JP7450249B2

JP7450249B2 - 修飾蛋白質の生産装置及び生産方法

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Publication number: JP7450249B2
Application number: JP2020037151A
Authority: JP
Inventors: 雄飛岸; 則子吉本; 修一山本
Original assignee: Yamaguchi University NUC
Current assignee: Yamaguchi University NUC
Priority date: 2020-03-04
Filing date: 2020-03-04
Publication date: 2024-03-15
Anticipated expiration: 2040-03-04
Also published as: JP2021139726A

Description

この発明は、一つのカラム内で蛋白質の修飾反応と分離を連続して行い、未反応の蛋白質を再利用することのできる修飾蛋白質の生産装置及び生産方法に関するものである。

生体分子である蛋白質に合成化合物を修飾した修飾蛋白質は、生体安定性・分子特異性の高い優れた医薬品として機能する。例えば、両親媒性高分子ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を修飾したＰＥＧ化蛋白質は、ＰＥＧ付加による水和半径の増加とともに生体半減期が長くなる。また、抗体蛋白質に毒性の高い薬物を結合した抗体－薬物複合体（ＡＤＣｓ）は、特定の細胞のみで薬理活性を発揮することが可能となる。
しかし、蛋白質の修飾反応では複数の修飾位置・修飾数異性体（以下「修飾異性体」という。）が副生する。このため、修飾反応後に複数の精製ステップが必要である。蛋白質医薬品の精製にはクロマトグラフィー分離が用いられており、修飾蛋白質の精製にも応用されるが、精製操作を終えた蛋白質を反応槽に導入し、その後、修飾異性体の精製を行う一連のプロセスの中には精製操作の重複がある。
そこで、本発明者らは、非特許文献１（Biotechnology Journal, 2013, 8, 801-810）において、クロマトカラムを蛋白質修飾反応用の流通型反応器として利用可能であることを報告し、非特許文献２（Biotechnology Journal, 2018, 13, 1700738）において、クロマトカラムを蛋白質修飾反応用の流通型反応器として利用し、さらに反応条件を蛋白質の溶出条件に設定することで蛋白質を修飾反応させると同時に修飾蛋白質を分離させることが可能であることを報告しており、非特許文献３（Biotechnology and Bioengineering, Vol.113, No.8, 2016, 1711-1718）では、クロマトカラムを蛋白質修飾反応用の流通型反応器として利用し、修飾蛋白質と修飾されていない蛋白質（以下「非修飾蛋白質」という。）を分離するとともに、非修飾蛋白質を再利用する図が報告されている。

また、特許文献１（特表２０１８－５２４１４６号公報）記載の発明は、複数のクロマトカラムからバイオ医薬プロダクト、生物学的プロダクト、高分子プロダクトを連続的に溶出する方法を提供しており、特許文献２（特表２０１８－５１９４９８号公報）記載の発明は、少なくとも２つの単位操作を含む、流体中の生体分子を分離するための液体クロマトグラフィーシステム、装置及び方法であって、第１単位操作がマルチカラムクロマトグラフィーのステップであり、第２単位操作が生体分子または流体を改変するステップで構成され、生体分子の連続的または半連続的な処理を可能にするものである。

Noriko Yoshimoto, Yu Isakari, Daisuke Itoh, Shuichi Yamamoto,"PEG chain length impacts yield of solid‐phase protein PEGylation and efficiency of PEGylated protein separation by ion‐exchange chromatography: Insights of mechanistic models", Biotechnology Journal, 2013, 8, 801-810 Yu Isakari, Yuhi Kishi, Noriko Yoshimoto, Shuichi Yamamoto, Ales Podgornik,"Reaction‐Mediated Desorption of Macromolecules: Novel Phenomenon Enabling Simultaneous Reaction and Separation", Biotechnology Journal, 2018, 13, 1700738 David Pfister, Massimo Morbidelli, "Integrated Process for High Conversion and High Yield Protein PEGylation", Biotechnology and Bioengineering, Vol.113, No.8, 2016, 1711-1718

特表２０１８－５２４１４６号公報特表２０１８－５１９４９８号公報

しかし、非特許文献１及び２に記載されている技術は、クロマトカラムを蛋白質修飾反応用の流通型反応器として利用しているが、非特許文献１では連続的な修飾反応や分離を行っておらず、非特許文献２では修飾反応と分離が同時に達成可能ではあるものの、その達成条件は限られており汎用性に乏しいものであった。
また、非特許文献３に記載されている技術では、官能基を有するいわゆる活性化ＰＥＧによる蛋白質の修飾反応は液体の反応槽で行い、液相反応によって生成するＰＥＧ化蛋白質のＰＥＧ結合数の選択性に乏しい上に、その後のＰＥＧ化蛋白質の分離はイオン交換クロマトカラムで行われるため、反応と分離を別々に行わなければならない。そして図面ではクロマトカラムから排出された蛋白質が回収されて反応槽に戻されていることが図示されているが、連続操作を行っているものではない。さらに仮に蛋白質の再利用のための循環ラインを設けて連続操作を行うにしても、クロマトカラム出口に設けた吸光度検出部から受信される排出成分のピークを監視員が監視してバルブを切り替える場合は、人為ミスにより修飾蛋白質や非修飾蛋白質に異物が混合し、廃棄するか再分離が必要となるおそれがあった。さらに吸光度を検出してバルブを切り替える自動制御を行う場合は、バルブ切り替えを行うことによって修飾蛋白質や非修飾蛋白質がクロマトカラムから溶出されていないにもかかわらず吸光度のピークが発現する、いわゆるゴーストピークが現れることがあるため、上記の人為ミスと同様の問題を生じるおそれがあった。
そして、非特許文献１～２で利用している固相反応場における蛋白質修飾反応は、修飾位置や修飾数の制御を行うことができるので、目的とする修飾蛋白質を得ることができるが、非修飾蛋白質が残留し易く、反応収率が低いという問題があり、非特許文献３、特許文献１及び２で利用している液相反応場における蛋白質修飾反応は、修飾位置の制御を行うことができず、目的とする修飾蛋白質だけでなく目的としない修飾異性体が含まれる修飾蛋白質の混合物が生成されてしまうという問題があった。

この発明は、これらの問題に鑑み、固相反応によって目的とする修飾蛋白質を高い収率で得られるようにすることを第１の目的とし、非修飾蛋白質の再利用における修飾反応及び分離プロセスにおける誤操作や誤制御を防止し、生産性を向上させることを第２の目的とする修飾蛋白質の生産装置等を提供するものである。

請求項１に係る発明の修飾蛋白質の生産装置は、
入口と出口を有し蛋白質と両親媒性高分子ポリエチレングリコールとを内部で固相反応によって修飾反応させ修飾蛋白質の生成をするイオン交換クロマトカラムと、
非修飾蛋白質を前記イオン交換クロマトカラムに供給する非修飾蛋白質供給部と、
両親媒性高分子ポリエチレングリコールを前記イオン交換クロマトカラムに供給する修飾体供給部と、
塩含有液を前記イオン交換クロマトカラムに供給する塩含有液供給部と、
塩含有液の塩濃度を制御する塩濃度制御部と、
前記イオン交換クロマトカラム内の蛋白質と修飾反応せずに前記出口から排出される両親媒性高分子ポリエチレングリコールを回収する修飾体回収部と、
前記出口から排出される複数種の修飾蛋白質を回収する修飾蛋白質回収部と、
前記出口から排出される非修飾蛋白質を前記非修飾蛋白質供給部に還流させて回収する非修飾蛋白質還流部を備えていることを特徴とする。

請求項２に係る発明は、請求項１に記載の修飾蛋白質の生産装置において、
前記出口から排出される排出物の吸光度を検出する吸光度検出部を備え、
検出された吸光度に基づいて、前記修飾蛋白質回収部及び前記非修飾蛋白質還流部の作動を制御する制御部を備えていることを特徴とする。

請求項３に係る発明は、請求項２に記載の修飾蛋白質の生産装置において、
前記吸光度検出部は、前記出口から排出される複数種の修飾蛋白質及び非修飾蛋白質の吸光度を検出し、
前記制御部は、
前記複数種の修飾蛋白質及び前記非修飾蛋白質の各蛋白質毎の前記吸光度がピークとなる溶出塩濃度を予備実験に基づいて演算する溶出塩濃度演算部を有し、
前記溶出塩濃度演算部によって演算された各蛋白質毎の前記溶出塩濃度に対応する前記イオン交換クロマトカラムへの塩含有液供給量に基づいて、前記修飾蛋白質回収部及び前記非修飾蛋白質還流部の動作を制御することを特徴とする。

請求項４に係る発明は、請求項３に記載の修飾蛋白質の生産装置において、
前記制御部は、
あらかじめ前記複数種の修飾蛋白質及び前記非修飾蛋白質を前記イオン交換クロマトカラムの内部に供給してから前記塩含有液により溶出させる予備実験で得られる所定の定数に基づき、前記複数種の修飾蛋白質及び前記非修飾蛋白質の前記吸光度がピークとなる時における溶出塩濃度を演算する溶出塩濃度演算部と、
前記溶出塩濃度を含む関数であって前記イオン交換クロマトカラムの液相中における前記複数種の修飾蛋白質又は前記非修飾蛋白質のいずれかの成分の濃度に対する前記液相中の成分と同じ成分の固相中の濃度の比である分配係数に基づいて、前記複数種の修飾蛋白質又は前記非修飾蛋白質が前記出口に達する塩含有液供給量を演算する溶出量演算部を有し、
前記塩含有液供給量に基づいて前記修飾蛋白質回収部及び前記非修飾蛋白質還流部の作動を制御することを特徴とする。

請求項５に係る発明は、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の修飾蛋白質の生産装置において、
回収した非修飾蛋白質を含む塩含有溶液の塩濃度を低減する塩濃度低減部を備えていることを特徴とする。

請求項６に係る発明の修飾蛋白質の生産方法は、
入口と出口を有するイオン交換クロマトカラム内に非修飾蛋白質を供給する非修飾蛋白質供給工程と、
両親媒性高分子ポリエチレングリコールを前記入口から供給することによって非修飾蛋白質と両親媒性高分子ポリエチレングリコールとを固相反応によって修飾反応させ修飾蛋白質を生成する修飾反応工程と、
前記修飾反応工程中に前記イオン交換クロマトカラム内の蛋白質と修飾反応せずに前記出口から排出される両親媒性高分子ポリエチレングリコールを回収する修飾体回収工程と、
両親媒性高分子ポリエチレングリコールの供給を停止した後、第１濃度の塩含有液の供給を開始するとともに塩濃度を前記第１濃度よりも高い第２濃度まで高めて前記入口から供給することによって前記出口から排出される複数種の修飾蛋白質を回収する修飾蛋白質回収工程と、
前記第２濃度よりも高濃度の塩含有液を前記入口から供給することによって前記出口から排出される非修飾蛋白質を還流させて回収する非修飾蛋白質還流工程と、
回収した非修飾蛋白質を還流させ前記入口から供給する再供給工程を含むことを特徴とする。

請求項７に係る発明は、請求項２に係る修飾蛋白質の生産装置における前記修飾蛋白質回収部及び前記非修飾蛋白質還流部の動作を制御するための制御プログラムであって、
コンピュータに、
前記出口から排出される複数種の修飾蛋白質及び非修飾蛋白質の各蛋白質毎の吸光度がピークとなる溶出塩濃度を予備実験に基づいて演算させ、
演算された各蛋白質毎の前記溶出塩濃度に対応する前記イオン交換クロマトカラムへの塩含有液供給量に基づいて、前記制御部に対して前記修飾蛋白質回収部及び前記非修飾蛋白質還流部の動作制御を実行させるための制御プログラムである。

請求項１に係る発明の修飾蛋白質の生産装置及び請求項６に係る発明の修飾蛋白質の生産方法によれば、入口と出口を有するイオン交換クロマトカラム内に非修飾蛋白質を供給し、両親媒性高分子ポリエチレングリコールを入口から供給することによって非修飾蛋白質と両親媒性高分子ポリエチレングリコールとを固相反応によって修飾反応させ、修飾反応工程中に蛋白質と修飾反応せずに出口から排出される両親媒性高分子ポリエチレングリコールを回収し、両親媒性高分子ポリエチレングリコールの供給を停止した後に第１濃度の塩含有液の供給を開始するとともに塩濃度を第１濃度よりも高い第２濃度まで高めて入口から供給することによって複数種の修飾蛋白質を回収し、第２濃度よりも高濃度の塩含有液を入口から供給することによって非修飾蛋白質を還流させて回収し、回収した非修飾蛋白質を還流させ入口から再供給することができ、修飾反応させた後にイオン交換クロマトカラム内に残留している非修飾蛋白質を廃棄することなく再度両親媒性高分子ポリエチレングリコールと修飾反応させて分離することができるので、目的とする修飾蛋白質が高い収率で得られる。

請求項２に係る発明の修飾蛋白質の生産装置によれば、請求項１に係る発明の効果に加え、出口から排出される排出物の吸光度を検出し、検出された吸光度に基づいて、修飾蛋白質回収部及び非修飾蛋白質還流部の作動を制御し、また、修飾蛋白質を回収するタイミング及び非修飾蛋白質を還流させて回収するタイミングを制御することができるので、修飾蛋白質の生産に係る操作を自動化でき、誤操作をなくすとともに、生産性が格段に向上する。

請求項３に係る発明の修飾蛋白質の生産装置及び請求項７に係る発明の制御プログラムによれば、請求項２に係る発明の効果に加え、出口から排出される複数種の修飾蛋白質及び非修飾蛋白質の各蛋白質毎の吸光度がピークとなる溶出塩濃度を予備実験に基づいて演算し、演算された各蛋白質毎の溶出塩濃度に対応するイオン交換クロマトカラムへの塩含有液供給量に基づいて修飾蛋白質回収部及び非修飾蛋白質還流部の動作を制御することができるので、ゴーストピークの影響を受けることなく複数種の修飾蛋白質を回収するタイミング及び非修飾蛋白質を還流させて回収するタイミングを制御することができる。

請求項４に係る発明の修飾蛋白質の生産装置によれば、請求項３に係る発明の効果に加え、溶出塩濃度を含む関数であってイオン交換クロマトカラムの液相中における修飾蛋白質又は非修飾蛋白質のいずれかの成分の濃度に対する液相中の成分と同じ成分の固相中の濃度の比である分配係数に基づいて、複数種の修飾蛋白質又は非修飾蛋白質がイオン交換クロマトカラムの出口に達する塩含有液供給量を演算するので、より精度良く修飾蛋白質回収部及び非修飾蛋白質還流部の作動を制御することができる。

請求項５に係る発明の修飾蛋白質の生産装置によれば、請求項１から請求項４のいずれか１項に係る発明の効果に加え、回収した非修飾蛋白質を含む塩含有溶液の塩濃度を低減してクロマトカラムに供給することができるので、目的とする修飾蛋白質がさらに高い収率で得られる。

実施形態１に係る修飾蛋白質の生産装置の概念図。修飾蛋白質を生産するプロセスを示すフローチャート。修飾蛋白質の主な生産プロセスにおける生産装置の状態を示す図。修飾蛋白質の生産プロセスにおける主要操作の開始から停止の区間を示した図。必要な塩含有液の供給量を予測するための予備実験の内容及び処理手順を示すフロー図。実施形態２に係る修飾蛋白質の生産装置の概念図。液相反応から得られた蛋白質等のＩＥＣカラム排出時の吸光度及び塩濃度の変化を示すグラフ。塩濃度勾配と蛋白質等の溶出量がピークとなる塩濃度との関係を示す両対数の曲線を示すグラフ。溶出実験結果に基づき計算から求めた塩濃度Ｉと分配係数Ｋの関係を示すグラフ。溶出実験結果及び数値計算の結果から求めた塩濃度勾配溶出法による蛋白質等の移動距離を示すグラフ。各プロセスにおける排出物の吸光度と塩濃度の変化を示すグラフ。修飾反応の回数と修飾蛋白質の選択性及び収率の変化を示すグラフ。

以下、本発明の実施形態を説明する。なお、本発明の実施形態は以下に述べる態様に限定されるものではない。

〔実施形態１〕
図１は実施形態１に係る修飾蛋白質の生産装置の概念図である。
実施形態１に係る修飾蛋白質の生産装置は、図１の概念図に示すように、以下の構成を備えている。
（ａ）入口１と出口２を有し蛋白質と修飾体を内部で修飾反応させるクロマトカラム３を備えている。
（ｂ）非修飾蛋白質を含む溶液を供給する非修飾蛋白質供給部４を備えている。非修飾蛋白質供給部４は供給部をもつタンクであればよく、GE Healthcare Life Sciences製のスーパーループ（Superloop）を用いることができる。
（ｃ）修飾体を含む修飾体溶液を供給する修飾体供給部５を備えている。修飾体供給部５としては、配管、タンクを用いることができ、タンクとしては前述のスーパーループを用いることができる。修飾体供給部は修飾体の分解防止のため冷却可能な冷却装置をさらに備えていることが好ましい。
（ｄ）塩を含む塩含有液を供給する塩含有液供給部６を備えている。塩含有液供給部６は純水または塩濃度の相対的に低い液が供給される第１濃度の塩含有液の貯槽と、塩濃度が低濃度塩含有液よりも高い濃度の第３濃度の塩含有液の貯槽と、第１濃度の塩含有液及び第３濃度の塩含有液をそれぞれ生産装置の系内へ送出する２台のポンプを有している。第１濃度の塩含有液と第３濃度の塩含有液とはそれぞれ別々に系内に供給される他、必要に応じて混合されて所定濃度にして系内に供給される。
（ｅ）塩含有液の塩濃度を制御する塩濃度制御部７を備えている。塩濃度制御部７は、第１濃度の塩含有液、第３濃度の塩含有液のそれぞれの貯槽から系内へ供給するラインのバルブの開閉もしくは開度またはポンプの起動停止若しくは回転数を制御してこれらの塩含有液の供給量を制御する。塩濃度制御部７の供給量制御を後述の制御部１８から行うことができるようになっている。
（ｆ）クロマトカラム３の出口２から排出される排出物の吸光度（典型的には波長が２８０ｎｍの紫外線吸光度）及び電気伝導度を検出し、吸光度に基づく吸光度信号及び電気伝導度に基づく塩濃度信号を送信する吸光度等検出部８を備えている。
（ｇ）クロマトカラム３内の蛋白質と修飾反応せずに出口２から排出される修飾体を回収する修飾体回収部９を備えている。
（ｈ）出口２から排出される修飾蛋白質を回収する修飾蛋白質回収部１０を備えている。
（ｉ）出口２から排出される非修飾蛋白質を非修飾蛋白質供給部４に還流させ回収する非修飾蛋白質還流部１１を備えている。
（ｊ）還流させた非修飾蛋白質を含む塩含有液のうち非修飾蛋白質供給部４を通過した塩含有液を受け入れる廃棄部１３を備えている。
（ｋ）塩含有液供給部６から供給される塩含有液及び非修飾蛋白質還流部１１から還流される非修飾蛋白質を含む溶液の通過経路を切り替える第１バルブ１４を備えている。
（ｌ）回収した非修飾蛋白質をクロマトカラム３に供給する際に塩濃度を低減する塩濃度低減部としての脱塩カラム１５を備えている。脱塩カラム１５としてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）のカラムを備えることができる。
（ｍ）非修飾蛋白質供給部４及び塩含有液供給部６側から供給される非修飾蛋白質や塩含有液の通過経路を切り替える第２バルブ１６を備えている。
（ｎ）クロマトカラム３から排出される排出物の通過経路を切り替える第３バルブ１７を備えている。
（о）非修飾蛋白質、修飾体及び塩含有液の各溶液について、クロマトカラム３等系内への供給動作、すなわち供給開始、供給停止、塩含有液の濃度変更等を制御する制御部１８を備えている。また、制御部１８は、中央演算処理部を備えている。中央演算処理部は、修飾蛋白質及び非修飾蛋白質の各蛋白質毎の前記吸光度がピークとなる溶出塩濃度を後述の予備実験に基づき演算をする溶出塩濃度演算部を有しており、溶出塩濃度に達する前記クロマトカラムへの塩含有液供給量に基づいて修飾蛋白質回収部及び非修飾蛋白質還流部の動作を制御する。また、制御部１８は、これらの演算部から得られる数値を記憶させ読み出し可能な記憶部をさらに備えている。
そのほかに制御部１８は各溶液の供給量を供給容積又は経路の容量から逆算した供給時間を記憶部に記憶させることにより制御することもできる。また、各溶液の供給の開始、停止及び供給量調節の動作を塩濃度制御部７へ信号を送信して実行することができる。さらに、制御部１８は吸光度等検出部８からの吸光度信号及び塩濃度信号を受信してモニタリングしつつ、受信信号を記憶部に記憶するようにしてもよい。

図２は固相反応によって修飾蛋白質を生産するプロセスを示すフローチャートであり、図３は修飾蛋白質の主な生産プロセスにおける生産装置の状態を示す図である。
なお、図３において太線で示す部分は、各プロセスにおいて塩含有液等が通過する経路を示している。また、図３においては図１における制御部からの制御信号を示す破線を省略したものを図示した。
図２及び図３に示すように、実施形態１においては、以下のプロセスによって修飾蛋白質が生産される。
（１）非修飾蛋白質のクロマトカラムへの供給
第３バルブを修飾体回収部側に設定しておく。第１バルブ１４において、塩含有液供給部６から供給される塩含有液の通過経路を非修飾蛋白質供給部４の一方側（図３では上側）とするとともに、非修飾蛋白質供給部４の他方側（図３では下側）から排出される非修飾蛋白質を含む溶液及び塩含有液の通過経路を第２バルブ１６側とし、第２バルブ１６において、非修飾蛋白質を含む溶液の通過経路を脱塩カラム１５の一方側（図３では左側）とするとともに、脱塩カラム１５の他方側（図３では右側）から排出される非修飾蛋白質を含む溶液の通過経路をクロマトカラム３の入口１側として、非修飾蛋白質を含む溶液とともに第１塩濃度の塩含有液をクロマトカラム３の内部に供給開始する。（図２のプロセス１及び図３左上の生産プロセス(Ｉ)を参照）。このように脱塩カラム１５に通液させることにより非修飾蛋白質の溶液の塩濃度を低下させてクロマトカラム３の内部に供給する。
この塩濃度の低減によってクロマトカラム３内部の固相の上流側から下流側にわたり広範囲に蛋白質が分散されにくく狭い範囲に吸着する。そのためクロマトカラム３からの分離成分が混合されて排出されることを抑制できより確実に分離できる。
この非修飾蛋白質供給終了後、クロマトカラム３の内部に第１濃度の塩含有液を供給し、クロマトカラム３内の固相である担体を平衡化するのが好ましい。
図４は、本実施形態の修飾蛋白質の生産プロセスにおける主要操作の区間を各溶液の供給液量（溶出液量）で示した図である。蛋白質としては限定するものではないが、リゾチーム、ウシ血清アルブミン、ＤＮＡなどの核酸などが挙げられる。塩含有液の塩の成分としては限定されるものではないが、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ），塩化カリウム（ＫＣｌ）などを用いることができる。塩含有液は、緩衝液などを含んでいるものが好ましい。
（２）修飾体のクロマトカラムへの供給による蛋白質修飾反応
第３バルブ１７において、修飾体溶液の通過経路は修飾体回収部９側のまま第１バルブ１４において、塩含有液供給部６から供給される塩含有液の通過経路を第２バルブ１６側とし、第２バルブ１６において、塩含有液の通過経路を修飾体供給部５の一方側（図３では左側）とするとともに、修飾体供給部５の他方側（図３では右側）から排出される修飾体を含む溶液の通過経路をクロマトカラム３の入口１側として、修飾体を含む溶液をクロマトカラム３の内部に供給開始し（図２のプロセス２及び図３右上の生産プロセス(II)を参照）、クロマトカラム３内での蛋白質修飾反応を進める（図２のプロセス２及び図４を参照）。その後、第２バルブ１６をクロマトカラム入口１側として修飾体溶液のクロマトカラム３の内部への供給を停止する。その後、第１バルブ１４及び第３バルブ１７の状態を変えずに、第１濃度の塩含有液をクロマトカラム３の内部に供給する。これにより、クロマトカラム内及び配管内の修飾体溶液は第１濃度の塩含有液によって洗浄される。
修飾体溶液の供給量はあらかじめ反応に必要とされる量以上の所定量あればよく、所定量を記憶部に記憶し制御部１８によって供給制御することができる。修飾体溶液は、アミノ基と反応するＮＨＳ基を有するポリエチレングリコール、いわゆる活性化ＰＥＧを含む溶液が好ましく、重量平均分子量は4,000～20,000(g/mol)の範囲であればよいが、5,000～10,000(g/mol)が好ましい。活性化ＰＥＧは低温ほど活性が維持されるため供給前に１０℃以下、好ましくは５℃以下に冷却される。ＰＥＧ溶液は低温のままクロマトカラム３に供給されてもよいが、供給直前に室温程度に戻してから供給されるほうが反応促進上好ましい。

（３）塩含有液の塩濃度を漸増させるクロマトカラムへの供給による修飾蛋白質回収
第３バルブ１７において、塩含有液の通過経路を修飾蛋白質回収部１０側として、塩濃度制御部７により塩含有液の塩濃度を第１濃度から後述の蛋白質等の溶出予測手法により求めた第２濃度まで徐々に上げながら、塩含有液を所定量クロマトカラム３の内部へ供給開始する（図２のプロセス３及び図４を参照）。この操作によって修飾蛋白質がクロマトカラムから排出され回収される（図３右下の生産プロセス(III)を参照）。この後、第１濃度の塩含有液によってクロマトカラム３内及び配管内が洗浄される。
（４）塩濃度をさらに上昇させた塩含有液のクロマトカラムへの供給による非修飾蛋白質回収
第３バルブ１７において、塩含有液の通過経路を非修飾蛋白質還流部１１側とし、また、第１バルブ１４において、非修飾蛋白質還流部１１から送られてくる塩含有液を非修飾蛋白質供給部４の方側（図３では下側）に送る通過経路を加えるとともに、非修飾蛋白質供給部４の一方側（図３では上側）から排出される塩含有液を廃棄部１３側に送る通過経路を加えて、非修飾蛋白質を非修飾蛋白質供給部４に回収する（図２のプロセス４、図４及び図３左下の生産プロセス(IV)を参照）。
この非修飾蛋白質回収は塩濃度制御部７により塩含有液の塩濃度を第２濃度から第３濃度（図４参照）まで高めて行なう。その後、第３バルブ１７において、塩含有液の通過経路を修飾体回収部９側として、排出される塩含有液を回収し、その後塩濃度が第１濃度の塩含有液を供給してクロマトカラム３内や配管内を洗浄する。
第３濃度までの塩濃度の上昇は、速やかに行うため、第１濃度の塩含有液を停止して行う。なお、非修飾蛋白質が高濃度塩含有液とともに回収される場合は後述の塩濃度低減操作をする。このため後述の蛋白質等の溶出予測手法から求めた溶出ピークが生じる塩濃度に達してから速やかに非修飾蛋白質の回収を終了する。具体的には非修飾蛋白質の回収が終了したら第３バルブ１７を直ちに修飾体回収部９側へ切り替える。実用的には吸光度のピークが観測される場合には、吸光度のピークの裾野からピークに達するまでの塩含有液供給量を記憶し、その供給量の２倍の量以上に達したら非修飾蛋白質の回収を終了するようにしてもよい。必要な場合は、予備実験によって吸光度のピークの上昇及びその後の下降の挙動を確認後、非修飾蛋白質の回収を終了させるタイミング、すなわち塩含有液供給量を決定してもよい。

（５）非修飾蛋白質溶液の塩濃度低減後のクロマトカラムへの供給
非修飾蛋白質供給部４に蓄えた非修飾蛋白質を、上記（１）のプロセス（図２のプロセス５及び図３左上の生産プロセス(Ｉ)を参照）により脱塩カラム１５で塩濃度を低減した後、非修飾蛋白質を含む溶液をクロマトカラム３の内部に供給開始する（図２のプロセス５、プロセス１及び図３左上の生産プロセス(Ｉ)を参照）。このクロマトカラム３への非修飾蛋白質の供給終了後、さらに第１濃度の塩含有液を供給し、クロマトカラム３の固相である担体を平衡化する（図４参照）。
なお、このプロセス（図２のプロセス５）からは、２回目の修飾反応のプロセス開始となり、このサイクルを複数回繰り返して実施する。

（蛋白質等の溶出予測手法）
本実施形態では制御部が所定の吸光度信号を受信して非修飾蛋白質の信号のピークが検出されるまでの塩含有液の供給量を記憶して、記憶された供給量の供給を経てから必要なバルブの操作による非修飾蛋白質の回収を行う制御が可能であることを述べた。このような制御は修飾蛋白質の回収におけるバルブの操作を行う制御にも同様に応用できる。しかし、バルブ操作の際に修飾蛋白質および非修飾蛋白質（以下「蛋白質等」という。）が吸光度等検出部８を流れていないのにかかわらずあたかもこれらの吸光度を示すピークが出現する、いわゆるゴーストピークが見られることがあった。このような場合には、吸光度信号にもとづいたバルブ制御を行っても、誤操作となってしまいせっかくの回収物に他の不要な成分が混入するなどの不都合が生じるおそれがあった。こうした誤操作になるきっかけとしてはバルブ制御のほかにポンプの起動や停止でも生じるおそれもあった
そこで以下では、蛋白質等の種類毎の溶出ピークとなる塩濃度を予備実験に基づく数値計算を含む演算により求め、その塩濃度に達する塩含有液の供給量に達してから蛋白質等の回収の操作を行う手法を述べる。クロマトカラムの固相である担体に吸着した修飾蛋白質や非修飾蛋白質の吸着帯が塩含有液によってクロマトカラム出口へ移動して溶出されるタイミング、すなわちこれらの蛋白質等の吸光度がピークを迎えるタイミングをあらかじめ蛋白質等の種類毎、具体的には修飾蛋白質の種類毎と非修飾蛋白質とに分けて求めておき、クロマトカラム３内に塩含有液を供給しその供給量に応じてバルブ操作を行うシーケンス制御を実行するための溶出予測手法を述べる。

蛋白質等の吸光度がピークを迎えるタイミング、すなわち蛋白質等の吸着帯がカラム出口に達するときの塩濃度及び必要な塩含有液の供給量の予測は以下の手順で行うことができる。

＜イオン交換体上での分配係数＞
クロマトカラム３はイオン交換クロマトグラフィーカラムを前提とする。イオン交換体上でのＢ個（Ｂは吸着サイト数）のイオンＳと交換される蛋白質等Ｐのイオン交換反応は数式１で表される。
ここで、上付きバーは固定相、すなわち担体に吸着した濃度を示す。
上式により平衡定数Keは以下のように導かれる。
活量係数を一定とし、１と仮定した場合、次式が導かれる。
ここでCqは固定相の表面に吸着した蛋白質等の濃度、Cは移動相、すなわち液相の蛋白質等の濃度である。Iは移動相中の塩濃度、Iqは固定相の塩濃度(つまりイオン交換体のイオン交換基に結合した塩の濃度)である。
固定相中の全濃度はイオン交換容量Λに等しい。よってIqとC_Pは次式で表される。
蛋白質等の分子量が大きくなるほど、蛋白質分子は複数のイオン交換基を覆い隠し、蛋白質等に結合しないイオン交換基が存在するはずである。この検討事項に基づき、覆い隠された電荷もしくは立体障害S_Fが立体的物質作用(ＳＭＡ)方程式としてCramerらによって導出された（Clayton A. Brooks Steven M. Cramer,’’ Steric mass‐action ion exchange: Displacement profiles and induced salt gradients”, AIChE J.,vol.38, pp.1969, 1992）。ここで、S_Fは蛋白質等に立体的に隠されたイオン交換サイト数の平均である。従って、固定相の合計のイオン交換容量は、
となる。ここでの蛋白質等の濃度は低く、Λ＝Iqである。分配係数Kq=Cq/Cは次のようになる。
吸着サイト数ＢはＳＭＡモデルで特有の電荷として参照される。

＜塩濃度に基づく分配係数の導出式＞
固定相は細孔を有する多孔性微粒子群であり次のように示すことができる。
ここでε_Pは多孔性微粒子の空隙率、C_Pは細孔内の蛋白質等の濃度、ρ_Pは粒子密度、qは単位重量あたりの多孔性微粒子対する蛋白質等の重量である。C_PとC_qは次のようになる。
従ってC_Sは、
となる。
ここでＫはクロマトグラフィーにおける溶出塩濃度を含む関数であってクロマトカラムの液相中における蛋白質等の濃度に対する固相中における同じ蛋白質等の濃度の比である分配係数、K_SECは分子サイズに基づいた微粒子細孔への蛋白質等の分配のされやすさを示す分配係数である。
数式７の右辺をK_pqに代入すると、次の方程式が導かれる。
ここでＡは比例定数である。

＜蛋白質等の溶出がピークとなる塩濃度の演算式＞
クロマトカラム内の蛋白質等の吸着帯の移動は次式で表される。
ここでHは相率（相体積比）であり数式１５で表される。
ここでuは移動相速度u=F_v/(A_Cε)、F_vは体積流量、A_Cはクロマトカラム断面積であり、またV_tカラム体積、V₀はカラム空隙体積、εはカラム空隙率である。
時間tとカラム入り口から出口方向への移動距離zの関数として直線的な塩濃度勾配で塩含有液をカラムに供給した場合の移動相中の塩濃度Iは、次式で表される。
ここでgは塩濃度勾配g=(I_F-I₀)/V_g、V_gは勾配に必要な溶液量、すなわち塩濃度勾配を開始するときの初期塩濃度I₀から目的とする最終塩濃度I_Fに達するまでにクロマトカラムに供給した塩含有液量、K’は塩の分配係数(定数)である。次に数学的操作を行う。
ここでGは空隙体積で規格化した塩濃度勾配G=V₀gであり、Zはカラム長さである。
上式より以下の式が得られる。
上式をカラム入口（z = 0）においてI = I₀、カラム出口（z = Z）においてI = I_Rの条件で積分すると、
が得られる。ここで、I_Rは溶出する塩含有液の塩濃度（溶出塩濃度）である。数式１３に示されるように、規格化した塩濃度勾配をＧＨと溶出塩濃度I_Rの関係式である数式２０が成立する。
ｐＨを一定にしてクロマトカラムに供給する移動相の塩濃度を徐々に上げることで蛋白質等をクロマトカラムから溶出させる塩濃度勾配溶出法による予備実験で得られる蛋白質等の吸光度がピークになる溶出塩濃度（Ｉ_Ｒ）を横軸に、ＧＨを縦軸にとり両対数グラフ上にプロットする。塩濃度勾配を少なくとも異なる４条件で行われ、それらの４プロット以上のプロットに対して最小二乗法によって直線を引く。このグラフをＧＨ-Ｉ_Ｒ曲線と呼ぶ。数式２０に示されるようにＧＨ-Ｉ_Ｒ曲線の直線の傾きおよび切片から吸着サイト数Ｂ及び比例定数Ａの各定数が求められる。
Ａ及びＢを求めたのち、それぞれの塩濃度勾配gにおける蛋白質等のK_Rを算出した。K_Rは数式１２及び数式１３により求められ、この結果が次の数式２１で用いられる。

＜クロマトカラムから蛋白質等が溶出する塩含有液供給量の予測＞
次にクロマトグラフィーの分配モデルに基づき、単位時間あたりのカラム内における蛋白質等の移動速度を数式２１に示す。
ここでｚはクロマトカラム内移動距離、ｔは時間、uは移動相速度である。なお、K_SECは、蛋白質等がすべて溶出する一定濃度の塩含有液共存下でのイソクラティック溶出法により求められる。
一方、溶出塩濃度Ｉは時間の関数として次の数式２２から求まる。
数式２１のIを数式２２に変換したうえで、蛋白質等毎の上記Ａ、Ｂ及びＫsecの値、クロマトカラムへの塩含有液の供給流量、使用クロマトカラムの長さ、内径及び空隙率を用い数式２１を数値計算で積分し、ある時間ｔにおけるクロマトカラム内の移動相である蛋白質等の移動距離ｚを算出する。数値計算は典型的にはルンゲクッタ法を用いて行う。移動距離ｚがクロマトカラム長さを超えた時点で蛋白質等の溶出がピークとなる溶出時間となり、その塩濃度Ｉの理論値が求められる。以上の結果蛋白質等がクロマトカラム出口から溶出する時間が求められ、クロマトカラムの容積等から溶出に必要な塩含有液の供給量を計算によって予測できる。
図５は、蛋白質等の溶出に必要な塩含有液の供給量を予測するための予備実験の内容及び処理手順を示すフロー図である。

〔実施形態２〕
図６は実施形態２に係る修飾蛋白質の生産装置の概念図である。
本実施形態に係る修飾蛋白質の生産装置は、図６の概念図に示すように、回収した非修飾蛋白質をクロマトカラム３に供給する際に脱塩する脱塩カラム１５を第１バルブ１６とクロマトカラム３の入口１との間に備えていない点のみで、実施形態１に係る修飾蛋白質の生産装置と相違している。そのため、実施形態２に係る修飾蛋白質の生産装置の構成についての説明は省略する。
塩濃度低減部としての脱塩カラムがない代わりに非修飾蛋白質を含む溶液の脱塩ではなく塩濃度を希釈して低下させるだけの希釈部を設けることができる。この希釈部として非修飾蛋白質供給部４を兼用することができるので、この場合の希釈手法について実施形態１との相違点だけを述べる。実施形態１のプロセス（１）に替えて非修飾蛋白質の溶液を直接クロマトカラム３の入口へ供給する。以下プロセスとは実施形態１で述べたプロセスをいう。その後、プロセス（２）～（５）を行うが、プロセス（５）の際に非修飾蛋白質を非修飾蛋白質供給部４に回収後、カラム平衡化とともに第１濃度の塩含有液を非修飾蛋白質供給部４に注入させておくことで希釈が行われる。
その後プロセス（１）へ戻り、これら本実施形態のプロセスの操作を繰り返す。このようにすることで、クロマトカラム３の固相内で非修飾蛋白質は流れ方向に分散されるのを抑制することができる。

（実施形態の他の変形例）
実施形態１及び２に係る修飾蛋白質の生産装置及び生産方法に関する変形例を列記する。
（０１）実施形態１及び２では、図２に示すプロセス３において、塩含有液の塩濃度を第１濃度から第２濃度まで徐々に上昇させながら供給し、プロセス４において、溶液の塩濃度を第２濃度から第３濃度まで上昇させるために第１濃度の塩含有液の供給を停止して第３濃度の塩含有液だけを供給したが、塩濃度の上昇率は第１濃度から第２濃度までと、第２濃度から第３濃度までとにおいて、同じにしても良い。また、非修飾蛋白質の溶出において第１塩濃度の塩含有液ともに第３濃度の塩含有液を供給し、第２濃度より高く第３濃度より低い濃度で供給してもよい。
（０２）実施形態１及び２において、塩濃度勾配溶出法による蛋白質等の溶出における塩含有液の塩濃度を第１濃度から第２濃度まで上昇させる間に濃度変化の勾配を途中で変えてもよい。蛋白質への修飾体の修飾数が異なるものあるいは修飾異性体が生成する場合で、これら各々成分がカラム出口の溶出ピークとなる時間、すなわち溶出速度が異なる場合には、それらの分離を行いやすくするために濃度変化の勾配を小さくするとよい。濃度勾配を途中で変える塩濃度勾配溶出法によって蛋白質等の溶出ピークを得るタイミングをあらかじめ把握することでシーケンス制御が可能となる。
（０３）実施形態１及び２において、ゴーストピークの出現のタイミングによっては回収物のコンタミのおそれが小さいと見込まれる場合は、制御部１８に上記吸光度等検出部８からの吸光度信号を所定値で受信してから吸光度のピーク値までの上昇時間を記憶部に記憶させ、修飾体の供給、非修飾蛋白質の回収に要する時間をその上昇時間の所定倍数時間に設定して制御させるようにしてもよい。同様に塩含有液供給による配管洗浄等に要する時間をあらかじめ設定して記憶部に記憶させ、その時間だけ洗浄等するなどの制御をしてもよい。
（０４）実施形態１及び２において各種溶液の供給の制御は、供給量のほかに、クロマトカラムや配管の断面積や容積から逆算した蛋白質等の移動距離や塩含有液の供給時間に基づいて制御してもよい。
（０５）実施形態１及び２において必要に応じてカラム出口に流量計を設けてカラムへの蛋白質等や修飾体の試薬の供給量を監視することができる。また、各溶液を所定容積供給する際に、制御部１８にかかる流量計の出力を送信し、カラムへの各溶液の供給量を制御してもよい。
（０６）実施形態１および２において非修飾蛋白質を含む溶液として塩濃度が概ね０．５Ｍ（Ｍはmol/Ｌを指す。以下同じ。）以下の低濃度で供給量も少ない場合は、必ずしも塩濃度低減部を通液させなくてもよい。特にサイクル1の初回の蛋白質が購入時のものなどバージンのものを使用する場合はその溶液の塩濃度によっては塩濃度低減を不要としてもよい。
（０７）実施形態１および２において非修飾蛋白質を繰り返しクロマトカラムへ再供給する際に、非修飾蛋白質とは別にバージンの蛋白質を非修飾蛋白質供給部に補給しておいてもよい。
（０８）実施形態２において、非修飾蛋白質供給部を希釈部として用いる代わりに長めもしくは十分な容積の配管をクロマトカラム３の入口１の上流側の系内に設けて、その配管へ希釈用の比較的低濃度の塩含有液あらかじめ滞留させておき、高濃度塩含有液を含む非修飾蛋白質を混合させて希釈するようにしてもよい。また、上記配管を設けるのと同様に系内に希釈用の配管とともにまたは希釈用配管とは別に貯槽を設けてもよい。さらに希釈時の混合を促進させるため配管内に混合用のステータや貯槽内に攪拌装置を設けてもよい。

〔実施例１〕
実施形態１の図１に基づきプロセス（１）～（５）に従って修飾蛋白質の生産実験を行った方法及び結果を以下に述べる。

＜比例定数Ａ及び吸着サイト数Ｂの決定＞
生産実験の前に、クロマトカラムからの蛋白質等の溶出がピークとなる塩濃度を計算で求めるために、まず数式２０の比例定数Ａ及び吸着サイト数Ｂの決定をするため図１の生産装置の一部を用いてクロマトカラムによる塩濃度勾配溶出実験を行った。
使用蛋白質、使用試薬、使用カラム、計測装置の条件（試験条件Ｎｏ．１）を以下に示す。
－試験条件Ｎｏ．１－
・蛋白質（非修飾蛋白質）
Sigma-Aldrich社製Hen egg white lysozyme（以下「Lysozyme」という。）
・修飾体
日油（株）製 ME-050CS（重量平均分子量5000g/mol）
・カラム供給用の塩含有液
第１濃度用：0.01Mリン酸緩衝液と0.03M NaClの混合液（ｐＨ７）
第３濃度用：0.01Mリン酸緩衝液と1M NaClの混合液（ｐＨ７）
・陽イオン交換クロマトカラムＮｏ．１（以下「ＩＥＣカラムＮｏ．１」という）
REPRIGEN社製 Atoll SPHP、カラム担体cross-linked agarose 充填カラム長さ5cm、カラム内径0.5cm、カラム空隙率0.35
・導電率計及び制御装置等
吸光度（UV）及び塩濃度を計測する導電率計並びに各溶液の供給及び供給量の制御は、GE Healthcare Life Sciences製自動液体クロマトグラフィーAKTA pure25に付属の機器及びソフトウエアを使用。
・非修飾蛋白質供給装置
GE Healthcare Life Sciences製 Superloop 容量150ｍL

以下液相反応により修飾蛋白質を得てＩＥＣカラムＮｏ．１を用いて塩濃度勾配溶出法による蛋白質等の溶出を行った詳細を述べる。
試験管内で10mgの Lysozymeに10ｍMのリン酸ナトリウム緩衝液と30mMのNaCl(pH7.0)との混合液を加えて、室温で保管されていたME-050CSをLysozymeに対して６倍のモル数を混合し、25℃で30min反応させて修飾蛋白質を得た。この液相反応において得られた修飾蛋白質とLysozymeの混合溶液をＩＥＣカラムＮｏ．１内に供給したのち、ｐＨ７に保持した塩含有液を流量1.0ｍＬ/ｍｉｎでＮａＣｌ濃度を０．０３Ｍから直線的に上昇させて溶出させる塩濃度勾配溶出を行った。その結果を図７に示す。修飾蛋白質としてこれらの溶出ピークはLysozyme にPEGの分子が１つだけ結合した３つの修飾異性体（PEG1,PEG2及びPEG3）、PEGの分子が２つ結合した２つの修飾異性体（PEG4，PEG5）、PEGの分子が３つ結合した修飾異性体（PEG6）の６種と同定された。そこで液相反応で得られた溶液について塩濃度勾配溶出法を異なる塩濃度勾配で４条件行った。
図８は上記溶出実験結果から得た蛋白質等の溶出量がピークとなる塩濃度（ＮａＣｌ）Ｉ_Ｒと規格化した塩濃度勾配ＧＨを示す両対数の曲線（ＧＨ-Ｉ_Ｒ曲線）である。この図中最も右側の曲線上にある４つのプロットがLysozymeであり、その左側にPEG1～6が番号順に並んでいる。７つの各曲線は各蛋白質等の４つのプロットについて最小二乗法により引いた直線である。これらの結果から、求めた吸着サイト数ＢおよびパラメーターＡの各定数を表１に示す。

＜塩濃度に対応する分配係数の決定＞
図９は、上記溶出実験結果に基づき計算から求めた溶出塩濃度Ｉと分配係数Ｋの関係を示すグラフである。この結果を数式２１の数値計算で用いた。またK_SECの定数値は試験条件Ｎｏ．１において１M NaClの塩含有液共存下でのイソクラティック溶出法により各蛋白質等について求め表１に示した。

＜蛋白質等がクロマトカラムから溶出する塩含有液供給量の算出＞
図１０は、上記溶出実験結果で求められた表１の各数値、ＩＥＣカラムNo.1へ供給される塩含有液流量１ｍｌ/min、同カラムの長さ、内径及びカラム空隙率を用いて数式２１をルンゲクッタ法による数値計算によって求めた結果から描いた塩濃度と蛋白質等の移動距離を示すグラフである。同図にLysozyme及びPEG1～4について時間と移動距離の関係の計算結果も示した。この結果からＩＥＣカラムＮｏ．１出口における溶出がピークとなるために必要な塩含有液の供給量を求めた。

＜修飾蛋白質の生産及び分離試験とその結果＞
以上の結果から求められた各蛋白質等の溶出に必要な塩含有塩の供給量、その他ＩＥＣカラムへの非修飾蛋白質の供給量、修飾体の供給量、系内の洗浄や置換に必要な塩含有液の供給量についても吸光度及び伝導率の計測値あらかじめ制御部の記憶部に設定しシーケンス制御を行う生産試験を４回繰り返した。
修飾蛋白質の生産および分離試験の条件を試験条件Ｎｏ．２として以下に示す。この試験では使用蛋白質、使用試薬、計測装置は試験条件Ｎｏ．１と同一であり異なるのは次のようにＩＥＣカラムＮｏ．２及び脱塩カラムを使用したことであるため、相違する試験条件だけを示す。
－試験条件Ｎｏ．２－
・ＩＥＣカラムＮｏ．２
GE Healthcare Life Sciences製 SP Sepharose High Performance カラム担体cross-linked agarose、充填カラム長さ5cm、カラム内径0.9cm 、カラム空隙率0.36
・脱塩カラム
GE Healthcare Life Sciences製 HiTrap Desalting、カラム担体cross-linked agarose、充填カラム長さ2.5cm、カラム内径1.6cm
・修飾体供給装置
ループ配管を使用（5℃のME-050CSを室温ループ配管へ供給）

修飾異性体の組成比、転化率および活性化PEGの加水分解の半減期に基づき、陽イオン交換クロマトカラムの担体に吸着したLysozymeのモル濃度とのME-050CSのモル濃度の比（反応仕込み比）、反応時間はそれぞれ1:6、4時間とした。また、陽イオン交換クロマトカラムへ供給したME-050CSの供給モル数はLysozyme供給モル数の24倍とし、ME-050CS２ｍＬを流速0.017ｍＬ／分及び室温で供給して修飾反応を実施した。修飾体溶液供給後、修飾蛋白質を溶出させるため塩含有液を１ｍＬ/ｍｉｎ及び室温で供給しながら塩濃度勾配溶出法による溶出を行った。修飾体の温度は反応開始直前まで５℃に冷却してあった。蛋白質の修飾反応の条件は、液相反応において最適化したものに倣い決定した。なお、塩含有液の第1濃度から第２濃度までの調整は第１濃度用及び第３濃度用の塩含有液を混合させて行い、第２濃度から第３濃度までの調整は第１濃度用の塩含有液の供給を停止して、第３濃度用の塩含有液だけを供給して行った。
脱塩カラムを使用した「脱塩カラム有」の場合と脱塩カラムを使用せず希釈による「脱塩カラム無」の場合のシーケンス制御による操作名とＩＥＣカラムＮｏ．２、すなわち第３バルブからの排出先を表２に示す。同表でＩＥＣカラム洗浄は第１濃度用の塩含有液の供給による洗浄である。また各操作名の項目で括弧書きの101～105の数字は、後述の図１１の図中に示した各区間を示す。

図１１の「脱塩カラム有」のグラフは本実施例の各プロセスにおけるクロマトカラムからの排出物の吸光度と塩濃度の変化を示すグラフである。
なお、図１１の上部に示した数字は実施形態１における修飾蛋白質の生産工程の流れを示しており、１が上記（２）のプロセスに、２が上記（３）のプロセスに、３が上記（４）のプロセスに、４が上記（５）後半のプロセスに対応している。

以下、各生産工程における吸光度と塩濃度の変化について説明する。
生産工程１：上記（２）のプロセスにおいては修飾反応を行っているが、修飾体の一部がＩＥＣカラムを素通りするため、修飾体による大きな吸収が見られる。また、修飾体供給とともに供給される塩含有液の塩濃度は第1濃度でありほぼ０．０３Ｍとなっている。
生産工程２：上記（３）のプロセスで溶液の塩濃度を０．０３Ｍから第２濃度の０．２５Ｍまで連続的に増加させるため、塩濃度は０．０３Ｍから０．２５Ｍに徐々に上がっている。塩濃度が上がるにつれて生成したPEG化したLysozyme（修飾蛋白質）の溶出が起こり、その修飾蛋白質による吸収が見られる。
生産工程３：上記（４）のプロセスにおいては非修飾蛋白質の溶出が起こるため、その非修飾蛋白質による大きな吸収が見られるが、非修飾蛋白質の溶出が終了すると吸光度はほぼ０となる。また、上記（４）のプロセスにおいて塩濃度が第３濃度（１Ｍ）の塩含有液が供給されるので、塩濃度は０．２５Ｍから１Ｍに急激に上昇し、その後上記（４）のプロセスにおいて塩濃度０．０３Ｍの塩含有液が供給されるので、塩濃度は１Ｍからほぼ０．０３Ｍに急激に下降している。
生産工程４：上記（５）のプロセスにおいては、非修飾蛋白質等の溶出は起こらないので、吸光度はほぼ０となっている。また、同プロセスでは塩濃度０．０３Ｍの塩含有液が供給され続けるので、塩濃度はほぼ０．０３ＭでＩＥＣカラムの固相が平衡化され、その後回収した非修飾蛋白質を脱塩部へ供給するが、脱塩部や配管に残留した塩分が排出され一時期において塩濃度が上昇していると考えられる。

〔実施例２〕
本実施例においては、脱塩カラムを設けない実施形態２の生産装置を用い、希釈部としての非修飾蛋白質供給部に第１濃度の塩濃度の塩含有液を希釈液として注入しておき、ＩＥＣカラムへ供給した点が実施例１の実験装置及びその方法が異なる。
図１１の「脱塩カラム無」のグラフは本実施例の各プロセスにおけるクロマトカラムからの排出物の吸光度と塩濃度の変化を示した。生産工程１～４の区分は実施例１と同様である。本実施例では生産工程１～３まではほぼ実施例１と同様の溶出挙動を示した。生産工程４終了前に塩濃度の小さな溶出ピークが出たのは、Lysozyme溶液が第１濃度の塩含有液に置換されていなかったためと考えられる。

図１２は、実施例１及び２に係る生産工程による修飾反応の回数、修飾蛋白質の選択性（目的とする修飾蛋白質（ＰＥＧ１）生成量（Ｗ）と、目的とする修飾蛋白質（ＰＥＧ１）生成量（Ｗ）及びその修飾蛋白質のすべての異性体の生成量（Ｘ）の合計量（Ｗ＋Ｘ）との比率）並びに修飾蛋白質の収率（目的とする修飾蛋白質生成量（Ｗ）と、非修飾蛋白質回収量（Ｒ）及びすべての修飾蛋白質生成量（Ｙ）の合計量（Ｒ＋Ｙ）との比率）の変化を示すグラフである。比率の計算は、目的とする各成分の吸光度の曲線を積分して得られた吸光面積を、全ての成分の吸光面積の合計値で割って求めた。

図１２のグラフから分かるように、修飾蛋白質の選択性は各回ともほぼ同じであり、脱塩カラムの有無による影響もほとんどない。
また、修飾蛋白質の収率は、修飾反応の回数２回までは脱塩カラムの有無による影響を受けていないが、修飾反応の回数が多くなるにつれて脱塩カラム有の方が収率はわずかに大きいものの大差ない。
表３は、実施例１及び２における未反応のLysozyme及び生成物のPEG1～6の吸光面積をそれぞれ４サイクル分合計算したときの未反応のLysozyme及び生成物のPEG1～6の存在比、すなわち収率をそれぞれ示している。また、同表には、実施例１で述べた比例定数Ａ及び吸着サイト数Ｂの決定時の試験条件で、液相反応の時間を30分、480分とした場合について得られた蛋白質等をＩＥＣカラムに供給して得られた溶出成分からの収率をそれぞれ比較例１、２として示した。
この結果から、未反応のLysozymeについては実施例１と比較例１、２を比べても収率に大差はなく同等に近いレベルに達しており、繰り返し蛋白質を反応させる効果が見られる。一方、実施例１、２とも修飾蛋白質であるPEG1～3、すなわちＰＥＧ分子が１つだけ修飾さえた生成物の収率が高く、比較例はその収率が極めて低いので本発明の選択性が高かった。

１入口２出口３クロマトカラム
４非修飾蛋白質供給部５修飾体供給部６溶液供給部
７塩濃度制御部８吸光度等検出部９修飾体回収部
１０修飾蛋白質回収部１１非修飾蛋白質還流部
１３廃棄部１４第１バルブ１５脱塩カラム
１６第２バルブ１７第３バルブ１８制御部

Claims

入口と出口を有し蛋白質と両親媒性高分子ポリエチレングリコールとを内部で固相反応によって修飾反応させ修飾蛋白質の生成をするイオン交換クロマトカラムと、
非修飾蛋白質を前記イオン交換クロマトカラムに供給する非修飾蛋白質供給部と、
両親媒性高分子ポリエチレングリコールを前記イオン交換クロマトカラムに供給する修飾体供給部と、
塩含有液を前記イオン交換クロマトカラムに供給する塩含有液供給部と、
塩含有液の塩濃度を制御する塩濃度制御部と、
前記イオン交換クロマトカラム内の蛋白質と修飾反応せずに前記出口から排出される両親媒性高分子ポリエチレングリコールを回収する修飾体回収部と、
前記出口から排出される複数種の修飾蛋白質を回収する修飾蛋白質回収部と、
前記出口から排出される非修飾蛋白質を前記非修飾蛋白質供給部に還流させて回収する非修飾蛋白質還流部を備えている
ことを特徴とする修飾蛋白質の生産装置。
前記出口から排出される排出物の吸光度を検出する吸光度検出部を備え、
検出された吸光度に基づいて、前記修飾蛋白質回収部及び前記非修飾蛋白質還流部の作動を制御する制御部を備えている
ことを特徴とする請求項１に記載の修飾蛋白質の生産装置。
前記吸光度検出部は、前記出口から排出される複数種の修飾蛋白質及び非修飾蛋白質の吸光度を検出し、
前記制御部は、
前記複数種の修飾蛋白質及び前記非修飾蛋白質の各蛋白質毎の前記吸光度がピークとなる溶出塩濃度を予備実験に基づいて演算する溶出塩濃度演算部を有し、
前記溶出塩濃度演算部によって演算された各蛋白質毎の前記溶出塩濃度に対応する前記イオン交換クロマトカラムへの塩含有液供給量に基づいて、前記修飾蛋白質回収部及び前記非修飾蛋白質還流部の動作を制御する
ことを特徴とする請求項２に記載の修飾蛋白質の生産装置。
前記制御部は、
あらかじめ前記複数種の修飾蛋白質及び前記非修飾蛋白質を前記イオン交換クロマトカラムの内部に供給してから前記塩含有液により溶出させる予備実験で得られる所定の定数に基づき、前記複数種の修飾蛋白質及び前記非修飾蛋白質の前記吸光度がピークとなる時における溶出塩濃度を演算する溶出塩濃度演算部と、
前記溶出塩濃度を含む関数であって前記イオン交換クロマトカラムの液相中における前記複数種の修飾蛋白質又は前記非修飾蛋白質のいずれかの成分の濃度に対する前記液相中の成分と同じ成分の固相中の濃度の比である分配係数に基づいて、前記複数種の修飾蛋白質又は前記非修飾蛋白質が前記出口に達する塩含有液供給量を演算する溶出量演算部を有し、
前記塩含有液供給量に基づいて前記修飾蛋白質回収部及び前記非修飾蛋白質還流部の作動を制御する
ことを特徴とする請求項３に記載の修飾蛋白質の生産装置。
回収した非修飾蛋白質を含む塩含有溶液の塩濃度を低減する塩濃度低減部を備えている
ことを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の修飾蛋白質の生産装置。
入口と出口を有するイオン交換クロマトカラム内に非修飾蛋白質を供給する非修飾蛋白質供給工程と、
両親媒性高分子ポリエチレングリコールを前記入口から供給することによって非修飾蛋白質と両親媒性高分子ポリエチレングリコールとを固相反応によって修飾反応させ修飾蛋白質を生成する修飾反応工程と、
前記修飾反応工程中に前記イオン交換クロマトカラム内の蛋白質と修飾反応せずに前記出口から排出される両親媒性高分子ポリエチレングリコールを回収する修飾体回収工程と、
両親媒性高分子ポリエチレングリコールの供給を停止した後、第１濃度の塩含有液の供給を開始するとともに塩濃度を前記第１濃度よりも高い第２濃度まで高めて前記入口から供給することによって前記出口から排出される複数種の修飾蛋白質を回収する修飾蛋白質回収工程と、
前記第２濃度よりも高濃度の塩含有液を前記入口から供給することによって前記出口から排出される非修飾蛋白質を還流させて回収する非修飾蛋白質還流工程と、
回収した非修飾蛋白質を還流させ前記入口から供給する再供給工程を含む
ことを特徴とする修飾蛋白質の生産方法。
請求項２に係る修飾蛋白質の生産装置における前記修飾蛋白質回収部及び前記非修飾蛋白質還流部の動作を制御するための制御プログラムであって、
コンピュータに、
前記出口から排出される複数種の修飾蛋白質及び非修飾蛋白質の各蛋白質毎の吸光度がピークとなる溶出塩濃度を予備実験に基づいて演算させ、
演算された各蛋白質毎の前記溶出塩濃度に対応する前記イオン交換クロマトカラムへの塩含有液供給量に基づいて、前記制御部に対して前記修飾蛋白質回収部及び前記非修飾蛋白質還流部の動作制御を実行させるための制御プログラム。