JP2022553073A - 治療・診断標的としてのｈｌａ－ｈ， ｈｌａ－ｊおよびｈｌａ－ｌ - Google Patents

治療・診断標的としてのｈｌａ－ｈ， ｈｌａ－ｊおよびｈｌａ－ｌ Download PDF

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本発明は、対象の腫瘍の治療もしくは予防のための医薬、または対象の腫瘍の検出のための診断薬の製造方法に関し、該方法は、 (A）前記対象から得られた試料中の、少なくとも1つの核酸分子および／または少なくとも1つのタンパク質もしくはペプチドの発現を測定することであって、タンパク質もしくはペプチドはHLA-H, HLA-J HLA-L, HLA-VまたはHLA-Yと少なくとも８５％同一性を有し、核酸分子は前記タンパク質もしくはペプチドをコードするかまたは少なくとも１５０ヌクレオチドを含むその核酸の断片からなる、測定すること、および(B）対象における少なくとも1つの核酸分子および／または少なくとも1つのタンパク質もしくはペプチドの発現を阻害することができる医薬を製造すること、および／または対象における少なくとも1つの核酸分子および／または少なくとも1つのタンパク質またはペプチドの発現部位をin vivoで検出することができる診断薬を作製することを含む。

Description

本発明は、対象の腫瘍の治療もしくは予防のための医薬、または対象の腫瘍の検出のための診断薬の製造方法に関し、該方法は、 (A）前記対象から得られた試料中の少なくとも1つの核酸分子および／または少なくとも1つのタンパク質もしくはペプチドの発現を測定することであって、少なくとも1つの核酸分子は、 (a)配列番号1から5のいずれか１つのアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるポリペプチドをコードする核酸分子、(b) 配列番号6から10のいずれか1つのヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる核酸分子、 (c) (a)のアミノ酸配列と少なくとも85%同一、好ましくは少なくとも90%同一、最も好ましくは少なくとも95%同一であるポリペプチドをコードする核酸分子, (d) (b)のヌクレオチド配列と少なくとも９５%同一、好ましくは少なくとも９６%同一、最も好ましくは少なくとも９８%同一であるヌクレオチド配列からなる核酸分子, (e) (d)の核酸分子に対して縮重したヌクレオチド配列からなる核酸分子, (f) (a)から(e)のいずれか1つに記載の核酸分子の断片からなる核酸分子であって、前記断片は、少なくとも150ヌクレオチド、好ましくは少なくとも300ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも450ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも600ヌクレオチドを含む、核酸分子、または (g) TがUで置換されている、(a)から(f)のいずれか１つに記載の核酸分子に対応する核酸分子から選択され、少なくとも1つのタンパク質またはペプチドが、（a）から（g）のいずれか1つに記載の核酸分子によってコードされるタンパク質またはペプチドから選択される、測定すること；および(B） （A）において少なくとも1つの核酸分子および／または少なくとも1つのタンパク質もしくはペプチドが発現している場合、対象における少なくとも1つの核酸分子および／または少なくとも1つのタンパク質もしくはペプチドの発現を阻害することができる医薬を製造すること、および／または (B'）（A）において少なくとも1つの核酸分子および／または少なくとも1つのタンパク質またはペプチドが発現している場合、対象における少なくとも1つの核酸分子および／または少なくとも1つのタンパク質またはペプチドの発現部位をin vivoで検出することができる診断薬を作製することを含む。
本明細書では、特許出願及び製造業者のマニュアルを含む多くの文献が引用されている。これらの文書の開示は、本発明の特許性に関連するとは考えられないが、その全体は本明細書に参照により援用される。より具体的には、全ての参照文書は、各個々の文書が参照により援用されることが具体的かつ個別に示された場合と同程度に、参照により援用される。
個別化腫瘍治療とは、特定の腫瘍治療が奏効しやすい患者を予測することを中心とした治療戦略である。このアプローチは、腫瘍マーカーが患者の予後や治療に対する腫瘍の反応に関連するという考えに基づいている。腫瘍マーカーには、DNA、RNA、タンパク質、メタボロームなどのプロファイルがあり、治療効果を予測することができる。
腫瘍を持つ患者にとって適切な治療法を選択することは、絶えず進化する分子診断学と急速に出現する生物医学文献に基づく複雑な決定である。臨床試験において、実用的なゲノム変化と標的治療との関連を追跡することは、治療を行う腫瘍医と研究者にとって同様に困難なことである。化学療法は、多くの腫瘍種でがん治療の基幹となっているが、奏効率に限界があり、副作用も顕著である。がんの発生・進行・耐性に関わるドライバー分子機構は、治療標的としてますます追求されている。乳がんにおけるHER2、慢性骨髄性白血病におけるbcr-abl、非小細胞肺がん（NSCLC）におけるALKなどの個別化腫瘍治療の成功例は、腫瘍学に革命を起こしている。
がん領域におけるプレシジョンメディシンは、診断バイオマーカー（健康な患者におけるがんの発生を検出し、腫瘍を早期に発見する）、予後バイオマーカー（疾患の自然経過を予測する）、予測バイオマーカー（特定の治療が行われた場合の臨床結果を予測する）、薬物ゲノムバイオマーカー（薬剤代謝変化を特定し、特定の治療に関する反応や毒性を予測する）等の特定への取り組みに及んでおり、連続性を持つ。
しかし、効果的な個別化された腫瘍治療や腫瘍診断に到達するために、腫瘍の評価や治療・診断の標的として/治療に使用できる新しい手段や方法の特定は、依然として急務である。この必要性は、本発明によって対処される。
従って、本発明は、第１の態様において、対象の腫瘍の治療もしくは予防のための医薬、または対象の腫瘍の検出のための診断薬の製造方法に関し、該方法は、以下を含む：(A）前記対象から得られた試料中の少なくとも1つの核酸分子および／または少なくとも1つのタンパク質もしくはペプチドの発現を測定することであり、少なくとも1つの核酸分子は、 (a)配列番号1から5のいずれか１つのアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるポリペプチドをコードする核酸分子、(b) 配列番号6から10のいずれか1つのヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる核酸分子、 (c) (a)のアミノ酸配列と少なくとも85%同一、好ましくは少なくとも90%同一、最も好ましくは少なくとも95%同一であるポリペプチドをコードする核酸分子;(d) (b)のヌクレオチド配列と少なくとも９５%同一、好ましくは少なくとも９６%同一、最も好ましくは少なくとも９８%同一であるヌクレオチド配列からなる核酸分子;(e)(d)の核酸分子に対して縮重したヌクレオチド配列からなる核酸分子; (f) (a)から(e)のいずれか1つに記載の核酸分子の断片からなる核酸分子であって、前記断片は少なくとも150ヌクレオチド、好ましくは少なくとも300ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも450ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも600ヌクレオチドを含む、核酸分子、または (g) TがUで置換されている、(a)から(f)のいずれか１つに記載の核酸分子に対応する核酸分子から選択され; 少なくとも1つのタンパク質またはペプチドが、（a）から（g）のいずれか1つに記載の核酸分子によってコードされるタンパク質またはペプチドから選択される測定すること；および(B）（A）において少なくとも1つの核酸分子および／または少なくとも1つのタンパク質もしくはペプチドが発現している場合、対象における少なくとも1つの核酸分子および／または少なくとも1つのタンパク質もしくはペプチドの発現を阻害することができる医薬を製造すること、および／または (B'）（A）において少なくとも1つの核酸分子および／または少なくとも1つのタンパク質またはペプチドが発現している場合、対象における少なくとも1つの核酸分子および／または少なくとも1つのタンパク質またはペプチドの発現部位をin vivoで検出することができる診断薬を作製すること。
本明細書で使用される「医薬」という用語は、腫瘍の治療または予防に関して薬学的に活性な化合物または化合物の組み合わせを指定する。本明細書で使用する「診断薬」という用語は、対象における腫瘍の検出に使用できる化合物または化合物の組合せを指定する。例えば、以下に詳述するように、診断薬は検出可能な標識で標識することができ、これによりin vivoで腫瘍病変を検出することができる。腫瘍病変とは、対象の腫瘍組織の領域である。医薬及び診断薬は対象に投与することができる。
医薬の性質は、本発明の第1の態様の方法の工程（A）において少なくとも1つの核酸分子及び／又は少なくとも1つのタンパク質若しくはペプチドが発現していれば、本発明により、対象において、少なくとも1つの核酸分子及び／又は少なくとも1つのタンパク質若しくはペプチドの発現を抑制することができるものであれば特に限定されるものではない。同様に、診断薬の性質も、本発明の第1の態様の方法の工程（A）において少なくとも1つの核酸分子及び／又は少なくとも1つのタンパク質若しくはペプチドが発現していれば、本発明により、対象において、少なくとも1つの核酸分子及び／又は少なくとも1つのタンパク質若しくはペプチドの発現部位をin vivo検出することができるものであれば特に限定されるものではない。発現部位に関して、腫瘍は一般的に原発性腫瘍部位と呼ばれる特定の身体部位に由来することが理解される。腫瘍増殖の結果、腫瘍は体内の別の場所、いわゆる二次腫瘍部位に転移することがある。診断薬は、好ましくは、少なくとも原発性腫瘍部位を検出することができ、より好ましくは、原発性腫瘍部位と（少なくとも部分的に）二次性腫瘍部位が存在する場合には、その両方を検出することができるものである。
医薬は、好ましくは、本発明に係る少なくとも1つの核酸分子又は少なくとも1つのタンパク質若しくはペプチドを特異的に阻害し、診断薬は、好ましくは、本発明に係る少なくとも1つのタンパク質若しくはペプチドを特異的に検出する。つまり、その医薬は、他の核酸分子やタンパク質、ペプチドを阻害しないか、本質的に阻害しないことを意味する。これは、診断薬が他の核酸分子やタンパク質、ペプチドを検出しない、あるいは本質的に検出しないことも意味する。特に、選択されたそれぞれの標的HLA核酸分子またはタンパク質またはペプチド以外のHLA核酸分子またはタンパク質またはペプチドが阻害または検出されないことが好ましい。
「対象」とは、哺乳動物、好ましくは家畜またはペット動物、例えばウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌまたはネコ、最も好ましくはヒトをいう。対象は、がんが疑われる対象であってもよいし、がんであることが分かっている対象であってもよい。後者の場合、対象はすでにがん治療を受けていて効果がなかった場合がある。また、治療前と治療後では、治療によって発現が変わったかどうかを判断するために、治療に方法を用いることも可能である。
腫瘍は、生理学的機能を有さず、制御されない通常急速な細胞増殖から生じる、組織の異常な良性または悪性の新しい増殖である。腫瘍は好ましくはがんである。がんは生理学的機能を持たない組織の異常な悪性新生であり、制御されない通常急速な細胞増殖から生じる。前記がんが、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、外陰部がん、膀胱がん、唾液腺がん、膣がん、膵臓がん、甲状腺がん、腎臓がん、肺がん、上部消化管のがん、結腸がん、直腸結腸がん、前立腺がん、頭部および頸部の扁平上皮がん、子宮頸がん、神経膠芽腫、悪性腹水、リンパ腫および白血病からなる群から選択されることが好ましい。好ましいがんは、本明細書において以下に定義される。
腫瘍またはがんは、好ましくは固形腫瘍またはがんである。固形腫瘍またはがんは、非固形腫瘍(例、白血病)とは対照的に、通常はのう胞または液状領域を含まない異常な塊の組織である。
配列番号6～10の核酸配列は、それぞれヒトHLA-H、HLA-J、HLA-L、HLA-VおよびHLA-Yをコードする遺伝子である。本発明の核酸分子は、ゲノムDNAまたはmRNAであることが好ましい。mRNAの場合、核酸分子はさらに、ポリAテールを含み得る。
配列番号1～5のアミノ酸配列は、それぞれ可溶型ヒトHLAタンパク質HLA-H、HLA-J、HLA-L、HLA-VおよびHLA-Yである。HLAタンパク質は、膜貫通ドメインを持たないため、可溶性である。
HLA-Lに関しては、配列番号3および配列番号8は、HLA-Lの可溶型をコードし、HLA-Lはまた配列番号 11（アミノ酸配列）および12（ヌクレオチド配列）の膜結合型でも見られることが留意される。この膜結合型は、膜からのタンパク質分解による切断によって膜から放出されることができる。このような、膜から剥離することで可溶性となるHLAフォームはshedded isoformsとも呼ばれる。Rizzo et al.(2013), Mol Cell Biochem.; 381(1-2):243-55 を参照のこと。したがって、本発明の第1の態様で定義した配列番号8に由来する核酸分子、および本発明の第1の態様で定義した配列番号3に由来するタンパク質またはペプチドも、それぞれ配列番号 12および11の膜結合型に由来するものであってもよい。HLA-Lまたはそれに由来する配列の発現を決定することに関しても、可溶性形態に限定して決定することが好ましく、膜結合型からの発現を決定しないようにする。これは、例えば、分析前に試料から細胞や細胞膜を除去することによって行うことができる。
本発明による用語「核酸分子」は、cDNAなどのDNA、または二本鎖もしくは一本鎖ゲノムDNAおよびRNAを含む。この点に関して、「DNA」(デオキシリボ核酸)は、ヌクレオチド塩基と呼ばれる、デオキシリボース糖骨格上で一緒に連結された、アデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)およびチミン(T)の化学構築ブロックの任意の鎖または配列を意味する。DNAは、ヌクレオチド塩基の一本鎖、または二重らせん構造を形成することができる2本の相補鎖を有することができる。「RNA」(リボ核酸)は、リボース糖骨格上で一緒に連結されたヌクレオチド塩基と呼ばれる、アデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)およびウラシル(U)を構成する化学構築ブロックの任意の鎖または配列を意味する。RNAは、典型的にはmRNAのようなヌクレオチド塩基の一本鎖を有する。また、一本鎖および二本鎖ハイブリッド分子、すなわち、DNA－DNA、DNA－RNAおよびRNA－RNAも含まれる。特定の核酸分子、例えば、shRNA、miRNA、または本明細書に後述するアンチセンス核酸分子も、当技術分野で既知の多くの手段によって修飾することができる。このような修飾の非限定的な例としては、メチル化、「キャップ」、1つ以上の天然に存在するヌクレオチドのアナログでの置換、およびヌクレオチド間修飾(例えば、非荷電結合(例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメートなど)および荷電結合(例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど)を有するものなど)が挙げられる。核酸分子には次のポリヌクレオチドとも呼ばれるものが、タンパク質(例えば、核酸、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ-L-リジン等)、インターカレーター(例えば、アクリジン、プソラレン等)、キレーター(例えば、金属、放射性金属、鉄、酸化的金属等)、及びアルキレーターのような、1つ以上の追加的な共有結合部分を含んでもよい。ポリヌクレオチドはメチルまたはエチルホスホトリエステルあるいはアルキルホスホルアミデート結合の形成によって誘導体化することができる。さらに、DNAまたはRNAの合成または半合成誘導体および混合ポリマーなどの、当技術分野で公知の核酸模倣分子が含まれる。このような核酸模倣分子または核酸誘導体としては、ホスホロチオエート核酸、ホスホラミデート核酸、2'－O－メトキシエチルリボ核酸、モルホリノ核酸、ヘキシトール核酸(HNA)、ペプチド核酸(PNA)およびロックド核酸(LNA)が挙げられる(BraaschおよびCorey, Chem Biol 2001,8: 1を参照のこと)。LNAは、リボース環が2'-酸素と4'-炭素の間のメチレン結合によって拘束されているRNA誘導体である。また、含まれるのは、修飾塩基を含む核酸、例えばチオウラシル、チオグアニンおよびフルオロウラシルである。核酸分子は、典型的にはタンパク質および/またはポリペプチドを作製するために細胞機構によって使用される情報を含む遺伝情報を保有する。核酸分子はさらに、プロモーター、エンハンサー、応答エレメント、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、5'および3'非コード領域などを含み得る。
用語「タンパク質」は、本明細書中で用語「ポリペプチド」と互換的に使用される場合、少なくとも50個のアミノ酸を含む、一本鎖タンパク質またはそれらの断片を含む、アミノ酸の線状分子鎖を表す。本明細書で使用する「ペプチド」という用語は、最大49個のアミノ酸からなる一群の分子を記載する。本明細書で使用される「ペプチド」という用語は、少なくとも15アミノ酸、少なくとも20アミノ酸、少なくとも25アミノ酸、および少なくとも40アミノ酸のより好ましい分子群を表す。ペプチドおよびポリペプチドの群は、「(ポリ)ペプチド」という用語を用いて一緒に言及される。(ポリ)ペプチドはさらに、少なくとも2つの同一または異なる分子からなるオリゴマーを形成し得る。そのような多量体の対応する高次構造は、対応して、ホモ－またはヘテロ二量体、ホモ－またはヘテロ三量体などと呼ばれる。例えば、HLAタンパク質はシステインを含んでいるため、二量化する可能性のある部位がある。用語「(ポリ)ペプチド」および「タンパク質」はまた、天然に修飾された(ポリ)ペプチドおよびタンパク質をいい、ここで、修飾は例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化および当該分野で周知の類似の修飾によって達成される。
本発明によれば、「配列同一性パーセント(%)」という用語は、鋳型核酸またはアミノ酸配列の全長を構成するヌクレオチドまたはアミノ酸残基の数と比較した、2つ以上の整列した核酸またはアミノ酸配列の同一ヌクレオチド/アミノ酸の一致(「ヒット」)の数を表す。他の用語では、アラインメントを使用して、2つ以上の配列またはサブ配列について、同じ(例えば、80%、85%、90%または95%同一)であるアミノ酸残基またはヌクレオチドのパーセンテージが比較の窓にわたって、または当技術分野で公知の配列比較アルゴリズムを使用して測定されるような指定された領域にわたって、または手動でアラインメントされ、視覚的に検査される場合に、(サブ)配列が比較され、そして最大対応についてアラインメントされる場合に決定され得る。この定義はまた、整列される任意の配列の相補体にも適用される。
本発明に関連するヌクレオチドおよびアミノ酸配列の分析およびアラインメントは、好ましくはNCBI BLASTアルゴリズム(Stephen F. Altschul, Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaeffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, および David J. Lipman(1997)、 Nucleic Acids Res.25:3389-3402)を用いて行われる。BLASTは、ヌクレオチド配列(ヌクレオチドBLAST)およびアミノ酸配列(タンパク質BLAST)に使用することができる。当業者は、核酸配列を整列させるためのさらなる適切なプログラムを知っている。
本明細書で定義するように、少なくとも85％の同一、好ましくは少なくとも90％の同一、最も好ましくは少なくとも95％同一の配列が、本発明によって想定される。しかし、本発明はまた、少なくとも97.5%、少なくとも98.5%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.8%、および100%同一の好ましい配列同一性の増加を想定する。
本明細書で使用する「縮重」という用語は、遺伝暗号の縮重を意味する。コドンの縮重とは、アミノ酸を指定する3塩基対コドンの組み合わせの多さとして示される遺伝暗号の重複性のことである。同義突然変異の存在を説明するのは、遺伝暗号の縮重である。
試料は、対象の体液または対象の臓器由来の組織試料であってもよい。体液の非限定的な例は、全血、血漿、血清、尿、腹膜液、および胸膜液、脳脊髄液、涙液、または溶液中のそれらからの細胞である。組織の非限定的な例は、結腸、肝臓、乳房、卵巣、および精巣である。組織サンプルは、吸引もしくは穿刺、切除によって、または生検もしくは切除された細胞材料につながる任意の他の外科的方法によって採取され得る。試料は処理された試料、例えば、凍結、固定、包埋等された試料であってもよい。好ましいタイプのサンプルは、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)サンプルである。FFPE試料の調製は標準的な医療行為であり、これらの試料は長期間保存することができる。
本発明の方法の文脈における核酸分子またはタンパク質もしくはペプチドの発現、好ましくは発現レベルを評価する方法は、当技術分野で確立されている。
例えば、核酸分子の発現は、リアルタイム定量PCR(RT-qPCR)、電気泳動技術またはDNAマイクロアレイ(Roth (2002)、 Curr.Issues Mol.Biol.、 4: 93-100)によって得ることができ、RT-qPCRが好ましい。これらの方法において、発現レベルは、試料中の1つ以上の基準遺伝子の(平均)発現レベルに対して正規化され得る。本明細書中で使用される「基準遺伝子」という言葉は、検査されている系、すなわち腫瘍、におけるRNA転写産物/mRNAレベル上で比較的不変なレベルの発現を有する遺伝子、を意味する。このような遺伝子はハウスキーピング遺伝子と呼ばれることがある。基準遺伝子の非限定的な例は、CALM2、B2M、RPL37A、GUSB、HPRT1およびGAPDH、好ましくはCALM2および/またはB2Mである。他の適切な参照遺伝子は、当業者に公知である。
RT-qPCRはサーマルサイクラーにおいて、各試料を少なくとも1つの特定波長の光線で照射し、励起されたフルオロフォアによって発せられる蛍光を検出する能力を有して実施される。サーマルサイクラーはまた、試料を急速に加熱および冷却することができ、それによって、核酸およびDNAポリメラーゼの物理化学的特性を利用する。リアルタイムqPCRにおけるPCR産物の検出のための2つの一般的な方法は(1)任意の二本鎖DNAとインターカレートする非特異的蛍光色素、および(2)プローブとその相補的配列(例えば、TaqManプローブ)とのハイブリダイゼーション後にのみ検出を可能にする蛍光レポーターで標識されたオリゴヌクレオチドからなる配列特異的DNAプローブである。プローブは一般に、蛍光標識プローブである。好ましくは、蛍光標識プローブが蛍光レポーター色素およびクエンチャー色素(=二重標識プローブ)の両方で標識されたオリゴヌクレオチドからなる。適切な蛍光レポーターおよびクエンチャー色素/部分は当業者に公知であり、レポーター色素/部分6-FAMTM、JOETM、Cy5(登録商標)、Cy3(登録商標)およびクエンチャー色素/部分ダブシル、TAMRATM、BHQTM-1、-2または-3を含むが、これらに限定されない。好ましくは、本発明に従って使用するためのプライマーが15～30ヌクレオチドの長さを有し、特にデオキシリボヌクレオチドである。一実施形態では、プライマーは、（1）HLA遺伝子またはそれに由来する標的mRNA配列に特異的であり、（2）120bp未満（好ましくは100bp未満）のアンプリコンサイズを提供し、（3）mRNA特異的（エキソン／イントロンを考慮すること。ゲノムDNAを増幅しないことが好ましい）、（4）二量体化傾向がない、及び／又は（5）融解温度Tmが58℃～62℃の範囲にある（好ましくは、Tmが約60℃）ことである。上述のように、プローブは(2)によるRT－qPCRに必要であるが、(1)によるRT－qPCRの場合、SYBR greenなどのインターカレーター色素で置き換えることができる。
RT-qPCRは、本明細書の以下の実施例で説明する。表1に開示されているHLA-H、J、L、Gの発現を検出するための特異的なプライマー。これらのプライマー対の1つ以上は、本明細書で定義されるHLA-H、J、Lおよび／またはG、あるいはそれらに由来する核酸分子の発現を検出するために使用することが好ましい。これらの各プライマーペアは、表1に示すように、それぞれのプローブとともに使用することがより好ましい。
qPCRの代替の１つとして、電気泳動技術または更なる代替としてDNAマイクロアレイを使用して、本発明の第1の態様の核酸分子のレベルを得ることもできる。mRNAの同定と定量のための従来の手法は、大きさと配列特異的プロービングに関する情報を提供するゲル電気泳動の組合せによるものである。ノーザンブロットは、この後者クラスにおいて最も一般的に適用される技術である。リボヌクレアーゼ保護アッセイ(RPA)はより感度が高く、ノーザンブロットに比して労働集約的でない代替法として開発された。ハイブリダイゼーションは、溶液中の標識リボヌクレオチドプローブを用いて行われ、その後、非ハイブリダイズ試料およびプローブは一本鎖RNAを選択的に分解するリボヌクレアーゼ(例えば、RNase AおよびRNase T1)の混合物で消化される。その後の変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動は定量のための手段を提供し、そしてまた、プローブによってハイブリダイズされた領域のサイズを与える。ノーザンブロットおよびRPAの両方について、定量の正確さおよび精度は、検出方法および利用される記載または標準の関数である。最も一般的にはプローブが32Pまたは33Pで放射標識され、この場合、最終ゲルはX線フィルムまたは蛍光スクリーンに暴露され、各バンドの強度はそれぞれ、濃度計または蛍光イメージャーで定量化される。両方の場合において、露光時間は必要とされる感度に適合するように調整され得るが、蛍光体ベースの技術は一般に、より感度が高く、より大きなダイナミックレンジを有する。放射能を使用する代わりに、プローブを抗原またはハプテンで標識し、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ結合抗体によって結合させ、基板を添加した後、フィルムまたは蛍光イメージャー上の化学発光によって定量することができる。これらの画像化用途の全てにおいて、プローブなしのゲルの隣接領域からの背景の差し引きが行われるべきである。ゲルフォーマットの大きな長所は、任意の基準標準を試料と同時に画像化することができることである。同様に、ハウスキーピング遺伝子の検出は、全てのサンプルについて同じ条件下で行われる。
さらに、次世代配列決定(NGS)が使用され得る(BehjatiおよびTarpey, Arch Dis Child Educ Pract Ed.2013 Dec; 98(6):236)。NGSは、ゲノム研究に革命をもたらしたRNAまたはDNA配列技術である。NGSを使えば、1日以内にヒトゲノム全体の塩基配列を決定できる。対照的に、ヒトゲノムの解読に用いられた先のサンガー配列決定技術は、最終草案の提出に10年以上を要した。本発明を考慮して、NGSはオープンコンフィギュレーション(ゲノムワイドエキソーム配列決定)において定量するために、または本出願において開示されるそれぞれのHLA遺伝子およびアイソフォームを有する集中パネルとして使用され得る。
DNAマイクロアレイの構築には、2つの技術が登場している。一般に、アレイの設計のための各場合における出発点は、プローブされるべき遺伝子または推定遺伝子に対応する配列のセットである。第1のアプローチでは、オリゴヌクレオチドプローブがガラス基板上で化学的に合成される。cDNAプローブに対するオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの可変効率のために、複数のオリゴヌクレオチドプローブが、目的の各遺伝子に相補的に合成される。さらに、アレイ上の各完全に相補的なオリゴヌクレオチドについて、単一のヌクレオチド位置にミスマッチを有するオリゴヌクレオチドが構築され、そして正規化のために使用される。オリゴヌクレオチドアレイは、約104-106プローブ/cm2の密度で通常的に作成される。DNAマイクロアレイ構築のための第2の主要な技術は、スライドガラスまたは他の適切な基材上へのcDNAプローブの直接的なロボットシステム印刷法である。DNAクローンを、目的の各遺伝子について得、精製し、そしてユニバーサルプライマーを使用するPCRによって共通のベクターから増幅する。プローブは、大きさが50～200μmのオーダーのスポットにロボットにより被着される。この間隔で、例えば、約103プローブ/cm2の密度を達成することができる。
タンパク質またはペプチドの発現は例えば、「タンパク質またはペプチドに結合する分子」、および好ましくは「タンパク質またはペプチドに特異的に結合する分子」を使用することによって決定され得る。タンパク質またはペプチドに結合する分子は、既知の条件下で主にタンパク質またはペプチドに結合して生じる分子を示す。また、タンパク質またはペプチドの発現は、ウエスタンブロット分析、質量分析、FACS-分析、ELISA、免疫組織化学などを用いて得ることができる。これらの技術は、タンパク質またはペプチドを定性的、半定量的および/または定量的に検出するために使用され得る手段の非限定的な例である。
ウエスタンブロット分析は所与の試料、例えば、組織ホモジネートまたは身体抽出物中の特異的タンパク質またはペプチドを検出するために使用される、普及している周知の分析技術である。それは、(ポリ)ペプチドの長さ(変性条件)によって、またはタンパク質の3－D構造(天然/非変性条件)によって、天然または変性タンパク質またはペプチドを分離するためにゲル電気泳動を使用する。次いで、タンパク質またはペプチドを膜(典型的にはニトロセルロースまたはPVDF)に移し、そこで標的タンパク質に特異的な抗体を用いてプローブ(検出)する。
また、質量分析(MS)分析は、荷電粒子の質量電荷比が測定される、普及している周知の分析技術である。質量分析は、粒子の質量を決定するため、試料または分子の元素構成を決定するため、およびタンパク質、ペプチドおよび他の化合物などの分子の化学構造を解明するために使用される。MS原則は化学化合物をイオン化して荷電分子または分子断片を生成し、それらの質量電荷比を測定することからなる。
蛍光活性化細胞選別(FACS)分析は普及している周知の分析技術であり、ここで、生物学的細胞は、各細胞の蛍光特性の特定の光散乱に基づいて選別される。細胞を4%ホルムアルデヒド中で固定し、0.2% Triton－X－100で透過性にし、フルオロフォア標識抗体(例えば、モノクローナルまたはポリクローナル抗HLA抗体)と共にインキュベートすることができる。
酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)は普及している周知の高感度分析技術であり、ここでは、特異的タンパク質またはペプチドの検知のためのマーカーとして、酵素が抗体または抗原に結合される。
免疫組織化学(IHC)は、免疫染色の一般的な適用である。それは、生物学的組織中の抗原に特異的に結合する抗体の原則を利用することによって、組織切片の細胞中の抗原(タンパク質)を選択的に同定する方法を含む。特定のデバイスと組合せして、IHCは、タンパク質発現の定量的なin situ評価のために使用され得る(総説として、クレガーら(2006)Arch Pathol Lab Med,130:1026－1030)。定量的IHCは、染色強度が絶対タンパク質レベルと相関することを利用する。
HLA-L、HLA-HおよびHLA-Jが当技術分野で誤って偽遺伝子としてアノーテートされていることが、出願人によって以前に意外にも発見された。実際、これらの遺伝子はタンパク質をコードする遺伝子であり、HLA-L、HLA-H、HLA-Jの発現がさまざまながんで検出された（PCT/EP2019/060606、EP 19 18 4729.2、EP 19 18 4681.5、EP 19 18 4717.7）。さらに、HLA-VとHLA-Yにはプロモーター領域とオープンリーディングフレームも見いだされた。HLA-L、HLA-H、HLA-J、HLA-VおよびHLA-Yはいずれも当技術分野で誤って命名されたものなので、HLA-L、HLA-H、HLA-J、HLA-VおよびHLA-Yをまとめて新しいHLAグループと記載することができ、本明細書ではクラスIwと呼ぶ。また、膀胱がん患者におけるHLA-L、HLA-H、HLA-Jの高発現レベルは、これらの患者の生存に悪影響を及ぼすことが明らかになった。これらのHLA遺伝子の発現レベルが高いほど、患者が2年間のうちにがんで死亡する可能性が高くなる (EP 19 18 4681.5 and EP 19 18 4717.7)。この一連の証拠は、可溶型HLAフォームL、HおよびJの発現が、腫瘍患者の免疫システムを回避するメカニズムとして腫瘍に利用されていることを示している。HLA-V、HLA-Yについても同様に考えることができる。この理論に縛られることなく、本発明者らは、これらの可溶性HLAが腫瘍細胞の周囲に雲を形成し、腫瘍細胞が腫瘍患者の免疫系に認識されるのを防いでいるのだと考えている。したがって、HLA-L、HLA-H、HLA-J、HLA-Vおよび／またはHLA-Yを核酸またはタンパク質レベルで阻害することができる医薬は、腫瘍の治療および予防に適した手段であることがわかる。同様に、HLA-L、HLA-H、HLA-J、HLA-V、HLA-Yの部位を生体内で核酸レベルあるいはタンパク質レベルで検出できる診断薬は、対象の腫瘍を診断することが可能である。しかし、腫瘍細胞は不均一であるため、すべての腫瘍が可溶性HLA-L、HLA-H、HLA-J、HLA-VおよびHLA-Yの一つ以上の発現を利用して免疫系から逃れるとは限らない。このため、本発明の第1の態様の方法は、HLA-L、HLA-H、HLA-J、HLA-VおよびHLA-Yの発現を核酸レベルおよび／またはタンパク質レベルで判定し（工程A）、HLA-L、HLA-H、HLA-J、HLA-Vおよび／またはHLA-Yが発現していれば、医薬（工程B）および／または診断薬（B'）を作製するものである。この医薬または診断薬は、特に、本発明の第1の態様の方法で使用されるように、試料が得られた対象に対して個人的に調整された医薬または診断薬として使用することができる。この方法は、添付の実施例によってさらに説明される。実施例1および2は、HLA発現の撮像と検出を示したものである。実施例3および4では、抗HLA診断薬および治療薬の生成を示している。実施例5は、がんマウスモデルにおけるHLA発現の診断に関するものである。最後に、実施例6～9では、がん患者におけるHLA発現の診断と抗HLA療法について説明した。
本発明の第1の態様の好ましい実施形態によれば、方法は、以下の発現を決定することを含む。 (i) 配列番号6～10のヌクレオチド配列の少なくとも2つの核酸分子、または本発明の第1の態様で定義されるそれら由来の核酸分子、(ii) 配列番号1～5のいずれか1つのアミノ酸配列の少なくとも2つのタンパク質、または本発明の第1の態様で定義されるそれら由来のタンパク質もしくはペプチド、および／または (iii）工程（A）において決定された、配列番号6～10のヌクレオチド配列の少なくとも1つの核酸分子または第1の態様に定義されたそれら由来の核酸分子、および配列番号1～5のいずれか1つのアミノ酸配列の少なくとも1つのタンパク質またはペプチドまたは本発明の第1の態様に定義されたそれら由来のタンパク質またはペプチド。
腫瘍は、患者の免疫システムから逃れるために、HLA-L、HLA-H、HLA-J、HLA-Y、HLA-Vのうち1つだけでなく、その2つまたは3つすべてを発現している場合がある。このため、HLA-L、HLA-H、HLA-J、HLA-YおよびHLA-Vの少なくとも2つ、少なくとも、少なくとも3つ、少なくとも4つおよび5つすべての発現を核酸レベル、タンパク質レベルまたはそれらの任意の混合物で優先して決定することが有利である。
HLA-L、HLA-H、HLA-J、HLA-YおよびHLA-Vのうちの1つ以上、ならびに任意に、本明細書に記載のHLA遺伝子、タンパク質またはペプチドのうちの追加の1つ以上を測定することは、治療すべき患者にとって最適化された抗HLA治療レジメンをコンパイルすることができる。診断に関しては、これらのHLAのうちの1つ以上を測定することにより、例えば、選択された腫瘍病変におけるHLA発現プロファイルを決定することができる。
本発明の第1の態様の別の好ましい実施形態によれば、方法はさらに、工程（A）において、HLAクラスIb遺伝子HLA-E、HLA-F、及びHLA-Gの少なくとも1つ及び／又は前記MHCクラスIb遺伝子から生成される少なくとも一つのタンパク質又はペプチドの発現を決定することを含んでいる。
本発明の第1の態様のさらに好ましい実施形態によれば、本方法は、工程（A）において、HLAクラスI遺伝子HLA-A、HLA-B、及びHLA-Cの少なくとも1つ及び／又は前記MHCクラスI遺伝子から生成される少なくとも一つのタンパク質若しくはペプチドの発現を決定することをさらに含む。
本発明の第1の態様のさらに好ましい実施形態によれば、本方法は、工程（A）において、HLAクラスII遺伝子HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA、及びHLA-DRB1の少なくとも一つ及び／又は前記MHCクラスII遺伝子から生成する少なくとも一つのタンパク質若しくはペプチドの発現を決定することをさらに含む。
ヒト白血球抗原(HLA)系または複合体は、ヒトの主要組織適合性複合体(MHC)タンパク質をコードする遺伝子複合体である。これらの細胞表面タンパク質は、ヒトの免疫系の調節を担っている。HLA遺伝子複合体は、染色体6p21内の3 Mbpの領域に存在する。HLA遺伝子は多型性が高く、多くの異なる対立遺伝子を持ち、それにより適応免疫系を微調整することができる。ある遺伝子がコードするタンパク質は、臓器移植の因子として歴史的に発見されたことから、抗原とも呼ばれる。
HLAシステムは、クラスIからIIIの3つに分類されている。大きく2つのクラスMHCクラスIとIIがある。
ヒトには、HLA-A、HLA-B、HLA-Cとして知られる3つの主要なまたは古典的なMHCクラスI遺伝子がある。主なMHCクラスI遺伝子は、当技術分野ではクラスIまたはクラスIaと呼ばれている。これらの遺伝子から産生されるタンパク質は、ほとんど全ての細胞の表面に存在する。細胞表面では、これらのタンパク質が細胞内からエキスポートされたタンパク質断片(ペプチド)に結合する。MHCクラスIタンパク質は、これらのペプチドを免疫系に提示する。腫瘍MHCクラスIa発現の消失など、T細胞認識を回避することを目的とした免疫逃避戦略は、悪性細胞でよく見られる（Garrido, Curr Opin Immunol.2016 Apr; 39:44-51）。したがって、腫瘍細胞は免疫システムから逃れるためにMHCクラスIwの発現を増加させる一方で、MHCクラスIaの発現は腫瘍細胞によって減少させられるのである。したがって、本明細書に記載の治療法は、HLA-A、HLA-B、およびHLA-Cの発現を増加させる化合物を含んでいてもよい。最も単純な形態では、そのような化合物は、HLA-A、HLA-B、および／またはHLA-C、あるいはHLA-A、HLA-B、および／またはHLA-Cを発現するベクターまたはプラスミドであり得る。腫瘍細胞は、免疫系から逃れるためにMHCクラスIaをダウンレギュレートし、MHCクラスIwをアップレギュレートするので、それぞれの少なくとも1つのメンバーの検出は、本発明の方法の選択性を高める可能性もある。これも、MHCクラスIaが正常な細胞で発現しているのに対し、MHCクラスIwは本発明者らの知る限り発現していないためである。そのため、正常組織と悪性組織の境界をより選択的に判断することができる。
ヒトはさらに、HLA-E、HLA-F、HLA-Gと呼ばれる3つのマイナーまたは非古典的なMHCクラスI遺伝子を持っている。マイナーMHCクラスI遺伝子は、当技術分野ではクラスIbと呼ばれている。 HLAクラスIb遺伝子、HLA-E、HLA-F、HLAGは、古典的なHLAクラスIa遺伝子よりもずっと後に発見された。 様々な研究の結果は、成人期におけるHLAクラスIb分子の機能的役割を支持しているが、特にHLA-GとHLA-Fは、生殖と妊娠に関連して最も集中的に研究されており、また、主に研究されてきた（Persson et al.(2017), Immunogenetics, DOI 10.1007/s00251-017-0988-4)。胎盤の胎児-母体界面におけるHLAクラスIbタンパク質の発現は、半同種異系胎児(semi-allogeneic fetus)の母体受容に重要であるようである。 HLAクラスIaの機能とは対照的に、HLAクラスIbは免疫調節および寛容化機能を有している。HLA-Fは、例えば、HLA-F1、-F2または-F3とすることができる。同様に、HLA-Gは、HLA-G1、-G2、-G3、-G4、-G5、-G6、および-G7のいずれか1つであり得る。
具体的には、HLA-Gの一次転写物（8つのエキソン, NCBI Gene Bank NM_002127.5, version of September 16, 2019）は、膜結合型（HLA-G1、-G2、-G3、-G4）および可溶型（HLA-G5、-G6、-G7）タンパク質アイソフォームをコードする7つの代替mRNAにスプライシングすることができる（Carosella et al, 2008, Trends Immunol.:29（3）:125-32）。HLA-G1は全長HLA-G分子であり、HLA-G2はエキソン4を欠き、HLA-G3はエキソン4と5を欠き、HLA-G4はエキソン5を欠いている。HLA-G1～G4は、エキソン6と7にコードされる膜貫通部と細胞質尾部の存在により、膜結合型分子である。HLA-G5はHLA-G1に似ているがイントロン5を残し、HLA-G6はエキソン4を欠くがイントロン5を残し、HLA-G7はエキソン4を欠くがイントロン3を残したものである。HLA-G5および-G6は、膜貫通型および細胞質尾部の翻訳を防ぐための早期停止コドンを含むイントロン5の存在により可溶型である。HLA-G7は、早期停止コドンを含むイントロン3が存在するため可溶型である。また、HLA-Fはオルタナティブスプライシングされている。F1、F2、F3の3つのアイソフォームは、いずれも膜結合型アイソフォームである。HLA-E のアイソフォームは報告されておらず、HLA-E は膜結合型である。HLA-E、HLA.-F1、F2、F3およびHLA-G1、G2、G3、G4、G5、G6およびG7のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号13～23に、これらのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号24～34に示した。MHCクラスIbタンパク質およびペプチドは、HLA-Lに関連して本明細書で上述したように、そのオープンコンフォマー形態も含む。例えば、HLA-Fのオープンコンフォーマーは、先行技術から知られている；Garcia-Beltran（2016）；Nat Immunol.2016 Sep; 17(9):1067-1074.例えば、古典的なHLAコンフォメーションや他の重HLA鎖との複合体とは別に、β2-ミクログロブリンやペプチド結合溝に結合したペプチドがないことを特徴とするHLA-Fの安定したオープンコンフォメーション（OC）が存在する（Sim et al.(2017) Immunity 2017, 46, 972-974）。HLA-FのようないくつかのHLA遺伝子は、他のHLAクラスI分子の重鎖と複合体を形成する（Goodridge et al (2010) J. Immunol.2010, 184, 6199-6208).また、これらのオープンコンフォーマーや複合体は、本発明に従って使用することができるHLAクラスIb遺伝子によって包含される。MHCクラスIwの場合と同様に、腫瘍は免疫系から逃れるためにMHCクラスIbの発現をアップレギュレートする（Wuerfel et.(2019), Int.J.Mol.Sci.2019, 20, 1830; doi:10.3390/ijms20081830)。クラスIwの阻害剤（例えば、抗体、siRNA、低分子、抗体ミメティック、分子等）の好ましい例を以下に記載するが、これらの好ましいタイプはIb阻害剤にも準用される。
ヒトにはHLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA、HLA-DRB1の6つの主要なMHCクラスII遺伝子が存在する。MHCクラスII遺伝子は、ほとんど特定の免疫系細胞の表面だけに存在するタンパク質をつくるための指示を提供している。MHCクラスIタンパク質と同様に、これらのタンパク質は免疫系にペプチドを提示する。 MHCクラスII遺伝子は、ほとんど特定の免疫系細胞の表面だけに存在するタンパク質をつくるための指示を提供している。MHCクラスIタンパク質と同様に、これらのタンパク質は免疫系にペプチドを提示する。腫瘍細胞によるMHC-II発現の生物学的帰結は、Axelrod et al.(2019), Clin Cancer Res, DOI:10.1158/1078-0432論文に概説されている。腫瘍特異的MHC-IIは、免疫療法により治療された患者を含むがん患者の良好な転帰や、マウスモデルにおける腫瘍拒絶反応と関連していることを示す証拠が積み重ねられている。例えば、腫瘍細胞上のMHC-II分子の発現は、免疫チェックポイント阻害剤に対する反応を予測することができる。
ヒト白血球抗原（HLA）分子は、腫瘍抗原がT細胞受容体に認識されるためにHLAに制限された形で提示されなければならないため、免疫系が腫瘍細胞を認識し、その後殺傷するために必須である。HLA-Iaの発現障害は細胞傷害性免疫機構の活性化を妨げ、HLA-IIの発現障害は抗原提示細胞の抗原提示能に影響を与える。腫瘍細胞による異常なHLA-Ib発現は、事実上すべての免疫細胞の活動を阻害することによって免疫逃避を有利にする（Rodriguez (2017), Immunogenetics (2017), Oncology Letters, https://doi.org/10.3892/ol.2017.6784, pages:4415-4427 および EP 2 561 890 B1 および Wuerfel et al.(2019), Int.J.Mol.Sci.2019, 20, 1830; doi:10.3390/ijms20081830).
より詳細には、腫瘍細胞表面におけるHLA-I(a)の発現変化は、腫瘍細胞の免疫認識や腫瘍細胞と免疫細胞の間のシグナル伝達に重要であることから、発がんを促進する初期かつ頻繁な事象であると考えられる。いくつかの研究では、異なるヒト腫瘍において古典的なHLA-I(a)分子の発現が全体的または部分的に失われ、複数のHLAアレルの少なくとも50％がヘテロ接合性喪失（LOH）事象によって引き起こされると報告されている。腫瘍細胞が様々な免疫エフェクターによる認識を回避するために用いるもう一つのHLA介在戦略は、免疫担当細胞に対する阻害リガンドとして機能するマイナーまたは非古典的なHLA-Ib分子の異常発現で、腫瘍の免疫逃避を可能にすることである。
上記の理由から、本発明の第1の態様の方法において、さらに、1つ以上のHLAクラスIa、HLAクラスIbおよび／またはHLAクラスII遺伝子またはタンパク質もしくはペプチドの発現を評価することが有利である。この発現解析の結果、腫瘍が対象の免疫系からどのように逃れるかについてのさらなる情報が得られ、したがって、腫瘍に対抗するために患者に合わせた医薬を提供するため、あるいはin vivo腫瘍部位を検出するために合わせた診断薬を提供するために考慮できるさらなる情報が提供される。
例えば、HLAクラスIbの発現が検出された場合、新規HLAクラスIwに関連して上述したように、検出されたHLAクラスIbを核酸またはタンパク質レベルで阻害することができる化合物を医薬に配合することも好ましい。同様に、HLAクラスIbの発現を検出する場合には、新規HLAクラスIwとの関連で本明細書に上述したのと同様に、HLAクラスIbの部位及び／又は量を核酸又はタンパク質レベルでin vivo検出することができる化合物を診断薬に組み入れることもまた、好ましい。この点で、Iwクラスに関連して本明細書で上述および後述する好ましい特徴および実施形態は、Ibクラスにも準用される。
本発明の第1の態様の別の好ましい実施形態によれば、本方法はさらに、工程（A）において、妊娠初期およびがん胎児性退縮(carcinoembryonic regression)において発現している少なくとも1つの成長因子および／または少なくとも1つの腫瘍マーカーおよび／または少なくとも1つのタンパク質の発現を決定することを含んでいる。
成長因子とは、細胞の成長、増殖、治癒、分化を促進する天然由来の物質である。腫瘍形成および腫瘍の進行における成長因子の役割は、例えば、Witschら、(2011), Physiology (Bethesda).2010 Apr; 25(2):85-101に記載されている。腫瘍は成長因子を異常に発現しており、腫瘍細胞は制御不能な状態で成長することができる。成長因子の発現が検出された場合、新しいHLAクラスIwに関連して本明細書で上述したように、検出された成長因子を核酸またはタンパク質レベルで阻害することができる化合物を医薬に組み込むことも好ましい。同様に、成長因子の発現を検出する場合、新規HLAクラスIwに関連して本明細書で上述したように、核酸またはタンパク質レベルで成長因子の部位および/または量をin vivoで検出することができる化合物を診断薬に組み入れることもまた、好ましい。この点で、Iwクラスに関連して本明細書で上述および後述する好ましい特徴および実施形態は、成長因子に準用される。
腫瘍マーカーとは、血液、尿、体内組織などに含まれるバイオマーカーで、1種類以上のがんの存在によって上昇する可能性のあるものである。腫瘍マーカーには多くの種類があり、それぞれが特定の病気のプロセスを示し、がんの存在を検出するために腫瘍学で使用されている。本明細書における腫瘍マーカーは、核酸分子、タンパク質、コンジュゲートされたタンパク質、またはペプチドであることができる。したがって、腫瘍マーカーを検出することで、腫瘍の診断に役立つ可能性がある。従って、腫瘍マーカーの発現が検出される場合、新規HLAクラスIwに関連して本明細書に上述したように、核酸またはタンパク質レベルで腫瘍マーカーの部位および／または量をin vivoで検出することができる化合物を診断薬に組み入れることもまた、好ましい。この点で、Iwクラスに関連して本明細書で上述および後述する好ましい特徴および実施形態は、腫瘍マーカーにも準用される。
妊娠初期やがん胎児性退縮(carcinoembryonic regression)で発現しているタンパク質（例：がん胎児性抗原（CEA）遺伝子ファミリー）は、通常、出生後にはあまり発現しない。これらのタンパク質の正常な機能は、組織の構造を組織化し、さまざまなシグナル伝達を制御することである。その異常な発現は、ヒトの悪性腫瘍の発生につながる。特に、CEAとCEACAM6は多くの種類のヒトのがんで発現が増加している。その異常な発現は、ヒトの悪性腫瘍で見られる。このようなタンパク質の発現が検出された場合、新規HLAクラスIwに関連して上述したように、検出されたタンパク質を核酸またはタンパク質レベルで阻害することができる化合物を医薬に配合することも好ましい。同様に、このようなタンパク質の発現が検出される場合、新規HLAクラスIwに関連して上述したように、核酸またはタンパク質レベルでタンパク質の部位および/または量をin vivoで検出することができる化合物を診断薬に組み込むこともまた好ましい。この点で、Iwクラスに関連して本明細書で上述および後述する好ましい特徴および実施形態は、そのようなタンパク質に準用される。
本発明の第1の態様のより好ましい実施形態によれば、少なくとも1つの成長因子は、上皮成長因子（EGF）、線維芽細胞増殖因子（FGF）、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）、成長分化因子-9（GDF9）、肝細胞増殖因子（HGF）、肝細胞由来増殖因子（HDGF）、ケラチノサイト成長因子（KGF）、神経成長因子（NGF）、胎盤成長因子（PGF）、血小板由来成長因子（PDGF）、間質細胞由来因子1（SDF1）、トランスフォーミング増殖因子および血管内皮成長因子からなる群から選択される。
これらの成長因子については、その発現が腫瘍の増殖を促進することが知られているため、上記の成長因子のリストが好ましい。
本発明の第1の態様の別のより好ましい実施形態によれば、少なくとも1つの腫瘍マーカーは、ソマトスタチン受容体、TSH（チロトロピン）受容体、チロシン受容体、及びPSMA（前立腺特異的膜抗原）からなる群から選択される。
上記の腫瘍マーカーのリストは、現在、特定の腫瘍の診断に使用されているため、好ましいとされている。
本発明の第1の態様の別の好ましい実施形態によれば、(i)医薬は、少なくとも１つの核酸分子の発現を阻害することができる低分子、アプタマー、siRNA、shRNA、miRNA、リボザイム、アンチセンス核酸分子、CRISPR－Cas9ベースの構築物、CRISPR－Cpf1ベースの構築物、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、または転写アクチベーター様(TAL)エフェクター(TALE)ヌクレアーゼであるかまたはこれらを含み、および/または(ii) 医薬は、少なくとも1つのタンパク質またはペプチドを阻害することができる低分子、抗体、タンパク質医薬、またはアプタマーであるかまたはこれらを含み、タンパク質医薬は、好ましくは抗体ミメティックであり、抗体ミメティックは、好ましくはアフィボディ、アドネクチン、アンチカリン、DARPins、アビマー、ナノフィチン、アフィリン、KunitzドメインペプチドおよびFynomers(登録商標)から選ばれ、および／または (iii)診断薬は、少なくとも１つの発現核酸分子に結合することができる低分子、アプタマー、siRNA、shRNA、miRNA、リボザイム、アンチセンス核酸分子、CRISPR－Cas9ベースの構築物、CRISPR－Cpf1ベースの構築物、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、および転写アクチベーター様(TAL)エフェクター(TALE)ヌクレアーゼであるかまたはこれらを含み、および/または(iv) 診断薬は、少なくとも1つの発現タンパク質またはペプチドに結合することができる低分子、抗体、タンパク質医薬、またはアプタマーであるか、またはこれらを含み、ここで、タンパク質医薬は、好ましくは抗体ミメティックであり、抗体ミメティックは、好ましくはアフィボディ、アドネクチン、アンチカリン、DARPins、アビマー、ナノフィチン、アフィリン、KunitzドメインペプチドおよびFynomers(登録商標)から選ばれる。
本明細書で使用される「低分子」は、好ましくは有機分子である。有機分子は炭素基礎を有する化合物のクラスに関連するか、または属し、炭素原子は、炭素－炭素結合によって一緒に連結される。化学化合物の供給源に関連する用語「有機」の本来の定義であり、有機化合物は植物または動物または微生物の供給源から得られる炭素含有化合物であり、一方、無機化合物は、鉱物源から得られたものである。有機化合物は、天然であっても合成であってもよい。有機分子は好ましくは芳香族分子であり、より好ましくはヘテロ芳香族分子である。有機化学では、芳香族性という用語が同じ原子セットを有する他の幾何学的または結合配列よりも安定性が高い共鳴結合の環を有する環状(環形状)、平面(平坦)分子を表すために使用される。芳香族分子は非常に安定であり、他の物質と反応するために容易に分解しない。複素芳香族分子において、芳香環中の原子の少なくとも1つは、炭素以外の原子、例えば、N、S、またはOであり、上記の全ての有機分子について、分子量は好ましくは200Da～1500Daの範囲であり、より好ましくは300Da～1000Daの範囲である。
あるいは、本発明に係る「低分子」が無機化合物であってもよい。無機化合物は鉱物源に由来し、炭素原子を持たないすべての化合物(二酸化炭素、一酸化炭素および炭酸塩を除く)を含む。好ましくは、低分子が約2000Da未満、または約500Da未満などの約1000Da未満、さらにより好ましくは約Da amu未満の分子量を有する。小分子の大きさは、当技術分野でよく知られている方法、例えば質量分析によって決定することができる。低分子は、例えば、標的分子のクリスタル構造に基づいて設計することができ、ここでは、生物学的活性の原因と考えられる部位を同定し、in vivoハイスループットスクリーニング(HTS)アッセイのようなin vivoアッセイで検証することができる。
本発明で使用される用語「抗体」は、例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を含む。さらに、標的（例えばHLA-J）に対する結合特異性を保持する誘導体やその断片も「抗体」の用語に含まれる。抗体断片または誘導体は、特に、FabまたはFab'断片、Fd、F（ab'）2、FvまたはscFv断片、VhHまたはV-NAR-ドメインのような単一ドメインVHまたはV様ドメイン、ならびにミニボディ、ダイアボディ、トリボディまたはトリプルボディ、テトラボディまたは化学結合Fab'-マルチマーなどのマルチマー形式を含む（例えば、Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 198; Harlow and Lane “Using Antibodies:A Laboratory Manual” Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999; Altshuler EP, Serebryanaya DV, Katrukha AG.2010, Biochemistry (Mosc)., vol. 75(13), 1584; Holliger P, Hudson PJ.2005, Nat Biotechnol., vol. 23(9), 1126を参照。）多量体フォーマットは特に、2つの異なったタイプの抗原に同時に結合することができる二重特異性抗体を含む。第一の抗原は、本発明に係るタンパク質上に見出すことができる。第2の抗原は例えば、がん細胞または特定の型のがん細胞上で特異的に発現される腫瘍マーカーであり得る。二重特異性抗体フォーマットの非限定的な例は、Biclonics(二重特異的、全長ヒトIgG抗体)、DART(Dual-affinity Re-targeting Antibody)およびBiTE(種々の抗体の2つの一本鎖可変断片(scFvs)からなる)分子である(Kontermann and Brinkmann (2015)、 Drug Discovery Today, 20(7):838-847)。このような二重特異性抗体を用いることで、二重特異性抗体の抗腫瘍作用を腫瘍細胞に集中させることができる。
用語「抗体」はまた、キメラ(ヒト定常ドメイン、非ヒト可変ドメイン)、一本鎖およびヒト化(非ヒトCDRを除くヒト抗体)抗体などの実施形態を含む。
抗体の産生のための様々な技術は当該分野で周知であり、そして例えば、Harlow and Lane(1988)および(1999)ならびにAltshuler et al. 2010(上掲)に記載される。従って、ポリクローナル抗体は添加剤およびアジュバントとの混合物中の抗原での免疫化の後に動物の血液から得られ得、そしてモノクローナル抗体は連続的な細胞株培養によって産生される抗体を提供する任意の技術によって産生され得る。このような技術に関する例は、例えば、Harlow E and Lane D, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Harlow E and Lane D, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999に記載されており、Koehler and Milstein, 1975によってもともと記載されたハイブリドーマ技術、トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術（例えば、Kozbor D, 1983, Immunology Today, vol.4,7; Li J, et al.2006, PNAS, vol.103(10), 3557）、EBV-ハイブリドーマ法によるヒトモノクローナル抗体の作製（Cole et al., 1985, Alan R. Liss, Inc, 77-96）などがある。さらに、組換え抗体はモノクローナル抗体から得ることができ、またはファージ、リボソーム、mRNA、もしくは細胞ディスプレイなどの様々なディスプレイ方法を用いてde novoで調製することができる。組換え(ヒト化)抗体の発現に適したシステムは例えば、細菌、イースト、昆虫、哺乳動物細胞株、またはトランスジェニック動物もしくは植物から選択することができる(例えば、米国特許第6,080,560号; Holliger P, Hudson PJ.2005, Nat Biotechnol.、 vol.23(9)、 11265を参照されたい)。さらに、一本鎖抗体の産生のために記載された技術(特に、米国特許第4,946,778号参照)は、例えばHLA-Jのエピトープに特異的な一本鎖抗体を産生するように適合され得る。BIAcoreシステムで使用されるような表面プラズモン共鳴は、ファージ抗体の効率を増加させるために使用され得る。
本明細書中で使用される用語「抗体ミメティック」は、抗体と同様に、抗原、例えばHLA-Jタンパク質に特異的に結合することができるが、抗体に構造的に関連しない化合物を指す。抗体ミメティックは通常、約3～20kDaのモル質量を有する人工ペプチドまたはタンパク質である。例えば、抗体ミメティックは、アフィボディ、アドネクチン、アンチカリン、DARPins、アビマー、ナノフィチン、アフィリン、クニッツドメインペプチド、Fynomers(登録商標)、三重特異性結合分子およびプロドディー(prododies)からなる群より選択され得る。これらのポリペプチドは当該分野で周知であり、そして以下にさらに詳細に記載される。
本明細書中で使用される「アフィボディ」という用語は、ブドウ球菌タンパク質AのZ-ドメインに由来する抗体ミメティックのファミリーを指し、構造的には、アフィボディ分子は、融合タンパク質にも取り込むことができる3-ヘリックスバンドルドメインに基づく。アフィボディはそれ自身、約6kDaの分子量を有し、高温および酸性またはアルカリ性条件下で安定である。標的特異性は、親タンパク質ドメインの結合活性に関与する2つのαヘリックスに位置する13のアミノ酸をランダム化することにより得られる(Feldwisch J, Tolmachev V.; (2012) Methods:Mol Biol.899:103-26)。
用語「アドネクチン」(「モノボディ」とも呼ばれる)は、本明細書中で使用される場合、ヒトフィブロネクチンIII (10Fn3)の10番目の細胞外ドメインに基づく分子に関し、2～3の露出したループを有する94残基のIg様βサンドイッチフォールドを採用するが、中央のジスルフィド架橋を欠く(Gebauer and Skerra (2009) Curr Opinion in Chemical Biology 13:245-255)。所望の標的特異性、例えばHLA－Jに対するアドネクチンは、タンパク質の特異的ループに修飾を導入することによって遺伝子操作することができる。
本明細書中で使用される用語「アンチカリン」は、リポカリンに由来する改変タンパク質を指す(Beste G, Schmidt FS, Stibora T, Skerra A. (1999) Proc Natl Acad Sci U S A. 96(5):1898-903; Gebauer and Skerra (2009) Curr Opinion in Chemical Biology 13:245-255)。アンチカリンは8本鎖βバレルを有し、リポカリンの中で高度に保存されたコアユニットを形成し、開いた末端に4つの構造的に可変なループを介してリガンドに対する結合部位を天然に形成する。アンチカリンは、IgGスーパーファミリーとは相同ではないが、これまで抗体の結合部位に典型的と考えられてきた特徴を示す: (i)配列変異の結果としての高い構造可塑性、(ii)立体配座柔軟性の上昇で、形状の異なる標的への誘導適合を可能にする。
本明細書中で使用される用語「DARPin」は、設計されたアンキリンリピートドメイン(166残基)を指し、これは、典型的には3回の反復β-ターンから生じる硬い界面を提供する。DARPinは通常、人工的なコンセンサス配列に対応する3つの反復配列をもっており、反復ごとに6つの位置がランダム化されている。そのため、DARPinは構造的柔軟性を欠いている(Gebauer and Skerra, 2009)。
本明細書中で使用される用語「アビマー」は、種々の膜受容体のA-ドメインに由来し、リンカーペプチドによって連結される、各々30～35アミノ酸の2つ以上のペプチド配列からなる抗体ミメティックのクラスを指す。標的分子の結合はAドメインを介して起こり、所望の結合特異性、例えばHLA－Jに対するドメインは、例えばファージディスプレイ技術によって選択することができる。アビマーに含まれる異なるAドメインの結合特異性は同一であってもよいが、同一である必要はない(Weidle UH, et al.、 (2013)、 Cancer Genomics Proteomics; 10(4): 155-68)。
「ナノフィチン」(別名アフィチン)は、スルホロブス・アシドカルダリウスのDNA結合タンパク質Sac7dに由来する抗体模倣タンパク質である。ナノフィチンは通常、約7kDaの分子量を有し、そして結合表面上のアミノ酸をランダム化することによって、標的分子(例えば、HLA－J)に特異的に結合するように設計される(Mouratou B, Behar G, Paillard-Laurance L, Colinet S, Pecorari F.、 (2012) Methods: Mol Biol.; 805:315-31)。
本明細書で使用される「アフィリン」という語は、ガンマ-Bクリスタリン性またはユビキチンのいずれかを足場として使用し、ランダム突然変異誘発によってこれらのタンパク質の表面上のアミノ酸を修飾することによって開発される抗体ミメティックを指す。所望の標的特異性、例えばHLA－Jに対するアフィリンの選択は例えば、ファージディスプレイまたはリボソームディスプレイ技術によって行われる。足場にもよるが、アフィリンの分子量はおよそ10または20kDaである。本明細書で使用される場合、用語アフィリンはまた、アフィリンの二量体型または多量体型を指す(Weidle UH, et al.、 (2013)、 Cancer Genomics Proteomics; 10(4):155－68)。
「クニッツドメインペプチド」は、ウシ膵臓トリプシン阻害剤(BPTI)、アミロイド前駆体タンパク質(APP)または組織因子経路阻害剤(TFPI)のようなクニッツ型プロテアーゼ阻害剤のクニッツドメインに由来する。クニッツドメインは約6kDAの分子量を有し、必要な標的特異性、例えばHLA-Jに対するドメインはファージディスプレイなどのディスプレイ技術によって選択することができる(Weidle et al.、 (2013)、 Cancer Genomics Proteomics; 10(4):155-68)。
本明細書中で使用される「Fynomer(登録商標)」という用語は、ヒトFyn SH3ドメインに由来する非免疫グロブリン由来結合ポリペプチドを指す。Fyn SH3由来ポリペプチドは当技術分野でよく知られており、例えば、Grabulovski et al.(2007) JBC, 282, p. 3196-3204, WO 2008/022759, Bertschinger et al (2007) Protein Eng Des Sel 20(2):57-68, Gebauer and Skerra (2009) Curr Opinion in Chemical Biology 13:245-255, or Schlatter et al.(2012), MAbs 4:4, 1-12)に記載されている。
本明細書で用いられる用語「三重特異性結合分子」は、ポリペプチド分子が三つの結合ドメインを有し、よって三つの異なったエピトープに対して結合、好ましくは特異的に結合することができることを意味する。これら3つのエピトープのうちの少なくとも1つは、本発明の第4の態様のタンパク質のエピトープである。2つの他のエピトープはまた、本態様の第4のタンパク質のエピトープであり得るか、または1つもしくは2つの異なった抗原のエピトープであり得る。三重特異性結合分子は、好ましくはTriTacである。TriTacは、3つの結合ドメインから構成され、血清半減期が延長され、モノクローナル抗体の約3分の1の大きさである固形腫瘍のためのT細胞誘導(T-cell engager)である。
アプタマーは、特定の標的分子に結合する核酸分子またはペプチド分子である。アプタマーは通常、大きなランダムな配列プールからこれらを選択することにより作製されるが、天然のアプタマーも、リボスイッチに存在する。アプタマーは、基本研究および臨床目的の両方において、高分子薬物として用いることができる。アプタマーはリボザイムと組み合わせることができ、それらの標的分子の存在下で自己切断する。これらの化合物分子は、さらなる研究、工業的および臨床用途を有する (Osborne et. al. (1997)、 Current Opinion in Chemical Biology, 1:5-9; Stull & Szoka (1995)、 Pharmaceutical Research, 12, 4:465-483)。
核酸アプタマーは、通常オリゴヌクレオチドの(通常は短い)鎖からなる核酸種である。典型的には、小分子、タンパク質、核酸、さらには細胞、組織および生物などの種々の分子標的に結合するために、in vitro選択の反復ラウンドまたは同等にSELEX (指数関数的濃縮によるリガンドの体系的進化)を介して改変されている。
ペプチドアプタマーは、通常、細胞内の他のタンパク質相互作用を妨害するように設計されたペプチドまたはタンパク質である。それらは、両端でタンパク質足場に結合した可変ペプチドループからなる。この二重構造束縛は、ペプチドアプタマーの結合親和性を、抗体に匹敵するレベルまで大きく増加させる(ナノモル範囲)。可変ペプチドループは典型的には10～20個のアミノ酸を含み、足場は、良好な溶解特性を有する任意のタンパク質であり得る。現在、細菌タンパク質であるチオレドキシンAが最も一般的に使用されている足場タンパク質であり、可変ペプチドループがレドックス活性部位内に挿入されており、-Cys-Gly-Pro-Cys-ループ（配列番号35）、2つのシステインの側鎖がジスルフィド結合を形成することができる。ペプチドアプタマーの選択は異なるシステムを用いて行うことができるが、現在最も広く用いられているのは酵母ツーハイブリッドシステムである。
アプタマーは、一般的に使用される生物分子、特に抗体のそれらに匹敵する分子認識特性を提供するので、バイオテクノロジーおよび治療用途のための有用性を提供する。アプタマーは、その識別認識に加えて、試験管内で完全に改変することができ、化学合成により容易に生産され、望ましい貯蔵特性を有し、治療用途においてほとんどまたは全く免疫原性を誘発しないので、抗体よりも有利である。非修飾アプタマーは血流から速やかに除去され、半減期は数分から数時間である。これは主に、アプタマーが本来低分子量である結果、ヌクレアーゼの分解と腎臓による身体からのクリアランスのためである。非修飾アプタマーの応用は、現在、血液凝固のような一過性の状態の治療、または局所送達が可能な眼のような器官の治療に焦点を当てている。この迅速なクリアランスは、in vivo画像診断などの応用において利点となりうる。2'-フッ素置換ピリミジン、ポリエチレングリコール(PEG)結合、アルブミンへの融合または他の半減期延長タンパク質などのいくつかの修飾が科学者に利用可能であり、アプタマーの半減期を数日間または数週間にわたって増加させることができる。
本明細書で使用される場合、用語「プロボディ」は、プロテアーゼ活性化可能なプロドラッグ、例えば、プロテアーゼ活性化可能な抗体プロドラッグを意味する。プロボディは、真正のIgG重鎖および修飾された軽鎖からなる。マスキングペプチドは、腫瘍特異的プロテアーゼによって切断可能なペプチドリンカーを介して軽鎖に融合される。マスキングペプチドは健康な組織へのプローブ様結合を防止し、それによって毒性の副作用を最小限にする。さらに、プロボディにより、低分子、抗体または抗体ミメティックおよびアプタマーの結合および/または阻害活性を、特定の組織または細胞型、特に罹患組織または細胞型に限定することができる。プロボディでは低分子、抗体または抗体ミメティックまたはアプタマーは本発明のタンパク質への結合を制限または防止するマスキングペプチドに結合され、このマスキングペプチドはプロテアーゼによって切断され得る。プロテアーゼは、基質として知られる特異的アミノ酸配列を切断することによってタンパク質をより小さな断片に消化する酵素である。正常の健康な組織では、プロテアーゼ活性は厳密に制御される。がん細胞では、プロテアーゼ活性はアップレギュレートされる。プロテアーゼ活性が調節され、最小限である健康な組織または細胞において、プロボディの標的結合部位はマスクされたままであり、したがって結合することができない。一方、プロテアーゼ活性がアップレギュレートされる疾患組織または細胞では、プロボディの標的結合部位はマスクされず、したがって結合および/または阻害することができる。
本発明によれば、短鎖干渉RNAまたはサイレンシングRNAとしても知られる「低分子干渉RNA (siRNA)」という用語は、生物学において様々な役割を果たす18～30、好ましくは19～25、最も好ましい21～23またはさらに好ましい21ヌクレオチド長二本鎖RNA分子を指す。最も顕著なことは、siRNAが特定の遺伝子の発現を妨害するRNA干渉(RNAi)経路に関与することである。siRNAは、RNAi経路における役割に加えて、RNAi関連経路においても、例えば、抗ウイルス機構として、またはゲノムのクロマチン構造を形成する際に、作用する。
天然に存在するsiRNAは、明確な構造をもっている。すなわち、両端に2ntの3'突出部をもつ短い二本鎖のRNA (dsRNA)である。各鎖は5'ホスフェート基と3'ヒドロキシル(-OH)基をもつ。この構造は、長いdsRNAか小さなヘアピンRNAのどちらかをsiRNAに変換する酵素であるダイサーによるプロセシングの結果である。 siRNAを細胞内に外因的に(人工的に)導入して、目的の遺伝子の特異的なノックダウンをもたらすこともできる。このようにして、配列が既知である本質的に任意の遺伝子を、適切に調整されたsiRNAとの配列相補性に基づいて標的化することができる。二本鎖RNA分子またはその代謝プロセシング産物は、標的特異的核酸修飾、特にRNA干渉および/またはDNAメチル化を媒介することができる。外因的に導入されたsiRNAは、その3'末端および5'末端に突出部を欠くことがあるが、しかしながら、少なくとも1つのRNA鎖が5'および/または3'-突出部を有することが好ましい。好適には、二本鎖の一方の末端は、1～5ヌクレオチド、より好適には1～3ヌクレオチド、最も好適には2ヌクレオチドの3'-突出部を有する。もう一方の末端は平滑末端であってもよいし、最大6ヌクレオチドの3'-突出部を有していてもよい。一般に、siRNAとして作用するのに適した任意のRNA分子が、本発明において想定される。これまで最も効率的なサイレンシングは、2-nt 3'突出部を有するように対になった21-ntセンスおよび21-ntアンチセンス鎖から構成されるsiRNA二重鎖で得られた。2-ntの3'突出部の配列は、第1の塩基対に隣接する対になっていないヌクレオチドに限定された標的認識の特異性に少し寄与する(Elbashir et al. 2001)。3'突出部の2'-デオキシヌクレオチドはリボヌクレオチドと同程度に効率的であるが、合成がより安価で、おそらくヌクレアーゼ抵抗性がより高い。siRNAの送達は、例えば、siRNAを生理食塩水と組み合わせ、その組み合わせを静脈内または経鼻的に投与することにより、またはsiRNAをグルコース（例えば5％グルコースなど）中に配合することにより、当技術分野で知られている方法のいずれかを用いて達成することができ、カチオン性脂質およびポリマーは、静脈内または腹腔内（IP）のいずれかの全身経路を通じたin vivoでのsiRNA送達に使用できる (Fougerolles et al.(2008), Current Opinion in Pharmacology, 8:280-285; Lu et al.(2008), Methods in Molecular Biology, vol. 437:Drug Delivery Systems - Chapter 3:Delivering Small Interfering RNA for Novel Therapeutics)。
短ヘアピンRNA (shRNA)は、RNA干渉を介して遺伝子発現をサイレンシングするために使用できる、緊密なヘアピンターンを作るRNAの配列である。 shRNAは、細胞に導入されたベクターを使用し、U6プロモーターを利用して、常にshRNAが発現されるようにする。このベクターは通常娘細胞に受け継がれ、遺伝子サイレンシングを受け継ぐことができる。shRNAヘアピン構造は細胞機構によってsiRNAに切断され、次にRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)に結合する。この複合体は結合しているsiRNAに一致するmRNAに結合して切断する。 本発明で使用されるsi/shRNAは、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイトおよび従来のDNA/RNA合成装置を用いて化学的に合成されることが望ましい。RNA合成試薬の供給業者は、Proligo (Hamburg、ドイツ)、Dharmacon Research (Lafayette, CO, USA)、Pierce Chemical(Perbio Scienceの一部、Rockford, IL, USA)、Glen Research (Sterling, VA, USA)、ChemGenes (Ashland, MA, USA)およびCruachem (Glasgow, UK)である。最も好都合なことに、siRNAまたはshRNAは、異なる品質およびコストのRNA合成生成物を販売する、市販のRNAオリゴ合成供給業者から得られる。一般に、本発明で適用可能なRNAは、従来技術で合成され、RNAiに適した品質で容易に提供される。
RNAiに影響を及ぼすさらなる分子には、例えば、マイクロRNA(miRNA)が含まれる。前記RNA種は一本鎖RNA分子である。内因的に存在するmiRNA分子は、相補的なmRNA転写産物に結合し、RNA干渉と同様のプロセスを通して、前記mRNA転写産物の分解の引き金を引くことによって、遺伝子発現を調節する。したがって、外因的miRNAはそれぞれの細胞に導入した後に、HLA-Jの阻害剤として使用され得る。
リボザイム(リボ核酸酵素由来、RNA酵素または触媒RNAとも呼ばれる)は、化学反応を触媒するRNA分子である。多くの天然リボザイムは、自身の切断または他のRNAの切断のいずれかを触媒するが、リボソームのアミノトランスフェラーゼ活性を触媒することもわかっている。よく特徴づけられた小さな自己切断RNAの非限定的な例は、ハンマーヘッド、ヘアピン、肝炎デルタウイルス、およびin vitroで選択された鉛依存性リボザイムであるが、グループIイントロンはより大きなリボザイムの例である。触媒による自己切断の原理は近年よく確立されるようになった。ハンマーヘッド型リボザイムは、リボザイム活性をもつRNA分子の中で最もよく特徴づけられている。ハンマーヘッド型構造が異種RNA配列に組み込まれ、リボザイム活性がそれによってこれらの分子に移入され得ることが示されたので、標的配列が潜在的に一致する切断部位を含むならば、ほぼあらゆる標的配列に対する触媒的アンチセンス配列を作製することができるようである。ハンマーヘッド型リボザイムを構築する基本原理は以下の通りである:GUC (またはCUC)トリプレットを含むRNAの関心領域が選択される。通常6～8ヌクレオチドの2本のオリゴヌクレオチド鎖が取られ、触媒ハンマーヘッド配列がそれらの間に挿入される。最良の結果は通常、短いリボザイムと標的配列で得られる。
また、最近の発展は、ハンマーヘッドリボザイムを有する小さな化合物を認識するアプタマーの組合せである。標的分子と結合したときにアプタマーに誘導される立体配座変化はリボザイムの触媒機能を調節することができる。
用語「アンチセンス核酸分子」は、本明細書中で使用される場合、標的核酸に相補的である核酸を指す。本発明によるアンチセンス分子は、標的核酸と相互作用することができ、より具体的には、標的核酸とハイブリダイズすることができる。ハイブリッドの形成により、標的遺伝子の転写および/または標的mRNAの翻訳が減少または遮断される。アンチセンス技術に関する標準的な方法が記載されている(例えば、Melaniら、Cancer Res.(1991)51:2897-2901を参照)。
CRISPR/Cas9はCRISPR‐Cpf1と同様に、ほぼ全ての細胞/モデル生物に適用可能であり、ノックアウト突然変異、染色体欠失、DNA配列の編集および遺伝子発現の調節に用いることができる。遺伝子発現の調節は、転写抑制因子と結合した触媒的に死んだCas9酵素(dCas9)を用いて、特定遺伝子、ここでは例えばHLA-J遺伝子の転写を抑制することによって操作することができる。同様に、触媒的に不活性な「死んだ」Cpf1ヌクレアーゼ(PrevotellaおよびFrancisella－1由来のCRISPR)を、合成転写リプレッサーまたはアクチベーターに融合させて、内因性プロモーター(例えば、HLA－J発現を制御するプロモーター)をダウンレギュレートし得る。あるいは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)または転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)のDNA結合ドメインが標的（例えばHLA-J）遺伝子またはそのプロモーター領域またはその5`-UTRを特異的に認識し、それによって標的の発現を阻害するように設計することができる。
興味の遺伝子またはその発現に関与する調節分子を標的とする核酸分子を阻害するものとして提供される阻害剤も、本明細書において想定される。標的遺伝子または調節分子の発現を減少または消失させるこのような分子には限定されるものではないが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼおよび転写アクチベーター様(TAL)ヌクレアーゼが含まれる。このような方法は、Silva et al., Curr Gene Ther.2011;11(1):11-27; Miller et al., Nature biotechnology.2011;29(2):143-148, and Klug, Annual review of biochemistry.2010; 79:213-231に記載されている。
本発明の第1の態様のより好ましい実施形態によれば、医薬であるか、または含まれる低分子、抗体、タンパク質医薬、またはアプタマーは、細胞傷害剤に融合され、 細胞傷害剤は、好ましくは治療用放射性同位元素、より好ましくは 177Lu、90Y、67Cuおよび225Acであり、および/または診断薬であるかまたはそれに含まれる低分子、抗体、タンパク質医薬、またはアプタマーは撮像剤に融合され、撮像剤は、好ましくは治療用放射性同位元素であり、より好ましくは 67Ga、44Sc、111In、99mTc、57Co、131Iである。
この好ましい実施形態によれば、小分子、抗体、タンパク質医薬、またはアプタマーは、コンジュゲートのフォーマットで生成されることになる。薬物コンジュゲートをデザインするための切断可能リンカーおよび非切断性リンカーは、当技術分野で公知である。
このケースでは小分子、抗体またはタンパク質薬物およびアプタマーはそれ自身、阻害効果を有さないかもしれないが、阻害効果は薬物によってのみ付与される。同様に、低分子化合物、抗体、タンパク質医薬、アプタマーは、それ自体ではin vivo腫瘍部位を検出する能力がない場合があるが、コンジュゲーションパートナーによってのみ、当該検出が可能となる。
これらの場合、小分子、抗体、タンパク質医薬、またはアプタマーは、本発明によるタンパク質またはペプチドに医薬または診断薬の部位特異的な結合を付与する。
医薬の場合、細胞傷害剤は、本発明によるタンパク質を産生および/または結合する細胞を殺傷することができる。従って、本発明のタンパク質に結合する分子の標的化能力を細胞傷害剤の細胞殺傷能力と組み合わせることにより、コンジュゲートは、健常組織と疾患組織および細胞との間の識別を可能にする阻害剤となる。同様に、診断薬の場合、診断薬は、本発明によるタンパク質を産生および／または結合する細胞を検出する（例えば、可視化する）ことが可能である。したがって、本発明のタンパク質に結合する分子の標的化能力と診断薬の殺細胞能力を組み合わせることで、コンジュゲートはin vivo腫瘍部位を検出することができる診断薬となる。
治療用放射性同位元素は、がん細胞を死滅させる量の放射線を腫瘍細胞に直接照射する。そのような同位体の例として、177Lu、90Y、67Cu、225Acがある。一方、治療用放射性同位元素は、放射線診断で放射線を検出できる量だけ腫瘍細胞に直接放射線を照射する。例えば、67Ga、44Sc、111In、99mTc、57Co、131Iなどが挙げられる。
本発明は、第2の態様において、対象の腫瘍の治療または予防に使用するための、本発明の第1の態様の方法によって製造される医薬に関する。
処理される対象は、好ましくは、本発明の第1の態様の方法で使用される試料が得られた対象者と同じ対象である。その結果、対象は、対象の腫瘍に合わせた腫瘍治療または予防を受けることができる。
本発明は、第3の態様において、対象の腫瘍部位をin vivoで検出する際に用いる、本発明の第1の態様の方法によって製造される診断薬に関するものである。
診断される対象は、好ましくは、本発明の第1の態様の方法で使用される試料が得られた対象と同じである。その結果、対象の腫瘍に合わせた腫瘍診断を受けることができる。
本発明の第3の態様の好ましい実施形態によれば、検出は、対象の全身を走査することを含み、走査は、好ましくは、全身陽電子放出断層撮影（PET）スキャナを用いる。
全身陽電子放出断層撮影（PET）スキャナーのような全身用スキャナーでは、人体全体の画像、好ましくは3D画像を作成することができる。
特にPETスキャナーは、スキャナーの効率が良いので有利である。標準的な放射線量を使用して最短1秒画像を作成することができ、従来の装置よりもはるかに速いスピードで画像を作成することができる。さらに、被ばく低減のために、スキャナーの時間を数秒増やすだけで、線量を下げることができる。スキャナーは、異なる組織や臓器が異なる刺激にどのように反応するかを評価することができる。また、炎症の広がり、さまざまな疾患の影響、がん腫瘍の動きなども、このスキャン技術によって容易に評価することができる。PETスキャナーは、Explorer Total Body ScanTMが望ましい。
本発明の第3の態様の好ましい実施形態によれば、検出は、対象の腫瘍部位への放射性同位元素の放射線量取り込みを測定することを含んでいる。
本実施形態によれば、診断用放射性同位元素、より好ましくは 67Ga、44Sc、111In、99mTc、57Co、131Iが検出のために使用される。放射性同位元素は、好ましくは、本明細書で上述したようなコンジュゲートの一部である。
対象の腫瘍部位への放射性同位元素の放射線量取り込みを測定する手段及び方法は、当該技術分野において知られており、例えば、Eberle Huguetteら(2014) World J Nucl Med.; 13(1):50-55又はFrancisら(2015) Journal of Radiation Research and Applied Sciences, 8(2):182-189 に記載されている。例えば、撮影にはSiemens e.cam SPECT 装置を用い、画像に基づく取り込みの定量化は、ソフトウェア、例えばImage Jソフトウェアにより行うことができる。
本発明の第3の態様のより好ましい実施形態によれば、測定された放射線量取り込みに基づいて、治療的有効量の医薬が決定されることになり、ここで、医薬は、好ましくは本発明の第1の態様の方法によって製造される。
腫瘍における放射性核種の取り込みを定量化することは、患者の治療に対する反応、重要な臓器への線量、腫瘍の診断において重要であり、推奨されている（Francis et al.(2015) Journal of Radiation Research and Applied Sciences, 8(2):182-189) 。例えば、診断用放射性同位元素の取り込み量が少ない場合は、治療用放射性同位元素の高用量が必要であり、逆も同様ある。
本明細書で特徴付けられる実施形態に関して、特に請求項では、従属請求項で言及される各実施形態が、各請求項の各実施形態(独立または従属)と組み合わせられることが意図されている。例えば、3つの選択肢A、B、Cを記載する独立請求項1、3つの選択肢D、E、Fを記載する従属請求項2、請求項1および2に依存し3つの選択肢G、H、Iを記載する請求項3の場合、明細書は、 特に明記しない限り、組合せA, D, G; A, D, H; A, D, I; A, E, G; A, E, H; A, E, I; A, F, G; A, F, H; A, F, I; B, D, G; B, D, H; B, D, I; B, E, G; B, E, H; B, E, I; B, F, G; B, F, H; B, F, I; C, D, G; C, D, H; C, D, I; C, E, G; C, E, H; C, E, I; C, F, G; C, F, H; C, F, I, 対応する実施形態を明確に開示すると理解されよう。
同様に、また、独立請求項及び/又は従属請求項が選択肢を記載していない場合においても、従属請求項が複数の先行する請求項に遡って参照している場合、それによってカバーされる対象事項の組合せは、明示的に開示されているとみなされることが理解される。例えば、独立請求項1、請求項1をさかのぼって参照する従属請求項2、および請求項2および1の両方をさかのぼって参照する従属請求項3の場合、請求項3及び1の対象事項の組合せは、請求項3、2及び1の対象事項の組合せと同様に明確かつ明白に開示されることになる。請求項1～3のいずれか1項を参照するさらなる従属請求項4が存在する場合、請求項4及び1、請求項4、2及び1、請求項4、3及び1並びに請求項4、3、2及び1の対象事項の組合せは、明確かつ明白に開示されることになる。
HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-Fアイソフォーム, HLA-G, HLA-H, HLA-J のα2および3ドメインの領域、膜貫通ドメイン、および対応する連結ペプチドと細胞質領域におけるタンパク質配列の概要である。コンセンサス配列は、並んだ配列の上にグレーでハイライトされている。また、HLAペプチド配列の違いは、グレーで強調されている。予測されるα3は他のHLA遺伝子と異なり、グレーで強調表示されている。独自のHLA-J抗体を作製するためのペプチド配列を茶色の矢印で描き、「JULY 抗体」と命名した。
患者の卵巣がん、乳がん、膀胱がん組織および胎盤組織におけるウエスタンブロット分析によるHLA-Jタンパク質の発現の証拠である。
実施例により本発明を説明する。
実施例1放射性核種標識抗HLA抗体によるがん細胞のイメージング
この実施例では、セラノスティクスと呼ばれる、放射性核種を標識した抗体を用いた個別化抗腫瘍治療法の作成について記載する。また、陽電子放出断層撮影（PET）とコンピュータ断層撮影（CT）を用いて、患者の腫瘍や転移を検出し治療するin vivoの方法についても記載する。
第一段階として、診断用放射性核種で標識した抗HLA抗体を用いて、腫瘍および転移巣の個別かつ固有のHLA発現パターン（成体および／または胚および／または以前の「偽遺伝子」）を可視化する。HLAの発現パターンを決定し、がん細胞の分布や腫瘍の大きさを評価した後、治療用放射性核種を標識した治療用抗HLA抗体混合物を適用する。第一段階で適用した診断用放射性核種を標識した抗HLA抗体により、治療効果や成功率をモニターすることができる。
放射線被曝を最小限に抑え、適用した放射性同位元素標識抗HLA抗体の治療効果を最大化するためには、治療前にHLAの状態を把握することが有利になる。
HLA発現パターンを決定するために、全身スキャナー「Explorer Total Body ScannerTM」（United Imaging社、上海）を用いてPET/CT撮影を行う。この装置は、従来のPET/CTスキャナーに比べ、30秒の測定時間で40倍の高感度を実現した。2.8mm以上のHLAを発現している病変を6倍の画像分解能で検出することができる。また、全身用スキャナーは、患者の放射線負担を軽減し、副作用を最小限に抑えることができる。
腫瘍細胞にのみ発現しているHLAクラスIb、Iw遺伝子を検出するために使用する抗体には、抗HLA-G抗体（LILLY1、およびLILLY2）、抗HLA-J抗体（JULY）などがある。これらの抗体は、他のHLA遺伝子との交差反応を最小限にするために、HLAクラスIbおよびIw遺伝子ごとに固有のペプチド配列に対して作製されている（BioGenes社、ベルリン、ドイツ）。HLA-J抗体は、HLA-Jのユニークなα3および膜貫通ドメインのc末端に対して作製されている（図1）。ペプチド配列は、アルファ3ドメイン、連結ペプチドおよび膜貫通ドメインのN末端にわたる22アミノ酸を含む。
実施例2 - HLA-Jタンパク質発現の検出
HLA-Jタンパク質の存在を証明するために、患者の卵巣がん、乳がん、膀胱がんの組織と胎盤（n=1）に対してウエスタンブロット分析を行った。20μgのタンパク質組織溶解物を、変性条件下で10% SDS－PAGEゲル中で分離し、そしてニトロセルロース膜に湿った状態で移した。特異的抗HLA－J抗体「JULY」とのインキュベーション後、HPRと結合した抗ウサギ抗体とのインキュベーション後、続いてTMB基質の適用後に、紫色沈殿物が観察された。ウエスタンブロット分析では、約55kDaの大きさのHLA‐Jタンパク質が認められた（図２）。計算されたHLA‐Jのタンパク質サイズは26.7kDa程度である。卵巣がんの組織サンプルについては、100kDa付近に更なるバンドが検出されることがある。これらの知見は、HLA‐Jがジスルフィド結合を作り出すシステイン残基によって引き起こされる二量体および四量体コンホメーションで主に存在することを示す。
実施例3 - 撮像のための68ガリウムによる抗HLA-J JULY-mAbおよび抗HLA-G LILLY-mAbの標識
がん細胞の分布を十分に評価するために、HLA-J抗体JULYと抗HLA-G抗体LILLYに診断用放射性核種であるガリウム-68を標識させた。
両性元素であるガリウム-68は、現在の知見では288日と長い半減期を有する親核種ゲルマニウム-68からGe-68/Ga-68ジェネレーター系で導出された（Zhernosekov et al., J Nucl Med 2007 Oct; 48(10):1741-8).放射化学的に純粋なガリウム-68を得るために、Ge-68/Ga-68ジェネレーターに後処理した陽イオン交換を行い、10分以内に純粋なガリウム-68を採取できるようになった（Mueller et al., Recent Results Cancer Res.2013; 194:77-87.）ガリウム-68自体の半減期は約68分なので、高速で標識する必要がある。カセットベースの合成システムであるクリックケミストリー（EZAG, Berlin, Germany）に基づき、JULYとLILLYにキレーターであるDOTA (1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N,N',N",N"'-tetraacetic acid) でガリウム-68を標識した。本システムは、放射性医薬品の生成を自動化、高速化し、GMPに準拠した製造方法を提供する。品質、無菌性、エンドトキシン試験および化学的・放射化学的純度は、欧州薬局方V.8.0（欧州薬局方（Ph.Eur.)Vol 8 (2013-2016) European Directorate of Quality of Medicines）のモノグラフに従って試験された。 生体内分布、結合親和性、線量測定は、細胞株および患者の新鮮凍結組織スライドを用いたin vivoで確認した。
ルテチウム-177標識JULYおよびLILLY治療の要件は、ルテチウム-177 PSMA治療と同様である（Baum et al., Nuklearmediziner 2015; 38(02):145-152).腎臓の保護は、バッドベルカプロトコル（bad berka protocol） (Schuchardt et al., Recent Results Cancer Res.2013; 194:519-36)に従った.
実施例4-抗HLA-J JULY-mAbおよび抗HLA-G LILLYを177ルテチウムで標識し、治療に使用する。
ルテチウム177は低エネルギーのベータ線放出核種であり、軟組織での平均透過範囲は650μm、半減期は6.72日である。ルテチウム177は、ベータ線を放出する放射性核種の範囲が小さい一方で、アルファ線を放出する放射性核種の50倍のレンジャー（ranger)であるため、治療用放射性核種として最適な核種である。低エネルギーのガンマ線を放出することで、PET/CTによるイメージングと分布解析が可能になる。特許DE102011051868A1によるイッテルビウム-176上の間接的な製造ルートで生成される。抗体JULYおよびLILLYのラベリングは、Repetto-Llamazares et al, PLoS One.2014; 9(7)に記載されているように行った。品質、無菌性、エンドトキシン試験および化学的・放射化学的純度は、欧州薬局方V.8.0（欧州薬局方（Ph.Eur.)Vol 8 (2013-2016) European Directorate of Quality of Medicines）のモノグラフに従って試験された。
生体内分布、結合親和性、線量測定は、細胞株および患者由来 の新鮮凍結組織スライドで確認した。
実施例5 - BBN誘発膀胱がん発がん動物モデルにおける抗HLA-J JULY-mAbおよび抗HLA-G Lilly-mab放射性同位元素68ガリウムの尾静脈への静脈内注射および膀胱内点滴注入(instillation)による全身適用後の生体内分布図
実験動物セットアップ
ジョージら（Transl Oncol.2013 Jun; 6(3):244-255）に従い、C57BL/6/cマウス（チャールズリバーラボラトリーズインターナショナル、Inc、Wilmington、MA）に膀胱特有の発がん物質N-ブチル-N-（4-ヒドロキシブチル）ニトロサミン（BBN）で膀胱がんを誘発させた。簡単に言うと、動物を2つのグループに分けた（n= 27-30/グループ）。グループ1は水道水のみを投与したコントロールとし、グループ2はBBNを投与した。発がん性物質BBN（TCI America, Portland, OR）を飲料水中0.05%で8週齢から20週齢のマウスに自由に供給した。BBN摂取量を測定するために水の消費量を記録し、グループ間で比較した。体重は8週齢から32週齢の間の複数の時点で測定された。動物は腫瘍の進行と生存をモニターし、32週間後に殺して膀胱と臓器の重量を測定した。
抗HLA-J JULY-mAbと抗HLA-G Lilly-Mabの放射性同位元素68ガリウムによる生体内分布の解析。
膀胱がんを発症した動物と腫瘍のないマウスで生体内分布が評価された。動物に6.66 MBqのガリウム-68標識抗HLA-J JULY-mAbまたはガリウム-68標識抗HLA-G Lilly-mabを100 μLのPBSで膀胱内注射した。注射後45分と90分後にマウスを犠牲にし、ガリウム-68標識抗HLA-J JULY-mAbまたはガリウム-68標識抗HLA-G Lilly-mAbの蓄積量をγカウンターで測定するための臓器を準備した。取り込み量は、組織1gあたりの注入活性のパーセンテージで表した。膀胱を分離して半分に分け、一方は組織学と免疫組織化学のために処理し、もう一方はRNA単離のために急速冷凍した。
尾静脈への静脈内注射により、ガリウム-68標識抗HLA-J JULY-mAbまたはガリウム-68標識抗HLA-G Lilly-mAbを全身に投与し、全身への生体内分布を測定するために、第2のセットが実施された。注射後45分と90分後にマウスを犠牲にし、ガリウム-68標識抗HLA-J JULY-mAbまたはガリウム-68標識抗HLA-G Lilly-mAbの蓄積量をγカウンターで測定するための臓器を準備した。取り込み量は、組織1gあたりの注入活性のパーセンテージで表した。 膀胱を分離して半分に分け、一方は組織学と免疫組織化学のために処理し、もう一方はRNA単離のために急速冷凍した。
PET-CTスキャナーで生体内分布がモニターされた。
177ルテチウムを放射標識した抗HLA-J JULY-mAbおよび抗HLA-G Lilly-mAbによる放射性免疫療法。
腫瘍を持つマウスを10匹ずつ9群に分け、放射性免疫療法法を実施した。これらの群は、BBN誘導後1時間、7日、14日に、100μLのPBSに溶かした0.925MBqのルテチウム-177抗HLA-J JULY-mAbまたはルテチウム-177抗HLA-G LILLY-mAbを膀胱内に、 または0.37 MBqのルテチウム-177抗HLA-J JULY-mAbまたは68-ガリウム抗HLA-G LILLY-mAbを100μLのPBSに溶解し、BBN誘導後1時間または7日に、または40μgのマイトマイシンCを40μLの0.9% NaClに溶解し、BBN誘導後1時間または7日に、または2μgの非標識ルテチウム-177抗HLA-J JULY-mAbまたはルテチウム-177抗HLA-G LILLY-mAbをBBN誘導後1時間に投与された。対照群にはBBN誘導後1時間目にPBSを膀胱内投与した。治療中、マウスは麻酔をかけられた（90分）。
ルテチウム-177抗HLA-J JULY-mAbまたは68-ガリウム抗HLA-G LILLY-mAbを尾静脈に静脈内注射して全身に適用し、第2のセットアップが行われた。腫瘍を有するマウスを10匹ずつ9群に分けた。これらの群は、100μLのPBSに溶かした0.925MBqのルテチウム-177抗HLA-J JULY-mAbまたはルテチウム-177抗HLA-G LILLY-mAbを静脈内にBBN誘導後1時間、7日目、14日目に、 または100μLのPBSに溶かした0.37 MBqのルテチウム-177抗HLA-J JULY-mAbまたは68-ガリウム抗HLA-G LILLY-mAbをBBN誘導後1時間または7日に、または40μgのマイトマイシンCを40μLの0.9％NaClに溶かし、BBN誘導後1時間または7日目に、または2μgの非標識ルテチウム-177抗HLA-J JULY-mAbまたはルテチウム-177抗HLA-G LILLY-mAbをBBN誘導後1時間に投与された。対照群には、腫瘍細胞接種後1時間にPBSを膀胱内投与した。治療中、マウスは麻酔をかけられた（90分）。
放射線免疫療法はPET-CTスキャナーでモニタリングされた。
病理組織学的評価と組織マイクロアレイの作製
膀胱の病理組織を評価するために、まず膀胱を摘出し、縦に半分に切り、10％緩衝ホルマリンで固定した。ホルマリン固定した膀胱をパラフィン包埋し、切片化し、標準プロトコールに従ってヘマトキシリンとエオシンで染色を行った。染色したスライドを専門の病理医（S.S.S.）が病理組織学的に評価し、膀胱を正常とがん、浸潤性と筋浸潤性に分類した。そして、組織マイクロアレイを構築するための腫瘍の領域をマークするために、これらを検討した。組織マイクロアレイは、パラフィンブロックから打ち抜いた0.6mm円柱コアを使って、手動式の組織アレイヤー（Beecher Instruments, Silver Spring, MD）で作成した。代表的な再現性を高めるために、個々のブロックから3回に分けてコアを作成した。このようにして、180匹の雌マウスに相当する合計540個のコアを用いて、5つのマスターブロックが作成された。これらのブロックから5マイクロメートルの切片を切り出し，荷電スライド（Fisher Scientific, Houston, TX）に載せて，適切に染色した．簡単に言えば、これらのスライドを脱パラフィンし、再水和し、マイクロ波またはプロテイナーゼKで前処理して抗原賦活化したものである。その後、対応する抗体を用いて免疫組織化学染色を行った。染色方法は、ビオチン化Ig二次抗体、DAB基質、ヘマトキシリン対比染色による間接ビオチン-アビジン系に基づく。陰性対照スライドは、一次抗体を省くか、無関係な抗体（マウスモノクローナルIg）でインキュベートした後に得られた。
Ki-67染色による腫瘍細胞増殖の観察
上記で作成した組織マイクロアレイを用いて、切片は、TechMate 500 Plus（Dako North America Inc, Carpinteria, CA）中で25分間インキュベートしたモノクローナルMIB-1抗体（Clone MIB-1, mouse IgG1, 1:100 from Dako North America Inc）により免疫組織化学的に評価したKi-67抗原について染色し、DABで視覚化した。画像は、組織切片全体について、倍率20倍の対物レンズ付きCRIマルチスペクトルカメラ（Caliper, Hopkinton, MA）を用いて、Vectraスキャナーで撮影された。画像解析は、InForm 1.2ソフトウェアを用いて行った。InFormは、各組織切片の代表的なフィールドでKi-67陽性細胞をカウントするようトレーニングされた。画像から、Image-Pro Plusソフトウェア（Media Cybernetics Inc, Bethesda, MD）を用いて、尿道以外の組織の領域をマスクした。組織の全セクションの画像を用いて、陽性に染色された細胞の割合を算出した。
アポトーシスアッセイ
細胞死は、先に述べたように、Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) アッセイを用いたDNA鎖切断の酵素標識によってin situで検出された。ネガティブコントロールには、Terminal deoxynucleotidyl transferaseを脱イオン水に置き換え、ポジティブコントロールには、1.0 g/ml DNase I (DN 25; Sigma-Aldrich, St Louis, MO) で前処理をした切片を使用した。画像は上記のようにVectraスキャナーで撮影し、InForm 1.2とImage-Pro Plusソフトウェアを用いてTUNEL陽性細胞のパーセンテージを求めた。
HLA免疫組織化学
HLA-JとHLA-Gの免疫組織化学的染色には、HLA-JとHLA-Gに対するウサギポリクローナル抗体（BioGenes, Berlin, Germany）を使用した。HLA-JおよびHLA-Gの発現の評価は、組織処理の盲検化された病理医（S.S.S.）がAllred scoringの修正版を用いて実施した。パーセンテージの評点に強度を掛け合わせ、0から9までの総合スコアを算出した。HLA-Jおよび-Gの発現スコアは、陰性（0）、低（＜6）、高（≧6）に分類された。
HLA mRNAの発現解析
雄マウスから得た膀胱検体を粉末化し、QIAshredder columns (Qiagen, Hilden, Germany) でホモジナイズし、RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) でメーカー推奨に従ってトータルRNAを抽出した。RNAは、TaqManプライマーとプローブを用いた定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）分析により定量した。すべての抽出物について、安定したリファレンス／ハウスキーパー遺伝子として知られる構成的発現遺伝子カルモジュリン2遺伝子（CALM2）のリアルタイムPCR（RT-qPCR）による定量を行い、十分な高品質RNA量を有するかどうかを検証した。RT－qPCR法による遺伝子発現の詳細な解析のために、目的の部位に隣接するプライマーおよび中間でハイブリダイズする蛍光標識プローブを利用した。RNA特異的プライマー/プローブ配列を使用して、プライマー/プローブ配列をエキソン/エキソン境界を横切って位置させることによってRNA具体的な測定可能にした。同じ遺伝子の複数のアイソフォームが存在する場合、プライマーを選択して、全ての関連するまたは選択されたスプライスバリアントを適切に増幅した。全てのプライマー対を、従来のPCR反応によって特異性についてチェックした。 HLA-H、J、L、Gに対して特異的なプライマーを作製した。
Figure 2022553073000001
上記プライマーおよびプローブは、配列番号36～83に対応する。例えば、HLA-G エキソン3のフォワードプライマー、プローブ、リバースプライマーは、それぞれ配列番号 36、37、38である。
結果
膀胱特異的な発がん物質であるBBNを投与したところ、70％の腫瘍増殖が認められた。ガリウム-68標識抗HLA-J JULY-mAbまたはガリウム-68標識抗HLA-G Lilly-mAb（100μL中6.66MBq）を膀胱内点滴注入した45分後と90分後に、68ガリウム活性の定量化により各臓器の放射免疫複合体の取り込みを分析した。ガリウム68標識抗HLA-J JULY-mAbまたはガリウム68標識抗HLA-G Lilly-mAbを局所的に膀胱内に投与することにより、治療用化合物が膀胱内に優れた状態で留まり、全身への影響はほとんどないことが推測される。これらのデータから、全身毒性は低いことが示唆され、300日以上生存した動物が犠牲になった後に病気の徴候がないことで確認された。
ルテチウム-177抗HLA-J JULY-mAbおよびルテチウム-177抗HLA-G LILLY-mAbの膀胱内投与後の治療反応と効果をモニターするために、治療前後の異なる時点で腫瘍のPET-CT画像が記録された。BBN誘発14日後にルテチウム-177抗HLA-J JULY-mAbとルテチウム-177抗HLA-G LILLY-mAbを投与したところ、完全消失と腫瘍負荷の減少の両方を観察することができた。さらに、Simple PCIソフトウェアを用いて、選択したマウスの腫瘍からの発光を治療前後のROI上で定量化した。BBN誘発7日後にルテチウム-177抗HLA-J JULY-mAbまたはルテチウム-177抗HLA-G LILLY-mAb処理を行ったマウスの膀胱内腫瘍の発光（0.925MBq）は、膀胱内腫瘍の完全または部分寛解を示す。
腫瘍細胞注入の1時間後にPBSまたは非標識の抗HLA-J JULY-mAbおよび抗HLA-G LILLY-mAb処理を行ったマウスは、それぞれ41日および89日の生存期間中央値に達した。BBN導入1時間後に0.37または0.925 MBqルテチウム-177抗HLA-J JULY-mAbおよびルテチウム-177抗HLA-G LILLY-mAb治療療法を受けた群は、いずれも生存期間中央値が300日以上と有意に長く（P < 0.001） 、腫瘍の発生はなかった。90％の動物で無病生存が確認された。
実施例6-放射性同位元素68ガリウム標識抗HLA-J JULY-mAb および抗HLA-G Lilly-mAbの生体内分布およびネオアジュバントプラチウムベース化学療法に反応しない進行筋浸潤膀胱がん患者の膀胱に注入した後の放射性同位元素ルテチウム-177で標識したこれらの抗体による治療
ネオアジュバントプラチナ系化学療法が無効な筋層浸潤性進行膀胱がん患者を対象に、ガリウム68標識抗HLA-J JULY-mAb抗体およびガリウム68標識抗HLA-G Lilly-mAb抗体による生体内分布測定を実施した。点滴注入(instillation)はEAU泌尿器科ガイドライン（Roupretら、Eur Urol.2018 Jan; 73(1):111-122)に従った。全身PET-CTスキャナーで生体内分布がモニターされた。PET-CTによる分子イメージングでは、68ガリウムで標識した抗HLA-J JULY-mAbと抗HLA-G Lilly-mAbが筋層浸潤性膀胱がんを主に標的とし、同時に周囲の健常膀胱組織への取り込みが極めて低いことが確認されました。このデータから、抗HLA-J JULY-mAbおよび抗HLA-G LILLY-mAbは全身毒性が低く、有効な抗腫瘍治療となることが示された。
放射線免疫療法では、ルテチウム177で標識した抗HLA-J JULY-mAbと抗HLA-G LILLY-mAbを患者に投与した。点滴注入(instillation)はEAU泌尿器科ガイドライン（Roupretら、Eur Urol.2018 Jan; 73(1):111-122)に従った。ルテチウム177標識抗HLA-J JULY-mAbおよび抗HLA-G LILLY-mAbnoの点滴注入(instillation)は、静脈系から全身に投与する方法と比較すると、全身への放射性毒性負荷が低く、腎機能が保たれるという利点がある。全患者が組織学的に証明された筋層浸潤性膀胱がんであった。全身用PET-CTスキャナーで点滴注入療法の効果を確認した。再構成は、低線量CTに基づく減衰・散乱補正を含め、メーカーが実装している反復再構成アルゴリズムで行った。定量的な解析のために、ダイナミックリストモードデータを300秒の6枚の画像として再構成した。膀胱と全臓器の固定サイズの関心領域（VOI）において、平均標準化取り込み値（SUV）を測定した。
HLA-J、HLA-G陽性の膀胱がんが検出された。また、副作用は認められなかった。ルテチウム-177標識抗HLA-J JULY-mAbおよび抗HLA-G LILLY-mabで得られた取得画像は、ガリウム-68標識抗HLA-J JULY-mAbおよびガリウム-68標識抗HLA-G Lilly-mab抗体を用いて以前に得られた画像と同様であった。治療効果を評価するために、異なる時点でPET-CT画像を撮影した。抗HLA-Jおよび抗HLA-G放射線免疫療法は、腫瘍サイズの縮小や病理学的完全奏効など、患者に奏効を示すことが確認された。
実施例7-抗HLA-J JULY-mAbおよび抗HLA-G Lilly-mAbの放射性同位元素68ガリウムの生体内分布およびこれらの抗体の放射性同位元素ルテチウム-177をネオアジュバントプラチウムベース化学療法に反応しない進行した筋肉浸潤膀胱がん患者に静脈内投与した治療法
ネオアジュバントプラチナ系化学療法が無効な筋層浸潤性進行膀胱がん患者を対象に、ガリウム68標識抗HLA-J JULY-mAb抗体およびガリウム68標識抗HLA-G Lilly-mAb抗体による生体内分布測定を実施した。静脈内注射は、EAU泌尿器科ガイドライン（Roupret et al, Eur Urol.2018 Jan;73(1):111-122）に従って適応した。全身PET-CTスキャナーで生体内分布がモニターされた。PET-CTによる分子イメージングにより、68ガリウム標識抗HLA-J JULY-mAbおよび抗HLA-G Lilly-mabは筋層浸潤性膀胱がんを主な標的とし、同時に他の臓器への取り込みが非常に少ないことが判明した。このデータから、抗HLA-J JULY-mAbおよび抗HLA-G LILLY-mAbは全身毒性が低く、有効な抗腫瘍治療となることが示された。
放射線免疫療法では、ルテチウム177で標識した抗HLA-J JULY-mAbと抗HLA-G LILLY-mAbを患者に投与した。静脈内注射は、EAU泌尿器科ガイドライン（Roupret et al, Eur Urol.2018 Jan;73(1):111-122）に従って適応した。全患者が組織学的に証明された筋層浸潤性膀胱がんであった。放射線免疫療法の効果は、全身PET-CTスキャナーでモニターされた。再構成は、低線量CTに基づく減衰・散乱補正を含め、メーカーが実装している反復再構成アルゴリズムで行った。定量的な解析のために、ダイナミックリストモードデータを300秒の6枚の画像として再構成した。膀胱と全臓器の固定サイズの関心領域（VOI）において、平均標準化取り込み値（SUV）を測定した。
HLA-JおよびHLA-G陽性の膀胱がんと異なる転移部位が検出され、同時に他の臓器への取り込みが非常に少なかった。また、副作用は認められなかった。ルテチウム-177標識抗HLA-J JULY-mAbおよび抗HLA-G LILLY-mabで得られた取得画像は、ガリウム-68標識抗HLA-J JULY-mAbおよびガリウム-68標識抗HLA-G Lilly-mab抗体を用いて以前に得られた画像と同様であった。治療効果を評価するために、異なる時点でPET-CT画像を撮影した。抗HLA-Jおよび抗HLA-G放射線免疫療法は、腫瘍サイズの縮小や病理学的完全奏効など、患者に奏効を示すことが確認された。また、転移巣の大きさや数も減少した。一部の患者では、適用した放射線免疫療法に対して、転移や腫瘍が全く認められないという病理学的な完全奏効を示した。
実施例8-抗HLA-J JULY-mAbおよび抗HLA-G Lilly-mAbの放射性同位元素68ガリウムの生体内分布とBCG点滴注入に抵抗性の非筋層浸潤膀胱がん患者の膀胱に点滴注入した後の放射性同位元素ルテチウム-177で標識したこれらの抗体による治療。
ネオアジュバントプラチナ系化学療法が無効な筋層非浸潤性進行膀胱がん患者を対象に、ガリウム68標識抗HLA-J JULY-mAb抗体およびガリウム68標識抗HLA-G Lilly-mAb抗体による生体内分布測定を実施した。点滴注入(instillation)はEAU泌尿器科ガイドライン（Roupretら、Eur Urol.2018 Jan; 73(1):111-122)に従った。全身PET-CTスキャナーで生体内分布がモニターされた。PET-CTによる分子イメージングでは、68ガリウムで標識した抗HLA-J JULY-mAbと抗HLA-G Lilly-mAbが筋層浸潤性膀胱がんを主に標的とし、同時に周囲の健常膀胱組織への取り込みが極めて低いことが確認されました。このデータから、抗HLA-J JULY-mAbおよび抗HLA-G LILLY-mAbは全身毒性が低く、有効な抗腫瘍治療となることが示された。
放射線免疫療法では、ルテチウム177で標識した抗HLA-J JULY-mAbと抗HLA-G LILLY-mAbが患者に投与された。点滴注入(instillation)はEAU泌尿器科ガイドライン（Roupretら、Eur Urol.2018 Jan; 73(1):111-122)に従った。ルテチウム177標識抗HLA-J JULY-mAbおよび抗HLA-G LILLY-mAbnoの点滴注入(instillation)は、静脈系から全身に投与する方法と比較すると、全身への放射性毒性負荷が低く、腎機能が保たれるという利点がある。すべての患者は、組織学的に筋層非浸潤性膀胱がんであることが証明された。全身PET-CTスキャナーで点滴注入療法の効果を確認した。再構成は、低線量CTに基づく減衰・散乱補正を含め、メーカーが実装している反復再構成アルゴリズムで行った。定量的な解析のために、ダイナミックリストモードデータを300秒の6枚の画像として再構成した。膀胱と全臓器の固定サイズの関心領域（VOI）において、平均標準化取り込み値（SUV）を測定した。
HLA-JおよびHLA-G陽性の膀胱がんが検出されたが、他の臓器では検出されなかった。また、副作用は認められなかった。ルテチウム-177標識抗HLA-J JULY-mAbおよび抗HLA-G LILLY-mabで得られた取得画像は、ガリウム-68標識抗HLA-J JULY-mAbおよびガリウム-68標識抗HLA-G Lilly-mab抗体を用いて以前に得られた画像と同様であった。治療効果を評価するために、異なる時点でPET-CT画像を撮影した。抗HLA-Jおよび抗HLA-G放射線免疫療法は、腫瘍サイズの縮小や病理学的完全奏効など、患者に奏効を示すことが確認された。
実施例9-抗HLA-J JULY-mAbおよび抗HLA-G Lilly-mAbの放射性同位元素68ガリウムの生体内分布およびBCG点滴注入に抵抗性の非筋浸潤性膀胱がん患者への、静脈内注入による放射性同位元素ルテチウム-177標識したこれらの抗体による治療
BCG治療に反応しない進行した非筋層浸潤性膀胱がん患者を対象に、ガリウム68標識抗HLA-J JULY-mAb抗体およびガリウム68標識抗HLA-G Lilly-mAb抗体による生体内分布測定を実施した。静脈内注射は、EAU泌尿器科ガイドライン（Roupret et al, Eur Urol.2018 Jan;73(1):111-122）に従って適応した。全身PET-CTスキャナーで生体内分布がモニターされた。PET-CTによる分子イメージングにより、68ガリウム標識抗HLA-J JULY-mAbおよび抗HLA-G Lilly-mabは筋層非浸潤性膀胱がんを主な標的とし、同時に他の臓器への取り込みが非常に少ないことが判明した。このデータから、抗HLA-J JULY-mAbおよび抗HLA-G LILLY-mAbは全身毒性が低く、有効な抗腫瘍治療となることが示された。
放射線免疫療法では、ルテチウム177で標識した抗HLA-J JULY-mAbと抗HLA-G LILLY-mAbを患者に投与した。静脈内注射は、EAU泌尿器科ガイドライン（Roupret et al, Eur Urol.2018 Jan;73(1):111-122）に従って適応した。すべての患者は、組織学的に筋層非浸潤性膀胱がんであることが証明された。放射線免疫療法の効果は、全身PET-CTスキャナーでモニターされた。再構成は、低線量CTに基づく減衰・散乱補正を含め、メーカーが実装している反復再構成アルゴリズムで行った。定量的な解析のために、ダイナミックリストモードデータを300秒の6枚の画像として再構成した。膀胱と全臓器の固定サイズの関心領域（VOI）において、平均標準化取り込み値（SUV）を測定した。
HLA-JおよびHLA-G陽性の膀胱がんと異なる転移部位が検出され、同時に他の臓器への取り込みが非常に少なかった。また、副作用は認められなかった。ルテチウム-177標識抗HLA-J JULY-mAbおよび抗HLA-G LILLY-mabで得られた取得画像は、ガリウム-68標識抗HLA-J JULY-mAbおよびガリウム-68標識抗HLA-G Lilly-mab抗体を用いて以前に得られた画像と同様であった。治療効果を評価するために、異なる時点でPET-CT画像を撮影した。抗HLA-Jおよび抗HLA-G放射線免疫療法は、腫瘍サイズの縮小や病理学的完全奏効など、患者に奏効を示すことが確認された。また、転移巣の大きさや数も減少した。一部の患者では、適用した放射線免疫療法に対して、転移や腫瘍が全く認められないという病理学的な完全奏効を示した。

Claims (15)

  1. 対象の腫瘍の治療もしくは予防のための医薬、または対象の腫瘍の検出のための診断薬の製造方法であって、
    （Ａ）前記対象から得られた試料中の少なくとも１つの核酸分子および／または少なくとも１つのタンパク質もしくはペプチドの発現を測定することであり、
    少なくとも１つの核酸分子は、
    （ａ） 配列番号１から５のいずれか１つのアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるポリペプチドをコードする核酸分子、
    （ｂ） 配列番号６から１０のいずれか１つのヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる核酸分子、
    （ｃ） （ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、好ましくは少なくとも９０％同一、最も好ましくは少なくとも９５％同一であるポリペプチドをコードする核酸分子；
    （ｄ） （ｂ）のヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一、好ましくは少なくとも９６％同一、最も好ましくは少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列からなる核酸分子、
    （ｅ） （ｄ）の核酸分子に対して縮重したヌクレオチド配列からなる核酸分子、
    （ｆ） （ａ）から（ｅ）のいずれか１つに記載の核酸分子の断片からなる核酸分子であって、前記断片は、少なくとも１５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも３００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも４５０ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも６００ヌクレオチドを含む、核酸分子
    （ｇ） ＴがＵで置換されている、（ａ）から（ｆ）のいずれか１つに記載の核酸分子に対応する核酸分子から選択され；
    少なくとも１つのタンパク質またはペプチドが、（ａ）から（ｇ）のいずれか１つに記載の核酸分子によってコードされるタンパク質またはペプチドから選択される、測定すること；および
    （Ｂ） （Ａ）において少なくとも１つの核酸分子および／または少なくとも１つのタンパク質もしくはペプチドが発現している場合、対象における少なくとも１つの核酸分子および／または少なくとも１つのタンパク質もしくはペプチドの発現を阻害することができる医薬を製造すること、および／または
    （Ｂ’） （Ａ）において少なくとも１つの核酸分子および／または少なくとも１つのタンパク質またはペプチドが発現している場合、対象における少なくとも１つの核酸分子および／または少なくとも１つのタンパク質またはペプチドの発現部位をｉｎ ｖｉｖｏで検出することができる診断薬を作製すること、を含む方法。
  2. 請求項１に記載の方法であって、
    （ｉ） 配列番号６～１０のヌクレオチド配列の少なくとも２つの核酸分子、または請求項１で定義されるそれら由来の核酸分子の発現、
    （ｉｉ） 配列番号１～５のいずれか１つのアミノ酸配列の少なくとも２つのタンパク質、または請求項１で定義されるそれら由来のタンパク質もしくはペプチドの発現、および／または
    （ｉｉｉ） 配列番号６から１０のヌクレオチド配列の少なくとも１つの核酸分子または定義された請求項１に記載のそれら由来の核酸分子、および配列番号１から５のいずれか１つのアミノ酸配列の少なくとも１つのタンパク質またはペプチドまたは請求項１に定義されたそれら由来のタンパク質またはペプチドの発現
    が工程（Ａ）で決定される、方法。
  3. 工程（Ａ）において、さらに、ＨＬＡクラスＩｂ遺伝子ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、及びＨＬＡ－Ｇの少なくとも１つ、及び／又は前記ＭＨＣクラスＩｂ遺伝子から生成される少なくとも１つのタンパク質若しくはペプチドの発現を決定する、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 工程（Ａ）において、ＨＬＡクラスＩ遺伝子ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃの少なくとも１つ、及び／又は前記ＭＨＣクラスＩ遺伝子から生成される少なくとも１つのタンパク質又はペプチドの発現をさらに決定する、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 工程（Ａ）において、ＨＬＡクラスＩＩ遺伝子ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＡ、及びＨＬＡ－ＤＲＢ１の少なくとも１つ、及び／又は前記ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子から生成する少なくとも１つのタンパク質若しくはペプチドの発現をさらに決定する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 工程（Ａ）において、さらに、少なくとも１つの成長因子及び／又は少なくとも１つの腫瘍マーカー及び／又は妊娠初期及びがん胎児性退縮（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）において発現している少なくとも１つのタンパク質の発現を決定する、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 少なくとも１つの成長因子は、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、成長分化因子－９（ＧＤＦ９）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、肝細胞由来増殖因子（ＨＤＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、胎盤成長因子（ＰＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、間質細胞由来因子１（ＳＤＦ１）、トランスフォーミング増殖因子および血管内皮増殖因子からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
  8. 少なくとも１つの腫瘍マーカーが、ソマトスタチン受容体、ＴＳＨ受容体、チロシン受容体、及びＰＳＭＡからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
  9. 請求項１から８のいずれか一項に記載の方法であって、
    （ｉ） 医薬は、少なくとも１つの核酸分子の発現を阻害することができる低分子、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸分子、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ベースの構築物、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１ベースの構築物、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、または転写アクチベーター様（ＴＡＬ）エフェクター（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼであるかまたはこれらを含み、および／または
    （ｉｉ） 医薬は、少なくとも１つのタンパク質またはペプチドを阻害することができる低分子、抗体、タンパク質医薬、またはアプタマーであるかまたはこれらを含み、
    タンパク質医薬は、好ましくは、抗体ミメティックであり、
    抗体ミメティックは、好ましくは、アフィボディ、アドネクチン、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎｓ、アビマー、ナノフィチン、アフィリン、クニッツドメインペプチドおよびＦｙｎｏｍｅｒｓ（登録商標）から選択され、および／または
    （ｉｉｉ） 診断薬は、少なくとも１つの発現核酸分子に結合することができる低分子、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸分子、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ベースの構築物、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１ベースの構築物、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、および転写アクチベーター様（ＴＡＬ）エフェクター（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼであるかまたはこれらを含み、および／または
    （ｉｖ） 診断薬は、少なくとも１つの発現タンパク質またはペプチドに結合することができる低分子、抗体、タンパク質医薬、またはアプタマーであるか、またはこれらを含み、
    タンパク質医薬は、好ましくは、抗体ミメティックであり、
    抗体ミメティックは、好ましくは、アフィボディ、アドネクチン、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎｓ、アビマー、ナノフィチン、アフィリン、クニッツドメインペプチド、およびＦｙｎｏｍｅｒｓ（登録商標）から選択される、方法。
  10. 請求項９に記載の方法であって、
    医薬であるかまたはそれに含まれる低分子、抗体、タンパク質医薬、またはアプタマーは、細胞傷害剤と融合され、ここで、細胞傷害剤は、好ましくは治療用放射性同位元素、より好ましくは １７７Ｌｕ、９０Ｙ、６７Ｃｕおよび２２５Ａｃであり、および／または
    診断薬であるかまたはそれに含まれる低分子、抗体、タンパク質医薬、またはアプタマーは、撮像剤と融合され、撮像剤は、好ましくは治療用放射性同位元素であり、より好ましくは６７Ｇａ、４４Ｓｃ、１１１Ｉｎ、９９ｍＴｃ、５７Ｃｏ、１３１Ｉである、方法。
  11. 対象の腫瘍の治療または予防に使用するための、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法によって製造された医薬。
  12. 対象の腫瘍部位をｉｎ ｖｉｖｏ検出するために使用するための、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法によって製造された診断薬。
  13. 検出が、対象の全身を走査することを含み、走査が、好ましくは全身陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）スキャナーを用いる、請求項１２に記載の使用のための診断薬。
  14. 検出が、対象の腫瘍部位への放射性同位元素の放射線量取り込み量を測定することを含む、請求項１２または１３に記載の使用のための診断薬。
  15. 測定された放射線量取り込み量に基づいて、治療的有効量の医薬が決定されるべきであり、ここで医薬は、好ましくは請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法によって製造される、請求項１４に記載の使用のための診断薬。
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