KR20100012056A - 고정 표본에서 긴 단편 ｒｎａ를 분리하는 방법 - Google Patents

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KR20100012056A
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캐슬린 데이넨버그
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리스판스 지네틱스, 인크.
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Abstract

본 발명은 고정 조직 표본으로부터 긴 단편 RNA의 추출 방법에 관한 것이다. 특히 본 발명은 올리고뉴클레오타이드 혼성화를 기반으로 한 분석을 포함한 생물학적 응용에 사용하기 위한 포르말린-고정 파라핀-포매 조직 표본으로부터 RNA 추출 방법에 관한 것이다.

Description

고정 표본에서 긴 단편 ＲＮＡ를 분리하는 방법{Methods for isolating long fragment RNA from fixed samples}
본 출원은 본원에 그 전체가 참고문헌으로 포함된 2007년 6월 22일 제출된 가출원번호 60/945,785의 우선권을 청구한다.
본 발명은 고정 조직 표본에서 고수율 및 고품질(긴 단편) RNA를 추출 및 분리하는 분야에 관한 것이다. 본 발명은 고정 또는 고정 및 파라핀 포매 조직 내에서 암 생물표지(biomarker)와 같은 유전자에 대해 유전자 발현 수치를 평가하는 방법을 제공하기 위해 이들 신규한 추출 방법의 이용에 관한 것이다. 또한 본 발명은 환자 종양 세포에서 특정 생물표지의 mRNA 수치를 측정하고 이를 예정된 역치 발현 수치와 비교함으로서 화학요법 기반 요법을 결정하는 방법을 제공한다.
RNA 종의 정량적 측정은 현대 분자생물학 연구에서 추구하는 중심이다. 또한 RNA 종은 예를 들어 진행성 및 비-진행성 종양과 같은 다양한 다른 조직 형태에 특성을 부여하기 위해 유전자 발현 프로파일의 준비시 매우 중요한 임상적 의미를 지닌다. 매우 민감한 형광-기반 실시간 RT-PCR 절차 및 다른 혼성화-의존적 방법의 개발을 포함한 최근 기술 진보는 환자 생검 표본에서 수득된 바와 같은 매우 적은 양의 mRNA의 신속하고 특정한 정량을 수행 가능하게 한다. 특히 RNA 정량의 임상적 연구로의 응용시, 대부분의 정량 방법에서 최적 결과에 대한 충분한 품질의 RNA의 수득시 문제가 발생한다.
메신저 RNA(mRNA)는 신선/동결 조직에서 상당히 안정적이고, 또한 주로 완전한 형태로 분리되는 것이 매우 용이하다. 그러나 신선-동결 조직 표본을 채취하도록 특별한 노력이 이루어진 일부 연구를 제외하고 환자에서 채취된 생검 조직 표본은 일반적으로 포르말린 고정되고 파라핀 포매된다. 이는 대부분의 임상적 시험 참가자뿐만 아니라 병원에서 통상적으로 치료받는 환자 유래의 조직 표본의 경우가 그렇다. 포르말린 고정 및 파라핀 포매(FFPE)가 대부분 일반적으로 사용되는 방법인 첫 번째 이유는 조직의 병리학적 조사를 촉진시키기 위함이다. 분자조직병리학적 상관관계가 어렵고 현미-해부된 종양 또는 다른 조직의 정제가 더욱 어렵기 때문에 저온 유지 장치-절단된 신선-동결 조직의 형태학적 조사가 차선책이다. 이에 반해 조직 표본의 포르말린-고정 및 파라핀-포매는 형태를 보존시키고 병리학적 조사를 더욱 용이하게 한다. FFPE가 널리 사용되는 두 번째 이유는 신선-동결 조직 표본을 보관하기 어렵고 비용 부담이다. 진단 분석 및 분자적 분석을 위해 충분한 조직 표본의 수득 및 확보에 관련된 병참학적 문제는 능가할 수 없는 것으로 판단된다. 그 결과 광범위한 유전자 분석에 적당한 충분한 동결 조직 표본을 포함하거나 충분한 장기간 환자 추적 및 결과 데이터를 지닌 세계적인 조직 은행이 거의 존재하지 않는다. 한편 FFPE 조직은 현재 병리학적 실시의 기초로 존재한다. 장기간 추적을 지닌 보관용 FFPE 조직은 용이하게 이용 가능하고 임상학적 및 연구자 모두에게 용이하게 접근 가능하고 이는 임상 셋팅시 조사를 위한 유전자 물질의 광대한 공급원을 나타낸다.
조직 형태를 우수하게 보존하나 불행하게도 포르말린 고정 과정은 조직 내 RNA에 대해 유해한 결과를 지닌다. RNA 분자는 단편화되고 즉 작은 조각으로 분열될 뿐만 아니라 포르말린에 의해 교차-결합된다. 이들 과정 모두는 유전자 발현 프로파일의 생성과 같은 RNA 정량 진행시 FFPE 표본 유래 RNA 이용의 어려움을 크게 증가시킨다. 짧은 길이 RNA는 정량적 실시간 RT-PCR을 위한 최적 프라이머-프로브를 수득하는 것을 더욱 어렵게 하고 교차-결합은 분리된 RNA 물질의 성공적인 증폭을 수행하기 위해 필수적인 RNA 또는 DNA의 신규 스트랜드를 합성하는 RNA 또는 DNA 중합효소 효소의 전진을 방지한다. 또한 FFPE 조직 유래의 무작위-단편화 RNA의 이용은 신선-동결 조직과 비교시 증폭된 RNA 수율을 현격히 감소시키고, 작은 단편 길이는 특히 후속 혼성화 단계의 효율 및 특이성을 감소시킨다. 혼성화의 특이성은 PCR시 잘못된 양성 결과 및 높은 배경 증폭을 방지하는데 매우 중요하다. 이러한 이유로 FFPE 조직에서 최고 수율이 가능한 최고 품질의 RNA를 분리하는 방법을 개발하는 것이 중요하다.
FFPE 조직으로부터 완전한 고분자량(긴 단편) RNA의 추출은 어렵고 모순된 과정이다. 표본에서 RNA를 추출하는 다양한 기술은 당분야에 알려져 있다. 이들 추출 기술은 다양한 성공으로 시험되었다. 일부 연구는 보관 FFPE 조직으로부터 DNA 및 RNA 추출을 최적화하는 신규한 방법을 제공한 바 있고, 다른 연구는 정량적 RT-PCR 분석시 고정 지속 효과를 조사하였다(연구자들이 일반적으로 대조군을 지니지 않은 인자). 현재 연구는 성공적으로 PCR 수행될 수 있는 FFPE에서 RNA를 추출 가능함을 나타내었으나 추출된 RNA의 분리 수율 및 품질(길이)의 일관성에 문제점이 존재한다. 200개 뉴클레오타이드(nt)보다 긴 추출 RNA의 단편을 증폭하고자 하는 시도는 일반적으로 성공하지 못했고 60 내지 120개 nt 범위의 단편의 증폭만이 어느 정도 성공으로 달성되었다. 현재 추출 방법의 대부분의 연구의 중점은 FFPE 조직에서 최대 수율의 RNA 수득에 집중되어 있고 고품질의 추출 RNA를 수득하는 방법, 즉 추출 과정 동안 추가 분해를 방지함으로서 RNA 단편 길이를 보존시키는 방법을 발견하는 것은 반드시 필요하지 않았다. 이들 2가지 목표는 항상 양립 가능한 것은 아니다: 최대 수율의 RNA 수득은 RNA 길이의 추가 분해 조건을 필요로 하고, 이는 더 많으나 짧은 길이의 RNA를 유발한다.
덜 인식되고 대부분의 종전 연구에서 일반적으로 제기되지 않은 또다른 요인은 RNA 제제의 DNA 오염이다. DNA가 RNA보다 더욱 안정한 분자이기 때문에 FFPE 추출은 종종 RNA보다 더 많은 DNA를 포함한다. RNA 및 DNA는 매우 화학적으로 유사한 분자이고 DNA의 염기 서열은 RNA 내에서 복제된다. 따라서 혼성화 기술을 수반하는 RNA 분석시 DNA가 혼성화 사이트로의 결합에 대해 RNA 분자와 경쟁하기 때문에 많은 양의 DNA 오염은 거짓된 결과를 유발할 수 있다. 예를 들어 PCR 동안 프라이머 및 프로브는 RNA로부터 생성된 cDNA뿐만 아니라 오염 DNA에 결합하여 증폭시킬 수 있다. RT-PCR를 위한 RNA 분리시 DNA의 존재는 소위 RNA 특이적 프라이머, 즉 인트론-엑손 접합부를 교차하여 대응 유전자 DNA 내 대응 유전자 서열을 증폭하지 않는 프라이머를 이용함으로서 처리된다. 그러나 RNA 특이적 프로브를 이용하여도 DNA 내 가-유전자(pseudo-gene)가 증폭될 수 있다. 표본 제제 내 분명한 DNA 부재의 하나의 이익은 RT-PCR 수행시 RNA-특이적 프라이머에 한정되고, 따라서 프라이머 결합 사이트의 선택이 크게 증가된다는 점이다.
따라서 용인되는 낮은 DNA 동시-분리/오염으로 고수율로 고품질(긴 단편) RNA를 분리하는 방법이 요구된다. 본 발명은 이러한 요구를 만족시킨다.
암 조직 내 다양한 생물표지의 발현 수치를 측정하기 위한 RNA 분리는 특정 이상의 진단시 또는 적당한 요법 방향을 결정에 대해 의사를 원조하는데 유용할 수 있다. 예를 들어 암 진단에 유용할 뿐만 아니라 특정 화학요법이 질병 치료에 유익한지 여부를 예측하는데 유용한 생물표지가 확인되었다. 많은 질병 생물표지가 알려져 있고, 예를 들어 일부 명명된 암 생물지표 ERCCl, TS, DPD, Her2-neu, EGFR, GST-pi, k-ras 및 RRMl을 포함한다.
더욱이 본원에 개시된 RNA 분리 방법은 어떠한 FFPE 조직으로부터도 긴 단편 RNA를 분리하는데 이용될 수 있다. 일반적으로 FFPE 조직은 어떠한 암 유래의 종양 생검로부터 유래될 것이다.
ERCC1
절제 복구 상호-보상(ERCC1) 유전자는 DNA 부가물의 복구에 필수적이다. 인간의 ERCC1 유전자는 클로닝되었다(Westerveld et al., Nature(런던) 310:425-428 (1984); Tanaka et al., Nature 348:73-76 (1990)). 이러한 유전자에 결함이 있는 돌연변이 인간 및 햄스터 세포주를 사용한 여러 연구는 ERCC1에 의해 암호화된 생성물이 백금-DNA 부가물의 절제 복구에 관여함을 나타낸다(Dabholkar et al., J. Natl. Cancer Inst. 84:1512-1517 (1992); Dijt et al., Cancer Res. 48:6058-6062 (1988); Hansson et al., Nucleic Acids Res. 18: 35-40(1990)).
DNA-복구 결손 CHO 세포 내로 트랜스펙트시 ERCC1은 백금-DNA 부가물을 복구하는 능력과 함께 시스플라틴에 대한 세포 내성을 부여한다(Hansson et al., Nucleic Acids Res. 18: 35-40(1990)). 현재 용인되는 절제 복구의 모델은 손상 인식/절제 단계가 절제 복구 과정에서 속도 결정 단계임을 시사한다.
백금-기반 요법을 받은 암 환자 유래의 악성 세포 내 ERCC1과 같은 절제 복구 유전자의 상대 발현 수치가 검사되었다(Dabholkar et al., J. Natl. Cancer Inst. 84:1512-1517 (1992)). 시스플라틴(DDP)/플루오로우라실의 화학요법으로 치료시 위암 환자의 ERCC1 과-발현은 종양 반응 및 궁극적인 생존율에 부정적인 영향을 미치는 것으로 보고되었다(Metzger et al., J Clin Oncol 16:309, 1998). 최근의 증거는 젬시타빈(Gem)이 ERCC1 뉴클레오타이드 절제 복구(NER) 활성을 조절할 수 있음을 나타낸다. 따라서 ERCC1의 종양내 발현 수치는 DDP 및 GEM이 암 환자에게 효과적인 화학요법제가 될 것인지 여부를 결정하는 주요한 예후 인자가 될 수 있다.
GST-pi
글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST)계 단백질은 세포 독성 약물의 해독에 관여한다. 글루타티온으로 독성 및 발암성 친전자성 분자의 접합을 촉매함으로서 상기 GST 효소는 세포 거대분자를 손상으로부터 보호한다(Boyer et al., Preparation, characterization and properties of glutathione S-transferases. In: Zakim D, Vessey D (eds.) Biochemical Pharmacology and Toxicology. New York, NY: John Wiley and Sons, 1985). 이들 단백질의 특정 이성형 글루타티온 S-트랜스퍼라제 Pi(GST-pi, 또한, 본원에서 GSTP1 또는 GST-π로 상호 교환 가능하게 표기됨)는 인간 상피 조직에서 널리 발현되고 일부 종양에서 과발현되는 것으로 입증되었다(Terrier et al., Am J Pathol 1990; 137:845-853; Moscow et al., Cancer Res 1989; 49: 1422-1428). 정확한 메커니즘은 불명확하나 증가된 GST-pi 수치가 약물 내성 종양에서 발견되었다(Tsuchida et al., Crit Rev Biochem Mol Biol 1992; 27: 337-384). 종전의 연구는 GST 단백질(mRNA가 아님)의 저발현은 백금-기반 화학요법에 대한 응답과 관련됨을 나타낸다(Nishimura et al., Cancer. Clin Cancer Res 1996;2:1859-1865; Tominaga, et al., Am. J. Gastro. 94:1664-1668, 1999; Kase, et al., Acta Cytologia. 42:1397-1402, 1998). 그러나 이들 연구는 단백질 수치를 측정하기 위해 정량적 유전자 발현을 측정하지 않고 반-정량적인 면역 조직 화학적 염색법을 이용하였다. 그러나 정량적 GST-pi 유전자 발현 측정은 매우 효과적인 예후를 달성하는데 필요하다.
Her2 neu/EGFR
폐암은 서방 국가에서 남성과 여성 모두에서 암-관련 사망의 주된 원인이 되고 있다. 미국에서는 약 171,000건의 새로운 폐암 증례가 진단되었고, 160,000명의 환자가 매년 이러한 질환으로 인해 사망한다. 지난 20여 년간 폐암에 대한 검출 및 치료의 발전에도 불구하고 총 5년의 생존자는 15% 이하이다(Ginsberg, et al., In: DeVita, et al., Cancer : Principles in Practice of Oncology, Ed. 5, pp. 858-910. Philadelphia: Lipincott-Raven Publishers, 1997). 비-소세포 폐암종 (NSCLC) 환자의 생존율을 더욱 향상시키기 위해 분자 변경을 기반으로 한 예후 분류가 중요하다. 이러한 분류는 더욱 정확하고 유용한 예후 도구 및 결국 효과적인 치료법 선택을 제공하게 된다.
수용체 티로신 키나제(RTK)는 분열촉진 신호의 형질도입에서 중요하다. RTK는 표피 성장 인자(EGF)와 같은 성장 인자에 대한 세포외 리간드 결합 도메인 및 세포질 단백질상의 티로신 아미노산 잔기를 인산화하는 키나제로서 작용하는 세포내 부분을 포함하여 세포 증식을 매개하는 거대한 막에 걸쳐 있는 단백질이다. 다양한 분류의 수용체 티로신 키나제는 상이한 수용체 티로신 키나제에 결합하는 성장 인자의 계열에 기초하는 것으로 알려져 있다(Wilks, Advances in Cancer Research, 1993,60,43-73).
수용체 티로신 키나제의 EGF-R 패밀리와 같은 분류 Ⅰ 키나제는 EGF, HER2-neu, erbB, Xmrk, DER 및 let23 수용체를 포함한다. 이들 수용체는 유방암(Sainsbury et al., Brit. J. Cancer, 1988, 58,458; Guerin et al., Oncogene Res., 1988, 3, 21), 폐의 편평 세포암(Hendler et al., Cancer Cells, 1989, 7,347), 방광암(Neal et al., Lancet, 1985,366), 식도암(Mukaida et al, Cancer, 1991,68,142), 결장암, 직장암 또는 위암과 같은 위장관암(Bolen et al., Oncogene Res., 1987, 1, 149), 백혈병(Konaka et al., Cell, 1984,37,1035) 및 난소암, 기관지암 또는 췌장암(유럽 특허 명세서 제0,400,586호)과 같은 일반적인 인간 암에 빈번하게 존재한다.
특히 EGFR 티로신 키나제 활성은 정상 세포에서 거의 검출되지 않는 반면, 악성 세포에서는 더욱 빈번하게 검출된다(Hunter, Cell, 1987,50, 823). 최근 EGFR은 뇌, 폐 편평 세포, 방광, 위, 유방, 두경부, 식도, 부인과 및 갑상선 종양과 같은 다수의 인간 암에서 과발현되는 것으로 보고되었다(W J Gullick, Brit. Med. Bull., 1991, 47, 87). 또한 수용체 티로신 키나제는 건선과 같은 다른 세포-증식 질환에서 중요하다. EGFR 질환은 정상적으로 EGFR을 발현하지 않는 세포에 의한 EGFR 발현 또는 원치 않는 세포 증식 및/또는 부적절한 EGFR 수치의 존재를 야기하는 증가된 EGFR 활성화를 특징으로 한다. EGFR은 형질전환 성장 인자-α(TGF-a) 뿐 아니라 리간드 EGF에 의하여 활성화되는 것으로 알려졌다.
또한 HER2-neu 단백질도 분류 Ⅰ 수용체 티로신 키나제(RTK) 패밀리의 일원이다(Yarden and Ullrich, Annu. Rev. Biochem. 57: 443, 1988; Ullrich and Schlessinger, Cell 61: 203, 1990). HER2-neu 단백질은 구조적으로 EGFR과 관련된다(Caraway, et al., Cell 78 : 5, 1994; Caraway, et al., J. Biol. Chem. 269: 14303, 1994). 이들 수용체는 공통의 분자 구조를 공유하고 그의 세포질 도메인 내에 2개의 시스테인-풍부 부위를 포함하며 그의 세포질 도메인 내에 효소 영역과 구조적으로 관련된다.
HER2-neu 단백질의 리간드-의존성 활성화는 p165(HER2-neu)에 직접 결합하고 효소 활성을 자극할 수 있는 신경활성 인자(NAF)에 의해 매개되는 것으로 간주된다(Dougall et al., Oncogene 9: 2109, 1994; Samata et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 1711, 1994). HER2-neu 단백질의 리간드-독립성 호모이량체화 및 결과적인 수용체 활성화는 HER2-neu 단백질의 과발현에 의해 촉진된다. 활성화된 HER2-neu 복합체는 포스포키나제로서 작용하고 다른 세포질 단백질을 인산화시킨다. HER2-neu 질환은 HER2-neu 발현의 부적절한 활성 또는 과활성을 특징으로 하고 암과 같은 원치 않는 세포 증식을 야기하게 되는 증가된 HER2-neu 발현을 지닌다.
수용체 티로신 키나제 EGFR 및 HER2-neu의 저해제는 포유류 암세포 성장의 선택적 저해제로서 사용된다(Yaish et al. Science, 1988, 242,933). 예를 들어 EGF 수용체 티로신 키나제 저해제인 에르브스타틴은 무흉선 누드 마우스에 주사된 인간 유방 암종 세포를 발현하는 EGFR의 성장을 감소시키나 EGFR을 발현하지 않는 종양의 성장에는 아무런 영향을 미치지 않는다(Toi et al., Eur. J. Cancer Clin. Oncol., 1990, 26, 722). 또한 다양한 스티렌 유도체도 티로신 키나제 억제 특성을 지니고(유럽 특허 출원 제0211363호, 제0304493호 및 제0322738호), 항-종양제로서 사용될 수 있는 것으로 규명되었다. 이들 2종의 스티렌 유도체는 누드 마우스에 주사된 인간 편평 세포 암종의 성장을 약화시킴으로써 그 유효성이 입증된 분류 Ⅰ RTK 저해제이다(Yoneda et al., Cancer Research, 1991, 51, 4430). 또한 유럽 특허 출원 제0520722호 및 제0566226호에는 특정 4-아닐리노퀴나졸린 유도체가 수용체 티로신 키나제의 저해제로 유용한 것으로 알려져 있다. 이들 화합물에 의해 나타난 매우 밀접한 구조-활성 관련성은 퀴나졸린 고리가 아데닌 포켓 내에 결합되고 아닐리노 고리는 인접한 특정 친지질성 포켓 내에 결합되는 명백하게-한정된 결합 모드를 나타낸다. 3종의 4-아닐리노퀴나졸린 유사체(2종의 가역적 저해제 및 1종의 비가역적 저해제)는 항암 약물로서 임상적으로 평가되었다(Denny, Farmaco 2001 Jan-Feb; 56 (1-2) : 51-6). 최근 미국 식약청은 HER2-neu 과발현 전이성 유방암의 치료를 위한 단일클론 항체 트라스타주마브(trastazumab)(Herceptin 등록상표)의 사용을 승인하였다(Scheurle, et al., Anticancer Res 20: 2091-2096, 2000).
종양에 대한 유효한 화학요법은 종종 제제의 조합을 요하기 때문에 각각의 단일 약품에 대한 내성 또는 감도의 결정 인자의 식별 및 정량화가 각각의 조합 화학요법을 디자인하는데 있어서 중요한 수단이 되고 있다. 암 환자로 유래의 악성 세포 내의 EGFR 및/또는 HER2-neu의 상대 발현 수치와 생존율과의 확실한 상관성을 얻고자 하는 연구가 있기는 하였으나 성공을 거두지 못하였다.
EGFR 및 NSCLC에서의 예후 중요성은 현재까지 논란을 일으키고 있다. 결합 분석을 이용한 연구는 증가된 EGFR 발현을 진행된 단계의 NSCLC 및 단축된 총 생존과 상호관련시킨 반면 EGFR mRNA 또는 단백질 발현을 측정하기 위한 반-정량적 기법을 이용한 연구는 임상적 성과와의 일관된 상관성을 나타내지 못하였다(Veale et al., Br. J. Caner 68 : 162-165, 1993 ; Fujino et al., Eur. Cancer 32: 2070-2074, 1996; Rusch, et al., Cancer Res 53 : 2379-2385, 1993; Pfeiffer, et al., Br J Cancer 74 : 86-91, 1996; Pastorino, et al., J Clin Oncol 15 : 2858-2865, 1997). 면역조직화학적 방법을 이용한 NSCLC 종양 내 EGFR 발현의 연구는 NSCLC 종양에서 32∼47%의 EGFR 과발현에 대한 빈도를 나타내었다(Veale et al., Br. J. Caner 55: 513-516, 1987; Veale et al., Br. J. Caner 68: 162-165, 1993; Fujino et al., Eur, Cancer 32: 2070-2074, 1996; Rusch, et al., Cancer Res 53: 2379-2385, 1993; Pastorino et al., J. Clin. Onc. 15: 2858-2865, 1997, Tateishi, et al., Eur J Cancer 27 : 1372-75, 1991; Rachwal, et al., Br J Cancer 72: 56-64, 1995; Rusch, et al., Cancer Res 15 : 2379-85, 1993; Pfeffer, et al., Br J Cancer 78 : 96-9, 1998; Ohsaki, et al., Oncol Rep 7: 603-7, 2000). 더욱이 AC 및 LC와 비교시 SCC에서의 일반적으로 높은 EGFR 발현을 지니는 조직학적 서브타입 간에 EGFR 발현의 유의적인 차이가 보고되고 있다.(Fujino et al., Eur. Cancer 32: 2070-2074, 1996; Veale et al., Br. J. Caner 55: 513-516, 1987; Pastorino et al., J. Clin. Onc. 15: 2858-2865, 1997; Pfeiffer, et al., Br J Cancer 78 : 96-9, 1998; Ohsaki et al., Oncol. Rep. & : 603-7, 2000). 그러나 이들 연구는 EGFR 과발현과 폐암 환자 생존간의 일관된 상관성이 존재하지 않는 것으로 보고되었다.
EGFR 과발현과 환자 생존의 감소간의 의미 있는 상관성의 관찰이 일부 비결정적 연구에서 이루어졌다(Veale et al., 1987 ; Ohsaki et al., 2000). 그러나 Veale et al.은 단지 19명의 NSCLC 환자만의 모집단을 분석하였다. Ohsaki et al.는 EGFR 단백질 발현을 p53 과발현을 지닌 NSCLC 환자에서의 불충분한 예후와 상호 관련시켰다(P=0.024).
EGFR과 관련하여 HER2-neu 및 NSCLC의 예후적 중요성은 현재까지 여전히 논란이 일고 있다. 편평 세포 암종, 선암종 및 대세포 암종을 포함한 NSCLC에서 HER2-neu 단백질 과발현이 입증되었다(Veale et al., 1987; Schneider, et al., Cancer Res 49 : 4968-4971, 1989; Kern et al., Cancer Res. 50: 5184-5191,1990; Weiner, et al., Cancer Res 50: 421-425, 1990; Scheurle, et al., Anticancer Res. 20: 2091-2096, 2000). 단백질 분석을 이용한 초기의 연구는 폐 선암종(AC)에서의 HER2-neu 단백질 과발현과 불충분한 전체 생존율간의 관련성을 보고하였다(Kern, et al., Cancer Res 50 : 5184-5191,1990; Kem et al., J Clin Invest 93 : 516-20, 1994). 그러나 반박하는 연구는 폐 선암종(AC)에서의 HER2-neu 단백질 과발현과 불충분한 전체 생존율간의 상관성이 존재하지 않는 것으로 보고하였다(Pfeiffer et al., Br. J. Cancer 74: 86-91,1996).
또다른 중요한 논점은 암의 예후자로서 HER2-neu 및 EGFR 공통-과발현간의 상호관계를 평가하는 것이다. Tateishi et al., Eur. J. Cancer 27: 1372-75,1991에서는 분석된 AC의 13%에서 EGFR 및 HER2-neu 단백질 공통-발현을 측정하였고, 이들 2개의 유전자의 공통-과발현은 불충분한 5년의 생존과 상호관련됨을 발견하였다. 그러나 HER2-neu 과발현 단독의 경우 폐의 편평 세포 암종(SCC) 및 대세포 암종(LCC)에서의 HER2-neu 및 EGFR 공통-발현과 생존간의 관련성은 보고되지 않았다.
EGFR 및 HER2-neu 발현 수치의 측정을 위한 일관성이 없는 방법은 이들 유전자의 발현이 암 환자 생존율을 예측하는 데 어느 정도 사용될 수 있는지를 결정하는데 있어서의 문제의 근원이 되고 있다. 지금까지 NSCLC 내의 HER2-neu 및 EGFR 발현 조사는 EGFR 및 HER2-neu 발현 모두에 대한 양성 등급의 NSCLC 종양 빈도의 큰 편차를 야기하였다. 선암종(AC)에서 양성 단백질 염색으로 정의되는 HER2-neu의 과발현은 광학 현미경 슬라이드 상에서의 파라핀 포매된 조직 및 HER2-neu 항혈청을 사용하여 2-45% 대세포 암종(LC) 및 0-20% 편평 세포 암종(SCC)에서 13-80%로 보고되었다(Pfeiffer et al., 1996 ; Kern et al., 1990; Kern et al., 1994; Tateishi et al., 1991; Shi, et al., Mol Carcing 5 : 213-8, 1992; Bongiorno, et al., J Thorac Cardiovasc Surg 107 : 590-5, 1994; Harpole, et al., Clin Cancer Res 1 : 659-64, 1995; Volm et al., Anticancer Res 12 : 11-20, 1992). 더욱이 최근의 보고는 HER2-neu 발현 수치를 평가하기 위하여 디자인된 현행 프로토콜의 비특이성을 나타내고 있다. 침습성 유방암에서 HER2-neu 발현의 측정을 위한 HercepTest(등록상표)는 매우 높은 의사 양성을 지니는 것으로 나타났다(Jacobs et al., J Clin Oncol 17 : 1983-1987,1999).
EGFR 및 HER2-neu의 발현 수치를 측정하기 위한 정확하고, 정밀하고 일관된 방법이 존재할 경우 어떠한 발현 수치가 환자의 생존율과 상호관련되는지 및 수용체 티로신 키나제 표적화된 화학요법이 적절한지 여부를 확인할 수 있다. 표준화된 방법을 이용한 NSCLC 내의 EGFR 및/또는 HER2-neu 과발현의 일관된 입증은 이들 수용체를 과발현하는 암을 치료하기 위해 현재 그리고 미래의 수용체 티로신 키나제 표적화된 화학요법에 대한 임상 시험, 예를 들어 화학요법제, 항체-기반 약물을 설정하는데 있어서 바람직하다.
DPD
5-플루오로우라실(5-FU)은 위장관암 및 유방암과 같은 대부분의 암을 포함한 다수의 상이한 유형의 암의 치료를 위해 매우 광범위하게 사용되는 약제이다(Moertel, C.G. New Engl. J. Med., 330: 1136-1142 (1994)). 40년 이상 동안 대장임에 대한 최선의 치료 표준은 5-FU 단독 사용이었으나, 이는 5-FU 및 CPT-11을 병용하는 "표준 치료법(standard of care)"으로 대체되었다(Saltz et al., Irinotecan Study Group. New England Journal of Medicine. 343: 905-14 (2000)). 최근 5-FU와 옥살리플라틴의 병용은 대장암에서 높은 반응속도를 생성하였다(Raymond et al., Semin. Oncol., 25: 4-12 (1998)). 따라서 5-FU가 현재 사용되는 화학요법의 중심에 있기 때문에 5-FU는 다년간 암 치료에 사용될 것으로 판단된다. 더욱이 단일 약제 5-FU 요법은 CPT-11 또는 옥살리플라틴과의 병행 요법이 과도하게 독성을 나타낼 것으로 판단되는 환자를 위해 계속 사용될 것이다.
5-FU는 단지 소수의 환자들만이 상기 요법에 대한 적당한 반응을 경험하는 대부분의 항암제의 전형이다. 대형의 무작위 임상 시험은 전이성 대장암 환자에 대한 단일 약제로서 5-FU에 대한 종양의 전체 적인 반응 속도는 15-20% 범위임을 나타내었다(Moertel, C.G. New Engl. J. Med., 330: 1136-1142 (1994)). 상기 다른 화학요법제와 병용시 5-FU-기반 치료법에 대한 종양 반응 속도는 약 40%로 증가되었다. 그럼에도 불구하고 치료받은 대부분의 환자는 5-FU를 기반으로 한 화학요법을 수행한 환자에 비해 확인할 수 있는 잇점을 도출하지 않았고 상당한 위험, 불편 및 비용을 초래했다. 치료 이전에 개체의 종양의 반응성을 예상할 수 있는 신뢰할 만한 수단이 존재하지 않기 때문에 표준 임상 실무는 모든 환자에게 5-FU-기반 치료를 수행하게 하고, 대다수의 환자들은 만족스럽지 않은 결과로 고통받고 있다는 것이 충분히 인식되고 있다.
5-FU의 작용 메카니즘 및 대사 경로는 수년간에 걸쳐 광범위하게 연구되어 상기 약제의 항종양 활성의 가장 중요한 생화학적 결정 인자를 확인하게 되었다. 궁극적인 목표는: a) 그의 세포내 대사 및 생화학의 조절하고; b) 환자가 상기 약제에 반응할 것인지(또는 반응하지 않을 것인지)를 예측하기 위해 치료 이전에 환자의 종양 내의 반응 결정 인자를 측정함으로써 함으로써 5-FU의 임상적 효능을 개선시키는 것이었다. 2가지 주 결정 인자는 이들 연구로부터 도출되었다: 1) 5-FU의 표적 효소인 티미딜레이트 신타제(TS)의 확인 및 2) 5-FU 이화 효소인 디히드로피리미딘 데히드로게나제(DPD)의 확인.
5-FU 기반 요법에 대한 종양 반응 예측 분야에서 첫 번째 연구는 대장암 내 표적 효소 TS에 집중되었다. Leichman et al(Leichman et al., J. Clin. Oncol. 15: 3233-3229 (1997))은 대장암 유래의 전처리 생검의 RT-PCR에 의해 측정된 바와 같이 5-FU에 대한 종양 반응과 TS 유전자 발현을 상호관련시키는 예정 임상 시험을 수행하였다. 이러한 연구는: 1) 이들 종양 중에서 50-배 범위의 큰 TS 유전자 발현 수치; 및 2) 반응성 및 무반응성 종양 사이의 TS 유전자 발현의 현저히 상이한 수치를 나타내었다. 반응군의 TS 수치 범위(내부 대조군 대비 0.5-4.1 x 10-3)는 무반응군의 TS 레벨 범위(내부 대조군 대비 1.6-23.0 x 10-3) 보다 더 협소하였다. 연구자들은 단지 무반응자들만이 존재한 상기 TS 발현의 결과적인 "무반응 컷오프(cut-off)" 역치 수치를 측정하였다. 따라서 상기 "무반응 컷오프"를 상회하는 TS 발현 수치를 지니는 환자는 치료 이전에 무반응자로서 양성으로 확인될 수 있다. "무반응" 분류는 <50% 종양 수축, >25% 종양 증가를 초래하는 진행성 성장 및 <50% 수축, 무변화 또는 <25% 증가를 지닌 비-진행성 종양을 지닌 모든 치료 반응을 포함한다. 이들 종양은 최대 TS 수치를 지닌다. 따라서 높은 TS 발현은 특히 내성 종양을 확인시켜 준다. 특정 역치 이상의 TS 발현 수치는 5-FU에 반응하지 않는 종양의 서브세트를 확인시켜 주는 반면 이들 수치 이하의 TS 발현 수치는 현저히 더 높은 반응 속도가 예측하게 하나 반응 종양을 특이적으로 확인시키는 것은 아니다.
후속 연구는 TS 발현 수치와 함께 5-FU 치료에 대한 종양 반응 결정 인자로서 DPD 발현 수치의 유용성을 조사하였다. DPD는 5-FU의 5,6 이중 결합을 환원하는 이화 효소이며, 세포독성제로서 5-FU를 불활성화시키게 된다. 종전 연구는 정상 조직 내의 DPD 수치가 5-FU의 생체이용율에 영향을 미쳐 그의 약동학과 항-종양 활성을 조절할 수 있음을 나타내었다(Harris et al., Cancer Res., 50: 197-201 (1990)). 또한 종양 내 DPD 수치는 5-FU에 대한 감도와 관련되어 있다는 증거도 제시되었다(Etienne et al., J. Clin. Oncol. 13: 1663-1670 (1995); Beck et al., Eur. J. Cancer 30: 1517-1522 (1994)). Salonga et al(Clin Cancer Res., 6:1322-1327 (2000))은 TS 발현이 이미 측정된 한 세트의 종양에서 5-FU/루코보린 치료에 대한 종양 반응 결정 인자로서 DPD의 유전자 발현을 조사하였다. TS와 같이 반응 종양 간의 DPD 발현의 범위(0.6-2.5 x 10-3, 내부 대조군 대비 4.2-배)는 무반응 종양의 범위(0.2 - 16 x 10-3, 내부 대조군 대비 80-배)에 비해 매우 협소하였다. 약 2.5 x 10-3의 역치 수치 이상의 DPD 발현을 지닌 반응 종양은 존재하지 않았다. 더욱이 DPD 및 TS 발현 수치는 서로 상관관계가 존재하지 않는 것으로 나타났고, 이는 이들이 독립적으로 조절되는 유전자임을 나타낸다. 그들 각각의 "무반응 컷오프" 역치 수치 이하의 TS 및 DPD 발현 수치를 지닌 종양군 중에서 92%가 5-FU/LV에 반응하였다. 따라서, 반응 종양은 DPD 및 TS의 저 발현 레벨을 기초로 확인될 수 있다.
또한 DPD는 5-FU 독성에 대한 중요한 마커이다. 5-FU을 기반으로 한 치료를 받고 있는 매우 낮은 DPD 수치를 지닌 환자(예를 들어 DPD 결핍 증후군; 즉, 티민 우라실우리아)는 생명에 위협이 되는 독성으로 고통받고 있는 것으로 관찰되었다(Lyss et al., Cancer Invest, 11: 2390240 (1993)). 실제로 5-FU 치료시 DPD 수치의 중요성은 일본에서 5-FU와 항바이러스 화합물인 소리부딘 사이의 부적당한 약제 상호작용으로 인한 19명의 사망 발생에 의해 극적으로 예시되었다(Diasio et al., Br. J. Clin. Pharmacol. 46, 1-4 (1998)). 소리부딘의 대사산물은 DPD의 강력한 저해제인 것으로 추후 밝혀졌다. 이러한 치료는 환자에 대한 5-FU의 독성을 증가시키는 DPD의 DPD 결핍 증후군-유사 감소 수치를 초래하였다(Diasio et al., Br. J. Clin. Pharmacol. 46, 1-4 (1998)).
따라서 a) 암 치료시 5-FU 프로토콜의 광범위한 이용; b) 5-FU에 대한 종양 반응을 예측시 DPD 발현의 중요한 역할; 및 c) 통상의 5-FU을 기반으로 한 치료에 대한 DPD-결핍 증후군을 지닌 환자의 감도로 인해 화학요법 이전에 DPD 발현 수치의 정확한 측정이 암 환자에게 중요한 잇점을 제공할 것임이 명백하다.
DPD 효소 활성의 측정은 활성 효소를 포함하는 상당량의 신선한 조직을 필요로 한다. 불행하게도 대부분의 전처리 종양 생검은 활성 효소를 지니지 않는 고정 파라핀 포매(FPE) 조직, 특히 포르말린-고정 파라핀 포매 조직으로만 이용 가능하다. 더욱이 생검은 일반적으로 매우 소량의 이질성 조직만을 포함한다.
RT-PCR 프라이머 및 프로브 서열은 동결 조직 또는 신선 조직 내에서 DPD 발현을 분석하는데 이용 가능하다. 그러나 이들 프라이머는 RT-PCR에 의해 고정 조직으로부터 DPD mRNA의 정량에는 부적당하다. 현재 기존의 프라이머는 결과가 없거나 일정하지 않은 결과를 나타냈다. 이는 a) 원래 낮은 수치의 DPD RNA; b) 파라핀 내에 포매된 매우 소량의 조직; 및 c) 파라핀 내 RNA의 <100 bp의 작은 조작으로의 분해에 기인하는 것으로 판단된다. 그 결과로 다른 연구자들은 파라핀 처리된 조직 내에서 DPD 발현의 상기한 정량을 가능하게 하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 세트를 수득하고자 협조하였으나 아직 성공적이지 못한 노력으로 그쳤다. 따라서 제안된 암 치료법을 위한 초기 예후를 제공하는 위해 고정 조직으로부터 DPD mRNA를 정량하는 방법이 요구된다. DPD 효소 활성 및 상응하는 mRNA 발현 수치가 밀접하게 상호관련되어 있는 것으로 나타났기 때문에(Ishikawa et al., Clin. Cancer Res., 5: 883-889 (1999); Johnson et al., Analyt. Biochem. 278: 175-184 (2000)) FPE 표본 내에서 DPD mRNA 발현을 측정하는 것은 신선 조직 내 효소 활성을 측정할 필요 없이 환자의 DPD 발현 수치 상태를 평가하는 방법을 제공한다. 더욱이 FPE 표본은 현미해부에 용이하게 적용할 수 있어 DPD 유전자 발현은 기질 조직으로 오염되지 않은 종양 조직에서 측정될 수 있다.
TS
티미딜레이트 신타제(TS)는 데옥시우리딘 모노포스페이트(dUMP)의 데옥시티미딘 모노포스페이트(dTMP)로의 환원성 메틸화를 촉매하여 세포 내에 티미딘 뉴클레오타이드의 디 노보(de novo) 합성 경로만을 제공하는 DNA 생합성의 필수적 효소이다(Johnston et al., 1995). 티미딜레이트 신타제는 화학요법제로서 가장 일반적인 항폴린산제인 5-플루오로우라실(5-FU)에 대한 표적이다. 결장암, 두경부암 및 유방암의 치료를 위한 가장 효과적인 단일 약제로서 5-FU의 1차 작용은 TS 활성을 저해하는 것이고, 세포내 티미딘 수치의 고갈을 유발하고 그 결과 세포 사멸을 야기한다.
TS 발현의 상당한 변이가 원발성 종양(Johnston et al., 1995; Lenz et al., 1995) 및 전이(Farrugia et al., 1997; Leichmann et al., 1997) 모두로부터의 임상적 종양 표본 중에서 보고되었다. 예를 들어 대장암의 경우 정상 위장관 점막 조직에 대한 종양 조직 내 TS 발현 비율은 2∼10의 범위이었다(Ardalan and Zang, 1996).
또한 5-FU 노출 후 종양 세포 내 TS 단백질의 급성 유도 및 TS 효소 수치 증가를 나타낸 연구에 의해 입증된 바와 같이 티미딜레이트 신타제는 종양 내성 발달시 임상적 중요성을 지닌 것으로 알려져 있다(Spears et al., 1982; Swain et al., 989). 5-FU와 같은 세포독성제에 반응하여 TS를 급성으로 과발현할 수 있는 종양의 능력은 플루오로우라실 내성 발달에 역할을 지닌다. 종전 연구는 TS 단백질 수치가 5-FU의 유효성과 직접적으로 상호관련되고 단백질과 RNA 발현간의 직접적인 상관관계가 존재하고(Jackman et al., 1985) TS 발현은 대장암 및 유방암에서 강력한 예후 마커임을 나타내었다(Jackman et al., 1985; Horikoshi et al., 1992).
진행 전이 질환의 경우 RT-PCR에 의해 정량된 높은 TS mRNA와 높은 TS 단백질 발현 모두는 대장암(Johnston et al., 1995, Farrugia et al., 1997, Leichman et al., 1997), 위암(Lenz et al., 1995, Alexander et al., 1995) 및 두경부암(Johnston et al., 1997)에 대한 플루오로피리미딘-기반 치료에 대한 불충분한 반응을 예측시키는 것으로 나타났다. 반응자와 무-반응자 사이의 상당한 중복이 낮은 TS 카테고리 내에 종종 존재하였으나 중간 이상의 TS 수치를 지닌 환자는 주로 무반응자이었다. 디히드로피리미딘 데히드로게나제(DPD) 및 티미딘 포스포릴라제(TP) 발현 수치, 복제 오류 양성(RER+) 상태(Kitchens and Berger 1997) 및 p53 상태(Lenz et al., 1997)와 같은 또다른 분자 특성과 결합시 TS 과발현의 예측 수치는 더욱 강화된다. 현재까지 인간 종양 내 TS의 발현을 평가한 연구는 인간 종양 내 TS 발현을 기반으로 한 반응 및 결과를 예측할 수 있는 능력이 미래에 TS-지정 요법이 이로운 환자를 선택하는 기회를 제공함을 제안한다.
본 발명의 하나의 관점은 고정 조직 표본으로부터 RNA의 추출 방법을 제공하는 것이다. 또한 본 발명은 포르말린-고정 파라핀-포매 조직으로부터 RNA를 분리하는 확실하고 재현가능한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 3시간 이상의 시간 동안 약 44 내지 62℃의 범위의 온도로 약 0.1 mM 내지 20 mM 농도의 킬레이트제 및 프로티나제 K(바람직하게는 약 5 ㎍ 프로티나제 K/400 ㎕, (12.5 ㎍ 프로티나제 K/ml))를 포함하는 추출 용액 내에서 고정 조직 표본을 가열하는 단계; 및 DNA 오염을 제거하고 상기 추출 용액으로부터 RNA를 분리하는 단계를 포함하는 고정 조직 표본으로부터 긴 단편 RNA를 분리하는 방법을 제공한다.
특정 실시태양에서 가열은 약 45 내지 60℃, 약 48 내지 58℃, 약 48 내지 55℃, 약 48 내지 52℃ 또는 약 50℃의 온도 범위이다. 특히 바람직한 가열 온도는 약 50∼56℃이다.
특정 실시태양에서 상기 시간은 4시간 이상, 8시간 이상, 12시간 이상, 14시간 이상 또는 16시간 이상이다. 바람직한 실시태양에서 상기 시간은 약 16시간이다.
상기 킬레이트제는 EDTA, EGTA, 구연산염, 구연산, 살리실산, 살리실산염, 프탈산, 2,4-펜탄딘, 히스티딘, 히스티디놀 디하이드로클로라이드, 8-하이드록시퀴놀린, 8-하이드록시퀴놀린, 구연산염 또는 0-하이드록시퀴논과 같은 어떠한 킬레이트제도 가능하다. 바람직한 실시태양에서 상기 킬레이트제는 EDTA 또는 구연산나트륨이다.
특정 실시태양에서 상기 킬레이트제는 EDTA 또는 구연산나트륨이고 약 2.5 mM 내지 약 5.0 mM의 농도, 약 3.0 m│ 내지 약 4.0 mM의 농도, 약 3.25 mM 내지 약 3.75 mM의 농도로 존재한다. 바람직한 실시태양에서 │EDTA 또는 구연산나트륨은 약 0.6 mM 내지 약 3.6 mM의 농도로 존재한다. 또다른 바람직한 실시태양에서 EDTA 또는 구연산나트륨은 약 3.6 mM로 존재한다.
DNA 오염은 1차 PCI 추출, 2차 PCI 추출 또는 이 둘 모두에 있어서 무질서유발제(chaotropic agent) 존재 하에 2개의 페놀/클로로포름/이소아밀(DNAse 첨가 또는 무첨가 모두) 또는 통상적으로 이용 가능한 정제 컬럼(즉 DNase 또는 다른 생성물 첨가 또는 무첨가 Qiagen)(즉 DNase 부재 Ambion Turbo 처리)에 의한 페놀/클로로포름/이소아밀(PCI) 알코올 추출과 같으나 이에 한정적이지 않은 당분야에 알려진 방법에 의해 제거될 수 있다. 일부 실시태양에서 이들 방법의 혼합이 이용된다.
무질서유발제는 요소, 이소티오시안산구아니디니움, 티오시안산나트륨(NaSCN), 구아니딘 HCl, 염화구아니디니움, 티오시안산구아니디니움, 테트라클로로아세트산리튬, 과염소산나트륨, 테트라클로로아세트산루비듐, 요오드화칼륨 또는 트리플루오로아세트산세슘과 같은 어떠한 알려진 무질서유발제도 가능하다. 특정 실시태양에서 무질서유발제는 이소티오시안산구아니디니움이다.
특정 실시태양에서 고정된 포르말린-고정 파라핀 포매 조직 표본은 16년 이하이다. 바람직한 실시태양에서 상기 조직 표본은 5년 이하이고, 바람직한 실시태양에서 상기 조직 표본은 2년 이하이다.
특정 실시태양에서 긴 단편 RNA는 200개 뉴클레오타이드 이상의 길이이다. 또다른 실시태양에서 긴 단편 RNA는 300개 뉴클레오타이드 이상이다. 바람직한 실시태양에서 긴 단편 RNA는 300 내지 400개 뉴클레오타이드 길이이다.
도 1A 및 1B는 긴 단편 RNA 수율 상의 온도 효과를 나타낸 것이다. 이들 데이터는 더 낮은 온도에서의 더 긴 인큐베이션이 더 높은 수율의 더 긴 단편 RNA를 분리시킴을 나타낸다.
도 2A 및 B는 RNA 수율 상의 가열 시간 효과를 나타낸 것이다. 데이터는 모든 크기의 RNA 단편 수율이 더 긴 가열 시간에 증가됨을 나타낸다. 가열 시간 증가시 100 bp 단편의 수율은 10배 이상(3.5 PCR 사이클)까지 증가되었고, 300 bp 단편은 약 26 또는 약 600-배까지 증가되었다.
도 3A 및 B는 FFPE 조직 유래의 RNA 상의 인큐베이션 온도 및 추출 용액의 EDTA 농도 효과를 나타낸 것이다. 이들 데이터는 바람직한 가열 시간으로서 50℃ 및 바람직한 EDTA 농도로서 3.6 mM을 나타낸다.
도 4는 파라핀 매트릭스에서 RNA를 채취하기 위한 추출 진행시 프로티나제 K의 양 변화 효과를 나타낸 것이다. 데이터는 5 ㎍(도면 내 1X)이 최소 DNA 오염뿐만 아니라 최대 RNA 수율 모두에 대한 바람직한 농도임을 나타낸다.
도 5A 및 5B는 5가지 추출 방법을 이용한 RNA 수율 및 DNA 오염 비교 결과를 나타낸 것이다: 1) 고온 무질서유발제 방법; 2) PK 방법(프로티나제 K, 저온 및 긴 가열 시간을 포함한 본 발명의 방법); 3) 이소티오시안산구아니딘("GITC")로의 단일 페놀 추출을 이용한 PK 방법; 4) 2차 추출시 GITC로의 이중 페놀 추출을 이용한 PK 방법; 5) GITC 대신 Tris 완충액으로의 이중 페놀 추출을 이용한 PK 방법. 예를 들어 도면에서 "F4_1_100bp" 명칭은 고온 무질서유발제 방법으로 처리된 표본 F4을 의미하고; F4_2_100bp는 PK 방법으로 처리된 표본 F4를 의미하고; F4_3_100bp는 GITC로의 단일 페놀 추출을 이용한 PK 방법으로 처리된 표본 F4를 의미한다. 도표의 좌측 상의 최종 5개 막대는 NRT(역전사 부재)로서 지정되었고 표본 내 DNA 함량을 나타낸다.
도 6은 B5, D6 및 F5로 지정된 FFPE 표본에서 분리된 RNA의 양 및 순도 비교를 나타낸다. "PK"는 본 발명의 분리 방법의 이용을 나타내고, "RGI"는 고온 분리 방법(미국 특허 제6,248,535호에 나타남)의 이용을 나타내고, "para"는 통상적으로-이용가능한 Paradise 키트의 이용을 나타낸다. RNA 순도는 280 nm에서의 자외선 흡광도에 의해 측정된다. 이들 데이터는 본 발명이 시험된 3개 표본 내에서 Paradise 키트보다 더 높은 수율의 RNA 및 더욱 순수한 RNA(DNA 오염에 대항하는)를 분리시킴을 나타낸다. 또한 결과는 PK 방법이 RGI 방법만큼 많은 RNA를 생성하지 않고 더욱 순수한 RNA 표본을 제공함을 나타낸다.
도 7은 각 표본 내 β-액틴의 PCR 증폭에 의해 측정시 FFPE 표본 B5, D6 및 F5에서 분리된 100, 300, 400 및 1000 bp RNA 단편 양 비교를 나타낸 것이다. "PK"는 본 발명의 분리 방법의 이용을 나타내고, "RGI"는 고온 분리 방법(미국 특허 제6,248,535호에 나타남)의 이용을 나타내고, "para"는 통상적으로-이용가능한 Paradise 키트의 이용을 나타낸다. 데이터는 PK를 이용한 바람직한 방법이 최소 DNA 오염뿐만 아니라 각각의 단편 길이의 최적 수율을 제공함을 나타낸다. 막대 그래프 아래의 도표는 막대 그래프에 나타난 숫자 데이터를 제공한다.
도 8은 각각의 방법에 의해 분리된 RNA 단편의 크기 분포 비교를 나타낸 것이다. RNA는 크기-배제 컬럼에 의해 분획화되고 280 nm에서의 UV 흡광도에 의해 정량된다. 작은 단편이 큰 단편보다 컬럼을 더 빠르게 이동한다. D5 = 표본 1; F5 = 표본 2; D6 = 표본 3. "PK"는 본 발명의 분리 방법의 이용을 나타내고, "RGI"는 고온 분리 방법(미국 특허 제6,248,535호에 나타남)의 이용을 나타내고, "para"는 통상적으로-이용가능한 Paradise 키트의 이용을 나타내고, "동결"은 상응하는 신선-동결 조직에서 분리된 RNA 분획이다. 다섯 번째 줄의 단일 플롯은 분자량 표준을 포함한다. 본 도면은 PK 방법이 다른 방법보다 우수한 품질의 긴 단편 RNA를 제공함을 나타낸다.
도 9는 통상의 방법을 이용하여 신선 동결 조직에서 분리된 RNA에 대한 본 발명을 이용한 FFPE 조직에서 분리된 RNA 내 β-액틴 발현 수치(PCR에 의해 측정시)의 비교를 나타낸 것이다. 이들 데이터는 특히 본 발명의 방법을 이용하여 FFPE에서 추출된 RNA로 수득된 유전자 발현 분석이 신선-동결 조직 내 유전자 발현과 상호 관련되고 이를 확실하게 반영함을 나타낸다. 예를 들어 신선-동결 조직 결과와 FFPE간의 직접적인 상관관계는 1의 기울기 및 R2 수치를 나타낸다. R2 수치가 1에 가까울수록 품질이 더 가깝게 된다. 따라서 PK 분리의 경우 R2 수치는 0.89이고, 0.81의 R2 수치로 수득된 Paradise 키트 또는 0.81의 R2 수치의 RGI보다 우수하다.
도 10은 긴 단편 RNA 종의 추출 수율 상의 표본 수명 효과를 나타낸 것이다. 데이터는 표본 수명에 따라 Ct 수치의 누진적 증가(낮은 수율의 RNA)를 나타낸다. 따라서 표본이 오래될수록 RNA 품질이 저하된다(덜 긴 단편 RNA). 표본 1, 2, 3, 4 및 5는 1991년에 고정되었고; 표본 2는 2000년에 고정되었고 표본 D7, D9 및 F3은 2005년에 고정되었다. "RNA"로 표지된 컬럼은 비-역전사 대조군 즉 DNA 오염 양을 나타낸다.
도 11은 NSCLC 내 보정 상대 ERCC1 발현에 대한 시스플라틴/Gem 치료 받은 환자의 전체 생존을 나타내는 그래프이다. 6.7x10-3 역치 이하의 보정 상대 ERCC1 발현 수치의 환자는 우수한 생존과 유의적으로 상호관련되었다. 반면 6.7x10-3 역치 이상의 보정 상대 ERCC1 발현 수치의 환자는 불량한 생존과 유의적으로 상호관련되었다(P = 0.009 로그 랭크 데스트).
도 12는 내부 대조군 유전자에 대해 보정 상대 ERCC1 발현을 계산하는 방법을 나타내는 도표이다. 도표는 2개의 시험 표본(알려지지 않은 1 및 2)으로 수득된 데이터를 포함하고 보정되지 않은 유전자 발현 데이터(UGE)를 측정하는 방법을 나타낸다. 또한 도표는 pre-TaqMan 기술에 의해 측정된 알려진 상대 ERCC1 수치로 TaqMan 기기에 의해 생성된 UGE를 표준화하는 방법도 나타낸다. 이는 UGE에 보정 인자 KERCC1를 곱하여 이루어진다. 도면 내 내부 대조군 유전자는 β-액틴이고 교정기 RNA는 인간 간 전체 RNA(Stratagene, Cat. #735017)이다.
도 13은 본 발명의 56명 환자의 인구통계학적 세목, 종양 단계 및 세포 타입을 나타내는 표이다. 수행된 치료 주기의 중간수는 3이었다(범위 1-6). 14면 환자(25%)는 이전에 화학요법을 받았고 대부분(9명 환자)은 탁센(Taxane) 단독 또는 DDP 또는 카르보플라틴과의 병용 치료를 받았다. 56명 환자 중 3명은 방사선치료를 받았고 5명 환자는 원발 종양의 외과 절제술이 수행되었다.
도 14는 역치 이하의 보정 ERCC1 발현 수치를 지닌 환자가 역치 이상의 보정 ERCC1 수치를 지닌 환자의 경우 20.4주(95% C.I. 6.9, 33.9주)와 비교시 61.6주(95% C.I. 42.4, 80.7주)의 유의적으로 더 긴 중간 생존을 지님을 나타내는 표이다. 종양 단계에 대해 조정시 낮거나 높은 ERCC1 발현과 전체 생존간의 관련성에 대한 로그 랭크 통계는 3.97이었고 P 수치는 0.046이었다. 비조정된 로그 랭크 결과는 본 도면에 나타나 있다. Kaplan Meier 생존 곡선 및 로그 랭크 테스트를 이용한 단일변수 분석 상의 전체 생존과 유의적으로 관련된 인자도 나타나 있다. 이들은 체중 감소 사전치료 및 ECOG 수행 상태의 존재이다. 환자 연령(P=0.18), 성별 (P=0.87), 종양 단계(P=0.99), 종양 세포 타입(P=0.63) 및 흉막 유축(P=OJl)은 전체 생존에 대한 유의적인 예후 인자가 아니었다. 보정 상대 ERCC1 발현 수치, ECOG 수행 상태 및 체중 감소는 Cox 비례 위험 퇴보 모델 다변수 분석시 생존에 대한 유의적인 예후 인자로 존속하였다. 종양 단계 상에 계층화된 Cox 퇴보 모델에 대한 P 수치는 ERCCl의 경우 0.038, 체중 감소의 경우 0.017 및 ECOG 수행 상태의 경우 0.02이었다(PS 0 대비 1 또는 2).
도 15는 내부 대조군 유전자에 대한 DPD 발현을 계산하는 방법을 나타내는 도표이다. 도표는 2개의 시험 표본(알려지지 않은 1 및 2)으로 수득된 데이터를 포함하고, 보정되지 않은 유전자 발현 데이터(UGE)를 측정하는 방법을 나타낸다. 또한 도표는 종전 공개된 DPD 수치로 Taqman 기기에 의해 생성된 UGE를 표준화하는 방법도 나타낸다. 이는 UGE에 보정 인자 KDPD를 곱하여 달성된다. 도면 내 내부 대조군 유전자는 β-액틴이고 교정기 RNA는 Universal PE RNA; Applied Biosystems의 Cat #4307281, lot # 3617812014이다.
도 16은 각각의 조직 타입의 표본에 대한 상대 보정 DPD 발현 수치의 박스플롯(boxplot)을 나타낸 것이다. 박스는 25번째 및 75번째 백분위수(4분위수) 범위를 나타낸다. 중간 수치는 각각의 박스 내 수평 막대로 나타나 있다. 위스커(whisker)는 25번째 및 75번째 백분위수 이외의 수치를 나타내나 박스 상단에 나타난 바깥 수치는 배제시킨다.
도 17은 5-FU 및 옥실리플라틴 치료법을 받은 높은(β-액틴 유전자 발현의 약 7.5 x 10-3배 이상; n=7) 및 낮은(β-액틴 유전자 발현의 약 7.5 x 10-3배 이하; n=43) 보정 TS 발현 수치를 지닌 환자가 지닌 대장 선암종 종양의 추정 생존 가능성 및 월별 생존을 나타내는 그래프이다.
도 18은 5-FU 및 옥실리플라틴 치료법을 받은 높은(β-액틴 유전자 발현의 약 4.9x10-3배 이상; n=10) 및 낮은(β-액틴 유전자 발현의 약 4.9 x 10-3배 이하; n=40) 보정 ERCC1 발현 수치를 지닌 환자가 지닌 대장 선암종 종양의 추정 생존 가능성 및 월별 생존을 나타내는 그래프이다.
도 19는 5-FU 및 옥실리플라틴 치료법을 받은 높은(β-액틴 유전자 발현의 약 7.5x10-3배 이상의 TS 발현 및 β-액틴 유전자 발현의 약 4.9x10-3배 이상의 ERCC1; n=14) 및 낮은(β-액틴 유전자 발현의 약 7.5 x 10-3배 이하의 TS 발현 및 β-액틴 유전자 발현의 약 4.9 x 10-3배 이하의 ERCC1; n=36) 보정 TS 및 ERCC1 발현 수치를 지닌 환자가 지닌 대장 선암종 종양의 추정 생존 가능성 및 월별 생존을 나타내는 그래프이다.
도 20은 단일변수 분석으로 분석된 ERCC1 및 TS 발현에 대한 옥살리플라틴/5-FU 치료된 대장암 환자의 생존을 나타내는 표이다.
도 21은 계층화 분석으로 분석된 ERCC1 및 TS 발현에 대한 옥살리플라틴/5-FU 치료된 대장암 환자의 생존을 나타내는 표이다.
도 22는 5-FU 및 옥살리플라틴 화학요법으로 치료된 환자가 지닌 대장 선암종 종양의 반응을 나타내는 그래프이다. 환자는 진행성 질환(PD), 부분적 반응(PR) 및 안정적 질환(SD)으로 분류되었다. TS 및 ERCC1 발현 모두 낮은 수치를 지닌 환자는 최상 반응을 지녔다.
도 23은 내부 대조군 유전자에 대한 ERCC1 발현을 계산하는 방법을 나타낸 도표이다. 도표는 2개의 시험 표본(알려지지 않은 1 및 2)으로 수득된 데이터를 포함하고, 보정되지 않은 유전자 발현 데이터(UGE)를 측정하는 방법을 나타낸다. 또한 도표는 pre-TaqMan 기술에 의해 측정된 알려진 상대 ERCC1 수치로 TaqMan 기기에 의해 생성된 UGE를 표준화하는 방법도 나타낸다. 이는 UGE에 보정 인자 KERCC1를 곱하여 달성된다. 도면 내 내부 대조군 유전자는 β-액틴이고 교정기 RNA는 인간 간 전체 RNA(Stratagene, Cat. #735017)이다.
도 24는 내부 대조군 유전자에 대한 TS 발현을 계산하는 방법을 나타낸 도표이다. 도표는 2개의 시험 표본(알려지지 않은 1 및 2)으로 수득된 데이터를 포함하고, 보정되지 않은 유전자 발현 데이터(UGE)를 측정하는 방법을 나타낸다. 또한 도표는 종전 공개된 TS 수치로 TaqMan 기기에 의해 생성된 UGE를 표준화하는 방법도 나타낸다. 이는 UGE에 보정 인자 KTS를 곱하여 달성된다. 도면 내 내부 대조군 유전자는 β-액틴이고 교정기 RNA는 Universal PE RNA; Applied Biosystems의 Cat #4307281, lot # 3617812014이다.
도 25는 내부 대조군 유전자에 대한 EGFR 발현을 계산하는 방법을 나타낸 도표이다. 도표는 2개의 시험 표본(알려지지 않은 1 및 2)으로 수득된 데이터를 포함하고, 보정되지 않은 유전자 발현 데이터(UGE)를 측정하는 방법을 나타낸다. 또한 도표는 pre-TaqMan 기술에 의해 측정된 알려진 상대 EGFR 수치로 TaqMan 기기에 의해 생성된 UGE를 표준화하는 방법도 나타낸다. 이는 UGE에 보정 인자 KEGFR을 곱하여 달성된다. 도면 내 내부 대조군 유전자는 β-액틴이고 교정기 RNA는 인간 간 전체 RNA(Stratagene, Cat. #735017)이다.
도 26은 내부 대조군 유전자에 대한 HER2-neu 발현을 계산하는 방법을 나타낸 도표이다. 도표는 2개의 시험 표본(알려지지 않은 1 및 2)으로 수득된 데이터를 포함하고, 보정되지 않은 유전자 발현 데이터(UGE)를 측정하는 방법을 나타낸다. 또한 도표는 종전 공개된 HER2-neu 수치로 TaqMan 기기에 의해 생성된 UGE를 표준화하는 방법도 나타낸다. 이는 UGE에 보정 인자 KHER2-neu를 곱하여 달성된다. 도면 내 내부 대조군 유전자는 β-액틴이고 교정기 RNA는 인간 간 전체 RNA(Stratagene, Cat. #735017)이다.
상세한 설명
본 발명은 고정 조직 표본에서 긴 단편 RNA를 분리하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 광범한 핵산을 포함한 생물학적 표본에 적당하다. 특히 본 발명의 방법은 고정 종양 조직 표본에서 RNA를 분리시 유용하다. 생물학적 표본은 포르말린(포름알데하이드)(Bouin 고정제 포함) 및 글루타르알데하이드와 같은 고정제로 고정된다. 알코올 침지와 같은 다른 고정 기술(Battifora and Kopinski, J. Histochem. Cytochem. (1986) 34:1095)을 이용하여 고정된 조직 표본도 적당하다. 또한 조직 표본은 파라핀 포매된다. 가장 일반적으로 조직 표본은 포르말린-고정 파라핀-포매(FFPE) 표본으로 보존된다.
본원에서 긴 단편 RNA는 100 nt보다 더 긴 RNA로 정의된다. 바람직하게는 RNA는 약 150 nt 길이 이상, 더욱 바람직하게는 약 200 nt 길이 이상, 가장 바람직하게는 약 300 nt 길이 이상이다. 특정 실시태양에서 긴 단편 RNA는 약 400 nt 길이 이상이다. 또한 긴 단편 RNA는 1000 nt 길이 이상의 RNA 단편도 포함한다.
일반적으로 일부 상세화된 인큐베이션 시간에 대한 증가된 온도는 FFPE 표본 유래의 RNA와 같은 추출 거대분자에 필수적이다. 파라핀으로부터 RNA 회수를 달성하기 위한 2개의 일반적 절차가 나타났다: 구아니디니움염과 같은 무질서유발제 존재시 FFPE 표본의 인큐베이션 또는 단백질을 분해하고 단백질 매트릭스로부터 RNA를 유리시키는 것을 돕는 효소인 프로티나제 K의 존재시 인큐베이션. 이들 기본 방법의 많은 변형이 알려져 있다. 그러나 FFPE 표본에서 긴 RNA 단편을 추출하기 위해 특별히 겨냥된 종전 연구 및 방법은 존재하지 않는다. 일반적으로 RNA 분자는 온도 증가 및 증가된 온도에 노출 시간 증가에 따라 분해된다는 개념이 존재한다. 그러나 온도/시간과 FFPE로부터 추출된 고품질/긴 단편 RNA의 최대 수율 사이의 정량적 상관관계는 알려지거나 일반적으로 인식되어 있지 않다. 더욱이 RNA가 열 효과 단독에 의해 명백하게 분해되지 않는 역치 온도가 존재함은 알려져 있지 않다.
본 발명자들은 온도 및 시간 모두 RNA 품질 상에 효과를 지님을 측정하였으나 긴 단편 RNA(300 nt 길이 단편과 같은 100 nt 길이 이상의 단편) 상의 온도 및 시간 효과에 대한 짧은 단편 RNA(100 nt 이하) 상의 온도 및 시간 효과 내 상관관계는 항상 존재하지는 않는다. 도 1A 및 1B는 FFPE 표본이 다양한 온도(92, 82, 72 및 62℃)에서 다양한 시간 동안(0.5, 1, 2 및 8시간) 인큐베이트된 결과를 제공한다. Y축은 Ct 수치이다. Ct 수치는 PCR 생성물 양에 관련되고, 따라서 PCR 반응시 존재하는 타겟의 고유 양과 관련된다. 관계는 역비례이고, 즉 더 큰 Ct 수는 본래 존재하는 더 적은 타겟 RNA를 나타낸다. 도 1에 나타난 결과는 92℃에서의 수율이 30분의 최단 시점에서조차 낮은 온도보다 더 낮았기 때문에 300 nt RNA가 온도-감수성임을 확인시킨다. 그러나 100 nt RNA의 경우 30분 및 1시간 인큐베이션에서 수율은 92℃가 아닌 62℃에서 최소였다. 300 nt 길이 표본은 짧은 인큐베이션 시간에서조차 100 nt 종보다 더욱 덜 풍부하다(약 6 Ct 사이클; 26=64-배). 더욱이 300 nt 종은 동일 조건 하에서 100 nt RNA의 경우 2 사이클 증가(22=4-배 감소)와 비교시 82℃에서 0.5시간에서 시작하여 2시간까지 더욱 열 감수성이다(Ct 사이클은 6까지 증가(26=64-배 수율 감소). 수율 변화는 모든 인큐베이션 시간에서 62℃에서 최소이고, 이는 RNA가 매우 안정한 역치 온도 이하의 존재를 나타내고 긴 시간 동안 저온에서의 인큐베이션이 높은 분자량 RNA의 최적 분리를 위해 더욱 생산적임을 제안한다. 62℃ 이상의 온도는 시간 경과시 RNA의 상당한 분해를 유발하는 반면 RNA의 전체 수율은 고온에서 다소 증가되고 긴 단편 RNA 수율은 감소된다.
도 2A 및 2B는 50℃에서 각각의 길이의 RNA 종의 회수된 RNA 양 상의 가열 시간 효과를 나타낸다. 이들 도면은 더 긴 시간에 인큐베이트시 모든 크기의 RNA의 수율이 증가됨을 나타낸다. 도 2에 나타난 바와 같이 종양 조직의 FFPE 표본은 0.5시간 내지 16시간까지 다양한 시간 동안 50℃에서 프로티나제 K 존재시 가열되었다. 예를 들어 F4_O.5_1X 100BP 표시는 표본 F4가 0.5시간 동안 가열되고 100 nt 길이 단편임을 의미한다. 모든 크기의 RNA 단편의 수율은 인큐베이션 시간 증가와 함께 증가되었다. 100 nt 단편의 수율은 10-배까지 증가된 반면(ca. 3.5 PCR 사이클) 300 nt 단편은 단시간부터 긴 인큐베이션 시간까지 약 26(6 PCR 사이클 감소에 상응) 또는 60-배까지 증가되었다. 이는 400 nt 단편에 대해서도 유사하게 나타났다. 수율의 다소 적은 증가가 1000 nt 단편에서 나타났고(약 10-배), 이는 증가된 추출이 긴 인큐베이션 시간에 이러한 크기의 일부 분해에 의해 균형 잡힘을 나타낸다. 이들 데이터는 파라핀 매트릭스로부터 RNA 추출의 상당한 시간 의존도를 나타내고 또한 이들 조건 하에 50℃에서 모든 RNA 단편 길이의 안정성을 지적한다(도 1에 나타난 82℃에서와 반대됨). 낮은 인큐베이션 시간이 절대 수치뿐만 아니라 상대 수치 상에서 300 nt 이상의 RNA 종의 수율을 실질적으로 증가시킴은 명백하다(즉 16시간 인큐베이션 시간에 100 bp와 300 bp 종 사이에 단지 2-배 Ct 차이).
따라서 도 1과 2를 함께 고려시 데이터는 RNA가 92℃에서 열적으로 불안정하고 증가된 온도가 특히 긴 단편 RNA 상에 유해함을 나타낸다. 또한 도면은 증가된 온도에서 더 긴 인큐베이션 시간이 낮은 온도에서보다 더 실질적으로 RNA를 분해함을 나타낸다. 그러나 도 2에 나타난 바와 같이 온도가 더 중간 온도로 저하되면 예측되는 시간 의존적 분해가 존재하지 않는다.
따라서 본 발명은 FFPE 조직과 같은 고정 조직 표본으로부터 긴 단편 RNA 분리 방법을 제공하고, 상기 조직 표본은 3시간 이상의 시간 동안 약 45 내지 62℃의 온도 범위로 가열된다. 또다른 실시태양에서 고정 조직 표본은 약 44 내지 60℃의 온도 범위, 더욱 바람직한 실시태양에서 약 48 내지 58℃의 온도 범위, 또다른 바람직한 실시태양에서 약 48 내지 55℃의 온도 범위, 또다른 바람직한 실시태양에서 약 48 내지 52℃의 온도 범위, 가장 바람직한 실시태양에서 약 50 내지 56℃의 온도 범위로 가열된다. 당업자는 용어 "약"은 가열 수조, 가열 블록 및 PCR 기계에서 발생하는 작은 비실질적 온도 변동을 포함하는데 사용되고 장치간의 또는 실험실간의 이러한 작은 변동은 유해하거나 최종 양성 효과를 지니지 않고 청구범위 내에 포함됨을 인식할 것이다. 당업자는 본 방법이 그의 의도된 이용(즉 긴 단편 RNA 분리)을 위해 수행되는 한 용어 "약"은 지정된 온도 범위 근방의 온도 변동이 청구범위에 포함됨을 나타내고자 함을 인식할 것이다.
조직 표본은 2시간 또는 20시간 이상의 어떠한 시기( 및 그 사이의 시간) 동안 상기 논의된 온도로 가열된다. 예를 들어 시간은 2시간과 20시간까지의 어떠한 시간 및 어떠한 범위 내에도 포함된다. 예를 들어 본 방법이 그의 의도된 이용(즉 긴 단편 RNA 분리)을 위해 수행되는 한 본 발명은 약 4시간 내지 약 19시간, 약 5시간 내지 약 17시간, 약 6시간 내지 약 17시간, 약 7시간 내지 16.5시간, 약 8시간 내지 약 16.5시간, 약 9시간 내지 약 16.5시간, 약 10시간 내지 약 16.25시간, 등의 시간에 가열을 제공한다. 바람직한 실시태양에서 상기 시간은 약 12시간 내지 약 17시간이고, 더욱 바람직한 실시태양에서 상기 시간은 약 14시간 내지 약 16시간이다. 가장 바람직한 실시태양에서 상기 시간은 16시간이다. 당업자는 본 방법이 그의 의도된 이용(즉 긴 단편 RNA 분리)을 위해 수행되는 한 용어 "약"이 지정된 시간 근방의 시간 변동이 청구범위에 포함됨을 나타내고자 함을 인식할 것이다.
본 발명 상의 특히 바람직한 실시태양은 약 50℃에서 약 16시간 동안 고정 조직 표본(FFPE와 같은)을 가열하는 단계를 포함하고, 이는 긴 단편 RNA 특히 300 nt 이상의 RNA의 수율을 극대화한다. 상기 논의되고 도 1 및 2에 나타난 바와 같이 RNA는 이러한 온도에서 긴 시간 동안 안정하고, 파라핀으로부터 거대분자의 추출이 시간 의존적이기 때문에 긴 단편 RNA의 최대 수율을 달성하기 위해서는 약 16시간의 인큐베이션 시간이 바람직하다(또한 이러한 온도에서 가능함).
또한 본 방법은 프로티나제 K의 존재시 고정 조직 표본의 가열 단계를 포함한다. 상기 논의된 바와 같이 프로티나제 K는 최대량의 RNA를 추출하는데 유용하다. 그러나 과량의 프로티나제 K가 분리시 사용되는 경우 매트릭스로부터 더 많은 DNA를 유리시켜 RNA 제제의 높은 DNA 오염을 유발하게 된다. 도 4는 파라핀 매트릭스로에서 RNA를 채취하는 인큐베이션 단계에서 다양한 양의 프로티나제 K의 효과를 나타낸다. 예를 들어 표본 F4, 16시간 가열, 1X(5 ㎍) 함량의 프로티나제 K를 나타내는 F4_16_lX_100bp로 표지된 표본은 F4_16_2X_100 bp(2X=10 ㎍) 및 F4_16_4X_100 bp(4X=20 ㎍) 표본보다 낮은 CT 수치를 지닌다. 또한 이는 300 bp 및 400 bp 크기의 RNA에서도 관찰된다(본 크기의 RNA에 대한 최소 CT 역치를 지닌 F4_16_lX_300bp 및 F4_16_lX_400bp 표본 참조). 따라서 5 ㎍ 프로티나제 K/400 ㎕의 농도(12.5 프로티나제 K/mL)가 바람직하다. 그러나 실시예 19에 나타난 바와 같이 다른 함량의 프로티나제 K도 성공적으로 사용될 수 있다(즉 0.5x, Ix, 2x, 4x). Qiagen 프로테아제, protease, 브로파신(brofasin)(Bromelia fastiasa에서 추출된 식물 프로티나제) 및 산악 빠빠야(Carica candamarcensis)에서 분리된 시스테인 프로티나제를 포함한 또다른 프로티나제 K도 사용된다.
2가 이상의 금속 이온을 킬레이트하는데 사용되는 EDTA(에틸렌 디아민 테트라아세트산)는 추출 완충액의 성분으로 종종 첨가된다. 그러나 추출 완충액에 EDTA를 사용하는 알려진 방법의 연구는 FFPE 추출 시행시 광범한 농도의 EDTA를 나타내었고, 이는 RNA 분자 상의 2가 금속 이온 효과를 방지하기 위해 특정 농도의 EDTA가 존재하거나 요구됨을 아무도 인식하지 않았음을 나타낸다. 도 3은 인큐베이션 시간 및 EDTA 농도 효과를 나타낸다. FFPE 조직 표본은 표본이 프로티나제 K 존재시 16시간 인큐베이션 동안 다른 온도(50, 60 및 70℃)에 노출된 점을 제외하고 실시예 1에 기재된 방법에 따라 처리되었다. 또한 추출 용액 내 4가지 다른 농도의 EDTA가 사용되었다. 도 3A는 3.6 mM 농도의 EDTA가 긴 단편 RNA의 더 높은 수율을 제공하였고 2-배 이상까지 수율을 증가시킴을 나타낸다. 또한 도 3은 모든 크기의 RNA의 최대 수율이 50℃ 인큐베이션 온도에서 수득되었음을 나타낸다(60℃에서 약 25% 이상 및 70℃에서 약 4-배 이상). 낮은 농도의 EDTA(0.1 mM)은 2-3 배정도까지 RNA 수율을 감소시켰고, 20 mM의 높은 수치 사용시 약 25%의 3.6 mM와 비교시 수율을 감소시켰다.
따라서 본 방법은 추출 용액 내 EDTA와 같은 킬레이트제의 사용을 더욱 제공한다. 킬레이트제는 다가 금속 이온 복합체 형성을 가능하게 하는 잘 알려진 유기 화합물이다. 이와 같이 EDTA 이외의 다른 킬레이트제도 본 발명의 방법에 이용된다. 킬레이트제는 통상적으로 사용되는 것에서 선택된다. 예를 들어 EDTA, EGTA, 구연산염(구연산나트륨과 같은), 구연산, 살리실산, 살리실산 염, 프탈산, 2,4-펜탄딘, 히스티딘, 히스티디놀 디하이드로클로라이드, 8-하이드록시퀴놀린, 구연산염 및 0-하이드록시퀴논이 당분야에 알려진 대표적인 킬레이트제이다. 바람직한 실시태양에서 EDTA 또는 구연산나트륨이 사용된다. 실시예 15 참조.
킬레이트제는 약 0.1 mM 내지 약 15 mM의 농도 및 그 범위 내 어떠한 농도로도 존재한다. 바람직한 실시태양은 약 2.5 mM 내지 약 5.0 mM 농도의 킬레이트제를 포함한다. 바람직한 실시태양은 약 3.0 mM 내지 약 4.0 mM 농도의 킬레이트제를 포함한다. 더욱 바람직한 실시태양은 3.25 mM 내지 3.75 mM 농도의 킬레이트제를 포함한다. 가장 바람직하게는 킬레이트제는 약 3.6 mM의 농도로 존재하고, 가장 바람직한 실시태양에서 킬레이트제는 EDTA 또는 구연산나트륨이고 약 0.6 mM 내지 약 3.6 mM로 존재하거나 약 3.6 mM로 존재한다. 당업자는 본 방법이 그의 의도된 이용(즉 긴 단편 RNA 분리)을 위해 수행되는 한 용어 "약"은 지정된 mM 함량 근방의 변동이 청구범위에 포함됨을 나타내고자 함을 인식할 것이다.
본 발명에 사용된 바와 같은 긴 인큐베이션 시간(무질서유발제과 함께 고온에서 짧은 인큐베이션 시간에 반대되는)의 단점은 상당한 양의 DNA가 RNA와 동시-추출될 수 있어서 배경 기술에 기재된 RNA 분석의 가능한 문제점을 유발하게 된다. DNA 오염은 처리의 후-추출 단계에 표본을 데옥시리보뉴클레아제(DNAse)로 처리함으로서 처리된다. 이러한 시약은 DNA 양을 감소시키는데 효과적일 수 있으나 또한 4- 내지 8-배까지 분리된 RNA 양도 감소시켜 이미 풍부하지 않은 조직 함량의 표본 분석의 심각한 손실이 될 수 있다. 따라서 본 발명은 DNAse 사용을 필요로 하지 않고 대신에 프로티나제 K 단계 후 이중-페놀/클로로포름 추출 방법을 이용하는 분리 방법을 제공한다. 이중 페놀/클로로포름 추출은 특히 대부분의 DNA를 제거하면서 RNA 수율을 보존하는 무질서유발제의 이용을 포함한다.
바람직한 실시태양에서 무질서유발제로의 이중 페놀/클로로포름 추출은 10% 이하의 DNA를 동시-분리시킨다.
이중 페놀/클로로포름 추출 단계는 1차 및 2차 이상의 페놀/클로로포름 추출을 수행하는 단계를 포함하고, 상기 2차 페놀/클로로포름 추출은 무질서유발제를 포함한다. 어떠한 무질서유발제도 사용된다. 무질서유발제는 뉴클레아제 활성을 저해함으로서 핵산을 안정화시킨다. 예를 들어 알려진 무질서유발제는 요소, 이소티오시안산구아니디니움, 티오시안산나트륨(NaSCN), 구아니딘 HCl, 염화구아니디니움, 티오시안산구아니디니움, 테트라클로로아세트산리늄, 과염소산나트륨, 테트라클로로아세트산루비듐, 요오드화칼륨 및 트리플루오로아세트산세슘을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
Qiagen(DNase을 이용하거나 아니거나)사의 정제 컬럼 및 Ambion Turbo DNase 부재 처리와 같은 통상적으로 이용 가능한 제품의 이용을 포함하나 이에 한정적인 것은 아닌 또다른 DNA 오염 제거 방법이 이용된다.
DNA 오염 제거 후 RNA는 에탄올 또는 이소프로판올 침전과 같은 알려진 절차를 이용하여 분리된다.
포르말린-고정되고 파라핀 매트릭스 내에 포매된 RNA 분자는 무한정 기간 동안 안정적이여서 보관 표본의 수명은 더 이상 문제점이 아니라고 일반적인 생각된다. 전체 RNA(모든 크기 및 단편)은 시간 경과에 따라 매우 느리게 감소되는 것은 사실이나 본 발명자들은 긴 단편의 RNA의 경우에는 해당되지 않음을 측정하였다. 300 nt 이상의 RNA 단편의 양은 오래된 FFPE 표본에서 현격히 감소된다. 도 10은 1991년에 고정된 표본(표본 1, 2, 3, 4 및 5)이 2005년에 고정된 표본(D7, D9 및 F3)보다 저수율 및 저품질의 RNA를 제공함을 나타낸다. 따라서 긴 단편 RNA가 중요한 응용의 경우 FFPE 조직 표본은 5년 이하가 되어야 한다. 그러나 표본이 16년인 경우에도 긴 단편 RNA가 수득되었다(데이터는 나타내지 않음). 따라서 본 발명의 하나의 실시태양에서 고정 표본의 수명이 5년 이하이다. 더욱 바람직한 실시태양에서 표본은 3년 이하이고 가장 바람직한 실시태양에서 표본은 2년 이하이다.
본 발명의 방법에 의해 분리된 RNA는 cDNA로의 역전사; 유전자 칩, 올리고뉴클레오타이드 마이크로어레이 등 상의 분석을 위한 방사능으로, 형광으로 또는 다른 것으로 표지된 cDNA 생성; 아크릴아미드 또는 아가로스 겔 전기영동에 의한 전기영동; 크로마토그래피에 의한 정제(예를 들어 이온 교환, 실리카 겔, 역상 또는 크기 배제 크로마토그래피); 핵산 프로브로의 혼성화; 및 기계, 초음파 또는 다른 수단에 의한 단편화를 포함하나 이에 한정적이지 않은 다양한 목적 및 분자 생물학 처리에 적당하다.
종종 암분야에서 생물표지의 발현은 치료법의 결정뿐만 아니라 진단에 중요하다. 본 방법은 어떠한 바람직한 생물표지에 대한 RNA를 분리하는데 이용될 수 있다. 예는 Kras, MMRl, ERCCl, DPD, Gst-pi, EGFR, TS 및 Her2-neu를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
따라서 본 발명은 긴 단편 RNA의 분리방법을 제공할 뿐만 아니라 본원에 개시된 방법에 의해 분리된 RNA도 제공한다. 본 발명의 또다른 실시태양은 본 발명의 분리된 RNA의 복제에 의해 제조된 cDNA를 제공한다. 당업자는 cDNA가 분리되고 정제된 RNA로부터 용이하게 제조될 수 있음을 인식할 것이다. 또한 본 발명의 또다른 관점은 마이크로어레이 또는 유전자 칩을 제조하기 위한 분리된 RNA 또는 분리된 RNA에서 제조된 cDNA의 이용을 제공한다. 또한 본 발명은 암 검출/진단시 및 유전자 발현 수치 또는 유전자 복제수를 기반으로 한 적당한 화학요법의 결정 분야에서 종종 발생하는 바와 같이 치료 또는 진단 목적으로 유전자 발현 또는 유전자 복제수의 분석시 본 발명의 분리된 RNA의 이용을 제공한다. 적당한 PCR 프라이머를 이용하여 어떠한 메신저 RNA의 발현 수치도 본 발명의 방법에 의해 측정될 수 있다. 정량적 RT-PCR 기술은 파라핀-포매시 단백질 발현 수치와 동일한 표본 내 유전자 발현 수치(RT-PCR 이용)와의 비교를 가능하게 한다.
ERCC1
본 발명의 특정 실시태양은 종양 내 ERCC1 mRNA 양이 플레티네이트제(platinating agent)로 치료된 환자의 생존과 상호관련된다는 발견의 일부에 존재한다. 높은 수치의 ERCC1 mRNA를 발현하는 종양을 지닌 환자는 백금-기반 화학요법에 내성을 지녀 낮은 수치의 생존능을 지닌 것으로 판단된다. 반대로 종양이 낮은 양의 ERCC1 mRNA를 발현하는 환자는 백금-기반 화학요법에 민감하고 높은 수치의 생존능을 지닌 것으로 판단된다. 환자의 종양 ERCC1 mRNA 상대 발현은 이를 예정된 역치 발현 수치와 비교함으로서 판단된다.
따라서 본 발명의 하나의 실시태양은 내부 대조군의 유전자 발현에 대한 고정 파라핀-포매(FPE) 조직 내 ERCC1 긴 단편 mRNA 발현량의 정량 방법을 제공한다. 본 발명자들은 고정되고 포매된 조직 내에서 정확한 ERCC1 발현 평가를 가능하게 하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 개발하였다. 본 발명은 바람직하게는 고정되고 파라핀 포매된(FPE) 조직 표본에서 추출된 긴 단편 RNA(바람직하게는 본 발명의 추출 방법을 이용하여)과 함께 사용되는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 ERCCl-504F(서열번호: 1), ERCC1-574R(서열번호: 2) 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 제공한다. 이러한 ERCC1 유전자 발현 측정은 백금-기반 화학요법의 예측에 이용된다. 예를 들어 참고문헌으로 포함된 미국 특허등록 제6,573,052호 참조.
이와 같이 본 발명의 하나의 실시태양은 첫 번째로 FPE 표본에서 긴 단편 RNA의 추출 및 두 번째로 역전사효소 중합효소 연쇄 반응을 수행하기 위한 한 쌍의 올리고뉴클레오타이드 프라이머, 바람직하게는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 ERCCl-504F(서열번호: 1), ERCC1-574R(서열번호: 2) 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 이용함으로서 표본 내 ERCC1 mRNA 함량의 측정을 포함한다. 바람직하게는 RNA는 본원에 개시된 어떠한 방법에 의해서도 FPE 세포에서 추출된다.
본 방법은 환자 유래의 어떠한 형태의 조직에도 응용될 수 있다. 종양 조직의 내성 조사시 종양 조직을 조사하는 것이 바람직하다. 바람직한 실시태양에서 종양이 수득되는 환자 유래의 정상 조직 일부도 조사된다. 이후 정상 조직은 백금-기반 화학요법 화합물에 대해 내성을 지닌 것으로 예측되는 즉 높은 수치의 ERCC1 유전자 발현을 나타내나 종양은 이러한 화합물에 민감한 것으로 예측되는 즉 낮은 수치의 ERCC1 유전자 발현을 나타내는 환자는 높은 함량의 화학요법 조성물로 치료된다.
역치 수치 이하의 ERCC1 유전자 발현 수치를 나타내는 환자는 역치 수치 이상의 ERCC1 유전자 발현 수치를 발현하는 종양을 지닌 환자보다 더 높은 생존능을 지닐 것으로 예측되기 때문에 더 높은 함량의 화학요법 조성물로 치료된다. 한편 임상학자는 낮은 기대 생존능을 지닌 경우 역치 수치 이상의 ERCC1 유전자 발현 수치를 발현하는 종양을 지닌 환자가 화학요법으로부터 어떠한 유의적인 이점을 끌어낼 수 없다고 결정한다.
본 발명의 방법은 광범위한 종양 타입에 응용될 수 있다. 이는 개별적인 "종양 발현 프로파일"의 준비를 가능하게 하여 ERCC1 발현 수치가 개별적인 환자 표본에서 측정되고 다양한 화학요법제에 대한 반응이 예측된다. 바람직하게는 ERCC1에 관한 본 방법은 고형 종양, 가장 바람직하게는 비-소세포 폐암(NSCLC) 종양에 응용된다. 특정한 종양 타입으로의 본 발명의 일부 실시태양의 응용을 위해 특정 ERCC1 발현과 백금-기반 화학요법에 대한 임상적 내성간의 상관관계를 가능하게 하는 데이터 세트를 수집함으로서 ERCC1 유전자 발현 수치와 생존능간의 관계를 확인하는 것이 바람직하다.
ERCC1과 관련하여 본원에 한정된 "예정된 역치 수치"는 종양이 백금-기반 화학요법에 내성인 것으로 판단되는 것 이상의 ERCC1 종양 발현의 보정 상대 수치이다. 이러한 역치 수치 이하의 종양 발현 수치는 백금-기반 화학요법에 민감한 종양에서 발견되는 것으로 판단된다. 백금-기반 화학요법에 반응하는 종양 중 ERCC1:β-액틴의 비율로 표기되는 보정 상대 발현 범위는 약 6.7 x 10-3 이하이다. 백금-기반 화학요법에 반응하지 않는 종양은 약 6.7 x 10-3 이상의 ERCC1:β-액틴의 비율의 상대 발현을 지닌다. 실시예 7 참조.
또한 "예정된 역치 수치"는 백금-기반 화학요법을 받은 환자가 낮은 생존능을 지닌 것으로 판단되는 것 이상의 종양 보정 상대 ERCC1 발현 수치로서 ERCC1과 관련되어 정의된다. 백금-기반 화학요법을 받은 환자에서 이러한 역치 수치 종양 보정 상대 ERCC1 발현 수치는 높은 환자 생존능과 상호관련된다. ERCC1:β-액틴의 비율로 표기되는 역치 보정 상대 ERCC1 발현은 약 6.7 x 10-3 이다. 도 11, 실시예 7 참조. 그러나 본 발명은 내부 대조군 유전자로서 β-액틴의 이용에 한정적인 것은 아니다.
RNA는 본원에 논의된 바와 같이 본 발명의 어떠한 방법에 의해서도 FPE 조직에서 추출된다. 본원에 기재된 고정되고 파라핀-포매된(FPE) 조직 표본은 저장가능 또는 보관 조직 표본을 나타낸다. RNA는 먼저 파라핀 제거된 보관 병리학 표본 또는 생검 표본에서 분리된다. 예시적인 파라핀 제거 방법은 파라핀화 표본을 예를 들어 자일렌과 같은 유기 용매로 세척하는 단계를 포함한다. 파라핀 제거 표본은 저급 알코올 수용액으로 재수화될 수 있다. 적당한 저급 알코올은 예를 들어 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올을 포함한다. 파라핀 제거 표본은 예를 들어 감소 농도의 저급 알코올 수용액으로 연속적인 세척으로 재수화된다. 또한 표본은 동시에 파라핀 제거 및 재수화된다. 이후 RNA가 표본에서 추출된다.
신선, 동결 또는 고정 표본 유래의 정제된 전체 mRNA로부터 ERCC1 mRNA의 정량은 바람직하게는 예를 들어 당분야의 일반적인 역전사효소 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR) 방법을 이용하여 수행된다. 또다른 ERCC1 mRNA 정량 방법은 예를 들어 분자 표지(beacon) 및 다중 PCR에 유용한 다른 표지 프로브의 이용을 포함한다. 또한 본 발명은 예를 들어 Invader Assay(Third Wave Technologies, Inc.)과 유사한 형광 표지 프로브를 이용한 PCR-프리 시스템의 이용을 통한 ERCC1 mRNA의 정량을 예상한다. 가장 바람직하게는 ERCC1 cDNA 및 내부 대조군 또는 하우스키핑(housekeeping) 유전자(예를 들어 β-액틴)의 정량은 형광 기반 실시간 검출 방법(ABI PRISM 7700 or 7900 Sequence Detection System [TaqMan], Applied Biosystems, Foster City, Calif.) 또는 Heid et al.,(Genome Res 1996; 6:986 994) 및 Gibson et al.(Genome Res 1996; 6:995 1001)에 기재된 유사한 시스템을 이용하여 수행된다. ABI 7700(TaqMan 기기)의 결과는 Ct 또는 "사이클 역치"로 표기된다. TaqMan 시스템으로 표본 내 많은 수의 타겟 분자를 지닌 높게 발현되는 유전자는 적은 타겟 분자를 지닌 낮은 상대 발현(높은 Ct)의 유전자보다 적은 PCR 사이클(낮은 Ct)을 지닌 신호를 생성한다.
본원에 사용된 "하우스키핑" 유전자 또는 "내부 대조군"은 그 존재가 타겟 mRNA 수치(ERCCl, TS, DPD, Her2-neu, Gst-pi, RRMl, Kras 등)의 평가를 가능하게 하는 구성적 또는 포괄적으로 발현되는 어떠한 유전자도 포함하고자 하는 것이다. 이러한 평가는 유전자 전사의 전체 구성적 수치의 측정 및 RNA 회수시 변동의 제어를 포함한다. "하우스키핑" 유전자 또는 "내부 대조군"은 사이클로필린 유전자, β-액틴 유전자, 트팬스페린 수용체 유전자, GAPDH 유전자 등을 포함할 수 있으나 이에 한정적인 것은 아니다. 가장 바람직하게는 Eads et al., Cancer Research 1999; 59:2302 2306에 기재된 바와 같이 내부 대조군 유전자는 β-액틴 유전자이다.
RNA 회수시 변동의 제어는 "교정기 RNA"의 이용을 필요로 한다. "교정기 RNA"는 정확하게 미리-정량된 대조군 RNA의 어떠한 이용 가능한 공급원이다. 바람직하게는 인간 간 전체 RNA(Stratagene, Cat. #735017)이 사용된다.
본원에 사용된 "보정되지 않은 유전자 발현(UGE)"은 TaqMan 기기에 의해 생성된 내부 대조군 유전자에 대한 타겟 유전자 발현의 숫자 결과를 나타낸다. ERCC1에 대한 UGE를 측정하는데 사용된 방정식은 실시예 6에 나타나 있고 도 12의 표본 계산에 나타나 있다.
본 발명의 또다른 관점은 TaqMan 기기로 획득된 보정되지 않은 유전자 발현(UGE) 수치를 비-TaqMan 기술에서 유래된 "알려진 상대 유전자 발현" 수치로 표준화하는 방법을 제공한다. 바람직하게는 알려진 비-TaqMan 유래 상대 ERCC1:β-액틴 발현 수치는 조직 표본에 유래의 TaqMan 유래 ERCC1 UGE 수치로 표준화된다.
본원에 사용된 "보정 상대 ERCC1 발현"은 UGE에 ERCC1 특이적 보정 인자(KERCC1)를 곱하여 내부 대조군 유전자에 대한 알려진 범위의 ERCC1 발현 수치에 비교될 수 있는 수치를 유발하는 표준화된 ERCC1 발현을 나타낸다. 실시예 6 및 도 12는 이들 계산을 상세하게 나타낸다. 이들 숫자 수치는 특정 표본의 "보정 상대 ERCC1 발현"이 "예정된 역치" 수치의 이상 또는 이하에 포함되는지 여부를 측정 가능하게 한다. β-액틴 수치에 대한 보정 상대 ERCC1 발현의 예정된 역치 수치는 약 6.7 x 10-3이다. ERCC1, 내부 대조군 β-액틴 및 교정기 인간 간 전체 RNA(Stratagene, Cat. #735017)에 특이적인 KERCC1은 1.54 x 10-3이다.
"알려진 상대 유전자 발현" 수치는 종전 분석된 조직 표본에서 유래하고 구성적으로 발현되는 내부 대조군 유전자(예를 들어 β-액틴, GAPDH 등)에 대한 타겟 유전자의 RT-PCR 신호 비율을 기반으로 한다. 바람직하게는 이러한 조직 표본은 포르말린 고정되고 파라핀-포매된(FPE) 표본이고 RNA는 본원에 기재된 방법에 따라 이들로부터 추출된다. 내부 대조군에 대한 유전자 발현을 정량하기 위해 당분야에 알려진 표준 정량적 RT-PCR 기술이 이용된다. pre-TaqMan 기술 PCR 반응이 고정된 사이클 횟수(즉 30)로 수행되고 종점 수치는 각 표본에 대해 보고된다. 이후 이들 수치는 β-액틴 발현에 대한 ERCC1 발현 비율로 보고된다. Reed et al.의 미국 특허등록 제5,705,336호 참조.
KERCC1은 β-액틴 이외의 내부 대조군 유전자 및/또는 인간 간 전체 RNA(Stratagene, Cat. #735017)과 다른 교정기 RNA에 대해서도 측정된다. 이를 수행하기 위해서는 특정 대조군 유전자에 대한 ERCC1 발현 수치가 이미 측정된 바 있는(즉 "알려진 상대 유전자 발현") 조직 표본에 대해 내부 대조군 유전자 및 교정기 RNA 모두를 계산해야 한다. 바람직하게는 이러한 조직 표본은 포르말린 고정되고 파라핀-포매된(FPE) 표본이고 RNA는 본원에 개시된 방법을 이용하여 추출된다. 이러한 측정은 당분야에 잘 알려진 표준 pre-TaqMan, 정량적 RT-PCR 기술을 이용하여 이루어진다. 이러한 측정시 이러한 표본은 실시예 6에 기재된 바와 같이 새로운 내부 대조군 및/또는 교정기 RNA에 특이적인 새로운 KERCC1을 측정하는데 유용한 ERCC1의 "알려진 상대 유전자 발현" 수치를 지닌다.
일반적으로 ERCC1 유전자 영역 측면에 위치한 어떠한 올리고뉴클레오타이드쌍도 본 발명의 방법을 수행하는데 이용된다. 엄격한 조건 하에서 본 발명에 사용하기 위한 ERCC1 유전자 영역과 혼성화하는 프라이머는 20∼1000 염기쌍, 바람직하게는 100∼400 염기쌍, 가장 바람직하게는 약 200∼400 염기쌍의 생성물을 증폭시킬 것이다.
본 발명은 FPE 조직 내에서 ERCC1 발현의 특히 정확한 평가를 가능하게 하는 특정한 올리고뉴클레오타이드 프라이머쌍 및 이에 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 제공한다. 바람직한 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 ERCCl-504F(서열번호: 1) 및 ERCC1-574R(서열번호: 2)(또한 본원에서 올리고뉴클레오타이드 프라이머쌍 ERRCC1로도 표기됨) 및 이에 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 포함한다. 올리고뉴클레오타이드 프라이머 ERCCl-504F(서열번호: 1) 및 ERCC1-574R(서열번호: 2)은 엄격한 조건 하에서 ERCC1 유전자와 혼성화하고, 어떠한 mRNA 분리 방법, 특히 본원에 개시된 방법에 의해 FPE 세포에서 추출된 RNA를 이용하여 ERCC1 mRNA를 측정하는데 특히 효과적인 것으로 나타났다.
본원에 사용된 핵산에서의 "실질적으로 동일한"은 엄격한 조건 하에서 타겟에 대한 혼성화를 의미하고, 또한 비교시 핵산 분절 또는 그의 상보적 스트랜드는 적당한 뉴클레오타이드 삽입 및 결실과 적당하게 정렬되는 경우 약 60% 이상의 뉴클레오타이드, 일반적으로 약 70%, 더욱 일반적으로는 약 80% 이상, 일반적으로는 약 90% 이상 및 더욱 일반적으로는 약 95 내지 98% 이상의 뉴클레오타이드로서 동일하다. 혼성화가 특이성 전체 부재보다 더욱 선택적인 경우 선택적 혼성화가 존재한다. Kanehisa, Nucleic Acids Res., 12:203 213 (1984) 참조.
본 발명은 엄격한 조건 하에서 ERCCl-504F(서열번호: 1), 그의 상보체 또는 ERCC1-574R(서열번호: 2) 또는 그의 상보체의 올리고뉴클레오타이드 프라이머 서열의 전부 또는 일부에 혼성화하는 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
엄격한 혼성화 조건 하에서 높게 상보적인 즉 실질적으로 유사한 핵산 서열만이 혼성화된다. 바람직하게는 이러한 조건은 20개 인접 뉴클레오타이드 중 4개 이상의 미스매치, 더욱 바람직하게는 20개 인접 뉴클레오타이드 중 2개 이상의 미스매치, 가장 바람직하게는 20개 인접 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 미스매치를 지닌 핵산의 혼성화를 방지한다.
핵산의 혼성화 부분은 일반적으로 약 10개(예를 들어 15) 뉴클레오타이드 길이이다. 혼성화 핵산의 혼성화 부분은 본원에 제공된 올리고뉴클레오타이드 프라이머 또는 그의 상보체의 일부 또는 전부의 서열에 약 80% 이상, 바람직하게는 약 95% 이상, 가장 바람직하게는 약 98% 이상 동일하다.
엄격한 조건 하에서 핵산 표본으로의 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 혼성화는 하기에 정의된다. 핵산 이중가닥 또는 하이브리드 안정성은 프로브가 타겟 DNA로부터 해리되는 온도인 녹는점(Tm)으로 표기된다. 이러한 녹는점은 필요한 엄격한 조건을 정의하는데 이용된다. 서열이 프로브와 동일하다기 보다는 실질적으로 동일한 것으로 확인되어야 하는 경우 상동적 혼성화가 특정 염 농도(예를 들어 SSC 또는 SSPE)에서 발생하는 최하 온도를 먼저 수립하는 것이 유용하다. 이후 1% 미스매치가 Tm 1℃ 감소를 유발한다고 가정하여 혼성화 반응시 최종 세척 온도는 그에 따라 감소된다(예를 들어 프로브와 >95% 동일성을 지니는 서열이 조사되는 경우 최종 세척 온도는 5℃까지 감소됨). 실제로 Tm 변화는 1% 미스매치 당 0.5℃ 내지 1.5℃가 될 수 있다.
엄격한 조건은 5xSSC/5x Denhart 용액/1.0% SDS 내 68℃의 혼성화 및 실온에서 0.2xSSC/0.1% SDS 내 세척을 포함한다. 적당히 엄격한 조건은 42℃에서 3xSSC 내 세척을 포함한다. 염 농도 및 온도 파라미터는 프라이머와 타겟 핵산간의 최적 동일성 수치를 달성하도록 변경된다. 이러한 조건에 대한 추가적인 안내는 예를 들어 Sambrook, Fischer and Maniatis, Molecular Cloning, a laboratory manual, (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, (1989) 및 F. M. Ausubel et al eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons (1994)와 같이 당분야에서 용이하게 이용 가능하다.
본원에 개시된 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 동결 또는 신선 조직뿐만 아니라 고정된 또는 고정되고 파라핀 포매된 조직에서 ERCC1 유전자 발현의 정확한 평가를 가능하게 한다. 이는 FPE 표본 유래 RNA가 신선하거나 동결된 조직에 비해 더욱 단편화된다는 사실에도 불구한 것이다. 따라서 본 발명의 방법은 종전에는 고정 조직을 이용하여 ERCC1 유전자 발현을 분석하는 방법이 존재하지 않았으나 FPE 조직 내 ERCC1 발현 수치를 분석하는데 적당하다.
종양 내 존재하는 ERCC1 mRNA 양 측정으로부터 당업자는 특정한 제노톡신(genotoxin)에 대한 종양의 임상적 내성 또는 제노톡신이 투여된 환자의 생존능에 관한 예지할 수 있다. 예시적인 백금-기반 화학요법 또는 유사한 형태의 DNA 손상을 유도하는 화학요법은 제노톡신이다.
백금-기반 화학요법제는 DNA의 "거대 부가물"을 유발하고, 일차적인 효과는 이중 헬릭스의 3-차원 구조를 왜곡시키는 것이다. 이러한 화합물은 단독으로 또는 젬시타빈(Gem) 또는 5-플루오로우라실(5-FU)과 같은 다른 화학요법제와 함께 투여된다.
백금-기반 유전자독성 화학요법제는 공유결합 DNA 부가물을 형성하는 중금속 공동작용 화합물을 포함한다. 일반적으로 이들 중금속 화합물은 DNA에 공유결합으로 결합하여 적절한 부분에서 시스-1,2-인트라스트랜드 디뉴클레오타이드 부가물을 형성한다. 일반적으로 이러한 부류는 시스-디아민디클로로백금(Ⅱ)(시스플라틴)으로 대표되고 시스-디아민-(l,l-사이클로부탄디카르복시레이토) 백금(Ⅱ) (카르보플라틴), 시스-디아미노-(l,2-사이클로헥실) 디클로로백금(Ⅱ) 및 시스-(l,2-에틸렌디아민) 디클로로백금(Ⅱ)을 포함한다. 백금 1차 약제는 전술된 어떠한 대표적인 화합물의 유사체 또는 유도체를 포함한다.
현재 백금 공동작용 화합물에 의해 관리 가능한 종양은 수모세포종 및 신경모세포종과 함께 고환, 자궁내막, 자궁경부, 위, 편평세포, 부신피질 및 소세포 폐 암종을 포함한다. 트랜스-디아민디클로로백금(Ⅱ)(트랜스-DDP)은 그의 DNA 부가물의 신속한 복구로 인해 임상적으로 무익하다. 본원에서 화학요법제로서 트랜스-DDP의 이용은 비선택 세포 내 낮은 독성 및 선택 세포 내 높은 상대 독성을 지닌 화합물을 제공한다. 바람직한 실시태양에서 백금 화합물은 시스플라틴이다.
일반적으로 많은 화합물은 백금-기반 화학요법제와 함께 제공된다. 예를 들어 BEP(블레오마이신, 에토포사이드, 시스플라틴)는 방광암에 사용되고, MVP(미토마이신 C, 빈블라스틴, 시스플라틴)은 비-소세포 폐암 치료에 사용된다. 예를 들어 치료 약물 상승작용은 백금-기반 화학요법에 잠재적으로 포함된 많은 약물에 대해 보고된 바 있다. 이에 대한 최근 참고문헌의 매우 짧은 리스트는 하기를 포함한다: Okamoto et al, Urology 2001; 57:188-192.; Tanaka et al., Anticancer Research 2001; 21:313-315; Slamon et al., Seminars in Oncology 2001; 28:13-19; Lidor et al., Journal of Clinical Investigation 1993; 92:2440-2447; Leopold et al., NCI Monographs 1987; 99-104; Ohta et al., Cancer Letters 2001; 162:39-48; van Moorsel et al., British Journal of Cancer 1999; 80:981-990.
또다른 유전자독성 약제는 지속성 게놈 손상을 형성하고 암의 임상적 관리시 화학요법제로 사용하는 것이 바람직한 것이다. 세포 분열 사이클을 통한 세포 성장 속도뿐만 아니라 제노톡신-유도 DNA 손상의 세포성 복구 속도는 제노톡신 치료 결과에 영향을 미친다. 세포의 게놈 내 복구되지 않은 손상은 DNA 복제를 방해하거나 새로이 합성된 DNA의 복제 정확도를 손상시키거나 세포 생존에 필요한 유전자 발현을 저지시킨다. 따라서 유전자독성 약제의 세포독성의 하나의 결정 인자는 세포성 복구에 대한 그로부터 형성된 게놈 손상의 내성이다. 지속성 게놈 손상 예를 들어 적어도 세포가 세포 주기에 인도될 때까지 게놈 내에 존재하는 손상을 형성하는 유전자독성 약제는 일반적으로 일시적이고 용이하게 복구되는 게놈 손상을 형성하는 약제보다 더욱 효과적인 세포독소이다.
많은 암을 치료하는데 사용되고 ERCC1 발현 수치에 의해 영향 받는 일반적인 종류의 유전자독성 화합물은 DNA 알킬화제 및 DNA 중격제이다. 소랄렌(Psoralen)은 건선, 백반증, 진균성 감염 및 피부 T 세포 림프종과 같은 피부 질환의 광화학요법 치료에 유용한 것으로 알려진 유전자독성 화합물이다(Harrison's Principles of Internal Medicine, Part 2 Cardinal Manifestations of Disease, Ch. 60(12th ed. 1991)). DNA를 알킬화하거나 그 안에 삽입될 수 있는 또다른 일반적인 종류의 유전자독성 화합물은 합성적 및 자연발생적 항생제를 포함한다. 특히 본원의 관심사는 항신생물 항생제이고, 이는 하기 화합물 종류를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다: 암사크린; 블레오마이신; 카르미노마이신(카루비신), 다우노마이신(다우노루비신) 또는 14-하이드록시다우노마이신(아드리아마이신 또는 독소루비신); 미토마이신 A, B 또는 C; 미톡산트론; 플리카마이신(미트라마이신) 등.
일반적으로 사용되고 DNA를 알킬화하는 또다른 일반적인 종류의 유전자독성 약제는 할로에틸니트로소우레아, 특히 클로로에틸니트로소우레아를 포함한다. 이러한 광범한 종류의 대표적인 일원은 카무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무수틴 및 스트렙토조토신을 포함한다. 할로에틸니트로소우레아 1차 약제는 전술된 어떠한 대표적인 화합물의 유사체 또는 유도체도 될 수 있다.
DNA를 알킬화하는 또다른 일반적인 종류의 유전자독성 약제는 황 및 질소 머스타드를 포함한다. 이들 화합물은 구아닌의 N7 원자에서 공유결합 부가물을 형성함으로서 주로 DNA를 손상시킨다. 이러한 광범한 종류의 대표적인 일원은 클로람부실, 사이클로포스파마이드, 이로스파마이드, 멜팔란, 메클로로에타민, 노벰비신, 트로포스파마이드 등을 포함한다. 게놈 손상의 좌위로서 하나 이상의 미리 한정된 게놈 타겟을 선택하는 것이 바람직한 경우 선택된 세포 게놈 내 특정 서열과 공유결합 또는 비공유결합으로 상호작용하는 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 유사체도 유전자독성 약제로 사용될 수 있다. DNA를 알킬화하는 또다른 종류의 약제는 에틸렌이미딘 및 메틸멜라민을 포함한다. 이들 종류는 예를 들어 알트레타민(헥사메틸멜라민), 트리에틸렌포스포르아마이드(TEPA), 트리에틸렌티오포스포르아마이드(ThioTEPA) 및 트리에틸렌멜라민을 포함한다.
DNA 알킬화제의 또다른 종류는 부설판으로 대표되는 알킬 설포네이트; 벤조데파로 대표되는 아지니딘; 및 예를 들어 미토구아존, 미톡산트론 및 프로카바진으로 대표되는 또다른 것을 포함한다. 이들 종류 각각은 각각의 대표적인 화합물의 유사체 및 유도체를 포함한다.
DPD
본 발명자들은 조직 내에서 DPD 발현의 정확한 평가를 가능하게 하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 개시한다. 이들 올리고뉴클레오타이드 프라이머 DPD3a-51F(서열번호: 5) 및 DPD3a-134R(서열번호: 6)(본원에서 올리고뉴클레오타이드 프라이머쌍 DPD3 A로도 표기됨) 및 올리고뉴클레오타이드 프라이머 DPD3b-65 IF(서열번호: 7) 및 DPD3b-736R(서열번호: 8)(본원에서 올리고뉴클레오타이드 프라이머쌍 DPD3B로도 표기됨)(참고문헌으로 포함된 미국 특허등록 제7,005,278호 참조)은 고정 파라핀 포매(FPE) 종양 표본 내 DPD 유전자 발현을 측정하는데 사용하는 경우 특히 효과적이다.
본 발명은 엄격한 조건 하에서 DPD3A-51F(서열번호: 5), 그의 상보체, DPD3A-134R(서열번호: 6) 또는 그의 상보체의 올리고뉴클레오타이드 프라이머 서열의 전부 또는 일부에 혼성화하는 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 더욱이 본 발명은 엄격한 조건 하에서 DPD3b-651F(서열번호: 7), 그의 상보체, DPD3b-736R(서열번호: 8) 또는 그의 상보체의 올리고뉴클레오타이드 프라이머 서열의 전부 또는 일부에 혼성화하는 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오타이드도 포함한다.
핵산의 혼성화 부분은 일반적으로 약 10개(예를 들어 15) 뉴클레오타이드 길이이다. 혼성화 핵산의 혼성화 부분은 DPD3A-51F(서열번호: 5), 그의 상보체, DPD3A-134R(서열번호: 6) 또는 그의 상보체 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 일부 또는 전부의 서열에 약 80% 이상, 바람직하게는 약 95% 이상, 가장 바람직하게는 약 98% 이상 동일하다. 또한 혼성화 핵산의 혼성화 부분은 DPD3b-651F(서열번호: 7), 그의 상보체, DPD3b-736R(서열번호: 8) 또는 그의 상보체 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 일부 또는 전부의 서열에 약 80% 이상, 바람직하게는 약 95% 이상, 가장 바람직하게는 약 98% 이상 동일하다.
본 발명의 이러한 관점은 본원에 기재된 방법을 이용한 FPE 표본으로부터의 RNA의 확실한 추출방법의 이용 및 두 번째로 역전사효소 중합효소 연쇄 반응을 수행하기 위한 올리고뉴클레오타이드 프라이머쌍 DPD3A(DPD3a-51F(서열번호: 5) 및 DPD3a-134R(서열번호: 6)) 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오타이드 또는 DPD3B(DPD3b-65 IF(서열번호: 7) 및 DPD3b-736R(서열번호: 8)) 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오타이드를 이용한 표본 내 DPD mRNA 함량 측정법을 포함한다. 1999년 12월 20일 출원되고 참고문헌으로 분원에 포함된 미국 특허출원 제09/469,338호 참조.
DPD mRNA 발현은 5-FU-기반 화학요법에 대한 임상적 내성과 상호관련된다. 특히 높은 수치의 DPD mRNA 발현은 5-FU-기반 화학요법에 대한 내성과 상호관련된다.
본 발명의 방법은 광범위한 종양 타입에 응용된다. 이는 개별적인 "종양 발현 프로파일"의 준비를 가능하게 하여 DPD 발현 수치가 개별적인 환자 표본에서 측정되고 다양한 화학요법제에 대한 반응이 예측될 수 있다. 가장 바람직하게는 본 발명의 방법은 기관지폐포, 소장 또는 결장 종양에 응용된다. 특정 종양 타입으로의 본 발명의 일부 실시태양의 응용을 위해, 측정된 특정 DPD 발현 파라미터와 5-FU-기반 화학요법에 대한 임상적 내성간의 상관관계의 데이터-세트를 수집함으로서 임상적 내성에 대한 관계 측정을 확인하는 것이 바람직하다.
본 방법은 어떠한 타입의 종양에도 응용될 수 있다. 예를 들어 종양 조직의 내성 조사를 위해 종양 조직을 조사하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 종양이 수득된 환자 유래의 정상 조직 일부도 조사하는 것이 바람직하다. 정상 조직이 5-FU-기반 화합요법 화합물에 내성적이나 종양은 이러한 화합물에 민감할 것으로 예측되는 환자는 높은 함량의 화학요법 조성물로 치료된다.
본 발명의 방법은 환자 종양 유래의 세포 표본을 수득하는 단계를 포함한다. 고형 또는 림프구 종양 또는 그의 일부는 환자에서 외과적으로 절제된다. 이러한 절제 후 신속하게 조직 표본에서 RNA를 추출하는 것이 불가능한 경우 표본은 고정되거나 동결된다. 이후 RNA를 수득하는데 이용될 것이다. 절제된 조직의 동결 또는 신선 조직에서 추출되고 분리된 RNA는 예를 들어 Sambrook, Fischer and Maniatis, Molecular Cloning, a laboratory manual,(2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(1989)과 같은 당분야에 알려지 어떠한 방법으로도 추출된다. 바람직하게는 추출 과정 동안 RNA의 분해를 방지하고자 하는 주의가 이루어진다.
또한 환자에서 수득된 조직은 바람직하게는 예를 들어 포르말린(포름알데하이드) 또는 글루테르알데하이드에 의해 고정된다. 알코올 침지에 의해 고정된 생물학적 표본도 본 발명에서 고려된다. 고정된 생물학적 표본은 탈수되고 파라핀 또는 당업자에게 알려진 다른 고형 지지제 내에 포매된다. 이러한 고형 지지제는 유기 용매로 제거 가능할 것으로 예상되고 보존 조직의 후속 재수화를 가능하게 한다. 본원에 기재된 고정되고 파라핀-포매된(FPE) 조직 표본은 저장 가능하거나 보관 조직 표본이다. RNA는 본원에 기재된 어떠한 방법에 의해서도 FPE 세포로부터 추출된다.
신선, 동결 또는 고정 조직 유래의 정제된 전체 RNA로부터 DPD mRNA의 정량은 바람직하게는 예를 들어 당분야에서 통상적인 역전사효소 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR) 방법을 이용하여 수행된다. 또다른 DPD mRNA 정량 방법은 예를 들어 분자 표지 및 다중 PCR에 유용한 다른 표지 프로브의 이용을 포함한다. 또한 본 발명은 예를 들어 Invader Assay(Third Wave Technologies, Inc.)과 유사한 형광 표지 프로브를 이용한 PCR-프리 시스템의 이용을 통한 DPD mRNA의 정량을 예상한다. 가장 바람직하게는 DPD cDNA 및 내부 대조군 또는 하우스키핑 유전자(예를 들어 β-액틴)의 정량은 형광 기반 실시간 검출 방법(ABI PRISM 7700 or 7900 Sequence Detection System [TaqMan], Applied Biosystems, Foster City, Calif.) 또는 Heid et al.,(Genome Res 1996; 6:986 994) 및 Gibson et al.(Genome Res 1996; 6:995 1001)에 기재된 유사한 시스템을 이용하여 수행된다. ABI 7700(TaqMan 기기)의 결과는 Ct 또는 "사이클 역치"로 표기된다. TaqMan 시스템으로 표본 내 많은 수의 타겟 분자를 지닌 높게 발현되는 유전자는 적은 타겟 분자를 지닌 낮은 상대 발현(높은 Ct)의 유전자보다 적은 PCR 사이클(낮은 Ct)을 지닌 신호를 생성한다.
본 발명의 하나의 관점은 DPD mRNA의 상대 함량은 화학요법제 5-FU에 대한 내성과 상호관련된다는 발견에 일부 포함된다. 본원에서 높은 수치의 DPD mRNA를 발현하는 종양은 5-FU에 내성적인 것으로 나타났다. 반대로 낮은 양의 DPD mRNA를 발현하는 종양은 5-FU에 민감한 것으로 판단된다. 환자의 종양 DPD mRNA 발현은 이를 DPD 발현의 예정된 역치 발현 수치와 비교함으로서 판단된다.
DPD와 관련하여 본원에 사용된 "보정되지 않은 유전자 발현(UGE)"은 TaqMan 기기에 의해 생성된 내부 대조군 유전자에 대한 DPD 발현의 숫자 결과를 나타낸다. UGE를 측정하는데 사용된 방정식은 실시예 8에 나타나 있고 도 15의 표본 계산에 나타나 있다.
본 발명의 또다른 관점은 TaqMan 기기로부터 수득된 보정되지 않은 유전자 발현(UGE) 수치를 비-TaqMan 기술에서 유래된 종전 공개된 상대 유전자 발현 수치로 표준화하는 방법을 제공한다. 바람직하게는 비-TaqMan 유래 상대 DPD : 그 전체가 참고문헌으로 포함된 Salonga, et al., Clinical Cancer Research, 6:1322-1327, 2000에 종전 공개된 β-액틴 발현 수치는 표본 조직 유래 DPD UGE로 표준화된다.
본원에 사용된 "보정 상대 DPD 발현"은 UGE에 DPD 특이적 보정 인자(KDPD)를 곱하여 종전 공개된 수치 범위와 비교될 수 있는 수치를 유발하는 표준화된 DPD 발현을 나타낸다. 도 15는 이들 계산을 상세하게 나타낸다.
"종전 공개된" 상대 유전자 발현은 구성적으로 발현되는 유전자(β-액틴)에 대한 타겟 유전자의 RT-PCR 신호 비율을 기반으로 한다. pre-TaqMan 기술 연구에서 PCR 반응은 고정된 사이클 횟수(즉 30)로 수행되고 종점 수치가 각 표본에 대해 보고되었다. 이후 이들 수치는 β-액틴 발현에 대한 DPD 발현 비율로 보고되었다. 그 전체가 참고문헌으로 포함된 Salonga, et al, Clinical Cancer Research, 6:1322-1327, 2000 참조.
상대 DPD 발현의 "예정된 역치 수치"는 종양이 5-FU 기반 화학요법에 내성인 것으로 판단되는 것 이상의 DPD 발현 수치이다. 이러한 역치 수치 이하의 발현 수치는 5-FU에 민감한 종양에서 발견되는 것으로 판단된다. 5-FU 기반 화학요법에 반응하는 종양 중 상대 DPD 발현 범위는 약 0.6 x 10-3 내지 약 2.5 x 10-3(약 4.2-배 범위) 이하이다. 5-FU 기반 화학요법에 반응하지 않는 종양은 약 0.2 x l0-3 내지 약 16 x lO-3(약 80-배 범위)의 상대 DPD 발현을 지닌다. 일반적으로 약 2.0 x 10-3 이상, 바람직하게는 약 2.5 x 10-3 이상의 상대 DPD 발현이 존재하는 경우 종양은 5-FU 치료에 반응하지 않는다. 이들 숫자 수치는 특정 표본의 "보정 상대 DPD 발현"이 "예정된 역치" 수치의 이상 또는 이하에 포함되는지 여부를 측정 가능하게 한다. 보정 상대 DPD 발현 수치의 역치 수치는 약 2.O x 1O-3 내지 약 2.5 x 10-3이다.
본 발명의 방법은 광범위한 조직 및 종양 타입에 응용되고 따라서 환자의 치료 평가 및 유방암, 두경부암, 폐암, 식도암, 대장암을 포함한 광범한 암의 진단 또는 예후 도구로서 이용될 수 있다. 바람직하게는 본 방법은 기관지폐포암, 소장암 또는 결장암의 예후에 응용된다.
종양에서 발현되는 DPD mRNA 양의 측정으로부터 해당 의사는 5-FU-기반 화학요법에 대한 종양의 임상적 내성에 관해 예측할 수 있다. "5-FU-기반 화학요법"은 5-FU, 그의 유도체의 단독 또는 루코보린과 같은 다른 화학요법제 또는 우라실, 5-에티닐우라실, 브로모비닐우라실, 티민, 벤질옥시벤질우라실(BBU) 또는 5-클로로-2,4-디하이드록시피리딘과 같은 DPD 저해제와 동시 투여를 포함한다. 더욱이 식(Ⅰ)의 5'-데옥시-사이티딘 유도체와 5-FU 또는 그의 유도체와의 동시-투여는 5-FU 또는 그의 유도체와 DPD 저해제 5-에티닐우라실과의 투여와 비교시 종양 조직에 선택적인 화학요법제의 전달을 유의적으로 개선시키고 인간 암 이종이식 모델 내 유의적으로 개선된 항종양 활성을 나타내는 것으로 나타났다.
ERCC1/TS
본 발명은 TS 및 ERCC1 mRNA의 함량이 각각 5-FU 및 옥살리플라틴 약제에 대한 내성과 상호관련된다는 발견에 일부 포함된다. 높은 수치의 TS 및 ERCC1 mRNA를 발현하는 종양은 백금-기반 화학요법에 내성적인 것으로 간주된다. 반대로 낮은 함량의 TS 및 ERCC1 mRNA를 발현하는 종양은 백금-기반 화학요법에 민감한 것으로 판단된다. 환자의 종양 TS 및 ERCC1 mRNA 발현 상태는 이를 예정된 역치 발현 수치와 비교함으로서 판단된다.
본 발명은 내부 대조군의 유전자 발현에 대한 고정되거나 고정되고 파라핀-포매된(FPE) 조직 내 TS 및 ERCC1 mRNA 발현량의 정량 방법을 제공한다. 상기 논의된 ERCC1 프라이머 이외에 본 발명자들은 고정되거나 고정되고 포매된 조직에서 TS 유전자 발현의 정확한 평가를 가능하게 하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 개발하였다. 또한 본 발명은 바람직하게는 고정되고 파라핀 포매된(FPE) 종양 표본에서 추출된 RNA와 함께 사용되는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 TS-763F(서열번호: 9), TS-825R(서열번호: 10) 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오타이드를 제공한다. 참고문헌으로 포함된 미국 특허등록 제7,049,059호 참조. 이러한 TS 및 ERCC1 유전자 발현 측정은 백금-기반 화학요법의 예후에 사용된다.
본 발명의 이러한 실시태양은 첫 번째로 본원에 기재된 FPE 표본으로부터 RNA의 확실한 추출 방법, 두 번째로 역전사효소 중합효소 연쇄 반응을 수행하기 위한 상기 기재된 한 쌍의 ERCC1 및 TS 올리고뉴클레오타이드 프라이머 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오타이드를 이용한 표본 내 TS 및 ERCC1 mRNA 함량 측정법을 포함한다.
본 방법은 환자 유래의 어떠한 형태의 조직에도 응용될 수 있다. 종양 조직의 내성 조사를 위해 종양 조직을 조사하는 것이 바람직하다. 바람직한 실시태양에서 종양이 수득된 환자 유래의 정상 조직 일부도 조사된다. 이후 정상 조직은 백금-기반 화학요법 화합물에 대해 내성을 지닌 것으로 예측되는 즉 높은 수치의 TS 및 ERCC1 유전자 발현을 나타내나 종양은 이러한 화합물에 민감한 것으로 예측되는 즉 낮은 수치의 TS 및 ERCC1 유전자 발현을 나타내는 환자는 높은 함량의 화학요법 조성물로 치료된다.
본 발명의 방법은 광범위한 종양 타입에 응용될 수 있다. 이는 개별적인 "종양 발현 프로파일"의 준비를 가능하게 하여 TS 및/또는 ERCC1 발현 수치가 개별적인 환자 표본에서 측정되고 다양한 화학요법제에 대한 반응이 예측될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 방법은 고형 종양, 바람직하게는 대장 암종 종양에 응용된다.
TS와 관련하여 본원에서 한정된 "예정된 역치 수치"는 종양이 5-FU 및 5-FU 및 옥살리플라틴-기반 화학요법에 내성인 것으로 판단되는 것 이상의 TS 발현 수치이다. 이러한 역치 수치 이하의 발현 수치는 5-FU 또는 5-FU 및 옥살리플라틴-기반 화학요법에 민감한 종양에서 발견되는 것으로 판단된다. 5-FU 또는 5-FU 및 옥살리플라틴-기반 화학요법에 반응하는 종양 중 TS:β-액틴의 비율로 표기되는 상대 TS 발현 범위는 약 7.5 x 10-3 이하이다. 5-FU 또는 5-FU 및 옥살리플라틴-기반 화학요법에 반응하지 않는 종양은 약 7.5 x 10-3 이상의 TS:β-액틴 비율의 상대 발현을 지닌다.
본 발명의 방법 수행시 5-FU 및 옥살리플라틴-기반 화학요법의 효능을 예측하기 위해 ERCC1 발현 수치 및 TS 발현 수치가 환자 종양 표본에서 평가된다. 더욱이 본 발명의 방법에서 5-FU 기반 화학요법의 효능을 예측하기 위해 TS 발현 수치가 환자 종양 표본에서 평가된다. 또한 본 발명의 방법에서 옥살리플라틴 기반 화학요법의 효능을 예측하기 위해 ERCC1 발현 수치가 환자 종양 표본에서 평가된다. 또한 5-FU 및 옥살리플라틴-기반 병용 화학요법의 효능을 예측하기 위해 단지 TS 발현 수치만이 환자 종양 표본에서 평가된다.
본 발명의 이러한 실시태양의 방법을 수행시 종양 세포는 바람직하게는 환자에서 분리된다. 고형 또는 림프구 종양 또는 그의 일부는 환자에서 외과적으로 절제되거나 통상의 생검에 의해 수득된다. 동결 또는 신선 표본에서 분리된 RNA는 예를 들어 Sambrook, Fischer and Maniatis, Molecular Cloning, a laboratory manual(2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(1989)와 같은 당분야에 일반적인 어떠한 방법에 의해서도 세포로부터 추출된다. 바람직하게는 추출 과정 동안 RNA 분해를 방지하는 주의가 이루어진다.
RNA는 상기 기재된 어떠한 방법에 의해서도 FPE 세포로부터 추출된다. 신선, 동결 또는 고정 조직 유래의 정제된 전체 mRNA로부터 TS 및 ERCC1 mRNA의 정량은 바람직하게는 예를 들어 당분야에 통상적인 역전사효소 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR) 방법을 이용하여 수행된다. 또다른 TS 또는 ERCC1 mRNA 정량 방법은 예를 들어 분자 표지 및 다중 PCR에 유용한 또다른 표지 프로브의 이용을 포함한다. 또한 본 발명은 예를 들어 Invader Assay(Third Wave Technologies, Inc.)과 유사한 형광 표지 프로브를 이용한 PCR-프리 시스템의 이용을 통한 TS 및/또는 ERCC1 mRNA의 정량을 예상한다. 가장 바람직하게는 TS 및/또는 ERCC1 cDNA 및 내부 대조군 또는 하우스키핑 유전자(예를 들어 β-액틴)의 정량은 형광 기반 실시간 검출 방법(ABI PRISM 7700 or 7900 Sequence Detection System [TaqMan], Applied Biosystems, Foster City, Calif.) 또는 Heid et al.,(Genome Res 1996; 6:986 994) 및 Gibson et al.(Genome Res 1996; 6:995 1001)에 기재된 유사한 시스템을 이용하여 수행된다. ABI 7700(TaqMan 기기)의 결과는 Ct 또는 "사이클 역치"로 표기된다. TaqMan 시스템으로 표본 내 많은 수의 타겟 분자를 지닌 높게 발현되는 유전자는 적은 타겟 분자를 지닌 낮은 상대 발현(높은 Ct)의 유전자보다 적은 PCR 사이클(낮은 Ct)을 지닌 신호를 생성한다.
본원에 사용된 "보정되지 않은 유전자 발현(UGE)"은 TaqMan 기기에 의해 생성된 내부 대조군 유전자에 대한 TS 및/또는 ERCC1 발현의 숫자 결과를 나타낸다. UGE를 측정하는데 사용된 방정식은 실시예 10 및 11에 나타나 있고 도 23 및 24의 표본 계산에 나타나 있다.
본원에 사용된 "보정 상대 DPD 발현"은 UGE에 TS 특이적 보정 인자(KTS)를 곱하여 내부 대조군 유전자에 대한 알려진 TS 발현 수치 범위와 비교될 수 있는 수치를 유발하는 표준화된 TS 발현을 나타낸다. 실시예 10 및 도 24는 이들 계산을 상세하게 나타낸다. 이들 숫자 수치는 특정 표본의 "보정 상대 TS 발현"이 "예정된 역치" 수치 이상 또는 이하에 포함되는지 여부를 측정 가능하게 한다. β-액틴 수치에 대한 보정 상대 TS 발현의 예정된 역치 수치는 약 7.5 x 10-3이다. TS, 내부 대조군, β-액틴 및 교정기 Universal PE RNA; Applied Biosystems의 Cat #4307281, lot #3617812014에 특이적인 KTS는 12.6 x 10-3이다.
KTS는 β-액틴 이외의 내부 대조군 유전자 및/또는 Universal PE RNA; Applied Biosystems의 Cat #4307281, lot #3617812014와 다른 교정기 RNA에 대해서도 측정된다. 이를 수행하기 위해서는 특정 대조군 유전자에 대한 TS 발현 수치가 이미 측정된 바 있는(즉 "알려진 상대 유전자 발현" 또는 "종전 공개된") 조직 표본에 대해 내부 대조군 유전자 및 교정기 RNA 모두를 계산해야 한다. 바람직하게는 이러한 조직 표본은 포르말린 고정되고 파라핀-포매된(FPE) 표본이고 RNA는 본원에 개시된 방법을 이용하여 추출된다. 이러한 측정은 당분야에 잘 알려진 표준 pre-TaqMan, 정량적 RT-PCR 기술을 이용하여 이루어진다. 이러한 측정시 이러한 표본은 실시예 10에 기재된 바와 같이 새로운 내부 대조군 및/또는 교정기 RNA에 특이적인 새로운 KTS를 측정하는데 유용한 TS의 "알려진 상대 유전자 발현" 수치를 지닌다.
"종전 공개된" 상대 유전자 발현은 구성적으로 발현되는 유전자(β-액틴)에 대한 타겟 유전자의 RT-PCR 신호 비율을 기반으로 한다. pre-TaqMan 기술 연구에서 PCR 반응은 고정된 사이클 횟수(즉 30)로 수행되고 종점 수치가 각 표본에 대해 보고되었다. 이후 이들 수치는 β-액틴 발현에 대한 ERCC1 또는 TS 발현 비율로 보고되었다. 그 전체가 참고문헌으로 포함된 Salonga, et al, Clinical Cancer Research, 6:1322-1327, 2000 참조.
본 발명의 방법은 광범위한 조직 및 종양 타입에 응용되고 따라서 환자의 치료 평가 및 유방암, 두경부암, 폐암, 식도암, 대장암을 포함한 광범한 암의 진단 또는 예후 도구로서 이용될 수 있다. 바람직한 실시태양에서 본 방법은 대장 암종의 예후에 응용된다.
전-화학요법 처리 종양 생검은 일반적으로 극소량의 이질성 조직만을 포함하는 고정 파라핀 포매(FPE) 조직으로만 이용 가능하다. 이러한 FPE 표본은 용이하게 현미해부되어 TS 및 ERCC1 유전자 발현이 기질 조직으로 오염되지 않은 종양 조직에서 측정된다. 더욱이 이러한 표본은 두 타입의 조직을 모두 포함하기 때문에 생검 조직 표본 내 기질 조직과 종양 조직 사이의 비교가 이루어질 수 있다.
TS 유전자 영역 측면에 위치한 어떠한 올리고뉴클레오타이드쌍도 본 발명의 방법을 수행하는데 이용된다. 본 발명에 이용하기 위한 엄격한 조건 하에서 TS 유전자 영역에 혼성화하는 프라이머는 20∼1000개 염기쌍, 바람직하게는 100∼400개 염기쌍, 가장 바람직하게는 200∼400개 염기쌍의 생성물을 증폭시킬 것이다.
HER2-neu/EGFR
높은 수치의 HER2-neu 및/또는 EGFR mRNA를 발현하는 종양은 수용체 티로신 키나제 타겟된 화학요법에 민감할 것으로 판단된다. 반대로 낮은 양의 HER2-neu 및 EGFR mRNA를 발현하는 종양은 수용체 티로신 키나제 타겟된 화학요법에 민감하지 않을 것으로 판단된다. 환자의 차별적 HER2-neu 및 EGFR mRNA 발현 상태는 예정된 역치 발현 수치와 이를 비교함으로서 판단된다.
본 발명은 내부 대조군의 유전자 발현에 대한 신선, 동결, 고정 또는 고정되고 파라핀-포매된(FPE) 조직 내 HER2-neu 및/또는 EGFR mRNA 발현량의 정량 방법을 제공한다. 본 발명자들은 신선, 동결, 고정 또는 고정되고 포매된 조직에서 HER2-neu 및/또는 EGFR 유전자 발현의 정확한 평가를 가능하게 하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 개발하였다. 바람직하게는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 EGFR-1753F(서열번호: 11), EGFR-1823R(서열번호: 12) 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오타이드는 신선, 동결, 고정 또는 고정되고 포매된(FPE) 종양 표본에서 추출된 RNA와 함께 사용된다. 또한 본 발명은 바람직하게는 신선, 동결, 고정 또는 고정되고 포매된(FPE) 종양 표본에서 추출된 RNA와 함께 사용되는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 HER2-neu 2671F(서열번호: 13), HER2-neu 2699R(서열번호: 14)(참고문헌으로 포함된 미국 특허등록 제6,582,919호 참조) 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오타이드를 제공한다. 이러한 HER2-neu 및/또는 EGFR 유전자 발현 측정은 수용체 티로신 키나제 타겟된 화학요법의 예후에 사용된다.
본 발명의 이러한 실시태양은 신선, 동결, 고정 또는 FPE 표본으로부터 RNA의 확실한 추출 방법 및 본원에 기재된 방법을 이용하고 한 쌍의 올리고뉴클레오타이드 프라이머 HER2-neu 2671F(서열번호: 13), HER2-neu 2699R(서열번호: 14) 또는 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 이용한 표본 내 HER2-neu mRNA 함량 측정 방법을 포함한다.
본 발명의 방법은 광범위한 종양 타입에 응용될 수 있다. 이는 개별적인 "종양 발현 프로파일"의 준비를 가능하게 하여 HER2-neu 및/또는 EGFR 발현 수치가 개별적인 환자 표본에서 측정되고 다양한 화학요법제에 대한 반응이 예측될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 방법은 고형 종양, 가장 바람직하게는 NSCLC 종양에 응용된다.
본원에 정의된 "차별적 발현 수치"는 각각 매치되는 비-악성 조직 표본 내 EGFR 또는 HER2-neu의 발현 수치에 대한 종양 내 EGFR 또는 HER2-neu의 발현 수치의 차이를 나타낸다. 차별적 발현 수치는 종양 표본 유래의 특정 유전자의 UGE를 매치되는 비-악성 조직 표본 유래의 동일한 유전자의 UGE로 나누어 측정된다.
EGFR 발현과 관련하여 본원에 정의된 "예정된 역치 수치"는 종양이 수용체 티로신 키나제 타겟된 화학요법에 민감한 것으로 판단되는 것 이상(즉 높은)의 차별적 EGFR 발현 수치이다. 높은 차별적 EGFR 발현 수치는 낮은 환자 생존능의 예후이다. 이러한 역치 수치 이하의 발현 수치를 지닌 종양은 수용체 티로신 키나제 타겟된 화학요법에 의해 영향 받지 않을 것으로 판단된다. 낮은 차별적 EGFR 발현 수치는 더 높은 환자 생존능의 예후이다. 차별적 발현이 "예정된 역치 수치" 이상 또는 이하인지 여부는 식도의 편평세포 암종을 지닌 환자에서 수득된 매치되는 비-악성 조직 내 개별적인 차별적 종양/정상(T/N) 발현 비율을 계산한 Mafune et al.,에 의해 사용된 방법에 의해 측정된다(Mafune et al., Clin Cancer Res 5:4073-4078, 1999). 이러한 분석 방법은 매치되는 비-악성 조직에서 수득된 개별적인 배경 발현을 기반으로 각각의 환자에 대한 정확한 발현 수치를 유발한다. 매치되는 비-악성 조직 표본 내 EGRF:β-액틴의 UGE로 나눈 종양 표본 내 EGRF:β-액틴의 UGE가 약 1.8의 예정된 역치 수치 이상인 경우 EGFR의 차별적 발현은 "높은" 것으로 간주되고 낮은 생존능을 표시한다. 매치되는 비-악성 조직 표본 내 EGRF:β-액틴의 UGE로 나눈 종양 표본 내 EGRF:β-액틴의 UGE가 약 1.8의 예정된 역치 수치 이하인 경우 EGFR의 차별적 발현은 "낮은" 것으로 간주되고 높은 생존능을 표시한다.
차별적 HER2-neu 발현과 관련하여 본원에 정의된 "예정된 역치 수치"는 종양이 수용체 티로신 키나제 타겟된 화학요법에 민감한 것으로 판단되는 것 이상(즉 높은)의 차별적 HER2-neu 발현 수치이다. 높은 차별적 HER2-neu 발현 수치는 낮은 환자 생존능의 예후이다. 이러한 역치 수치 이하의 발현 수치를 지닌 종양은 수용체 티로신 키나제 타겟된 화학요법에 의해 영향 받지 않을 것으로 판단된다. 낮은 차별적 HER2-neu 발현 수치는 더 높은 환자 생존능의 예후이다. 매치되는 비-악성 조직 표본 내 EGRF:β-액틴의 UGE로 나눈 종양 표본 내 HER2-neu:β-액틴의 UGE가 약 1.8의 예정된 역치 수치 이상인 경우 HER2-neu의 차별적 발현은 "높은" 것으로 간주되고 낮은 생존능을 표시한다. 매치되는 비-악성 조직 표본 내 HER2-neu:β-액틴의 UGE로 나눈 종양 표본 내 HER2-neu:β-액틴의 UGE가 약 1.8의 예정된 역치 수치 이하인 경우 HER2-neu의 차별적 발현은 "낮은" 것으로 간주되고 높은 생존능을 표시한다.
HER2-neu에 대한 "역치 수치"는 하기 결과 및 방법을 이용하여 측정되었다. HER2-neu과 β-액틴 PCR 생성물간의 비율로 표기되는 보정 HER2-neu mRNA 발현은 정상 폐에서 4.17 x lO-3(범위: 0.28∼23.86 x l0-3) 및 종양 조직에서 4.35 x lO-3(범위: 0.21∼68.11 x 10-3)이었다(P=O.019 Wilcoxon 테스트). Miller and Siegmund(Miller et al., Biometrics 38:1011-1016, 1982) 및 Halpern(Biometrics 38:1017-1023, 1982)에 의한 최대 카이-제곱 방법은 환자를 낮고 높은 차별적 HER2-neu 발현자로 분리하기 위해 1.8의 역치 수치를 측정하였다. 이러한 기준에 따라 29명(34.9%) 환자는 높은 차별적 HER2-neu 발현을 지니고 54명(65.1%)은 낮은 차별적 HER2-neu 발현을 지녔다.
EGFR에 대한 "역치 수치"는 하기 결과 및 방법을 이용하여 측정되었다. 중간 보정 EGFR mRNA 발현은 정상 폐에서 8.17 x lO-3(범위: 0.31∼46.26 x 10-3) 및 종양 조직에서 7.22 x 10-3(범위: 0.27∼97.49 x 10-3)이었다(P=n.s.). 최대 카이-제곱 방법(Miller(1982); Halpern(1982))은 환자를 낮고 높은 차별적 EGFR 발현자로 분리하기 위해 1.8의 역치 수치를 측정하였다. 이러한 기준에 따라 28명(33.7%) 환자는 높은 차별적 EGFR 발현을 지니고 55명(66.3%)은 낮은 차별적 EGFR 발현 상태를 지녔다.
본 발명의 방법 수행시 수용체 티로신 키나제 타겟된 화학요법의 효능을 예측하기 위해 차별적 EGFR 발현 수치 또는 차별적 HER2-neu 발현 수치가 환자에서 평가된다. 더욱이 본 발명의 방법에서 수행시 수용체 티로신 키나제 타겟된 화학요법의 효능을 예측하기 위해 차별적 HER2-neu 발현 수치가 환자에서 평가된다. 또한 본 발명의 방법에서 수용체 티로신 키나제 타겟된 화학요법의 효능을 예측하기 위해 차별적 EGFR 발현 수치가 환자에서 평가된다. 또한 수용체 티로신 키나제 타겟된 화학요법의 효능을 예측하기 위해 차별적 EGFR 발현 수치와 차별적 HER2-neu 발현 수치 모두가 환자에서 평가된다.
본원에서 정의된 "매치되는 비-악성 표본"은 차별적 EGFR 및/또는 차별적 HER2-neu 발현에 대해 분석되는 종양 표본과 동일한 개체에서 유래한 비-암성 조직 표본을 나타낸다. 바람직하게는 매치되는 비-악성 표본은 종양 표본이 유래한 기관과 동일한 기관에서 유래한다. 가장 바람직하게는 매치되는 비-악성 표본은 종양 표본이 유래한 동일한 기관 조직층에서 유래한다. 또한 매치되는 비-악성 종양 표본은 종양 표본이 생검됨과 동시에 채취되는 것이 바람직하다. 바람직한 실시태양에서 하기 2가지 위치에서 유래한 조직이 분석된다: 가능한 환경 하에 폐 종양 및 종양과 최대 원거리에서 채취된 비-악성 폐 조직 또는 결장 종양 및 종양과 최대 원거리에서 채취된 비-악성 결장 조직.
본 발명의 이러한 실시태양의 방법을 수행시 종양 세포는 바람직하게는 환자에서 분리된다. 고형 또는 림프구 종양 또는 그의 일부는 환자에서 외과적으로 절제되거나 통상의 생검에 의해 수득된다. 동결 또는 신선 종양 표본에서 분리된 RNA는 예를 들어 Sambrook, Fischer and Maniatis, Molecular Cloning, a laboratory manual(2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(1989)과 같은 당분야에 일반적인 어떠한 방법에 의해서도 세포로부터 추출된다. 바람직하게는 추출 과정 동안 RNA 분해를 방지하는 주의가 이루어진다.
그러나 생검 후 환자에서 수득된 조직은 일반적으로 포르말린(포름알데하이드) 또는 글루테르알데하이드 또는 알코올 침지에 의해 고정된다. 고정된 생물학적 표본은 탈수되고 파라핀 또는 당업자에 알려진 다른 고형 지지제 내에 포매된다. Plenat et al., Ann Pathol January 2001;21(l):29-47 참조. 고정되고 포매된 조직뿐만 아니라 비-포매된 고정 조직도 본 발명의 방법에 사용된다. 고정 조직을 포매하기 위한 고형 지지제는 예를 들어 유기 용매로 제거 가능하게 계획되어 보존 조직의 후속 재수화를 가능하게 한다.
RNA는 본원에 기재된 어떠한 방법에 의해서도 파라핀-포매된(FPE) 조직 세포로부터 추출된다. 신선, 동결 또는 고정 조직 유래의 정제된 전체 mRNA로부터 HER2-neu 또는 EGFR mRNA의 정량은 바람직하게는 예를 들어 당분야에 통상적인 역전사효소 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR) 방법을 이용하여 수행된다. 또다른 HER2-neu 또는 EGFR mRNA 정량 방법은 예를 들어 분자 표지 및 다중 PCR에 유용한 또다른 표지 프로브의 이용을 포함한다. 더욱이 본 발명은 예를 들어 Invader Assay(Third Wave Technologies, Inc.)과 유사한 형광 표지 프로브를 이용한 PCR-프리 시스템의 이용을 통한 HER2-neu 및/또는 EGFR mRNA의 정량을 예상한다. 가장 바람직하게는 HER2-neu 및/또는 EGFR cDNA 및 내부 대조군 또는 하우스키핑 유전자(예를 들어 β-액틴)의 정량은 형광 기반 실시간 검출 방법(ABI PRISM 7700 or 7900 Sequence Detection System [TaqMan], Applied Biosystems, Foster City, Calif.) 또는 Heid et al.,(Genome Res 1996; 6:986 994) 및 Gibson et al.(Genome Res 1996; 6:995 1001)에 기재된 유사한 시스템을 이용하여 수행된다. ABI 7700(TaqMan 기기)의 결과는 Ct 또는 "사이클 역치"로 표기된다. TaqMan 시스템으로 표본 내 많은 수의 타겟 분자를 지닌 높게 발현되는 유전자는 적은 타겟 분자를 지닌 낮은 상대 발현(높은 Ct)의 유전자보다 적은 PCR 사이클(낮은 Ct)을 지닌 신호를 생성한다.
본원에 사용된 "보정되지 않은 유전자 발현(UGE)은 TaqMan 기기에 의해 생성된 내부 대조군 유전자에 대한 HER2-neu 및/또는 EGFR 발현의 숫자 결과를 나타낸다. UGE를 측정하는데 사용된 방정식은 실시예 12 및 13에 나타나 있고 도 25 및 26의 표본 계산에 나타나 있다.
이들 숫자 수치는 차별적 유전자 발현(즉 매치되는 비-종양 표본의 "UGE"로 나눈 특정 종양 표본의 "UGE")이 "예정된 역치" 수치의 이상 또는 이하에 포함되는지 여부를 측정 가능하게 한다. EGFR 및 HER2-neu에 대한 예정된 역치 수치는 약 1.8이다.
본 발명의 또다른 관점은 TaqMan 기기로부터 수득된 보정되지 않은 유전자 발현(UGE) 수치를 비-TaqMan 기술에서 유래된 "알려진 상대 유전자 발현" 수치로 표준화하는 방법을 제공한다. 바람직하게는 TaqMan에 의한 조직 표본 유래 HER2-neu 및/또는 EGFR UGE 수치는 알려진 비-TaqMan 유래 상대 HER2-neu 및/또는 EGFR:β-액틴 발현 수치로 표준화된다.
본원에 사용된 "보정 상대 EGFR 발현"은 UGE에 EGFR 특이적 보정 인자(KEGFR)를 곱하여 내부 대조군 유전자에 대한 알려진 EGFR 발현 수치 범위와 비교될 수 있는 수치를 유발하는 표준화된 EGFR 발현을 나타낸다. 실시예 12 및 도 25는 이들 계산을 상세하게 나타낸다. EGFR, 내부 대조군 β-액틴 및 교정기 인간 간 전체 RNA(Stratagene, Cat #735017)에 특이적인 KEGFR은 26.95 x 10-3이다. 또한 이들 숫자 수치는 매치되는 비-종양 표본의 "보정 상대 발현으로 나눈 특정 종양 표본의 "보정 상대 발현"(즉 차별적 발현)이 "예정된 역치" 수치 이상 또는 이하에 포함되는지 여부를 측정 가능하게 한다. HER2-neu 또는 EGFR에 대한 예정된 역치 수치는 약 1.8이다. 종양 표본 내 EGFR 또는 HER2-neu의 차별적 발현이 매치되는 비-종양 표본보다 1.8배 이상인지 여부를 측정시 UGE 수치 또는 보정 상대 발현 수치가 사용될 수 있음을 용이하게 인식할 것이다. 예를 들어 종양의 보정 상대 발현 수치를 매치되는 비-종양 표본으로 나누는 경우 K-인자는 약분되고 하나는 UGE 수치를 사용할 때와 동일한 비율로 남는다.
"알려진 상대 유전자 발현" 수치는 종전 분석된 조직 표본에서 유래되고 구성적으로 발현되는 내부 대조군 유전자(예를 들어 β-액틴, GAPDH 등)에 대한 타겟 유전자의 RT-PCR 신호 비율을 기반으로 한다. 바람직하게는 이러한 조직 표본은 포르말린 고정되고 파라핀-포매된(FPE) 표본이고 RNA는 본원에 기재된 프로토콜에 따라 이들로부터 추출된다. 내부 대조군에 대한 유전자 발현을 정량하기 위해 당분야에 알려진 표준 정량적 RT-PCR 기술이 이용된다. pre-TaqMan 기술에서 PCR 반응은 고정된 사이클 횟수(즉 30)로 수행되고 종점 수치가 각 표본에 대해 보고되었다. 이후 이들 수치는 β-액틴 발현에 대한 EGFR 발현 비율로 보고되었다.
KEGFR은 β-액틴 이외의 내부 대조군 유전자 및/또는 인간 간 전체 RNA(Stratagene, Cat #735017)와 다른 교정기 RNA에 대해서도 측정된다. 이를 수행하기 위해서는 특정 대조군 유전자에 대한 EGFR 발현 수치가 이미 측정된 바 있는(즉 "알려진 상대 유전자 발현") 조직 표본에 대해 내부 대조군 유전자 및 교정기 RNA 모두를 계산해야 한다. 바람직하게는 이러한 조직 표본은 포르말린 고정되고 파라핀-포매된(FPE) 표본이고 RNA는 실시예 1에 기재된 프로토콜에 따라 이들로부터 추출된다. 이러한 측정은 당분야에 잘 알려진 표준 pre-TaqMan, 정량적 RT-PCR 기술을 이용하여 이루어진다. 이러한 측정시 이러한 표본은 실시예 12에 기재된 바와 같이 새로운 내부 대조군 및/또는 교정기 RNA에 특이적인 새로운 KEGFR을 측정하는데 유용한 EGFR의 "알려진 상대 유전자 발현" 수치를 지닌다.
본원에 사용된 "보정 상대 HER2-neu 발현"은 UGE에 HER2-neu 특이적 보정 인자(KHER2-neu)를 곱하여 내부 대조군 유전자에 대한 알려진 HER2-neu 발현 수치 범위와 비교될 수 있는 수치를 유발하는 표준화된 HER2-neu 발현을 나타낸다. 실시예 13 및 도 26은 이들 계산을 상세하게 나타낸다. HER2-neu, 내부 대조군 β-액틴 및 교정기 인간 간 전체 RNA(Stratagene, Cat #735017)에 특이적인 KHER2-neu은 13.3 x 10-3이다.
KHER2-neu은 β-액틴 이외의 내부 대조군 유전자 및/또는 인간 간 전체 RNA(Stratagene, Cat #735017)와 다른 교정기 RNA에 대해서도 측정된다. 이를 수행하기 위해서는 특정 대조군 유전자에 대한 HER2-neu 발현 수치가 이미 측정된 바 있는(즉 "알려진 상대 유전자 발현") 조직 표본에 대해 내부 대조군 유전자 및 교정기 RNA 모두를 계산해야 한다. 바람직하게는 이러한 조직 표본은 포르말린 고정되고 파라핀-포매된(FPE) 표본이고 RNA는 본원에 기재된 프로토콜에 따라 이들로부터 추출된다. 이러한 측정은 당분야에 잘 알려진 표준 pre-TaqMan, 정량적 RT-PCR 기술을 이용하여 이루어진다. 이러한 측정시 이러한 표본은 실시예 13에 기재된 바와 같이 새로운 내부 대조군 및/또는 교정기 RNA에 특이적인 새로운 KHER2-neu를 측정하는데 유용한 HER2-neu의 "알려진 상대 유전자 발현" 수치를 지닌다.
본 발명의 방법은 광범위한 조직 및 종양 타입에 응용되고 따라서 환자의 치료 평가 및 유방암, 두경부암, 폐암, 식도암, 대장암을 포함한 광범한 암의 진단 또는 예후 도구로서 이용될 수 있다. 바람직한 실시태양에서 본 방법은 NSCLC 종양의 예후에 응용된다.
전-화학요법 처리 종양 생검은 일반적으로 극소량의 이질성 조직만을 포함하는 고정 파라핀 포매(FPE) 조직으로만 이용 가능하다. 이러한 FPE 표본은 용이하게 현미해부되어 HER2-neu 및/또는 EGFR 유전자 발현이 비-악성 기질 조직으로 오염되지 않은 종양 조직에서 측정된다. 더욱이 이러한 표본은 두 타입의 조직을 모두 포함하기 때문에 생검 조직 표본 내 기질 조직과 종양 조직 사이의 비교가 이루어질 수 있다.
일반적으로 서열번호: 10에 나타난 바와 같이 EGFR 유전자 영역 측면에 위치한 어떠한 올리고뉴클레오타이드도 본 발명의 방법을 수행하는데 이용된다. 엄격한 조건 하에서 본 발명에 사용되는 EGFR 유전자 영역에 혼성화하는 프라이머는 20∼1000개 염기쌍, 바람직하게는 100∼400개 염기쌍, 가장 바람직하게는 200∼400개 염기쌍 생성물을 증폭시킬 것이다.
더욱이 HER2-neu 유전자 영역 측면에 위치한 어떠한 올리고뉴클레오타이드도 본 발명의 방법을 수행하는데 이용된다. 엄격한 조건 하에서 본 발명에 사용되는 HER2-neu 유전자 영역에 혼성화하는 프라이머는 20∼1000개 염기쌍, 바람직하게는 100∼400개 염기쌍, 가장 바람직하게는 200∼400개 염기쌍 생성물을 증폭시킬 것이다.
HER2-neu의 과활성은 HER2-neu를 암호화하는 유전자의 증폭 또는 세포 증식성 장애와 상호관련될 수 있는 HER2-neu 활성 수치의 생성을 나타낸다(즉 HER2-neu 수치가 증가됨에 따라 하나 이상의 세포 증식성 장애 증상의 중증도가 증가됨).
이와 같이 기재된 본 발명, 본 발명의 실시는 하기 제공된 실험적 실시예에 의해 설명된다. 당업자는 예시적 실시예에 사용된 재료 및 방법이 다양한 방법으로 변형될 수 있음을 인식할 것이다. 이러한 변형은 본 발명의 범주에 포함되는 것으로 간주된다.
실시예 1: 긴-단편 RNA 추출 절차
Ⅰ. 조직 제조
커버 슬립이 없는 유리 슬라이드 상에 FFPE 조직을 포함하는 파라핀 블록의 10 마이크론 절편을 봉입시키는데 표준 실험 절차가 이용된다. 탈파라핀화 및 슬라이드의 세포핵 신속 적색(NFR) 염색은 하기와 같이 처리된다:
슬라이드는 자일렌으로 5분간 2회 세척된 후 에탄올("EtoH")로 세척되었다. 슬라이드는 표준 실험 절차를 이용하여 NFR로 염색된다.
목적 영역(예를 들어 종양 조직 또는 기질 조직)은 수동으로 또는 레이저 캡처 현미해부기로 절제된다(절제되는 영역의 크기에 따라 달리).
Ⅱ. RNA 추출
Tris/HCL, EDTA, SDS 및 물을 포함한 추출 용액이 제조된다. 종양 조직은 원심분리관 내의 추출 용액 및 프로티나제 K에 첨가된다. 이후 표본은 긴 단편 RNA의 최대 수율을 위해 적당한 온도 및 시간 동안 가열된다. 예를 들어 표본은 50℃에서 16시간 동안 가열된다. 가열 단계 후 표본은 큰 튜브로 이동되고 2 M 구연산나트륨(NaOAC)가 첨가된다. 페놀/클로로포름/이소아밀알코올(PCI) 추출이 수행된다. 상단 액상은 새로운 청결한 튜브에 이동되고 글리코겐이 첨가된다. RNA는 이소프로판올(iPrOH)로 침전된다. 펠렛화된 RNA는 무질서유발제(0.5% 사코신 - 이소티오시안산구아니딘(GITC)와 같은)와 혼합된다. 디티오트레이톨(DTT)도 튜브에 첨가된다. 5 mM Tris가 첨가되고 혼합된다. 이후 2 M NaOAc 및 PCI가 첨가되고 교반되고, 튜브는 얼음 위에서 인큐베이트된다. 튜브는 회전되고 상단 액상은 글리코겐을 포함한 새로운 튜브로 이동된다. RNA는 다시 펠렛화되고(iPrOH를 이용) 에탄올 세척된다. RNA는 5 mM Tris 내에 현탁된다.
Ⅲ. PCR 정량
본 발명의 방법에 의해 수득된 추출 RNA를 이용하여 cDNA 제제(35) 및 실시간 RT-PCR 정량은 종전 기재된 바와 같이 수행된다. 각각의 추출의 PCR은 3반복으로 수행된다. 데이터는 β-액틴 유전자의 Ct 수치로 보고된다. Ct 수치는 PCR 생성물 양을 나타내고, 따라서 PCR 반응시 존재하는 타겟의 본래 양에 관련된다. 관계는 역비례이고 즉 큰 Ct 숫자는 본래 존재하는 적은 타겟 cDNA를 나타낸다. 각각의 PCR 사이클은 양의 2-배 차이를 나타내고, 따라서 예를 들어 2개 PCR 반응간의 4-사이클 Ct 차이는 cDNA 함량의 16-배 차이를 의미한다(24=16).
실시예 2: 분리된 RNA의 길이 분포 측정방법
FFPE 조직에서 분리된 다양한 RNA 단편 길이의 상대적 양을 측정하기 위해 하기 방법이 이용되었다. 본 발명 및 다른 알려진 추출 방법을 이용하여 FFPE 표본에서 분리된 RNA는 올리고 dT 프라이머를 이용하여 cDNA로 전환되었다. 이는 3'-올리고 A 테일을 포함한 mRNA 단편만이 cDNA로 연장되고 전환되어 단편 길이를 측정하는 시작점을 제공하게 됨을 의미한다. β-액틴 mRNA의 PCR 증폭은 mRNA의 전체 생성을 나타내는데 이용된다. mRNA의 3'-말단으로부터 100, 300, 400 및 1000 bp 위치를 나타내는 β-액틴 유전자의 약 100∼120 bp 분절을 증폭하는데 프라이머가 선택된다(도 2). 이러한 방법으로 실질적으로 100, 300, 400 및 1000 bp 단편을 증폭하고자 하는 바와 대립하여 증폭의 길이-의존적 효율의 차이는 최소화된다. 따라서 각각의 프라이머 세트의 PCR 생성물의 Ct는 각각의 단편 크기의 양의 거의 실제 비율을 나타내어야 한다.
코드화 영역의 3'-말단으로부터 약 100∼300, 400 및 1000 bp에 위치한 β-액틴 cDNA의 분절을 증폭함으로서 FFPE 조직에서 분리된 RNA 단편 길이를 측정하기 위한 방법
증폭
100 bp 3' 말단으로부터 21∼105
300 bp 3' 말단으로부터 206∼293
400 bp 3' 말단으로부터 322∼407
1000 bp 3' 말단으로부터 1050∼1110
실시예 3: 프로티나제 K의 효과
본 실시예는 RNA 수율 및 DNA 오염 상의 프로티나제 K 농도 효과를 나타낸다. 프로티나제 K 농도는 50℃에서 0.5, 2, 3 및 16시간의 인큐베이션 시간에 4-배 범위(5∼20 ㎍, 도면 내 1X∼4X로 표시됨)까지 변화된다. 도 4에 나타난 바와 같이 1X(5 ㎍)의 프로티나제 K는 약 2-배(1 Ct) 이상의 높은 함량의 우수한 RNA 수율을 제공하나 더욱 중요하게는 1X 이상의 프로티나제 K 함량은 명백하게 높은 DNA 오염을 제공한다(2∼3 Ct 사이클). 또한 본 실험은 짧은 인큐베이션 시간보다 16시간 인큐베이션 시간에 3 내지 7 Ct 사이클 이상인 추출 DNA 함량 상의 인큐베이션 시간 작용을 나타낸다. 먼저 RNA를 cDNA로 전환하는 역전사 반응을 수행하지 않고 PCR을 수행함으로서 DNA가 추출물에서 검출된다("역전사 부재 또는 NRT 대조군"). PCR 증폭만이 발생하는 이러한 방법은 동시-추출된 DNA의 경우이고, 너무 높은 것은 RNA의 PCR 정량시 높은 배경 수치를 제공할 수 있어서 불확실한 데이터를 유발하게 된다.
실시예 4: DNA 동시-추출 최소화
본 실시예는 최소한의 RNA 소실로 FFPE 추출물에서 DNA를 선택적으로 제거하는 절차를 나타낸다. 더 많은 DNA를 제거하고자 하는 노력으로 무질서유발제 GITC를 포함한 2차 페놀/클로로포름 추출 절차의 유효성을 시험하는 실험이 수행되었다. 하기 추출 방법은 RNA 수율 및 DNA 오염에 대해 비교되었다:
1. 92℃에서 30분간 FFPE 조직의 인큐베이션 및 페놀/클로로포름/이소아밀("PCI") 추출("RGI" 방법) 또는 "고온 무질서유발제 방법"으로도 표기됨. 이는 유전자 발현의 고-효율 RT-PCR 정량을 위해 FFPE로부터 RNA를 추출하기 위해 종전 개발된 신속 단기간-인큐베이션-고온 방법이다. 본원에서 비교 목적으로 이용되는 이러한 방법은 미국 특허등록 제6,248,535호에 기재되어 있고 PCI 추출 후 이소프로판올("iPrOH") 침전 및 에탄올("EtOH") 세척을 포함한다. 본 발명의 하나의 실시태양은 RGI 방법과 비교되고 이는 "PK"로 표시된다.
2. PK(50℃, 프로티나제 K로 16시간) + PCI + iPrOH + EtOH(즉 단일 페놀/클로로포름 추출);
3. PK + GITC 및 PCI + iPrOH + EtOH(단일 페놀/클로로포름 추출 절차에 GITC 첨가);
4. PK + PCI + iPrOH + EtOH + GITC + PCI + iPrOH + EtOH(2차 페놀/클로로포름에 포함된 GITC를 지닌 이중 페놀/클로로포름 추출);
5. PK + PCI + iPrOH + EtOH + Tris 첨가+ PCI + iPrOH + EtOH(2차 페놀/클로로포름에 GITC 대신 Tris를 지닌 이중 페놀/클로로포름 추출).
도 5는 이들 실험 결과를 나타낸다. 고온(RGI) 방법은 짧은 인큐베이션으로 인해 최소 DNA 오염을 제공하나 낮은 수율의 RNA도 제공한다(각각의 시리즈의 첫 번째 막대). 긴-인큐베이션 PK 방법은 더 많은 RNA를 제공하나 높은 DNA 오염을 지닌다(두번째 막대). 1차 추출 단계에 GITC 첨가 효과는 적은 DNA를 유발하나 RNA 수율 감소도 존재한다(세번째 막대). 2차 페놀/클로로포름 추출 단계시 GITC 사용 효과는 단일 페놀/클로로포름 추출보다 다소 적은 RNA 수율만을 지닌다(약 1 Ct 사이클)(네 번째 막대). 그러나 단일 페놀/클로로포름 추출과 비교시 7 Ct 사이클까지 DNA 감소가 존재하였다(NRT 시리즈의 네 번째 막대). 2차 페놀/클로로포름 추출시 GITC 대신 Tris가 사용된 경우 RNA 수율은 동일하였으나 DNA는 Ct 사이클까지 감소되었고, 이는 2차 페놀/클로로포름 추출 단계시 무질서유발제의 바람직성을 나타낸다. 이들 결과로부터 무질서유발제 GITC를 포함한 2차 페놀/클로로포름 추출 단계가 RNA 수율 및 최소 DNA 오염 측면에서 가장 효과적인 것으로 결정되었다.
실시예 5: PK 추출 방법에 의해 추출된 RNA와 2가지 다른 추출 방법을 추출된 RNA의 비교
본 실시예는 여러 다른 기준에 의해 본 발명의 방법("PK" 방법)에 의해 추출된 RNA를 평가한다.
도 6은 PK 방법, RGI 방법(상기 논의됨) 및 컬럼 정제 단계를 이용한 통상적으로 이용 가능한 FFPE 표본으로부터 RNA의 분리 방법인 Paradise 키트((Arcturus, Co., Mountain View, CA)에 의해 종양 표본 B5, D6 및 F5에서 분리된 RNA 전체량의 분광광도계 정량을 나타낸다. 높은 UV 흡광도로 표시된 바와 같이 시험된 3개 표본에서 PK 방법은 Paradise 키트보다 높은 수율의 전체 RNA를 제공하였으나 RGI 방법만큼 높은 수율의 전체 RNA는 아니었다. RNA 순도를 나타내는 260/280 흡광도 비율은 PK 방법에 의해 분리된 2/3 표본에 대해 1.8에 근접하였다(순수 RNA에 대한 비율은 1.8임).
도 7은 종양 표본 F5, D5 및 D6에서 PK 방법, RGI 방법 및 Paradise 키트에 의해 분리된 100, 300, 400 및 1000 bp RNA 단편의 양을 비교한다. 본 실험시 고온 방법은 260 nm에서의 전체 최적 흡광도의 원인이 되는 많은 매우 짧은 단편을 생성하나 그 짧은 길이로 인해 PCR의 프라이머-프로브 세트에 의해 증폭될 수 없기 때문에 도 7에서 높은 UV 흡광도로 나타난 RGI 방법에 의한 명백하게 높은 RNA 수율과 PCR에 의해 나타난 낮은 수율간의 명백한 불일치가 발생한다.
도 8은 PK 방법, RGI 방법 및 Paradise 키트에 의해 분리된 RNA 단편의 크기 분포를 비교한다. 3가지 방법에 의해 추출된 RNA는 제조사의 지침에 따라 RNA 6000 Nano Assay 및 Agilent 2100 Bioanalyzer Software를 이용한 Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, Palo Alto, CA) 상에서 분석되었다. 이러한 분석기는 더 짧은 길이 RNA가 더 빠르게 유출되어 이들 도표 내 y-축에 더 가까이 위치하는 크기 배제 컬럼 상에서 용출 시간에 의해 올리고핵산 분자를 분리시킨다. RGI 방법은 주로 짧은 단편을 제공하는 반면 본 방법(PK 방법)에 의해 분리된 RNA는 Paradise 방법보다 더 높은 수율의 긴 단편을 지닌 단편 크기 범위를 제공하였다.
도 9는 본(PK) 방법을 이용하여 FFPE 조직에서 분리된 RNA 내 β-액틴의 유전자 발현과 매치되는 신선 동결 조직 세트로부터 통상의 산 구아니디움 티오시아네이트 클로로포름(AGPC) 방법(Chomczynski and Saachi, Anal Biochem (1987) 162:156-159)을 이용하여 분리된 것과의 비교를 나타낸다. β-액틴 유전자 발현의 우수한 상관관계(R = 0.89)가 신선-동결 및 FFPE 매치되는 표본 세트로부터 분리된 RNA에서 수득되었다.
실시예 6: ERCC1에 대한 보정되지 않은 유전자 발현(UGE) 측정
2쌍의 병행 반응 즉 "시험" 반응 및 "교정" 반응이 수행되었다. ERCC1 증폭 반응 및 β-액틴 내부 대조군 증폭 반응은 시험 반응이다. 개별적인 ERCC1 및 β-액틴 증폭 반응은 교정기 RNA 주형 상에서 수행되고 교정 반응으로 표기된다. TaqMan 기기는 4개의 다른 사이클 역치(Ct) 수치를 생성할 것이다: 시험 반응 유래의 CtERCC1 및 Ctβ-액틴 및 교정 반응 유래의 CtERCC1 및 Ctβ-액틴. 2가지 반응에 대한 Ct 수치의 차이는 하기 방정식에 따라 결정된다:
ΔCt시험 = CtERCC1-Ctβ-액틴("시험" 반응 유래)
ΔCt교정기 = CtERCC1-Ctβ-액틴("교정" 반응 유래)
다음 단계는 하기 방정식에 따라 2를 마이너스 ΔCt 제곱하는 것을 포함한다.
2-ΔCt test ("시험" 반응 유래)
2-ΔCt 교정기("교정" 반응 유래)
이후 TaqMan 기기 유래의 ERCC1에 대한 보정되지 않은 유전자 발현을 수득하기 위해 하기 계산이 수행된다:
ERCC1에 대한 보정되지 않은 유전자 발현(UGE) = 2-ΔCt test/2-ΔCt 교정기
알려진 상대 ERCC1 발현 수치로 UGE의 표준화
표준화 계산은 UGE에 ERCC1 및 특정 교정기 RNA에 특이적인 보정 인자(KERCC1)를 곱하는 것을 포함한다. 또한 보정 인자 KERCC1은 어떠한 내부 대조군 유전자 및 어떠한 정확하게 미리-정량된 교정기 RNA로부터도 측정될 수 있다. 바람직하게는 내부 대조군 유전자 β-액틴 및 정확하게 미리-정량된 교정기 RNA 인간 간 전체 RNA(Stratagene, Cat. #735017)가 사용된다. 이들 시약의 경우 보정 인자 KERCC1은 1.54 x 10-3과 동일하다.
표준화는 상기 기재된 User Bulletin #2 내 Applied Biosystems, the TaqMan 제조사에 의해 기재된 ΔCt 방법의 변형을 이용하여 달성된다. 이러한 절차를 수행하기 위해 상기 기재된 TaqMan 방법을 이용하여 6개의 다른 시험 조직의 UGE이 ERCC1에 대해 분석되었다. 내부 대조군 유전자 β-액틴 및 교정기 RNA인 인간 간 전체 RNA(Stratagene, Cat. #735017)가 사용되었다.
각각의 표본 AG221, AG222, AG252, 성인 폐, PC3, AdCo1에 대해 알려진 상대 ERCC1 발현 수치는 그의 상응하는 TaqMan 유래 UGE로 나누어 비평균화 보정 인자 K를 생성하였다.
K비평균 = 알려진 수치/UGE
다음으로 모든 K 수치는 평균되어 ERCC1, 교정기 RNA 유래의 인간 간 전체 RNA(Stratagene, Cat. #735017) 및 β-액틴에 특이적인 단일 KERCC1 보정 인자를 결정한다.
따라서 pre-TaqMan ERCC1 발현 연구와 일치하는 규모 상에서 알려지지 않은 조직 표본 내 보정 상대 ERCC1 발현을 측정하기 위해 동일한 내부 대조군 유전자 및 교정기 RNA 사용을 조건으로 TaqMan 기기 유래의 보정되지 않은 유전자 발현 데이터(UGE)에 KERCC1 특이적 보정 인자를 곱한다.
보정 상대 ERCC1 발현 = UGE x KERCC1
KERCC1은 어떠한 정확하게 미리-정량된 교정기 RNA 또는 내부 대조군 유전자를 이용하여서도 측정된다. 미리-정량된 RNA의 미래 공급원은 상기 방법에 기재된 바와 같이 알려진 상대 ERCC1 발현 수치로 알려진 표본에 대해 교정될 수 있거나 상기 기재된 인간 간 전체 RNA(Stratagene, Cat. #735017)와 같은 종전 교정된 교정기 RNA에 대해 교정된다.
예를 들어 후속 KERCC1이 다른 내부 대조군 유전자 및/또는 다른 교정기 RNA에 대해 측정되는 경우 특정한 내부 대조군 유전자에 대한 ERCC1 발현 수치가 이미 측정된 바 있는 조직 표본에 대해 내부 대조군 유전자 및 교정기 RNA 모두를 교정해야 한다. 이러한 측정은 당분야에 잘 알려진 표준 pre-TaqMan, 정량적 RT-PCR을 이용하여 이루어질 수 있다. 이들 표본에 대해 알려진 발현 수치는 상응하는 UGE 수치로 나누어 상기 표본에 대한 K를 결정하게 된다. 이후 K 수치는 알려진 표본 수에 따라 평균되어 다른 내부 대조군 유전자 및/또는 교정기 RNA에 특이적인 새로운 KERCC1을 결정하게 된다.
실시예 7
모든 환자는 장래 다기관 3개 부문 무작위 시험의 시스플라틴/젬시타빈 부분에 등록되었다(GEPC/98-02, 진행성 NSCLC에서 시스플라틴/젬시타빈(CG) 대 시스플라틴/젬시타빈/비노렐빈(CGV) 대 젬시타빈/비노렐빈 후 이포스파마이드/비노렐빈(GV/TV) 연속 더블릿의 스페인 폐암 그룹 Ⅲ기 시험 ). 모든 환자는 3주마다 Gem 1250 mg/m2 1,8일 플러스 CDDP 100 mg/m2 1일이 투여되었다. GEPC/98-02에 대한 적격 기준은 측정 가능한 단계 Ⅳ(무증상인 경우 뇌 전이 적격) 또는 단계 ⅢB(악성 흉막 및/또는 심낭 삼출 및/또는 쇄골상부 선증) NSCLC 및 Eastern Cooperative Group(ECOG) 수행 득점 0 2이었다. 모든 환자는 연구 진입 전 흉부 x-선 및 흉부 및 상복부의 전산화 단층촬영법(CT) 스캔이 수행되었고 적어도 6주마다 반복 조사가 수행되었다. 종양 반응은 완전한 반응, 부분적 반응, 안정적 질환 및 진행성 질환으로 WHO 기준에 따라 평가되었다. 종양은 기준 종양 측량을 수립하는데 사용된 것과 동일한 영상 방법으로 치료 동안 재평가되었다.
전체 mRNA는 현미해부된 FPE 전처리 종양 표본에서 분리되었고, 보정 상대 ERCC1 발현은 정량적 RT-PCR을 이용하여 측정되었다. 이러한 표본으로부터 mRNA를 분리하는 한가지 방법은 본원 및 1999년 12월 20일 출원되고 참고문헌으로 포함된 미국 특허출원 제09/469,338호에 기재되어 있다.
통계 분석
연속 시험 변수 보정 상대 ERCC1 발현과 2분법 변수(환자 성별, 중간 연령 이상 또는 이하의 연령, 체중 감소의 존재, 흉막 삼출, 종양 단계)간의 유의적인 관련성에 대해 시험하기 위해 Mann- Whitney U 테스트가 이용되었다. 다수의 그룹 내 보정 상대 ERCC1 발현의 유의적인 차이(ECOG 수행 상태, 조직병리학)에 대해 시험하기 위해 Kruskal-Wallis 테스트가 이용되었다. Fisher's exact test는 반응 및 이분화된 보정 상대 ERCC1 발현 수치를 포함한 분류별 임상병리학적 수치의 분석에 이용되었다.
모든 환자는 사망하거나 데이터가 검열될 때까지 첫 번째 연구가 수행되었다. Kaplan-Meier 생존 곡선 및 로그 랭크 테스트는 생존 및 무질병 생존에 대한 단일변수 분포를 분석하는데 이용되었다. 어떤 발현 수치가 환자를 불량 및 우수 예후 서브그룹(사망 가능성)에 최상으로 이분화시키는지를 측정하기 위해 Miller and Siegmund(Biometrics 1982; 38:1011-1016 and Halpern (Biometrics 1982; 38:1017-1023)의 최대 카이-제곱 방법이 그룹화의 강도를 측정하는데 사용되는 통계치로서 로그-랭크 테스트와 함께 변경되었다. 최대 카이-제곱 분석을 기반으로 연관성의 강도 측정으로 해석되는 P 수치를 측정하기 위해 1000 부트-스트랩-유사 시뮬레이션이 연관성 부재 가설 하에 최대 카이-제곱 통계치의 분포를 추정하는데 이용되었다(Biometrics 1982; 38:1017-1023). 단일변수 분석에서 유의적인 인자의 Cox의 비례 위험 모델링은 어떤 인자가 생존에 유의적인 영향을 지니는지를 확인하는데 수행되었다. SPSS 버전 10.0.5 소프트웨어(SPSS Inc., Chicago 111.)는 모든 통계 분석에 이용되었다. 모든 P 수치는 양면화되었다.
보정 상대 ERCC1 발현 수치
ERCC1 mRNA 발현은 분석된 모든 56개 표본에서 검출 가능하였다. 내부 대조군 하우스키핑 유전자 β-액틴 발현에 대한 중간 보정 상대 ERCC1 발현은 6.7 x 10-3이었다(0.8 x 10-3 내지 24.6 x 10-3 범위). 보정 상대 ERCC1 발현 수치와 연령(P=0.66), 성별(P=O.18), 무작위화 전 6개월 이내의 체중 감소 존재(P=0.74), 종양 단계(ⅢB 대 Ⅳ, P=O.39) 또는 흉막 삼출 존재(P=0.25, 모든 Mann- Whitney U 테스트) 인자 사이에 유의적인 연관성은 존재하지 않았다. 또한 다른 수행 상태 등급 (P=0.48, Kruskal-Wallis 테스트) 또는 다른 종양 세포 타입(모두 4개 종양 타입, P=O.10, Kruskal-Wallis 테스트) 중 보정 상대 ERCC1 발현 수치들 간의 유의적인 차이도 존재하지 않았으나 보정 상대 ERCC1 발현 수치는 샘암종(중간 5.2 x 10-3, Mann-Whitney 테스트)과 비교시 SCC 종양(중간 8.6 x 10-3)에서 유의적으로 더 높았다.
화학요법에 대한 반응
평가 가능한 47명 환자의 전체 반응 비율은 44.7%이었다. 완전한 반응 및 부분적 반응 즉 "반응성" 종양 내 보정 상대 ERCC1 발현 수치(중간 4.3 x lO-3, 1.2 x lO-3 내지 24.6 x10-3 범위)는 안정적 질환 및 진행성 질환 즉 "무-반응성" 종양 내 수치(중간 7.85 x lO-3, 0.8 x l0-3 내지 24.3 x lO-3, P=0.31 Mann-Whitney 테스트)와 유의적으로 상이하지 않았다. 또한 어떠한 ERCC1 수치 이상 또는 이하의 보정 상대 ERCC1 발현 수치를 지닌 반응성 및 무-반응성 종양의 비율간의 유의적인 차이도 존재하지 않았다(모두 Fisher's exact test). 역치 수치 이하의 보정 상대 ERCC1 발현("낮은" 발현, 52% 반응자)을 지닌 반응 비율은 역치 수치 이상의 보정 상대 ERCC1 발현("높은" 발현, 36.4% 반응자, Fisher's exact test, P=0.38)을 지닌 종양보다 더 높았다.
환자 전체 생존과 보정 상대 ERCC1 발현 수치간의 연관성
중간 전체 생존 시간은 36.6주(0 - 113.4주 범위)이었고 진행되는 중간 시간은 24.4주(0 - 102.9주)이었다. 환자를 불량- 및 우수-예후 서브그룹으로 이분화시키는 역치 보정 상대 ERCC1 발현 수치를 확인하기 위한 로그 랭크 테스트 및 최대 카이-제곱 통계의 이용은 차별적 수치 범위가 중간 수치를 포함하고, 따라서 생존 분석에 대한 역치 수치로 이용됨을 나타내었다. 따라서 역치 보정 상대 ERCC1 발현 수치는 NSCLC에 대해 6.7 x 10-3으로 측정되었다. 도 1은 역치 보정 상대 ERCC1 발현 수치 이상 및 이하의 종양내 보정 상대 ERCC1 발현 수치를 지닌 환자에 대한 Kaplan-Meier 생존 곡선을 나타낸다. 도 14에 나타난 바와 같이 역치 수치 이하의 보정 상대 ERCC1 발현 수치를 지닌 환자는 역치 수치 이상의 보정 상대 ERCC1 발현 수치를 지닌 환자의 20.4주(95% C.I. 6.9, 33.9주)와 비교시 61.6주(95% C.I. 42.4, 80.7주)의 유의적으로 긴 중간 생존을 지녔다. 종양 단계에 조정시 낮거나 높은 보정 상대 ERCC1 발현과 전체 생존 사이의 연관성에 대한 로그 랭크 통계는 3.97이었고 P 수치는 0.046이었다. 비조정 로그 랭크 결과는 도 14에 나타나 있다.
5.8 x 10-3의 개별적인 보정 상대 ERCC1 발현 역치 수치는 위암 환자의 경우 전체 생존과 관련되는 것으로 종전 연구에 나타났기 때문에 이러한 수치가 시험되었다(Metzger et al., J Clin Oncol 1998; 16:309 316). 높은 6.7 x 10-3 보정 상대 ERCC1 발현 역치 수치가 더욱 강력한 선별기이나 전체 생존은 5.8 x 10-3 이하의 ERCC1 수치를 지닌 환자와 비교시 5.8 x 10-3 이하의 보정 상대 ERCC1 발현 수치를 지닌 본 연구의 NSCLC 환자 그룹에 대해 더욱 유의적으로 우수하였다(로그 랭크 통계 6.37, P=0.011).
Kaplan Meier 생존 곡선 및 로그 랭크 테스트를 이용한 단일변수 분석 상의 전체 생존과 유의적으로 관련된 또다른 인자는 전처리 체중 감소의 존재 및 ECOG 수행 상태이다. 환자 연령(P=O.18), 성별(P=O.87), 종양 단계(P=0.99), 종양 세포 타입(P=0.63) 및 흉막 삼출 존재(P=O.71)는 전체 생존에 대해 유의적인 예후 인자가 아니었다. 보정 상대 ERCC1 발현 수치, ECOG 수행 상태 및 체중 감소는 Cox 비례 위험 회귀 모델 다변수 분석시 생존에 대한 유의적인 예후 인자로 남아 있었다(도 14). 종양 단계 상의 계층화된 Cox 회귀 모델에 대한 P 수치는 ERCC1의 경우 0.038, 체중 감소의 경우 0.017 및 ECOG 수행 상태의 경우 0.02이었다(PS 0 대 1 또는 2).
본 연구는 암 환자에 대한 백금-기반 화학요법제 치료 후 낮은 ERCC1 mRNA 발현 수치와 개선된 생존간의 연관성을 발견하였다.
실시예 8: DPD에 대한 보정되지 않은 유전자 발현(UGE)의 측정
2쌍의 병행 반응이 수행된다. "시험" 반응 및 "교정" 반응. DPD 증폭 반응 및 β-액틴 내부 대조군 증폭 반응은 시험 반응이다. 개별적인 β-액틴 및 DPD 증폭 반응은 교정기 RNA 상에서 수행되고 교정 반응으로 표기된다. TaqMan 기기는 4개의 다른 사이클 역치(Ct) 수치를 생성할 것이다: 시험 반응 유래의 CtDPD 및 Ctβ-액틴 및 교정 반응 유래의 CtDPD 및 Ctβ-액틴.
2개 반응에 대한 Ct 수치의 차이는 하기 방정식에 따라 결정된다:
ΔCt시험 = CtDPD-Ctβ-액틴("시험" 반응 유래)
ΔCt교정기 = CtDPD-Ctβ-액틴("교정" 반응 유래)
다음 단계는 하기 방정식에 따라 2를 마이너스 ΔCt 제곱하는 것을 포함한다.
2-ΔCt test ("시험" 반응 유래)
2-ΔCt 교정기("교정" 반응 유래)
이후 TaqMan 기기 유래의 DPD에 대한 보정되지 않은 유전자 발현을 수득하기 위해 하기 계산이 수행된다:
DPD에 대한 보정되지 않은 유전자 발현(UGE) = 2-ΔCt test/2-ΔCt 교정기
알려진 상대 DPD 발현 수치로 UGE의 표준화
표준화 계산은 UGE에 DPD 및 특정 교정기 RNA에 특이적인 보정 인자(KDPD)를 곱하는 것을 포함한다. 보정 인자 KDPD는 어떠한 내부 대조군 유전자 및 어떠한 정확하게 미리-정량된 교정기 RNA로부터도 측정될 수 있다. 바람직하게는 내부 대조군 유전자 β-액틴 및 정확하게 미리-정량된 교정기 RNA인 Applied Biosystems의 Universal PE RNA; Cat #4307281, lot # 3617812014가 사용된다.
표준화는 상기 기재된 User Bulletin #2 내 Applied Biosystems, the TaqMan 제조사에 의해 기재된 ΔCt 방법의 변형을 이용하여 달성된다. 이러한 절차를 수행하기 위해 상기 기재된 TaqMan 방법을 이용하여 6개의 다른 종전 공개된 조직의 UGE가 DPD에 대해 분석되었다. 내부 대조군 유전자 β-액틴 및 교정기 RNA인 Applied Biosystems의 Universal PE RNA; Cat #4307281, lot # 3617812014가 사용되었다.
그 전체가 참고문헌으로 포함된 Salonga el al.,에 종전 기재된 각각의 표본 L7, L91, L121, L150, L220 및 L164의 상대 DPD 발현 수치(PV)는 그의 상응하는 TaqMan 유래 UGE로 나누어 비평균화 보정 인자 K를 생성하였다.
K비평균 = PV/UGE
다음으로 모든 K 수치는 평균되어 DPD, Universal PE RNA; Cat #4307281, lot # 3617812014 교정기 RNA 및 β-액틴에 특이적인 단일 KDPD 보정 인자를 결정한다.
따라서 종전 공개된 pre-TaqMan DPD 발현 연구와 일치하는 규모 상에서 알려지지 않은 조직 표본 내 보정 상대 DPD 발현을 측정하기 위해 동일한 내부 대조군 유전자 및 교정기 RNA 사용을 조건으로 TaqMan 기기 유래의 보정되지 않은 유전자 발현 데이터(UGE)에 KDPD 특이적 보정 인자를 곱한다.
보정 상대 DPD 발현 = UGE x KDPD
KDPD는 어떠한 정확하게 미리-정량된 교정기 RNA 이용하여서도 측정된다. 미리-정량된 RNA의 미래 공급원은 상기 방법에 기재된 바와 같이 공개된 표본에 대해 교정될 수 있거나 상기 기재된 Universal PE RNA; Cat #4307281, lot # 3617812014와 같은 종전 교정된 교정기 RNA에 대해 교정된다.
실시예 9: FPE 대장 종양 표본 내 DPD 발현
상기 기재된 방법은 진행성 대장암 환자 34명 유래의 34개 종양 표본을 분석하는데 이용되었다. 모든 환자는 장래 다기관 유럽 5-FU/CPT11 교차 시험 V239의 일부로서 정맥내 5-FU/LV 병용 요법으로 치료되었다. 모든 환자는 류코보린 20 mg/m2로 연속 5일간 15분 주입으로 제공된 정맥내 5-FU 425 mg/m2로 치료되고 연속 5일간 주입으로 제공되었다.
환자의 9명(25.5%)은 완전한 반응, 부분적 반응 및 최소 반응을 포함한 어떠한 반응으로도 정의된 반응으로 5-FU/LV에 반응하였다. 진행성 질환 또는 안정적 질환을 지닌 환자는 무-반응자로 분류되었다(25명 환자, 73.5%). 전체 mRNA는 현미해부된 FPE 전처리 종양 표본에서 분리되었고, DPD/β-액틴의 상대 mRNA 발현 수치는 기재된 바와 같이 정량적 PCR을 이용하여 측정되었다. 반응 및 무-반응 환자 그룹에 대한 평균 보정 DPD:β-액틴 수치는 각각 0.87 x 10-3 및 2.04 x 10-3이었다. 2개의 독립 표본 세트 내 수치 랭크를 비교하는 Mann-Whitney U 테스트는 반응 및 무-반응 환자 그룹 내 보정 상대 DPD 발현 수치를 비교하는데 이용되었다. 상대 DPD 수치는 무-반응자와 비교시 반응자 그룹에서 유의적으로 낮았다(P=0.02). 이들 환자 내 DPD mRNA 발현과 5-FU/LV에 대한 반응간의 연관성은 도 16에 나타나 있다. 이들 데이터는 DPD 발현이 5-FU-기반 화학요법에 대한 반응의 예후 인자임을 나타낸다.
실시예 10: TS에 대한 보정되지 않은 유전자 발현(UGE)의 측정
2쌍의 병행 반응이 수행된다. "시험" 반응 및 "교정" 반응. 도 24. TS 증폭 반응 및 β-액틴 내부 대조군 증폭 반응은 시험 반응이다. 개별적인 TS 및 β-액틴 증폭 반응은 교정기 RNA 주형 상에서 수행되고 교정 반응으로 표기된다. TaqMan 기기는 4개의 다른 사이클 역치(Ct) 수치를 생성할 것이다: 시험 반응 유래의 CtTS 및 Ctβ-액틴 및 교정 반응 유래의 CtTS 및 Ctβ-액틴.
2개 반응에 대한 Ct 수치의 차이는 하기 방정식에 따라 결정된다:
ΔCt시험 = CtTS-Ctβ-액틴("시험" 반응 유래)
ΔCt교정기 = CtTS-Ctβ-액틴("교정" 반응 유래)
다음 단계는 하기 방정식에 따라 2를 마이너스 ΔCt 제곱하는 것을 포함한다.
2-ΔCt test ("시험" 반응 유래)
2-ΔCt 교정기("교정" 반응 유래)
이후 TaqMan 기기 유래의 TS에 대한 보정되지 않은 유전자 발현을 수득하기 위해 하기 계산이 수행된다:
TS에 대한 보정되지 않은 유전자 발현(UGE) = 2-ΔCt test/2-ΔCt 교정기
알려진 상대 TS 발현 수치로 UGE의 표준화
표준화 계산은 UGE에 TS 및 특정 교정기 RNA에 특이적인 보정 인자(KTS)를 곱하는 것을 포함한다. 보정 인자 KTS는 어떠한 내부 대조군 유전자 및 어떠한 정확하게 미리-정량된 교정기 RNA로부터도 측정될 수 있다. 바람직하게는 내부 대조군 유전자 β-액틴 및 정확하게 미리-정량된 교정기 RNA인 Applied Biosystems의 Universal PE RNA; Cat #4307281, lot # 3617812014가 사용된다. 이들 시약의 경우 보정 인자 KTS는 12.6 x 10-3과 동일하다.
표준화는 상기 기재된 User Bulletin #2 내 Applied Biosystems, the TaqMan 제조사에 의해 기재된 ΔCt 방법의 변형을 이용하여 달성된다. 이러한 절차를 수행하기 위해 상기 기재된 TaqMan 방법을 이용하여 6개의 다른 종전 공개된 시험 조직의 UGE가 TS 발현에 대해 분석되었다. 이들 조직 표본은 그 전체가 참고문헌에 포함된 Salonga el al., Clinical Cancer Research, 6:1322 1327, 2000에 기재되어 있다. 내부 대조군 유전자 β-액틴 및 교정기 RNA인 Applied Biosystems의 Universal PE RNA; Cat #4307281, lot # 3617812014가 사용되었다.
종전 공개된 각각의 표본 L7, L91, L121, L150, L220 및 L164의 상대 TS 발현 수치는 그의 상응하는 TaqMan 유래 UGE로 나누어 비평균화 보정 인자 K를 생성하였다(그 전체가 참고문헌에 포함된 Salonga el al., Clinical Cancer Research, 6:1322 1327, 2000).
K비평균 = 알려진 수치/UGE
다음으로 모든 K 수치는 평균되어 TS, Applied Biosystems의 Universal PE RNA; Cat #4307281, lot # 3617812014 교정기 RNA 및 β-액틴에 특이적인 단일 KTS 보정 인자를 결정한다.
따라서 pre-TaqMan TS 발현 연구와 일치하는 규모 상에서 알려지지 않은 조직 표본 내 보정 상대 TS 발현을 측정하기 위해 동일한 내부 대조군 유전자 및 교정기 RNA 사용을 조건으로 TaqMan 기기 유래의 보정되지 않은 유전자 발현 데이터(UGE)에 KTS 특이적 보정 인자를 곱한다.
보정 상대 TS 발현 = UGE x KTS
KTS는 어떠한 정확하게 미리-정량된 교정기 RNA 이용하여서도 측정된다. 미리-정량된 RNA의 미래 공급원은 상기 방법에 기재된 바와 같이 알려진 상대 TS 발현 수치를 지닌 표본에 대해 교정될 수 있거나 상기 기재된 Applied Biosystems의 Universal PE RNA; Cat #4307281, lot # 3617812014와 같은 종전 교정된 교정기 RNA에 대해 교정된다.
예를 들어 후속 KTS가 다른 내부 대조군 유전자 및/또는 다른 교정기 RNA에 대해 측정되는 경우 특정한 내부 대조군 유전자에 대한 TS 발현 수치가 이미 측정되거나 공개된 바 있는 조직 표본에 대해 내부 대조군 유전자 및 교정기 RNA 모두를 교정해야 한다. 이러한 측정은 당분야에 잘 알려진 표준 pre-TaqMan, 정량적 RT-PCR을 이용하여 이루어질 수 있다. 이들 표본에 대해 알려진 발현 수치는 상응하는 UGE 수치로 나누어 상기 표본에 대한 K를 결정하게 된다. 이후 K 수치는 알려진 표본 수에 따라 평균되어 다른 내부 대조군 유전자 및/또는 교정기 RNA에 특이적인 새로운 KTS를 결정하게 된다.
실시예 11: 환자 선택 및 화학요법 치료
모든 환자는 1998∼2000년에 서던 캘리포니아 대학 의료 센터에서 특별 프로토콜 3C-98-3에 등록되었고, 하기 옥살리플라틴/5-FU 병용 치료 요법을 받았다: 130 mg/m2 옥살리플라틴 플러스 5-FU 연속 주입. 모든 환자는 5-FU로의 이전 치료가 실패하였고 60%(30/50)는 이리노테칸(CPT-11)로의 추가 2차 라인 치료가 실패하였다. 모든 환자는 프로토콜 진입시 단계 Ⅳ 대장암의 활성적 질환을 나타내었다.
임상 조사 및 반응 기준
화학요법 동안 매별 조사가 수행 상태, 체중, 복통, 전혈구 계산 및 혈청 크레아티닌 및 혈액 요소 질소 수치에 대해 기록되었다. 종양 부하는 전산화 단층촬영법(CT)를 이용하여 측정된다. 이차원 측정 가능 종양 덩어리가 프로토콜 진입시 요구되었다. 요법에 대한 반응자는 종양 부하가 6주 이상 동안 50% 이상까지 감소된 환자로 분류되었다. 무-반응자는 안정적 질환 또는 암 진행을 지닌 사람을 포함하였다. 생존은 5-FU/옥살리플라틴으로의 화학요법부터 어떠한 사망 원인까지의 일수로 산정되었다. 최종 추적 조사시 생존한 환자는 그 시점에 검열되었다.
통계 분석
TaqMan 분석은 2개의 절대 측정치간의 비율로 표기되는 수치를 제공한다(목적 유전자 : 내부 참조 유전자). Mann-Whitney 테스트 및 Kruskal-Wallis 테스트는 TS 및 ERCC1 발현(연속 변수로서)과 환자 인구통계학의 연관성을 조사하는데 이용되었다(각각 Zar, Biostatistical Analysis. Prentice-Hall, Inc Englewood Cliffs, NJ. (1974), pp. 109-114 and 139-142). 어떤 결정(cut-off) 역치 수치가 환자를 낮은 및 높은 TS 및 ERCC1 발현 서브그룹으로 가장 잘 이분화시키는지를 측정하기 위해 Miller and Sigmund(Biometrics 38: 1011-1016, 1982) 및 Halpern(Biometrics 38: 1017-1023, 1982)의 최대 카이-제곱 방법이 변경되었다.
이분화된 분자 표지와 화학요법에 대한 반응간의 연관성을 평가하기 위해 Pearson의 카이-제곱 테스트가 이용되었다(Zar, Biostatistical Analysis. Prentice-Hall, Inc Englewood Cliffs, NJ. (1974), pp. 59-68). 상대 사망 위험률을 계산하기 위해 위험 비율(hazard ratio)이 이용되었다(Schulman, Infection Control & Hospital Epidemiology, 18:65-73, 1997). 이들 계산은 로그-랭크 테스트 통계에서 계산시 관찰되고 예측된 이벤트 수를 이용하여 Pike 추정을 기반으로 하였다(Pike, J R Stat Soc Series A 135: 201-203, 1972). 최대 카이-제곱 분석을 기반으로 한 연관성의 강도 측정치로서 해석되는 P 수치를 측정하기 위해 1000개 부트-스트랩-유사 시뮬레이션이 연관성 부재 가설 하에 최대 카이-제곱 통계 분포를 추정하는데 이용되었다(Halpern, Biometrics 38: 1017 1023, 1982). 유의성 수치는 p<0.05로 조정되었다.
반응 및 생존 조사에 이용 가능한 인구통계학 및 환자
14명(28%)의 여성 및 36명(72%)의 남성으로 구성되고 59세의 중간 연령(최소: 34; 최대: 83)을 지닌 50명 환자 전체가 본 연구에서 조사되었다. 이러한 그룹의 인종 배경은 39명의 코카시안계, 6명의 히스패닉계, 3명의 아시아계 및 2명의 아프리카-아메리카계를 포함하였다. 50명 환자 모두는 TS 발현 및 ERCC1 발현 수치를 생존과 관련시키는데 평가 가능하였다. 45명(90%)은 이러한 분자 파라미터와 상기 인용된 기준에 의한 반응간의 연관성을 시험하는데 평가 가능하였다.
TS 발현 수치 및 ERCC1 발현 수치
전체 mRNA는 현미해부된 FPE 전처리 종양 표본에서 분리되었고, ERCC1의 상대 mRNA 발현 수치 : β-액틴 및 또는 TS : β-액틴은 정량적 RT-PCR을 이용하여 측정되었다. 이러한 표본으로부터 mRNA의 분리 방법은 본원 및 1999년 12월 20일 출원되고 참고문헌으로 포함된 미국 특허출원 제09/469,338호에 기재되어 있다. 종전 기재된 바와 같이 ERCC1 및 β-액틴의 발현 수치를 측정하기 위해 역전사/중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)-기반 분석 시스템이 이용되었다. 보정 상대 ERCC1 및/또는 TS 발현은 상기 기재된 바와 같이 측정되었다.
TS 유전자 발현은 분석된 50개 표본 모두에서 검출 가능하였다. 하우스키핑 유전자인 β-유전자에 대한 중간 보정 TS 발현은 3.4 x 10-3(최소: 0.18 x l0-3; 최대: 11.5 x 10-3)이었다. 보정 ERCC1 유전자 발현은 분석된 47개(94%) 표본에서 검출 가능하였다. 중간 보정 ERCC1 발현은 2.53 x 10-3(최소: 0.00; 최대: 14.61 x 10-3)이었다. 성별, 연령 및 인종 기원에 의한 분석시 보정 TS 및 ERCC1 mRNA 내 유의적인 차이는 발견되지 않았다.
TS 발현과 관련한 생존
본 연구에서 분석된 50명 환자에 대한 10.5개월의 중간 추적 기간에(95% C.I.: 1.8,21.2) 중간 생존은 8.4개월(95% C.I.: 6.4,12.3)이었다. 7.5 x 10-3의 TS 역치 수치를 이용하여 43명(86%) 환자는 낮은 보정 TS 발현 수치를 지녔고, 7명(14%) 환자는 높은 보정 TS 발현 수치를 지녔다. 보정 TS 유전자 발현과 생존간의 연관성을 조사하기 위해 로그-랭크 테스트가 이용되었다. 각각의 생존 곡선은 도 17에 나타나 있고 낮은 보정 TS 발현 그룹에서 10.2개월(95% C.I.: 7.4,15.1) 및 높은 보정 TS 발현 그룹에서 1.5개월(95% C.I.: 1.1,2.1)의 중간 생존을 나타낸다(P<0.001; 로그랭크 테스트). 6개월에 생존 가능성은 높은 발현자 그룹의 경우 0.00인데 반해 보정 TS 발현.ltoreq.7.5 x lO-3을 지닌 환자의 경우 0.77이었다. 단일변수 분석시 보정 TS 발현 수치>7.5 x 10-3을 지닌 환자는 TS 수치 ltoreq.7.5 x lO-3을 지닌 환자와 비교시 8.4배(95% CI: 2.63,27.13) 증가된 상대 사망 위험률을 지녔다(p<0.001, 도 17).
ERCC1 발현과 관련한 생존
역치로서 4.9 x 10-3을 이용하여 40명(80%)은 낮은 보정 ERCC1 발현 수치를 지녔고, 10명(20%)은 높은 보정 ERCC1 발현 수치를 지녔다. 도 22는 추정된 생존 가능성 대비 보정 ERCC1 발현 수치의 Kaplan Meier 도표를 나타내고, 낮은 발현자 그룹에서 10.2개월(95% C.I.: 7.8,15.1) 및 높은 발현자 그룹에서 1.9개월(95% C.I.: 1.1,4.9)의 중간 생존을 나타낸다(P<0.001; 로그랭크 테스트). 6개월에 생존 가능성은 보정 ERCC1 발현 >4.9 x 10-3을 지닌 환자의 경우 0.16인데 반해 보정 ERCC1 발현.ltoreq.4.9 x lO-3을 지닌 환자의 경우 0.76이었다. 단일변수 분석시 보정 TS 발현 수치>4.9 x 10-3을 지닌 환자는 보정 ERCC 수치.ltoreq.4.9 x lO-3을 지닌 환자와 비교시 4.8배(95% CI: 2.09,15.88) 증가된 상대 사망 위험률을 지녔다(p<0.001, 도 20).
합동 ERCC1 및 TS 발현과 관련한 생존
낮은 보정 TS 및 ERCC1 발현 수치가 36명(72%) 환자에서 검출되었고, 14명(28%) 환자는 높은 보정 TS 및/또는 ERCC1 발현 수치를 지녔다. 두 유전자 모두에 대해 낮은 발현 수치를 지닌 환자는 유의적으로 우수한 생존을 지녔다. 중간 생존은 낮은 보정 TS 및 ERCC1 발현자의 경우 11.1개월((95% CI: 8.4,17.5)이고 낮은 보정 TS 및/또는 ERCC1 발현자의 경우 1.9개월(95% CI: 1.1,4.9)이었다(P<0.001, 로그랭크 테스트; 도 19). 두 유전자 모두에 대해 낮은 보정 발현 수치를 지닌 환자는 TS 또는 ERCC1 중 하나 이상의 유전자에 대해 높은 보정 발현 수치를 지닌 환자의 경우 0.10인데 반해 0.85의 6개월 생존 가능성을 지녔다. 종양 내 두 유전자 모두에 대해 낮은 발현 수치를 나타낸 환자와 비교시 하나 이상의 유전자(TS 또는 ERCC1)에 대해 증가된 보정 발현을 지닌 환자의 경우 상대 사망 위험률은 7.12(95% CI: 2.60,19.52)이었다(P<0.001; 도 20). TS 및 ERCC1 mRNA 발현은 계층화 분석에 의해 나타난 바와 같이 서로 독립적이다(도 24).
반응과 TS 및 ERCC1 유전자 발현 수치와의 연관성
중간 보정 TS 발현 수치는 45명의 측정 가능한 환자에 대해 3.4 x 10-3(최소: 0.18 x 10-3; 최대: 11.50 x 10-3)이었고 전체 50명 환자-집단과 동일하다. 종양을 낮은 및 높은 TS 발현자로 분리시킴으로서 반응이 분석되는 경우 3/4(75%)의 부분적 반응자, 26/27(96%)의 안정적 질환 환자 및 9/14(64%)의 진행성 질환 환자가 낮은 보정 TS 발현을 지녔다(P=0.02; Fisher's Exact Test).
중간 보정 ERCC1 발현 수치는 45명의 측정 가능한 환자에 대해 2.7 x 10-3(최소: 0.00; 최대: 14.16 x 10-3)이었고 전체 50명 환자-집단과 유의적으로 상이하지 않았다. 그러나 ERCC1 발현 수치는 화학요법에 대한 반응과 통계적으로 유의적으로 관련되지 않았다(p=0.29; Fisher's Exact Test).
실시예 12: EGFR에 대한 보정되지 않은 유전자 발현(UGE) 측정
2쌍의 병행 반응이 수행되었다. "시험" 반응 및 "교정" 반응. 도 29. EGFR 증폭 반응 및 β-액틴 내부 대조군 증폭 반응은 시험 반응이다. 개별적인 EGFR 및 β-액틴 증폭 반응은 교정기 RNA 주형 상에서 수행되고 교정 반응으로 표기된다. TaqMan 기기는 4개의 다른 사이클 역치(Ct) 수치를 생성할 것이다: 시험 반응 유래의 CtEGFR 및 Ctβ-액틴 및 교정 반응 유래의 CtEGFR 및 Ctβ-액틴. 2가지 반응에 대한 Ct 수치의 차이는 하기 방정식에 따라 결정된다:
ΔCt시험 = CtEGFR-Ctβ-액틴("시험" 반응 유래)
ΔCt교정기 = CtEGFR-Ctβ-액틴("교정" 반응 유래)
다음 단계는 하기 방정식에 따라 2를 마이너스 ΔCt 제곱하는 것을 포함한다.
2-ΔCt test ("시험" 반응 유래)
2-ΔCt 교정기("교정" 반응 유래)
이후 TaqMan 기기 유래의 EGFR에 대한 보정되지 않은 유전자 발현을 수득하기 위해 하기 계산이 수행된다:
EGFR에 대한 보정되지 않은 유전자 발현(UGE) = 2-ΔCt test/2-ΔCt 교정기
알려진 상대 EGFR 발현 수치로 UGE의 표준화
표준화 계산은 UGE에 EGFR 및 특정 교정기 RNA에 특이적인 보정 인자(KEGFR)를 곱하는 것을 포함한다. 또한 보정 인자 KEGFR은 어떠한 내부 대조군 유전자 및 어떠한 정확하게 미리-정량된 교정기 RNA로부터도 측정될 수 있다. 바람직하게는 내부 대조군 유전자 β-액틴 및 정확하게 미리-정량된 교정기 RNA 인간 간 전체 RNA(Stratagene, Cat. #735017)가 사용된다. 이들 시약의 경우 보정 인자 KEGFR은 1.54와 동일하다.
표준화는 상기 기재된 User Bulletin #2 내 Applied Biosystems, the TaqMan 제조사에 의해 기재된 ΔCt 방법의 변형을 이용하여 달성된다. 이러한 절차를 수행하기 위해 상기 기재된 TaqMan 방법을 이용하여 6개의 다른 FPE 시험 조직의 UGE이 EGFR에 대해 분석되었다. 내부 대조군 유전자 β-액틴 및 교정기 RNA인 인간 간 전체 RNA(Stratagene, Cat. #735017)가 사용되었다.
각각의 표본 AG221, AG222, AG252, 성인 폐, PC3, AdCo1에 대해 알려진 상대 EGFR 발현 수치는 그의 상응하는 TaqMan 유래 UGE로 나누어 비평균화 보정 인자 K를 생성하였다.
K비평균 = 알려진 수치/UGE
다음으로 모든 K 수치는 평균되어 EGFR, 교정기 RNA 유래의 인간 간 전체 RNA(Stratagene, Cat. #735017) 및 β-액틴에 특이적인 단일 KEGFR 보정 인자를 결정한다.
따라서 pre-TaqMan EGFR 발현 연구와 일치하는 규모 상에서 알려지지 않은 조직 표본 내 보정 상대 EGFR 발현을 측정하기 위해 동일한 내부 대조군 유전자 및 교정기 RNA 사용을 조건으로 TaqMan 기기 유래의 보정되지 않은 유전자 발현 데이터(UGE)에 KEGFR 특이적 보정 인자를 곱한다.
보정 상대 EGFR 발현 = UGE x KEGFR
KEGFR은 어떠한 정확하게 미리-정량된 교정기 RNA 또는 내부 대조군 유전자를 이용하여서도 측정된다. 미리-정량된 RNA의 미래 공급원은 상기 방법에 기재된 바와 같이 알려진 상대 EGFR 발현 수치로 알려진 표본에 대해 교정될 수 있거나 상기 기재된 인간 간 전체 RNA(Stratagene, Cat. #735017)와 같은 종전 교정된 교정기 RNA에 대해 교정된다.
예를 들어 후속 KEGFR이 다른 내부 대조군 유전자 및/또는 다른 교정기 RNA에 대해 측정되는 경우 특정한 내부 대조군 유전자에 대한 EGFR 발현 수치가 이미 측정된 바 있는 조직 표본에 대해 내부 대조군 유전자 및 교정기 RNA 모두를 교정해야 한다. 이러한 측정은 당분야에 잘 알려진 표준 pre-TaqMan, 정량적 RT-PCR을 이용하여 이루어질 수 있다. 이들 표본에 대해 알려진 발현 수치는 상응하는 UGE 수치로 나누어 상기 표본에 대한 K를 결정하게 된다. 이후 K 수치는 알려진 표본 수에 따라 평균되어 다른 내부 대조군 유전자 및/또는 교정기 RNA에 특이적인 새로운 KEGFR을 결정하게 된다.
실시예 13: HER2-neu에 대한 보정되지 않은 유전자 발현(UGE)의 측정
2쌍의 병행 반응이 수행되었다. "시험" 반응 및 "교정" 반응. 도 26. HER2-neu 증폭 반응 및 β-액틴 내부 대조군 증폭 반응은 시험 반응이다. 개별적인 HER2-neu 및 β-액틴 증폭 반응은 교정기 RNA 주형 상에서 수행되고 교정 반응으로 표기된다. TaqMan 기기는 4개의 다른 사이클 역치(Ct) 수치를 생성할 것이다: 시험 반응 유래의 CtHER2-neu 및 Ctβ-액틴 및 교정 반응 유래의 CtHER2-neu 및 Ctβ-액틴. 2가지 반응에 대한 Ct 수치의 차이는 하기 방정식에 따라 결정된다:
ΔCt시험 = CtHER2-neu-Ctβ-액틴("시험" 반응 유래)
ΔCt교정기 = CtHER2-neu-Ctβ-액틴("교정" 반응 유래)
다음 단계는 하기 방정식에 따라 2를 마이너스 ΔCt 제곱하는 것을 포함한다.
2-ΔCt test ("시험" 반응 유래)
2-ΔCt 교정기("교정" 반응 유래)
이후 TaqMan 기기 유래의 HER2-neu에 대한 보정되지 않은 유전자 발현을 수득하기 위해 하기 계산이 수행된다:
HER2-neu에 대한 보정되지 않은 유전자 발현(UGE) = 2-ΔCt test/2-ΔCt 교정기
알려진 상대 HER2-neu 발현 수치로 UGE의 표준화
표준화 계산은 UGE에 HER2-neu 및 특정 교정기 RNA에 특이적인 보정 인자(KHER2-neu)를 곱하는 것을 포함한다. 또한 보정 인자 KHER2-neu는 어떠한 내부 대조군 유전자 및 어떠한 정확하게 미리-정량된 교정기 RNA로부터도 측정될 수 있다. 바람직하게는 내부 대조군 유전자 β-액틴 및 정확하게 미리-정량된 교정기 RNA 인간 간 전체 RNA(Stratagene, Cat. #735017)가 사용된다. β-액틴 및 정확하게 미리-정량된 교정기 RNA인 인간 간 전체 RNA(Stratagene, Cat. #735017)를 이용하면 보정 인자 KHER2-neu는 12.6 x 10-3과 동일하다.
표준화는 상기 기재된 User Bulletin #2 내 Applied Biosystems, the TaqMan 제조사에 의해 기재된 ΔCt 방법의 변형을 이용하여 달성된다. 이러한 절차를 수행하기 위해 상기 기재된 TaqMan 방법을 이용하여 6개의 다른 FPE 시험 조직의 UGE이 HER2-neu에 대해 분석되었다. 내부 대조군 유전자 β-액틴 및 교정기 RNA인 인간 간 전체 RNA(Stratagene, Cat. #735017)가 사용되었다.
각각의 표본 AG221, AG222, AG252, 성인 폐, PC3, AdCo1에 대해 알려진 상대 HER2-neu 발현 수치는 그의 상응하는 TaqMan 유래 UGE로 나누어 비평균화 보정 인자 K를 생성하였다.
K비평균 = 알려진 수치/UGE
다음으로 모든 K 수치는 평균되어 HER2-neu, 교정기 RNA 유래의 인간 간 전체 RNA(Stratagene, Cat. #735017) 및 β-액틴에 특이적인 단일 KHER2-neu 보정 인자를 결정한다.
따라서 pre-TaqMan EGFR 발현 연구와 일치하는 규모 상에서 알려지지 않은 조직 표본 내 보정 상대 HER2-neu 발현을 측정하기 위해 동일한 내부 대조군 유전자 및 교정기 RNA 사용을 조건으로 TaqMan 기기 유래의 보정되지 않은 유전자 발현 데이터(UGE)에 KHER2-neu 특이적 보정 인자를 곱한다.
보정 상대 HER2-neu 발현 = UGE x KHER2-neu
KHER2-neu는 어떠한 정확하게 미리-정량된 교정기 RNA 또는 내부 대조군 유전자를 이용하여서도 측정된다. 미리-정량된 RNA의 미래 공급원은 상기 방법에 기재된 바와 같이 알려진 상대 HER2-neu 발현 수치로 알려진 표본에 대해 교정될 수 있거나 상기 기재된 인간 간 전체 RNA(Stratagene, Cat. #735017)와 같은 종전 교정된 교정기 RNA에 대해 교정된다.
예를 들어 후속 KHER2-neu가 다른 내부 대조군 유전자 및/또는 다른 교정기 RNA에 대해 측정되는 경우 특정한 내부 대조군 유전자에 대한 HER2-neu 발현 수치가 이미 측정된 바 있는 조직 표본에 대해 내부 대조군 유전자 및 교정기 RNA 모두를 교정해야 한다. 이러한 측정은 당분야에 잘 알려진 표준 pre-TaqMan, 정량적 RT-PCR을 이용하여 이루어질 수 있다. 이들 표본에 대해 알려진 발현 수치는 상응하는 UGE 수치로 나누어 상기 표본에 대한 K를 결정하게 된다. 이후 K 수치는 알려진 표본 수에 따라 평균되어 다른 내부 대조군 유전자 및/또는 교정기 RNA에 특이적인 새로운 KHER2-neu를 결정하게 된다.
실시예 14: 다른 농도의 EDTA 및 다른 인큐베이션 온도의 시험
실시예 1에 기재된 절차는 추출 용액 내 4개 다른 농도의 EDTA(0.l mM, 0.6 mM, 3.6 mM 및 2O mM) 및 4개 다른 인큐베이션 온도(44, 50, 56 및 62℃)를 이용하여 수행되었다. 이들 변수는 2개의 다른 FFPE 표본으로 평가되었다. 4개의 다른 프라이머 세트가 사용되었다 - 100, 300, 400 및 lOOO bp 프라이머(프라이머가 RNA의 3'(폴리 A) 말단으로부터 100, 300, 400 또는 1,000 bp 떨어져 있음을 의미). 올리고 dT 역전사효소가 수행되었다. 추출 과정은 다양한 온도에서 16시간 동안 Tris/EDTA/PK 완충액(상기 기재된)을 사용하였다. DNA 오염을 제거하기 위해 단일 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올(PCI) 추출이 수행되었다. 분리된 RNA는 50 ㎕ Tris 내에 재현탁되었다.
데이터는 모든 인큐베이션 온도가 수행되고 다른 EDTA 농도가 수행되었으나 긴 단편 RNA를 수득하기 위한 바람직한 파라미터는 3.6 mM EDTA 및 50∼56℃ 온도 범위를 이용하였음을 나타내었다(최하 Ct에 의해 나타남). 하기 표 2 참조.
Figure pct00001
실시예 15: 킬레이트제로서 EDTA 대신 구연산나트륨 또는 EGTA의 사용
본 실험에서 3개의 다른 킬레이트제가 시험되었다: EDTA, EGTA 및 구연산나트륨. EGTA 및 구연산나트륨은 3.6 mM EDTA와 함께 0.1, 0.6, 3.6 및 20 mM에서 시험되었다. 표본은 50℃에서 16시간 동안 인큐베이트되었다 오염 DNA를 제거하기 위해 단일 페놀/클로로포름 단계가 이용되었다. 분리된 RNA는 50 ㎕ Tis 내에 재현탁되었다. 결과는 0.6 및 3.6 mM의 구연산나트륨이 우수한 킬레이트제이고 20 mM의 높은 농도에서도 작용함을 나타내었다. 하기 표 3 참조.
Figure pct00002
실시예 16: PK 농도 및 인큐베이션 시간
RNA 추출은 0.5x, 1x, 2x 및 4x PK 농도를 지닌 Tris/EDTA/PK 완충액으로 구성된 추출 용액을 제외하고는 상기 기재된 바와 같이 수행되었다. 1x PK 농도 = 500 ㎍/ml. 3, 6, 12, 16 및 20시간의 인큐베이션 시간이 평가되었고 단일 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올(PCI) 추출이 수행되었다. RNA는 50 ㎕ Tris 내에 재현탁되었다. 올리고 dT 역전사효소가 수행되었다. 결과는 바람직한 인큐베이션 시간이 50℃에서 16시간 동안임을 나타내었다. 모든 다른 농도의 PK가 수행되었고 1x 뿐만 아니라 더 높은 농도도 수행되었음을 나타낸다. 표 4 참조.
Figure pct00003
Figure pct00004

실시예 17: FFPE 췌장 관선암종(PDA) 조직으로부터 mRNA 및 gDNA 분리
본 발명의 방법을 이용하여 RNA가 FFPE 췌장 관선암종(PDA) 조직 표본에서 분리되었다. 전체적인 mRNA 발현 및 gDNA 복제수 데이터는 단일 현미해부된 표본에서 수득되었고 동일한 플랫폼 상에서 개별적으로 처리된 조직 유래의 데이터와 비교되었다. mRNA 및 gDNA 데이터는 중복 프로브(gDNA의 경우) 및 강한 복제수/mRNA 발현 합치의 중간 비율에 이해 입증된 바와 같이 동결 비-현미해부 종양 조직에 대한 우수한 품질과 유사한 것으로 판명되었다.
후복막기간에서 조직을 수득하는 것이 어렵고 수득된 핵산의 불량한 품질로 인해 췌장 관선암종(PDA) 원발 종양의 발현 및 복제수 패턴에 관해 거의 알려진 바 없다. 더욱이 중증 결합조직증식증은 기질 오염을 유발하고(Chu, G.C., et al., Stromal biology of pancreatic cancer. J Cell Biochem, 2007. 101(4): p. 887-907) 기관의 과도한 자가분해 특성은 분해된 핵산 품질을 유발한다.
종양 조직의 현미해부는 수동 또는 레이저 해부 기술을 이용하여 수행되었다. 현미해부 후 gDNA는 Response Genetics(Los Angeles, CA)에서 독점적 추출 절차에 의해 분리되었다. 전체 RNA는 본 발명의 방법으로 분리되었다. 2개 회수의 RNA 증폭 및 cDNA 제조는 종전 기재된 바와 같이 수행되었다(Lord, R. V., et al., Telomerase reverse transcriptase expression is increased early in the Barrett's metaplasia, dysplasia, adenocarcinoma sequence. J Gastrointest Surg, 2000. 4(2): p.135-42). cRNA가 합성되고 Affymetrix HuI 33Plus2 칩에 혼성화되었다. 동시-추출된 gDNA(70 ng)은 종전 기재된 바와 같이 분자 전도 프로브(MIP) 플랫폼 상에서 광범위 게놈 대립유전자-특이적 복제수 분석이 수행되었다(Wang, Y., et al., Analysis of molecular inversion probe performance for allele copy number determination. Genome Biol, 2007. 8(11): p. R246).
게놈 DNA 및 mRNA는 PDA 내 단일 현미해부된 FFPE 표본에서 성공적이고 일관되게 동시-분리되고 광범위-게놈 규모 상에서 발현 및 대립유전자 특이적 복제수에 대해 분석될 수 있음이 판명되었다. FFPE MIP 데이터는 비-현미해부된 동결 종양 표본에 적당하게 비교되었다. 유전자 발현은 개별적으로 추출된 표본 내의 복제수를 반영한다. 핵산의 현미해부 및 동시-추출(mRNA 및 gDNA)의 이러한 방법은 보관 FFPE 조직을 다수의 플랫폼 상에서 광범위 게놈 분석에 이용 가능하게 하고, 유전성 질환 연구 및 신선한 재료가 거의 이용 가능하지 않은 임상적 시험과 관련한 게놈 분석에 이용 가능한 큰 병리학적 보관소 내에 존재하는 가치 있는 환자 표본 유래의 데이터를 극대화시킨다.
실시예 18: 상기 논의된 프라이머의 서열:
ERCC1-504F 서열번호:1 gggaatttgg cgacgtaatt c
ERCC1-574R 서열번호:2 gcggaggctg aggaacag
GST-F 서열번호: 3 cctgtaccag tccaatacca tcct
GST-R 서열번호: 4 tcctgctggt ccttcccata
DPD3A 서열번호: 5 aggacgcaag gagggtttg
DPD3a-13R 서열번호: 6 gtccgccgag tccttactga
DPD3b-651F 서열번호: 7 gaagcctatt ctgcaaagat tgc
DPD3b-736R 서열번호: 8 gagtacccca atcgagccaa a
TS-763F 서열번호: 9 ggcctcggtg tgccttt
TS-825R 서열번호: 10 gatgtgcgca atcatgtacg t
EGFR-1753F 서열번호: 11 tgcgtctctt gccggaat
EGFR-1823R 서열번호: 12 ggctcaccct ccagaagctt
Her2-neu 2671F 서열번호: 13 ctgaactggt gtatgcagat tgc
Her2-neu 2699R 서열번호: 14 ttccgagcggccaagtc
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Claims (34)

  1. a) 약 0.1 mM 내지 약 20 mM 농도의 킬레이트제 및 프로티나제 K를 포함하는 추출 용액 내에서 고정 조직 표본을 약 44 내지 약 62℃ 범위의 온도로 약 3시간 이상의 시간 동안 가열시키는 단계;
    b) DNA 오염을 제거하는 단계; 및
    c) 상기 추출 용액에서 RNA를 분리하는 단계를 포함하는
    고정 조직 표본에서 긴 단편 RNA를 분리하는 방법
  2. 제 1항에 있어서, 상기 가열은 45 내지 약 60℃, 약 48 내지 약 58℃, 약 48 내지 약 55℃, 약 48 내지 52℃ 및 약 50℃의 온도 범위로 구성된 군에서 선택됨을 특징으로 하는 방법
  3. 제 1항에 있어서, 상기 가열은 약 50∼56℃임을 특징으로 하는 방법
  4. 제 1항에 있어서, 상기 시간은 4시간 이상임을 특징으로 하는 방법
  5. 제 4항에 있어서, 상기 시간은 8시간 이상임을 특징으로 하는 방법
  6. 제 5항에 있어서, 상기 시간은 12시간 이상임을 특징으로 하는 방법
  7. 제 6항에 있어서, 상기 시간은 14시간 이상임을 특징으로 하는 방법
  8. 제 7항에 있어서, 상기 시간은 약 16시간임을 특징으로 하는 방법
  9. 제 3항에 있어서, 상기 시간은 약 16시간임을 특징으로 하는 방법
  10. 제 1항에 있어서, 상기 킬레이트제는 EDTA, EGTA, 구연산염, 구연산, 살리실산, 살리실산염, 프탈산, 2,4-펜탄딘, 히스티딘, 히스티디놀 디하이드로클로라이드, 8-하이드록시퀴놀린, 8-하이드록시퀴놀린, 구연산염 또는 0-하이드록시퀴논으루 구성된 군에서 선택됨을 특징으로 하는 방법
  11. 제 1항에 있어서, 상기 킬레이트제는 EDTA임을 특징으로 하는 방법
  12. 제 1항에 있어서, 상기 킬레이트제는 구연산나트륨임을 특징으로 하는 방법
  13. 제 1항에 있어서, 상기 킬레이트제는 약 0.6 mM 내지 약 5.0 mM의 농도로 존재함을 특징으로 하는 방법
  14. 제 1항에 있어서, 상기 킬레이트제는 약 0.6 mM 내지 약 3.6 mM의 농도로 존재함을 특징으로 하는 방법
  15. 제 1항에 있어서, 상기 킬레이트제는 3.6 mM의 농도로 존재함을 특징으로 하는 방법
  16. 제 11항에 있어서, 상기 EDTA는 약 3.6 mM로 존재함을 특징으로 하는 방법
  17. 제 12항에 있어서, 상기 구연산나트륨은 약 0.6 mM 내지 약 3.6 mM로 존재함을 특징으로 하는 방법
  18. 제 1항에 있어서, 상기 DNA 오염 제거는 1차 및 2차 페놀 추출로 수행되고 상기 2차 페놀 추출은 무질서유발제(chaotropic agent)를 포함함을 특징으로 하는 방법
  19. 제 1항에 있어서, 상기 무질서유발제는 요소, 이소티오시안산구아니디니움, 티오시안산나트륨(NaSCN), 구아니딘 HCl, 염화구아니디니움, 티오시안산구아니디니움, 테트라클로로아세트산리튬, 과염소산나트륨, 테트라클로로아세트산루비듐, 요오드화칼륨 및 트리플루오로아세트산세슘으로 구성된 군에서 선택됨을 특징으로 하는 방법
  20. 제 1항에 있어서, 상기 무질서유발제는 이소티오시안산구아니디니움임을 특징으로 하는 방법
  21. 제 1항에 있어서, 상기 고정 표본은 포르말린-고정 파라핀 포매 조직 표본임을 특징으로 하는 방법
  22. 제 21항에 있어서, 상기 고정된 포르말린-고정 파라핀 포매 조직 표본은 5년 이하임을 특징으로 하는 방법
  23. 제 1항에 있어서, DNase는 이용되지 않음을 특징으로 하는 방법
  24. a) 추출 용액 내에서 고정 조직 표본을 약 50℃ 내지 약 56℃ 범위의 온도로 약 16시간의 시간 동안 가열시키는 단계; 및
    b) 2차 페놀 추출이 무질서유발제를 포함하는 1차 및 2차 페놀 추출을 수행하고 상기 추출 용액에서 RNA를 분리하는 단계를 포함하는
    긴 단편 RNA의 분리 방법
  25. a) 2.5 mM 내지 약 5.0 mM 농도의 킬레이트제 및 12.5 ㎍ 프로티나제 K/mL 농도의 프로티나제 K를 포함하는 추출 용액 내에서 포르말린-고정 파라핀 포매 조직 표본을 약 45℃ 내지 약 62℃ 범위의 온도로 3시간 이상의 시간 동안 가열시키는 단계; 및
    b) 2차 페놀 추출이 무질서유발제를 포함하는 1차 및 2차 페놀 추출을 수행하고 상기 추출 용액에서 RNA를 분리하는 단계를 포함하는
    긴 단편 RNA의 분리 방법
  26. a) 약 3.6 mM 농도의 EDTA 또는 구연산나트륨 및 12.5 ㎍ 프로티나제 K/mL 농도의 프로티나제 K를 포함하는 추출 용액 내에서 고정된 파라핀 포매 조직 표본을 약 50℃∼56℃의 온도로 약 16시간의 시간 동안 가열시키는 단계; 및
    b) 2차 페놀 추출이 무질서유발제를 포함하는 1차 및 2차 페놀 추출을 수행하고 상기 추출 용액에서 RNA를 분리하는 단계를 포함하는
    포르말린-고정 파라핀 포매 조직으로부터 긴 단편 RNA의 추출 방법
  27. 제 1항에 있어서, 긴 단편 RNA는 200개 뉴클레오타이드 길이 이상임을 특징으로 하는 방법
  28. 제 1항에 있어서, 상기 긴 단편 RNA는 300개 뉴클레오타이드 이상임을 특징으로 하는 방법
  29. 제 1항에 있어서, 상기 추출 방법은 DNA를 10% 이하로 동시-분리함을 특징으로 하는 방법
  30. 제 1항의 방법에 의해 분리된 긴 단편 RNA
  31. 제 30항의 긴 단편 RNA로부터 생성된 cDNA
  32. 유전자 발현 분석시 제 30항의 RNA의 이용
  33. a) 제 1항의 방법에 의해 조직 표본에서 긴 단편 RNA를 분리하는 단계;
    b) 증폭된 mRNA를 수득하기 위해 타겟 유전자 영역을 증폭 가능한 한 쌍의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 이용하여 mRNA를 증폭시키는 단계; 및
    c) 내부 대조군 유전자의 mRNA 품질에 대한 타겟 유전자 mRNA 품질을 측정하는 단계를 포함하는
    고정된 파리핀 포매 조직 표본 내 타겟 유전자 발현 수치의 측정 방법
  34. 제 33항에 있어서, 상기 타겟 유전자는 ERCC1, TS, DPD, Her2neu, Gst-pi, RRM1 또는 Kras임을 특징으로 하는 방법
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