JP2005333987A - 悪性血液疾患の予後 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】癌患者、特に悪性血液疾患の患者の治療法であって、患者の遺伝子発現プロファイル及び/または分子マーカーを分析して、患者の状態及び/または予後を決定するステップを含む。本発明はまた、非再発性または非難治性患者がファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、場合によっては他の薬物の治療に対して応答し易いか否かを分析する方法も提供する。この方法は、患者の治療の監視及び治療方法の選択にも有用である。FTI治療に応答して調節された遺伝子を得て、これをプロファイルの作成に用いることができる。
【選択図】図5
Description
臨床評価及び応答の定義
この検査は、再発性または難治性AML患者を各28日サイクルの最初の21日間の開始経口投与量600mgでティピファニブで治療する、非盲検多施設非競合フェーズ2臨床試験(アルソー(Harousseau)ら(2003年))の一部である。患者は、再発性AML患者群と難治性AML患者群の2つの群に分けた。合計で252人の患者(再発性135人、難治性117人)を治療した。80人の患者を選択して、個々にインフォームドコンセントが必要な骨髄サンプルをRNAマイクロアレイ分析のために採取した。この検査では全体の応答率が比較的低かった。従って、遺伝子発現プロファイリングのために、患者をティピファニブに対する応答に対して、病理によって決定される客観的応答のある患者(完全な緩解(CR)、血小板の回復が不完全な完全な緩解(CRp)、または部分的な緩解(PR))、臨床部位によって決定される血液学的応答のある患者(骨髄の白血病芽細胞の50%を超える減少)、または病理及び臨床部位の両方によって決定される安定疾患の患者(血液学的応答はないが疾患が進行していない)に分けた。血小板の回復が不完全な完全な緩解は、輸血を必要としない100,000/μL未満の血小板数を除いて同様に定義する。部分的な緩解は、骨髄芽細胞が少なくとも50%減少し、好中球(>500/μL)及び血小板数(>50,000/μL)が部分的に回復した状態と定義する。応答は、初めの記録から少なくとも4週間後に確認しなければならない。
骨髄サンプルを、ティピファニブで治療する前に患者から採取し、このサンプルをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈し、Ficoll‐diarizoateで遠心分離した(1.077g/mL)。この白血球をPBSで2回洗浄し、10%ジメチルスルホキシド(DMSO)を含むウシ胎児血清(FBS)に再懸濁し、直後に−80℃で保存した。この細胞を解凍し、RNeasyキット(カリフォルニア州バレンシアのキアゲン社(Qiagen))で全RNAをこの細胞サンプルから抽出した。RNAの質を、Agilent Bioanalyzer(電気泳動装置)で検査した。Affymetrix(カリフォルニア州クララのサンタ社(Snata))プロトコルに従ってcDNA及びcRNAの合成を行った。
1回の増幅では複数のサンプルのRNA収量がチップハイブリダイゼーションに用いる十分な標識cRNAを得るのに不十分であるため2回の線形増幅を行った。ハイブリダイゼーションのために、11μgのcRNAを、40mM Tris酢酸、pH8.1、100mM 酢酸カリウム、及び30mM 酢酸マグネシウムで35分間、94℃でインキュベートしてランダムに断片化した。断片化したcRNAを、60rpmにセットしたローティッセ・オーブン(rotisserie oven)で16時間、45℃でU133Aアレイにハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションの後、このアレイを6×SSPE及びTritonX‐100(0.005%)を含む0.5×SSPEで洗浄し、次いで、ストレプトアビジン‐フィコエリトリン(SAPE:オレゴン州ユージーン(Eugene)の分子プローブ(Molecular Probes))で染色した。Agilent G2500A GeneArrayスキャナー(カリフォルニア州パロアルトのアジレント・テクノロジーズ社(Agilent Technologies))を用いて結合した標識プローブを定量した。
高い感度の応答が予測される遺伝子を同定するためにパーセンタイル解析を利用した。非応答者の少なくとも40%に比べて応答者の100%で上方制御または下方制御された遺伝子を同定した。カイ二乗検定及びスチューデントt−検定を用いて、ras突然変異状態及び遺伝子発現を含む患者の応答性と患者の共変量との相関性の有意性を調べた。自動k平均法及び階層クラスタリングをOmnivizで行った。次いで、選択された遺伝子の予測値を、Leave‐one‐out及びLeave‐five‐out cross validation法で解析した。ここで、データセットから1つ(または5つ)のサンプルから取り出し、マーカーを11,723の遺伝子から再選択した。次いで、この遺伝子の予測値を、線形判別分析を用いて残りのサンプルに対して調べた。感度を、検査で検出された真陽性の数を真陽性と偽陰性の合計数で除して求めた。特異性は、検査で検出された真陰性の数を真陰性と偽陽性との合計数で除して求めた。陽性の予測値は、真陽性の数を真陽性と偽陽性の合計数で除して求めた。陰性の予測値は、真陰性の数を真陰性と偽陰性の合計数で除して求めた。治療に応答する患者の陽性の尤度比は、感度を1から特性を減じたもので除して得られる。受信者動作曲線(ROC)を用いて、100%の感度を必要とする各クラシファイアの適切な閾値を選択した。このROCにより、診断のためにそれぞれのパラメータの感度及び特異性を計算することができる。
TaqMan(登録商標)リアルタイムPT‐PCRを用いてAHR遺伝子及びAKAP13遺伝子のマイクロアレイの結果を検証した。各1μgのサンプルの増幅したRNAから、製造者(インビトロジェン社(Invitrogen))の取扱説明書に従ってT7オリゴ(dT)プライマー及びSuperscript II逆転写酵素を用いてcDNAを作製した。AKAP13遺伝子及びコントロール遺伝子PBGDのプライマー及びMGBプローブをPrimer Express(アプライド・バイオシステムズ社(Applied Biosystems))を用いてデザインし、AHR遺伝子及びコントロール遺伝子HPRTのプライマー及びプローブは、ABIがAssays‐on−Demandとして販売している。AKAP13のプライマー/プローブの配列は、AKAP13順方向プライマー:5’GGTCAGATGTTTGCCAAGGAA3’、AKAP13逆方向プライマー:5’TCTTCAGAAACACACTCCCATC‐3’、AKAP13プローブ:6FAM‐TGAAACGGAAGAAGCTTGTA‐3’である。全てのプライマー及びプローブは、90%を超える最適な増幅効率であるかについて検査した。相対検量線は、HeLa cDNA(大抵の場合は、25ng〜2.5pgの範囲)の5つの希釈液(それぞれ10倍)から構成されている。RT‐PCR増幅混合物(25μL)には、100ngの鋳型cDNA、2×TaqMan(登録商標)ユニバーサルPCRマスターミックス(12.5μL:アプライド・バイオシステムズ社(Applied Biosystems))、500nM 順方向プライマー及び逆方向プライマー、及び250nM プローブを含む。ABI PRISM 7900HT Sequence Detector(アプライド・バイオシステムズ社)上で反応させた。サイクル条件は、50℃での2分間のAmpErase UNGの活性化、95℃での10分間のポリメラーゼの活性化、95℃で15秒間とアニーリング温度(59℃または60℃)で60秒間のサイクルを50回である。それぞれのアッセイでは、目的の遺伝子及びコントロール遺伝子に対して検量線、非鋳型コントロール、及び鋳型cDNAが3つずつ含まれている。それぞれの遺伝子の相対的な量は、検量線に基づいて算出し、コントロール遺伝子の量で標準化した。3つの同じサンプルの平均変動率(算出した量に基づいた)は8%であった。ストックから個々に希釈した鋳型を用いた反復実験間の相関性が0.95を超えていた。同じTaqMan(登録商標)実験が再現性のある結果を示した場合は、サンプルを単にマイクロアレイデータと比較した。
AKAP13ベクター、オンコLBC、プロトLBC、及びベクターコントロール(pSRalpha−neo)を、ドクター・デニズ・トクソ(Dr. Deniz Toksoz)から入手した(チェン(Zheng)ら(1995年))。HL60細胞系を米国組織培養機関(American Tissue Culture Collection)から入手して、10%FBSを含むRPMI 1640で増殖させた。細胞は、製造者の取扱説明書に従ってEffectene試薬(キアゲン社)を用いてそれぞれのベクターで一過性に形質移入し、G418(600μg/mL)で7日間保存した。次いで、ティピファニブを様々な濃度(0、1.5、3.1、6.3、13、25、50、100、200、1000、及び10,000nM)で同じ培養液(1.5×105細胞/mL)に添加した。細胞数を6日目にカウントした。細胞数を薬物を含まない培養液に対して標準化してコントロール生細胞のパーセントを得た。
再発性及び難治性AMLの発現プロファイリング
FTIsはもともと、ファルネシルトランスフェラーゼ酵素(FTase)活性を特異的に阻害して発癌遺伝子ras経路を遮断するようにデザインされている。従って、ras変異の活性化について、再発性または難治性AML患者80人の骨髄からのDNAをまず分析し、ras変異とティピファニブに対する応答との考えられる相関性を調べた。AMLサンプルの26%がN‐ras変異を含み、変異状態は客観的応答や全生存と相関していなかった(アルソー(Harousseau)ら(2003年))。従って、FTIティピファニブに対する応答の予測に用いることができる新規のシグネチャを特定するために遺伝子発現プロファイリングを行った。ティピファニブで治療する前に80人の患者から遺伝子発現分析のために骨髄サンプルを採取した。表2に、患者の情報が示されている。
応答者と非応答者の間で差次的に発現する遺伝子の同定
次に、全ての応答者と少なくとも40%の非応答者との間で差次的に発現する遺伝子を同定するために遺伝子発現データを用いて管理下で解析を行った。このような基準は、可能な最高レベルの感度でティピファニブに対する応答を予測できる遺伝子を同定するために選択した。応答者と非応答者とを分類でき(表5)、t‐検定で有意なp値(p<0.05)が得られる合計19の遺伝子(表4)を11,723の遺伝子から同定した。シグナル伝達、アポトーシス、細胞増殖、発癌、及び場合によってはFTI生物学に関与する遺伝子も含まれている(ARHH、AKAP13、IL3RA)
マイクロアレイ遺伝子発現データを検証するために、マイクロアレイハイブリダイゼーションに用いる標識標的cRNAの作製に用いたcDNAに対してTaqMan(登録商標)リアルタイムRT‐PCRを実施した。遺伝子発現データを検証するために2つの遺伝子を選択した。AHR遺伝子及びAKAP13遺伝子が、応答者に対して最高レベルの特異性が得られたため選択した。相関率は、AHRが0.74、AKAP13が0.94であり、マイクロアレイ遺伝子発現データがPCRによって認証されたことを意味する(図2)。
AKAP13が、ティピファニブに対して耐性のある患者で過剰発現した。この遺伝子の予測値を、Leave‐one‐out cross validation法(LOOCV、図3のA)で58のサンプルについて計算した。AKAP13遺伝子の発現は、96%の負の予測値(NPV)の非応答、43%の正の予測値(PPV)の低発現レベル仲介応答を予測した(x2=13.7、P=0.0022)。全体的な診断精度は69%であり、応答の正の尤度比が2.4であった。従って、AKAP13遺伝子の発現に基づいたこの患者集団の分類により、応答率が全群の24%(14/58)から遺伝子発現率の低い患者群の43%(13/30)に増大した。各患者におけるAKAP13遺伝子の発現の値が図3のBに示されている。生存をカプラン‐マイヤー分析(Kaplan-Meier analysis)で分析すると、この遺伝子の発現が低い患者の平均生存期間は発現レベルが高い患者よりも90日長かった(P=0.008、図3のC)。
AKAP13単独よりも優れた精度でティピファニブに対する応答を予測できる遺伝子マーカーの候補のセットを同定するためにLOOCVを用いた。クラシファイアを、t‐検定のP値に基づいた遺伝子数の増大を用いて作成し、このようなクラシファイアの誤差率をLOOCVで計算し、予測する応答感度を100%に維持する(図4のA)。3遺伝子クラシファイアは、低い誤差率で応答を予測できる(図4のA)。これは、Leave‐five‐out cross validationを実施した時に確認された。遺伝子を追加すると誤差率が上昇するため、追加の遺伝子がクラシファイアにノイズを付与することを示している。3遺伝子クラシファイアの場合、LOOCVにより、NPVが94%、PPVが48%、全体的な診断精度が74%、正の尤度比が2.9であることが実証された(図4のB)。各患者における3遺伝子の発現値の組合せが図4のCに示されている。従って、この遺伝子シグネチャをもつ患者群の場合、ティピファニブに対する応答率が、この患者集団における24%(14/58)に対して48%(12/25)であった。
AKAP13遺伝子は、ティピファニブに対する耐性の最も強力なマーカーである。従って、HL60細胞系でこの遺伝子のオンコLBC変異体変異体及びプロトLBC変異体を過剰発現させてFTI生物学におけるその関与を調べた。次いで、一過性形質移入体をティピファニブに対する感度について検査した。このAML細胞系モデルにおける両方のAKAP13変異体の過剰発現により、コントロール細胞に比べティピファニブに対する耐性が約20倍増大した(図3)。LBCオンコジーンとLBCプロトオンコジーンの両方が、ティピファニブに対する耐性を同程度に増大させたのが、コントロールに比べて2以上のlog単位、死滅曲線の右方向へ平行移動していることで分かる。
近年、2つのグループが、臨床結果の予測に有用な新たに診断された成人AML患者の遺伝子発現プロファイルを確認した(ブリンガー(Bullinger)ら(2004年)、バルク(Valk)ら(2004年))。これらのプロファイルは、核型分析などの現在用いられている診断マーカーよりも強力なようである。更に、発現プロファイルで、標準的な化学療法薬(チャン(Chang)ら(2003年)、オクツ(Okutsu)ら(2002年)、及びチョク(Chok)ら(2003年))及び新規の選択抗癌剤を含む抗癌剤に対する応答性を予測できることが分かった(ホフマン(Hofmann)ら(2004年)、マックリーン(McLean)ら(2004年))。同様に、遺伝薬理学的プロファイルが、チロシンキナーゼ阻害剤ゲフィチニブ(gefitinib)に対する患者の応答に相関することが分かった(パエズ(Paez)ら(2004年)及びリンク(Lynch)ら(2004年))。この研究で、非小細胞肺癌患者の亜群が、標的治療に対する臨床応答に相関する標的上皮細胞成長因子受容体内で変異を起こしていることが分かった。
AML予後遺伝子シグネチャの分析
この3遺伝子シグネチャは、薬物治療の種類に関係なく予後を予測することができる。これを確認するために、まず従来の化学療法で治療した新たに診断されたAML患者で最近同定された遺伝子発現シグネチャを評価した(ブリンガー(Bullinger)ら(2004年))。このシグネチャは、cDNAアレイを用いて定義した。従って、まずこれらの遺伝子をAffymetrix遺伝子チップ上のプローブに一致させた。ブリンガー(Bullinger)らによって同定された133の予測遺伝子の内、167のプローブセット(103個の遺伝子に対応する)がAffymetrix U133Aチップに一致した。我々の分析で同定したこの3つの遺伝子は、ブリンガー(Bullinger)らの133遺伝子リスト(配列番号23‐189)に含まれていない。これらの167のプローブセットを用いて階層クラスタリングにより2つの主要な患者群に分類した(図8のA)。カプラン‐マイヤー分析(Kaplan-Meier analysis)により、これらのクラスターを良好な予後の患者と不良な予後の患者に明確に階層分類した(図8のB、P=0.0000219)。従って、我々のデータが、ブリンガー(Bullinger)ら(2004年)によって同定された133遺伝子予後シグネチャのサブセットを患者の再発性及び難治性の集団に使用できることを示している。従って、これが、予後遺伝子プロファイルが様々なマイクロアレイプラットフォーム及び様々な種類のAMLに対して驚くほど強力であることを示している。
臨床評価及び応答の定義
現在の試験は、AMLにおける各28日サイクルの最初の21日間の開始経口投与量600mg(1日2回)で単一薬剤としてティピファニブが投与されたファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤の有効性及び安全性について調べる非盲検多施設非競合フェーズ2試験である。患者は、再発性AMLと難治性AMLの2つの集団に分けた。合計で252人の患者(再発性135人、難治性117人)を治療した。遺伝子発現プロファイリングのために、ティピファニブに対する応答を、事後の任意の時点で病理または臨床部位によって、客観的応答(上記したCR、CRp、またはPR)のある患者、安定疾患であると確認された患者、または血液学的応答(白血病芽細胞の50%を超える減少)のある患者に分けた。
全てのサンプルを、前述の処理及び分析に同意した患者から採取した。骨髄サンプルを、ティピファニブで治療する前に患者から採取し、このサンプルをPBSで希釈し、Ficoll‐diarizoateで遠心分離した(1.077g/mL)。この白血球をPBSで2回洗浄し、10%DMSOを含むFBSに再懸濁し、直後に−80℃で保存した。この細胞を解凍し、RNeasyキット(カリフォルニア州バレンシアのキアゲン社(Qiagen))で全RNAをこの細胞サンプルから抽出した。RNAの質を、Agilent Bioanalyzerで検査した。Affymetrix(カリフォルニア州クララのサンタ社(Snata))プロトコルに従ってcDNA及びcRNAの合成を行った。1回の増幅では複数のサンプルのRNA収量がチップハイブリダイゼーションに用いる十分な標識cRNAを得るのに不十分であるため2回の線形増幅を行った。
自動階層クラスタリング及びクラスタリングをOmnivizで実施した。S‐Plusを用いてカプラン‐マイヤー分析(Kaplan-Meier analysis)を実施した。
新たなAMLで同定した予後シグネチャは再発性及び難治性の患者に有用である
近年発行された2つの研究論文に、新たに診断された成人AML患者の遺伝子発現のプロファイリング、及びこのプロファイリングの臨床結果の予測への使用が記載されている(ブリンガー(Bullinger)ら著(2004年)及びバルク(Valk)ら著(2004年))。Affymetrix U133A遺伝子チップを用いて再発性及び難治性のAML患者58人のプロファイリングを行った。ブリンガー(Bullinger)らによって同定された133の予測遺伝子の内、167のプローブセット(103個の遺伝子に対応する)がU133Aチップで同定された(図9)。この167のプローブセットを配列表に記載し、配列番号23‐189を付した。
応答者と非応答者(安定疾患の患者は含まない)との間で差次的に発現する遺伝子の同定
4人の患者が安定疾患であると分類されたが、これらの患者は応答者または非応答者に明確に区別できないため分析から除外した。安定疾患の患者を分析に含めると、薬物治療に関係なく予後に関連した遺伝子選択の分析が偏ってしまう恐れがある。従って、10人の応答者を44人の非応答者と比較することになった。選択される遺伝子は、40%の特異性を有し、最小の平均の変化が2倍である必要がある。このような基準は、可能な限り高レベルの感度でティピファニブに対する応答を予測できる遺伝子を同定するために選択した。11,723の遺伝子から、応答者と非応答者とを階層分類でき、かつt‐検定で有効なP値(P<0.05)が得られた合計8個の遺伝子を同定した(表6‐5)。これらの遺伝子の中には、シグナル伝達、アポトーシス、細胞増殖、発癌、及び場合によってはFTI生物学に関与する遺伝子が含まれている。
次に、8つの選択された遺伝子から最適な診断精度が得られる最小の遺伝子のセットを同定する。クラシファイアは、受信者動作曲線(ROC)解析で得たAUC値に基づいて遺伝子の増大数を用いて作成し、応答を予測する感度を100%に維持したまま、これらのクラシファイアの誤差率をLOOCVを用いて計算した(図12のA)。AKAP13遺伝子は、40%未満の最低の誤差率で応答を予測することができる(図12のA)。3つ以上の遺伝子をクラシファイアに用いる場合、誤差率が50%超に増大する。AKAP13の場合、LOOCVにより、NPVが93%、PPVが31%、全診断精度が63%、陽性の可能性の比率が2.0であることが示された(図12のB)。各患者におけるAKAP13の発現の値が図12のCに示されている。従って、AKAP13の発現率が低い患者群の場合、ティピファニブに対する応答率は、現在の患者集団の18%(10/54)に対して31%(8/26)である。AKAP13遺伝子を用いると、カプラン‐マイヤー分析(Kaplan-Meier analysis)により、予測された応答者群と予測された非応答者群の生存に有意差が示された(図12のD)。
AUCは、ROC解析の曲線の下側の領域であり、全診断精度を示す。
抗体(予言的)
ポリクローナル抗体の作製のために、LBCオンコジーン由来ペプチドを合成し、キーホールリンペットヘモシニアンに結合し、これを用いてウサギを免疫化した。この血清が対応するペプチドに対して反応するかをELISAで検査し、陽性のバッチを親和精製した。精製した抗体は、組織部分にエピトープを有するペプチドを特異的に検出する。これは、抗体と対応するペプチドが同時に添加された場合に信号が完全に消滅することで確認できる。IHCで良く機能するこのポリクローナル抗体に加えて、自然の折りたたみ状態のタンパク質を検出できるモノクローナル抗体も作製した。モノクローナル抗体を作製するために、自然の折りたたみ及び翻訳後修飾が確実となるように哺乳動物細胞で産生された精製sれた抗原を作製した。この抗原、すなわちLBCオンコプロテイン‐IgG定常部分融合タンパク質をマウス骨髄腫細胞で発現させ、このタンパク質をおとり(bait)としてFc部分を用いて精製した。この精製された抗原を、C末端ポリクローナル抗体によりウエスタンブロットで確認した。この抗原を用いて、IgG定常部分ではなくLBCペプチドに対して作用する抗体を産生する陽性クローンから選択してLBCペプチドに対するマウスモノクローナル抗体を得た。LBCオンコジーンを臨床で同定するためのキットを、これらの抗体または類似の抗体を用いて容易に作製することができる。このようなキットは、LBCペプチド(従ってLBCオンコジーン)同定用の抗体、適切な標識試薬(例えば、酵素及びラベルなど)、並びにこのようなキットの臨床用途に有用な、希釈用緩衝液、安定剤、及びこのようなアッセイに一般的に用いられる他の物質などの他の試薬(オプション)を含むことができる。
免疫組織化学(予言的)
LBCオンコジーンのC末端ペプチドに対する親和精製されたポリクローナル抗体をIHCの検出及びLBCオンコジーンの局在化に用いた。ホルマリン固定してパラフィンに埋め込んだ正常及び腫瘍組織から得た4μmの切片を、3‐アミノプロピル‐トリエトキシ‐シラン(APES、ミズーリ州セントルイスのシグマ(Sigma))がコーティングされたスライドガラスに載せた。これらの切片を、段階的濃度のエタノールで脱パラフィン化して再水和し、室温で30分間、メタノールペルオキシド(methanolic peroxide)(絶対メタノールに溶かした0.5%過酸化水素)で処理して、内因性ペルオキシダーゼ活性を阻害した。抗原の回収は、電子レンジで5分間(650W)、2回行った。Elite ABCキット(Vectastain、カリフォルニア州バーリンガムのベクター・ラボラトリーズ(Vector Laboratories))を用いて免疫ペルオキシダーゼ染色を行った。LBCペプチド抗体は、1:2000の最適な希釈で使用した。ビオチン標識二次抗体及びペルオキシダーゼ標識アビジン‐ビオチン複合体の両方を切片上で30分間インキュベートした。PBS(pH7.2)で希釈液を作製し、全てのインキュベーションを室温の湿室で行った。ある染色ステップと別の染色ステップの間にスライドガラスをPBSで3回洗浄した。ペルオキシダーゼ染色は、3‐アミノ‐9‐エチルカルバゾール(3-amino-9-etylcarbazole)(シグマ(Sigma))溶液(0.03%過酸化水素を含む0.05M酢酸緩衝液中に0.2mg/mlの濃度、pH5.0)を用いて室温で15分間、見えるようにした。最後に、切片を、マイヤーのヘマトキシリンで軽く後染色し、水溶性封入剤(Aquamount、BDH)で封入した。コントロール実験では、一次抗体を正常なウサギの血清のIgG断片で置換する、或いは一次抗体をLBCペプチドで予め吸収する。このような染色は、細胞のサブセットにLBCオンコジーンが存在することを示している。
(1)急性骨髄性白血病(AML)患者の予後(生存/転帰)を評価する方法であって、
(a)前記患者から生体サンプルを採取するステップと、
(b)(i)配列番号1または5‐22に一致する、または(ii)表7に示されている配列番号1または5‐22に一致するpsid番号からなる群から選択されるプローブセットによって認識される、mRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記サンプルにおける発現レベルを測定するステップとを含み、
所定のカットオフレベルよりも高いまたは低い前記遺伝子発現レベルがAMLの予後を示していることを特徴とする方法。
(2)急性骨髄性白血病(AML)患者の状態を決定する方法であって、
(a)前記患者から生体サンプルを採取するステップと、
(b)(i)配列番号1または5‐22に一致する、または(ii)表7に示されている配列番号1または5‐22に一致するpsid番号からなる群から選択されるプローブセットによって認識される、mRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記サンプルにおける発現レベルを測定するステップとを含み、
所定のカットオフレベルよりも高いまたは低い前記遺伝子発現レベルがAMLの状態を示していることを特徴とする方法。
(3)急性骨髄性白血病(AML)患者の治療プロトコルを決定する方法であって、
(a)前記患者から生体サンプルを採取するステップと、
(b)(i)配列番号1または5‐22に一致する、または(ii)表7に示されている配列番号1または5‐22に一致するpsid番号からなる群から選択されるプローブセットによって認識される、mRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記サンプルにおける発現レベルを測定するステップとを含み、
所定のカットオフレベルよりも高いまたは低い前記遺伝子発現レベルが、治療に対して患者が応答する可能性を十分に示し、医師が適切な治療の程度及び種類を決定することができることを特徴とする方法。
(4)急性骨髄性白血病(AML)患者を治療する方法であって、
(a)前記患者から生体サンプルを採取するステップと、
(b)(i)配列番号1または5‐22に一致する、または(ii)表7に示されている配列番号1または5‐22に一致するpsid番号からなる群から選択されるプローブセットによって認識される、mRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記サンプルにおける発現レベルを測定するステップであって、所定のカットオフレベルよりも高いまたは低い前記遺伝子発現レベルが、前記患者が治療に応答する可能性を示す、前記ステップと、
(c)前記患者が治療に応答しそうな場合に前記患者をアジュバント療法で治療することを特徴とする方法。
(5)前記患者が再発性または難治性AMLであることを特徴とする実施態様(1)、(2)、(3)、または(4)に記載の方法。
(7)更に、前記サンプル中で恒常的に発現している少なくとも1種類の遺伝子の発現レベルを測定するステップを含むことを特徴とする実施態様(1)、(2)、(3)、または(4)に記載の方法。
(8)発現パターンの比較をパターン認識法で行うことを特徴とする実施態様(1)、(2)、(3)、または(4)に記載の方法。
(9)前記パターン認識法がCox比例ハザード分析の使用を含むことを特徴とする実施態様(8)に記載の方法。
(10)前記所定のカットオフレベルが、良性細胞または正常組織に対して前記サンプルで少なくとも1.5倍の過剰発現または1.5分の1の過少発現であることを特徴とする実施態様(1)、(2)、(3)、または(4)に記載の方法。
(12)前記p値が0.05未満であることを特徴とする実施態様(11)に記載の方法。
(13)前記遺伝子発現をマイクロアレイまたは遺伝子チップで測定することを特徴とする実施態様(1)、(2)、(3)、または(4)に記載の方法。
(14)前記マイクロアレイがcDNAアレイまたはオリゴヌクレオチドアレイであることを特徴とする実施態様(13)に記載の方法。
(15)前記マイクロアレイまたは前記遺伝子チップが更に、1または複数の内部コントロール試薬を含むことを特徴とする実施態様(13)に記載の方法。
(17)前記PCRが逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT‐PCR)であることを特徴とする実施態様(16)に記載の方法。
(18)前記RT‐PCRが更に、1または複数の内部コントロール試薬を含むことを特徴とする実施態様(17)に記載の方法。
(19)遺伝子発現を、その遺伝子によってコードされるタンパク質を測定または検出して検出することを特徴とする実施態様(1)、(2)、(3)、または(4)に記載の方法。
(20)前記タンパク質を、そのタンパク質に特異的な抗体によって検出することを特徴とする実施態様(19)に記載の方法。
(22)前記測定した特性が、DNA増幅、メチル化、突然変異、及び対立遺伝子変異体からなる群から選択されることを特徴とする実施態様(21)に記載の方法。
(23)急性骨髄性白血病(AML)患者の予後患者レポートを作成する方法であって、
(a)患者から生体サンプルを採取するステップと、
(b)前記サンプルの遺伝子発現を測定するステップと、
(c)前記ステップ(b)の結果に再発ハザードスコアを適用するステップと、
(d)前記ステップ(c)で得た結果を用いて前記レポートを作成するステップとを含むことを特徴とする方法。
(24)前記レポートが、前記患者の転帰の評価及び/または患者集団に対するリスクの可能性を含むことを特徴とする実施態様(23)に記載の方法。
(25)前記患者が再発性または難治性の患者であることを特徴とする実施態様(23)に記載の方法。
(27)配列番号1‐22、または表7に示されている配列番号1及び5‐22に一致するpsid番号からなる群から選択される少なくとも1つのプローブセットを含むことを特徴とする組成物。
(28)生体サンプルで急性骨髄性白血病の予後を決定するためのアッセイを行うためのキットであって、
(i)配列番号1及び5‐22に一致する、または(ii)表7に示されている配列番号1及び5‐22に一致するpsid番号からなる群から選択されるプローブセットによって認識される、mRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組合せの単離された核酸配列、それらの相補体、またはそれらの一部を検出するための物質を含むことを特徴とするキット。
(29)前記配列番号が1、5、及び6であることを特徴とする実施態様(28)に記載のキット。
(30)更に、マイクロアレイ分析を実施するための試薬を含むことを特徴とする実施態様(29)に記載のキット。
(32)生体サンプルで急性骨髄性白血病の予後を評価するための製品であって、
(i)配列番号1及び5‐22に一致する、または(ii)表7に示されている配列番号1及び5‐22に一致するpsid番号からなる群から選択されるプローブセットによって認識される、mRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組合せの単離された核酸配列、それらの相補体、またはそれらの一部を検出するための物質を含むことを特徴とする製品。
(33)前記配列番号が1、5、及び6であることを特徴とする実施態様(32)に記載の製品。
(34)更に、マイクロアレイ分析を実施するための試薬を含むことを特徴とする実施態様(32)に記載の製品。
(35)更に、前記核酸配列、それらの相補体、またはそれらの一部をアッセイするための培地を含むことを特徴とする実施態様(32)に記載の製品。
(37)(i)配列番号1及び5‐22に一致する、または(ii)表7に示されている配列番号1及び5‐22に一致するpsid番号からなる群から選択されるプローブセットによって認識される、mRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組合せの単離された核酸配列、それらの相補体、またはそれらの一部を含み、前記組合せが生体サンプルで急性骨髄性白血病の状態または予後を特徴付けるのに十分であることを特徴とする実施態様(36)に記載のマイクロアレイ。
(38)測定または特徴付けが1.5倍の過剰発現または1.5分の1の過少発現であることを特徴とする実施態様(36)に記載のマイクロアレイ。
(39)測定により統計的に有意なp値の過剰発現または過少発現が得られることを特徴とする実施態様(36)に記載のマイクロアレイ。
(40)前記p値が0.05未満である特徴とする実施態様(39)に記載のマイクロアレイ。
(42)更に、1または複数の内部コントロール試薬を含むことを特徴とする実施態様(36)に記載のマイクロアレイ。
(43)診断/予後ポートフォリオであて、
(i)配列番号1及び5‐22に一致する、または(ii)表7に示されている配列番号1及び5‐22に一致するpsid番号からなる群から選択されるプローブセットによって認識される、mRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組合せの単離された核酸配列、それらの相補体、またはそれらの一部を含み、
前記組合せが生体サンプルで急性骨髄性白血病の状態または予後を特徴付けるのに十分であることを特徴とする診断/予後ポートフォリオ。
(44)測定または特徴付けが1.5倍の過剰発現または1.5分の1の過少発現であることを特徴とする実施態様(43)に記載のポートフォリオ。
(45)測定により統計的に有意なp値の過剰発現または過少発現が得られることを特徴とする実施態様(43)に記載のポートフォリオ。
Claims (46)
- 急性骨髄性白血病(AML)患者の予後(生存/転帰)を評価する方法であって、
(a)前記患者から生体サンプルを採取するステップと、
(b)(i)配列番号1または5‐22に一致する、または(ii)表7に示されている配列番号1または5‐22に一致するpsid番号からなる群から選択されるプローブセットによって認識される、mRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記サンプルにおける発現レベルを測定するステップとを含み、
所定のカットオフレベルよりも高いまたは低い前記遺伝子発現レベルがAMLの予後を示していることを特徴とする方法。 - 急性骨髄性白血病(AML)患者の状態を決定する方法であって、
(a)前記患者から生体サンプルを採取するステップと、
(b)(i)配列番号1または5‐22に一致する、または(ii)表7に示されている配列番号1または5‐22に一致するpsid番号からなる群から選択されるプローブセットによって認識される、mRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記サンプルにおける発現レベルを測定するステップとを含み、
所定のカットオフレベルよりも高いまたは低い前記遺伝子発現レベルがAMLの状態を示していることを特徴とする方法。 - 急性骨髄性白血病(AML)患者の治療プロトコルを決定する方法であって、
(a)前記患者から生体サンプルを採取するステップと、
(b)(i)配列番号1または5‐22に一致する、または(ii)表7に示されている配列番号1または5‐22に一致するpsid番号からなる群から選択されるプローブセットによって認識される、mRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記サンプルにおける発現レベルを測定するステップとを含み、
所定のカットオフレベルよりも高いまたは低い前記遺伝子発現レベルが、治療に対して患者が応答する可能性を十分に示し、医師が適切な治療の程度及び種類を決定することができることを特徴とする方法。 - 急性骨髄性白血病(AML)患者を治療する方法であって、
(a)前記患者から生体サンプルを採取するステップと、
(b)(i)配列番号1または5‐22に一致する、または(ii)表7に示されている配列番号1または5‐22に一致するpsid番号からなる群から選択されるプローブセットによって認識される、mRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記サンプルにおける発現レベルを測定するステップであって、所定のカットオフレベルよりも高いまたは低い前記遺伝子発現レベルが、前記患者が治療に応答する可能性を示す、前記ステップと、
(c)前記患者が治療に応答しそうな場合に前記患者をアジュバント療法で治療することを特徴とする方法。 - (5)前記患者が再発性または難治性AMLであることを特徴とする請求項1、2、3、または4に記載の方法。
- 前記配列番号が1、5、及び6であることを特徴とする請求項1、2、3、または4に記載の方法。
- 更に、前記サンプル中で恒常的に発現している少なくとも1種類の遺伝子の発現レベルを測定するステップを含むことを特徴とする請求項1、2、3、または4に記載の方法。
- 発現パターンの比較をパターン認識法で行うことを特徴とする請求項1、2、3、または4に記載の方法。
- 前記パターン認識法がCox比例ハザード分析の使用を含むことを特徴とする請求項8に記載の方法。
- 前記所定のカットオフレベルが、良性細胞または正常組織に対して前記サンプルで少なくとも1.5倍の過剰発現または1.5分の1の過少発現であることを特徴とする請求項1、2、3、または4に記載の方法。
- 前記所定のカットオフレベルが、良性細胞または正常組織に対して、転移細胞を有する前記サンプルで少なくとも統計的に有意なp値の過剰発現であることを特徴とする請求項1、2、3、または4に記載の方法。
- 前記p値が0.05未満であることを特徴とする請求項11に記載の方法。
- 前記遺伝子発現をマイクロアレイまたは遺伝子チップで測定することを特徴とする請求項1、2、3、または4に記載の方法。
- 前記マイクロアレイがcDNAアレイまたはオリゴヌクレオチドアレイであることを特徴とする請求項13に記載の方法。
- 前記マイクロアレイまたは前記遺伝子チップが更に、1または複数の内部コントロール試薬を含むことを特徴とする請求項13に記載の方法。
- 遺伝子発現を、前記サンプルから抽出したRNAのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で核酸を増幅して決定することを特徴とする請求項1、2、3、または4に記載の方法。
- 前記PCRが逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT‐PCR)であることを特徴とする請求項16に記載の方法。
- 前記RT‐PCRが更に、1または複数の内部コントロール試薬を含むことを特徴とする請求項17に記載の方法。
- 遺伝子発現を、その遺伝子によってコードされるタンパク質を測定または検出して検出することを特徴とする請求項1、2、3、または4に記載の方法。
- 前記タンパク質を、そのタンパク質に特異的な抗体によって検出することを特徴とする請求項19に記載の方法。
- 遺伝子発現をその遺伝子の特性を測定して検出することを特徴とする請求項1、2、3、または4に記載の方法。
- 前記測定した特性が、DNA増幅、メチル化、突然変異、及び対立遺伝子変異体からなる群から選択されることを特徴とする請求項21に記載の方法。
- 急性骨髄性白血病(AML)患者の予後患者レポートを作成する方法であって、
(a)患者から生体サンプルを採取するステップと、
(b)前記サンプルの遺伝子発現を測定するステップと、
(c)前記ステップ(b)の結果に再発ハザードスコアを適用するステップと、
(d)前記ステップ(c)で得た結果を用いて前記レポートを作成するステップとを含むことを特徴とする方法。 - 前記レポートが、前記患者の転帰の評価及び/または患者集団に対するリスクの可能性を含むことを特徴とする請求項23に記載の方法。
- 前記患者が再発性または難治性の患者であることを特徴とする請求項23に記載の方法。
- 請求項23に従った方法で作成した患者レポート。
- 配列番号1‐22、または表7に示されている配列番号1及び5‐22に一致するpsid番号からなる群から選択される少なくとも1つのプローブセットを含むことを特徴とする組成物。
- 生体サンプルで急性骨髄性白血病の予後を決定するためのアッセイを行うためのキットであって、
(i)配列番号1及び5‐22に一致する、または(ii)表7に示されている配列番号1及び5‐22に一致するpsid番号からなる群から選択されるプローブセットによって認識される、mRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組合せの単離された核酸配列、それらの相補体、またはそれらの一部を検出するための物質を含むことを特徴とするキット。 - 前記配列番号が1、5、及び6であることを特徴とする請求項28に記載のキット。
- 更に、マイクロアレイ分析を実施するための試薬を含むことを特徴とする請求項29に記載のキット。
- 更に、前記核酸配列、それらの相補体、またはそれらの一部をアッセイするための培地を含むことを特徴とする請求項28に記載のキット。
- 生体サンプルで急性骨髄性白血病の予後を評価するための製品であって、
(i)配列番号1及び5‐22に一致する、または(ii)表7に示されている配列番号1及び5‐22に一致するpsid番号からなる群から選択されるプローブセットによって認識される、mRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組合せの単離された核酸配列、それらの相補体、またはそれらの一部を検出するための物質を含むことを特徴とする製品。 - 前記配列番号が1、5、及び6であることを特徴とする請求項32に記載の製品。
- 更に、マイクロアレイ分析を実施するための試薬を含むことを特徴とする請求項32に記載の製品。
- 更に、前記核酸配列、それらの相補体、またはそれらの一部をアッセイするための培地を含むことを特徴とする請求項32に記載の製品。
- 請求項1、2、3、または4の方法を実施するためのマイクロアレイまたは遺伝子チップ。
- (i)配列番号1及び5‐22に一致する、または(ii)表7に示されている配列番号1及び5‐22に一致するpsid番号からなる群から選択されるプローブセットによって認識される、mRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組合せの単離された核酸配列、それらの相補体、またはそれらの一部を含み、前記組合せが生体サンプルで急性骨髄性白血病の状態または予後を特徴付けるのに十分であることを特徴とする請求項36に記載のマイクロアレイ。
- 測定または特徴付けが1.5倍の過剰発現または1.5分の1の過少発現であることを特徴とする請求項36に記載のマイクロアレイ。
- 測定により統計的に有意なp値の過剰発現または過少発現が得られることを特徴とする請求項36に記載のマイクロアレイ。
- 前記p値が0.05未満である特徴とする請求項39に記載のマイクロアレイ。
- cDNAアレイまたはオリゴヌクレオチドアレイを含むことを特徴とする請求項36に記載のマイクロアレイ。
- 更に、1または複数の内部コントロール試薬を含むことを特徴とする請求項36に記載のマイクロアレイ。
- 診断/予後ポートフォリオであて、
(i)配列番号1及び5‐22に一致する、または(ii)表7に示されている配列番号1及び5‐22に一致するpsid番号からなる群から選択されるプローブセットによって認識される、mRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組合せの単離された核酸配列、それらの相補体、またはそれらの一部を含み、
前記組合せが生体サンプルで急性骨髄性白血病の状態または予後を特徴付けるのに十分であることを特徴とする診断/予後ポートフォリオ。 - 測定または特徴付けが1.5倍の過剰発現または1.5分の1の過少発現であることを特徴とする請求項43に記載のポートフォリオ。
- 測定により統計的に有意なp値の過剰発現または過少発現が得られることを特徴とする請求項43に記載のポートフォリオ。
- 前記p値が0.05未満である特徴とする請求項45に記載のマイクロアレイ。
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