WO2005080570A1 - 乳癌の術後予後予測に関与する遺伝子 - Google Patents

Abstract

乳癌における遺伝子発現をゲノムワイドにかつ網羅的に解析した結果に基づき、乳癌患者の術後予後を遺伝子発現の観点から予測するシステムを提供することを課題とする。ヒト遺伝子の遺伝子発現をDNAマイクロアレイにより網羅的に解析し、様々な状態にある乳癌の遺伝子発現機能を比較することにより、乳癌術後予後予測システムを確立した。

Description

明 細 書 乳癌の術後予後予測に関与する遺伝子 技術分野

本発明は、 乳癌の術後予後予測に関与する遺伝子に関する。 さらに、 この遺伝 子を使った乳癌の術後予後の検査方法、 乳癌の術後予後を制御する癌治療 のス クリーニング方法、 及び乳癌の術後予後の診断キットに関する。 背景技術

乳癌は女性の癌死亡率の上位原因に位置する疾患であるが、 いまだに生物学的 見地からの悪性度、 生存予後を規定する有力な因子は見出されていない。

エストロゲンレセプ夕一 （E R ) の状態はヒト乳癌についての、 臨床及び生物 学的な症状の 1つの決定要素である。 アジュバントホルモン治療は、 年齢、 閉経 期の状態、 腋窩リンパ節'（axillary node) の関与、 あるいは腫瘍径にかかわらず E R陽性の乳癌患者において通常有効である； しかしながら、 E R陰性乳癌は、 この治療方法に対して抵抗性がある（J Clin Oncology (2001) 19， 3817-1827.、Breast Cancer (2001) 8,298-304.) 。 E R陰性腫瘍を持っている患者が、 化学療法に対し て同じ応答をいつも示すものではない。 そして、 現存する指標では、 臨床の症状 によりこのタイプの乳癌を分別することができないことから、 手術後の予後は、 多様であると言える （J Natl Cancer Inst (1991) 83, 154-155.、 J Natl Cancer Inst (2000) 93, 979-989.) 。

また、 リンパ節転移の無い乳癌患者 （node陰性乳癌； ηθ) の予後は、 転移乳癌 患者におけるよりは良い。 しかし、 日本において、 本発明者らは、 node陰性乳癌 患者の 16 %が最初の手術後 5年以内に再発することを見出している （Clin Cancer Res (2000) 6,3193-3198.) 。

乳癌患者の術後予後予測は、 現在利用できるアジュバント （adjuvant) 治療の 観点から重要性が増している。 術後に再発しそうな患者を同定することに役立つ 遺伝子マーカーは、 ハイリスクな患者に適当な術前アジュパント療法を行い得る 利益をもたらし、不要かつ煩雑で不快な副作用をもたらすことが阻止可能となる。 従来、 個々の患者のための術後の処置決定は腫瘍径及びステージ、 リンパ節へ の転移、 臨床病理学的因子による診断、 及びホルモンレセプターの検索などによ り行われてきたが、 決定的な方法ではなかった （Cancer (1982) 50, 2131-2138.、 Histopathology (1991) 19, 403-410·、 Int JCancer (1996) 69, 135-141.、 Am J Clin Oncol (1997) 20,546-551.、 Eur J Cancer (2002) 38, 1329-1334.、 Jpn JCancerRes (2000) 91 ,293-300.) 。

近年、 術後の乳癌患者の予後マーカーとして遺伝子の変異の重要性を決定しよ うとしたものがある。 これらの遺伝子の変異には p53の変異 （Breast Cancer Res Treat (2001) 69, 65-68.) 、 いくつかの対立遺伝子でのヘテロ接合性の欠失 （Int J Clin Oncol (2001) 6, 6-12.) 、 BRCA2遺伝子 (Int J Cancer (2002) 198, 879-882.) 、 WTl遺伝子 (Clin Cancer Res (2002) 8, 1167-1171) 、 HER2/neu遺伝子 （Arch Surg (2000) 135, 1469-1474.) 、 及び Ki-67遺伝子 (J Pathol (1999) 187, 207-216.) の異 常な発現を含む。 しかしながら、 癌が多遺伝子の異常の集積による疾患であるこ とを考えると、 有効な予後予測手段とは言いがたい。

さらに、 近年各種生物におけるゲノムプロジェクトが進められており、 ヒト遺 伝子をはじめとして、 多数の遺伝子とその塩基配列が急速に明らかにされつつあ る。 配列の明らかにされた遺伝子の機能については、 各種の方法で調べることが できる。 その有力な方法の一つとして、 明らかにされた塩基配列情報を利用した 遺伝子発現解析が知られている。 例えば、 ノーザンハイブリダィゼーシヨンに代 表されるような、 各種の核酸—核酸間ハイブリダィゼーション反応や各種の P C R反応を利用した方法が開発され、 当該方法により各種遺伝子とその生体機能発 現との関係を調べることができる。 これらの方法では適用し得る遺伝子の数に制 限があるが、 今日のゲノムプロジェクトを通して明らかにされつつあるような、 一個体レベルという極めて多数の遺伝子の総合的 ·系統的解析を行うために、 多 数遺伝子の一括発現解析を可能とする DNAマイクロアレイ法 （DNAチップ法） と呼ばれる新しい分析法、 及び方法論が開発されてきた。 DNAマイクロアレイとしては、リソグラフィ一技術を応用して区画化された多 数のセル上に DNA合成を行ったもの （USP 5445934) 、 基盤上に溝又は穴で区画 を形成し、 該区画の内壁にプローブを固定化したもの （特開平 11-108928号、 特開 2000-78998号） 、 チップ上に固定するプローブ量を多くするために、 アクリルァ ミ ド等のゲルにプローブを固定したマイクロアレイ （USP5770721、 特開 2000-60554号） 等、 多数の形状物が知られている。

また、 核酸固定化ゲルを保持する核酸固定化ゲル保持繊維配列体を作製し、 こ の配列体を配列体の繊維軸と交差する方向に切断することにより得られるマイク ロアレイも知られている （特開 2000-270878号、 特開 2000-270879号） 。

最近の研究により、 癌診断のための新規な遺伝子マーカ一の同定に cDNAマイ クロアレイ技術が有効であることがわかった。 現在までに、 数人の研究者が乳癌 のマイクロアレイ分析を行っているが、 乳癌の術後予後予測の可能な乳癌遺伝子 発現特性のデ一夕を記述したものはない （Proc Natl Acad Sci U SA (1999) 96, 9212-9217.、 Nature (2000) 406, 747-752.、 Proc Natl Acad Sci U S A (2001) 98,11462-11467.、 Cancer Res (2001) 61 , 5979-5984.、 Cancer Res (2000) 60, 2232-2238. , Cancer Res (2001) 61， 5168-5178.、 Proc Natl Acad Sci U S A (2001) 98, 10869-10874.) 。 一つの例外として、 リンパ節の転移陰性腫瘍の特定のプロフィ ールが、 遠隔転移への進行前の短い間隔を予測することを示す。 （N Engl J Med (2002) 347， 1999-2009.) 。 発明の開示

本発明の目的は、 乳癌における遺伝子発現をゲノムワイドにかつ網羅的に解析 した結果に基づき、 乳癌患者の術後予後を遺伝子発現の観点から予測する画期的 な手段を提供することを課題とする。

本発明は、 ヒト遺伝子の遺伝子発現を D N Aマイクロアレイにより網羅的に解 祈し、 様々な状態にある乳癌の遺伝子発現機能を比較することにより、 乳癌術後 予後予測システムを確立した。

すなわち、 本発明は、 以下の （1 ) ~ ( 8 ) の遺伝子 （群） である。 ( 1 ) 乳癌の術後予後予測に関与する以下の定義の少なくとも 1よりなる遺伝 子；

1 ) エストロゲンレセプ夕一陰性の乳癌において、 外科手術後 5年以内に死亡 した乳癌患者からの遺伝子（5y-Dグループ）と数年以上無病（disease-free) 生存した患者からの遺伝子 （5y-Sグループ） とが、 その発現機能によって 区別することができたマ一力一遺伝子群。

2 )手術時にリンパ節への転移がなかった （node陰性） （ηθ) 乳癌において、 手術後 5年以内に再発した ηθ乳癌患者からの遺伝子 （5Y-Rグループ） と 5 年以上の間無病生存した患者からの遺伝子 （5Y-Fグループ） とが、 その 発現機能によって区別することができたマーカ一遺伝子群。

3 ) 原発性乳癌において、 外科手術後 5年以内に死亡した乳癌患者からの遺伝 子 （5Dグループ） と数年以上無病生存した患者からの遺伝子 （5Sダル一 プ）とが、その発現機能によって区別することができたマーカ一遺伝子群。

( 2 ) 原発性乳癌の術後予後予測に関与する以下の配列より選ばれる遺伝子； pro-alpha- 1 type 3 collagen (PIIIP)、

complement component Clr、

dihydropyrimidinase-like 3 (DPYSL3)

protein tyrosine kinase 9-like (PTK9L)、

carboxypeptidase E (CPE)> ·

alpha-tubulin、

beta-tubulin、

heat shock protein HSP 90-alpha gene、

malate dehydrogenase >

NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 beta subcomplex, 3 (NDUFB3)。

( 3 ) 原発性乳癌の術後予後予測に関与する予後の良い群で高発現する以下か ら選ばれる遺伝子；

pro-alpha- 1 type 3 collagen (PIIIP)>

complement component Clr、 dihy dr opyrimidinas e-like 3 (DPYSL3)、

protein tyrosine kinase 9-like (PTK9L)、

carboxypeptidase E (CPE)、

alpha- tubulin、

beta-tubulin。

( 4 ) 原発性乳癌の術後予後予測に関与する予後の悪い群で高発現する以下か ら選ばれる遺伝子；

heat shock protein HSP 90-alpha gene、

malate dehydrogenase、

NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 beta subcomplex, 3 (NDUFB3)。

( 5 ) 手術時にリンパ節への転移がなかった（node陰性） （ηθ)乳癌において、 術後予後予測に関与する以下の配列より選ばれる遺伝子；

AF058701/ DNA polymerase zeta catalytic subunit ( EV3) 、

AI066764/ lectin, galactoside-binding, soluble, 1 (galectin 1)、

xl5940/ ribosomal protein L31.、

Hs.94653/ neurochondrin(KIAA0607)、

M13436/ ovarian beta-A-inhibin、

Hs.5002/ copper chaperone for superoxide dismutase; CCS、

D67025/ proteasome (pro some, macropain) 26S subunit, non-ATPase, 3、

M80469/ MHC class I HLA-J gene、

Hs.4864/ ESTs、

Hs.106326/ ESTso

( 6 ) 手術時にリンパ節への転移がなかった（node陰性） （ηθ)乳癌において、 術後予後予測に関与する予後の悪い群で高発現する以下から選ばれる遺伝子；

AF058701/ DNA polymerase zeta catalytic subunit (REV3) 、

AI066764/ lectin, galactoside-binding, soluble, 1 (galectin 1)、

xl5940/ ribosomal protein L31.₀

( 7 ) 手術時にリンパ節への転移がなかった（node陰性） （ηθ)乳癌において、 術後予後予測に関与する予後の良い群で高発現する以下から選ばれる遺伝子；

Hs.94653/ neurochondrin(KIAA0607)、

M13436/ ovarian beta-A-inhibin、

Hs.5002/ copper chaperone for superoxide dismutase; CCS、

D67025/ proteasome (prosome, macropain) 26S subunit, non-ATPase, 3、

M80469/ MHC class I HLA-J gene,

Hs.4864/ ESTs、

Hs.106326/ ESTso

( 8 ) エストロゲンレセプ夕一陰性の乳癌において、 術後予後予測に関与する 以下の配列より選ばれる遺伝子；

Hs.108504/ FLJ20113/ ubiauitin-SDecific protease otubam 1

Hs.146550/ MYH9/ myosin, heavy polypeptide 9, non-muscie

Hs.194691/ RAI3 / retinoic acid induced 3

Hs.1975/ TDRD3/ tudor domain containing 3

Hs.203952/ TRRAP/ transformation/transcription domain-associated protein

Hs.278607/ GSA7/ ubiquitin activating enzyme El -like protein

Hs.429/ ATP5G3/

ATP synthase, H+ transporting, mitochondrialFOcomplex, subunitc (subunit9) isoform3

Hs.75305/ AIP/ aryl hydrocarbon receptor interacting protein

Hs.81170/ PIM1/ pim-1 oncogene

Hs.99987/ ERCC2/

excision repaircross-complementingrodentrepairdeficiency,

complementationgroup2

Y12781 / Transducin (beta) like 1 rotein

Hs.104417/ KIAA1205 protein

cl.21783/ Hypothetical protein Hs.112628/ Hypothetical protein: MGC43581

Hs.170345/ Hypothetical protein FLJ13710

Hs.53996/ weakly similar to zinc finger protein 135

Hs.55422/ Hypothetical protein

Hs.112718/ EST

Hs.115880/ EST

Hs.126495/ EST

また本発明は、 上記 （8 ) の内、 予後の悪い群で高発現する遺伝子である。 さらに本発明は、 上記 （1 ) 〜 （8 ) のいずれかの遺伝子及び/又はそれら遣 伝子に特異的なプローブが搭載された DNAマイクロアレイであり、 好ましくは、 D N Aマイクロアレイが繊維型マイクロアレイである。

前記遺伝子及び Z又はそれら遺伝子に特異的なプローブは轧癌の術後予後の検 查方法においてマーカーとして使用することができる。 さらには、 乳癌の術後予 後を制御する癌治療薬のマーカーとしても使用することができる。 また、 前記マ イクロアレイは乳癌の術後予後の検査方法において使用することができる。

さらに、 本発明は、 前記遺伝子及び Z又はそれら遺伝子に特異的なプローブを マーカーにして、 乳癌の術後予後を制御する癌治療薬のスクリーユング方法であ る。前記スクリ一二ング方法には、前記マイクロアレイを使用することができる。 また、 当該マーカーは試薬として包含することができ、 乳癌の術後予後の診断 キットとして使用することができる。 当該試薬キットにはマーカーが搭載された D N Aマイクロアレイ、 好ましくは繊維型マイクロアレイを包含する。

本発明の手法により、 完全に新規の乳癌関連遺伝子を見出すと同時に、 それら の遺伝子が乳癌の悪性化に深く関与し、 最終的には轧癌患者の予後に影響を及ぼ していることを発見した。 さらには見出された遺伝子の発現状態を評価する数式 を構築することにより、 まったく新規かつ有効な乳癌術後予後予測システムを開 発した。 癌が遺伝子の異常による疾患であることを考慮すると、 遺伝子発現の観 点から見た本発明のシステムは従来の予後評価法とはまったく異なる、 癌の生物 学的本質を捉えた画期的な予後予測システムであると考えられる。 図面の簡単な説明

図 1は、 5y-Sグループに比べて 5y-Dグループで ¾現が上昇した遺伝子群 （A) と減少した遺伝子群 （B) を示す写真である。

図 2は、 5y-Sグループと 5y-Dグループ由来の RNAの半定量 RT-PCRの分析結果 を示す写真である。

図 3は、 個々の患者における予後スコアを示す。

図 4は、 5Y-Fグループと 5Y-Rグループ由来の RNAについての半定量 RT-PCR の分析結果を示す写真である。

図 5は、 5Y-Fグループと 5Y-Rグループ由来の RNAについての半定量 RT-PCR の分析結果を示す写真である。

図 6は、 個々の患者の予後スコアを示す。

図 7は、 5S腫瘍において高発現する 7遺伝子の半定量 PCRの分析結果を示す写 真である。

M :マーカーラダー (Marker ladder)

S1 -S10：手術後 5年以上の間無病生存した患者の新たに検査した組織である。 D 1— D 10：手術後 5年以内に乳癌で死亡した患者を新たに検査したケースである。 発現強度の違いは Student's t-テストで評価した； p値が 0.05以下の場合、 統計的に 有意であると考えられる。

図 8は、 5Dグループで高発現する 3遺伝子の半定量 PCRの分析結果を示す写真 である。 符号の説明は図 7の説明を参照。

図 9は、 新たに調べた 20ケースの予後指標 （PI) を描図した結果である。 5年 以上の間無病生存した全 10人の患者の指標は 7より高かった。 一方、 手術後 5年以 内に乳癌で死亡した患者の指標は 7より低かった。 2つのグループの分配は統計学 的に有意である （p =0.0002) 発明を実施するための最良の形態

本発明の一つの態様であ.る乳癌の術後予後予測に関与するマ エストロゲンレセプター陰性乳癌、 node陰性乳癌及び原発性乳癌において、 外科 手術後 5年以内に死亡あるいは再発した患者、 及び 5年以上の間生存した患者から の遺伝子の発現機能を cDNAマイクロアレイで分析することにより得られたもの である。

具体的には、 本発明の態様の一つは、 乳癌の術後予後予測に関与する既知配列 から選ばれる以下の定義の少なくとも 1よりなる遺伝子である；

1 ) エストロゲンレセプ夕一陰性の乳癌において、 外科手術後 5年以内に死亡し た乳癌患者からの遺伝子 （5y-Dグループ） と数年以上無病 （disease-free) 生存し た患者からの遺伝子 （5y-Sグループ） と力 その発現機能によって区別すること ができたマ一カー遺伝子群。 '

2 ) 手術時にリンパ節への転移がなかった （node陰性） （ηθ) 乳癌において、 手 術後 5年以内に再発した ηθ乳癌患者からの遺伝子（5Y-Rグループ） と 5年以上の間 無病生存した患者からの遺伝子 （5Y-Fグループ） とが、 その発現機能によって区 別することができたマ一力一遺伝子群。

3 ) 原発性乳癌において、 外科手術後 5年以内に死亡した乳癌患者からの遺伝子 (5Dグループ） と数年以上無病生存した患者からの遺伝子 （5Sグループ） とが、 その発現機能によって区別することができたマーカ一遺伝子群。

本発明の乳癌の術後予後予測に関与する遺伝子は、 Random-permutationテス卜、 Ma皿- Whitneyテストを用いて cDNAマイクロアレイのデータを評価することに より得られたものである。 本発明は遺伝子発現機能を cDNAマイクロアレイと半 定量 PCR実験とを組み合わせて評価することにより、 臨床レベルにおいてより役 立つアプローチを提示する。

本発明では、 乳癌患者の遺伝子発現機能を評価することにより、 原発性乳癌の 術後予後予測に関与する遺伝子を同定した。

具体的には、 本発明の態様の一つは原発性乳癌の術後予後予測に関与する既知 配列から選ばれる以下の配列より選ばれる遺伝子である；

pro-alpha- 1 type 3 collagen (PIIIP)_¾

complement component Clr、 dihydropyrimidinase-like 3 (DPYSL3),

protein tyrosine kinase 9-like (PTK9L)、

carboxypeptidase E (CPE)、

alpha- tubulin- beta-tubulin、

heat shock protein HSP 90-alpha gene、

malate dehydrogenase ,

NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 beta subcomplex, 3 (NDUFB3)。 本発明において 「高発現」 とは、 対象遺伝子の発現量が、 母集団における同遺 伝子の発現量の平均値と比較したときに、 当該平均値よりも高いこと、 例えば 2 倍以上であることを意味する。

また、 本発明おいて 「低発現」 とは、 対象遺伝子の発現量が、 母集団における 同遺伝子の発現量の平均値と比較したときに、 当該平均値よりも低いこと、 例え ば 2倍以下であることを意味する。

上記の遺伝子のいくつかは腫瘍細胞の増殖又は遠隔転移に関連していると考え られる。 例えば、 heat shock protein HSP 90-alphaは、 多くのキナ一ゼのシャぺロ ンであり、 癌細胞の成長を促進する可能性がある （Neckers,L.(2002)Trends Mol Med 8, S55-61.) 。 malate dehydrogenaseは、 好気性及び嫌気性代謝に伴うエネル ギ一に関連する重要な酵素であり、 malatedehydrogenaseの活性は扁平上細胞癌の 腫瘍マ一カーに関連する（Ross, C.D.,et al. (2000) Otolaryngol HeadNeck Surg 122, 195-200.) 。 NADH dehydrogenase(ubiquinone) 1 beta subcomplex,3(NDUFB3)は ミトコンドリアの電子伝達系に属しており、乳癌細胞株である MDA-MB-231にお いて NDUFB3を含む領域の染色体異常が顕著である （Xie,D.，etal.(2002) Int J Oncol 21, 499-507.) 。

上記の原発性乳癌の術後予後予測に関与する 10遺伝子は予後の良い群 （5Sダル —プ） と予後の悪い群 （5Yグループ） とで異なる発現を示し、 10遺伝子のうち 7 遺伝子は予後の良い群 （5Sグループ） で高発現する遺伝子である。 すなわち、 本発明の態様の一つは、 原発性乳癌の術後予後予測に関与する既知 配列から選ばれる予後の良い群で高発現する以下から選ばれる遺伝子である； pro-alpha- 1 type 3 collagen (PIIIP)、

complement component Clr、

dihydropyrimidinase-like 3 (DPYSL3),

protein tyrosine kinase 9-like (PTK9L)、

carboxypeptidase E (CPE)、

alpha- tubulin,

beta-tubulin。 上記の原発性乳癌の術後予後予測に関与する 10遺伝子のうち 3遺伝子は予後の 悪い群 （5Yグループ） で高発現する遺伝子である。 すなわち、 本発明の態様の一 つは、 原発性乳癌の術後予後予測に関与する既知配列から選ばれる予後の悪い群 で高発現する以下から選ばれる遺伝子である；

heat shock protein HSP 90-alpha gene,

malate dehydrogenase,

NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 beta subcomplex, 3 (NDUFB3)。 ここで、 原発性乳癌の予測指標 (PI)を以下のように定義し、 乳癌の術後予後予 測に用いることができる；

予測指標 (PI)= (乳癌組織における上記の予後の良い群で高発現する 7遺伝子の正 規化した発現比率の合計） 一 （乳癌組織における上記の予後の悪い群で高発現す る 3遺伝子の正規化した発現比率の合計） 。

本発明では、 乳癌患者の遺伝子発現機能を評価し、 node陰性乳癌の術後予後予 測に関与する 10遺伝子を同定した。

具体的には、 本発明の一つの態様は、 手術時にリンパ節への転移がなかった (node陰性） （ηθ) 乳癌において、 術後予後予測に関与する既知配列から選ばれ る以下の配列より選ばれる遺伝子である； AF058701/ DNA polymerase zeta catalytic subunit (REV3) 、

AI066764/ lectin, galactoside-binding, soluble, 1 (galectin 1)、

xl5940/ ribosomal protein L31.、

Hs.94653/ neurochondrin(KIAA0607)、

Ml 3436/ ovarian beta- A-inhibin、

Hs.5002/ copper chaperone for superoxide dismutase; CCS、

D67025/ proteasome (prosome, macropain) 26S subunit, non-ATPase, 3、

M80469/ MHC class I HLA-J gene,

Hs.4864/ ESTs、

Hs.106326/ ESTsc 上記の node陰性乳癌の術後予後予測に関与する遺伝子には腫瘍細胞の増殖、 遠 隔転移に関与する遺伝子が含まれる。 例えば、 galectin 1は細胞分化を制御するォ —トクライン型癌抑制因子である （AxelH, et al. (2003) Int. J. Cancer, 103: 370-379.) 。 また、 癌転移を活性化する遺伝子が含まれる。

上記の node陰性乳癌の術後予後予測に関与する 10遺伝子は予後の良い群（5Y-F グループ） と予後の悪い群 （5Y-Rグループ） とで異なる発現を示し、 10遺伝子の うち 3遺伝子は予後の悪い群 （5Y-Rグループ） で高発現する遺伝子である。 すな わち、 本発明の一つの態様は手術時に node陰性乳癌において、 術後予後予測に関 与する既知配列から選ばれる予後の悪い群で高発現する以下から選ばれる遺伝子 である；

AF058701/ DNA polymerase zeta catalytic subunit (REV3) 、

AI066764/ lectin, galactoside-binding, soluble, 1 (galectin 1)、

xl5940/ ribosomal protein L31。

上記の node陰性乳癌の術後予後予測に関与する 10遺伝子のうち 7遺伝子は予後 の良い群 （5Y-Fグループ） で高発現する遺伝子である。 すなわち、 本発明の一つ の態様は node陰性乳癌において、 術後予後予測に閧与する既知配列から選ばれる 予後の良い群で高発現する以下から選ばれる遺伝子である； Hs.94653/ neurochondrin(KIAA0607)、

M13436/ ovarian beta-A-inhibin、

Hs.5002/ copper chaperone for superoxide dismutase; CCS、

D67025/ proteasome (prosome, macropain) 26S subunit, non-ATPase, 3、

M80469/ MHC class I HLA-J gene、

Hs.4864/ ESTs、

Hs.106326/ ESTs。

ここで、 node陰性乳癌の予後スコア (PS)を以下のように定義し、 乳癌の術後予 後予測に用いることができる ；

予後スコア (PS)= (乳癌組織における上記の予後の悪い群で高発現する 3遺伝子 の正規化した発現比率の合計） 一 （乳癌組織における上記の予後の良い群で高発 現する 7遺伝子の正規化した発現比率の合計） 。

本発明では、 乳癌患者の遺伝子発現機能を評価することにより、 エストロゲン レセプター陰性の乳癌の術後予後予測に関与する 20遺伝子を同定した。

具体的には、 本発明の一つの態様は、 エストロゲンレセプター陰性の乳癌にお いて、 術後予後予測に関与する既知配列から選ばれる以下の配列より選ばれる遺 伝子である ；

Hs.108504/ FLJ20113/ ubiquitin-suecific protease otubain 1

Hs.146550/ MYH9/ myosin, heavy polypeptide 9, non-muscle

Hs.194691/ RAI3/ retinoic acid induced 3

Hs.1975/ TDRD3/ tudor domain containing 3

Hs.203952/ TRRAP/ transformation/transcription domain-associated protein

Hs.278607/ GSA7/ ubiquitin activating enzyme El -like protein

Hs.429/ ATP5G3/ ATPsynthase, H+transporting,

mitochondrialFOcomplex, subunitc(subunit 9) isoform 3

Hs.75305/ AIP/ aryl hydrocarbon receptor interacting protein

Hs.81170/ PIM1/ pim-1 oncogene Hs.99987/ ERCC2/

excisionrepaircross-complementingrodentxepairdeficiency,complementationgro up2

Y12781/ Transducin (beta) like 1 rotein

Hs.104417/ KIAA1205 protein

cl.21783/ Hypothetical protein

Hs.112628/ Hypothetical protein: MGC43581

Hs.170345/ Hypothetical protein FLJ13710

Hs.53996/ weakly similar to zinc finger protein 135

Hs.55422/ Hypothetical protein

Hs.112718/ EST

Hs.115880/ EST

Hs.126495/ EST。

上記のエストロゲンレセプター陰性乳癌の術後予後予測に関与する遺伝子には 腫瘍細胞の増殖又は遠隔転移に関連する遺伝子が含まれる。例えば、 PIM1はセリ ン /スレオニンキナーゼであり、 前立腺がんの臨床結果とその発現には相関性が ある (Oesterreich.S., et al.(1996) Clin Cancer Res, 2, 1199-1206.) 。 また、 TRRAP 蛋白質は哺乳類 HAT複合体のサブュニットであり、 TRRAPのアンチセンス RNA は乳癌細胞のエストロゲン依存性の成長を阻害する。

上記のエストロゲンレセプ夕一陰性乳癌の術後予後予測に関与する 20遺伝子 は、 予後の悪い群 （5y-Dグループ） で高発現する。 すなわち、 本発明の一つの態 様は、 予後の悪い群で高発現する、 前記のエストロゲンレセプターに対して陰性 の乳癌において、 術後予後予測に関与する既知配列から選ばれる遺伝子である。 ここで、 上記のエストロゲンレセプター陰性乳癌の術後予後予測に関与する遺 伝子の発現に基づいて、 以下のように乳癌の術後予後を予測することができる； ( 1 ) 上記のエストロゲンレセプ夕一陰性乳癌の術後予後予測に関与する 20遺伝 子の乳癌組織における発現量を母集団における平均値と比較し、 各遺伝子発現量 が母集団の平均値の 2倍以上であるならば、 1点を付与、 ( 2 ) ( 1 ) の操作を各 20遺伝子について行い、 合計点数が 8点以上ならば、 予 後不良とする。

上記の乳癌の術後予後予測に関連する遺伝子は、 マーカ一として乳癌の術後予 後の検査に用いることができる。 すなわち、 本発明の一つの態様は、 前記遺伝子 をマ一カーにする乳癌の術後予後の検査方法である。

上記の乳癌の術後予後予測に関連する遺伝子は、 マーカーとして乳癌の術後予 後を制御する癌治療薬のスクリーニングに用いることができる。 すなわち、 本発 明の一つの態様は、 前記の遺伝子をマーカーにする乳癌の術後予後を制御する癌 治療薬のスクリーニング方法である。

上記の乳癌の術後予後予測に関連する遺伝子は、 マーカーとして乳癌の術後予 後の診断に用いることができる。 また、 上記遺伝子に対して特異的なプローブを 設計し、 それらプローブをマーカーとして使用することもできる。 それらプロ一 ブは例えば、 ダイナコム社製 Probe Quest (登録商標） により設計することが可 能である。 すなわち、 本発明の一つの態様は、 前記の遺伝子をマーカーにする試 薬を含む乳癌の術後予後の診断キッ卜である。

上記の診断キットはマイクロアレイを包含することができる。 すなわち、 本発 明の一つの態様は、 前記診断キットがマイクロアレイを包含するものである診断 キットである。

上記マイクロアレイを包含するものである診断キッ卜のマイクロアレイには繊 維型マイクロアレイが含まれる。 ここで、 繊維型マイクロアレイの調製方法につ いては、 前記特許文献 6 _ 7を引用する。 すなわち、 本発明の一つの態様は、 マ イクロアレイが繊維型マイクロアレイである前記診断キットである。 次に、 実施例により本発明の実施の態様を具体的に説明するが、 本発明は実施 例に限定されるものではない。 実施例 1

エストロゲンレセプ夕一陰性乳癌における術後予後予測の遺伝子発現機能の 評価

(組織サンプル）

日本医科大学並びに癌研究会の倫理委員会より承認されたガイドラインに従つ てインフォームドコンセントを得た後、 癌研究会付属病院 （東京） において

1995-1997年に手術を受けた乳癌患者から原発性乳癌及び隣接する正常乳腺から の組織を採取した。 組織は速やかに凍結され、 -80° Cで保存された。 954人の患 者について、 その全員を 5年以上の間あるいは死亡時まで臨床的に追跡し、 手術 後 5年以内に死亡したエストロゲンレセプター陰性乳癌の患者 10人 （5y-D) 、 及 び 5年以上の間無病生存した患者 10人 （5y-S) から試料を選んだ。 両方の患者ダル ープの臨床のバックグラウンドは、 年齢、 リンパ節転移、 腫瘍径と組織型におい て一致させた （表 1 ) 。

(乳癌の 20症例の臨床的特徴）

表 1

'ル ゴ ケース no. ER扰態 年 ¾ 性別 絰過 ^a ¾ ,j¾ ^ 丁丁 ^D°

すべての患者は癌研究会付属病院の「乳癌のための手術後の臨床のプロトコル」 に従って手術後のアジュパント治療を受けた。各症例での アジュバント治療の選 択は、 外科手術のタイプ、 リンパ節関与の状態、 及び局所あるいは遠隔転移の存 在に基づいて厳密に決定した。 本発明の研究においては、 患者のいずれもがアジ ュバント化学療法の前に遠隔転移を持っておらず、 外科手術の前に放射線療法あ るいは化学療法を受けていなかった。

(臨床病理 （Clinicopathological) パラメ一夕）

次のパラメ一夕を調べた：組織型、 腫瘍径及び浸潤 （t因子） 、 リンパ節関与 (lymph node involvement) 、 及びエストロゲンレセプタ― (ER) とプロゲステ ロンレセプ夕一 （PgR) の状態。 腫瘍を TNM分類と日本の乳癌学会 （1989) の組 織分類によって、 次のタイプに分類した ； noninvasivetubular ( la) 、 invasive papillotubular (al)、 invasive solid-tubular (a2)、 invasivescirrhouscarcinoma、a3)、 及び他の特別なタイプ （b) 。 分類は基本的に世界保健機構の乳癌組織分類と同 じである。 t因子は、 組織学的 TNM分類に従って次のタイプに分類した；最大寸 法が 2 c m以下の腫瘍 （tl) 、 皮膚又は胸筋への浸潤のない、 最大寸法が 2 c m以 上の腫瘍 （t2) 、 皮膚あるいは胸筋への浸潤のあるもの （t3) 。

(cDNAマイクロアレイのデザィンと構成）

UniGene デ一夕ベースから選択した 25，344の cDNAsにより、 " ゲノムワイド cDNA マイクロアレイ"を構築した。 当該 cDNAsは種々のヒト器官から分離され た poly(A)+RNAを使い RT-PCRで作成された。 PCR産物を、 ArraySpotter Generation III (Amersham Biosciences) ¾ 1 って夕つ フ 7のスライ ド · ガラス (AmershamBiosciences UK Limited ^ Buckinghamshire、 UK) にス aヽッ卜し 。 各スライドは、 384のハウスキーピング遺伝子を含む。

(RNAの調製及び増幅）

腫瘍原料を採取後直ちに- 80 で急速凍結した。 RNAを、 TRIzol (Invitrogen Inc.、 Carlsbad, CA、 USA)を使って抽出し、さらに RNeasykits (Quiagen Inc> Valencia, CA)を使って精製した。各 RNAの純度を、 分光測光法及び 1.2 %変性ホルムアミド ゲル上で電気泳動することにより評価した。 高純度 RNAは、 1.8-2.0の吸光度比

(260nm/280nm) を持ち、 ホルムアミドゲル電気泳動上で 28S/18Sリポゾ一マル バンドが 1.8以上の比率を有するサンプルとして定義した。 1ユニットの DNasel

(EpicentreTechnologies, Madison, Wl) ( l unit/ l) で処理後、 出発原料とし て各試料から RNAの 2 gを用いて T7RNAポリメラ一ゼによる RNA増幅を行つた。 増幅を 2回行い、 RNeasykits (Quiagen Inc.、 Valencia^ CA) で、 増幅された RNA

(aRNA) を精製した。 各 aRNAの量を分光光度計により測定し、 その品質をホ ルムアミドゲル電気泳動によりチェックした。

(aRNAの標識、 ハイブリダィゼ一シヨン及びスキャニング）

マイクロアレイ分析の cDNAを、 aRNAから調製した。 乳癌及び正常乳腺組織 力 りの aRNA (5〜10 gノ を、 amino allyl-cDNA labelingkits (Ambion、 Austin ^ TX) を使い Cy5 (癌試料） と Cy3 (正常試料） で標識した。 Cy3-と Cy5-標識 cDNA プローブを混合し、 95°Cで 5分加熱した後、 30秒氷で急冷し、 マイクロアレイに ハイブリダィゼ一ションさせた。混合されたプローブを、 microarrayhybridization solution version 2 (Amersham Biosciences UK Limited^ Buckinghamshire, UK; を 50 %終濃度のホルムアミド（Sigma-A'ldrichCorp.、 St丄 ouis、 MO、 USA)に添加 した。 15時間 40°Cでのハイブリダィゼーシヨンの後に、 マイクロアレイスライド を、 最初に lxSSCと 0.2 % SDSによって、 10分間 55 °Cで洗浄し、 次いで 2回 0.1xSSC/0.2 % SDSで各 1分間室温で洗浄した。 全ての処理は、 AutomatedSlide Processor System (Amersham) で行つた。 各ハィブリダイゼーシヨンのシグナル 強度を、 Gene Pix 4000A (Axonlnstruments, Inc.、 Foster City、 CA、 USA) でス キヤニングし、 Gene Pix 3.0 (Axon Instruments)で分光測光法により評価した。 ス キャンされたシグナルを、 以下の文献記載の方法 （thetotal gene normalization method) で正規化した （Yang YH, Dudoit S， Luu P, et al. (2002)Nucleic Acids Res 30,el5; Manos EJ， Jones DA.(2001) Cancer Res 61: 433-438) 。 (シグナル分析及び異なる発現を示す遺伝子の選択）

各ハイプリダイゼーシヨンのシグナル強度を、 Gene Pix Pro 3.0 (Axon Instruments, In 、 Foster City、 CA、 USA) により測光法で評価した。 癌とコン トロール間の mRNA発現量を正規化するために、 各遺伝子発現の Cy5： Cy3比率 を調整した。 その結果、 ハウスキーピング遺伝子の平均化された Log (Cy5： Cy3 比率） はゼロであった。 27個のハウスキーピング遺伝子は、 Webサイ ト http：〃 www.nhgri.nih.gov/DIR/LCG/ARRAY/expn.htmlのハウスキーピングパ ネルから援用した。 各マイクロアレイスライドについて、 （S /N) 比のカット オフ値を 3.0に設定した。 そして、 Cy3と Cy5のシグナル強度が、 カットオフ値よ り低い遺伝子は検討から除外した。

(Mann-Whitney ァスト)

5y-Dと 5y-S腫瘍間で、 明らかに異なる発現を示した遺伝子を検討するために、 Mann- Whitneyテストを、 一連のサンプル Xに適用した。 Xは、 各遺伝子及び各サ

ある （OnoK, Tanaka T, Tsunoda T， et al.

(2000) Cancer Res 2000; 60: 5007-5011) 。 U値を、 両グループの少なくとも 5サン プルで有意なシグナルを与えた各遺伝子について計算した。 U値が 23より低いか、 あるいは 77より大きい遺伝子を選択した。 U値は、 各 X値に基づく各遺伝子の、 5y-Dグループに対する 5y-Sグループを計算しているので、 23より低い U値は、 5y-D グループに比べ 5y-Sグループにおいて高発現するものと評価した。しかしながら、 77より大きな U値を持つ遺伝子は、 5y-Sグループに比べ 5y-Dグループにおいて高 発現するものと評価した。 この基準によると、 183遺伝子が 5y-Sグループで高発現 しており、 31遺伝子が 5y-Sグループで高発現していた。 したがって、 2つのグルー プ間での中間発現値が 2倍以上の差異を示す遺伝子のみを （ XD/ ^ XS < 0.5 あるいは ≥_ 2.0、 XDと XSがそれぞれ 5y-Dあるいは 5y-Sグループの平均 X 値を示す） 予後関連の遺伝子と定義した。 その結果、 全部で 110遺伝子が選ばれ た。 そのうち 90遺伝子が 5y-D腫瘍群で高いレベルで発現しており、 20遺伝子が 5y-S腫瘍群で高いレベルで発現していた。

(Random-permutation " ^卜)

さらに Ma皿- Whitneyテストによって選択された 110遺伝子の価値を評価する ために、 permutationテストを行った。 そしてグループ差異に関連する遺伝子の可 能性、 Ps、 もまた想定した。 各遺伝子を、 発現ベクター V ( g ) = (XI , X2、 - --、 X20) (Xiは最初のサンプル群における i番目のサンプルの遺伝子発現レベルを 示す） で表すとき、 理想的発現パターンは c= (cl、 c2 、 - --、 c20) (i番目のサ ンプルが S又は Dグループに属するかにより ci= + 1又は 0となる） で表現される。 遺伝子と グループ差異 Pgc間の相関は、 次のように定義された：すなわち、 Pgc = ( _S - D) I ( <5 _S + δ _Ό) ； _S ( _D) と <5 _s ( <5 _d) は、 新規に定義され た S (又は D) グループにおいて、 各サンプルの該遺伝子" g "の log₂Xの標準偏差 を示す。

permutationテストは、 cの座標を入れ換えることにより行った。 すべての permutation間で相関値、 Pgcを計算した。 これらの手順は 10000回にわたり繰り 返し行った。 偶然に、 2つのグループを分類する遺伝子の可能性を示す p値が、 選 択された 110遺伝子の各々について評価された。 最終的に、 5y-Dケースで高発現 するる 71遺伝子と、 5y-Sケースで低発現する 15遺伝子を選別した。 (半定量 (Semi-quantitative)RT-PCR)

RNA (2 x g ) を、 DNase I (Epicentre Technologies, Madison、 WI、 USA) で処理し、 Reverscript Ilreversetranscriptase (和光純薬 (株)、 大阪、 日本） とオリ ゴ （dT) 12-18プライマ一を使って単鎖 c DNAを逆転写させた。 単鎖 cDNAsは、 量的なコントロールとして GAPD (glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase) の 発現をモニタリングすることにより次の PCR増幅のために濃度調整を行った。 各 PCRは、 Gene Amp PCRシステム 9700 (AppliedBiosystems, Foster City, CA、 USA) を用レ xPCRパッファー 30 1量で、 以下の反応条件で行った；

94°C5分、 (94 30秒、 60°C30秒、 及び 72°C30分） を 25-35サイクル _c

RT-PCRに使つたプライマー配列は以下である：

配列番号 1 GAPD (control) forward, 5'-GGA AGGTGA AGG TCG GAG T-3' 配列番号 2 reverse, 5'-TGG GTG GAA TCA TAT TGGAA-3';

配列番号 3 Hs.l08504F, 5，-ACA CTT CAT CTG CTCCCT CAT AG-3';

配列番号 4 Hs.l08504R, 5'CTG CCT AGA CCT GAGGAC TGT AG-3';

配列番号 5 Hs.l46550F, 5'ACT GAG GCC TTT TGGTAG TCG-3';

配列番号 6 HS.146550 , 5'TCT CTT TAT TGT GATGCT CAG TGG-3'; 配列番号 7 Hs.76607F, 5'AAA TCC TTC TCG TGT GTTGAC TG-3';

配列番号 8 Hs.76607R, 5 'CAG TCA TGA GGG CTA AAAACT GA-3';

¾Β列番号 9 Hs.l975F, 5'GAA GAC AAC AAG TTT TAC CGG G-3';

配列番号 10 Hs.l975R, 5 'ATG GTT TTA TTG ACG GCAGAA G-3';

配列番号 11 Hs.203952F, 5 'AGG ACA CGT CCT CTCCTC TCT C-3';

配列番号 12 Hs.203952R, 5'TAA AGC TAG CGA AGGAAC GTA CA-3'; 配列番号 13 Hs.278607F, 5'TCC CTT CTG TTT CCT CAG TGT T-3';

配列番号 14 Hs.278607R, 5'CCT GCC CCG ATA AAA ATA TCT AC -3'; 配列番号 15 Hs.429F, 5'TTG ACC TTA AGC CTC TTTTCC TC-3';

配列番号 16 Hs.429R, 5'ATA ACG TAC ATT CCC ATGACA CC-3';

配列番号 17 Hs.75305F, 5'ACT TTC AAG ATG GGACCA AGG-3';

配列番号 18 Hs.75305R, 5'ATA TAC ACA GAA GCATGA CGC AG-3'; 配列番号 19 Hs.81170F, 5'TTG CTG GAC TCT GAAATA TCC C-3';

配列番号 20 Hs.81170R, 5'TTC CCC TGT ACA GTATTT CAC TCA-3';

配列番号 21 Hs.99987F, 5'CTG AGC AAT CTG CTCTAT CCT CT-3';

配列番号 22 Hs.99987R, 5'GTT CCA GAT TCG TGAGAA TGA CT-3';

配列番号 23 Y12781F, 5'ACC AGT AAC AAC TGT GGGATG G-3';

配列番号 24 Y12781 , 5'CAA ATG AGC TAC AAC ACACAA GG-3';

配列番号 25 Hs.l04417F, 5'CCC CCT CCA CCT TGTACA TAA T-3';

配列番号 26 Hs.l04417R, 5'GTT TTC GTT TGG CTGGTT GTG-3'; 配列番号 27 C1.21783F, 5'GTC TGA GAT TTT ACTGCA CCG-3'; 配列番号 28 cl.21783R, 5'GGA TGG AGC TGG AGGATA TTA-3';

配列番号 29 Hs 112628F, 5ΆΤΤ GCT AAG GAT AAGTGC TGC TC-3';

配列番号 30 Hs 112628R, 5'TGT CAG TAT AGA AGCCTG TGG GT-3';

配列番号 31 Hs 170345F, 5'TTC TTA GGC CAT CCCTTT TCT AC-3';

配列番号 32 Hs 170345 , 5'GCA TCT GAA TGT CTTTCT CCC TA-3';

配列番号 33 Hs 53996F, 5'CCA TAG GAT CTT GACTCC AAC AG-3';

配列番号 34 Hs 53996R, 5' ACT GGG AGT GGA GGAAAT TAG AG-3';

配列番号 35 Hs 55422F, 5'CTA ATG TAA GCT CCATTG GGA TG-3';

配列番号 36 Hs 55422R, 5'CAA ACT GCA AAC TAGCTC CCT AA-3';

配列番号 37 Hs 112718F, 5 'AAG ACT AAG AGG GAA AAT GTG GG-3';

配列番号 38 Hs 112718R, 5 'AGG TAA CCC AAA GTG ACA AAC CT-3';

配列番号 39 Hs 115880F, 5'TTA AGT GAG TCT CCT TGG CTG AG-3';

配列番号 40 Hs 115880R, 5'AGG GCC CCT ATA TCC AAT ACC TA-3';

配列番号 41 Hs 126495F, 5'GAT CTT TCA AGA TGAGCC AAG GT-3';

配列番号 42 Hs 126495R, 5 'AGT CAT TCA GAA GCCATT GAG AC-3'

(RT-PCR産物のシグナル強度測定と予後スコアの計算）

PCR産物を、 2%のァガロースゲル電気泳動とェチジゥムブ口マイド染色によ つて検出した。 ゲルを Spot Density法でデジタル画像処理システム （Alphalmager 3300； Alpha Innotech> San Leandro、 CA、 USA) でスキャンした。 各バンドの 2 次元領域を構築し、 その密度を IDV (integratedDensity Value) と定義したピクセ ル強度 (遺伝子発現)を得た。各グループにおける IDVの差異の重要性を、 Student's t-テストで評価した。 その結果、 t-テストで 0.05以下の p値を示した 20遺伝子を候 補として選択した （表 2 ) ；すなわち、 当該 20遺伝子の発現レベルは、 5y-Dダル —プにおいて 5y-Sグループに対して有意に高値であった。 この情報を用いて、 本 発明者らは術後予後を予測するスコアリングシステムの確立を試みた。 その際、 各遺伝子は、 各サンプルの発現レベルが 20サンプルの平均発現レベルより高いか 否かにより決定した。 もしサンプルの発現レベルが、 平均の 2倍以上であるなら ば、 付加的に + 1点を与えた。 次に各サンプルのために全票 （予後スコア） を得 るためにすベての 20遺伝子の点を合計した。 その結果、 8点以上のサンプルの場 合は、 悪い予後の表示と評価した。 他方、 8点以下の場合は、 好ましい予後を表 示していると評価した。

(予後スコアリングシステムの 20候補遺伝子）

表 2

Hs./Acoesion No. 锂

Hs.1 8504 FLJ20113: ubiquitin-spedfio protease otubain 1

Hs.146550 VH9: myosin, heavy poly eptide s, non-musde

Hs.134691 A13: retinoic acid induced 3

Hs.1ff75 TD D3:tudor domain containing 3

Hs .203852 TR AP： transfer mati onAransori ti on domain-assodated protein

Hs .278607 GSA7: ubiquitin aciivating ensyrne E1-like protein

Hs.429 ATP5G3: ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial FO complex, subunit o (subunit 9) isoform 3

Hs.73305 AIP: ar^ hydrocarbon receptor interacting protein

Hs.81170 PIM1: pi m-1 oncogene

Hs .99987 E CC2: exd si on repa r oross-co mpl e merrti ng rodent repair def i cienoy, co mpl ementati on group 2

Y 12781 Transducin (beta) li ke protein

Hs .104417 IAA1205 protei n

cl .21783 Hypothetical prolan

Hs.11262S Hypothetical protan: M6C43SS1

ΗΞ.170Ξ 5 Hypothetical protan FLJ13710

Hs .53998 v^eakl similar to Eincfinger protein 135

Hs.55422 Hypothetical protan

Hs.112718 EST

Hs.115880 EST

Hs.126495 EST

(結果)

エストロゲンレセプ夕一陰性乳癌組織で、 有意に高発現している 257遺伝子を 明らかにし、 同様に低発現している 378遺伝子を明らかにした。 5y-Dと 5y-Sダル ープ間で異なる発現を示す遺伝子を同定するために、マイクロアレイのデータを、 Mann-"Whitneyテス卜と Random-permutationテス卜に り分析した。

その結果、 5y-D腫瘍において全 71遺伝子 （10 EST と仮想タンパク質をコードし ている 9遺伝子を含む） が、 共通して高発現のグループに分類された。 これに対 して、 15遺伝子（3ESTを含む）が共通して低発現のグループに分類されだ（図 1 )。

5y-Dグループで高発現する遺伝子は、 癌細胞の増殖及び転移に関与する以下の 遺伝子を含む； matrix metalloproteinase 2 (MMP2) 、 heatshock protein 27 (HSPB 1、 Pim-1 oncogene PIMl ) 及び transrormation/transcriptiondomain-associated protein (TR AP)c

5y-Dグループで低発現する遺伝子は、 HLA-C (major histocompatibility complex, class I, C)及び特異的なキナーゼの遺伝子を含む。 D N A修復、 転写、 シ グナル伝達、 細胞骨格及び接着性と関係がある多くの遺伝子が、 2つのグループ 間で異なる発現を示した。

マイクロアレイのデータの信頼性を確かめるために、 5y-Dグループで髙発現す る 20遺伝子を選び ( Hs.108504 、 Hs.146550 、 Hs. l94691、 Hs. l975、 Hs.203952、 Hs.278607、 Hs.429 、 Hs.75305 、 Hs.81170 、 Hs.99987 、 Y12781、 Hs. l04417、 cl.21783, Hs.112628 、 Hs. l70345、 Hs.53996 、 Hs.55422 、 Hs.l l2718、 Hs.115880 及び Hs.126495 ) 、 半定量 RT-PCR によって該遺伝子の発現レベルを調べた。 そ の結果はマイクロアレイのデ一タと一致し、 5y-Dと 5y-Sグループを区別するため の統計学的な意義を有していた （代表的なデータを図 2で示す） 。

マーカー遺伝子の発現プロフィールを使って、 手術後の予後を予測するスコア リングシステムを構築するために、 前述の方法で予後スコアを計算した。 簡略に は、 マーカ一遺伝子が次の基準に従って選択された；

( 1 ) 調べた症例の少なくとも 60%でカツトオフレベルより高いシグナル強度を 示す；

( 2 ) I Ι1 _Ό - s 1が 1.0以下である。 ここで _D ( M S) は、 5y-D (5y-S) のケー スでの対数変換相対発現比率から導かれる平均値示す。

次に、 発現機能により 5y-Dグループと 5y-Sグループとを区別することができ た マ ー カ ー 遺伝子 を 同 定す る た め に Mann- Whitney テ ス ト と Random-permutationテストを行った。 関連するマイクロアレイの結果を、 半定量 RT-PCR実験により確認した。 Student'st-テストにより、 20遺伝子を予後マーカー として選別した （表 2 ) 。

本発明の予後スコア （PS) により、 20人の患者を、 予後不良と予測される 10人 (PSが 11以上） と、 予後良好と予測される 10人 （PSが 11未満） に分けた。 その結 果、 手術後の経過との対比により、 本発明のスコアリングシステムは 5y-Dケース では 80%、 5y-Sケースでは 100%の正確さにおいて信頼性があることを示した （図 3 A) 。

本発明の予後スコアリングシステムを使い、 追加 5症例について調べた （図 3 B ) 。 当該システムは、 2ケース （PS > 11 ;患者 TD-1、 及び TD-2) で不良予 後を、 3ケース （PSく 11；患者 TD-3、 TS-1、 及び TS-2) で良好予後を予測した。 その結果、 当該スコアリングシステムは、 これら 5症例の実際の臨床結果に関し て 80%の正確性であった。 実施例 2

node陰性の乳癌における術後予後予測の遺伝子発現機能の評価

(組織サンプル）

組織サンプルは実施例 1で記述した手法と同様に採取した。 手術後 5年以内に 再発した node陰性 （η θ) 癌の患者 （5Y-R) 12人、 及び 5年以上の間無病生存した 患者 （5Y-F) 12人からの腫瘍について、 遺伝子発現を検討した。 両方の患者ダル —プの臨床バックグラウンドは、 年齢、 リンパ節転移、 腫瘍径、 ホルモン受容体 の状態、 及び病理組織において一致させた （表 3 ) 。 フォローアップの中間期間 は、 7.8年、最初の手術と再発の間の平均期間は、 5Y-Rグループで 2.7年であった。 尚、 すべての患者は実施例 1で記載したアジュバント治療を受けた。

2345678911 o

(臨床 5543365

50298474321病理データ）

表 3

^

更年期 雄学的³ 分類 ： _ c 状據 分 位匿 fl <mm) T N M ステージ ER〈+/— ) PBR(+/-) D.F.I.

23232332322 1 a 12m

1 a 16m 0 49 tn

RRRRRLLLLLLL 0 20m ttttttttttttt

0 52m 0 14m 0 24m

233332232222

555535040583 0 25 m

： al： invasive papillotubular carcinoma _¾ a2： mvasives olid-tubularcarcmoma ^ a3： invasive schirrhous carcinoma

b： TNM分類： 日本乳癌学会の TNM分類に従って臨床学的に分類された ^c ： D.F.I：発病しない期間 (disease free interval)

(臨床病理 （Clinicopathological) パラメ一夕）

実施例 1で記述した手法で臨床病理パラメータを調べた。組織学的グレードは、 Elastonand Ellis (Abrams JS. Breast Cancer2001; 8: 298-304.) の方法により評価し た。 リンパ管浸潤は、 欠如か陽性で評価した （例えば、 癌周辺のリンパ管に癌細 胞がーつ又はそれ以上存在する場合、 陽性と評価した） 。脂肪浸潤 （Fatinvasion) は、 欠如か陽性かで評価した （例えば癌が、 間質組織にまで浸潤している場合、 陽性と評価した） 。 (cDNAマイクロアレイの調製）

25,344の cDNAsを有する、 "ゲノムワイ ド cDNAマイクロアレイキッ ト (Amersham Biosciences UK Limited、 Buckinghamshire、 UK) "を使用し 7こ。 PCR 産物は、 ArraySpotter Generation III (Amersham Biosciences) を使レ 、 タイプ 7 ガラススライド ( AmershamBiosciences) 上にスポッ卜した。

(R Aの調製と増幅）

実施例 1で記述した手法と同様に RNAの調製と増幅を行った。

(aRNAの標識、 ハイブリダイゼーシヨン及びスキヤニング）

実施例 1で 述した手法と同様に aRNAのラベリング、 ハイブリダィゼーショ ン及びスキャニングを行った。 (Mann- Whitney テスト）

無病及び再発グループ間で異なる発現を示す遺伝子を同定するために、 正規化 したシグナルを、 一連の Xに適用された Mann- Whitneyテストにより分析した。 こ こで Xは、 各遺伝子と各試料についての Cy5/Cy3signal強度比である。 2つのダル ープ間で、 発現強度において 2倍以上の差異を示す遺伝子を選んだ。 3.0以下のシ グナル—ノィズ比の遺伝子は分析から除外した。

U値を、両グループの少なくとも 5試料で有意のシグナルを与えた各遺伝子につ いて計算した。 37より低い或いは 107より大きい U値を持つ遺伝子を選択した。 U 値は、 各 X値に基づき各遺伝子について 5Y-Rグループに対する 5Y-Fグループにつ いて計算したので、 37より低い U値を持つ遺伝子は、 5Y-Rグループに比べて 5Y-F グループで、 高発現すると判断した （第一カテゴリー） —方、 107より大きい U 値を持つ遺伝子は、 5Y-Fグループに比べて 5Y-Rグループで、高発現すると判断さ れた （第二カテゴリー） 。

この方法で、 第一カテゴリ一で 78遺伝子、 第二カテゴリーで 55遺伝子を同定し た。 そこで、 2つのグループ間の中間発現値の 2倍以上の差異を示したもののみを 予後関連遺伝子と定義した （ X_R/ X_F £0.5あるいは 2.0、 ここで X _Rと /i X_F は、各 5Y-R又は 5Y-Fグループの平均的 X値を示す）。全部で、 98遺伝子が選ばれ、 そのうち 64遺伝子が 5Y-F腫瘍で高い発現レベルを示し、 34遺伝子が 5Y-R腫瘍で有 意に高い発現レベルを示した。

(Random-permutationア 卜)

Mann-Whitneyテス卜で選ばれた遺伝子の価値を評価するために、 permutation テストを行い、 そして各選択された遺伝子のグループ差異 （Ps) への相関がある ことを評価した。各遺伝子が、 発現べクタ一 V ( g ) = (Xl、 X2、 一-、 X24) (Xi ノがサンプルの最初のセットで iサンプルの遺伝子の発現レベルを示す） で表現さ れるとき、 理想化した発現パターンが c = (cl、 c2、 …-、 c24 ) (iサンプルが F か Rグループに属するかで ci= + 1又は 0となる） で表現される。

遺伝子と グループ差異 Pgc間の相関は、次のように定義された：すなわち、 Pgc = ( F+ R)/(sF+sR)； F ( R) と sF (sR)は、新規に定義された" F"又は" R" グループにおいて、 各サンプルの該遺伝子" g "の log₂Xの標準偏差を示す。

perm ationテストは、 cの座標を入れ換えることによって行われた。 すべての permutationの間に、 相関値、 Pgcsを計算した。 これらの手順は 10000回、 繰り返 して行われた。 偶然に、 2つのグループを分類する遺伝子の可能性を暗示する p値 が、 選択されだ 58遺伝子の各々のために評価された。

(半定量 RT-PCR)

RNA (5 g ) を、 DNase l (Epicentre Technologies、 Madison、 WI、 USA) (lunit/ l ) で処理後、 Reverscriptll reversetranscriptase (和光純薬（株）、 大阪、 日本） と0.5 ^/ / 1 0 0 (( 1) 12-18プライマ一を使って単鎖 cDNAを逆転写させ た。 単鎖 cDNAsの各調製物を、 量的なコントロールとして GAPDHをモニタリン グすることにより、 次の： PCR増幅のために希釈した。 全ての PCRは、 GeneAmp PCRシステム 9700 (Applied Biosystems、 Foster City, CA、 USA) を用い、 lxPCR バッファー 30 ^ 1量で以下の反応条件により行った；

94°C2分、

(94°C30秒、 58-62°C30秒、 及び 72 30秒) を 27-35サイクル、'

72 5分。

GAPDHの RT-PCRのためのプライマー配列は以下である：

配列番号 43 (forward) 5'-GAA AGG TGA AGG TCG GAG T-3'

配列番号 44 (reverse) 5*-TGG GTG GAA TCA TAT TGG AA -3'

(半定量 PCRのプライマ (無病グループで高発現する遺伝子） ）

表 4 A

Ac/HS Forward Reverse

M90439 配列 S¾45 CCAGACATCCATGGTACCTATAA 配列番 46 TATGCATTGAAACCTTACAGGGG

AF047472 配列番¾47 CTGTTAAACAAAGCGAGGTTAAGG 配列番号 4B GGGTTCTGCATCTCGTTTATTAG

Hs.118251 配列番号 49 GACACATAGCTCATAGGCACACA 配列番号 50 TTCTGGTACATGGTAAGTGCTCA

D26125 配列番号 51 TCCGCCATATTGATTCTGCTTA 配列番号 52 GTTTGCTTTCTGC5ACCATGGATA

Hs.8619 配列番 S53 GATAACAACTGC5ACCACATCCC 配列番号 54 AACAGGCAGACGAGGTAGACAC

X16135 配列番 S55 GAGAAGGATGGGTCCACCAGT 配列番号 56 GTACATGGGCAGGACAAATGTAT

Hs.9006 配列番号 57 ATTTCATTGGTAGTATGGCCCAC 配列番号 58 ATACCATGGGACAGGATTGTAAG 配列番 *59 GCTCAGACCAGCTCATACTTCAT 配列番 ·¾·60 CCAAAGACTGGGGTAGGTAAAAC

X07979 配列番 61- CTGGTGCTTTCTATCACCTCTTC 配列番号 62 GACTAGTGTGAAACAAGATGGGC

AF018080 配列番号 63 CTTGAACCCAGGAGTTTGAGAC 配列番¾64 GTGCCTCAGCTTTCTGAGTAGC

Hs.58464 配列番号 65 CTGGTGCTGACTATCCAGTTGA 配列番号 66 CTGGTAAACTGTCCAAAACAAGG

S79867 配列番号 67 CTCTTACCTGGACAAGGTGCGT 配列番号 68 GGATGAGCTCTGCTCCTTGAG

J02854 配列番 "％69 CAATGTTTGACCAGTCCCAGA 配列番号 70 CATGTTGTCTCAGTCCTCTATTGG

Z35309 配列番¾71 GGACAGCAGCTGGAGTACACA 配列番号 72 AATCAGATTTGTCGGTGCCTT

Hs.83097 配列番 S73 GGCTCTGCACTAAGAACACAGAG 配列番号 74 ACAACTAGCTCTCAGTTCAGGCA

Hs.79137 配列番 75 TGGAGCAGTATGACAAGCTACAA 配列番号 76 AAGCAGCACTGCATAAACTGTTC

Hs.4864 配列番号 77 TAAGTACTTTCCTGTGGGTCGCT 配列番号 78 CCACAAACAGGAAGCTATGTTCT

Y00052 配列番号 79 GTACTATTAGCCATGGTCAACCC 配列番号 80 CTACAGAAGGAATGATCTGGTGG

Hs.5002 配列番 *81 ATCAGTACGGGGACCTTACAAAC 配列番 ·¾82 CCTGTACTGAGCTCTCCAAAGAC

U43519 配列番 S83 TCCCTAGCTTCCTCTCCACA 配列番号 84 AGAATCATGCCTCCCCTTCT

Hs.94653 配列番 S85 ACCCCTCAAGTGTAAGGAACTG 配列番¾86 GGATCAAGAGTGTGTGTGTGTGT

X51441 配列番 *87 CAATGCCAGAGAC5AATATCCAGA 配列番号 88 GATACCCATTGTGTACCCTCTCC

Hs.108623 配列番 ·¾·89 CCACTCCACATAAGGGGTTTAG 配列番号 90 GAGGTTCTAGCTAAGTGCAGGGT

Hs.5318 Κ列番 CCATTGACATTGGAGTTAAGTATGC 配列番号 92 GGCAAAGAGCACATTTAGCAAT

Hs.69469 配列番 ¾93 GAAAGCCTATGTGAAAAGCTGGT 配列番 S94 TTGTTTCCAGGCATTAAGTGTG .

AA777648 配列番¾95 GCATCTTAGTCCACACAGTTGGT 配列番 96 GCCCTTACAGGTGGAGTATCTTC

Hs.106131 配列番 CTCATAGCCAGCATGACTTCTTT 配列番¾98 GGTTCACTTGTGACTGGTCATCT

X54079 配列番 *99 ACTTTTCTGAGCAGACGTCCAG 配列番号 100 TATCAAAAGAACACACAGGTGGC

AI041182 配列番 ¾101 ACGTTATTCCCAGTTCCTAAACC 配列番号 102 AGTCTCGGGTGACTCAATATC5AA

AA148265 配列番号 103 AGTTQAACCCAGGTACCTTTCTC 配列番号 104 CTAGGCCCTTTTAGAAAACATGG

Hs.4943 配列番¾105 TACTGGGAACGACTAAGGACTCA 配列番 106 TGCTGTGnGAGTAGGTTTCTGA

Hs.106326 配列番 ¾107 TGAGAGTCCTCAGAGGGTATCAG 配列番 CTTGAAGTCAAGAGTCCTGGTGT

M13436 配列番 *109 TTTCTGTTGGCAAGTTGCTG 配列番 10 CCCTTTAAGCCCACTTCCTC

X99920 配列番号 111 GATGAGAAGATGAAC5AGCTTGGA 配列番 *112 GAGGAAGCTTTATTTGGGAAGAG

U22970 配列番*" 3 ACTTCCCTCTCTGCCTTTCTG 配列番 *11 CAGATTGmTGGGCTTCTCACT 4 012455

(半定量 PCRのプライマー （再発グループで高発現する遺伝子） ）

表 4 B

(RT-PCR産物のシグナル強度測定と予後スコアの計算）

RT-PCR産物のシグナル強度を実施例 1で記述した手法と同様に測定 .評価し、 t-テス卜で 0.05以下の p値を示した 10遺伝子を候補として選んだ；そのうち 3遺伝子 の発現レベルは、 5y-Fグループに対して 5y-Rグループで高かった。 そして、 7遺伝 子の発現レベルは、 5y-Rグループに対して 5y-Fグループでより高かった。 このィ ンフオメ一ションを使って、 node陰性乳癌の術後予後を予測するスコアリングシ ステムの確立を試みた。

各遺伝子の対象とする発現レベルを得るために、 GAPDH発現に対するその発 現比率 （ER) を次の式によって計算した；

遺伝子 Aの ER = 癌サンプル Xの遺伝子 Aの半定量 PCR (ェチジゥムプロマイド染 色したパンドの強度） の 16-bit のイメージングスコア/癌サンプル Xの遺伝子 Aの GAPDHの 16-bitのイメージングスコア (node陰性乳癌の術後予後を予測するスコアリングシステムの定義）

node陰性乳癌の術後の遺伝子予後指標を構築するため、 予後スコア （PS) を定 義した； （5Y-Fグループに比べて 5Y-Rグループで高発現する遺伝子の正規化した 発現比率の合計） 一 （5Y-Rグループに比べて 5Y-Fグループで高発現する遺伝子の 正規化した発現比率の合計）

2つのグループ間の発現比の有意さは Student's t-テストで評価した。全ての統計 手法は、 Statview version 5.0 (SASInstitute、 Cary、 NC) によった。 (結果）

ゲノムワイドな遺伝子発現を検討した 24の乳がん患者の臨床病理所見を表 3 に要約した。 本発明者らは、 手術後 5年以上の間無病生存した 12例の node陰性乳 癌患者 （5Y-F) 、 及び外科手術の後に 5年の内に乳癌が再発した 12例の node陰性 乳癌患者（5Y-R)からの腫瘍について、 25,344のヒト遺伝子から構成される cDNA マイクロアレイによる遺伝子発現を検討した。 臨床のバックグラウンドは、 2つ のグループの間で、年齢、腫瘍径、エストロゲン受容体とプロゲステロン受容体、 及び病理学的に合致させた。

cDNA マイ ク ロ ア レイ のデー タ を 、 Mann- Whitney テス ト と Random-permutationテストにより分析し、 5Y-R及び 5Y-F腫瘍間で異なる発現を 示す遺伝子を同定した。 このフィルタ一で全 58遺伝子を選び、 そのうち 21遺伝子 が 5Y-R腫瘍で有意に強く発現した。そして 37遺伝子が 5Y-F腫瘍で高い発現レベル を示した。

5Y- 腫瘍に比べて 5Y-F腫瘍で高発現する 37遺伝子には、 6つの ESTs と 1つの 仮想たんぱく質があった （表 5 A、 各グループ間での発現の差異を" foldchange" として示す） 。 (5Y-R腫瘍に比べて 5Y-F腫瘍で有意に高発現する遺伝子)

表 5 A

Acノ HS 種類 - fold change

M90439 molecular marker (EPC- 1 ) gene 2.324 0.001

AF047472 spleen mitotic checkpoint BUB3 (BUB3) 2.889 0.0021

Hs.11 B251 ESTs 2.121 0.0031

D261 25 3 alpha-hydroxyste roid/ dihydradio I dehydrogenase DD4, partial cds 2.084 0.0036

Hs.8619 S Y(sex determining region Y) - ox 1 8 3.375 0.0041

X16135 novel heterogeneous nuclear RNP protein, L protein 4.839 0.0042

Hs,9006 VAMP(vesicle-asso elated membrane prateir - associated protein A,33kDa 3.807 0.0058

M1 8963 islet of Langerhans regenerating prate Inく reg) 2.022 0.0060

X07979 Integrin beta 1 subunit 2.997 0.0068

AF018080 PYRIN (MEFV) 4.016 0.0071

Hs.58464 ESTs 5.415 0.0079

S79867 type I keratin 16 [human, e idermal keratinocy es, mRNA Partial, 1 22 nt] 2.254 0.0090

J 2854 myosin light chain (MLC-2) 2.668 0.0090

Z35309 adenylate cyGlase8(brain) 2.264 0.0094

Hs.83097 hypothetical pratein FLJ22955 4.979 0.0096

Hs.79137 prate In—し iso s pa rate ( D~as pa rtate )o - me tylt ra nsf e rase 2.401 0.01 05

Hs.4864 ESTs 2.043 0.01 07

Y00052 Peptldylprolyl iso me rase A(cycIo philln A) 2.966 0.01 07

Hs.5002 copper chape rane for superoxide dismutase; CCS 2.032 0.011

U43519 dystraphtn-related protein 2 (DRP2) 2.022 0.011

Hs.106326 ESTs 4.733 0.0123

Hs.94653 ne uro cho ndrin(KIAA0607) 2.08 0.01 29

M13436 ovarian beta-A-lnhlbin 2.946 0.01 35

X51441 serum amyloid A (SAA) protein partial, clone pAS3 - alpha ' 2.383 0.01 55

Hs.1 08623 thrambospondin 2 2.019 0.0174

Hs.531 8 ESTs 4.38 0.0174

Hs.69^69 GA17 prate in 2.279 0.0197

AA777648 peripheral myelin protein 22 2.386 0.0209

Hs.1 061 31 ESTs 2.022 0.0213

X54079 heat shock protein HSP27 5.637 0.021 7

D67025 proteasome (proso me, macrapairv 26S subunit, non-ATPase, 3 3.179 0.0359

M80469 MHO class I HLA-J gene 3.572 0.0380

AI041182 ov77e07.x1 Soarcs.testis.NHT Homo sapiens cDNA clons IMAGE:1643364 2.321 0.0380

AA1 8265 RIBOSOMAL PROTEIN L 1. 2.019 0.0440

Hs.4943 Inter* Alpha - Tryt^ln Inhibitor Heavy Chain LIKE gene 2.426 0.0442

X99920 S1 00 calcium-binding prate in Al 3 3.326 0.0456

U22970 inte rfe no n-inducible peptide (6-1 6) eene · 2.741 0.0465 表 5 B は 5Y-Rグループ において高発現する 21遺伝子をリストにした。 その 5 つが ESTs で、一つが仮想たんぱく質をコードする。 58遺伝子のこのパネルから、 次のような基準で術後予後のマーカーを選んだ； （1 ) 症例の少なくとも 60%に 位置するカットオフレベルより高いシグナル強度をもつ； （2 ) I /x R- iF | >1.0、 ここで R( F)は、 5Y-R又は 5Y-F症例における対数変換発現比率から導かれる平 均値示す。 (5Y-F腫瘍に比べて 5Y-R腫瘍で有意に高発現する遺伝子)

表 5 B

Aa/HS 種^ fold change

X75252 Prostatic Bindig protein 4.506 0.001 1

AA9891 27 major histocom atibility complex, class 1,0 5.731 0.0060

Hs.1 28520 ESTs 1 .41 9 0.0067

HSMLN50 ESTs 3.482 0.0071

AF058701 DMA polymerase zeta catalytic subunit (REV3) 2.1 85 0.0085

AF043473 delayed - rectifier K+ channel alpha subunit (KCNS1 ),Potassium 4.786 0.01 44 voltage-gated channel, delayed— rectifier, subfamily S, member 1

Hs.26052 hypothetical protein MGC43306 4.829 0.01 50

Hs.77961 major histo compHtibility complex, class I, B . 5.775 0.01 52

Hs.26464 HIRA interacting protein 3 5.07 0.01 57

U44798 U1 -snRNP binding protein ho mo log (70kD) 2.61 5 0.01 94

Hs.77961 HC class I HLA-Bw62 5.775 0.0209

X64707 曰 B〇1 mRNA(ribosomal protein L13) 2.758 0.0210

Hs.6780 PTK9L protein tyrosine kinase 9一 like (A6- related protein) 2.749 0.0220

Hs.1 53428 Ests 3.1 64 0.0234

AI066764 leGtin, galaGtoside-binding, soluble, 1 (galectin 1 ) 2.606 0.0275 cl.5994 ESTs 2.844 0.0286 x1 6064 Tumor protein, translat io nalli/-co ntro lied 1 3.567 0.0366

E02628 polypeptide chain elongation facto alpha 4.055 0.0427

HUMTHYB4 thymosin eta-4 4.05 0.0436

Hs.1 1 6922 ESTs 2.538 0.0494 x1 5940 ri oso mal protein U31 . 2.1 25 0.0499

5Y-Rに比べ 5Y-F腫瘍で高発現する 7遺伝子 （Hs.94653、 M13436、 Hs.5002、 D67025、 M80469, Hs.4864、 及び Hs.106326 ; p=0.0018、 0.0011、 0.001、 0.008、 0.0081、 0.0018及び 0.001；各 Student'stテストによる;)及び 5Y-R腫瘍で比較的高発 現する 3遺伝子（AF058701、 AI066764、及び xl5940 ; p=0.0351、 0.00161及び 0.0001； 各 Student'st-テストによる）が基準に合致し、予後マーカ一として選択した（表 6 )。

(node陰性乳癌の予後マーカ一として選別した遺伝子)

表 6

AF058701 DNA polymerase zeta catalytic subunit (REV3)

AI066764 lectin, la cto side -binding, soluble, 1 (gale ctin 1 )

x15940 ri osomal protein L31.

Hs.94653 neuiOGhonclrin(KIAA0607)

Μ1343Θ ovarian beta - A-inhibin

Hs.5002 copper chape rone for superoxide dismutase; COS

D67025 proteasome (prasome, macro pain) 26S subunit, non - ATPase, 3

M80469 MHC class I HLA-J gene

Hs.4864 ESTs

Hs.106326 ESTs

GAPDH発現に対する正規化後半定量 RT-PCR実験でこれらのマーカ一の発現 を確認した。 図 3は、 乳癌再発 （5Y-Rグループ） の 12患者からのサンプルで高発 現する 3つのマ一力一遺伝子の: RT-PCRの結果を示す。 図 4は、 5Y-F (5年生存） グループで高発現する 7つのマーカ一遺伝子の結果を示す。 これら 10遺伝子の発 現比率を予後指標の定義に用いた。

予後スコア （PS)を次のように定義した；

PS = (5Y-R腫瘍で高発現する 3遺伝子の正規化した発現比率の合計）一 （5Y-F 腫瘍で髙発現する 7遺伝子の正規化した発現比率の合計）

検討した 24ケースの予後スコアを、 各マーカー遺伝子の発現比率と共に、 表 7 に要約した。 PSシステムは、 3より高い予後スコアを有する症例 R1から R12につ いては、 不良予後を予測した。 一方、 -16より低いスコアの症例 F1から F12につい ては、 良好予後を予測した。 この予測は、 実際のこれらの臨床結果と、 100%の 正確性で一致した （図 5) 。 5Y-Rグループの平均 PSは 9.44、 そして 5Y-Fグループ の平均 PSは- 28.92であった。 (node陰性乳癌再発の予後スコァ）

表 7

実施例 3

原発性乳癌における術後予後予測の遺伝子発現機能の評価

(組織サンプル）

組織サンプルは実施例 1記載の手法と同様に採取した。 1995-1997年の期間にお いて、 乳癌のための手術を受けて、 5年以上の間または死亡時まで臨床的に追跡 調査された 954人の患者の中から、 手術後 5年以内に死亡した 10例と手術後 5年以 上の間無病生存した 10例を標本として選んだ。 2つの患者グループの臨床背景は 年齢、 リンパ節への転移、 腫瘍径と組織型に関して、 可能な限り厳密に一致させ た （表 8 ) 。 最終的な予知システムをテストするのに用いた追加 20ケースの臨床 背景を表 9に要約した。 (マイクロアレイ分析に用いた患者の臨床的プロフィール)

表 8

ケース T N M ステ- -ジ年齢 NL³ ly^bf ^C ER^d

MS1 2 1 0 II 52 4 1 2 P

MS2 2 2 0 II 47 2 0 1 P

生存者

MS3 2 2 0 II 40 5 0 1 N

MS4 2 2 0 II 64 3 0 1 N/A

MD1 2 2 0 II 47 5 0 0 P

MD2 2 2 0 II 34 3 3 0 N

MD3 2 2 0 II 66 4 0 3 N

MD4 2 0 0 II 71 2 0 1 P

i\) Number of lymph nodes involved.

b) Lymph vessel invasion: 0, no cancer cells in vessels.

3, many cancer cells in vessels.

c) Fat invasion: 0, no invasion to fat tissue; 3, severe invasion to fat tissue. (I) Estrogen receptor status: P, positive; , negative; N/A, not available.

(RT-PCR分析に用いた患者の臨床的プロフィール)

表 9

ケース T N M ステージ iy^a f ^b

S1 2 0 0 II 0 1.

S2 2 2 0 II 1 0

S3 2 2 0 II 0 2

S4 2 1 0 II 1 0

S5 2 2 0 II 3 2

S6 2 0 0 II 0 0

S7 2 1 0 II 0 0

S8 , 2 1 0 II 0 2

S9 2 1 0 II 1 2

S10 2 1 0 II 0 0

D1 2 1 0 11 0 1

D2 2 2 0 II 0 0

D3 2 2 0 II 3 0

D4 2 2 0 11 0 3

D5 2 2 0 II 1 3

D6 2 .1 0 II 0 1.

D7 2 0 0 II 0 1

D8 2 1 0 11 0 0

D9 2 4 0 IV 1 0

D1.0 2 1 0 II 0 2

i Lymph vessel invasion h) Fat infiltration 年齢 ^e リンパ節 ^£|

関与

52.8 7.6

死亡茕 56.0 5.4

Mean of age (I) Average number of lymph nodes involved

(臨床病理 （Clinicopathological) パラメ 実施例 1で記術した手法で臨床病理パラメータを調べた。

(cDNAマイクロアレイの調製）

実施例 2で記述した手法で cDNAマイクロアレイの調製を行った。

(RNA抽出と RNA増幅）

RNAを TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA、 USA) で抽出した。 変性 RNAを除 去するため、 各々の抽出された; RNA { \ H g ) を、 3.0%ホルムアルデヒド変性ゲ ル上で電気泳動した。 DNA混入を除去するため、 RNeasyキット （QIAGEN、 Valencia CA を用レ て精製した？ MessageAmp aRNA千ッ卜 （Ambion、 Austin, TX) による Τ7 R N Aポリメラーゼベースの増幅を行い、 マイクロアレイ分析に 用いる RNAを調製した。 最初の増幅では、 RNA (5 Ai g) を錶型として用いた。 その後、 最初に増幅された RNA (aRNA) (2 x g) を、 二回目の増幅のための铸 型とした。 増幅された aRNAsは RNeasy精製キットで精製し、 各 aRNAの量を分光 光度計により測定した。

(aRNAの標識、 ハイブリダイゼーション及びデータ分析）

Amino Allyl cDNA標識キット （Ambion、 Austin, TX) により、 二回目の増 幅による蛍光プローブ作成用 aRNA (5 i g ) を用いて、 ハイブリダィゼーシヨン プロ一ブを作成した。 癌 RNA及び正常なコントロール RNAに由来するプローブ を、 Cy5ま 7こ! ¾Cy3の Mono-Reactive'Dye Amersham Bioscience UK Limited, Buckinghamshire, UK) で各々標識した。

非結合色素を除去するために、 標識プローブを、 QIA quick PCR精製キット (QIAGEN、 Valencia, CA) で精製した。 腫瘍及び正常 RNAからの蛍光標識プ ローブの各々 lOpmolを、 4xマイクロアレイハイブリダィゼーシヨン 'バッファー (Amersham (UK) ) 及び脱イオン化したホルムアミドと混合した。 プローブ混 合物を、 40でで 15時間 cDNAアレイにハイブリダィズさせた。 その後、 5分間で 1 回、 その後 10分間で 2回にわたり 0.2%SDSを含む O.lxSSCで洗浄した。 全ての手順 は、 AutomatedSlide Processor System (Amersham) で実行した。 それぞれのハイ ブリダイゼーシヨンのシグナル強度は、 Gene Pix 4000 (Amersham)で読み取り、 GenePix Pro 3.0 (Axon Instruments, Inc.、 Foster City、 CA、 USA) によって評価 し た 。 み 取 っ た シ グ ナ ル は 、 totalgene normalization method (Yang,Y.H.,Dudoit,S., Luu, P., Lin, D.M., Peng, V.'Ngai, J., and Speed, T.P. (2002). Nucleic Acids Res 30, el5.； Manos, E.J., andJones, D.A.(2001). Cancer Res 61, 433-438. ) によって正規化した。

生存者と死亡者のグループ間で異なる発現を示す遺伝子を確認するために、 正 規化したシグナルを、 Mann-Whitneyテス卜で分析した；正規化したシグナルを 一連の Xに適用した。 Xとはそれぞれの遺伝子及びサンプルのための Cy5/Cy3シグ ナル強度比率である （Ono,K.,et al.(2000). Cancer Res 60, 5007-5011. ) 。

Mann-Whitneyテス卜で 0の U値を示した遺伝子と 2つのグループ間で発現強度が 2.0倍以上の違いを示したものを選んだ。 S/N比が 3.0未満の遺伝子は、検討から除 外した。

(半定量 RT-PCR及び遺伝子発現比率）

マイクロアレイのデータを検証するため、 本発明者らは: RNA (lO g) を逆転 写することにより、半定量 RT-PCR実験をした。転写された cDNAの濃度を調整す るため、 GAPDHを内部コントロール'として選び、 半定量 RT-PCRを実行した (Ono,K.,etal.(2000). Cancer Res 60,5007-5011. ) 。 GAPDHのプライマ—は、 5'-ggaaggtgaaggtcggagt-3 (Foward) 、 及び 5-tgggtggaatcatattggaa-3 (Reverse) で あった。 プライマ一の濃度を調整した後に、 半定量 RT-PCRを生存者と死亡者の グループからのサンプルで、 選別した遺伝子について実行した。 当該遺伝子 （表 1 0 ) の 各 々 の た め の プ ラ イ マ ー は 、 NCBIGen Bank ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ) の シーケ ンス情報 と ウ ェ ブサイ ト (http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi) 上のプフィ マー 3に基づいて設計した。 各半定量 PCR実験は、 テンプレートとして濃度を調 整した cDNA (l l) 、 5Uの TakaraEXTaq (Takara、 大津、 日本） 、 lxPCRバッ ファー （10mMの Tris-HCl、 50mMの KC1、 1.5mMの MgCl₂) 、 ΙΟηΜの dNTPsと lOpmolの前方及び後方プライマーで 30 1総量にて行った。

目 ii歹¹ J番号 160 ggaaggtgaaggtcggagt

酉己歹 !J番号 161 tgggtggaatcatattggaa

(半定量 P C Rのプライマー）

表 1 0

生存者と死亡者のグループの間で遺伝子発現の強度を評価するために、 各半定 量 PCR産物 （8 1) を、 2.5%ァガロースゲル上で電気泳動し、 ェチジゥムブロマ イドで染色した。 各々の染色されたサンプルの強度は、 バックグラウンド校正を 用いて Alphalmager 3300 (Alpha Inonotech、 San Leandro、 CA) により測定し た。 各遺伝子の発現レベルを得るために、 その発現比率を、 GAPDHの発現レべ ルで正規化した。

発現比率は、 以下の公式によって定義された：遺伝子 Aの発現比率 = 癌サン プル X 中の遺伝子 Aの半定量 PCRの 16ビットのイメージングスコア （ェチジゥム ブロマイドで染色したパンドの強度） /癌サンプル X中の GAPDHの 16ビットのィ メージンダスコア

(原発性乳癌の予後指標 （PI) の定義）

本発明者らは、 5 Sグループにおいて高発現する遺伝子の正規化した発現比率 の合計から、 5Dのグループにおいて高発現する遺伝子の正規化した発現比率の合 計を差し引くことにより、 原発性乳癌の予後指標 （PI) を定義した。 2つのグルー プ間の発現比率の有意性は Student'st-テストで評価した。 5S及び 5Dのグループ間 の PIの比較は Mann- Whitneyテストにより行った。 全ての統計は Statview version 5.0を使って保管した （SASInstitute Inc.、 Cary、 NC) 。

(結果）

18,432のヒト遺伝子からなる cDNAマイクロアレイ上で、 8人の乳癌患者からの 腫瘍のゲノムワイドな遺伝子発現機能を調べた。 患者のうちの 4人は手術後 5年以 上の間無病生存し （5S) 、 4人は 5年以内で、 乳癌で死亡した （5D) 。 臨床病理学 的背景は、 2つのグループ間で年齢、 腫瘍径、 リンパ節転移、 ホルモンレセプタ —状態と組織型について可能な限り厳密に一致させた （表 8 ) 。

5Dと 5Sのグループ間で異なる発現を示す遺伝子を同定するために、本発明者ら は Mann- Whitney テストによつて cDNA マイクロアレイのデータを分析した。こ れらの遺伝子のうちの 6つの ESTs/仮想タンパク質である合計 23遺伝子は、 Mann- Whitneyテストで 0の U値を示し、 5Sグループにおいて高発現する遺伝子で ある （表 1 1 ) 。

(マイクロアレイ分析の解析による生存グループで高発現する遺伝子群)

表 1 1 遺伝子名及び詳細

表 1 2は、 5Dの腫瘍において一般に髙発現しており、 6つの ESTs/仮想タンパ ク質を含み、 Mann-Whitney テストでゼロの U値を持つ 21遺伝子を記載する。 表 において、 "foldchange"として、 2つのグループ間の遺伝子発現の違いを示す。

(マイクロアレイ分析の解析による死亡グループで高発現する遺伝子群)

表 1 2

遺伝子名及び詳細

】

】

5Sグループにおいて高発現する 23遺伝子及び 5Dグループにおいて高発現する 21遺伝子から、 以下の基準に従って術後予後の予測マーカーを選んだ； （1 ) マ イクロアレイ分析では、 全ての症例の 5 S及び 5 D間のシグナル強度の違いが 2.0倍 より大きい ； （2 ) 半定量 PCRの 5S及び 5D間のシグナル強度が有意に異なる (Student'st-テストによる p値く 0.05) ； ( 3 ) 半定量 PCRの結果は、 独立した 3回 の実験によって再確認した。 5S腫瘍において高発現する 7遺伝子、 及び 5D腫瘍に おいて高発現する 3遺伝子は予後マーカーを選択するこれらの基準を満たした。 5Sグループにおいて高発現する 7遺伝子は、 pro-alpha-1 type 3 collagen (ΡΠΙΡ), complement component Clr、 dihydropyrimidinase-like 3 ( DPYSL3 ) 、 proteintyrosinekinase 9-like (PTK9L) 、 carboxy peptidase E (CPE) 、 a -tubulin と jS -tubulinをコードしている遺伝子から構成されている。これらのマーカー遺伝 子の Student'st-テストの p値は、 それぞれ 0.00039、 0.0012、 0.0042、 0.036、 0.039、 0.034と 0.00069であった。

5Dグループにおいて高発現する 3つのマーカー遺伝子は、 heat shock protein HSP 90-alpha gene、 malatedehy drogenas e ^及ひ、 ΝΑΰΗ dehydrogenase (ubiquinone) 1 beta subcomplex, 3 (NDUFB3)をコードしていた。 当該遺伝子の Student'st-テ ストの p値は、 それぞれ 0.05、 0.0055及び 0.011であった。

本発明者らは、半定量 RT-PCRの実験結果を、 内部コントロールとして GAPDH で正規化し評価することによりマーカー遺伝子の選択を検証した。

本発明者らは無作為に選んだ追加 20症例を調べるために半定量 PCRを行つた。 これらの患者のうちの 10人は手術後 5年以内に乳癌で死亡し、 そして、 残りの 10 人は 5年以上の間無病生存した。 図 7は、 5S腫瘍において高発現する 7つのマーカ 一遺伝子の： RT-PCRの結果を示す。図 8は、 5D腫瘍において高発現する 3つのマ一 力一遺伝子の RT-PCRの結果示す。

本発明者らは、 次のように予後指標 （PI) を定義した： （5Sグループにおいて 高発現する遺伝子の正規化した発現比率の合計） 一 （5Dグループにおいて高発現 する遺伝子の正規化した発現比率の合計） 。 選ばれたマーカー遺伝子の発現比率 と共に、 更なる試験例のための予後指標を、 表 1 3にまとめた。

(遺伝子の発現比率と予後指標）

表 1 3 S a a

一

PIは、 5Sグループの全 10症例 （S1から S10) の高い予後指標 （>7) 及び 5Dダル プの全 10症例 （D1から D10) の予後指標 （<7) (図 9) の実際の臨床結果を正 確に予測した。 5Sグループの PIは 21.2であった、 そして、 5Dグループの PIは- 0.7 であった。ここで PI値 7は、明らかに 5S腫瘍と 5D腫瘍を区別していた（p=0.0002) 産業上の利用の可能性

本発明の術後予後予測システムは、乳癌患者の術後リスクの予測に有効である。 さらに、 本発明の乳癌関連遺伝子の広範囲に及び遺伝子発現リストは乳癌の進行 についての様々な情報を提供するとともに、 乳癌治療の潜在的夕一ゲット分子の 予測が可能となる。 配列表フリーテキスト

配列番号 1〜 1 8 1 ：合成物

Claims

1 . 乳癌の術後予後予測に関与する以下の定義の少なくとも 1よりなる遺伝子；

1 ) エストロゲンレセプ夕一陰性の乳癌において、 外科手術後 5年以内に死亡 した乳癌患者からの遺伝子（5y-Dグループ）と数年以上無病（disease-free) 生存した患者からの遺伝子 （5y-Sグループ） とが、 その発現機能によって 区別することができたマーカ一遺伝子群。

ョ口

2 ) 手術時にリンパ節への転移がなかった（node陰性） （ηθ) 乳癌において、 手術後 5年以内に再発した ηθ乳癌の患者からの遺伝子 （5Y-Rグループ） と 5 年以上の間無病生存した患者からの遺伝子（5Y-Fグループ） とが、 その発 現機能によって区別することができたマーカ一遺伝子群。

3 ) 原発性乳癌において、 外科手術後 5年以内に死亡した乳癌患者からの遺伝 子 （5Dグループ） と数年以上無病生存した患者からの遺伝子 （5Sダル一 プ）とが、その発現機能によって区別することができたマーカー遺伝子群。 2 . 原発性乳癌の術後予後予測に関与する以下の配列より選ばれる遺伝子；

pro-alpha- 1 type 3 collagen (ΡΙΠΡ)、

complement component Glr、

dihydropyrimidinase-like 3 (DPYi>L3)、

protein tyrosine kinase 9-like (PTK9L)>

carboxypeptidase E (CPE)、

alpha-tubulin、

beta- tubulin、

heat shock protein HSP 90-alpha gene、

malate dehydrogenase ^

NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 beta subcomplex, 3 (NDUFB3)。

3 . 原発性乳癌の術後予後予測に関与する予後の良い群で高発現する以下から選 ばれる遺伝子；

pro-alplia-1 type 3 collagen (PIIIP)、 complement component Clrゝ

dihydropyrimidinase-like 3 (DPYSL3)、

protein tyrosine kinase 9-like (PTK9L)、

carboxypeptidase E (CPE)、

alpha-tubulin、

beta- tubulin

原発性乳癌の術後予後予測に関与する予後の悪い群で高発現する以下から選 ばれる遺伝子；

heat shock protein HSP 90-alpha gene、

malate dehydrogenase ,

NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 beta subcomplex, 3 (NDUFB3)。

手術時にリンパ節への転移がなかった （node陰性） （ηθ) 乳癌において、 術 後予後予測に関与する以下の配列より選ばれる遺伝子；

AF058701/ DNA polymerase zeta catalytic subunit (REV3) 、

AI066764/ lectin, galactoside-binding, soluble, 1 (galectin 1)、

xl5940/ ribosomal protein L31.、

Hs.94653/ neurochondrin(KIAA0607),

M13436/ ovarian beta-A-inhibin、

Hs.5002/ copper chaperone for superoxide dismutase; CCS、

D67025/ proteasome (prosome, macropain) 26S subunit, non-ATPase, 3、

M80469/ MHC class I HLA-J gene,

Hs.4864/ ESTs、

Hs.106326/ ESTs。

手術時にリンパ節への転移がなかった （node陰性） （ηθ) 乳癌において、 術 後予後予測に関与する予後の悪い群で高発現する以下から選ばれる遺伝子；

AF058701/ DNA polymerase zeta catalytic subunit (REV3) 、

AI066764/ lectin, galactoside-binding, soluble, 1 (galectin 1)、

xl5940/ ribosomal protein L31.。

7 . 手術時にリンパ節への転移がなかった （node陰性） （ηθ) 乳癌において、 術 後予後予測に関与する予後の良い群で高発現する以下から選ばれる遺伝子； Hs.94653/ neurochondrin(KIAA0607)、

M13436/ ovarian beta- A-inhibm、

Hs.5002/ copper chaperone for superoxide dismutase; CC >

D67025/ proteasome (prosome, macropain) 26S subunit, non-ATPase, 3、 M80469/ MHC class I HLA-J gene.

Hs.4864/ ESTs、

Hs.106326/ ESTso

8 . エストロゲンレセプター陰性の乳癌において、 術後予後予測に関与する以下 ' の配列より選ばれる遺伝子；

Hs.108504/ FLJ20113/ ubiquitin-SDecific protease otubain 1

Hs.146550/ MYH9/ myosin, heavv polypeptide 9, non-muscle

Hs .194691 / RAI3 / retinoic acid induced 3

Hs.1975/ TDRD3/ tudor domain containing 3

Hs.203952/ TRRAP/ transformation/transcription domain-associated protein

Hs.278607/ GSA7/ ubiquitin activating enzyme El -like protein

Hs.429/ ATP5G3/

ATP synthase, H+ transporting, mitochondrialFOcomplex,

subunitc(subunit9)isoform3

Hs.75305/ AIP/ aryl hydrocarbon receptor interacting protein

Hs.81170/ PIM1/ pim-1 oncogene

Hs.99987/ ERCC2/

excision repaircross-complementingrodentrepairdeficiency,

complementationgroup2

Y12781/ Transducin (beta) like 1 rotein

Hs.104417/ KIAA1205 protein cl.21783/ Hypothetical protein

Hs.112628/ Hypothetical protein: MGC43581

Hs.170345/ Hypothetical protein FLJ13710

Hs.53996/ weakly similar to zinc finger protein 135

Hs.55422/ Hypothetical protein

Hs.112718/ EST

Hs.115880/ EST

Hs.126495/ EST

9. 予後の悪い群で高発現する遺伝子である請求項 8から選ばれる遺伝子。

1 0. 請求項 1〜9のいずれか一に記載の遺伝子に特異的なプローブ。

1 1. 請求項 1〜1 0のいずれか一に記載の遺伝子及び 又はプローブが搭載さ れた DNAマイクロアレイ。

1 2. DNAマイクロアレイが繊維型マイクロアレイである請求項 1 1記載のマ イクロアレイ。

13. 請求項 1〜 1 0のいずれか一に記載の遺伝子及び Z又はプローブをマーカ 一にする乳癌の術後予後の検査方法。

14. 請求項 1 1又は 1 2に記載のマイクロアレイを使用する乳癌の術後予後の 検査方法。

1 5. 請求項 1〜 1 0のいずれか一に記載の遺伝子及び Z又はプローブをマーカ 一にする乳癌の術後予後を制御する癌治療薬のスクリーニング方法。

16. 請求項 1 1又は 1 2に記載のマイクロアレイを使用する乳癌の術後予後を 制御する癌治療薬のスクリーニング方法。

1 7. 請求項 1〜 1 0のいずれか一に記載の遺伝子及び 又はプローブをマ一力 一にする試薬を含む乳癌の術後予後の診断キット。

18. 請求項 1 7記載の診断キットがマイクロアレイを包含するものである診断 キッ卜。

1 9. マイクロアレイが繊維型マイクロアレイである請求項 1 8記載の診断キッ 卜。