JP2021503289A - 新規なcip2aバリアント及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
・ポリAテールを含まないNOCIVA特異的イントロンmRNA配列:配列番号1のヌクレオチド1635〜1983(350nt);
・新規なNOCIVAペプチド(13アミノ酸)をコードするNOCIVA mRNA配列:配列番号1のヌクレオチド1636〜1674(39nt);
・3’UTR:配列番号1のヌクレオチド1675〜2010(335nt);
・ポリAテールを含まない3’UTR:配列番号1のヌクレオチド1675〜1983(310nt);
・ポリAテール:配列番号1のヌクレオチド1984〜2010;及び
ポリアデニル化シグナル:配列番号1のヌクレオチド1962−1967。
a)対象から得られ、NOCIVA mRNAを含むことが疑われる生体試料を用意するステップと;
b)場合により、例えば、ランダム又はポリTプライマー又は配列特異的プライマーを使用して、mRNAのcDNAへの逆転写を実施するステップと;
c)場合により、もしあれば、上記試料中のNOCIVA特異的DNAを増幅するステップと;
d)上記作業に適したいずれかの選択された方法で、mRNA、cDNA又は増幅されたDNAなどのNOVICA特異的配列を検出するステップと
を含み、
ステップc)及びd)は別々に又は同時に実施することができる。
材料及び方法
3’RACE及び5’RACE
Macherey−Nagel NucleoSpin RNA IIキットで抽出した全RNAをRACE実験のテンプレートとして使用した。3’末端と5’末端の両方のcDNA増幅のために、Invitrogen 3’RACE(カタログ番号183743−019)及び5’RACE(カタログ番号18374−058)キットを製造元のプロトコルに従って使用した。複数の遺伝子特異的プライマー(GSP)を設計し、cDNA末端の適切なCIP2A関連増幅に使用した。増幅した配列をアガロースゲルに泳動し(予測フラグメントサイズに結合した割合)、切断し、DNA抽出し(NucleoSpin(登録商標)Gel及びPCR Clean−up、Macherey−Nagel)、分析用にDNA配列決定した。シーケンシングプライマーを、GSPの下流になるように設計した。
全RNAを、細胞株又は抽出された単核細胞(患者の骨髄試料)の細胞ペレットから単離した。細胞株からの全RNAをNucleoSpin RNA IIキット(Macherey−Nagel)で抽出し、患者の試料から、E.Z.N.A.(登録商標)全RNAキットI(OMEGA bio−tek)を使用して、製造元の指示に従って単核細胞からの全RNAを単離した。単離後、NanoDrop装置(ND−1000;NanoDrop Technologies)を使用してRNA濃度を測定した。
各遺伝子特異的アッセイのプライマーを、可能であれば、ゲノムDNAの増幅を回避するために、異なるエクソン配列に配置されるように設計した。各反応のプライマー濃度は300nM、プローブ濃度は200nMであった。qPCR反応の特異性を、アガロースゲル電気泳動及び融解曲線分析によって検証した。予想されるサイズの1つのバンド及び単一ピークがそれぞれ必要であった。製造元の指示に従って、KAPA PROBE FAST qPCRキット(Kapa Biosystems)及び7900 HT FastリアルタイムPCRシステム(Thermo Fisher)を使用して、標的cDNAの増幅を実施した。定量的リアルタイムPCRを以下の条件下で実行した:95℃で10分間、引き続いて95℃で15秒と60℃で1分間の45サイクル。相対遺伝子発現データを、SDSソフトウェア(バージョン2.4.1、Applied Biosystems)による2^−ΔΔC(t)方法を使用して、内因性ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)及びβアクチンの発現レベルに正規化した。結果は、少なくとも2つの独立した実験及び2つの技術的複製の平均から導出した。
ヒトCIP2Aの切断型ドメイン(1〜560、1〜330、561〜905)及び完全長NOCIVAを、N末端GSTタグ及びその間にTEV切断部位を有するpGEX‐4T1ベクター(GE Healthcare)にクローニングした。全ての構築物を、LB培地で増殖させた大腸菌(E.coli)BL21(DE3)細胞(Novagen)で過剰発現させた。細菌細胞を、OD600が0.5〜0.7に達するまで37℃で培養し、次いで、0.2mMイソプロピルβ−D−1−チオガラクトピラノシド(IPTG)によって16℃で一晩誘導した。細菌ペレットを回収し、超音波処理によって溶解した。GST融合タンパク質を、グルタチオンセファロース4Bカラム(GE17−0756−01、GE Healtcare)によって精製した。試料の純度を、SDS−PAGE及びクーマシーブリリアントブルーによる染色を使用して検証した。
以下の抗体を使用した:マウスモノクローナル抗CIP2A(sc−80659、Santa Cruz);マウスモノクローナル抗ヌクレオリンC23(sc−17826、Santa Cruz)、4’6−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI、Life Technologies)、ECL HRP結合二次抗体(GE Healthcare)、Alexa Fluorコンジュゲート二次抗体(488抗ウサギ、594抗マウス、Life Technologies)。
タンパク質抽出物を、変性条件下でSDS−PAGEを使用して分離し(4〜20%Mini−PROTEAN TGX Gels)、PVDF膜(Bio−Rad Laboratories)に移した。膜を5%ミルク−TBST(トリス緩衝生理食塩水及び0.1%Tween 20)でブロッキングし、指示された一次抗体と4℃で一晩インキュベートし、次いで、ECL HRP結合二次抗体(GE Healthcare)とRTで1時間インキュベートした。ECL Plusウエスタンブロット試薬(GE Healthcare)を膜に添加し、フィルムを現像した。
細胞を4%PFAにより室温で5分間固定し、洗浄し、PBS中0.2%Triton X−100+30%ウマ血清で15分間透過処理し、PBS中30%ウマ血清で室温で30分間ブロッキングした。細胞を洗浄し、次いで、PBS中30%ウマ血清に希釈した指示される一次抗体(1:100)で4℃で一晩染色した。次いで、細胞を洗浄し、Alexaコンジュゲート二次抗体(1:200)及び4’6−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI、核染色、1:10000)PBS中30%ウマ血清と室温で1時間インキュベートした。細胞の光学フィールドを、Zeiss Zeiss AxioVert 200M(Carl Zeiss)倒立蛍光顕微鏡で画像化した。
組織材料を、標準的な組織学の慣例に従って調製した、すなわち、緩衝ホルマリン(pH7.0)に固定し、パラフィンブロックに包埋した。免疫組織化学(IHC)を3μmに切断した切片に実施した。抗原回復のために、組織切片を、電子レンジ中、クエン酸緩衝液(Dako REAL Target Retrieval Solution、S2031、Dako、Glostrup、デンマーク)で2回、それぞれ7分間処理した。IHCをLab Vision Autostainer 480(Thermo−Fisher Scientific、Fremont、CA、米国)を使用して行い、シグナルを、色素原としてジアミノベンジジンを用いて、製造元のプロトコル(DPVB+110HRP;Immunovision Technologies、Vision Biosystems、Norwell、MA、米国)に従って、PowerVision+ポリマーキットを適用して検出した。NOCIVA特異的抗体(2つ別個、ウサギポリクローナル、Biogenes)を1:2000の希釈で適用した。
統計解析及び比較を、JMP Pro 12プログラムを使用して実施した。連続変数を記述統計(中央値、四分位範囲及び範囲)によって要約し、頻度及び百分率をカテゴリーデータについて計算した。連続変数の場合、独立した試料間の比較にはマン・ホイットニーのU検定を使用し、対応のあるデータにはウィルコクソンの順位和検定を使用した。全生存期間関数をカプラン・マイヤー推定法によって推定し、群間の比較にはログ・ランク検定を使用した。多変量解析を実施して、遺伝子発現レベル(中央値より下又は上)と応答(OSについて死亡vs生存、再燃について再燃vs非再燃)の関係を調べた。全ての試験を、5%有意水準で両側とした。
CIP2Aの潜在的なmRNAバリアントを特定するために、cDNA末端PCRアッセイ(3’RACE及び5’RACE)の迅速な増幅を、ヒト細胞株mRNA試料に使用した。結果として、RT−PCR及び配列決定によりさらに検証した3つのCIP2A mRNAバリアントを特定した(図1A)。1つのバリアント形態はCIP2Aエクソン1〜19のみを含み、もう1つのバリアント形態はエクソン1〜21を含んでいたが、3’UTRを欠いていた。NOCIVAと命名される新たなmRNA配列が特定され、これはエクソン13と14との間のイントロンの一部にC末端融合したCIP2Aのエクソン1〜13を含んでいた。図1Dは、選択的スプライシングによるKIAA1524遺伝子からのNOCIVA mRNA形成を示している。KIAA1524遺伝子エクソン13とエクソン14(図1D中下線)の間のイントロン領域(図1D中太字)は、スプライシング機構によって代替エクソンとみなされ、エクソン13の端に付着している。プレmRNAを処理してmRNAを成熟させた後、ポリ(A)テールをNOCIVA転写産物の3’末端に付着させる。よって、NOCIVA転写産物は、ユニークで、以前は未知の配列を形成した(図1A及び図1B)。興味深いことに、NOCIVA特異的イントロン配列はコーディングフレーム内にあり、CIP2A mRNA配列が先行し、13アミノ酸に対応する40ヌクレオチドの後に、古典的終止コドンTAAが続く(図1B)。NOCIVAの潜在的3´UTRは、およそ350ヌクレオチド、引き続いてAATAAA配列、及び古典的ポリA配列からなる。したがって、NOCIVA遺伝子産物は、C末端に13個の新たなアミノ酸(NNKNTQEAFQVTS)を有する切断型CIP2Aをコードする(図1B)。重要なことに、この13aaペプチド配列は、Blast相同性検索に基づくヒトプロテオームの既知のタンパク質配列と一致しない(表1)。NOCIVA発現についての検証PCRを、NOCIVAのユニークなC末端部分をコードするmRNAに特異的なプライマーを使用して、複数の細胞株で行った(図1C)。その後、ゲルからの正しいサイズのバンドを配列決定して、PCR産物がNOCIVA mRNA産物を表すことを確認した。
正常組織及びがん性組織におけるNOCIVA mRNAバリアントの発現を試験するために、正常細胞及びがん性細胞のパネルで2つのNOCIVA特異的プライマー−プローブセット(表2のプライマーとプローブのペア16及び17)を使用してqPCRを行った。患者由来のケラチノサイト(Ker)試料を、正常組織のモデルとして使用し、頭頸部扁平上皮がん(SCC)細胞試料を、がん性組織のモデルとして使用した。以前に、CIP2AがHNSCC試料で有意に過剰発現されることが示されており、その高発現はヒトHNSCCの患者の予後不良と相関している(Ventelaら、2015)。興味深いことに、NOCIVA発現も、Kerと比較してSCC試料における有意に上昇した発現を示した(図2A)。
AML患者試料におけるNOCIVA及びCIP2A mRNAの状態をさらに検証するために、診断AML患者の骨髄試料のより大きな試料パネルでqPCRを使用した。試料パネルは、2000年1月〜2010年7月の間に収集し、18〜65歳の、トゥルク大学中央病院(TYKS)で初発AML又は二次性AMLと診断された合計93人の患者からなる。ここで説明する試料収集と発現プロファイリングの両方について、有効な倫理的許可が得られた。各試料の発現正規化のためのハウスキーピング遺伝子としてGAPDH及びb−アクチンを使用した。AMLにおける過剰発現の程度を推定するために、AML試料におけるNOCIVAとCIP2A e20の両方の発現を、市販の正常な骨髄(BM)対照試料(Clontech)におけるこれらの遺伝子のレベルに正規化した。CIP2A及びNOCIVAに加えて、既知のAMLマーカーであるWT1とEVI1の発現、及び以前にAMLに関連付けられた他のPP2A阻害剤タンパク質、SETについて試料を分析した(Cicconeら、2015)。ほぼ全ての患者が正常な骨髄試料と比較して低レベルのCIP2Ae13又はCIP2Ae20を発現したが、AML試料の合計78%がNOCIVAの過剰発現を示した(図3A及び図3B)。正常な骨髄試料の2倍を超えるNOCIVA過剰発現を示す患者の割合は68%であった。WT1、EVI1及びSETは、公開された文献に一致する発現パターンを示した。
上記で分析した93人の患者のうち、80人の患者の臨床フォローアップ情報が利用可能であった。その遺伝的プロファイルに基づく臨床的に使用されるリスク群へのこれらの患者の分布を図4Aに提示する。全生存期間(OS)についての多変量解析では、診断年齢、及び中程度(リスク群2)リスク群と有害(リスク群3)リスク群の両方が、短い患者の生存期間と有意に相関していた(図4B)。次に、NOCIVA、CIP2Ae13、CIP2Ae20、WT1、EVI1又はSETの発現がリスク群と関連するかどうかを評価した。全てのリスク群間の差と比較した場合、唯一の統計学的に有意な関連性がEV1発現で見られた(図4C)。これらのデータは、NOCIVA発現が現在使用されているAMLリスク群分類と独立していることを示している。重要なことに、高いNOCIVA発現は、多変量解析の短いOSと有意に相関し、ハザード比がEVI1の発現よりも高かった(1.511対1.265)(図4D)。代わりに、非常に興味深いことに、低いCIP2Ae13発現は、ハザード比0.173でより良好な患者の生存期間の境界の有意な予測因子であった(図4D)。NOCIVA mRNA発現レベルを中央値と比較して高と低の2つの群に分けて使用した患者の全生存期間のカプラン・マイヤー分析では、NOCIVAの高発現患者も有意に短い生存期間を示した(図4E、p=0.022)。最後に、高いNOCIVAは短いOSと関連しているが、低いCIP2Ae13はむしろ良好なOSと関連しているように見えるため、高いNOCIVA/CIP2Ae13比が短いAML患者のOSを予測する新規な診断マーカーとして機能することができるかどうかを試験した。図4Fに示されるように、これはNOCIVA/CIP2Ae13比が多変量解析で短いOSと統計学的に非常に有意な関連を示した場合に当てはまる。
CIP2Aを、エクソン16(CIP2Ae16)の存在に基づいてNOCIVAと識別することができる。この目的のために、以下に記載されるアッセイを開発する。Life Technologies製のCIP2Aエクソン16、Hs00405413_m1用のTaqMan(登録商標)遺伝子発現アッセイはすでに存在しており、これも同じ試料材料で試験する。あるいは又はさらに、CIP2Aを、上記の例に記載されるように、CIP2Ae13又はCIP2Ae20に基づいてNOCIVAと識別することができる。
Roche Design Centreで設計されたTaqMan遺伝子発現アッセイを使用して、他の血液悪性腫瘍及び確立された細胞株(慢性骨髄性白血病を含む)におけるNOCIVA遺伝子発現の発現の定量化を実施する。融解曲線及び増幅効率分析によってアッセイを検証する。RNeasyミニキット(Qiagen)を使用してモノクローナル細胞抽出物から全RNAを単離する。cDNAを、SuperScriptIII逆転写酵素(Invitrogen)を使用して、製造元の指示に従って合成する。グリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ及びβアクチンを内部対照として使用する。KAPA PROBE FAST qPCRキットを、qPCR反応に使用し、QuantStudio(商標)12K FlexリアルタイムPCRシステムをプレート分析に使用する。PCR反応サイクル:1:95℃ 10分、2:95℃ 15秒、3:60℃ 1分;ステップ2〜3を45回繰り返す。相対遺伝子発現データの分析を、Thermo Fisher Cloudソフトウェアによる2−ΔΔCT法を使用して実施する。遺伝子を、その発現値が、正常なBM対照試料の分析によって定義される(Clontech、Human Bone Marrow total rna)各遺伝子について確立されたカットオフ値(平均+3 s.d.)よりも高い又は低い場合、脱制御されているとみなす。
RNAscope(登録商標)(Advanced Cell Diagnostics、ACD)及びViewRNA(商標)(Invitrogen)を含むRNAインサイチューハイブリダイゼーション技術を、種々のホルマリン固定固形がん細胞株及びホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織試料(少なくとも乳房、前立腺、HNSCC)で、製造元の指示に従って、NOCIVA及びCIP2A検出について試験する。CIP2A及びNOCIVA検出用の同様の試料の以前のqPCR分析に基づいて、陰性及び陽性の生物学的対照を選択する。製造元の指示に従って、技術的対照を実験設定に含める。ACD及びInvitrogenに、CIP2A及びNOCIVA mRNAインサイチュー検出用の新規なプローブ設計について連絡をする。ACD及びInvitrogenが、CIP2A及びNOCIVA検出用のインサイチューハイブリダイゼーションプローブを設計及び製造する。受け取った読出しの分析を、製造元の指示に従って調べる。
BioGenes GmbHによるNOCIVA特異的ペプチドNNKNTQEAFQVTS(配列番号3)に対してウサギを免疫化することにより、2つのNOCIVA特異的抗体を作製した。ペプチド合成(純度少なくとも80%、HPLC及びMSによる品質管理)の際に、担体タンパク質との指向されたコンジュゲーションのために、追加のN末端システインをNOCIVA特異的ペプチドに付加した。
診断用免疫組織化学(IHC)について上記のように作製されたNOCIVA特異的抗体の適用性を試験及び最適化した。信頼できる検出結果のために、適切なIHC方法を選択することが重要である。頭頸部扁平上皮がん及び乳がん組織からのパラフィン包埋試料からなる組織マイクロアレイ(TMA)を、NOCIVA特異的ペプチドに対して作製された抗体で染色した。
上記のように作製されたNOCIVA特異的抗体を、診断用蛍光活性化セルソーティング(FACS)に使用するために検証及び最適化する。この目的のために、診断時に新たに収集した末梢血及び骨髄試料中のNOCIVAを測定するプロトコルを開発して予測値を調査する。試料調製を、FACS分析用の血液患者試料を取り扱うためのTYKSlabのプロトコルに従って行う。血液試料の典型的なFACSプロトコルでは、細胞を500μlの2%パラホルムアルデヒドに再懸濁し、37℃で10分間固定し、氷上で1分間冷却する。遠心分離(770g、3分)によって細胞を回収し、500μlの90%メタノールを添加した後、試料を短時間ボルテックスし、氷上で30分間インキュベートする。次いで、細胞を洗浄し(リン酸緩衝生理食塩水及び0.5%ウシ血清アルブミンを含有する1mlのインキュベーション緩衝液で完全に)、回収し、25μlのインキュベーション緩衝液に再懸濁する。この後、試料を室温で10分間インキュベートする。抗体を最終濃度30μg/mlになるように添加し、ボルテックスし、室温で40分間インキュベートする。試料を2回洗浄し、フルオレセイン標識した二次抗体Alexa Fluor 488(10μg/ml)に再懸濁し、暗所中室温で30分間インキュベートする。次いで、フローサイトメトリー(FACScalibur又は類似)を使用して、2回洗浄した細胞を、データ分析用のcellquest proソフトウェア(又は類似)で分析する。試料中に存在するNOCIVAタンパク質のレベルを、幾何平均蛍光強度(MFI)−対照試料のMFI値として決定する。NOCIVA枯渇細胞は、この設定でも陰性生物学的対照として役立つ。陽性対照は、NOCIVA検出用のAML試料の事前のウエスタンブロット分析に基づいて選択する。研究目的で、NOCIVA特異的FACSも試験し、その性能を種々の固形がん細胞株及び組織試料(乳房、前立腺及びHNSCC試料を含む)で検証する。
Claims (41)
- 配列番号3に示されるアミノ酸配列を含むCIP2Aの単離されたポリペプチドバリアント。
- 配列番号2に示されるアミノ酸配列、又はアミノ酸546〜558によって形成される領域外の配列番号2と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のポリペプチド。
- 配列番号1のヌクレオチド1636〜1674によって定義される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる、請求項1又は2に記載のポリペプチド。
- 配列番号1に示される核酸配列、又は配列番号1のヌクレオチド1636〜1674によって定義される領域外の配列番号1と少なくとも80%の配列同一性を有する核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる、請求項1から3のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 請求項1から4のいずれか一項に定義されるポリペプチドをコードする単離されたCIP2Aポリヌクレオチド。
- 配列番号1のヌクレオチド1636〜1674によって定義される核酸配列を含む、請求項5に記載のポリヌクレオチド。
- cDNAである、請求項5又は6に記載のポリヌクレオチド。
- 3’UTRをさらに含む、請求項5から7のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号1に示される核酸配列、又は配列番号1のヌクレオチド1636〜1674によって定義される領域外の配列番号1と少なくとも80%の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項5から8のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- がんバイオマーカーとしての、請求項1から4のいずれか一項に記載のポリペプチド又は請求項5から9のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの使用。
- がんが、リンパ系がん及び固形がんからなる群から選択される、請求項10に記載の使用。
- リンパ系がんが、急性骨髄性白血病(AML)及び慢性骨髄性白血病(CML)からなる群から選択される、請求項11に記載の使用。
- 固形がんが、扁平上皮がん(SCC)、頭頸部扁平上皮がん(HNSCC)、肺がん、乳がん、結腸直腸がん、前立腺がん、胃がん、肝がん、子宮頸がん、食道がん、膀胱がん、腎がん及び膵がんからなる群から選択される、請求項11に記載の使用。
- 全生存期間の減少などの予後不良のバイオマーカーとしての、請求項10から13のいずれか一項に記載の使用。
- 請求項1から4のいずれか一項に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗CIP2Aバリアント抗体又はその抗原結合フラグメント。
- エピトープが、配列番号2のアミノ酸546〜558に対応する又は重複する配列から選択される5〜20個の連続アミノ酸を含む、請求項15に記載の抗体又はそのフラグメント。
- 請求項5から9のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド中の標的配列と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであって、標的配列が、配列番号1のヌクレオチド1635〜1983によって形成される配列に包含される又は重複するオリゴヌクレオチド。
- 配列番号1のヌクレオチド1635〜1983、1636〜1674又は1675〜1983によって形成される配列の8〜40個、好ましくは15〜35個、より好ましくは20〜30個の連続ヌクレオチドとハイブリダイズする、請求項17に記載のオリゴヌクレオチド。
- 好ましくは検出可能な標識を含む、プローブである、請求項17又は18に記載のオリゴヌクレオチド。
- 請求項5から9のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの少なくとも一部を特異的に増幅するプライマー対であって、配列番号1のヌクレオチド1635〜1983、1636〜1674又は1675〜1983によって形成される配列に包含される又は重複する標的配列と特異的にハイブリダイズする3’プライマーを含むプライマー対。
- 配列番号1のヌクレオチド1〜1634によって形成される配列に包含される標的配列と特異的にハイブリダイズする5’プライマーを含む、請求項20に記載のプライマー対。
- プライマーが、10〜40個、好ましくは15〜35個、最も好ましくは20〜30個のヌクレオチド長を有する、請求項20又は21に記載のプライマー対。
- がんを予後判定、検出、スクリーニング、診断又は監視するための方法であって、患者からの試料中の請求項1から4のいずれか一項に記載のポリペプチド又は請求項5から9のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの発現レベルを測定するステップを含む、上記方法。
- 発現レベルを測定するステップが、核酸増幅を実施することを含む、請求項23に記載の方法。
- 増幅が、請求項20から22のいずれか一項に記載のプライマー対を使用して実施される、請求項24に記載の方法。
- 発現レベルを測定するステップが、ポリヌクレオチドを請求項17から19のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることを含む、請求項23から25のいずれか一項に記載の方法。
- 発現レベルを測定するステップが、試料中の請求項1から4のいずれか一項に記載のポリペプチドへの請求項15又は16に記載の抗体の結合を検出することを含む、請求項23に記載の方法。
- 発現レベルを測定するステップが、次世代シーケンシング、RNAインサイチュー(in situ)ハイブリダイゼーション、及び質量分析による定量的標的プロテオミクス、例えば選択的反応モニタリング(SRM)、SWATH及びマスサイトメトリーからなる群から選択される技術によって行われる、請求項23に記載の方法。
- がんが、AML、CML及びPLMなどのリンパ系がん、ならびに扁平上皮がん(SCC)、頭頸部扁平上皮がん(HNSCC)、肺がん、乳がん、結腸直腸がん、前立腺がん、胃がん、肝がん、子宮頸がん、食道がん、膀胱がん、腎がん及び膵がんなどの固形がんからなる群から選択される、請求項23から28のいずれか一項に記載の方法。
- 対照の発現と比較したポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現増加が予後不良を示す、請求項23から29のいずれか一項に記載の方法。
- AMLと診断された対象に治療を割り当てるための方法であって、
対象からの生体試料を、請求項1から4のいずれか一項に記載のポリペプチド又は請求項5から9のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドに特異的に結合する試薬と接触させるステップと;
結合に基づいてポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現レベルを測定するステップと;
発現レベルを対照と比較することによって、測定されたポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現レベルが試料中で増加しているかどうかを測定するステップと;
発現が増加している場合、幹細胞療法を含む治療法を割り当てるステップと
を含む、上記方法。 - 対照がCIP2A又はハウスキーピング遺伝子である、請求項30又は31に記載の方法。
- 臨床試料中の請求項1から4のいずれか一項に記載のポリペプチドの存在を検出するためのイムノアッセイであって、
試料を請求項15又は16に記載の抗体と接触させるステップと;
抗体の特異的結合があれば、定性的又は定量的に検出するステップと
を含むイムノアッセイ。 - 試料を、請求項1から4のいずれか一項に記載のポリペプチドに特異的に結合するが、そのエピトープが請求項15又は16に記載の抗体のエピトープとは異なるさらなる抗体と接触させて、サンドイッチ免疫複合体を形成するステップと、免疫複合体の存在があれば、定性的又は定量的に検出するステップとを含む、請求項33に記載のイムノアッセイ。
- 試料を、CIP2Aのポリペプチドに特異的に結合するが、そのエピトープが配列番号4のアミノ酸546と905との間にあるさらなる抗体と接触させて、第2のサンドイッチ免疫複合体を形成するステップと、第2の免疫複合体の存在があれば、定性的又は定量的に検出するステップとを含む、請求項33又は34に記載のイムノアッセイ。
- 2つのサンドイッチ免疫複合体の比が決定される、請求項35に記載のイムノアッセイ。
- 生体試料中の請求項5から9のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの存在を検出する方法であって、
a)試料を請求項17から19のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドと接触させるステップと;
b)オリゴヌクレオチドの特異的ハイブリダイゼーションを検出するステップと
を含む、上記方法。 - a)の前に、請求項20から22のいずれか一項に記載のプライマー対を使用してポリヌクレオチドを増幅するステップを含む、請求項37に記載の方法。
- 生体試料中の請求項5から9のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの存在を検出する方法であって、
a)試料を請求項20から22のいずれか一項に記載のプライマー対と接触させるステップと;
b)核酸増幅を実施するステップと;
c)ステップb)で得られたアンプリコンを、請求項17から19のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドで定性的又は定量的に検出するステップと
を含む、上記方法。 - 請求項15又は16に記載の抗体を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のポリペプチドのレベルを測定するためのキット。
- 請求項17から19のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド及び/又は請求項20から22のいずれか一項に記載のプライマー対を含む、請求項5から9のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドのレベルを測定するためのキット。
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US20130115599A1 (en) * | 2011-11-08 | 2013-05-09 | Medical Diagnostic Laboratories, Llc | Increased cip2a expression and bladder cancer in humans |
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