에 대한 특이성을 갖는 애드넥틴은 단백질의 특정 루프에 변형을 도입함으로써 유 전적으로 조작될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "안티칼린 (anticalin)"은 리포칼린 유래의 조작된 단백질을 지칭한다 (Beste G, Schmidt FS, Stibora T, Skerra A. (1999) Proc Natl Acad Sci US A. 96 (5): 1898-903; Gebauer and Skerra (2009) Curr Opinion in Chemical Biology 13: 245-255). 안티칼린은 리포칼린 중에서 고도로 보존된 코어 단위를 형성하고 개방 말단에서 4 개의 구조적으로 가변적인 루프를 통해 리간드에 대한 결합 부위를 자연적으로 형성하는 8 가닥의 β-배럴을 갖는다. 안티칼린은, IgG 수퍼패밀리와 동종 (homologous)은 아니지만, 지금까지 항체의 결합 부위에 대해 전형적인 것으로 간주된 특징을 보여준다: (i) 서열 변이의 결과로 높은 구조적 유연성 (flexibility) 및 (ii) 상이한 모양을 갖는 표적에 대해 유도된 맞춤을 허용하는 상승된 형태적 유연성 (conformational flexibility).

본원에서 사용된 용어 "다핀 (DARPin)"은 일반적으로 3 개의 반복된 β-turn에서 발생하는 단단한 인터페이스를 제공하는 설계된 안키린 (ankyrin) 반복 도메인 (166 개 잔기)을 의미한다. 다핀 (DARPin)은 일반적으로 인공적인 공통염기 서열 (consensus sequence)에 해당하는 3 개의 반복을 가지며, 여기서 반복 당 6 개의 위치가 무작위로 지정된다. 결과적으로 DARPin은 구조적 유연성이 부족하다 (Gebauer and Skerra, 2009).

본원에서 사용되는 용어 "아비머 (avimer)"는 각각 30 내지 35 개 아미노산의 2 개 이상의 펩타이드 서열로 구성되는 항체 유사체 부류를 지칭하며, 이는 다양한 막 수용체의 A-도메인으로부터 유래되고 링커 펩타이드로 연결된다. 표적 분자의 결합은 A-도메인을 통해서 발생하고 원하는 결합 특이성을 갖는 도메인 (즉, HLA-J)은, 예를 들어, 파지 디스플레이 기술에 의해 선택될 수 있다. 아비머에 포함된 다른 A-도메인의 결합 특이성은 동일할 수 있지만 반드시 동일 할 필요는 없다 (Weidle UH, et al.,(2013), Cancer Genomics Proteomics; 10(4):155-68).

"나노피틴 (nanofitin)"(아피틴으로도 알려짐)은 술포로부스 아시도칼다리우스 (Sulfolobus acidocaldarius)의 DNA 결합 단백질 Sac7d로부터 유래된 항체 모방 단백질이다. 나노피틴은 일반적으로 약 7 kDa의 분자량을 가지며, 결합 표면 상의 아미노산의 무작위화 (randomising)에 의하여 표적 분자, 예를 들어 HLA-J, 에 특이적으로 결합하도록 설계된다 (Mouratou B, Behar G, Paillard-Laurance L, Colinet S, Pecorari F.,(2012) Methods Mol Biol.; 805:315-31).

본원에서 사용된 용어 "아필린 (affilin)"은 감마-B 결정형 또는 유비퀴틴을 스캐폴드로 사용하고 이러한 단백질의 표면에 있는 아미노산을 무작위 돌연변이 유발에 의해 변형함으로써 개발된 항체 유사체를 의미하다. 원하는 표적 특이성 (즉, HLA-J에 대한)을 갖는 아필린의 선택은, 예를 들어, 파지 디스플레이 또는 리보좀 디스플레이 기술에 의해 수행된다. 스캐폴드에 따라 아필린의 분자량은 약 10 또는 20 kDa이다. 본원에서 사용된 용어 아필린은 또한 이합체 또는 다합체화된 형태의 아필린도 의미한다 (Weidle UH, et al.,(2013), Cancer Genomics Proteomics; 10(4):155-68).

"쿠니츠 도메인 펩타이드 (Kunitz domain peptide)"는 소 췌장 트립신 저해제 (BPTI), 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) 또는 조직 인자 경로 저해제 (TFPI)와 같은 쿠니츠-형 프로테아제 저해제의 쿠니츠 도메인으로부터 유래된다. 쿠니츠 도메인은 대략 6 kDA의 분자량을 가지며 원하는 표적, 즉 HLA-J에 대한, 특이성을 갖는 도메인은 파지 디스플레이와 같은 디스플레이 기술에 의해 선택될 수 있다 (Weidle et al., (2013), Cancer Genomics Proteomics; 10 (4 ): 155-68).

본원에서 사용된 용어 "피노머스 (Fynomer®)"는 인간 Fyn SH3 도메인으로부터 유래 된 비-면역글로불린-유래 결합 폴리펩타이드를 지칭한다. Fyn SH3-유래 폴리펩타이드는 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어, Grabulovski et al. (2007) JBC, 282, p. 3196-3204, WO 2008/022759, Bertschinger et al (2007) Protein Eng Des Sel 20(2):57-68, Gebauer and Skerra (2009) Curr Opinion in Chemical Biology 13:245-255, 또는 Schlatter et al. (2012), MAbs 4:4, 1-12)에 설명되어있다.

본원에서 사용된 용어 "삼중 특이적 결합 분자 (trispecific binding molecule)"는 3 개의 결합 도메인을 가지며, 따라서 3 개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있고, 바람직하게는 특이적으로 결합할 수 있는 폴리펩타이드 분자를 지칭한다. 이들 3 개의 에피토프 중 적어도 하나는 본 발명의 제 4 측면의 단백질의 에피토프이다. 2 개의 다른 에피토프는 또한 본 발명의 제 4 측면의 단백질의 에피토프 일 수 있거나 1 개 또는 2 개의 상이한 항원의 에피토프 일 수 있다. 삼중 특이적 결합 분자는 바람직하게는 TriTac이다. TriTac은 연장된 혈청 반감기를 갖고 단일 클론 항체 크기의 약 1/3을 갖도록 설계된 3 개의 결합 도메인으로 구성된 고형 종양에 대한 T-세포 인게이저 (T-cell engager)이다.

본원에서 사용된 용어 "프로바디 (probody)"는 프로테아제-활성화 가능한 항체 전구약물 (prodrug)을 지칭한다. 프로바디는 진짜와 같은 (authentic) IgG 중쇄와 변형된 경쇄로 구성된다. 마스킹 펩타이드는 종양 특이적 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 펩타이드 링커를 통해 경쇄에 융합된다. 상기 마스킹 펩타이드는 프로바디가 건강한 조직에 결합하는 것을 방지하여, 독성 부작용을 최소화 한다.

압타머는 특정 표적 분자에 결합하는 핵산분자 또는 펩타이드 분자이다. 압타머는 일반적으로 큰 무작위 서열 풀에서 선택하여 만들어 지지만, 리보스위치 (riboswitche)에 천연 압타머도 존재하다. 압타머는 거대분자 약물(macromolecular drug)로 기본 연구 및 임상 목적 모두에 사용할 수 있다. 압타머는 표적 분자의 존재 시에 리보자임과 결합하여 자가-절단할 수 있다. 이러한 화합물 분자에 추가 연구, 산업 및 임상적 적용을 갖는다 (Osborne et. al. (1997), Current Opinion in Chemical Biology, 1:5-9; Stull & Szoka (1995), Pharmaceutical Research, 12, 4:465-483).

핵산 압타머는 일반적으로 (보통 짧은) 올리고 뉴클레오티드의 가닥으로 구성된 핵산 종 (species)이다. 통상적으로, 이들은 소분자, 단백질, 핵산, 심지어 세포, 조직 및 유기체와 같은 다양한 분자 표적에 결합하도록 시험관 내 선택의 반복 라운드 또는, 동등하게, SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment)를 통해 설계된다.

펩타이드 압타머는 일반적으로 세포 내부의 다른 단백질 상호작용에 간섭하도록 설계된 펩타이드 또는 단백질이다. 그들은 단백질 스캐폴드의 양쪽 끝에 부착 된 가변 펩타이드 루프로 구성된다. 이러한 이중 구조적 제약 (constraint)은 펩타이드 압타머의 결합 친화도를 항체에 필적하는 수준 (나노 몰 범위)으로 크게 증가시킨다. 가변 펩타이드 루프는 통상적으로 10 내지 20 개의 아미노산을 포함하고, 스캐폴드는 우수한 용해도 특성을 갖는 임의의 단백질 일 수 있다. 현재, 박테리아 단백질 티오레독신-A (Thioredoxin-A)는 가장 일반적으로 사용되는 스캐폴드 단백질이며, 가변 펩타이드 루프는 야생형 단백질에서 -Cys-Gly-Pro-Cys-loop (SEQ ID NO: 55)인 레독스-활성화 부위 내에 삽입되며, 두 개의 시스테인 측면 사슬은 이황화 다리를 형성할 수 있다. 펩타이드 압타머는 다른 시스템을 사용하여 선택될 수 있지만, 현재 가장 널리 사용되는 것은 효모 2-하이브리드 시스템 (yeast two-hybrid system)이다.

압타머는 일반적으로 사용되는 생체분자, 특히 항체에 필적하는 분자 인식 특성을 제공하기 때문에 생명공학 및 치료적 사용을 위한 유용성을 제공하다. 차별적 인식능 외에도, 압타머는 시험관에서 완벽하게 조작될 수 있고, 화학 합성에 의해 쉽게 생산되며, 바람직한 저장 특성을 가지고, 그리고 치료적 사용에서 면역 원성을 거의 또는 전혀 유발하지 않기 때문에 항체 이상의 이점을 제공하다. 변형되지 않은 압타머는, 주로 압타머의 본질적으로 낮은 분자량의 결과로, 주로 신장에 의해 신체에서 뉴클레아제 분해 및 제거되기 때문에, 혈류에서 빠르게 제거되며, 반감기가 수 분에서 수 시간이다. 변형되지 않은 압타머 적용은 현재 혈액 응고와 같은 일시적인 상태를 치료하거나, 국소 전달이 가능한 눈과 같은 장기를 치료하는 데 중점을 두고 있다. 이 빠른 제거는 생체 내 진단 영상과 같은 응용분야에서 이점이될 수 있다. 2'-불소-치환된 피리미딘, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 결합, 알부민 또는 기타 반감기 연장 단백질과의 융합 등과 같은 여러 변형이 과학자들에게 가능하며, 그렇게 함으로써 압타머의 반감기가 몇 일 또는 몇 주 동안 증가될 수 있다.

논의 된 바와 같이, 전술된 소분자, 항체 또는 항체 유사체 및 압타머는 본 발명의 제 4 측면의 단백질에 특이적으로 결합할 수 있다. 이러한 결합은 본 발명의 제 4 측면의 단백질의 면역억제 특성, 바람직하게는 암 환자에서 화학요법에 대한 내성을 유도하고/하거나 무진행 생존률과 전체 생존률을 감소시키는 능력을 차단할 것이다. 이 경우, 소분자, 항체 또는 항체 유사체 및 압타머는 또한 차단 소분자, 차단 항체 또는 항체 유사체 및 차단 압타머로 불린다. 차단 소분자, 차단 항체 또는 항체 유사체 및 차단 압타머는 본 발명의 제 4 측면의 단백질과 일반적으로 상호작용하는 리간드 및 수용체와 같은 다른 세포성 성분과 본 발명의 제 4 측면의 단백질의 상호작용을 차단한다.

상기 소분자, 항체 또는 항체 유사체 및 압타머는 또한 약물-접합체의 형태로 생성될 수 있다. 이 경우, 소분자, 항체 또는 항체 유사체 및 압타머 자체는 저해 효과가 없을 수 있고 저해 효과는 약물에 의해서만 부여된다. 상기 소분자, 항체 또는 항체 유사체 및 압타머는 본 발명의 단백질을 생성 및/또는 결합하는 세포로 약물의 부위 특이성 결합능을 부여한다. 상기 약물은 바람직하게는 본 발명의 단백질을 생성 및/또는 결합하는 세포를 죽일 수 있다. 따라서, 본 발명의 단백질에 결합하는 분자의 표적화 능력과 약물의 세포-살상 능력을 결합함으로써, 약물 접합체는 건강한 조직과 병에 걸린 조직을 구분할 수 있는 저해제 (inhibor)가 된다. 약물 접합체를 설계하기 위한 절단 가능 및 절단 불가능 링커는 당업계에 공지되어 있다. 세포를 살상할 수 있는 약물의 비 제한적인 예는 세포 증식 억제제와 암세포에 직접 방사선을 전달하는 방사성 동위원소 (radioisotope)이다.

또한, 소분자, 항체 또는 항체 유사체 및 압타머의 결합 및/또는 억제 활성을 특정 조직 또는 세포-유형, 특히 질병 조직 또는 세포-유형에 한정하는 것이 가능하다. 예를 들어, 프로바디가 설계될 수 있다. 프로바디에서 상기 소분자, 항체 또는 항체 유사체 또는 압타머는 본 발명의 단백질에 결합하는 것을 제한 또는 방지하는 마스킹 펩타이드에 결합되고 마스킹 펩타이드는 프로테아제에 의해 절단될 수 있다. 프로테아제는 기질로 알려진 특정 아미노산 서열을 절단하여 단백질을 작은 조각으로 분해하는 효소이다. 정상의 건강한 조직에서, 프로테아제 활성은 엄격하게 제어된다. 암세포에서, 프로테아제 활성은 상향조절된다. 프로테아제 활성이 제어되고 최소인 건강한 조직이나 세포에서 프로바디의 표적-결합 영역은 가려져있어 결합될 수 없다. 다른 한편으로, 프로테아제 활성이 상향조절되는 병든 조직 또는 세포에서 프로바디의 표적 결합 영역은 가려지지 않아 결합 및/또는 저해를할 수 있다.

본 발명에 따르면, 용어 "작은 간섭 RNA (siRNA)"는, 짧은 간섭 RNA 또는 침묵 RNA로도 알려져 있으며, 18 내지 30 개, 바람직하게는 19 내지 25 개, 가장 바람직하게는 21 내지 23 개, 또는 훨씬 더 바람직하게는 21개의 뉴클레오티드-길이의 이중-가닥 RNA 분자의 부류로 생물학에서 다양한 역할을 하는 것을 의미한다. 특히, siRNA 특정 유전자의 발현을 방해하는 RNA 간섭 (RNAi) 경로에 관여한다. RNAi 경로에서의 역할 외에도, siRNA는 또한 RNAi-관련 경로에서, 예를 들어, 항바이러스 메커니즘 또는 게놈의 염색질 구조를 형성하는 것으로서 역할을 한다.

자연에서 자연적으로 발견되는 siRNA는 잘 정의된 구조를 갖는다: 양쪽 끝에 2-nt 3' 돌출부 (overhang)를 갖는 짧은 이중 가닥 RNA (dsRNA). 각 가닥은 5' 포스페이트 그룹과 3' 하이드록실 (-OH) 그룹을 갖는다. 이 구조는 긴 dsRNA 또는 작은 헤어핀 RNA를 siRNA로 변환하는 효소인 다이서 (dicer)에 의해 처리된 결과이다. siRNA는 또한 관심있는 유전자의 특이적 넉다운을 일으키기 위해 세포로 외인성으로 (인위적으로) 도입될 수 있다. 따라서, 본질적으로 서열이 알려진 임의의 유전자는 서열 상보성에 기초하여 적절하게 맞춤화된 siRNA로 표적화될 수 있다. 이중-가닥 RNA 분자 또는 이의 대사 생성물 (metabolic processing product)은, 표적-특이적 핵산 변형, 특히 RNA 간섭 및/또는 DNA 메틸화를 매개할 수 있다. 외인성으로 도입된 siRNA는 3' 및 5' 말단에 돌출부가 없을 수 있지만, 적어도 하나의 RNA 가닥이 5'- 및/또는 3'-돌출부 (overhang)를 갖는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 이중-가닥의 일 말단은 1 내지 5 개 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 1 내지 3 개 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 2 개 뉴클레오티드의 3'-돌출부 (overhang)를 갖는다. 다른 말단은 두가닥말단 (blunt-end)이거나 최대 6 개 뉴클레오티드의 3'-돌출부 (overhang)를 가질 것이다. 일반적으로, siRNA로서 작용하기에 적합한 임의의 RNA 분자가 본 발명에서 구상된다. 지금까지 가장 효율적인 침묵 (silencing)은 2nt 3'-돌출부를 갖는 방식으로 짝을 이루는 21-nt 센스 및 21-nt 안티센스 가닥으로 구성된 siRNA 이중체 (duplexes)로 얻었다. 상기 2-nt 3' 돌출부의 서열은 첫 번째 염기 쌍에 인접한 짝을 이루지 않은 뉴클레오티드로 제한되는 표적 인식의 특이성에 약간의 기여를 한다 (Elbashir et al. 2001). 3' 돌출부의 2'-데옥시뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드만큼 효율적이지만 합성 비용이 더 저렴하고 아마도 더 많은 뉴클레아제 내성이 있다. siRNA의 전달은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여, 예를 들어 siRNA를 식염수와 조합하고 상기 조합물을 정맥 내 또는 비강 내로 투여하거나 글루코스 (예를 들어 5 % 글루코스) 또는 양이온성 지질에서 siRNA를 제형화함으로써 달성될 수 있고; 폴리머는 정맥 내 (IV) 또는 복강 내 (IP)의 전신 경로를 통한 생체 내 siRNA 전달에 사용될 수 있다 (Fougerolles et al. (2008), Current Opinion in Pharmacology, 8: 280-285; Lu et al.(2008), Methods in Molecular Biology, vol. 437: Drug Delivery Systems - Chapter 3: Delivering Small Interfering RNA for Novel Therapeutics).

짧은 헤어핀 RNA (shRNA)는 RNA 간섭을 통해 유전자 발현을 침묵 시키는데 사용될 수 있는 팽팽한 헤어핀 커브 (hairpin turn)를 만드는 RNA의 서열이다. shRNA는 세포에 도입된 벡터를 사용하고 shRNA가 항상 발현되도록 하기위해 U6 프로모터를 사용하다. 이 벡터는 일반적으로 딸 세포로 전달되어 유전자 침묵이 유전되게 한다. shRNA 헤어핀 구조는 세포 시스템 (cellular machinery)에 의해 siRNA로 절단된 다음 RNA-유도 침묵 복합체 (RISC)에 결합된다. 이 복합체는 결합된 siRNA와 매칭되는 mRNA에 결합하고 절단하다. 본 발명에서 사용되는 si/shRNA는 적절하게 보호된 리보뉴클레오시드 포스포라미다이트 및 통상적인 DNA/RNA 합성기를 사용하여 화학적으로 합성하는 것이 바람직하다. RNA 합성 시약 공급 업체는 Proligo (독일 함부르크), Dharmacon Research (Lafayette, CO, USA), Pierce Chemical (Perbio Science, Rockford, IL, USA), Glen Research (Sterling, VA, USA), ChemGenes ( Ashland, MA, USA) 및 Cruachem (Glasgow, UK)이다. 가장 편리하게, siRNA 또는 shRNA는 다양한 품질과 비용의 RNA-합성 제품을 판매하는 상업적 RNA 올리고 합성 공급 업체에서 얻는다. 일반적으로, 본 발명에서 적용할 수 있는 RNA는 통상적으로 합성되어 RNAi에 적합한 품질로 쉽게 제공된다.

RNAi에 영향을 미치는 추가의 분자는, 예를 들어, 마이크로 RNA (miRNA)를 포함한다. 상기 RNA 종은 단일 가닥 RNA 분자이다. 내인성으로 존재하는 miRNA 분자는 상보적 mRNA 전사체에 결합하고 RNA 간섭과 유사한 과정을 통해 상기 mRNA 전 사체의 분해를 촉발함으로써 유전자 발현을 조절한다. 따라서, 외인성 miRNA는 각 세포에 도입 된 후 HLA-J의 저해제로 사용될 수 있다.

리보자임 (리보 핵산 효소, RNA 효소 또는 촉매 RNA라고도 함)은 화학 반응을 촉매하는 RNA 분자이다. 많은 천연 리보자임은 자신의 절단 또는 다른 RNA의 절단을 촉매하지만, 또한 리보좀의 아미노 전이 효소 활성 (aminotransferase activity)을 촉매하는 것으로도 밝혀졌다. 잘 특성화된 작은 자가-절단 RNA의 비 제한적인 예는, 해머헤드 (hammerhead), 헤어핀 (hairpin), 델타 간염 바이러스 (hepatitis delta virus) 및 시험관 내-선택된 납-의존성 리보자임인 반면, 그룹 I 인트론은 더 큰 리보자임의 예이다. 촉매적 자가-절단의 원리는 최근 몇 년 동안 잘 확립되었다. 해머헤드 리보자임은 리보자임 활성을 갖는 RNA 분자 중에서 가장 잘 특성화된다. 해머헤드 구조가 이종 RNA 서열에 통합될 수 있고 그렇게 함으로써 리보자임 활성이 이러한 분자로 전달될 수 있음이 입증되었으므로, 표적 서열이 잠재적으로 일치하는 절단 부위를 포함하는 경우, 거의 모든 표적 서열에 대한 촉매 안티센스 서열이 생성될 수 있는 것으로 보인다. 해머헤드 리보자임을 구성하는 기본 원리는 다음과 같다: GUC (또는 CUC) 삼중자 (triplet)를 포함하는 RNA의 관심 영역이 선택된다. 일반적으로 각각 6 내지 8 개의 뉴클레오티드를 갖는 두 개의 올리고뉴클레오티드 가닥을 취하고, 그 사이에 촉매 해머헤드 서열이 삽입된다. 가장 좋은 결과는 일반적으로 짧은 리보자임과 표적 서열에서 얻을 수 있다.

본 발명에 따른 유용한 최근 개발은 작은 화합물을 인식하는 압타머와 해머헤드 리보자임의 조합이다. 표적 분자와 결합할 때 압타머에서 유도된 형태적 변화는 리보자임의 촉매 기능을 조절할 수 있다.

본원에서 사용 된 용어 "안티센스 핵산분자 (antisense nucleic acid molecule)"는 표적 핵산에 상보적인 핵산을 의미한다. 본 발명에 따른 안티센스 분자는 표적 핵산과 상호 작용할 수 있고, 보다 구체적으로 표적 핵산과 혼성화할 수 있다. 하이브리드의 형성으로 인해, 표적 유전자 들)의 전사 및/또는 표적 mRNA의 번역이 감소되거나 차단된다. 안티센스 기술과 관련된 표준 방법이 설명되어 있다 (예를 들어, Melani et al., Cancer Res.(1991) 51: 2897-2901 참조).

CRISPR/Cas9 및 CRISPR-Cpf1 기술은 거의 모든 세포/모델 유기체에 적용할 수 있으며 돌연변이, 염색체 결실, DNA 서열 편집 및 유전자 발현 조절에 사용될 수 있다. 유전자 발현의 조절은 특정 유전자, 여기서 HLA-J 유전자의 전사를 억제하기 위한 전사 억제자와 접합된 촉매적으로 활성이 없는 Cas9 효소 (dCas9)를 사용하여 처리될 수 있다. 유사하게, 촉매적으로 불활성인, "사멸된" Cpf1 뉴클레아 제 (Prevotella 및 Francisella-1의 CRISPR)는 합성 전사 억제자 또는 활성자에 융합되어 내인성 프로모터, 예를 들어, HLA-J 발현을 조절하는 프로모터를 하향조절 한다. 또는, 징크 핑거 뉴클레아제 (zinc finger nuclease, ZFN) 또는 TALEN (transcription activator-like effector nuclease)의 DNA 결합 도메인은 HLA-J 유전자 또는 이의 프로모터 영역 또는 5'-UTR을 특이적으로 인식하여 HLA-J 유전자의 발현을 저해하도록 설계될 수 있다.

HLA-J 유전자 또는 HLA-J 발현에 관여하는 조절 분자를 표적하는 억제 핵산분자로서 제공된 저해제가 또한 본원에서 고려된다. HLA-J 또는 조절 분자의 발현을 감소 또는 없애는 이러한 분자는, 비 제한적으로, 메가뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제 (zinc finger nuclease, ZFN), 및 TALEN (transcription activator-like effector nuclease)을 포함한다. 이러한 방법은 Silva et al., Curr Gene Ther. 2011; 11(1):11-27; Miller et al., Nature biotechnology. 2011;29(2):143-148 및 Klug, Annual review of biochemistry. 2010; 79:213-231에 기술된다.

제 6 측면에서, 본 발명은 (a) 제 3 측면의 숙주 세포를 배양하는 것, 및 (b) 제 4 측면의 생산된 단백질 또는 펩타이드를 분리하는 것을 포함하는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드를 생산하는 방법에 관한 것이다.

상기 용어 "배양"은 제어된 조건 하에서 숙주 세포가 성장하는 과정을 의미한다. 이러한 조건은 사용된 숙주 세포에 따라 달라질 수 있다. 당업자는 최적화 된 배양 조건을 설정하는 방법을 잘 알고 있다. 더욱이, 세포 배양을 확립, 유지 및 조작하는 방법은 최신의 기술 수준에서 광범위하게 설명되었다.

생성된 (폴리)펩타이드의 단리 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 비제한적으로 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 (크기 배제 크로마토그래피), 친화성 크로마토그래피, 고압 액체 크로마토 그래피 (HPLC), 역상 HPLC, 디스크 겔 전기 영동 또는 면역 침전과 같은 방법 단계를 포함한다, 예를 들어 Sambrook, 2001, Molecular Cloning: A Laboratory manual, 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York 참조.

본 발명에 따른 용어 "생산된 단백질 또는 펩타이드"는 과정의 산물을 지칭하며, 숙주 세포에서 과정이 유도될 수 있고, 이에 의하여 본 발명의 (폴리)펩타이드 합성에서 (폴리)펩타이드를 암호화하는 핵산분자로부터의 정보가 사용되는 것 암시한다. 당해 분야에 공지된 방법에 의한 본 발명의 펩타이드의 전사, RNA 스플라이 싱, 번역 및 번역 후 변형을 포함하는 이러한 과정에서 여러 단계가 조절될 수 있다. 따라서, 이러한 조절은 생산된 (폴리)펩타이드의 타이밍, 위치 및 양의 제어를 가능하게 한다.

제 7의 측면에서 본 발명은 핵산분자, 벡터, 숙주 세포, 단백질 또는 펩타이드, 결합 분자, 바람직하게는 본 발명의 저해제 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물, 바람직하게는 약학적 또는 진단 조성물에 관한 것이다.

본원에서 사용된 용어 "조성물"은 핵산분자, 벡터, 숙주 세포, 단백질 또는 펩타이드, 결합분자, 바람직하게는 제 5 측면의 저해제, 또는 하기에서 총괄적으로 화합물로 지칭되는 이들의 조합 중 적어도 하나를 포함하는 조성물을 지칭한다.

발명에 따른 상기 용어 "약학적 조성물"은 환자, 바람직하게는 인간 환자에게 투여하기 위한 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기에서 언급된 화합물을 포함한다. 선택적으로, 이는 본 발명의 화합물의 특성을 변경시킬 수있는 추가의 분자를 포함할 수 있으며, 이에 의하여 예를 들어 상기 화합물의 기능을 안정화, 조절 및/또는 활성화할 수 있다. 상기 조성물은 고체, 액체 또는 기체 형태 일 수 있으며, 특히, 분말(들), 정제(들), 용액(들) 또는 에어로졸(들)의 형태 일 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 임의로 및 추가적으로 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 적합한 약학적 담체의 예는 당업계에 잘 알려져 있으며 인산염 완충 식염수 용액, 물, 에멀젼, 예를 들어 오일/물 에멀젼, 다양한 유형의 습윤제, 멸균 용액, DMSO를 포함하는 유기용매 등을 포함한다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 잘 알려진 통상적인 방법으로 제제화될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 적절한 용량으로 대상체에게 투여될 수 있다. 투약 요법은 주치의와 임상 요인에 의해 결정될 것이다. 의학 분야에서 잘 알려진 바와 같이, 한 명의 환자에 대한 투여량은 환자의 크기, 신체 표면적, 연령, 투여되는 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반적인 건강 및 동시에 투여되는 약물을 포함한 여러 요인에 따라 달라진다. 주어진 상황에 대한 치료적 유효량은 일상적인 실험에 의해 쉽게 결정될 것이며 일반 임상의 또는 의사의 기술과 판단 범위 내에 있다. 일반적으로, 약학적 조성물의 정기 투여로서의 요법은 1 일 당 1 ㎍ 내지 5 g 단위의 범위에 있어야 한다. 그러나, 보다 바람직한 투여량은 하루에 0.01 mg 내지 100 mg, 더욱더 바람직하게는 0.01 mg 내지 50 mg, 가장 바람직하게는 0.01 mg 내지 10 mg의 범위 일 수 있다. 더욱이, 예를 들어 상기 화합물이 siRNA와 같은 iRNA 작용제인 경우, 투여되는 약학적 조성물의 총 약학적 유효량은 일반적으로 체중 kg 당 약 75 mg 미만, 예를 들어 약 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 2, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001 또는 0.0005 mg/kg 체중 미만일 것이다. 보다 바람직하게는, 양은 체중 kg 당 2000 nmol 미만의 iRNA 작용제 (예를 들어, 약 4.4 x 10¹⁶ 카피), 예를 들어 kg 체중 당 1500, 750, 300, 150, 75, 15, 7.5, 1.5, 0.75, 0.15, 0.075, 0.015, 0.0075, 0.0015, 0.00075 또는 0.00015 nmol 미만의 iRNA 제제일 것이다. 변화를 관찰하는데 필요한 치료 기간 및 치료 후 응답이 발생하는 간격은 원하는 효과에 따라 달라진다. 특정 양은 당업자에게 잘 알려진 통상적인 시험에 의해 결정될 수 있다.

아래에서 추가로 설명되는 바와 같이, 본 발명의 약학적 조성물은, 예를 들어, 종양 (특히, 암)을 치료하기 위한 것뿐만 아니라 백신 또는 면역억제제 (immunosuppressant)로 사용될 수 있다. 그러나, 상기 약학적 조성물은 또한 추가 질병의 치료 또는 예방을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 단백질 또는 펩타이드가 융합 단백질인 경우, 융합 파트너는 염증성 질환에 치료 특이성을 부여할 수 있다. 위에서 논의 된 바와 같이, 융합 파트너로서 사이토카인의 사용은 염증성 질환의 치료에 적합한 융합 단백질이 된다. 특정 사이토카인이 뇌졸중, 알츠하이머 병, 자가 면역 질환, 상처 치유 및 근위축성 측삭 경화증 (amyotrophic lateral sclerosis)의 치료를 위한 임상 시험에 도입되었으며, 만성 통증 치료를 위해 항-염증성 사이토카인 또는 염증성 사이토카인 길항제 (antagonist)의 국소 또는 전신 전달을 활용할 수 있다. 또한, 위에서 논의된 바와 같이, 융합 파트너로서 응고 촉진 인자의 사용은 상처 치유에 적합한 융합 단백질이 된다. 따라서, 융합 단백질에 의한 본 발명의 단백질 또는 펩타이드의 치료적 용도는 융합 파트너에 의해 부여된 추가 치료적 용도에 의해 보충될 수 있으며, 잠재적으로 상승적 치료 효과를 초래할 수 있다.

상기에서 또한 방사성 핵종 (radionucleide)은 본 발명의 단백질 또는 펩타이드의 융합 파트너로서 논의된다. 방사성 핵종을 포함하는 융합 단백질은 방사 리간드 요법 (radioligand therapy)에 사용될 수 있다. 방사성 리간드 요법에서 방사성 의약품 (일반적으로 루테튬-177과 같은 베타-방출 물질로 표지됨)은 종양 표적 구조 (일반적으로 표면 분자)에 특이적으로 결합하다. 예를 들어, 방사성 의약품은 종양 표적에 특이적 결합을 부여하여 종양에 대해 방사성 핵종을 표적화하는 항체를 추가로 포함할 수 있다. 방사성 리간드 요법은 일반적으로 전이된 질병에 사용되는 효과적인 전신 치료 요법이다. 방사성 의약품은 일반적으로 치료될 환자의 말초 정맥에 투여되거나 주입된다.

또한, HLA-J 핵산분자, 벡터, 숙주 세포, 단백질 또는 펩타이드, 결합분자, 바람직하게는 본 발명의 제 5 측면의 저해제 또는 이들의 조합 자체가 추가 치료 옵션을 제공할 가능성이있다. 예를 들어, HLA 영역은 면역 체계에서 중요한 역할을 하는 여러 분자를 암호화하다. HLA 영역과 자가 면역 질환 (AID) 사이의 강력한 연관성은 50 년 넘는 기간동안 확립되었다 (Gough and Simmons, Curr Genomics. 2007 Nov; 8(7):453-465). AID의 비-제한적인 예는 1 형 당뇨병 (T1D), 다발성 경화증 (MS), 류마티스 관절염 (RA), 그레이브스병 (GD), 강직성 척추염 (AS) 및 전신 홍 반성 루푸스 (SLE)이다.

골수 이식 또는 장기 이식의 성공 여부는 이식편-대-숙주질환 (GVHD)을 예방하기 위해 수혜자의 HLA 표현형과 기증자의 HLA 표현형을 일치시키는데 달려있다. 어떤 HLA 유전자좌가 임상적으로 관련이 있는지에 대한 오랜 논쟁이 있었다. 임상 결과 데이터가 축적됨에 따라, 모든 HLA 유전자좌가 관련성이 있음이 분명해졌다. 따라서, HLA-J도 역할을 한다고 안전하게 가정할 수 있다. 수혜자의 HLA-J 표현형을 기증자의 HLA-J 표현형과 일치시킬 수 없는 경우, 본 발명의 약학적 조성물의 억제는 GVHD를 예방하는 수단이될 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 비-치료적 용도로 사용하기 위한 것이다. 화장료 조성물은 또한 세정, 미용, 매력 증진, 또는 외형 변경을 위해 인체에 문지르거나, 붓거나, 뿌리거나, 분무하거나, 달리 적용되기 위한 조성물로서 사용 목적에 의해 정의될 수 있다. 본 발명에 따른 화장료 조성물의 특정 제형은 제한되지 않는다. 예상되는 제형에는 린스 용액, 에멀젼, 크림, 우유, 하이드로 겔과 같은 겔, 연고, 현탁액, 분산액, 분말, 고체 스틱, 거품 (foam), 스프레이 및 샴푸가 포함된다. 이를 위해, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 화장용으로 허용되는 희석제 및/또는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 원하는 제형에 따라 적절한 담체 및 희석제를 선택하는 것은 당업자의 기술 범위 내에 있다. 화장용으로 허용되는 적합한 희석제 및 담체는 당업계에 잘 알려져 있으며 Bushell et al. (WO 2006/053613)에 언급된 제제를 포함한다. 상기 상기 화장료 조성물의 바람직한 제형은 린스 용액 및 크림이다. 단일 사용으로 적용되는 본 발명에 따른 화장료 조성물의 바람직한 양은 0.1 내지 10 g, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 1 g, 가장 바람직하게는 0.5 g이다. 또한, 적용되는 양은 처리될 영역의 크기에 따라 달라지며 이에 맞게 조정되어야 한다.

제 8 측면에서, 본 발명은 의약, 바람직하게는 면역억제제, 백신, 또는 임신 촉진제로 사용하기 위한 핵산분자, 벡터, 숙주 세포, 단백질 또는 펩타이드, 결합 분자, 바람직하게는 본 발명의 저해제 또는 이들의 조합에 관한 것이다.

상기에서 이미 언급 한 바와 같이, 면역억제제는 면역 반응을 억제할 수 있는 약물이다. 이들은 면역억제 요법에서, 예를 들어, (i) 이식된 장기 및 조직 (예: 골수, 심장, 신장, 간)의 거부를 예방하고, (ii) 자가 면역 질환 또는 자가 면역 기원일 가능성이 가장 높은 질환 (예: 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 건선, 백반증, 전신 홍반성 루푸스, 유육종증, 국소 분절 사구체 경화증, 크론병, 베체트병, 천포창 (pemphigus), 경화증 (sclerodermia) 및 궤양성 대장염)을 치료 및/또는 (iii) 비-자가 면역 염증성 질환 (예: 장기 알레르기성 천식 조절 및 강직성 척추염)을 치료하기 위해 사용할 수 있다.

상기 백신은 바람직하게는 존재하는 종양을 치료하거나 종양의 발달을 예방하기 위해 사용될 수 있는 종양 백신이다. 기존 암을 치료하는 백신은 치료 암백신 (therapeutic cancer vaccine)이라고도 한다. 상기 백신은 "자가 유래"의 것, 즉, 환자로부터 채취된 시료에서 제조된 것 일 수 있고, 해당 환자에 특이적이다. 암백신의 방법은 일반적으로 암세포에서 단백질을 분리하고 상기 단백질을 항원으로하여 면역계를 자극해 상기 암세포를 죽이는 것을 목적으로 한다. 상기 항원은 본 발명에 따라 HLA-J 단백질/펩타이드로부터 유래된 것이다.

따라서, 본 발명은 또한 핵산분자, 벡터, 숙주 세포, 단백질 또는 펩타이드, 결합 분자, 바람직하게는 본 발명의 저해제 또는 이들의 조합과 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체 및/또는 희석제를 혼합하는 것을 포함하는 종양 백신의 제조 방법에 관한 것이다.

실시예 2 및 도 4/5는 높은 수준의 HLA-J 발현이 난소암 환자의 무진행 생존 및 전체 생존을 상당히 감소시키는 것과 관련이 있음을 보여준다. 따라서 HLA-J 발현이 종양이 면역 시스템을 회피하는데 도움을 준다고 안전하게 가정할 수 있다. 이것은 차례로 HLA-J가 면역억제제 (immunosuppressant) 역할을 한다는 것을 보여준다. 면역억제제로서의 HLA-J의 작용은 종양의 입장에서 해롭지만, 면역억제제에 의해 당업계에서 치료되는 상기 논의된 질환의 측면에서는 이로울 수 있다. 이것은 또한 HLA-J를 이용한 종양 환자의 백신 접종이 HLA-J 발현을 통해 종양의 면역계 회피를 억제하거나 없애는데 도움이될 수 있다는 것을 적어도 타당하게 만든다. 따라서, 본 발명의 핵산분자, 벡터, 숙주 세포, 단백질 또는 펩타이드 또는 조합은 약제, 바람직하게는 면역억제제 또는 백신으로 사용될 수 있다. 상기 핵산분자는 바람직하게는 제 1 측면의 항목 (g)의 핵산분자이다. 한편, 이하에 더 상세히 설명되는 바와 같이, 상기 결합 분자, 바람직하게는 본 발명의 제 5 측면의 저해제는 예를 들어 종양을 치료하는데 사용될 수 있다.

임신 촉진제 (pregnancy promoter)는 임신 가능성, 특히 배아 착상 가능성을 증가시키는 화합물이다. 착상 (implantation)은 이미 수정된 난자가 자궁벽에 달라 붙는 임신의 단계이다. 이 접착에 의해 배아가 어머니로부터 산소와 영양분을 받아 성장할 수 있다. 인간의 경우 수정란의 유착 및 착상은 배란 후 약 5 내지 6 일에 즘에 발생할 가능성이 가장 높다. 착상 실패는 2/3의 케이스가 부적절한 자궁 수용력 (uterine receptivity)으로 인한 것이고 1/3에서는 배아 자체의 문제에 의하여 발생하는 것으로 여겨진다. 이것은 또한 어머니의 나이에 달려 있다. 부적절한 자궁 수용은 젊은 산모에서 더 자주 발생하는 반면 배아 자체의 문제 (예: 염색체 이상)는 나이가 많은 산모 (특히 35 세 이상)에서 더 자주 발생한다. 부적절한 자궁 수용은 비정상적인 사이토카인과 호르몬 신호 그리고 후생적 변화 (epigenetic alteration)로 인해 발생할 수 있다. 반복적인 착상 실패는 여성 불임의 원인이다. 따라서 착상을 위한 자궁 내막 수용성을 최적화함으로써 임신율을 향상시킬 수 있다. 핵산분자, 벡터, 숙주 세포, 단백질 또는 펩타이드, 또는 이들의 조합은 착상을 위한 자궁 내막 수용성을 최적화하여 임신을 촉진하는 데 사용될 수 있다. 상기 핵산분자는 바람직하게는 제 1 측면의 항목 (g)의 핵산분자이다. 이것은 HLA-G가 사이토카인 분비를 조절하여 영약막 (trophopblastic)성 세포 침입을 제어하고 국소 면역 내성을 유지함으로써 착상에서 중요한 역할을하는 것으로 생각되기 때문이다 (Roussev and Coulam¸ J Assist Reprod Genet. 2007 Jul; 24(7): 288-295 참조). 더욱이, 착상 전 배아 (preimplanation)는 가용성 HLA-G 및 가용성 HLA-F를 발현하는 것으로 알려져 있다. 가용성 HLA-G 및 가용성 HLA-F의 발현 수준이 높을수록 배아의 착상률이 높아진다. 따라서 높은 수준의 HLA-J 발현은 성공적인 착상과 부합하는 반면 낮은 수준의 HLA-J 발현은 착상 실패와 부합할 것으로 예상된다. 따라서, 핵산분자, 벡터, 숙주 세포, 단백질 또는 펩타이드, 결합 분자, 바람직하게는 본 발명의 제 5 측면의 저해제 또는 이들의 조합은, 예를 들어, 시험 관 수정에서 사용될 수 있으며, 여기서 난모세포 (oocyte)는, 수정되고 모체에 이식되기 전에, 상기 핵산분자, 멕터, 숙주 세포, 단백질 또는 펩타이드, 또는 이들의 조합의 존재 하에서 배양된다.

제 9 측면에서, 본 발명은 약제로서 사용하기 위한, 바람직하게는 종양 치료에 사용하기 위한 결합 분자, 바람직하게는 본 발명의 저해제에 관한 것이다.

상기 제9 측면은 또한 면역 활성화제, 바람직하게는 종양 치료에 사용하기 위한 결합 분자, 바람직하게는 본 발명의 저해제에 관한 것이다.

면역 활성화제는 면역 반응을 촉진할 수 있는 약물이다. 면역 활성화제는, 예를 들어, 병에 걸린 세포에 대한 면역 반응을 촉진 및/또는 개시하기 위한 면역 활성화 요법에 사용될 수 있다. 상기 면역 반응은 바람직하게는 병에 걸린 세포에 대한 세포독성 면역 반응 및/또는 T-세포 반응이다.

언급된 바와 같이, 면역 활성화제는 바람직하게는 종양 치료의 맥락에서 사용된다. 첨부된 실시예에서 명백한 바와 같이, HLA-J는 종양에서 발현된다. HLA-J는 분비 단백질이며 하기의 예에 있는 데이터는 HLA-J가 종양 세포에 의해 분비됨을 보여주며, 따라서 HLA-J 단백질의 "구름 (cloud)"이 종양 세포 주위에 형성될 가능성이 가장 높으며, 이 구름은 면역 시스템에 의해 종양 세포가 인식되고 제거되는 것을 방지한다. 상기 결합 분자, 바람직하게는 본 발명의 저해제는 종양 세포로부터 이 보호성 구름을 제거하여 종양 세포에 대한 면역 반응을 촉진 및/또는 시작되도록 한다. 이 면역 활성화 메커니즘은 필요한 부분만 수정되어 (mutatis mutandis) 종양 세포가 아닌 다른 질병 세포에 적용된다.

종양은 생리적 기능을 갖지 않는 비정상적인 양성 또는 악성 조직의 새로운 성장이며, 일반적으로 제어되지 않는 빠른 세포 증식에서 발생하다. 종양은 바람직하게는 암이다. 암은 생리적 기능을 갖지 않는 비정상적인 악성 조직의 새로운 성장이며, 일반적으로 일반적으로 제어되지 않는 빠른 세포 증식에서 발생하다. 상기 암은 바람직하게는 유방암, 난소암, 자궁내막암, 질암, 외음부암, 방과암, 침샘암, 췌장암, 갑상선암, 신장암, 폐암, 상부 위장관 관련 암, 대장암, 결장암, 전립선암, 두경부 편평세포암, 자궁경부암, 교모세포종, 악성복수, 림프종 및 백혈병으로 이루어진 군에서 선택된다. 상기 암의 목록 중, 부인과 암 (예: 자궁 경부암, 난소암, 자궁암, 질암 및 외음부 암)이 바람직하며, 유방암 및 난소암이 가장 바람직하다. 또한 상기 암의 목록 중에서 방광암이 바람직하다.

종양 또는 암은 바람직하게는 고형 종양 또는 암이다. 고형 종양 또는 암은 일반적으로 액체성 종양 (liquid tumor)과 달리 낭종이나 액체 영역을 포함하지 않는 비정상적인 조직 덩어리이다.

본원의 실시예 2에서 입증되고 도 4 및 5에 나타낸 바와 같이, 높은 수준의 HLA-J mRNA 발현은 난소암 환자의 무증상 생존 및 전체 생존을 현저히 감소시키는데 관련된다. 유사하게, 화학요법 이전에 높은 수준의 HLA-J가 검출된 유방암 환자는 화학요법에 민감성이 덜하다는 것이 실시예 3 및 도 10에 나타나 있다. 마지막으로, 실시예 5 및 도 18은 방광암 환자에서 높은 수준의 HLA-J mRNA 발현을 보여준다. 본 발명과 관련하여 놀랍게도 HLA-J의 억제, 예를 들어, HLA-J의 발현 및/또는 번역의 억제는 종양 치료에 적합하다는 것이 발견되었다.

제 10 측면에서, 대상체로부터 수득된 시료에서 본 발명은 종양의 진단 및/또는 종양 및/또는 종야 예후의 등급화 (grading) 및/또는 HLA-J 저발현 종양 또는 HKA-J 고발현 종양으로 종양을 분류 및/또는 착상 실패의 진단 및/또는 진단하기 위한 제 1 측면의 항목 (g)의 핵산분자 또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드의 용도에 관한 것이다.

언급한 바와 같이, 상기 종양은 바람직하게는 암이다. 또한 언급 한 바와 같이, 본 발명의 이러한 측면과 관련하여 상기 종양 또는 암은 바람직하게는 고형 종양 또는 암이다.

상기 시료는 대상체의 체액이거나 대상체의 기관에서 추출한 조직 시료 일 수 있다. 체액의 비-제한적인 예는 전혈, 혈장, 혈청, 소변, 복막액, 및 흉막액, 뇌척수액, 눈물액 또는 용액 중 이들로부터의 세포이다. 조직의 비-제한적인 예는 결장, 간, 유방, 난소 및 고환이다. 조직 시료는 흡인 또는 종지점 (punctuation), 절제 또는 생검 또는 절개된 세포 물질을 얻을 수 있는 기타 수술적 방법으로 채취할 수 있다. 상기 시료는 가공된 시료, 예를 들어, 냉동, 고정, 포매 (embedding)된 시료 등 일 수 있다. 바람직한 시료의 유형은 포르말린 고정 파라핀 포매 (FFPE) 시료이다. FFPE 시료의 준비는 표준 의료 관행이며 이러한 시료는 장기간 보존될 수 있다.

본원에서 사용된 상기 용어 "진단"은 질병의 증상을 앓고 있는 대상체에서 질병의 확인에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 질병은 종양 또는 착상 실패이다. 본원에서 사용된 상기 용어 "등급화"는 종양을 갖는다고 진단된 대상체에서 종양 세포의 세포 퇴형성 (cell anaplasia) 정도의 확인에 관한 것이다. 종양 등급을 매기는데 가장 일반적으로 사용되는 시스템은 미국 암 공동 위원회 (American Joint Commission on Cancer)의 지침에 따른 시스템이다. 이 지침에 따라, 다음의 등급화 카테고리가 구분된다: GX (등급을 평가할 수 없음), G1 (고분화; 저등급), G2 (중등도 분화; 중등급), G3 (저분화; 고등급)으로 구분된다. G4 (분화되지 않음, 고등급). 본원에서 사용된 상기 용어 "예후"는 종양과 같은 질병으로부터의 회복의 예측 또는 가능성 및/또는 종양과 같은 질병의 생존률의 예측 또는 가능성에 관한 것이다. 종양의 경우, 상기 예후는 표적 병변의 종양 크기 변경, 질병-특이적 생존 (DSS), 무재발 생존 (RFS), 무진행 생존 (PFS) 및 원거리 무-재발 생존 중 하나 이상을 포함하며, 여기서 질병-특이적 생존 (DDS)가 바람직하다.

본 발명에 따른 용어 "대상체 (subject)"는 포유 동물을 의미하며, 바람직하게는 가축 또는 말, 소, 돼지, 양, 염소, 개 또는 고양이와 같은 애완 동물, 가장 바람직하게는 인간을 지칭한다.

상기 논의된 바와 같이, 종양 환자에서 HLA-J 발현 수준의 증가는 종양 환자에서 무진행 생존 및 전체 생존률의 현저한 감소와 관련된다. 따라서, 더 높은 수준의 HLA-J 발현은 또한 더 높은 종양 등급과 부합한다. 또한, HLA-J 발현이 모든 종양 시료에서 발견되었으므로, HLA-J 발현이 예후 마커 역할을 할뿐만 아니라 종양 진단 마커 역할을할 수 있음이 실시예에서 입증되었다.

상기 용도에서 양성 및/또는 음성 시료뿐만 아니라 미리 설정된 기준 (predetermined standard)이 포함될 수 있다. 대조군은 하나 이상의 대상체, 예를 들어, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400, 적어도 500, 적어도 600, 적어도 700, 적어도 800, 적어도 900, 적어도 1000, 적어도 1500, 또는 적어도 2000의 대상체의 시료로부터 얻어질 수 있다. 설정된 기준 (predetermined standards)은 양성 및/또는 음성 시료로부터 이전에 얻은 값을 지정한다.

건강한 대상체는 HLA-J를 발현하지 않을 것으로 예상되기 때문에, 종양의 진단을 위해서는 기준이 전혀 필요하지 않다고 여겨진다. 또한, 조사된 모든 종양 환자에서 HLA-J 발현이 검출된 것이 실시예에서 보여진다. 그럼에도 불구하고, 양성 및/또는 음성 시료뿐만 아니라 미리 설정된 기준이 본 발명의 종양 진단 적용에 포함될 수 있다. 진단을 위해, 양성 시료는 종양을 갖는 것으로 알려진 하나 이상의 대상체, 바람직하게는 진단될 대상과 동일한 신체 부위의 종양을 갖는 것으로 알려진 대상체로부터 얻는 것이다. 유사하게, 음성 시료는 종양이 없는 것으로 알려진 하나 이상의 대상체로부터 얻은 것이다. 시료에서 제 1 측면의 핵산분자 또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드의 발현 수준이 음성 대조군 또는 이들 유래의 미리 설정된 기준과 비교해서, 증가된 선호도로, 적어도 1.5 배 (fold), 2 배 (fold), 3 배 (fold), 4 배 (fold) 증가된 경우 대상체는 종양을 갖는 것으로 진단된다. 시료에서 제 1 측면의 핵산분자 또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드의 발현 수준이 양성 대조군 또는 이들 유래의 미리 설정된 기준과, 증가된 선호도로, 50 % 미만, 25 % 미만 및 10 % 미만으로 차이가 나면, 대상체는 종양을 갖는 것으로 진단된다. 예를 들어, 상기 양성 대조군이 100 %로 설정되면, 150% 내지 50 %, 바람직하게는 125 % 또는 75 %의 값을 나타내는 환자는 종양을 갖는 것으로 진단된다.

또한, 착상 실패의 진단을 위해, 양성 및/또는 음성 시료뿐만 아니라 미리 설정된 기준 (predetermined standard)이 사용될 수 있다. 진단을 위해 상기 양성 시료는 적어도 한 번의 착상 실패, 바람직하게는 적어도 두번의 착상 실패, 가장 바람직하게는 적어도 세 번의 착상 실패를 가졌던 한 명 이상의 여성 대상체로부터 얻는 것이다. 두 번 이상의 착상 실패는 반복적 또는 습관성 착상 실패라고도 한다. 유사하게, 음성 시료는 적어도 한 번의 성공적인 임신, 바람직하게는 적어도 두 번의 성공적인 임신, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 세 번의 성공적인 임신을 했던 한 명 이상의 여성 대상체로부터 얻은 것이다. 시료에서 제 1 측면의 핵산분자 또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드의 발현 수준이 음성 대조군 또는 이들 유래의 미리 설정된 기준과 비교해서, 증가된 선호도로, 적어도 1.5 배 (fold), 2 배 (fold), 3 배 (fold), 4 배 (fold) 감소된 경우 여성 대상체는 착상 실패로 진단된다. 시료에서 제 1 측면의 핵산분자 또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드의 발현 수준이 양성 대조군 또는 이들 유래의 미리 설정된 기준과, 증가된 선호도로, 50 % 미만, 25% 미만 및 10 % 미만으로 차이 (즉, 높거나 낮음)나면, 대상체는 착상 실패로 진단된다. 예를 들어, 상기 양성 대조군이 100 %로 설정되면, 125 % 또는 75 %의 값을 나타내는 환자는 착상 실패로 진단된다.

종양을 HLA-J 저발현 종양 또는 HLA-J 고발현 종양으로 분류하는 것과 관련하여, 각각 및 모든 종양이 상당한 양의 HLA-J를 발현하거나 발현 할 것으로 예상되는 것은 아니라는 점에 유의한다. 따라서, 종양을 갖는 대상체에서 결합 분자, 바람직하게는 본 발명의 제 5 측면의 저해제가 치료 옵션 일 수 있는지 여부를 밝히기 위해, 종양은 HLA-J 저발현 종양 또는 HLA-J 고발현 종양으로로 분류될 수 있고, 후자의 경우에만 상기 결합 분자 또는 저해제가 선택지가 된다. 분류를 위해, 대조군은 HLA-J를 발현하는 종양을 갖는 것으로 알려져 있고, 바람직하게는 결합 분자, 바람직하게는 본 발명의 제 5 측면의 저해제에 의해 치료 가능한 종양을 갖는 것으로 알려진 하나 이상의 대상체로부터 유래될 수 있다. 분류될 종양의 HLA-J 발현이 대조군 종양과 비교해서, 증가하는 선호도로, 적어도 2 배, 적어도 3 배, 적어도 4 배, 그리고 적어도 5 배 감소한 경우, 상기 종양은 HLA-J 저발현 종양이다. 한편, 분류될 종양의 HLA-J 발현이 대조군 종양과 비교해서, 증가하는 선호도로, 적어도 2 배, 적어도 3 배, 적어도 4 배 그리고 적어도 5 배 증가된 경우, 상기 종양은 HLA-J 고발현 종양이다.

예후 (prognosis)를 위해, 양성 대조군은 종양 (바람직하게는 예후되는 대상과 동일한 신체 부위의 종양)으로 사망한 한 명 이상의 대상체로부터 얻을 수 있고, 음성 시료는 종양의 진행없이 상당한 시간 동안 종양으로부터 살아남은 한명 이상의 대상체로부터 얻을 수 있다 (바람직하게는 예후되는 대상과 동일한 신체 부위의 종양). 상당한 양은, 증가된 선호도로서, 적어도 1 년, 적어도 2 년, 적어도 3 년, 적어도 4 년 및 적어도 5 년을 지칭하다. 시료에서 제 1 측면의 핵산분자 또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드의 발현이 양성 대조군 또는 이들 유래의 미리 설정된 기준 대비, 증가된 선호도로, 적어도 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배 감소되면, 대상체는 유리한 예후를 갖는다. 또한 시료에서 제 1 측면의 핵산분자 또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드의 발현 수준이 음성 대조군 또는 이들 유래의 미리 설정된 기준 대비, 증가된 선호도로, 50 % 미만, 25 % 미만 및 10 % 미만으로 차이나는 경우, 대상체는 유리한 예후를 갖는다. 시료에서 제 1 측면의 핵산분자 또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드의 발현이 음성 대조군 또는 이들 유래의 미리 설정된 기준 대비, 증가된 선호도로, 적어도 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배 증가되면, 대상체는 불량한 예후를 갖는다. 또한 시료에서 제 1 측면의 핵산분자 또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드의 발현 수준이 양성 대조군 또는 이들 유래의 미리 설정된 기준 대비, 증가된 선호도로, 50 % 미만, 25 % 미만 및 10 % 미만으로 차이나는 경우, 대상체는 불량한 예후를 갖는다. 예후의 측면과 관련하여, 실시예 3 및 도 9 및 10에에서 유방암 환자에서 HLA-J 발현 수준이 화학요법 동안 반응성의 예후를 나타내는 것임을 보여준다는 것이 주목된다. 루미날 유방암 환자는 HLAJ 발현 수준이 가장 높았고, 이 환자들은 화학요법에 거의 반응을 나타내지 않았다. 따라서, 바람직하게는, 상기 예후는 종양 치료의 예상된 치료 성공의 예후이고, 여기서 상기 항-종양 치료는 바람직하게는 화학요법이고/이거나 진단될 환자는 바람직하게는 유방암을 갖는다.

등급화를 위해, 양성 시료는 카테고리 G1 내지 G4 중 하나로 등급이 결정된 하나 이상의 대상체로부터 얻는 것 일 수 있다. 등급화를 위해, 하나 이상의 양성 시료가 사용될 수 있으며, 상기 양성 시료는 2 개, 바람직하게는 3 개, 가장 바람직하게는 카테고리 G1 내지 G4의 4 개 모두이다. 시료에서 제 1 측면의 핵산분자 또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드의 발현 수준이 양성 G1 대조군 또는 이들 유래의 미리 설정된 기준 대비, 증가된 선호도로, 50 % 미만, 25 % 미만 및 10 % 미만으로 차이나는 경우, 대상체는 G1 종양을 갖는 것으로 등급이 결정된다. 이것은 필요한 부분만 변경하여, G2 내지 G4 단계에 준용된다.

제 1 측면의 핵산분자 또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드의 수준을 얻는 방법은 당업계에 확립되어있다.

예를 들어, 제 1 측면의 핵산분자의 수준은 실시간 정량 PCR (RT-qPCR), 전기 영동 기술 또는 DNA 마이크로 어레이 (Roth(2002), Curr. Issues Mol. Biol., 4: 93-100)에 의하여 얻을 수 있고, 여기서 RT-qPCR이 바람직하다. 이들 방법에서, 발현 수준은 시료에서 하나 이상의 참조 유전자의 (평균) 발현 수준에 대해 정규화 될 것이다. 본원에서 사용된, 상기 용어 "참조 유전자 (reference gene)"는 검사되는 시스템에서, 즉, 암에서 RNA 전사체/mRNA 수준에서 상대적으로 변하지 않는 수준의 발현을 갖는 유전자를 의미한다. 이러한 유전자는 하우스키핑 유전자라고 지칭될 수 있다. 참조 유전자의 비-제한적인 예는 CALM2, B2M, RPL37A, GUSB, HPRT1 및 GAPDH, 바람직하게는 CALM2 및/또는 B2M이다. 다른 적합한 참조 유전자는 당업자에게 알려져있다.

RT-qPCR은 실시예에 의해 예시된다. RT-qPCR은 적어도 하나의 지정된 파장의 광선으로 각 시료를 비추고 여기된 형광단에서 방출되는 형광을 감지할 수 있는 능력을 가진 열 순환기에서 수행된다. 상기 열 순환기는 또한 시료를 빠르게 가열하고 냉각할 수 있으므로 핵산과 DNA 중합효소의 물리 화학적 특성을 활용할 수 있다. 실시간 qPCR에서 PCR 산물을 검출하는 두 가지 일반적인 방법은 다음과 같다: (1) 임의의 이중 가닥 DNA와 인터칼레이션 (intercalate)하는 비-특이적 형광 염료, (2) 프로브가 프로브와 상보적인 서열과 혼성화 한 다음에만 검출될 수 있는 형광 리포터로 표지된 올리고 뉴클레오티드로 구성된 서열-특이적 DNA 프로브 (예: TaqMan 프로브). 후자의 검출 방법은 이하의 실시예에서 사용된다. 상기 프로브는 일반적으로 형광 표지된 프로브이다. 바람직하게는, 상기 형광 표지된 프로브는 형광 리포터 염료 및 소광 염료 모두로 표지된 올리고 뉴클레오티드로 구성된다 (= 이중-표지 프로브). 적합한 형광 리포터 및 소광 염료/모이어티는 당업자에게 공지되어 있으며, 상기 리포터 염료/모이어티는 6-FAMTM, JOETM, Cy5®, Cy3®를 포함하고, 상기 소광 염료/모이어티는 dabcyl, TAMRATM, BHQTM-1, -2 또는 -3을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 본 발명에 따라 사용하기 위한 프라이머는 15 내지 30 개 뉴클레오티드의 길이를 가지며, 특히 데옥시 리보뉴클레오티드이다. 하나의 구체예에서, 상기 프라이머는 (1) HLA-J의 표적 mRNA-서열에 특이적이거나 이들로부터 유래되며, (2) 120bp 미만 (바람직하게는 100bp 미만)의 앰플리콘 크기를 제공하고, (3) mRNA-특이적 (엑손/인트론 고려; 바람직하게는 게놈 DNA의 증폭 없음)이며, (4) 이량체화하는 경향이 없고, 및/또는 (5) 58 ℃ 내지 62 ℃ 범위의 분리 온도 (melting temperature, Tm) (바람직하게 Tm은 약 60℃)를 갖도록 설계된다. 더욱 바람직하게 하나 이상의 프라이머 및 프로브가 HLA-J의 HLA-J 특이적 엑손 4/엑손 5 접합부부 (junction)에 특이적으로 결합한다 (도 3). 훨씬 더 바람직하게는, 실시예의 표 1에 나타낸 하나 이상의 프라이머 및 프로브가 RT-qPCR에 사용되며, 더욱 바람직하게는 각각의 프로브와 관련하여 선택적으로 사용될 수 있는 특정 프라이머 쌍 중 하나가 사용된다. 언급된 바와 같이, 상기 프로브는 (2)에 따른 RT-qPCR에 필요하지만, (1)에 따른 RT-qPCR의 경우, 프로브는 SYBR 그린과 같은 인터칼레이션 염료 (intercalating dye)로 대체될 수 있다. 표 1의 정방향 프라이머는 SEQ ID NO: 12 내지 25, 프로브는 SEQ ID NO: 26 내지 39, 그리고 역방향 프라이머는 SEQ ID NO: 40 내지 53에 해당한다. SEQ ID NO: 12의 정방향 프라이머 및 SEQ ID NO: 40의 역방향 프라이머는 프라이머 쌍이고, SEQ ID NO: 26은 프로브에 해당하며, SEQ ID NO: 13의 정방향 프라이머 및 SEQ ID NO: 41의 역방향 프라이머는 프라이머 쌍이고, SEQ ID NO: 27은 프로브에 해당한다. 가장 바람직하게 SEQ ID NO: 18 및 46의 프라이머 쌍, 선택적으로 SEQ ID NO: 32의 프로브가 함께, 사용된다. 이러한 프라이머 쌍과 프로브는 HLA-J의 HLA-J 특이적 엑손 4/엑손 5 접합부 (junction)에 특이적이다.

qPCR의 대안으로서, 또한 전기 영동 기술 또는 DNA 마이크로 어레이를 사용하여 본 발명의 제 1 측면 핵산분자의 수준을 얻을 수 있다. mRNA 식별 및 정량화에 대한 기존의 접근 방식은 크기에 대한 정보를 제공하는 겔 전기 영동과 서열-특이적 프로빙의 조합을 통해 이루어진다. 노던 블롯 (Northern blot)은 이 부류에서 가장 일반적으로 적용되는 기술이다. 리보뉴클레아제 보호 분석 (ribonuclease protection assay; RPA)은 노던 블롯에 대하여 더 민감하고 덜 노동력을 요구하는 대안으로 개발되었다. 용액에서 표지된 리보뉴클레오티드 프로브를 사용하여 혼성화가 수행된 후, 단일-가닥 RNA를 선택적으로 분해하는 리보뉴클레아제 혼합물 (예: RNase A 및 RNase T1)로 비-혼성화된 시료와 프로브를 분해한다. 이어지는 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동은 정량화 수단을 제공하며 프로브에 의하여 혼성화된 영역의 크기도 제공한다. 노던 블롯과 RPA 모두에서, 정량의 정확성과 정밀도는 검출 방법과 사용된 참조 또는 기준의 기능이다. 가장 일반적으로, 프로브는 32P 또는 33P로 방사성 표지되며, 이 경우 최종 겔이 X-선 필름 또는 인광체 스크린 (phosphor screen)에 노출되고, 각 밴드의 강도는 농도계 또는 인광체 이미징기기 (imager)로 각각 정량화된다. 두 경우. 모두 노출 시간을 필요한 감도에 맞게 조정할 수 있지만 인광체 기반 기술은 일반적으로 더 민감하고 더 큰 동적 범위를 갖는다. 방사능 사용에 대한 대안으로, 프로브는 항원 또는 햅텐 (hapten)으로 표지될 수 있고, 그 뒤에 이는 호스래디쉬 퍼옥시다제- (horseradish peroxidase-) 또는 알칼리성 포스파타제- (alkaline phosphatase-) 접합된 항체에 의해 결합되고, 기질을 첨가한 후에 필름 또는 형광 이미징 기기 (fluorescence imager) 상에서 화학발광에 의해 정량화된다. 이들의 모든 이미징 사용에서, 프로브없이 젤의 인접 영역에서의 배경값을 공제해야 한다. 겔 형식의 가장 큰 장점은 모든 참조 기준 (reference standard)이 시료와 동시에 이미지화될 수 있다는 것아다. 마찬가지로, 하우스키핑 유전자의 검출은 모든 시료에 대해 동일한 조건에서 수행된다.

DNA 마이크로 어레이의 구축 (construction )을 위해, 두 가지 기술이 등장했다. 일반적으로, 어레이 설계를 위한 각 경우의 출발점은 조사될 유전자 또는 추정 유전자 (putative gene)에 해당하는 일련의 서열이다. 첫 번째 접근법에서, 올리고 뉴클레오티드 프로브는 유리 기판에서 시작하여 화학적으로 합성된다. cDNA 프로브에 대한 올리고 뉴클레오티드 혼성화의 가변 효율 때문에, 여러 올리고 뉴클레오타이드 프로브가 각 관심 유전자에 상보적으로 합성된다. 더욱이, 어레이상의 각각의 완전히 상보적인 올리고 뉴클레오티드에 대해, 단일 뉴클레오티드 위치에 불일치를 갖는 올리고 뉴클레오티드가 구축되고 정규화에 사용된다. 올리고 뉴클레오티드 어레이는 일반적으로 약 10⁴-10⁶ 프로브/cm²의 밀도로 생성된다. DNA 마이크로 어레이 구축을 위한 두 번째 주요 기술은 cDNA 프로브를 유리 슬라이드 또는 기타 적합한 기판에 직접 로봇 인쇄하는 것이다. 관심있는 각 유전자에 대한 DNA 클론을 얻고, 정제하고, 범용 프라이머를 사용하여 PCR을 통해 공통 벡터에서 증폭한다. 상기 프로브는 50-200 μm 정도 크기의 스팟에 로봇으로 침착 (depositing)된다. 이 공간에서, 예를 들어 약 10³ 프로브/cm²의 밀도를 얻을 수 있다.

네 번째 측면의 단백질 또는 펩타이드의 수준은 예를 들어 "단백질 또는 펩타이드에 대한 결합 분자" 및 바람직하게는 "단백질 또는 펩타이드에 대한 특이적 결합 분자"를 사용하여 결정될 수 있다. 단백질 또는 펩타이드에 대한 결합 분자는 알려진 조건 하에서 단백질 또는 펩타이드에 주로 결합되는 분자를 가리킨다. 정한다. 본 명세서에서 전술된 결합 분자 중 하나인 "단백질 또는 펩타이드에 결합하는 분자"는, 바람직하게는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드의 저해제, 예를 들어 항체, 압타머 등이 사용될 수 있다. 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드의 수준은 웨스턴 블롯 (Western Blot) 분석, 질량 분광 분석, FACS 분석, 및 ELISA를 사용하여 얻을 수도 있다. 이들 기술은 단백질 또는 펩타이드를 정성적으로, 반-정량적으로 및/또는 정량적으로 검출하는데 사용할 수 있는 방법의 비-제한적인 예이다.

웨스턴 블롯 분석은 널리 사용되며, 주어진 시료 (예: 조직 균질물 또는 신체 추출물)에서 특정 단백질 또는 펩타이드를 검출하는데 사용되는 잘 알려진 분석 기술이다. 이는 겔 전기영동을 사용하여 (폴리)펩타이드의 길이 (변성 조건) 또는 단백질의 3D 구조 (천연/비 변성 조건)에 따라 천연 또는 변성된 단백질 또는 펩타이드를 분리한다. 그런 다음 단백질 또는 펩타이드는 막 (일반적으로 니트로셀룰로오스 또는 PVDF)으로 이동되고, 여기서 표적 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 탐침 (검출) 된다.

또한 질량 분광 (mass spectrometry; MS) 분석은 널리 사용되며 잘 알려진 분석 기법으로, 하전된 입자의 질량 대 전하 비율을 측정한다. 질량 분광 분석법은 입자의 질량을 결정하고, 시료 또는 분자의 원소 조성을 결정하고, 단백질, 펩타이드 및 기타 화합물과 같은 분자의 화학 구조를 밝히는데 사용된다. 상기 MS의 원리는 하전된 분자 또는 분자 단편을 생성하기 위해 화학적 화합물을 이온화하고 이들의 질량 대 전하 비율을 측정하는 것으로 구성된다.

형광 활성화 세포 분류 (FACS) 분석은 널리 사용되고 잘 알려진 분석 기술로서, 생물학적 세포는 각 세포의 형광 특성의 특정 광 산란에 따라 분류된다. 세포는 4 % 포름알데히드에 고정되고, 0.2 % Triton-X-100으로 투과화되고, 형광단-표지된 항체 (예: 모노- 또는 폴리-클로날 항-HLA-J 항체)와 함께 인큐베이션될 수 있다.

효소면역정량법 (Enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA)는 널리 사용되고 잘 알려진 민감한 분석 기법으로, 효소는 특정 단백질 또는 펩타이드의 검출을 위한 마커로서 항체 또는 항원에 연결된다.

제 1 측면의 핵산분자 또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드 다음으로, 대상체로부터 수득된 시료에서 하나 이상의 추가 화합물을 종양 진단 및/또는 종양 및/또는 종양 예후의 등급을 결정하는데 사용할 수 있다. 종양 진단 및/또는 종양 및/또는 종양 예후의 등급을 결정하기 위한 수많은 마커가 당업계에 공지되어 있으며, 제 1 측면의 핵산분자 또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드와 함께 사용될 수 있다. 여러 종양 마커는 특정 종양을 나타내며, 예를 들어 유방암 또는 결장암을 나타낸다. 종양 마커들은, 예를 들어 국립 암 연구소 (https://www.cancer.gov/about-cancer/diagnosis-staging/diagnosis/tumor-markers-fact-sheet), 또는 암 유전자 및 마커 통합 데이터베이스 CGMD (http://cgmd.in/)에 나열되어 있다. 하나 이상의 추가의 마커의 사용은 일반적으로 진단, 등급화 또는 예후의 신뢰성을 높인다.

제 11 측면에서, 본 발명은 대상체로부터 수득된 시료에서 제 1 측면, 항목 (g)의 핵산분자 및/또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 종양 진단 방법에 관한 것으로, 상기 제 1 측면, 항목 (g)의 핵산분자 및/또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드의 존재는 대상체의 종양을 나타낸다.

제 12 측면에서, 본 발명은 대상체로부터 수득된 시료에서 제 1 측면, 항목 (g)의 핵산분자 및/또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드의 수준을 결정하는 단계를 포함하는 종양 및/또는 종양 예후를 등급화하는 방법에 관한 것으로, 대조군과 비교하여 상기 제 1 측면, 항목 (g)의 핵산분자 및/또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드의 증가된 수준은 종양의 더 높은 등급 및/또는 불량한 종양 예후와 양의 상관관계가 있다.

본 발명의 제 11 및 제 12 측면의 방법은 방법의 형식으로 본 발명의 제 10 측면의 용도를 구현한다. 본 발명의 제 10 측면과 관련하여 상기에 제공된 정의 및 바람직한 실시예는 본 발명의 제 11 및 제 12 측면에 동일하게 적용될 수 있다.

제 13 측면에서, 본 발명은 종양 진단 및/또는 종양 및/또는 종양 예후의 등급화를 위한 키트에 관한 것으로, 이는 (a) 대상체로부터 수득한 시료에서 제 1 측면, 항목 (g)의 핵산분자 및/또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드의 검출 및/또는 정량화를 위한 수단, 및 (b) 상기 키트의 사용 설명서를 포함한다.

본 발명의 제 13 측면의 상기 키트는 키트의 형식으로 본 발명의 제 10 측면의 용도를 수행하는데 필요한 수단을 구현한다. 이러한 이유로, 본 발명의 제 10 측면과 관련하여 상기에 제공된 정의 및 바람직한 실시예는 본 발명의 제 13 측면의 키트에 동일하게 적용될 수 있다.

제 1 측면의 핵산분자의 검출 및/또는 정량화 수단은 바람직하게는 실시예의 표 1에 나타낸 프라이머 및 프로브 중 하나 이상이 RT-qPCR에 사용되며, 더욱 바람직하게는 각각의 프로브와 관련하여 선택적으로 사용될 수 있는 특정 프라이머 쌍 중 하나이다. 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드의 검출 수단은 바람직하게는 상기 본원에 기재된 바와 같이 항체 및/또는 항체 유사체이다. 검출 및/또는 정량화를 위한, 상기 항체 및/또는 항체 유사체는 표지될 수 있고, 예를 들어 형광 염료 또는 방사성 표지로 표지될 수 있다. 형광 염료 및 방사성 표지의 예는 또한 본 명세서의 위에 설명되어 있다.

키트의 다양한 구성은 하나 이상의 바이알과 같은 하나 이상의 용기에 포장될 수 있다. 상기 바이알은, 상기 구성의 추가 외에, 보관을 위한 보존제 또는 완충액을 포함할 수 있다. 상기 키트는 사용하기 위한 사용 설명서를 포함할 수 있고, 이는 바람직하게는 종양 진단 및/또는 종양 및/또는 종양 예후의 등급화를 위해 키트의 구성을 사용하는 방법을 알려주는 것일 수 있다.

제 14 측면에서, 본 발명은 종양을 갖는 대상체에서 종양 치료의 비-효과(non-efficacy)를 모니터링하는 방법에 관한 것으로, 이는 다음을 포함한다: (a) 치료를 시작하기 전에 대상체로부터 수득한 시료에서 제 1 측면의 핵산분자 및/또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드의 양을 결정하는 것; 및 (b) 치료를 시작한 후, 한 번 이상, 대상체로부터 수득한 시료에서 제 1 측면의 핵산분자 및/또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드의 양을 결정하는 것, 여기서 a)와 비교하여 b)에서 증가된 양은 종양 치료의 비-효과를 나타내며 및/또는 a)와 비교해서 b)에서 감소된 양은 종양 치료의 효과를 나타낸다.

유사하게, 제 15 측면에서, 본 발명은 치료가 필요한 대상체에서 면역억제 요법의 비-효과(non-efficacy)를 모니터링하는 방법에 관한 것으로, 이는 다음을 포함한다: (a) 치료를 시작하기 전에 대상체로부터 수득한 시료에서 제 1 측면의 핵산분자 및/또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드의 양을 결정하는 것; 및 (b) 치료를 시작한 후, 한 번 이상, 대상체로부터 수득한 시료에서 제 1 측면의 핵산분자 및/또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드의 양을 결정하는 것, 여기서 a)와 비교하여 b)에서 감소된 양은 면역억제 요법의 비-효과를 나타내며 및/또는 a)와 비교해서 b)에서 증가된 양은 면역억제 요법의 효과를 나타낸다.

본 발명의 다른 측면과 관련하여 상기에 제공된 정의 및 바람직한 구체예는 본 발명의 제 14 및 제 15 측면에 동일하게 적용될 수 있다. 예를 들어, 제 1 측면의 핵산분자 및/또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드의 양을 결정하기 위한 수단 및 방법은 본 발명의 제 10 측면과 관련하여 상기에서 설명된다. 이러한 수단 및 방법은 본 발명의 제 14 및 제 15 측면과 관련하여 동일하게 사용될 수 있다.

상기 종양 치료는 임의의 종양 치료, 예를 들어 수술, 방사선 요법 또는 화학요법 (chemotherapy) 일 수 있다. 상기 종양 치료는 바람직하게는 화학요법이다. 화학요법은 화학치료제 (chemotherapeutic agent)의 투여를 포함한다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 화학치료제는 세포증식 억제성 (cytostatic) 화합물 및 세포 독성 (cytotoxic) 화합물을 포함한다. 전통적인 화학치료제는 대부분의 암세포의 주요 특성 중 하나인 빠르게 분열하는 세포를 죽임으로써 작용한다. 화학치료제는 탁산 (taxane), 뉴클레오시드 유사체 (nucleoside analog), 캠프토테신 유사체 (camptothecin analog), 안트라사이클린 (anthracycline) 및 안트라사이클린 유사체, 에토포시드 (etoposide), 블레오마이신 (bleomycin), 비노렐빈 (vinorelbine), 사이클로포스파미드 (cyclophosphamide), 대사길항물질 (antimetabolite), 항-유사분열제 (anti-mitotics), 및 알킬화제 (alkylating agent)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 상기 화학요법은 또한 백금 기반 일 수 있으며, 즉, 백금 기반 화합물, 예를 들어 시스플라틴의 투여를 포함한다. 화학치료제는 보통 3 내지 6 개월 동안 조합되어 투여된다. 가장 일반적인 치료법 중 하나는 AC로 알려진, 사이클로포스파미드와 독소루비신 (adriamycin; 안트라사이클린 및 안트라 사이클린 유사체 그룹에 속함)을 함께 투여하는 것이다. 때때로, 도세탁셀과 같은 탁산 약물이 추가되고, 그 다음 치료요법 (regime)은 CAT로 알려져 있다; 탁산은 암세포의 미세 소관을 공격한다. 동등한 결과를 생성하는 또 다른 일반적인 치료법은 사이클로포스파미드, 대사길항물질인 메토트렉세이트 (methotrexate) 및 뉴클레오시드 유사체인 플루오로우라실 (fluorouracil)의 투여를 포함한다 (CMF). 또 다른 표준 화학요법 치료는 플루오로우라실, 에피루비신 (epirubicin) 및 사이클로포스파미드의 투여를 포함하며 (FEC), 이는 도세탁셀과 같은 탁산 또는 비노렐빈으로 보충될 수 있다.

제 14 측면에 따른 종양은, 바람직하게는 비-루미날 (non-luminal tumor) 종양이다. 비-루미날 (non-luminal tumor)은 호르몬 수용체 (에스트로겐-수용체 및/또는 프로게스테론-수용체) 음성 종양 또는 낮은 수준의 호르몬 수용체 (에스트로겐-수용체 및/또는 프로게스테론-수용체)를 발현하는 종양이다. 유방 종양의 경우, 루미날 A (luminal A) 종양은 호르몬-수용체 양성, Her2 음성이고 낮은 수준의 Ki-67 발현이며, 루미날 B (luminal B) 종양은 (i) 호르몬-수용체 양성, Her2 음성 및 높은 수준의 Ki-67 발현, 또는 (ii) 에스트로겐-수용체 양성, 프로게스테론-수용체 음성, Her2 음성이고 낮은 수준의 Ki-67을 발현한다. 비-루미날 (non-luminal tumor) 종양은 HER2 양성 종양 및 HER2 음성 및 호르몬 수용체 (에스트로겐 수용체 및/또는 프로게스테론 수용체) 음성인 TNBC (삼중 음성 유방암)로 나눌 수 있다.

마찬가지로 면역억제 요법 (immunosupressive therapy)은 임의의 면역억제 요법 일 수 있다. 예를 들어, 면역억제 요법은 하나 이상의 면역억제 약물, 예를 들어, 글루코코르티코이드 (glucocorticoid), 세포증식 억제제 (cytostatic) 및 항체에서 선택된다. 제 15 측면에 따르면, 대상체는 이식된 장기 또는 조직 (예: 골수, 심장, 신장, 간)을 받았거나, 자가 면역 질환 또는 자가 면역 기원일 가능성이 가장 높은 질환 (예: 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 건선, 백반증, 전신 홍반성 루푸스, 유육종증, 국소 분절 사구체 경화증, 크론병, 베체트병, 천포창 (pemphigus), 강직성 척추염 및 궤양성 대장염) 이거나, 비-자가 면역 염증성 질환 (예: 장기 알레르기성 천식 조절 및 강직성 척추염)을 치료하기 위해 사용할 수 있다.

실시예 2 및 도 4 및 5에서, 화학요법에 난소암 조직의 노출 시, HLA-J 발현의 8 배 증가가 입증되었다. 유사하게, 유방암 환자에서, 화학요법 동안 HLA-J 발현의 유의한 상향조절은 화학요법에 대한 반응의 부분적 합 (subtotal response)과 양의 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌다; 실시예 3 및 도 12 참조. HLA-J 발현의 증가가 높을수록 각각의 종양 환자의 무진행 생존률 및 전체 생존률이 더 나빠졌다. 특히, 적어도 2 배, 바람직하게는 적어도 3 배, 더 바람직하게는 적어도 4 배, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 6 배 그리고 가장 바람직하게는 적어도 8 배의 증가는 더 나쁜 예후를 나타낸다.

제 16 측면에서, 본 발명은 치료를 시작하기 전에 대상체로부터 수득한 시료에서 제 1 측면, 항목 (g)의 핵산분자 및/또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드의 수준을 결정하는 것을 포함하는 종양을 갖는 대상체에서 종양 치료의 효율을 예측하는 방법으로 관한 것으로, 여기서 음성 대조군과 비교해서 제 1 측면, 항목 (g)의 핵산분자 및/또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드의 감소된 수준은 종양 치료의 효과와 양의 상관관계가 있는 것이고; 및/또는 양성 대조군과 비교해서 제 1 측면, 항목 (g)의 핵산분자 및/또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드의 수준이 실질적으로 차이가 없다면 종양 치료의 효과와 양의 상관관계가 있다.

본 발명의 다른 측면과 관련하여 상기에 제공된 정의 및 바람직한 구체예는 본 발명의 제 16 측면에 동일하게 적용될 수 있다. 예를 들어, 제 1 측면의 핵산분자 및/또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드의 양을 결정하기 위한 수단 및 방법은 본 발명의 제 10 측면과 관련하여 상기에서 설명된다. 이러한 수단 및 방법은 본 발명의 제 16 측면과 관련하여 동일하게 사용될 수 있다.

제 16 측면에서, 음성 대조군은 종양 치료에 반응하지 않은 하나 이상의 대상체로부터 얻을 수 있다. 상기 양성 대조군은 종양 치료에 반응하는 하나 이상의 대상체로부터 얻을 수 있다. 또한, 대조군의 경우, 종양 치료를 시작하기 전에 하나 이상의 대상체의 시료를 확보해야한다. 바람직하게, 음성 및/또는 양성 대조군의 하나 이상의 대상체는 바람직하게는 조사 중인 대상체에서 사용되는 것과 동일한 종양 치료를 받았으며, 및/또는 이들 하나 이상의 대상체는 조상 중인 대상체와 동일한 신체 부위의 종양을 갖는다.

시료에서 제 1 측면의 핵산분자 또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드의 발현 수준이 음성 대조군 또는 이들 유래의 미리 설정된 기준과 비교해서, 증가된 선호도로, 적어도 1.5 배 (fold), 2 배 (fold), 3 배 (fold), 4 배 (fold) 감소된 경우, 대상체는 종양 치료에 반응성일 것으로 예상된다. 또한, 시료에서 제 1 측면의 핵산분자 또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드의 발현 수준이 양성 대조군 또는 이들 유래의 미리 설정된 기준과, 증가된 선호도로, 50 % 미만, 25% 미만 및 10 % 미만으로 차이가 나면, 대상체는 종양 치료에 반응성일 것으로 예상된다.

상기 종양 치료는 바람직하게는 화학요법이다. 상기 종양은 바람직하게는 상기 정의된 바와 같고, 가장 바람직하게는 제 16 측면과 관련하여 유방암이다. 실시예 3 및 도 9 및 10에서 유방암 환자에서 HLA-J 발현 수준이 화학요법 동안 반응을 예측하는 지표임을 보여준다.

제 17 측면에서, 본 발명은 대상체로부터 수득한 시료에서 제 1 측면, 항목 (g)의 핵산분자 및/또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드의 수준을 결정하는 것을 포함하는 개체의 종양이 루미날 종양 (luminal tumor)인지 예측하는 방법에 관한 것으로; 음성 대조군과 비교해서, 제 1 측면, 항목 (g)의 핵산분자 및/또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드의 증가된 수준이고/거나, 제 1 측면, 항목 (g)의 핵산분자 및/또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드의 수준이 양성 대조군과 비교해서 실질적으로 상이하지 않으면 상기 종양이 루미날 종양 임을 가리킨다.

본 발명의 다른 측면과 관련하여 상기에 제공된 정의 및 바람직한 구체예는 본 발명의 제 17 측면에 동일하게 적용될 수 있다. 예를 들어, 제 1 측면의 핵산분자 및/또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드의 양을 결정하기 위한 수단 및 방법은 본 발명의 제 10 측면과 관련하여 상기에서 설명된다. 이러한 수단 및 방법은 본 발명의 제 17 측면과 관련하여 동일하게 사용될 수 있다.

루미날 종양은 에스트로겐 수용체 (ER)-양성인 반면 비-루미날 종양은 ER-음성이다. 상기 루미날 종양은 바람직하게는 루미날 유방암 (luminal breast cancer)이다. 루미날 유방암은 ER-양성이고 Her2-음성이다. 보조 내분비 요법 (adjuvant endocrine therapy) 및 화학요법 치료에도 불구하고, ER-양성 종양 환자는 재발 위험이 높다; 조기 및 후기 재발이 발생할 수 있다. 따라서, ER-양성 종양 환자에서, 보조화학요법 (adjuvant chemotherapy)을 겪지 않아도 되기 때문에 ER- 양성 종양 환자를 확인하는 것이 중요하다. 이러한 환자는 확장된 보조 호르몬 요법의 효과를 더 잘 받을 것이기 때문이다.

제 17 측면에서, 상기 음성 대조군은 비-루미날 종양을 갖는 하나 이상의 대상체로부터 유래될 수 있다. 상기 양성 대조군은 루미날 종양을 갖는 하나 이상의 대상체로부터 유래할 수 있다. 상기 음성 및/또는 양성 대조군의 하나 이상의 대상체는 바람직하게는 조사중인 대상체와 동일한 신체 부위의 종양을 갖는다.

시료에서 제 1 측면의 핵산분자 또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드의 발현 수준이 음성 대조군 또는 이들 유래의 미리 설정된 기준과 비교해서, 증가된 선호도로, 적어도 1.5 배 (fold), 2 배 (fold), 3 배 (fold), 4 배 (fold) 증가된 경우, 대상체는 종양 치료에 반응성일 것으로 예상된다. 또한, 시료에서 제 1 측면의 핵산분자 또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드의 발현 수준이 양성 대조군 또는 이들 유래의 미리 설정된 기준과, 증가된 선호도로, 50 % 미만, 25% 미만 및 10 % 미만으로 차이가 나면, 대상체는 종양 치료에 반응성일 것으로 예상된다.

대상체의 종양이 루미날 종양인지를 예측하는 방법에서, 상기 방법의 민감도 및 특이성을 증가시킬 것으로 예상되는 루미날 종양의 추가 마커가 조사될 수 있다. 추가 마커의 비-제한적인 예는 ESR1, PGR 및 ERBB2이다. 에스트로겐 수용체 알파 (ERα)는 ESR1 유전자에 의해 암호화되므로, ESR1의 발현은 루미날 종양을 나타낸다. PgR 유전자는 루미날 종양에서 일반적으로 발현되는 프로게스테론 수용체를 암호화한다. 마지막으로, 유전자 ERBB2는 HER2를 암호화한다. ERBB2 발현의 부재는 루미날 종양을 나타낸다.

실시예 3에 나타난 바와 같이, 루미날 유방암 환자는 가장 높은 HLA-J 발현 수준을 보였으므로, 유방암 환자의 시료에서 높은 HLA-J 발현은 유방암이 루미날 유방암임을 나타낸다. HLA-J는 루미날 종양에 대한 우수한 마커라는 것이 밝혀졌다.

제 18 측면에서, 본 발명은 대상체의 종양이 비-루미날 종양 또는 루미날 종양인지 예측하는 방법에 관한 것으로, 이는 (a) 화학요법을 시작하기 전에 대상체로부터 수득한 시료에서 제 1 측면, 항목 (g)의 핵산분자 및/또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드의 수준을 결정하는 것; (b) 화학요법을 시작한 후, 바람직하게는 화학요법의 완료 후에, 대상체로부 수득한 시료에서,제 1 측면, 항목 (g) 핵산분자 및/또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드의 수준을 결정하는 것을 포함하고, 여기서, (a)와 비교해서 (b)의 제 1 측면, 항목 (g)의 핵산분자 및/또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드의 증가된 수준은 비-루미날 종양을 나타내고, 반면에 (a)와 비교해서 (b)의 제 1 측면, 항목 (g)의 핵산분자 및/또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드의 수준이 실질적으로 상이하지 않으면 루비날 종양을 나타낸다.

본 발명의 다른 측면과 관련하여 상기에 제공된 정의 및 바람직한 구체예는 본 발명의 제 18 측면에 동일하게 적용될 수 있다. 예를 들어, 제 1 측면의 핵산분자 및/또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드의 양을 결정하기 위한 수단 및 방법은 본 발명의 제 10 측면과 관련하여 상기에서 설명된다. 이러한 수단 및 방법은 본 발명의 제 18 측면과 관련하여 동일하게 사용될 수 있다.

상기 (b)의 수준을 상기 (a)의 수준과 비교할 때, 시료에서 제 1 측면의 핵산분자 또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드의 발현 수준이, 증가된 선호도로, 적어도 1.5 배 (fold), 2 배 (fold), 3 배 (fold), 4 배 (fold) 증가된 경우, 대상체는 비-루미날 종양을 갖는 것으로 예상된다. 상기 (b)의 수준을 상기 (a)의 수준과 비교할 때, 시료에서 제 1 측면의 핵산분자 또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드의 발현 수준이, 증가된 선호도로, 50 % 미만, 25% 미만 및 10 % 미만으로 차이나면 (즉, 높거나 더 낮음), 대상체는 루미날 종양을 갖는 것으로 예상된다.

상기 비-루미날 및 루미날 종양은 바람직하게, 비-루미날 및 루미날 유방암이다.

실시예 3에서, 화학요법 시, 비-루미날 유방암 환자에서 HLA-J 발현 수준이 증가하는 반면, 루미날 유방암 환자에서 HLA-J 발현이 본질적으로 화학요법에 의해 영향을 받지 않음을 보여준다.

마지막 측면에서, 본 발명은 제 1 측면의 핵산분자 및/또는 제 2 측면의 단백질 또는 펩타이드의 저해제를 확인하는 방법에 관한 것으로, 이는 (a) 성장 조건 하에서, 제 1 측면의 핵산분자를 발현하고/거나 제 2 측면의 단백질 또는 펩타이드를 생산하는 종양세포를 면역적격 세포 (immunocompetent cell)와 함께 배양하는 단계; (i) 시험 제제의 존재 및 (ii) 상기 시험 제제의 부존재 상태에서; (b) a)i) 및 a)ii)에 대한 종양 세포의 성장을 결정하는 단계; (c) a)i)에 대해 단계 b)에서 결정된 성장을 a)ii)에 대해 단계 b)에서 결정된 성장과 비교하는 단계 포함하고, 여기서 a)ii)의 성장과 비교하여, a)i)에 대한 감소된 성장은 상기 시험 제제가 제 1 측면의 핵산분자 및/또는 제 2 측면의 단백질 또는 펩타이드의 저해제임을 나타낸다.

성장 조건은 세포 유형마다 크게 다르지만, 세포가 배양되는 인공 환경은 다음을 포함하는 적절한 용기로 변함없이 구성된다: (i) 필수 영양소 (아미노산, 탄수화물, 비타민, 미네랄)을 공급하는 기질 또는 배지, (ii) 성장 인자, (iii) 호르몬, (iv) 가스 (O₂, CO₂), (v) 조절된 물리-화학적 환경 (pH, 삼투압, 온도). 따라서, 임의의 특정 종양 세포에 대한 상기 성장 조건이 아직 확립되지 않은 경우에도 종양 세포가 성장하는 적절한 조건을 확인하는 것은 통상적인 문제이다.

정해진 (determined) 세포 성장을 결정하기 위한 기술은 당업계에 확립되어있다. 세포 성장은 다양한 방법으로 감지할 수 있다. 세포 수의 증가는 예를 들어, 염료 배제 방법 (즉, trypan blue)을 사용하여 생존 세포 만 계수하여 현미경 관찰 하에서 세포를 수동으로 계수함으로써 측정될 수 있다. 덜 까다롭고 확장 가능한 방법은 세포계수기 (cytometer)의 사용을 포함하며, 유세포 분석법을 (flow cytometry) 사용하면 세포 수 ('이벤트')를 다른 특정 매개 변수와 결합할 수 있다: 막, 세포질 또는 핵 용 형광 프로브를 사용하면 죽은/생존 세포, 세포 유형, 세포 분화, Ki-67과 같은 바이오 마커의 발현을 구별할 수 있다.

상기 시험 제제로서, 소분자, 항체 또는 항체 유사체, 압타머, siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임 또는 안티센스 핵산 분자가 사용될 수 있다. 이들 화합물의 특성은 본 발명의 제 5 측면과 관련해서 상기에서 설명된다. 본 발명의 제 5 측면에 따라 사용되는 저해제는 제 1 측면의 핵산분자 및/또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드의 저해제인 것으로 이미 알려져 있지만, 상기 시험 제제는 이러한 저해제가 되는 능력에 대한 본 발명의 마지막 측면의 방법으로 시험된다. 예를 들어, 본 발명의 제 5 측면에 따르면, 제 1 측면의 핵산분자 및/또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드를 억제하는 것으로 알려진 소분자가 사용되지만, 본 발명의 마지막 측면에 따라, 제 1 측면의 핵산분자 및/또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드를 억제할 수 있는지 아직 알려지지 않은 소분자가 상기 방법으로 구현된다. 상기 소분자는 이러한 저해제의 능력에 대하여 본 발명의 마지막 측면의 방법으로 시험된다.

면역적격 세포는 체내 항원에 노출된 후 생체 내에서 면역 반응을 생성할 수 있는 세포이다. 상기 면역적격 세포는 바람직하게는 대식세포 또는 림프구, 보다 바람직하게는 림프구, 가장 바람직하게는 자연 살해 (NK) 세포이다. 림프구 및 특히 NK 세포는 종양 세포를 특이적으로 인식하고 죽일 수 있다.

여러 시험 제제의 효율성은 대량신속처리 (high-throughput) 체재에서 동시에 결정될 수 있고, 상기 체재는 본 발명의 5 측면과 관련하여 위에서 더 자세히 설명된다.

위에서 논의되고 하기의 예로부터 알 수 있는 바와 같이, 제 1 측면의 핵산분자 및/또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드는 면역적격 세포의 인식으로부터 종양 세포를 차폐함으로써 종양 세포의 성장을 촉진하므로, 제 1 측면의 핵산분자 및/또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드를 억제하면, 면역적격 세포가 종양 세포를 더 잘 인식하여 저해하거나 죽일 수 있기 때문에, 종양 세포 성장의 감소를 초래할 것으로 예상될 수 있다. a)ii)의 성장 대비 a)i)의 성장이, 증가하는 선호도에 따라, 적어도 10 %, 적어도 20 %, 적어도 50%, 적어도 75 %, 적어도 90 %, 그리고 적어도 95 % 감소하는 경우, 상기 시험 제제는 저해제로서 자격이 있다. 가장 바람직하게는, 상기 시험 제제는 완전하게 또는 본질적으로 종양 세포의 세포 성장을 제거한다.

제 1 측면의 핵산분자 및/또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드에 대한 시험 제제의 특이성 (specificity)을 보장하기 위해, 마지막 측면의 방법은 바람직하게는 a)ii)와 비교애서 a)i)에서 제 1 측면의 핵산분자 및/또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드의 양을 결정하는 추가 단계를 포함한다. 시험 제제의 부재 시 와 비교해서 시험 제제의 존재 시에, 감소된 양 또는 활성은 제 1 측면의 핵산분자 및/또는 제 4 측면의 단백질 또는 펩타이드에 대한 시험 제제의 특이성을 나타낸다.

본 상세한 설명, 특히 청구항에서 특징화된 구체예와 관련해서, 종속항에서 언급된 각각의 구체예는 상기 종속항이 인용하는 각 청구항 (독립항 또는 종속항)의 각 구체예와 결합되도록 의도된다. 예를 들어, 3 개의 대안 A, B 및 C를 나열하는 독립 청구항 1; 3 개의 대안 D, E, 및 F를 나열하는 종속 청구항 2;와 청구항 1 및 2를 인용하고 3 개의 대안 G, H, I를 나열하는 청구항 3의 경우, 달리 특별히 언급하지 않는 한, 명세서는 A, D, G; A, D, H; A, D, I; A, E, G; A, E, H; A, E, I; A, F, G; A, F, H; A, F, I; B, D, G; B, D, H; B, D, I; B, E, G; B, E, H; B, E, I; B, F, G; B, F, H; B, F, I; C, D, G; C, D, H; C, D, I; C, E, G; C, E, H; C, E, I; C, F, G; C, F, H; C, F, I의 조합에 해당하는 구체예를 모호하지 않게 개시하는 것으로 이해되어야 한다.

유사하게, 그리고 또한 독립항 및/또는 종속항이 대안을 언급하지 않는 경우, 종속항이 복수의 이전 청구항을 다시 언급하는 경우, 여기에 포함되는 발명 주제의 모든 조합은 명시적으로 공개된 것으로 간주되는 것으로 이해된다. 예를 들어, 독립 청구항 1, 청구항 1을 인용하는 종속 청구항 2, 및 청구항 2 및 1을 모두 인용하는 종속 청구항 3의 경우, 청구항 3, 2 및 1의 발명 주제의 조합과 같이 청구항 3 및 1의 발명의 주제의 조합이 명확하고 모호하지 않게 공개된다. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 하나를 인용하는 추가의 종속 청구항 4가 존재하는 경우, 청구항 4 및 1, 청구항 4, 2 및 1, 청구항 4, 3, 및 1의 발명 주제의 조합 뿐 아니라, 청구항 4, 3, 2, 및 1의 조합이 명확하고 모호하지 않게 공개된다.

도 1. 잠재적 번역 개시 부위에서 HLA-A1, HLA-A2, HLA-G, HLA-F1, HLA-F2 및 HLA-F3의 서열 정렬. 잠재적 개시코돈은 밝은 회색 배경으로 표시된다. 공개된 공통염기 서열과 개시코돈의 차이는 노란색 배경으로 표시된다. 스플라이스 위치는 회색 배경으로 표시된다. 설명된 HLA-J의 조기 종결코돈은 회색 배경과 회색 글자로 표시된다.
도 2. 막관통 도메인으로의 전이부에서 HLA-A1, HLA-A2, HLA-G, HLA-F1, HLA-F2 및 HLA-F3의 서열 정렬. 스플라이스 위치는 회색 배경으로 표시된다. 엑손 5-엑손 6 제공부와 수용부들 사이에서 연장된 횡단 (spanning)은 HLA-J 고유 서열의 삽입에서 비롯된다. 이로써 개시된 HLA-J의 새로운 종결코돈은 회색 배경과 회색 글자로 표시된다.
도 3. HLA-J 특이적 엑손 4/엑손 5 접합부 (junction)에서 RT-qPCR 분석에 의해 정량화된 HLA-J mRNA 발현. 상대적인 mRNA 발현은 CALM2를 참조 유전자로 사용하는 40-DCT 법에 의해 결정된다. 40-DCT 값이 높을수록, 유전자 발현이 높다. PCR 방법의 지수적 특성으로 인해, 각각 1 씩 증가는 유전자 발현의 두 배를 의미한다. 3 DCT 값의 증가는 HLA-J mRNA 발현의 8 배 증가를 의미한다.
도 4. HLA-J 특이적 엑손 4/엑손 5 접합부에서 RT-qPCR 분석에 의해 정량화 된 HLA-J mRNA 발현에 의한 계층화에 기반한 신보조 치료받은 (neoadjuvantly treated) 난소암 환자의 무진행 생존 확률을 보여주는 카플란-마이어 플롯 (Kaplan Meier Plot). 상대적인 mRNA 발현은 CALM2를 참조 유전자로 사용하는 40-DCT 법에 의해 결정된다. 치료 전 및 치료 후 발현 수준의 차이는 40-DCT 계산을 기반으로 결정되었다 (위 참조). 2 DCT 이상의 변화 (즉, ≥ 2.1)는 난소암 조직이 화학요법에 노출되었을 때 HLA-J가 8 배 이상 (a > 8 fold) 증가했음을 반영한다.
도 5. HLA-J 특이적 엑손 4/엑손 5 접합부에서 RT-qPCR 분석에 의해 정량화 된 HLA-J mRNA 발현에 의한 계층화에 기반한 신보조 치료받은 난소암 환자의 전체 생존 확률을 보여주는 카플란-마이어 플롯 (Kaplan Meier Plot). 상대적인 mRNA 발현은 CALM2를 참조 유전자로 사용하는 40-DCT 법에 의해 결정된다. 치료 전 및 치료 후 발현 수준의 차이는 40-DCT 계산을 기반으로 결정되었다 (위 참조). 2.1 DCT 이상의 변화는 난소암 조직이 화학요법에 노출되었을 때 HLA-J가 8 배 이상 (a > 8 fold) 증가했음을 반영한다.
도 6. HLA-J 특이적 엑손 4/엑손 5 접합부에서 RT-qPCR 분석에 의해 정량화 된 HLA-J mRNA 발현. 상대적인 mRNA 발현은 CALM2를 참조 유전자로 사용하는 40-DCT 법에 의해 결정된다. 40-DCT 값이 높을수록 유전자 발현이 높다.
도 7. 화학요법 경험없는 유방암 조직의 치료 전 코어 바늘 생검에서 HLA-J mRNA 발현과 유방암 아형의 핵심 마커의 상관관계.
도 8. 화학요법 치료 후 잔존하는 유방암 조직의 수술 표본 (specimen)에서 HLA-J mRNA 발현과 유방암 아형의 핵심 마커의 상관관계.
도 9. 유방암 환자 유래의 치료 전 코어 바늘 생검 시료에서 종양 퇴행 등급 (Tumor Regression Grade; TRG) 상태 및 HLA-J, ESR1, ERBB2 및 KRT5 mRNA의 mRNA 발현 수준의 데이터 분포.
도 10. 유방암 환자의 치료 전 코어 바늘 생검 시료에서, TRG 상태와 HLA-J, ESR1, ERBB2 및 KRT5 mRNA의 mRNA 발현 수준의 스피어만 상관관계 (Spearman correlation).
도 11. 신보조화학요법 후 유방 종양의 HLA-J, ESR1, ERBB2 및 KRT5 mRNA의 mRNA 발현 수준과 TRG 상태의 데이터 분포. 신보조화학요법에 대해 제한된 반응성을 갖는 종양 조직은 진한 회색으로 강조 표시된다.
도 12. 신보조화학요법 후 유방암 환자의 종양 조직에서 TRG 상태와 HLA-J, ESR1, ERBB2 및 KRT5 mRNA의 mRNA 발현 수준의 스피어만 상관관계 (Spearman correlation).
도 13. 신보조화학요법 전 (왼쪽 패널)과 후 (오른쪽 패널)의 유방암 환자의 종양 조직에서 TRG 상태 (x 축)에 따른 HLA-J mRNA 발현 (y 축)의 산점도.
도 14. 유방암 환자의 종양 조직에서 TRG 상태 (x 축)에 따른 화학요법 전과 후의 HLA-J mRNA 발현 차이 (y 축)의 산점도.
도 15. HLA-J 특이적 엑손 4/엑손 5 접합부에서 RT-qPCR 분석에 의해 정량화 된 HLA-J mRNA 발현에 의한 계층화에 기반한 신보조 치료받은 유방암 환자의 무진행 생존 확률을 보여주는 카플란-마이어 플롯 (Kaplan Meier Plot). 상대적인 mRNA 발현은 CALM2를 참조 유전자로 사용하는 40-DCT 법에 의해 결정된다. 치료 전 및 후 발현 수준의 차이는 40-DCT 계산을 기반으로 결정되었다 (위 참조). 3,5 DCT 이상의 변화는, 유방암 조직이 화학요법에 노출되었을 때, HLA-J의 16 배 이상 (a > 16 fold) 증가를 반영한다.
도 16. 알파 2 및 3 도메인 영역, 막관통 도메인 및 세포질성 영역에 상응하는 연결 펩타이드의 영역에서. HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F 동형들의 단백질들, HLA-G, HLA-H 및 HLA-J의 단백질 서열 요약, 공통염기 서열은 정렬된 서열 위에 회색으로 강조 표시된다. HLA 펩타이드 서열의 차이도 회색으로 강조 표시된다. HLA-J의 예상 알파 3 도메인은 다른 HLA 유전자의 이러한 도메인 (doaim)과 다르며 회색으로 강조 표시된다. HLA-J 특이적 항체의 생성을 위한 펩타이드 서열은 "JULY 항체"로 명명된 화살표로 표시된다.
도 17. (A) 화학요법 저항성 종양을 앓고 있는 환자 (n = 4; 환자 ID: 107, 114, 116 및 128))의 난소암 조직에서 웨스턴 블롯 분석에 의한 HLA-J 단백질 발현의 증거. 각 환자에 대해, HLA-J 단백질 발현은 신보조화학요법 전 (pre) 및 후에 (post) 평가되었다. (B) 난소암 ("OC"), 유방암 ("BC"), 요로/블랙커 암 ("UC") 및 태반 조직 (plazental tissue; "P1")에서 웨스턴 블롯 분석에 의한 HLA-J 단백질 발현의 증거.
도 18. 신보조화학요법 후, 3 명의 암 환자로부터 얻은 방광 절제 표본 (CYS) 생검 시료에서 HLA-J의 종양-특이적 발현, 화학요법 치료 전, 매치된 경요도절제 (transurethral resection; TUR) 생검 시료와 정상 조직 유래의 음성 대조군 시료의 "매핑"에서는 발현이 검출되지 않았다.

실시예는 본 발명을 설명한다.

실시예 1: 비 유전자로서 HLA-J의 확인 및 각각의 엑손/엑손 경계에서 HLA-J 특정 영역의 결정.

UCSC 게놈 브라우저 (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway)에 접속하고 HLA-A1 (NM_002116.7), HLA-A2 (NM_001242758.1), HLA-G (NM_002127.5), HLA-F1 (NM_001098479.1), HLA-F2 (NM_018950.2), HLA-F3 (NM_001098478.1) 게놈 서열을 다운로드하여, HLA-J ( NR_024240.1)의 추정 서열 (putative sequence )과 서열 정렬을 수행했다. 초기 정렬 분석은 잠재적 번역 개시 영역과 세포 외 알파 도메인에서 막관통 영역으로의 잠재적 전환에 초점을 맞추 었다. Messer et al.의 이전 간행물에 따르면 (Messer G, Zemmour J, Orr HT, Parham P, Weiss EH, Girdlestone J. HLA-J, a second inactivated class I HLA gene related to HLA-G and HLA-A. Implications for the evolution of the HLA-A-related genes. J Immunol. 1992 Jun 15; 148(12):4043-53.), HLA-J는 엑손 2 또는 엑손 4에서 번역 종료를 생성하는 해로운 돌연변이 때문에 유사유전자로 간주된다. 잠재적 리딩 프래임을 분석하기 위해서, 리보솜에 의해 번역된 메신저 RNA (mRNA) 전사체의 첫 번째 코돈인, 개시코돈이 분석되었다. Messer et al.sms 다음에 따른 공통배열 시작 부위에 대한 그들의 서열 해석을 기반으로 한다: ATG-GGG-GTC-ATG-GCG-CCC-CGA-ACC-C (SEQ ID NO: 10) (도. 1, HLA-G Sequence에서 ATG는 밝은 회색 배경). 그들 그룹에 의해 클로닝된 HLA-J의 서열 분석에 따르면, G가 없는 (도 1, HLA-J 서열에서 회색 "-"), 뉴클레오티드 위치 4에서 해로운 점 돌연 변이가 관찰될 수 있고, 이는 실제로 프레임 이동을 야기한다: ATG-GGG-TCA-TGG-CGC-CCC-GAA-CCC (SEQ ID NO: 11). Messer et al.에 의해 기술된 바와 같이, 이것은 엑손 2에서 단백질 서열의 조기 종결을 초래한다. 그러나, 본 명세서에 기술된 추가 연구는 놀랍게도 위치 10의 두 번째 잠재적인 개시 부위가 있음을 밝혀냈다. 서열 분석은 5 '와 3' 말단의 두 번째 ATG의 주변 주변 뉴클레오티드는 Kozak 서열의 요건과 일치한다. 더욱이, 공개된 개시코돈 공통배열과 비교할 때, HLA-F는 Messer et al.에 개시된 바와 같이 공통배열 개시코돈을 갖지 않지만, 본 발명에 따른 HLA-J에 대한 진짜 번역 개시 부위인 두 번째 개시 부위를 갖는다. 서열 정렬을 분석 한 결과, 위치 10에서 시작하고 두 번째 ATG 부위에 번역 개시 코돈을 가질 때, HLA-J는 조기 종결을 초래하는 프레임 이동 결실을 갖지 않지만, HLA-G와 실질적으로 유사한 단백질이라는 것이 밝혀졌다. 공통배열 정렬의 "오픈 리딩 프레임 3"(ORF3)이 관련 리딩 프레임으로 확인되었으며, 이는 유사유전자를 진정한 유전자 서열로 바꾸었다.

알파 도메인에서 막관통 도메인으로의 전이부에서 HLA-A1, HLA-A2, HLA-G, HLA-F1, HLA-F2, HLA-F3 및 HLA-J의 서열 정렬이 도 2에 묘사되어 있다. NCBI 명명법을 기반으로, 엑손 5는 HLA-s의 알파 23 도메인을 암호화하고, 엑손 6은 막투과 도메인을 암호화한다. 엑손 5와 엑손 6 (회색 글자의 HLA-G 서열에 따라, 도 2에서 회색 배경색으로 표시됨) 사이의 접합부에서 스플라이스 위치 (spice site)를 볼 때, HLA-J 내에 16 개 뉴클레오티드의 삽입이, HLA-J 고유의 서열을 생성하는 반면, 이러한 스플라이싱 제공부와 수용부를 파괴한다는 것이 명백해진다. 전체 서열에서 동일한 위치 또는 다른 임의의 위치에 유사한 서열을 갖는 다른 HLA는 없다. 중요한 것은 이 영역은 스플라이싱을 위한 HLA-J 특이적 제공부와 부용부 사이에 사이에 약 570 bp의 인트론 길이를 가진 진정한 엑손 영역 (exonic region)에서 유래한다. 따라서, 이 영역은 종양 및 정상조직 시료에서 분비된 HLA-J mRNA의 존재를 증명하기 위해 특히 관심을 갖는 곳으로 선택되었다 (실시예 2 참조).

비 유사유전자 HLA-J의 엑손 구조를 HLA-G와 비교할 때, HLA-J는 특히 알파 도메인 구조 2를 암호화하는 엑손 4 동족체 (homolog)가 결여되어 있으며, HLA-G의 게놈적으로 결정된 스플라이스 변이체 동족체로서 기능한다는 것이 분명해 진다. 더욱 중요한 것은, ORF3에 기초하여 추론된 아미노산 서열, 즉 "HTFLETSQGSKTRRFL(-종결)"(SEQ ID NO: 5) 다양한 전하성 아미노산 (예: E, K, R) 및 방향족 아미노산 (F)을 포함하며, 이는 이 서열이 막관통 횡단 영역 또는 앵커가되는 것을 배제한다. 따라서 새로 확인된 HLA-J는 분명히 HLA-G와 유사한 특징을 가진 분비 단백질이지만 펩타이드 제시에 중요한 알파 2 유사 도메인이 결여된다.

실시예 2: 신보조요법으로 치료된 난소암 환자 코호트에서 역전사 (RT) 정량적 PCR (RT-qPCR)에 의한 HLA-J mRNA 발현 수준의 결정

조직학적으로 확인된 FIGO III 내지 IV 기 상피성 난소암 또는 복막암종 (peritoneal carcinoma)을 가지며 최적의 선행 수술이 적합하지 않은 것으로 새로 진단된 환자와 신보조화학요법 (neo-adjuvant chemotherapy)의 후보자 45 명 (상기 암종 (carcinoma)은 이하에서 난소암으로도 지칭됨)이 후보자 45 명이 2004 년 9 월과 2007 년 12 월 사이의 연구에 등록되었다. 기타 포함 기준은 18 세 이상의 연령, 백금-기반 화학요법에 적합한 혈액학, 신장, 간 및 심장의 기능이었다. 제외 기준은 70 % 미만의 카르노프스키 척도 (Karnofsky performance status; KPS), 다른 악성 종양의 병력 및 수술 금지 사유 였다. 최적의 용적 축소 수술 가능성은 개방 복강경 검사에 의해 기준에서 제외되었다. 45 명 환자의 초기 연구 집단은 생검 시료가 마이크로어레이 분석에 적합하지 않은 9 명의 환자와 조직학적 검토 후 복막 중피종 (peritoneal mesothelioma) 진단으로 인해 부적합 판정된 1 명의 환자를 제외하고 35 명으로 축소되었다. 카보플라틴 AUC 5 및 파클리탁셀 175 mg/m2 Q3의 표준 요법은 신-보조제 치료로서 3 주마다 3 시간에 걸쳐 6 주기 동안 투여되었다. 75 세 이상의 3 명의 환자와 불량한 척도를 갖는 1 명의 환자 (KPS 70 %)에서, 단일-약제 카보플라틴이 복합 화학요법보다 선호되었다.

조직 병리학적 반응은 수술 시료 분석을 이용해 수술 후 평가되었다. 현재까지 난소암에서 신-보조화학요법 후 치료 반응을 설명하기 위한 조직병리학적 기준이 확고하게 확립되지 않았다. 난소암 (Le et al. 2007, Sassen et al. 2007) 및 유방암 (Ogston et al. 2003)에서 1 차 화학요법에 대한 반응에 관한 문헌에 따르면, 완전한 병리학적 반응으로서, 수술 검체 (surgical specimen)에 암세포가 없음, 매우 우수한 부분 관해 (remission)로서 작은 클러스터 (<1cm) 또는 개별 암세포 만의 지속성 및 수술 이후 거시적 잔류물이 없음이 고려되었다. 부분적 병리적 관해는 수술 시 종양 부담이 30 %에서 90 % 사이로 감소하는 것으로 정의되었으나, 안정된 질병은 초기 진단 복강경 검사에 비해 수술 시, 종양 부담이 감소하지 않거나 30 % 미만으로 감소하는 것으로 정의되었다. 완전하고 매우 좋은 부분 관해를 갖는 환자만 병리학적 반응자로 간주되었고, 다른 모든 사례는 병리학적 비-반응 자로 간주되었다. 생존 분석을 위해 카플란-마이어 생존 추정 및 cox 회귀 분석에 초기 진단에서 진행 (PFS) 또는 사망 (OS)까지의 시간 또는 진행과 사망 사이의 시간 (PDT)을 사용했다. 40 명의 환자로부터 완전한 생존 데이터가 제공되었다. 데이터 종결 시점에서, PFS 중앙값은 14.7 개월이었고 OS 중앙값은 33.5 개월이었으며, 이는 연구 시작시 매우 고도한 질병의 단계를 고려할 때 높은 수치이다 (절제 불가능한 FIGO III - IV).

mRNA 검출을 위해, 수집된 조직을 즉시 동결시키고 분석할 때까지 액체 질소에 저장하였다. 약 20-100 mg의 냉동된 난소 종양 조직이 액체 질소로 분쇄되었다. RNA는 상용 키트 (Qiagen)를 사용하여 추출하였고, RNA 무결성은 Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)에서 평가했으며, cDNA는 Invitrogen 키트 (Invitrogen Corp.)를 사용하여 1 mg의 전체 RNA에서 합성하고, 다른 곳에서 설명한 바에 따라 (Ihnen et al. 2008), Affymetrix HG-U133A 마이크로어레이 (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA, USA)에서 분석했다.

검증 목적을 위해, 동일한 신선한 조직생검으로부터 분리된 총 RNA를 전술 한 바와 같이 RT-qPCR에 적용하여 독립적인 기술적 접근에 의한 어레이 데이터를 검증하였다. HLA-J의 발현 평가를 위해 유전자 특이적 TaqMan-기반 프라이머/프로브 세트를 사용했다. RT-qPCR 방법에 의한 유전자 발현의 상세한 분석을 위해, 관심 영역 옆에 있는 프라이머와 그 사이에 혼성화되는 형광 표지된 프로브를 사용했다. 표적-특이적 프라이머와 프로브는 NCBI 프라이머 설계 도구 (www.ncbi.nlm.nih.go)를 사용하여 선택되었다. 엑손/엑손 경계를 가로 질러 프라이머/프로브 서열을 위치시킴으로써 RNA- 특이적 측정을 가능하게하는 RNA-특이적 프라이머/프로브 서열을 사용하였다. 또한, 알려진 다형성 (SNP)을 가진 서열 영역에 결합하지 않도록 프라이머/프로브를 선택했다. 동일한 유전자의 여러 동형체가 존재하는 경우, 적절한 모든 관련되거나 선택된 스플라이스 변이체를 증폭하도록 프라이머를 선택했다. 모든 프라이머 쌍은 통상적인 PCR 반응으로 특이도를 확인했다. 프라이머/프로브의 추가 최적화 후, 최적의 결과를 제공하는 프라이머 및 프로브를 표 1에 나열하였다. 이들 프라이머/프로브는, 예를 들어 특이도 및 증폭 효율 측면에서, 종래 기술로부터 알려진 프라이머/프로브보다 우수하다. 시료 RNA의 양을 표준화하기 위해, CALM2가 분석된 시료에서 차별적으로 조절되지 않았기 때문에 참조 유전자로 선택되었다. 치료 전 생검 또는 치료 후 잔류물 (resectate)에 대하여 낮은 RNA 함량 (즉, CALM2에 대한 원시 CT 값이 22 미만)을 갖는 시료 쌍은 제외되었다.

HLA-J mRNA 정량에 사용되는 프라이머 및 프로브

유전자	정방향-프라이머	프로브	역방향-프라이머
HLA-J	CCTCTGTCTCTACACCTCCATTCC	AGCTCCCTCTCTGGCACCAAGCTCC	TTCCCCTGGACTCTTCAAAAAG
HLA-J	CCCTCTCTGGCACCAAGCT	AGCCTGCGACGGGTCCTTCTTCCT	GGTCCGCGTCGTGAGTGT
HLA-J	GACCCT GCTCCGCTACTACAA	CAGAGCGAGGCGGACCCCCC	AGAACCCAGGACCTCGTTATGC
HLA-J	ACCCCCCCCAAGACACA	TGACCCACCCCCCTCTCTGAACATG	GAACCCAGGACCTCGTTATGC
HLA-J	GACCAGACCCAGGACATGGA	CTCGTGGAGACCAGGCCCACAGG	TACCACAACCGCCCACTTCT
HLA-J	TGCC CAAGCCCCTC ATC	TGAGATGGGTCACACATTTCTGGAAACTTCTC	CAGGGCCATGAGGTCCTAGA
HLA-J	TGCC CAAGCCCCTC ATC	TGAGATGGGTCACACATTTCTGGAAACTTCTC	CTAGAGGAACCTCCTAGTCTTGGAAC
HLA-J	GGAAACTTCTCAAGGTTCCAAGAC	AGGTTCCTCTAGGACCTCATGGCCCTGC	CTGTGAGAGGCCAGGAAGGTA
HLA-J	GGAGCTACTCTCAGGCTGCAA	CAGCCAAAGTGCCCAGGGCTC	CTTTACAAGCCGTGAGAGACACAT
HLA-J	TGCCTTGTGTGGGACTGAGA	CAAGATTTGTTCATGCCTTCCCTTTGTGAC	CAGAAAGAGAAGTCAGGGTTCTTGA
HLA-J	CTTCCCCGATCACCTTTCCT	CAGAGAAGTGGTGCTGGGATGTCTCCAT	TACAGCTCAGTGCACCATGAAGT
HLA-J	GCTCTCGGGGACCCTGG	ATGAGGTATTTCAGCACCGCCGTTCC	CCCACGGCAATGAAGCTG
HLA-J	CCAATCAGCGTCGCGCG	ACGCACCCACCGGGACTCGGAGT	ACCCCATCGTCGGCGTC
CALM2	GAGCGAGCTGAGTGGTTGTG	TCGCGTCTCGGAAACCGGTAGC	AGTCAGTTGGTCAGCCATGCT

비교 △CT 방법에 의한 유전자 발현의 상대적 정량화를 위한 전제조건인, 표적과 대조군 증폭의 효율성이 거의 동일함을 보여주는 TaqMan® 검증 실험이 수행되었다. 생물학적 시료 내에서 관심있는 유전자의 발현 분석을 수행하기 위해, 2 개의 특이적 분석의 각 프라이머/프로브를 혼합하여 4x 이중 분석 혼합물을 준비했다. CT 값의 개별적 검출을 위해, 분석 프로브는 다른 형광 프로브로 개질되었다. 각 4x 분석-혼합물에는 2 μM의 개질되지 않은 정방향 및 역방향 프라이머와 1.2 μM의 프로브가 포함되어 있다. 각 반응에 대해, FFPE 섹션 (위 참조)에서 추출된 총 RNA 2.5 ㎕는 96 웰 광학 반응 플레이트의 한 웰에서, 2.5 ㎕ 분석 혼합물, 2.5 ㎕ 효소 혼합물 및 2.5 ㎕ 물과 혼합되었다. PCR 반응의 측정은 Versant qPCR Cycler (Siemens) 또는 Light Cycler 480 (Roche)을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 적절한 조건 (5 분 50 ℃, 1주기; 20 초 95 ℃, 1 주기; 15 초 95 ℃; 1 분 60 ℃, 40 주기)에서 수행했다.

도 3에 도시된 바와 같이, 모든 난소암 시료는 HLA-J를 발현하였다. HLA-J mRNA 발현의 동적 범위는 5 DCT 값을 포함했으며, 이는 난소암 특이적 HLA-J 발현의 최대 2⁵ 까지 상향조절 (즉, 30 배)을 의미한다. 중요하게도, 이러한 상향조절은 진행성 난소암에서 신보조화학요법 치료 후에 자주 발생했다 (신보조화학요법-전 HLA-J mRNA 수준에 대한 밝은 막대와 -후 HLA-J mRNA 수준에 대한 어두운 막대 비교). 일치하는 시료 쌍 26 개 중 14 개 (~ 50 %)에서, 화학요법 후 실질적인 HLA-J 상향조절이 관찰된 반면, 하향조절은 환자 #107에 대해서만 관찰될 수있었다. 더욱이, HLA-J 발현의 상당한 증가는 더 나쁜 결과와 일치했다. 예를 들어, HLA-J mRNA 발현이 가장 많이 증가 (즉 8 배 이상)한 세 명의 환자 환자 #106, 환자 #108 및 환자 #112는 각각 8.7 개월, 9.2 개월 및 7.9 개월의 무진행 생존 간격을 가졌다. 유사하게, 초기 진단과 사망 사이의 전체 생존 기간은 각각 10.6 개월, 12.5 개월 및 10.3 개월이었다. 대조적으로, HLA-J mRNA 발현의 현저한 감소를 보인 환자 #107은 15.1 개월의 무진행 생존 간격과 43.0 개월의 전체 생존을 가졌다. 비교를 위한 PFS 중앙값은 14.7 개월 이었고, OS 중앙값은 33.5 개월 이었다.

다음으로, 화학요법 후 잔류물 (resectate)에서 HLA-J mRNA 발현의 4 배 이상 (> 4 fold) 증가를 볼 때, HLA-J mRNA 발현의 변화가 신보조요법으로 치료된 난소암 환자에서 예후값 (prognostic value)을 갖는지 분석하였다. 이 사전 정의 된 설정 내에서, 종양의 16 %는 HLA-J 발현의 현저한 증가를 나타냈다. 실제로, 그러한 환자의 무 진행 생존율과 전체 생존율은 도 4와 5에 나타낸 것처럼 상당히 불량했다.

이들 데이터는 분비 된 형태의 HLA-J가 난소암에서 과발현된다는 것을 입증한다. 또한, 화학요법 약물에 난소암이 노출되면 그 발현이 빈번하게 증가함을 보여준다 (환자의 적어도 50%). 더욱이, 이러한 데이터는 극단적인 상향조절 (8 배 이상)이 화학요법에 대한 저항성뿐만 아니라 감소된 무 진행 생존률과 전체 생존률과도 일관되게 관련이 있음을 보여준다.

앞서 정의된 가설에 따르면, 연구자들은 이전에 잘못 분류된 "유사유전자 (pseudogene)"의 발현이 난소암에 대해 입증된 바와 같이 암에서 기능적 및 예후 적 가치가 있음을 증명할 수 있다. 암 퇴행 (cancer regression)에 대한 신보조요법 치료의 효과는 오랫동안 논의되어 왔다. 신 생물 세포의 파괴는 항원과 신생 항원이 면역계에 노출되어, 전신적인 중장기 항-종양 반응을 유발하여 궁극적으로 장기적인 생존으로 이어지는 것으로 추정된다. 종양이 이러한 항-종양 효과를 피하고 면역세포에 의한 제거에서 벗어날 수 있는 방법은 여전히 밝혀지지 않았다.

여기에서 하나의 메커니즘이 분비된 HLA-J 동형체의 상향조절을 보여 주었다. 이러한 작은 HLA-G 유사 단백질은 알파 2 도메인이 없기 때문에, 세포 독성 및 항-종양성 면역 세포 (예: T 세포)의 제시 및 활성화를 위해 펩타이드에 결합할 수 없음이 분명하다. 그러나, 항원 제시 기능은 없지만, 면역세포에 결합할 수 있는 단백질의 분비는 면역 세포의 활성 과정을 방해할 수 있어, 면역 내성을 유발하여 종양 세포의 회피를 가능하게 한다.

분비된 동형체가 막 결합되지 않았기 때문에, 침윤성 면역 세포에 결합하는 면역 활성 리간드의 구배를 구축하여 이펙터 (effector) 활성을 변경한다. 극단적인 경우, 면역세포는 항-종양에서 종양 촉진 활성으로 전환될 수 있다. 작은 크기로 인해, 분비된 HLA 동형체는 근거리 (paracrine)뿐만 아니라 원거리에서도 활성을 갖는다. 혈액에서 이러한 단편을 검출하면 항 종양 활성 및 저항성 발생 시 각각의 치료 변화를 모니터링할 수 있다. 더욱이, 이러한 면역 활성 리간드를 차단함으로써, 비-제한적인 예로 면역 치료제 (예: 면역관문억제제)를 포함하는 통상적인 및/또는 다른 항-신 생물 치료의 효과를 증가시킬 수 있다.

실시예 3: 신보조요법으로 치료된 유방암 (BC) 환자 코호트에서 역전사 (RT) 정량적 PCR (RT-qPCR)에 의한 HLA-J mRNA 발현 수준의 결정

화학요법 및 유방 수술에 대한 적절한 의학적 상태를 갖는 것으로 새롭게 진단된 조기/국부적 진행성의 BC 환자가 연구에 적합하였다. 올리고전이성 유방암 (Oligometastatic BC) 환자도 치료 프로그램에 화학요법 후 유방 수술이 포함되어 있다면 자격이 있다. BC의 조직학적 진단은 코어 니들 생검으로 확인되었다. 모든 환자의 기준에서, 신체 검사, 유방 조영술, 유방 초음파, 유방 MRI, 흉부-복부 CT 스캔, 뼈 스캔 및 18F-FDG-PET/CT 연구를 수득하였다. 신체 검사, 유방 조영술, 유방 초음파 및 18F-FDG-PET/CT 연구는 두 번의 PCT (수술 전 화학요법) 주기 후와 수술 전에 반복되었다.

안트라사이클린-계 및 탁산-계 PCT가 환자에 6 내지 8 주기로 투여되었다. 수술 (액와 림프절 절제 (axillary lymph node dissection) 포함)은 PCT 완료 후 수행되었다. 유방 보존 수술을 받은 환자는 이후 방사선 요법으로 치료를 되었다.

화학요법 후 수득한 신선한 수술 표본 (유방 및 액와 림프절)는 숙련된 유방 병리학자에 의해 평가되었다. 밀러-페인 (Miller-Payne) 분류 (classification)는 PCT에 대한 조직학적 반응을 평가하는데 사용되는 등급 시스템이었다. 에스트로겐 수용체 (ER), 프로게스테론 수용체 (PR) 및 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (HER2)는 조사된 분자 마커였다. 면역조직화학 (IHC)은 ER 및 PR 평가에 사용되었다; 양성이 되려면, 종양 핵 세포의 적어도 10 %이 염색되어야 했음. HER2 상태는 IHC로 평가되었다; HER2 양성 (HER2+ive)은 IHC에 의해 3+ 또는 FISH (fluorescent in situ hybridization)에 의한 유전자 증폭으로 2+ IHC로 정의되었다. 또한, ESR1 및 ERBB2 상태에 대한 RT-qPCR 기반 평가를 수행하여 HLA 유전자 발현과 뚜렷한 유방암 아형의 연관성을 결정하기 위한 유방암 생물학의 주요 매개변수를 정량적으로 평가했다.

표 2에 나열된 주요 특징을 갖는 새롭게 진단된 BC 환자 60명이 2004 년 7 월부터 2011 년 3 월까지 등록되었다. PCT는 9 명의 환자에게 6 주기 동안 안트라사이클린-계 및 탁산-계로 치료요법 (15%)과 45명의 환자에게 총 8 주기 동안 4 주기 안트라사이클린-계 및 탁산-계의 순차적 치료요법으로 구성된다. 마지막 화학요법 주기로부터 31 일 (d) (11 내지 52d 범위)의 중간 간격에, 두 환자를 제외한 모든 환자가 수술을 받았다. 화학요법 종료 후, 환자 13 명 (22 %)에서 전체적인 최적 병리 반응 (pR)이 관찰되었으며, 47 명 (78 %)에서 병리학적 무-반응 (pNR)이 발생했다.

유방암 코호트의 환자 특성

환자의 특성 (n=60)	n (%)
나이 (중앙값 범위)	49 (31-72 %)
단계 (%) II A/B III A/B IV 올리고전이성 (oligometastatic)	30 (50 %) 23 (38 %) 7 (12 %)
수용체 상태 ER+ive/HER_ive ER_ive/HER_ive HER+ive (+3 IHC 또는 증폭된 FISH로 2+ IHC)	31 (52 %) 15 (25 %) 14 (23 %)
화학요법 안트라사이클린/탁산 요법 (6 주기) 안트라사이클린/탁산-계 순차적 요법 (8 주기) 탁산-트라스트주맙 (4-8 주기)	9 (15 %) 45 (75 %) 6 (10 %)
수술 유방-보존 수술 + 액와 결절 절개 (axillary nodal dissection) 유방절제술 + 액와 결절 절개	34 (57 %) 24 (40 %)

mRNA 검출을 위해, 수집된 조직을 즉시 동결시키고 분석할 때까지 액체 질소에 저장하였다. 치료전 코어 바늘 생검 및 치료-후 조직 잔류물을 액체 질소로 분쇄했다. RNA는 상용 키트 (Qiagen)를 사용하여 추출하고, RNA 무결성은 Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)에서 평가했으며, cDNA는 Invitrogen 키트 (Invitrogen Corp.)를 사용하여 1 mg의 전체 RNA에서 합성하고 다른 곳에서 설명된 바에 따라 (Ihnen et al., Breast Cancer Res Treat. 2008, Volume 112, Issue 3, pp 419-427), Affymetrix HG-U133A 마이크로 어레이 (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA, USA)에서 분석했다.

검증 목적을 위해, 동일한 신선한 조직생검으로부터 분리된 총 RNA를 전술 한 바와 같이 RT-qPCR에 적용하여 독립적인 기술적 접근에 의한 어레이 데이터를 검증하였다. HLA-J의 발현 평가를 위해 유전자 특이적 TaqMan-기반 프라이머/프로브 세트를 사용했다. RT-qPCR 방법에 의한 유전자 발현의 상세한 분석을 위해, 관심 영역 옆에 있는 프라이머와 그 사이에 혼성화되는 형광 표지된 프로브를 사용했다. 시료 RNA의 양을 표준화하기 위해, CALM2, RPL37A 및/또는 GAPDH가 분석된 시료에서 차별적으로 조절되지 않았기 때문에 참조 유전자로 선택되었다. 치료 전 생검 또는 치료 후 잔류물에 대하여 낮은 RNA 함량 (즉, CALM2에 대한 원시 CT 값 22 미만)을 갖는 쌍을 이룬 시료는 제외되었다. 총 19 명의 환자로부터 충분한 RNA 품질을 가진 쌍을 이룬 치료 전 및 치료 후 시료를 제공받았다. 중요한 것은, HLA-J RT-qPCR 분석에 더하여, ESR1, MLPH, ERBB2, KRT5와 같은 아형 특이적 마커뿐만 아니라 종양의 공격성 평가를 위해 침습 마커 MMP1 및 MMP7에 대해서도 추가 RT-qPCR 측정이 완료되었다 (표 2). ESR1 상태 정의 및 아형 결정은 이전에 설명한 것과 유사하게 수행되었다 (Pentheroudakis et al.. Breast Cancer Res Treat. 2008 Jul 31; Koutoula et al., Virchows Arch. 2013 Feb; 462(2):141-54, Noske et al., Breast Cancer Res Treat. 2011 Feb; 126(1): 109-17, Wirtz et al., Breast Cancer Res Treat. 2016 Jun;157(3):437-46.).

아형 및 침습 특성 결정을 위해 사용된 프라이머 및 프로브

GenSymbol	프로브_서열	정방향_서열	역방향_서열
RPL37A	TGGCTGGCGGTGCCTGGA	TGTGGTTCCTGCATGAAGACA	GTGACAGCGGAAGTGGTATTGTAC
GAPDH	AAGGTGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTG	GCCAGCCGAGCCACATC	CCAGGCGCCCAATAG
ESR1	ATGCCCTTTTGCCGATGCA	GCCAAATTGTGTTTGATGGATTAA	GACAAAACCGAGTCACATCAGTAATAG
ESR1	CTGGAGATGCTGGACGCCC	CGTGGTGCCCCTCTATGAC	GGCTAGTGGGCGCATGTAG
MLPH	CCAAATGCAGACCCTTCAAGTGAGGC	TCGAGTGGCTGGGAAACTTG	AGATAGGGCACAGCCATTGC
MLPH	CGGGCGTCTTCTGAGAGTCAGATCTTTG	CGATGTGGACACCTCTGATGA	AGGCATTCCACAGCTGAAATATG
ERBB2	AGGCCAAGTCCGCAGAAGCCCT	TCTGGACGTGCCAGTGTGAA	CCTGCTCCCTGAGGACACAT
ERBB2	TGATCATGGTCAAATGTTGGATGATTGACTC	CCATCTGCACCATTGATGTCTAC	CGGAATCTTGGCCGACATT
MMP1	AGAGAGTACAACTTACATCGTGTTGCGGCTCA	AGATGAAAGGTGGACCAACAATTT	CCAAGAGAATGGCCGAGTTC
MMP1	ACAGAGATGAAGTCCGGTTTTTCAAAGGGA	TTGAAGCTGCTTACGAATTTGC	GTCCCTGAACAGCCCAGTACTTA
MMP7	CAGTCTAGGGATTAACTTCCTGTATGCT	GAACGCTGGACGGATGGTA	GAATGGCCAAGTTCATGAGTTG
MMP7	AGTGGGAACAGGCTCAGGACTATCTCAAGAG	CGGGAGGCATGAGTGAGCTA	GGCATTTTTTGTTTCTGAGTCATAGA
KRT5	TGGAGGGCGAGGAATGCAGACTCA	CGCCACTTACCGCAAGCT	ACAGAGATGTTGACTGGTCCAACTC

표 3의 프로브는 SEQ ID NO: 56 내지 68에 해당하고, 정방향 프라이머는 SEQ ID NO: 69 내지 81에 해당하며, 역방향 프라이머는 SEQ ID NO: 82 내지 94에 해당한다. 예를 들어, 상기 RPL37A에 대한 프로브 및 프라이머는 SEQ ID NO: 56, 69 및 82이고, GAPDH에 대한 프로브 및 프라이머는 SEQ ID NO: 57, 70 및 83이다. 비교 △CT 방법에 의한 유전자 발현의 상대적 정량화를 위한 전제조건인, 표적과 대조군 증폭의 효율성이 거의 동일함을 보여주는 TaqMan® 검증 실험이 수행되었다. 생물학적 시료 내에서 관심있는 유전자의 발현 분석을 수행하기 위해, 2 개의 특이적 분석의 각 프라이머/프로브를 혼합하여 4x 이중 분석-혼합물을 준비했다. CT 값의 개별적 검출을 위해, 분석 프로브는 다른 형광 프로브로 개질되었다. 각 4x 분석-혼합물에는 2 μM의 개질되지 않은 정방향 및 역방향 프라이머와 1.2 μM의 프로브가 포함되어 있다. 각 반응에 대해, 동결 조직 및 포르말린-고정된 파라핀-포매 (FFPE) 섹션 (위 참조)으로부터 추출된 총 RNA 2.5 ㎕는 96 웰 광학 반응 플레이트의 하나의 웰에서, 2.5 ㎕ 분석 혼합물, 2.5 ㎕ 효소 혼합물 및 2.5 ㎕ 물과 혼합되었다. PCR 반응의 측정은 Versant qPCR Cycler (Siemens) 또는 Light Cycler 480 (Roche)을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 적절한 조건 (5 분 50 ℃, 1주기; 20 초 95 ℃, 1 주기; 15 초 95 ℃; 1 분 60 ℃, 40 주기)에서 수행했다.

도 6에 도시된 바와 같이, 난소암의 결과와 유사하게 (도 3 참조) 모든 유방암 시료는 HLA-J를 발현 하였다. 다시 말하지만, HLA-J mRNA 발현의 동적 범위는 7 DCT 값을 포함하여 광범위했으며, 이는 유방암에서 HLA-J 발현의 최대 2⁷ 상향조절 (즉, 128 배)을 의미한다. 중요하게도, 이러한 상향조절은 진행성 유방암에서 신보조화학요법 치료 후에 자주 발생했다 (신보조화학요법 후 HLA-J mRNA 수준-밝은 막대와 HLA-J mRNA 수준-어두운 막대 비교). 일치하는 시료 쌍 19 개 중 10 개 (~ 50 %)에서 화학요법 후 실질적인 HLA-J 상향조절이 관찰된 반면, 하향조절은 #25 및 #29 환자에서만 관찰될 수 있었다.

ESR1 mRNA 상태는 미리 정의된 컷오프 설정에 의해 결정되었고, 이 코호트에서 반 정량적 IHC 결정과 잘 연관되었다. 예상대로 ESR1 mRNA 상태는 WNT 의존성 침입 과정에 관여하는 매트릭스 메탈로프로테아제인 삼중 음성 유방암 (TNBC) 마커 MMP7 (Spearman Rho 0.3656; p=0.0498)과 역으로 관련이 있었다. 또한, ESR1 mRNA는 ERBB2 mRNA 과발현과 연관되지 않았는데, 이는 ERBB2 양성 종양의 절반이 ESR1을 과발현하는 반면 나머지 절반은 그렇지 않기 때문인 것으로 예상된다. 이것은 분석된 유방암 코호트의 타당성과 대표성을 입증한다.

비모수적 스피어만 상관 분석 (Non parametric Spearman correlation analysis) 결과, 신보조화학요법 이전의 코어 바늘 생검 시료에서 HLA-J 발현이 ESR1 mRNA 상태 (Spearman Rho 0.5679; p=0.0090)의 과발현과 유의적으로 연관되었으며, ES1 mRNA (Spearman Rho 0.4436; p=0.0501)의 정량적 결정에 중요한 경향을 나타낸다.

중요하게도, 치료 전 HLA-J mRNA 발현은 또한 KRT5 mRNA와 강력한 상관관계가 있었다 (Spearman Rho 0.6121; p=0.0041). KRT5는 TNBC, ERBB2 및 루미날 B (Luminal B) 종양에서 발생하는 유방암의 기저 유사 특성과 관련이있는 것으로 생각된다. 이것은 기저-유사 특성을 지닌 진행성 루미날 종양은 화학요법 경험이 없는 (naive) 상황에서 HLA-J 발현이 우세하다는 것을 나타내며, 이는 침윤성 림프구의 제어에 관여하는 새로운 (de novo) HLA-J 발현을 가리킨다.

다음으로, 나머지 종양 조직의 조직병리학적 반응에 따른 신보조화학요법 후 종양 조직에서 HLA-J mRNA 발현과 분자 아형에 사용되는 치료 전 바이오마커의 상관관계를 조사하였다.

놀랍게도, 치료 후 HLA-J mRNA 발현 수준과 관련하여 아형 특이적 마커 유전자 발현의 치료 전 연관성의 완전한 변경이 관찰되었다. 예를 들어, 화학요법 미경험 조직에서 HLA-J mRNA 발현과 치료 전 ESR1 mRNA 상태 (Spearman Rho 0.5679; p=0.0090)의 강력하고 유의한 연관성이 사라졌을뿐만 아니라, 거의 반대의 중요성에 도달했다 (Spearman Rho -0.4163; p=0.0679). 유사하게, 치료 전 HLA-J mRNA 발현과 KRT5 mRNA 발현 (Spearman Rho 0.6121; p=0.0041)의 강한 연관성은 생체 내 유방암 조직의 화학요법 치료시 반전되었지만, 비교적 작은 환자에서는 유의미한 수준에 도달하지 않았다 (Spearman Rho -0.3392; p=0.01434). 이러한 발견은 화학요법 치료시 비 루미날 및 삼중 음성 유방암이 HLA-J mRNA 발현을 극적으로 상향조절하는 반면, HLA-J mRNA 발현은 루미날 종양에서 비교적 증가하지 않고 영향을 받지 않음을 입증한다. 이것은 루미날 종양 및 삼중 음성 종양에서 아형 특이적인 새로운 (de novo) 발현과 종양 세포 침윤이 감소되는 것으로 알려진 루미라 종양에서 상향조절의 부족을 보여주기 때문에 매우 중요한다 (Schmidt et al., Cancer Res. 2008 Jul 1; 68(13): 5405-13). 치료 전 시료에만 초점을 맞춘 이러한 이전의 연구와는 달리, 여기에서 취해진 독특한 접근 방식은 치료시 종양 구동 면역 세포 조절의 역학을 설명한다. 중요하게도, 종양 조직의 역 조절은 새롭게 (de novo) 치료되지 않은 환경에서 이러한 동기를 갖지 않는 종양 아형에서 특히 분명해 진다.

다음으로, HLA-J 발현의 치료 전 수준은 Ogston et al. (Breast. 2003 Oct; 12(5):320-7)의 "종양 퇴행 등급" (Tumor Regression Grade; TRG)에 따른 화학요법에 대한 반응과 상관관계가 있었다. 이 TRG 시스템은 다음과 같이 종양 퇴행 등급으로 치료시 종양 크기의 감소 정도를 정량화한다:

TRG 1: 개별 악성세포에 대한 약간의 변경이지만 전체 세포성 (cellularity)에는 감소가 없다.

TRG 2: 종양 세포의 경미한 손실이지만 전체 세포성은 여전히 높음; < 30 % 손실.

TRG 3: 종양 세포에서 30 % 내지 90 % 감소.

TRG 4 : 종양 세포의 > 90 % 손실.

도 9에 나타낸 바와 같이, 밀러-페인 (Miller-Payne) 분류 (즉, TRG1 및 TRG2; 진한 회색으로 강조 표시됨)에 따른 어떠한 감소 징후도 보이지 않는 유방 종양은 동시에 가장 높은 HLA-J mRNA 발현을 나타냈다. 또한이 종양은 더 높은 수준의 ESR1 mRNA와 더 낮은 수준의 ERBB2 mRNA를 가졌다. 이것은 신보조화학요법 치료에 거의 반응하지 않는 루미날 종양이 루미날 특징과 가장 높은 치료 전 HLA-J mRNA 수준을 가지고 있음을 보여준다. 따라서, 치료 전 HLA-J mRNA 수준이 화학요법 반응을 예측할 수 있다는 결론을 내렸다.

특정 바이오 마커 및/또는 표적 유전자의 mRNA 발현과 화학요법 반응 평가 사이의 연관성을 비교하기 위해, 각각의 연속 변수를 사용하여 스피어만 상관관계가 수행되었다. 지금까지, ESR1 mRNA 및 ERBB2는, 여러 대규모 신보조 시도에서 후향적으로 그리고 전향적으로 검증 된 바 있기 때문에 (Denkert et al., Annals of Oncology 2012), 유방암에서 신보조화학요법에 대한 유방 종양의 반응을 예측하는데 가장 좋은 반응 마커로 알려져 있다. 이 시료 세트의 스피어만 상관관계 (Spearman correlation)는 ESR1은 높은 ESR1 mRNA 수준이 낮은 종양 퇴행 등급과 관련됨을 나타내며 종양 퇴행 등급과 반비례한다는 것을 나타낸다. 이것은 이 작은 시료 세트에서 통계적 유의성에 도달하지 않았지만 이전 보고서와 일치한다 (Spearman Rho -0.2272; p=0.3495). 예상대로, ERBB2 mRNA 발현은 종양 퇴행 등급과 양의 상관관계가 있으며 높은 ERBB2 mRNA 수준은 높은 종양 퇴행 등급과 관련이 있다. 이것은 이 작은 시료 세트에서 통계적 유의성에 도달하지 않았지만 이전 보고서와 일치한다 (Spearman Rho 0.2751; p=0.2543). 대조적으로, HLA-J mRNA 발현은 높은 유의성으로 종양 퇴행 등급과 반비례한다 (Spearman Rho -0.6094; p=0.0056). 이것은 치료 전 HLA-J mRNA 수준이 신보조화학요법에 대한 반응을 예측하는 기존 유방암 마커보다 우수하며, 치료 전 코어 바늘 생검에서 높은 수준의 HLA-J는 화학요법에 대한 비반응성을 나타낸다.

다음으로, 잔류 종양 조직에서 HLA-J mRNA의 화학요법 후 mRNA 수준이 신보조화학요법에 대한 반응과 관련이 있는지를 분석 하였다.

흥미롭게도, 신보조화학요법에 대한 반응이 없거나 최소인 유방 종양의 mRNA 수준은 ESR1과 HLA-J mRNA 발현이 유사한 수준을 갖는 것으로 밝혀졌다 (도 9와 비교). 대조적으로, 화학 치료 요법 (연한 회색)에 의해 공격을 받은 종양은 HLA-J 발현이 현저하게 증가함을 보여 주었다. 참고로, 종양의 50 %는 치료 전에 가장 높은 값보다 높은 HLA-J mRNA 수준을 가졌다. 동시에 낮은 수준의 HLA-J를 갖는 종양의 빈도는 극적으로 감소했다.

종양 퇴행 등급 3 및 4가 1 차 부위에서 종양 부담의 완전한 감소는 아니지만 현저한 감소와 관련이 있다는 점에 유의하는 것이 중요한다. 그러나, 완전한 반응 만이 우수한 무진행 생존률 및 전체 생존률과 관련이 있기 때문에, 화학요법에 대한 부분적 합이나 불완전한 반응만을 보이는 종양은 더 나은 생존율을 갖지 못한다.

흥미롭게도, 치료 후 바이오마커 및/또는 표적 유전자 발현의 mRNA 수준을 볼 때, 화학요법에 대한 소계 반응 (subtotal response)을 갖는 종양은 HLA-J mRNA의 유의한 상향조절을 동시에 나타내는 잔류 기저 유사 종양 세포 (residing basal like tumor cell)에 대해 더 풍부해졌다. 증가된 치료-후 KRT5와 HLA-J의 mRNA 발현은 높은 TRG 상태와 관련이 있었다 (각각, Spearman Rho 0.5239; p=0.0256 및 Spearman Rho 0.5821; p=0.0089).

이 발견은 TRG 상태에 기초한 HLA-J mRNA 발현의 산점도 분석에 의해 추가로 조사되었다. 도 13에 나타난 바와 같이, 신보조화학요법 전 TRG2를 TRG3 및 TRG4 종양과 비교할 때, 코어 바늘 생검에서 HLA-J mRNA 발현의 중간값의 단계적 감소가 있다. 대조적으로, 화학요법 후에는, 신보조화학요법 후에 잔류 원발 질환에서 HLA-J mRNA 발현 중간값이 단계적으로 증가한다.

결론적으로, 면역 침윤이 증가된 비-루미날 종양에서 화학요법 치료시, HLA-J mRNA 발현이 4 배 내지 32 배 증가하며 (Schmidt et al., Clin Cancer Res 2008에 의해 설명 됨), 또한 이는 반응의 정도와 선형적으로 연관된다. 이것은 종양 세포의 실질적인 파괴와 수지상 세포 또는 대식세포에 침투하여 종양 항원의 노출에 의해 유발되는 압도적인 면역 반응에 대한 종양 조직의 반작용으로 간주될 수 있다.

화학요법시 HLA-J mRNA 발현의 변화의 가장 예측 가능한 값은 개별 종양 쌍에 대한 치료 후 HLA-J mRNA 수준에서 치료 전 수준을 빼서 표시할 수 있다 (도 14 참조).

마지막으로, 유방암 환자의 무진행 생존률에 대한 HLA-J mRNA 발현의 변화의 관련성을 조사 하였다. 카플란-마이어 (Kaplan Meier) 분석은 3.5 DDCT 값을 초과하는 HLA-J mRNA 발현의 증가가 무진행 생존률이 더 나쁘다는 것을 보여준다 (p=0.0096).

요약하면, 이들 결과는, 치료 전 HLA-J mRNA 발현이 유방암에서 치료 결과 및 화학요법의 효과를 예측한다는 것을 입증한다. 더욱이, 난소암의 상황과 유사하게 (실시예 1 참조), 화학요법에 의해 유도된 종양 세포의 파괴와 그에 따른 종양 병변의 인식에 의한 증가된 면역 침투에 의한 제거를 방지하기 위한 종양 조직의 반작용을 입증하는 화학요법 치료 시 HLA-J 발현의 동적 차이가 존재한다. 난소암의 상황과 유사하게, 반작용의 정도는 더 나쁜 예후와 관련된다. 따라서 종양이 면역 인식 및 파괴로 유도된 치료를 회피하는 일반적인 메커니즘이 확인되었다. 이 메커니즘의 결정은 일상적 임상 환경에 쉽게 적용할 수 있는 단순하고 재현성이 높은 분석 시스템으로 축소되었다. 더욱이, 이 일반적인 메커니즘의 종양 특이적 차이는, 제한이 아닌 예시로서 확인된, ESR1, ERBB2 및/또는 KRT5 발현 수준을 결정하여 루미날 종양 간의 차이를 보여줌으로써 입증되었다. 이전에, ESR1 mRNA 결정에 대한 감소된 예시로서 분자 아형은 모든 종류의 종양에서 치료 효과와 관련하여 또한 예후적이고 또한 예측적 가치가 있음을 보여주며, 상기 종양의 예는 유방암 (PCT/EP2014/067675; EP20140755642), 난소암 (WO2009068655A1; PCT/EP2008/066449), 방광암 (WO 2016/131875 A1; PCT/EP 2016/053372) 및 폐암 (US 9,683,229 B2; EP10721373.8)이 있다. 따라서, 유방암에 대한 제한이 아닌 예로서 설명된, 본 발명은 또한m 기저의 유사한 종양 생명작용으로 인해, 다른 원발성 종양 부위에서 발생하는 루미날 및 비-루미날 기저 종양과 관련이 있다. 따라서, 본 명세서에 개시된 회피 메커니즘의 억제는 또한 다양한 암 징후에서 현재 요법에 중요한 보조 역할을한다.

실시예 4: 암 환자의 시료에서 HLA-J 항체를 통한 HLA-J 단백질 검출

고전적 (HLA-A 내지 C), 비-고전적 (HLA-E 내지 G) 및 유사유전자 (HLA-J 및 H)의 펩타이드 서열 상동성 분석은 Geneious Alignment에서 Geneious 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 공통염기 서열은 회색으로 강조 표시되며, 그 중에서도 분석된 서열이다. 공통염기 서열에 대한 펩타이드 서열의 차이도 회색으로 강조 표시된다. 알파 3 도메인, 연결 펩타이드 및 HLA-J의 막관통 도메인은 거의 연속적으로 회색으로 강조 표시되며, 이들 영역이, 유사유전자 HLA-H와 고전적 및 비-고전적 HLA 펩타이드 서열과 비교해서, HLA-J에 대해 고유함을 보여준다. 이러한 고유성으로 인해, HLA-J 항체는 HLA-J의 고유한 알파 3 및 막관통 도메인의 C-말단에 대하여 생성되었다 (도 16). 펩타이드 서열은 알파 3 도메인, 연결 펩타이드 및 막광통 도메인의 N-말단을 횡단하는 22 개의 아미노산을 포함한다.

HLA-J의 예측된 단백질의 존재를 증명하기 위해, 화학요법에 반응하지 않은 환자 (n=4; 환자 ID: 107, 114, 116, 128)의 난소암 조직에서 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다 (도 17A). 각 환자에 대해, HLA-J 단백질 발현은 화학요법 전 (pre) 및 후에 (post) 평가되었다. 15 ㎍의 단백질 조직 용해물을 10 % SDS-PAGE 겔에서 변성 조건에서 분리하고 습식으로 니트로 셀룰로오스 막으로 옮겼다. 특정 항-HLA-J 항체 "JULY"와 함께 배양 한 후, HPR과 결합된 항-토끼 항체와 함께 인큐베이션한 후, TMB 기질을 적용한 후, 자주색 침전물이 관찰되었다. 웨스턴 블롯 분석은 약 55 kDa의 관찰된 크기를 갖는 HLA-J 단백질의 존재를 보여 주었다. 시료 107 post와 관련하여, 약 100kDa에서 추가 밴드가 검출될 수 있다. 측정된 HLA-J 단백질의 크기는 약 26,7 kDa이다. 이러한 발견은 HLA-J가 주로 이황화 결합을 생성할 수 있는 시스테인 잔기에 의해 이량체 및 사량체 형태로 존재함을 나타낸다. 놀랍게도 환자 107, 116 및 128의 내에서, 화학요법 전 (pre) 및 후 (post) 조직 간에 단백질 발현의 변화가 관찰될 수 있다. 단백질 발현은 환자 #107 및 #116에서 시료 전부터 후까지 약간 증가한다. HLA-J 단백질 발현의 강한 증가는, mRNA 발현 분석에서 관찰된 바와 같이, 환자 #128의 신보조요법으로 치료 전부터 후까지 암 조직에서 관찰될 수 있다. 이 결과는 HLA-J가 면역 회피, 특히 신보조화학요법 치료 후의 면역회피에 기여하여 화학치료요법에 대한 불충분한 반응성을 야기한다는 것을 나타낸다. HLA-J 단백질이 다른 유형의 암 및 착상 전 또는 임신 후기 단계에 존재하는지를 확인하기 위해, 다양한 암 징후와 인간 태반 조직에서 얻은 단백질 용해물을 위에서 설명한 것과 유사한 웨스턴 블롯 기술로 분석했다 (도 17). 비). 중요한 것은 HLA-J 단백질이 난소암 ("OC"), 유방암 ("BC"), 요로/블랙커 암 ("UC") 및 플레센탈 조직 ("P1")에서 검출될 수 있다는 것이다. 이것은 HLA-J 단백질 발현이 비 생리적 조건 (예: 암) 및 정의된 생리적 상황 (예: "임신")에서 발생 함을 입증한다.

실시예 5: 비-부인과 암에서 HLA-J 발현의 예측적 가치

화학요법 치료시 HLA-J 상향조절이 비-부인과 암에서도 발생하는지 평가하기 위해, 진행성 근육 침습성 방광암 (advanced, muscle invasive bladder cancer)을 앓고 있는 환자 (양쪽 성별) 유래의 조직 시료를 화학요법 전 ("TUR"; 경피적 생검)과 화학요법 후 ("CYS"; 방광 절제 조직)에 수집했다. 또한, HLA-J의 종양 특이적 발현을 증명하기 위해, 방광절개술의 잔류물로부터 비-종양 조직을 수집하였다("맵핑", 동일한 환자의 정상 조직 시료). 초기 코호트는 조직학적으로 확인된 MIBC, UICC II 단계 및 III 단계 (cT2-3 및 cN0 또는 cN + M0)를 갖는 20 명의 환자의 유래의 일치하는 조직의 시료로 구성되었다. 모든 환자는 젬시타빈 1250 mg/m² (d1; d8) 시스플라틴 70 mg/m² (d1)의 3 신보조요법 주기로 치료를 받은 후 근본적인 방광절제술 (RC)을 받았다. 적어도 50%의 종양 함량 (최소 종양 크기 5x5 mm)을 갖는 대표적인 포르말린-고정 파라핀 포매 (FFPE) 블록이 경요도 절제 ("TUR") 생검 및 방광 절제 표본 ("CYS" 시료)을 위해 선택되었고, 잘 구분된 침습 경계 (invasion border)를 가지며 괴사 부위 또는 육아종성 염증이 없는 것이 선택되었다. 조직병리학적으로 확인된 정상 조직 대조군의 경우, 동일한 방광 절제 표본에서, 종양이 없는 영역을 대표적인 FFPE 블록을 준비하기 위해 선택했다 ("매핑" 시료). RNA는 FFPE에서 추출되었고, 이에 상업적으로 이용 가능한 비드-기반 추출 방법 (XTRACT 키트; STRATIFYER Molecular Pathology GmbH, Cologne, Germany)으로 처리된 10 μm 섹션을 사용하였다. RNA를 100 ㎕ 용출 완충액으로 용출하고, RNA 용출물을 분석했다. RT-qPCR은, 위에서 설명한대로, 유전자-특이적 TaqMan®-기반 분석을 사용하여, CALM2 (하우스 키핑 유전자) 발현뿐만 아니라 HLA-J mRNA의 상대적 정량화에 사용되었다. 실험은 다음 프로토콜에 따라 Roche Light Cycler LC480 (Roche, Germany)에서 수행되었다: 50 ℃에서 5 분, 95 ℃에서 20 초, 95 ℃에서 15 초 40 주기, 60 ℃에서 60 초. 40 번의 증폭 주기가 적용되었고, 각 시료에 대한 3 개의 마커와 1 개의 참조 유전자의 주기 정량 역치 (Ct) 값을 3 회 측정의 평균으로 추정했다. Ct 값은 표적 유전자의 Ct 값 (ΔCt)에서 하우스 키핑 유전자 CALM2의 Ct 값을 빼서 정규화되었다. HLA-J 특이적 mRNA 발현은, 전술한 바와 같이, 매칭된 TUR 생검, CYS 시료 및 맵핑 시료로부터 단일-단계 RT-qPCR을 사용하여 중복 측정에 의해 결정되었다. 상대적 유전자 발현은 위에서 설명한 40-DCT 법을 사용하여 결정되었다.

중요하게도, 맵핑 시료 중 어느 것도 HLA-J의 종양 특이적 발현을 입증하는 HLA-J 발현을 나타내지 않았다. 그러나 환자 20 명 중 3 명에서 HLA-J의 종양 특이적 발현이 신보조화학요법 후 CYS 시료에서 검출될 수 있는 반면, 화학요법 치료 전의 매칭되는 TUR 생검 시료에서는 발현이 검출되지 않았다 (도 18). 이것은 종양 특이적 HLA-J 발현이 이러한 종양의 화학요법-저항성 표현형에 기여하는 화학요법에 의해 유도되었음을 나타낸다. 이것은 신보조화학요법 후 증가된 HLA-J 발현이 유방암과 난소암뿐만 아니라 방광암과 같은 비-부인과 암에서도 발생한다는 것을 증명한다. 따라서 HLA-J 발현은 다수의 부인과 및 비-부인과 종양에 존재하는 보다 일반적인 저항 메커니즘으로 간주될 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Intellexon GmbH <120> HLA-J and medical/diagnostic uses thereof <130> AA2918 PCT <150> EP 18 16 9662.6 <151> 2018-04-26 <160> 108 <170> BiSSAP 1.3 <210> 1 <211> 219 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> HLA-J protein <400> 1 Met Ala Pro Arg Thr Leu Leu Leu Leu Leu Ser Gly Thr Leu Ala Leu 1 5 10 15 Ala Glu Thr Trp Ala Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ser Trp Pro Gly Arg Gly Glu Pro Ser Phe Ile Ala Val Gly Tyr 35 40 45 Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Val Asp Ser Asp Ala Val Ser Leu 50 55 60 Arg Met Lys Thr Arg Ala Arg Trp Val Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr 65 70 75 80 Trp Asp Leu Gln Thr Leu Gly Ala Lys Ala Gln Ala Gln Thr Asp Arg 85 90 95 Val Asn Leu Arg Thr Leu Leu Arg Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Asp 100 105 110 Pro Pro Gln Asp Thr Arg Asp Pro Pro Pro Ser Leu Asn Met Arg His 115 120 125 Asn Glu Val Leu Gly Ser Gly Leu Leu Pro Cys Gly Asp His Ile Asp 130 135 140 Leu Ala Ala Gly Trp Gly Gly Pro Asp Pro Gly His Gly Ala Arg Gly 145 150 155 160 Asp Gln Ala His Arg Gly Trp Asn Leu Pro Glu Val Gly Gly Cys Gly 165 170 175 Ser Ala Phe Trp Arg Gly Thr Glu Ile His Met Pro Cys Ala Ala Gln 180 185 190 Gly Ala Ala Gln Ala Pro His Pro Glu Met Gly His Thr Phe Leu Glu 195 200 205 Thr Ser Gln Gly Ser Lys Thr Arg Arg Phe Leu 210 215 <210> 2 <211> 660 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> HLA-J ORF3 <400> 2 atggcgcccc gaaccctcct cctgctgctc tcggggaccc tggccctggc cgagacctgg 60 gcgggctccc actccatgag gtatttcagc accgccgttt cctggccggg ccgcggggag 120 cccagcttca ttgccgtggg ctacgtggac gacacgcagt tcgtgcgggt cgacagtgac 180 gccgtgagtc tgaggatgaa gacgcgggcg cggtgggtgg agcaggaggg gccggagtat 240 tgggacctac agacactggg cgccaaggcc caggcacaga ctgaccgagt gaacctgcgg 300 accctgctcc gctactacaa ccagagcgag gcggaccccc cccaagacac acgtgaccca 360 cccccctctc tgaacatgag gcataacgag gtcctgggtt ctgggcttct accctgcgga 420 gatcacattg acctggcagc gggatgggga ggaccagacc caggacatgg agctcgtgga 480 gaccaggccc acaggggatg gaaccttcca gaagtgggcg gttgtggtag tgccttctgg 540 agaggaacag agatacacat gccatgtgca gcacaagggg ctgcccaagc ccctcatcct 600 gagatgggtc acacatttct ggaaacttct caaggttcca agactaggag gttcctctag 660 <210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> HLA-J unique 16 nucleotides insertion <400> 3 tcacacattt ctggaa 16 <210> 4 <211> 49 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> HLA-J unique 3??-end <400> 4 tcacacattt ctggaaactt ctcaaggttc caagactagg aggttcctc 49 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> HLA-J unique C-terminal end <400> 5 His Thr Phe Leu Glu Thr Ser Gln Gly Ser Lys Thr Arg Arg Phe Leu 1 5 10 15 <210> 6 <211> 270 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> HLA-J alpha chain domain alpha 1 nucleotide sequence <400> 6 ggctcccact ccatgaggta tttcagcacc gccgtttcct ggccgggccg cggggagccc 60 agcttcattg ccgtgggcta cgtggacgac acgcagttcg tgcgggtcga cagtgacgcc 120 gtgagtctga ggatgaagac gcgggcgcgg tgggtggagc aggaggggcc ggagtattgg 180 gacctacaga cactgggcgc caaggcccag gcacagactg accgagtgaa cctgcggacc 240 ctgctccgct actacaacca gagcgaggcg 270 <210> 7 <211> 276 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> HLA-J alpha chain domain alpha 3 nucleotide sequence <400> 7 gacccccccc aagacacacg tgacccaccc ccctctctga acatgaggca taacgaggtc 60 ctgggttctg ggcttctacc ctgcggagat cacattgacc tggcagcggg atggggagga 120 ccagacccag gacatggagc tcgtggagac caggcccaca ggggatggaa ccttccagaa 180 gtgggcggtt gtggtagtgc cttctggaga ggaacagaga tacacatgcc atgtgcagca 240 caaggggctg cccaagcccc tcatcctgag atgggt 276 <210> 8 <211> 90 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> HLA-J alpha chain domain alpha 1 amino acid sequence <400> 8 Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Ser Thr Ala Val Ser Trp Pro Gly 1 5 10 15 Arg Gly Glu Pro Ser Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln 20 25 30 Phe Val Arg Val Asp Ser Asp Ala Val Ser Leu Arg Met Lys Thr Arg 35 40 45 Ala Arg Trp Val Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Leu Gln Thr 50 55 60 Leu Gly Ala Lys Ala Gln Ala Gln Thr Asp Arg Val Asn Leu Arg Thr 65 70 75 80 Leu Leu Arg Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala 85 90 <210> 9 <211> 92 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> HLA-J alpha chain domain alpha 3 amino acid sequence <400> 9 Asp Pro Pro Gln Asp Thr Arg Asp Pro Pro Pro Ser Leu Asn Met Arg 1 5 10 15 His Asn Glu Val Leu Gly Ser Gly Leu Leu Pro Cys Gly Asp His Ile 20 25 30 Asp Leu Ala Ala Gly Trp Gly Gly Pro Asp Pro Gly His Gly Ala Arg 35 40 45 Gly Asp Gln Ala His Arg Gly Trp Asn Leu Pro Glu Val Gly Gly Cys 50 55 60 Gly Ser Ala Phe Trp Arg Gly Thr Glu Ile His Met Pro Cys Ala Ala 65 70 75 80 Gln Gly Ala Ala Gln Ala Pro His Pro Glu Met Gly 85 90 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Consensus start site <400> 10 atgggggtca tggcgccccg aaccc 25 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Frame shift start site <400> 11 atggggtcat ggcgccccga accc 24 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-J Forward Primer <400> 12 cctctgtctc tacacctcca ttcc 24 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-J Forward Primer <400> 13 ccctctctgg caccaagct 19 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-J Forward Primer <400> 14 gaccctgctc cgctactaca a 21 <210> 15 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-J Forward Primer <400> 15 acccccccca agacaca 17 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-J Forward Primer <400> 16 gaccagaccc aggacatgga 20 <210> 17 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-J Forward Primer <400> 17 tgcccaagcc cctcatc 17 <210> 18 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-J Forward Primer <400> 18 tgcccaagcc cctcatc 17 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-J Forward Primer <400> 19 ggaaacttct caaggttcca agac 24 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-J Forward Primer <400> 20 ggagctactc tcaggctgca a 21 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-J Forward Primer <400> 21 tgccttgtgt gggactgaga 20 <210> 22 <211> 20 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Probe <400> 30 ctcgtggaga ccaggcccac agg 23 <210> 31 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-J Probe <400> 31 tgagatgggt cacacatttc tggaaacttc tc 32 <210> 32 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-J Probe <400> 32 tgagatgggt cacacatttc tggaaacttc tc 32 <210> 33 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-J Probe <400> 33 aggttcctct aggacctcat ggccctgc 28 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-J Probe <400> 34 cagccaaagt gcccagggct c 21 <210> 35 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-J Probe <400> 35 caagatttgt tcatgccttc cctttgtgac 30 <210> 36 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-J Probe <400> 36 cagagaagtg gtgctgggat gtctccat 28 <210> 37 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-J Probe <400> 37 atgaggtatt tcagcaccgc cgttcc 26 <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-J Probe <400> 38 acgcacccac cgggactcgg agt 23 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CALM2 Probe <400> 39 tcgcgtctcg gaaaccggta gc 22 <210> 40 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-J Reverse Primer <400> 40 ttcccctgga ctcttcaaaa ag 22 <210> 41 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-J Reverse Primer <400> 41 ggtccgcgtc gtgagtgt 18 <210> 42 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-J Reverse Primer <400> 42 agaacccagg acctcgttat gc 22 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-J Reverse Primer <400> 43 gaacccagga cctcgttatg c 21 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-J Reverse Primer <400> 44 taccacaacc gcccacttct 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-J Reverse Primer <400> 45 cagggccatg aggtcctaga 20 <210> 46 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-J Reverse Primer <400> 46 ctagaggaac ctcctagtct tggaac 26 <210> 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Artificial Sequence <220> <223> Variable loop <400> 55 Cys Gly Pro Cys 1 <210> 56 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RPL37A Probe <400> 56 tggctggcgg tgcctgga 18 <210> 57 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Probe <400> 57 aaggtgaagg tcggagtcaa cggatttg 28 <210> 58 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ESR1 Probe <400> 58 atgccctttt gccgatgca 19 <210> 59 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ESR1 Probe <400> 59 ctggagatgc tggacgccc 19 <210> 60 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MLPH Probe <400> 60 ccaaatgcag acccttcaag tgaggc 26 <210> 61 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MLPH Probe <400> 61 cgggcgtctt ctgagagtca gatctttg 28 <210> 62 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ERBB2 Probe <400> 62 aggccaagtc cgcagaagcc ct 22 <210> 63 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ERBB2 Probe <400> 63 tgatcatggt caaatgttgg atgattgact c 31 <210> 64 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP1 Probe <400> 64 agagagtaca acttacatcg tgttgcggct ca 32 <210> 65 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP1 Probe <400> 65 acagagatga agtccggttt ttcaaaggga 30 <210> 66 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP7 Probe <400> 66 cagtctaggg attaacttcc tgtatgct 28 <210> 67 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP7 Probe <400> 67 agtgggaaca ggctcaggac tatctcaaga g 31 <210> 68 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRT5 Probe <400> 68 tggagggcga ggaatgcaga ctca 24 <210> 69 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RPL37A Forward Primer <400> 69 tgtggttcct gcatgaagac a 21 <210> 70 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Forward Primer <400> 70 gccagccgag ccacatc 17 <210> 71 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ESR1 Forward Primer <400> 71 gccaaattgt gtttgatgga ttaa 24 <210> 72 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ESR1 Forward Primer <400> 72 cgtggtgccc ctctatgac 19 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MLPH Forward Primer <400> 73 tcgagtggct gggaaacttg 20 <210> 74 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MLPH Forward Primer <400> 74 cgatgtggac acctctgatg a 21 <210> 75 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ERBB2 Forward Primer <400> 75 tctggacgtg ccagtgtgaa 20 <210> 76 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ERBB2 Forward Primer <400> 76 ccatctgcac cattgatgtc tac 23 <210> 77 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP1 Forward Primer <400> 77 agatgaaagg tggaccaaca attt 24 <210> 78 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP1 Forward Primer <400> 78 ttgaagctgc ttacgaattt gc 22 <210> 79 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP7 Forward Primer <400> 79 gaacgctgga cggatggta 19 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP7 Forward Primer <400> 80 cgggaggcat gagtgagcta 20 <210> 81 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRT5 Forward Primer <400> 81 cgccacttac cgcaagct 18 <210> 82 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RPL37A Reverse Primer <400> 82 gtgacagcgg aagtggtatt gtac 24 <210> 83 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Reverse Primer <400> 83 ccaggcgccc aatag 15 <210> 84 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ESR1 Reverse Primer <400> 84 gacaaaaccg agtcacatca gtaatag 27 <210> 85 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ESR1 Reverse Primer <400> 85 ggctagtggg cgcatgtag 19 <210> 86 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MLPH Reverse Primer <400> 86 agatagggca cagccattgc 20 <210> 87 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MLPH Reverse Primer <400> 87 aggcattcca cagctgaaat atg 23 <210> 88 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ERBB2 Reverse Primer <400> 88 cctgctccct gaggacacat 20 <210> 89 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ERBB2 Reverse Primer <400> 89 cggaatcttg gccgacatt 19 <210> 90 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP1 Reverse Primer <400> 90 ccaagagaat ggccgagttc 20 <210> 91 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP1 Reverse Primer <400> 91 gtccctgaac agcccagtac tta 23 <210> 92 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP7 Reverse Primer <400> 92 gaatggccaa gttcatgagt tg 22 <210> 93 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP7 Reverse Primer <400> 93 ggcatttttt gtttctgagt cataga 26 <210> 94 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRT5 Reverse Primer <400> 94 acagagatgt tgactggtcc aactc 25 <210> 95 <211> 177 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> NM_001098479.1 <400> 95 cacgcacccc gcgggactca tatttttccc agacgcggag gttggggtca tggcgccccg 60 aagcctcctc ctgctgctct caggggccct ggccctgacc gatacttggg cgggctccca 120 ctccttgagg tatttcagca ccgctgtgtg cggcccggcc gcggggagcc ccgctac 177 <210> 96 <211> 178 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> NM_018950.2 <400> 96 cacgcacccc gcgggactca tatttttccc agacgcggag gttggggtca tggcgccccg 60 aagcctcctc ctgctgctct caggggccct ggccctgacc gatacttggg cgggctccca 120 ctccttgagg tatttcagca ccgctgtgtc gcggcccggc cgcggggagc cccgctac 178 <210> 97 <211> 178 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> NM_001098478.1 <400> 97 cacgcacccc gcgggactca tatttttccc agacgcggag gttggggtca tggcgccccg 60 aagcctcctc ctgctgctct caggggccct ggccctgacc gatacttggg cgggctccca 120 ctccttgagg tatttcagca ccgctgtgtc gcggcccggc cgcggggagc cccgctac 178 <210> 98 <211> 179 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> NR_024240.1 <400> 98 ccacgcaccc accgggactc ggagtctccc cagacgccga cgatggggtc atggcgcccc 60 gaaccctcct cctgctgctc tcggggaccc tggccctggc cgagacctgg gcgggctccc 120 actccatgag gtatttcagc accgccgttt cctggccggg ccgcggggag cccagcttc 179 <210> 99 <211> 178 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> NM_002127.5 <400> 99 tcgctcaccc acccggactc attctcccca gacgccaagg atggtggtca tggcgccccg 60 aaccctcttc ctgctgctct cgggggccct gaccctgacc gagacctggg cgggctccca 120 ctccatgagg tatttcagcg ccgccgtgtc ccggcccggc cgcggggagc cccgcttc 178 <210> 100 <211> 180 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> NM_002116.7 <400> 100 gcacgcaccc accgggactc agattctccc cagacgccga ggatggccgt catggcgccc 60 cgaaccctcc tcctgctact ctcgggggcc ctggccctga cccagacctg ggcgggctcc 120 cactccatga ggtatttctt cacatccgtg tcccggcccg gccgcgggga gccccgcttc 180 <210> 101 <211> 180 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> NM_001242758.1 <400> 101 gcacgcaccc accgggactc agattctccc cagacgccga ggatggccgt catggcgccc 60 cgaaccctcc tcctgctact ctcgggggcc ctggccctga cccagacctg ggcgggctcc 120 cactccatga ggtatttctt cacatccgtg tcccggcccg gccgcgggga gccccgcttc 180 <210> 102 <211> 159 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> NM_001098479.1 <400> 102 cacgaggggc tgccccagcc cctcatcctg agatgggagc agtctcccca gcccaccatc 60 cccatcgtgg gcatgttgct ggccttgttg tccttggagc tgtggtcact ggagctgtgg 120 tcgctgctgt gatgtggagg aagaagagct cagatagaa 159 <210> 103 <211> 160 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> NM_018950.2 <400> 103 cacgaggggc tgccccagcc cctcatcctg agatgggagc agtctcccca gcccaccatc 60 cccatcgtgg gcatcgttgc tggccttgtt gtccttggag ctgtggtcac tggagctgtg 120 gtcgctgctg tgatgtggag gaagaagagc tcagatagaa 160 <210> 104 <211> 123 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> NM_001098478.1 <400> 104 agcagtctcc ccagcccacc atccccatcg tgggcatcgt tgctggcctt gttgtccttg 60 gagctgtggt cactggagct gtggtcgctg ctgtgatgtg gaggaagaag agctcagata 120 gaa 123 <210> 105 <211> 150 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> NR_024240.1 <400> 105 cacaaggggc tgcccaagcc cctcatcctg agatgggtca cacatttctg gaaacttctc 60 aaggttccaa gactaggagg ttcctctagg acctcatggc cctgctacct tcctggcctc 120 tcacaggacg ttttcttccc gcagatagaa 150 <210> 106 <211> 160 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> NM_002127.5 <400> 106 catgaggggc tgccggagcc cctcatgctg agatggaagc agtcttccct gcccaccatc 60 cccatcatgg gtatcgttgc tggcctggtt gtccttgcag ctgtagtcac tggagctgcg 120 gtcgctgctg tgctgtggag aaagaagagc tcagattgaa 160 <210> 107 <211> 160 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> NM_002116.7 <400> 107 catgagggtc tgcccaagcc cctcaccctg agatgggagc tgtcttccca gcccaccatc 60 cccatcgtgg gcatcattgc tggcctggtt ctccttggag ctgtgatcac tggagctgtg 120 gtcgctgccg tgatgtggag gaggaagagc tcagatagaa 160 <210> 108 <211> 160 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> NM_001242758.1 <400> 108 catgagggtc tgcccaagcc cctcaccctg agatgggagc tgtcttccca gcccaccatc 60 cccatcgtgg gcatcattgc tggcctggtt ctccttggag ctgtgatcac tggagctgtg 120 gtcgctgccg tgatgtggag gaggaagagc tcagatagaa 160

Claims

면역억제제, 암백신 또는 임신촉진제로 사용을 위한 핵산분자, 벡터, 숙주세포, 또는 단백질 또는 펩타이드, 또는 이들의 조합,
(I) 상기 핵산분자는
(a) SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열로 이루어지거나 이를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하고; 또는
(b) SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 서열로 이루어지며; 또는
(c) SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 70 %, 바람직하게는 적어도 80 %의 상동성, 더욱 바람직하게는 적어도 90 %의 상동성, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 95 %의 상동성인 폴리펩타이드를 암호화하고; 또는
(d) SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 70 %의 상동성, 바람직하게는 적어도 80 %의 상동성, 더욱 바람직하게는 적어도 90 %의 상동성, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 95 %의 상동성인 뉴클레오티드 서열로 이루어지며; 또는
(e) (d)의 핵산분자에 대하여 축퇴되는 뉴클레오티드 서열로 이루어지고; 또는
(f) (a) 내지 (e) 중 어느 하나의 핵산분자의 단편으로, 상기 단편은 적어도 150 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 300 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 적어도 450 뉴클레오티드, 및 가장 바람직하게는 적어도 600 뉴클레오티드를 포함하며; 또는
(g) (a) 내지 (f) 중 어느 하나의 핵산분자에 해당하며, 여기서 T가 U로 치환되고;
(II) 상기 벡터는 (I)의 핵산분자를 포함하며;
(iii) 상기 숙주세포는 (II)의 벡터로 형질전환, 형질도입 또는 형질감염되고; 및
(iv) 상기 단백질 또는 펩타이드는 (I)의 핵산분자에 의해 코딩된다.
면역활성화제 (immunoactivator)로 사용, 바람직하게는 종양 치료에 사용하기 위한 제1항에 정의된 핵산분자의 저해제 및/또는 제1항에 정의된 단백질의 결합분자, 바람직하게는 제1항에 정의된 단백질의 저해제.
제2항에 있어서,
상기 (i) 핵산분자의 저해제는 소분자 (small molecule), 압타머, siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임, 안티센스 핵산분자, CRISPR-Cas9-기반 구조체, CRISPR-Cpf1-기반 구조체, 메가뉴클레아제, 징크핑거 뉴클레아제, 및 전사 활성화제-유사 이펙터 (transcription activator-like (TAL) effector; TALE) 뉴클레아제로부터 선택되고, 및/또는
(ii) 상기 단백질의 결합분자, 바람직하게는 상기 단백질의 저해제는 소분자 (small molecule), 항체 또는 항체 유사체 (antibody mimetic), 압타머로부터 선택되고, 상기 항체 유사체는 바람직하게 애피바디 (affibody), 애드넥틴(adnectin), 안티칼린 (anticalin), 다핀(DARPin), 아비머 (avimer), 나노피틴 (nanofitin), 아피린 (affilin), 쿠니츠 도메인 펩타이드 (Kunitz domain peptides), 피노머스 (Fynomers®), 삼중 특이적 결합 분자 (trispecific binding molecule) 및 프로바디 (probody)로부터 선택된 것인 결합분자, 바람직하게는 저해제.
대상체로부터 수득한 시료에서 종양의 진단 및/또는 종양의 등급 평가 및/또는 종양의 예후 예측 및/또는 HLA-J 저발현 종양 또는 HLA-J 고발현 종양으로 종양의 분류 및/또는 착상실패 (implantation failure)의 진단을 위한 청구항 1의 (I) (g)에 정의된 핵산분자 또는 청구항 1에 정의된 단백질 또는 펩타이드의 용도.
대상체로부터 수득한 시료에서 청구항 1의 (I) (g)에 정의된 핵산분자 및/또는 청구항 1에 정의된 단백질 또는 펩타이드의 존재를 검출하는 것을 포함하고, 상기 청구항 1의 (I) (g)에 정의된 핵산분자 및/또는 청구항 1에 정의된 단백질의 존재는 대상체에서 종양을 나타내는 것인, 종양을 진단하는 방법.
대상체로부터 수득한 시료에서 청구항 1의 (I) (g)에 정의된 핵산분자 및/또는 청구항 1에 정의된 단백질 또는 펩타이드의 수준 (level)을 결정하는 것을 포함하고, 대조군과 비교하여 청구항 1의 (I) (g)에 정의된 핵산분자 및/또는 청구항 1에 정의된 단백질 또는 펩타이드의 증가된 수준은 더 높은 등급의 종양 및/또는 불리한 종양 예후와 관계 있는 것인 종양의 등급 평가 및/또는 종양 예후를 예측하는 방법.
(a) 대상체로부터 수득한 시료에서 청구항 1의 (I) (g)에 정의된 핵산분자 및/또는 청구항 1에 정의된 단백질 또는 펩타이드의 검출 및/또는 정량화를 위한 수단 (mean), 및
(b) 키트를 사용하기 위한 사용설명서 (instruction)
를 포함하는 종양의 진단 및/또는 종양의 등급 평가 및/또는 종양 예후 예측을 위한 키트.
(a) 치료를 시작하기 전에 대상체로부터 수득한 시료에서 청구항 1의 (I) (g)에 정의된 핵산분자 및/또는 청구항 1에 정의된 단백질 또는 펩타이드의 양을 결정하는 단계; 및
(b) 치료를 시작한 후, 한 번 이상, 대상체로부터 수득한 시료에서 청구항 1의 (I) (g)에 정의된 핵산분자 및/또는 청구항 1에 정의된 단백질 또는 펩타이드의 양을 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 a)와 비교하여 b)에서 증가된 양은 종양 치료의 비-효과를 나타내며 및/또는 a)와 비교해서 b)에서 감소된 양은 종양 치료의 효과를 나타는 것인 종양을 갖는 대상체에서 종양 치료의 비-효과(non-efficacy) 를 모니터링하는 방법.
(a) 치료를 시작하기 전에 대상체로부터 수득한 시료에서 청구항 1의 (I) (g)에 정의된 핵산분자 및/또는 청구항 1에 정의된 단백질 또는 펩타이드의 양을 결정하는 단계; 및
(b) 치료를 시작한 후 한 번 이상 대상체로부터 수득한 시료에서 청구항 1의 (I) (g)에 정의된 핵산분자 및/또는 청구항 1에 정의된 단백질 또는 펩타이드의 양을 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 a)와 비교하여 b)에서 감소된 양은 면역억제 치료의 비-효과를 나타내며 및/또는 a)와 비교해서 b)에서 증가된 양은 면역억제 치료의 효과를 나타는 것인 치료가 필요한 대상체에서 면역억제 요법 (immunosuppressive therapy)의 비-효과(non-efficacy)를 모니터링하는 방법.
상기 종양(tumor)은 암(cancer)인 제1항의 핵산분자, 벡터, 숙주세포, 및/또는 단백질 또는 펩타이드, 또는 이들의 조합, 제2항 또는 제3항의 결합분자, 바람직하게는 저해제, 제4항의 용도, 제5항, 제6항 또는 제8항의 방법, 또는 제7항의 키트.
제10항에 있어서,
상기 암은 유방암, 난소암, 자궁내막암, 질암, 외음부암, 방과암, 침샘암, 췌장암, 갑상선암, 신장암, 폐암, 상부 위장관 관련 암, 대장암, 결장암, 전립선암, 두경부 편평세포암, 자궁경부암, 교모세포종, 악성복수, 림프종 및 백혈병으로 이루어진 군에서 선택된 것인 핵산분자, 벡터, 숙주세포, 및/또는 단백질 또는 펩타이드, 또는 이들의 조합, 결합분자, 바람직하게는 저해제, 용도, 방법 또는 키트.
제10항에 있어서,
상기 암은 부인과 암인 핵산분자, 벡터, 숙주세포, 및/또는 단백질 또는 펩타이드, 또는 이들의 조합, 결합분자, 바람직하게는 저해제, 용도, 방법 또는 키트
제10항에 있어서,
상기 암은 유방암 또는 난소암인 핵산분자, 벡터, 숙주세포, 및/또는 단백질 또는 펩타이드, 또는 이들의 조합, 결합분자, 바람직하게는 저해제, 용도, 방법 또는 키트.
전항 중 한 항에 있어서,
상기 시료는 체액 또는 장기의 조직 시료인 핵산분자, 벡터, 숙주세포, 및/또는 단백질 또는 펩타이드, 또는 이들의 조합, 결합분자, 바람직하게는 저해제, 용도, 방법 또는 키트.