CN113853520A - 色谱方法、在色谱方法中测定至少一种化合物的浓度的方法及获得至少一种色谱方法参数的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及色谱方法、在色谱方法中测定至少一种化合物的浓度的方法及获得至少一种色谱方法参数的方法。

Description

色谱方法、在色谱方法中测定至少一种化合物的浓度的方法 及获得至少一种色谱方法参数的方法
本发明涉及色谱方法、在色谱方法中测定至少一种化合物的浓度的方法及获得至少一种色谱方法参数的方法。基于从测定至少一种化合物的浓度的方法或获得至少一种色谱方法参数的方法获得的结果进行色谱。
色谱操作期间涉及的质量传递机理和动力学现象的分析和建模是关于放大目的、质量源于设计方式以及过程集成和优化的重要工具(Schwellenbach,Jan；Zobel,Steffen；Taft,Florian；Villain,Louis；Strube,Jochen(2016):Purification of MonoclonalAntibodies Using a Fiber Based Cation-Exchange Stationary Phase:ParameterDetermination and Modeling.In Bioengineering(Basel,Switzerland)3(4).DOI:10.3390/bioengineering3040024)。已经提出了许多数学模型来描述在色谱操作期间获得的浓度分布，其特征在于在相关质量传输现象的描述中不同的复杂性水平。
一般性速率模型(GRM)可以被视为描述利用球形多孔颗粒的色谱法的最通用模型。在该模型中，考虑了对流、轴向分散和其它质量传输阻力(Guiochon,Georges；Shirazi,Dean G.；Felinger,Attila；Katti,Anita M.(2006):Fundamentals of preparative andnonlinear chromatography.2nd ed.Boston:Academic Press)。这包括溶质分子从流动相到吸附剂颗粒外表面的外部质量传递、颗粒内的扩散和配体位点处的吸附-解吸过程，这通常通过各种吸附等温线如空间质量作用(SMA)、Langmuir或Freundlich来描述。一般性速率模型可以以简化形式重新布置，其中不同的质量传递过程表示为一个单项。然而，模型参数测定是漫长且劳动密集的。
为了获得用于对色谱过程建模的简化方法，已经提出不考虑质量传递(参见US 9766 217 B2)。然而，这种简化导致可能产生不准确结果的模型。
鉴于上述情况，本发明的技术问题在于提供在色谱方法中测定化合物浓度的方法，所述方法应是简单的并且得到准确的结果；提供使用上述确定浓度的方法获得色谱方法参数的方法；以及提供采用确定浓度的方法或获得色谱方法参数的方法的色谱方法。
上述技术问题的解决方案通过提供权利要求所限定的主题来实现。
在第一方面，本发明涉及在色谱方法中测定至少一种化合物的浓度的方法，所述方法包括以下步骤：(ia)选择至少一种化合物；(ib)选择固定相；(ic)选择流动相；(id)选择具有包括固定相和流动相的色谱床的色谱装置；(iia)获得至少一种化合物在固定相上的吸附等温线；(iib)获得至少一种化合物在流动相中的最大扩散时间tdiff；(iii)选择至少一种化合物在色谱床中的最小停留时间tres，使得满足方程式I
方程式I：tres>tdiff
(iv)基于吸附等温线计算在色谱装置的预定位置z处和在预定时间t时至少一种化合物在流动相中的浓度c(z,t)。
通过(iii)选择如上所述的最小停留时间tres，可以忽略色谱方法中扩散的影响。因此，即使在没有考虑扩散的情况下，也可以可靠地计算浓度c(z,t)。本发明提供了用于对色谱过程建模的简单方法，所述方法使得可以进行准确的预测，并且可以用于获得适当的色谱参数，例如为了从实验室模式放大到工业水平。
根据本发明的优选实施方案，在不考虑至少一种化合物在流动相中的扩散的情况下进行步骤(iv)。因此，可以以不但高准确性而且简单且快速的方式计算浓度c(z,t)。
色谱法是分离的物理方法，其中待分离的组分分布在两个相之间，其中一个相是固定的(固定相)，而另一个相(流动相)在预定方向上移动。
本发明的方法不限于特定类型的色谱法。例如，本发明的方法可以用于吸附色谱法、亲和色谱法、柱色谱法、置换色谱法、洗脱色谱法、排阻色谱法、尺寸排阻色谱法、凝胶渗透色谱法、迎头色谱法、气相色谱法、离子交换色谱法、疏水作用色谱法、混合模式色谱法、等温色谱法、液相色谱法、正相色谱法、分配色谱法、平面色谱法、程序化流动色谱法、程序化压力色谱法、程序化温度色谱法、热解-气相色谱、反应色谱法、反相色谱法、超临界流体色谱法、二维色谱法等。根据本发明的方法特别适用于离子交换色谱法、疏水作用色谱法、亲和色谱法和混合模式色谱法。
在根据本发明的方法中，可以测定一种或多种化合物取决于过程期间的时间t和色谱装置/色谱床的位置z的浓度。在本文中，色谱装置的位置z沿着其中流动相在色谱法期间移动的上述预定方向。在本发明的上下文中，可以假定至少一种化合物的浓度在垂直于方向z的两个其它方向x和y上不变化。
步骤(ia)中选择的至少一种化合物不受特别限制。例如，它可以选自小分子(Mn≤8000g/mol，基于聚苯乙烯标准物通过GPC测定)、药物、蛋白质、核苷酸、核苷、生物细胞、病毒、病毒样颗粒、抗体-药物缀合物、电荷变化抗体、抗体片段、聚氨基酸和多肽。优选地，至少一种化合物包含或为蛋白质和/或药物。
本发明的方法能够计算色谱过程中至少一种化合物的浓度。原则上可以测定在色谱装置的任何预定位置z处和在色谱期间的任何时间t时存在于流动相中的任何化合物的浓度。优选地，计算在色谱装置的出口处在多个时间点的至少一种化合物的浓度。
可以计算仅一种化合物的浓度。然而，优选计算两种或更多种化合物的浓度。特别优选计算至少两种不同化合物的各自浓度，其中至少一种化合物是目标化合物，并且一种或多种其它化合物是杂质化合物。因此，例如可以通过本发明的方法确定在步骤(ia)至步骤(id)中选择的色谱参数是否能够令人满意地将一种或多种目标化合物与一种或多种杂质化合物分离。
根据本发明，目标化合物与杂质化合物之间的令人满意的分离意指在色谱期间的所有时间t，在色谱装置的出口处，仅目标化合物和杂质化合物中的一种在流动相中具有显著浓度。即，目标化合物和杂质化合物基本上在不同的时间t离开色谱装置。显著浓度为至少0.01μmol/L、优选至少0.001μmol/L、特别优选至少0.0001μmol/L的浓度。
根据本发明，步骤(ib)不受特别限制。原则上，可以使用适于色谱法的任何固定相。合适的固定相是例如多孔和无孔球形颗粒、多孔和无孔非球形颗粒(例如二氧化硅颗粒)、色谱树脂、色谱膜、色谱整料、膜吸附剂、织造物、非织造物和混合基质。根据本发明，优选在步骤(ib)中选择色谱膜(例如离子交换色谱膜)、膜吸附剂、整料、无孔球形颗粒或非球形颗粒作为固定相。
根据本发明，优选色谱床具有至多0.40、优选至多0.25、特别优选至多0.10、甚至更优选至多0.05、最优选0.01、例如0.00的内部孔隙率εp。当内部孔隙率εp低时，最大扩散时间tdiff趋于是短的，使得可以减少停留时间tres，这提高了色谱方法的效率。
就由多孔颗粒材料构成的固定相而言，色谱床的总孔隙率εT可以分为两项：
·内部孔隙率/空隙率εp：该项描述了相对于色谱床的总体积，多孔颗粒的内部空隙率。
·体相孔隙率/空隙率εb：该项描述了相对于色谱床的总体积，色谱床(流动通道)中的颗粒之间的空隙率。
两个孔隙率值εp和εb可以相加，以得到色谱床的总孔隙率εT：
εT＝εp+εb
色谱床的特征还可以在于
·固定相孔隙率εsp：该项描述了相对于固定相的总体积，多孔颗粒的内部空隙率。
Figure BDA0003366501080000041
由颗粒材料构成的固定相不仅可以通过上述参数εT、εp、εb和εsp来描述，还可以通常通过固定相来描述，所述固定相例如膜、整料、非织造物、织造物和其它非特定介质。根据固定相(基质)的结构，内部孔隙率εp可以等于零，这导致由于缺少基质内结构扩散而可以简化质量传输现象。
内部孔隙率εp、固定相孔隙率εsp、体相孔隙率εb和总孔隙率εT的值可以如下所解释的确定。
逆体积尺寸排阻色谱法(iSEC)是广泛使用的相对于分子尺寸测定色谱介质的空隙率和孔隙率的方法。必须选择用于逆体积尺寸排阻色谱法的参考分子(示踪物分子)。参考分子的尺寸应与至少一种化合物(例如目标分子)的尺寸相匹配。优选参考分子不与固定相相互作用。具有窄且限定的尺寸分布的参考分子的优选分子种类特别地但不限于多糖、聚丙烯酸酯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、胶乳珠。(逆体积尺寸排阻色谱法可以另外用于使用各种模型计算孔径分布。)
统计矩的常规方法表示了主要的分析方式。该方法适用于由示踪物的窄矩形脉冲注入系统导致的色谱峰，该方法是计算色谱床实际体积、空隙率(孔隙率)和分散系数Dax的有效方式。
按照矩分析技术，可以使用以下方式计算取决于缓冲条件和分子尺寸的空隙率值：
Figure BDA0003366501080000051
其中ε表示示踪物分子(参考分子)可达到的体积分数，V表示色谱床体积，F表示体积流速并且μp表示示踪物峰的第一矩。
对于所有信号，第一矩(μp)和第二矩
Figure BDA0003366501080000052
可以如由H.W.Haynes(A Model for theApplication of Gas Chromatography to measurements of Diffusion in BidisperseStructured Catalysts,AIChE J.19(1973)1043–1046.doi:10.1002/aic.690190526)提出的进行测量和计算，并且如果需要，通过减去色谱装置(例如HPLC系统)的柱外体积引起的矩来校正。
该校正程序可以通过测定在没有色谱介质的情况下测量的示踪物信号的第一矩(μHPLC)和第二矩
Figure BDA0003366501080000053
来进行。然后从在色谱介质存在下测定的第一矩(μp，obs)和第二矩
Figure BDA0003366501080000054
减去相应值以消除色谱系统的影响(参见以下式(4)和式(5))。
Figure BDA0003366501080000055
Figure BDA0003366501080000056
μp＝μp，obs-μHPLC (4)
Figure BDA0003366501080000061
其中μp和
Figure BDA0003366501080000062
是示踪物峰的第一矩和第二矩。μp，obs和
Figure BDA0003366501080000063
归因于整个系统，而μHPLC和
Figure BDA0003366501080000064
仅对应于柱外体积。Cd，i(t)表示示踪物i在检测器处在时间t时的浓度。即，通过检测器检测浓度Cd，i(t)。
如果色谱床没有内部孔隙率，则可以通过应用式(1)、式(2)和式(4)直接获得相对于所用分子尺寸的体相孔隙率εb。在这种情况下，εb＝ε＝εT，εp＝0并且εsp＝0。
如果色谱床具有内部孔隙率εp和固定相孔隙率εsp，则可以使用以下方式测定εp和εsp的值：
小示踪物分子可以完全达到反映停滞相的内部空隙率εp，以及由流动相所占据的较大传输通道中的体积εb。因此，所获得的可达到的体积分数的边界值反映了色谱床的总空隙率εT。即，在使用小分子(例如丙酮)作为示踪物i的情况下，在式(1)中，ε＝εT。
大的示踪物分子i被完全排除在内部空隙率εp之外。所获得的可达到的体积分数的边界值反映了流动相所占据的外部空隙率(体相孔隙率)εb。即，在使用通过尺寸排阻色谱法测定的重均分子量Mw为2000000g/mol的大分子(例如右旋糖酐)作为示踪物i的情况下，在式(1)中，ε＝εb。两个边界值都是描述色谱床的固定相孔隙率εsp所必需的：
Figure BDA0003366501080000065
相同的方式可以用于内部孔隙率εp。外部孔隙率和总孔隙率的两个值都是其计算(εp＝εT-εb)所必需的。
因此，确定εp和εsp需要不可达到内部孔隙的一种示踪物分子(例如右旋糖酐)，以及完全可达到内部孔隙的另一种示踪物分子(例如丙酮)。式(1)、式(2)和式(4)的组合使得可以计算εp或εsp的值，如在J.Schwellenbach,S.Zobel,F.Taft,L.Villain,J.Strube,Purification of monoclonal antibodies using a fiber based cation-exchangestationary phase:parameter determination and modeling,Bioengineering 3(2016)24/1-24/20.doi:10.3390/bioengineering3040024中详细描述。
在未知色谱床的内部孔隙率εp是否为零的情况下，根据上述方法处理固定相来确定内部孔隙率εp。如果εp是零，则使用小示踪物分子和大示踪物分子的实验对于式(1)中的ε将产生相同的结果，即，εb＝εT，并且根据式“εp＝εT-εb”，εp的所得值将是0。
在固定相由颗粒材料(例如二氧化硅颗粒)构成的情况下，色谱床的内部孔隙率εp反映了颗粒内的孔隙率。与此相反，体相孔隙率εb由颗粒之间的空间构成，而不考虑内部孔隙率εp。流动相可达到的总体积(总孔隙率εT)是体相孔隙率和内部孔隙率之和(εT＝εp+εb)。
根据本发明的优选实施方案，固定相是色谱膜(例如离子交换色谱膜)、色谱树脂或整料，优选色谱膜或整料。
根据本发明，可以在步骤(ic)中选择可以用于色谱方法的任何流动相。流动相优选为液体。此外，流动相可以包括或为有机溶剂或有机溶剂的混合物。除了一种或多种有机溶剂之外，流动相可以包括水。优选地，流动相是水性介质。流动相的组成可以在色谱方法(梯度色谱法)期间变化。例如，当流动相包括一种或多种有机溶剂时，一种或多种有机溶剂的浓度可以在色谱法期间改变。此外，当流动相是水性介质时，流动相的pH和/或盐浓度可以在色谱方法期间变化。对于这种情况(例如，在pH和/或盐浓度变化的情况下)，必须在步骤(iia)中获得流动相的各种组成(即，变化的pH和/或变化的盐浓度)的吸附等温线。
根据本发明，流动相的pH原则上可以取任何值。优选地，pH值为0至14、更优选2至12、特别优选3至11、甚至更优选4至10，最优选5至9。当然，pH在色谱方法期间也可以保持恒定。
根据本发明，流动相的盐浓度原则上可以取任何值，只要不超过盐在流动相中的溶解度即可。优选地，盐浓度的值为0至10mol/L、更优选0至5mol/L、特别优选0至3mol/L、最优选0至1mol/L。当然，盐浓度也可以在色谱方法期间保持恒定。
根据本发明，如上所述，一种或多种盐可以溶解在流动相中。一种或多种盐不受特别限制。优选地，一种或多种盐选自氯化钠、氯化钾、硫酸钠、碳酸钠、硫酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸铵、脲盐酸盐、胍盐酸盐、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、甘氨酸、柠檬酸三钠及其组合。替代地或另外地，流动相可以含有相应的酸，例如盐酸、硫酸、柠檬酸等。
在步骤(id)中选择的色谱装置不受特别限制。色谱装置可以具有从实验室规模(其中色谱床的体积Vb为至多500mL、优选至多100mL、特别优选至多20mL、甚至更优选至多5mL)至工业规模(其中色谱床的体积Vb为大于500mL、优选至少1L、特别优选至少5L、甚至更优选至少10L)的任何尺寸。优选地，体积Vb为至少0.01mL、更优选至少0.1mL、特别优选至少0.5mL。进一步优选的是，体积Vb为至多1000L、更优选至多500L。优选地，色谱装置的色谱床的体积Vb大于500mL。
优选地，步骤(id)不仅包括色谱装置的选择，还包括至少一个罐、液体泵、检测器、多个阀和过程控制软件(色谱设备的选择)的选择，但不限于此。色谱设备在其机械和系统上可能因加工复杂性而变化。例如，当色谱法是连续色谱方法时，可以省略罐。在图13所示的示例性色谱设备中，往复泵P1将进料溶液从进料罐B1提供至色谱装置，在此是膜吸附剂MA1。优选在色谱装置MA1的下游检测相应的检测器信号。此后，优选将流动相收集在罐B2中或进一步纯化。优选将杂质导向废物收集器(图13中未显示)。
根据本发明，色谱温度不受特别限制，只要可以在选定的温度下进行色谱即可。优选地，色谱温度大于0℃、更优选至少1℃、特别优选至少5℃、甚至更优选至少15℃。色谱温度的上限优选小于100℃、优选80℃或更低、更优选70℃或更低、特别优选60℃或更低、甚至更优选50℃或更低。色谱温度可以在色谱方法期间变化，优选在上述范围内变化。优选地，色谱温度是恒定的。
在本发明方法的步骤(iia)中，获得至少一种化合物在固定相上的吸附等温线。吸附等温线是使结合容量q与至少一种化合物在流动相中的浓度相关的方程式，即具有形式q＝f(c)的方程式。根据本发明，结合容量q(z,t)被理解为相对于特定时间t和位置z，吸附在固定相上而不是位于流动相中的至少一种化合物的比例并且以mol/L表示。
根据本发明，吸附等温线可以通过实验获得，这是优选的。因此，根据本发明的优选实施方案，获得吸附等温线的步骤(iia)包括一个或多个实验室实验。优选地，通过实验室实验获得平衡吸附数据。具体地，可以使用间歇实验，因为它们对目标分子需求低并且可以是自动化的。也可以使用在动态条件下基于填充色谱床内的吸收的其它实验，因为所得平衡数据是相同的，但需要较高量的目标分子。
本领域技术人员能够基于其背景知识确定吸附等温线。例如，在步骤(iia)中获得的吸附等温线可以是空间质量作用(SMA)吸附等温线、Langmuir吸附等温线或Freundlich吸附等温线。
根据本发明的优选实施方案，SMA等温线可以用作吸附等温线。根据影响因素如盐浓度和/或pH，可以使用SMA等温线以便描述至少一种化合物的吸附。SMA等温线可以如Brooks,Clayton A.；Cramer,Steven M.(1992):Steric mass-action ionexchange.Displacement profiles and induced salt gradients.In AIChE J.38(12),pp.1969–1978.DOI:10.1002/aic.690381212；and in Journal of Chromatography A,1233(2012)54-65“Determination of parameters for the steric mass action model-A comparison between two approaches”中详细描述所测定。当固定相是离子交换色谱膜时，优选SMA等温线。
在以下三个方程式中，电中性依赖于至少一种化合物的空间因子σi、至少一种化合物的特征电荷vi和抗衡离子的结合容量q1(q1是盐的结合容量)以及至少一种化合物的结合容量qi。在式中，n是至少一种化合物的数量，并且Λ是色谱介质(固定相)的离子容量。
Figure BDA0003366501080000091
Figure BDA0003366501080000092
Figure BDA0003366501080000093
色谱介质的离子容量Λ限定色谱主链上配体的数量。离子容量(或色谱介质的容量)Λ可以通过主链上的配体与结合至每个配体的特征组分的化学反应来测定或通过滴定来测定。对于离子交换色谱(IEX)，通过用相应的酸或碱滴定带电配体来测定离子容量Λ。
对于快速平衡或处于平衡状态，SMA等温线可以写成如下方程式。
Figure BDA0003366501080000101
在上述方程式中，ci是至少一种化合物的浓度，并且c1是结合位点处的盐浓度。
特征电荷vi和平衡常数k可以通过用以下方程式对容量因子logk'进行曲线评估来确定
Figure BDA0003366501080000102
在方程式中
Figure BDA0003366501080000103
使用对数容量因子对对数盐浓度的线性回归，通过斜率和截距得到电荷νi和平衡常数k。空间因子σi可以通过对实验结果的误差最小化来拟合或用以下方程式对于ci→∞；q1→0进行计算：
Figure BDA0003366501080000104
根据本发明的另一个优选实施方案，可以在步骤(iia)中获得Langmuir等温线。
Langmuir等温线可以写成以下形式的多种组分(即，在至少一种化合物的数量为2或更大的情况下)
Figure BDA0003366501080000105
其中qi表示化合物i的结合容量，Keq,i是平衡吸附常数，qmax,i是色谱介质的最大结合容量，并且ci是流动相中化合物i的浓度。此外，总和
Figure BDA0003366501080000106
包括存在于流动相中的能够吸附至固定相的所有组分，包括化合物i。
按照由Yamamot等人(Biotechnology and Bioengineering,Vol XXV,Pp.1465-1583(1983))和Forrer(Nicola Forrer,“Antibody purification with ion-exchangechromatography”,dissertation,ETH Zurich 2008)公开的著作，Langmuir参数，即最大结合容量qmax,i和平衡结合常数Keq,i，可以与流体相中的盐浓度或pH相关，以描述盐/pH依赖性结合行为。在以下方程式中，盐浓度或pH由cmod表示。
qmax,i＝a1·cmod+a2
Keq，i＝b1·exp(-b2·cmod)
参数a1、a2、b1和b2是用于描述等温线参数Keq，i和qmax，i的盐依赖性的系数。如果已经获得不同的盐浓度的等温线参数，则可以通过上述示出的函数与盐依赖性等温线参数数据集的最小二乘拟合来确定系数。
在选自色谱温度、流动相的pH和流动相的盐浓度的一个或多个条件变化的情况下，对于步骤(iia)中的每个变化条件需要获得若干吸附等温线，以便覆盖色谱温度的整个范围、流动相的pH的整个范围和/或流动相的盐浓度的整个范围。在这种情况下，根据本发明可以获得仅用于一些变化条件的吸附等温线，而其它条件的吸附等温线可以使用描述所获得的数据集的函数关系借助内插法来获得。对于等温线参数的盐依赖性所描述的类似方法可以用于温度或pH依赖性。
在本发明方法的步骤(iib)中，获得至少一种化合物在流动相中的最大扩散时间tdiff。最大扩散时间tdiff描述了在固定相的孔或传输通道的中心中的目标分子通过扩散到达结合位点所需的最大时间。
最大扩散时间tdiff可以如下描述来测定。
通常，至少一种化合物到达给定距离内的固定相的结合位点所需的时间可以使用均方位移(MSD)x(t)2进行近似。它是颗粒位置相对于参考位置随时间变化的偏差的度量。它是随机运动的空间范围的最常见的度量，并且可以被认为是测量由随机步行者“探索”的系统的部分。对于一维情况，MSD可以如下式中给出进行计算。
x(t)2＝2Defftdiff
因此，根据本发明方法的优选实施方案，最大扩散时间由以下方程式确定
Figure BDA0003366501080000111
因此，用于计算最大扩散时间的值为：
·有效扩散系数Deff。
·目标分子到达结合位点的最大扩散路径长度x(t)。
最大扩散路径长度x(t)由使用的固定相的几何形状或化学修饰给出。作为实例，给出了两种突出色谱介质的相应值：
Figure BDA0003366501080000121
两种方法(扫描电子显微镜和共焦激光扫描显微镜)都是成像程序。所获得的图像可以用于测量流动通道的尺寸或颗粒大小或两者的组合。这些尺寸是目标分子在到达结合位点之前需要行进的最大路径，因此反映最大扩散路径长度。该方法可以用于具有可以使用上述技术分辨的扩散尺寸的所有固定相。
扫描电子显微镜(SEM)也可以用于大于5μm至小于25μm的最大扩散路径长度。
作为另一种选择，如果目标分子的体相扩散系数是已知的，则可以基于相关性计算有效扩散系数Deff。许多分子如球状蛋白或病毒的体相扩散系数公开在文献中或可以被估计(例如，参见Biotechnology and Bioengineering,Vol.XXII,Pp.647-955(1980))。
作为另一种选择，可以使用爱因斯坦-斯托克斯(Einstein-Stokes)方程式基于分子半径r、溶剂的动态粘度η、温度T和玻耳兹曼(Boltzmann)常数kB来估计体相扩散系数D体相。
Figure BDA0003366501080000122
在限定的条件下，可以使用动态光散射测定分子半径r。该方法依赖于由溶液中的分子运动引起的散射光的强度波动。该方法也允许直接获取扩散系数。
可以使用落球粘度计测定溶液粘度η。斯托克斯定律是落球粘度计的基础，其中流体在垂直玻璃管中是静止的。允许已知尺寸和密度的球体下降通过液体。如果正确选择，则其达到最终速度，所述最终速度可以通过其经过管上的两个标记所花费的时间来测量。电子感测可以用于不透明流体。已知最终速度、球体的尺寸和密度以及液体的密度，斯托克斯定律可以用于计算流体的粘度。
由于在狭缩的孔系统中的运动，有效扩散系数Deff在多孔系统如色谱树脂或膜吸附剂的水凝胶层中通常低一个数量级。这可以概括为曲折因子τ。
Figure BDA0003366501080000131
因此，基于体相扩散系数D体相和曲折因子τ，可以计算有效扩散常数Deff。
按照由Mackie和Meares(J.S.Mackie,P.Meares,The Diffusion ofElectrolytes in a Cation-Exchange Resin Membrane.I.Theoretical,Proc.R.Soc.London.Ser.A.Math.Phys.Sci.232(1955)498–509.http://rspa.royalsocietypublishing.org/content/232/1191/498.abstract.)公开的相关性，可以使用固定相孔隙率εsp计算曲折因子：
Figure BDA0003366501080000132
固定相孔隙率εsp可以如上所述测定。
根据本发明方法的步骤(iii)，选择至少一种化合物在色谱床中的最小停留时间tres，使得满足方程式I。
方程式I:tres>tdiff
由于tres>tdiff，在步骤(iv)中可以忽略至少一种化合物的扩散，而基本上不损害方法的准确性。
至少一种化合物的最小停留时间可以使用体积流速F、由其几何尺寸Vb和总孔隙率εT限定的色谱床的体积来计算。
Figure BDA0003366501080000133
根据本发明的优选实施方案，选择化合物在色谱床中的最小停留时间tres，使得满足方程式I-1。
方程式I-1:tres>2·tdiff
根据方程式I-1，tres大于tdiff的两倍。优选地，tres>3·tdiff，tres>5·tdiff，更优选tres>10·tdiff,特别优选tres>100·tdiff。tres与tdiff的比率越高，在步骤(iv)中可以计算的浓度c(z,t)越精确
根据本发明，tres的值不受限制。通过选择合适的色谱参数，即使停留时间tres短，也可以满足方程式I。然而，优选停留时间tres为至少0.1秒、更优选至少2.5秒、甚至更优选至少5.0秒、特别优选至少7.5秒。
通过增加tres的值，增加了tres与tdiff的比率，这改善了根据本发明的方法的准确性。然而，当停留时间太长时，色谱过程可能变得太耗时，因此不经济。因此，优选tres为至多20.0秒、更优选至多17.5秒、特别优选至多15秒。
根据本发明的优选实施方案，在不考虑至少一种化合物吸附到固定相的速率和至少一种化合物从固定相解吸的速率的情况下进行步骤(iv)。根据该优选实施方案，不考虑吸附动力学。
在tdiff非常低的情况下，因为构成固定相的材料的孔或颗粒半径非常小，吸附动力学可以变成速率限制步骤。因此，根据本发明优选tres>tads、更优选tres>2tads、甚至更优选tres>3tads,，特别是对于其中tads代表特征吸附时间的情况。然而，如果保持体积流速为每分钟多至20个柱体积，则吸附反应的半衰期通常比床停留时间低两个数量级。因此，通常可以忽略吸附动力学，而不会使步骤(iv)中的结果不准确。
根据本发明的优选实施方案，在步骤(iv)中，基于以下方程式计算c(z，t)
Figure BDA0003366501080000141
其中Z是包括以下项的和
Figure BDA0003366501080000142
以及
Figure BDA0003366501080000143
其中
q(z，t)表示固定相对至少一种化合物的结合容量，
εb是色谱床的体相孔隙率，以及
v是流动相在色谱床中的速度(m/s)。
可以基于以下方程式来计算v的值
Figure BDA0003366501080000151
其中F是流动相的体积流速(预定的)，并且A是在步骤(id)中选择的色谱装置的横截面积。可以通过直接的几何计算来确定A的值。
本领域技术人员能够依靠其背景知识基于方程式
Figure BDA0003366501080000152
计算c(z,t)。优选地，通过使用计算机，特别优选地通过基于计算机的数值方法进行基于方程式
Figure BDA0003366501080000153
计算c(z,t)。
优选地，和Z还包括项
Figure BDA0003366501080000154
其中Dax是至少一种化合物在色谱床中的轴向分散系数。
至少一种化合物在色谱床中的轴向分散系数Dax可以基于以下方程式计算
Dax＝α·v
其中α是分散性因子。如实施例5中所示，可以通过测量在不同的线流速下的轴向分散系数经由线性回归来测定该因子。以类似的方式，如下所述的至少一种化合物在假设的DPF中的轴向分散系数Dax,DPF可以使用方程式Dax,DPF＝αDPF·v计算。
或者，轴向分散系数Dax可以由以下的方程式计算。
Figure BDA0003366501080000155
在上述方程式中，Bo是博登斯坦数，v是线速度，并且L是特征长度。博登斯坦数是通过脉冲示踪实验确定的，在脉冲示踪实验中，轴向分散系数或者以误差最小化与实验数据拟合，或者使用矩分析。特征长度是色谱床高度(参见Octave Levenspiel；TraxerTechnology Modeling of the Flow of Fluids ISBN:978-1-4419-8073-1)。
作为替代方案，可以由以下方程式计算轴向分散系数Dax。
Figure BDA0003366501080000156
Figure BDA0003366501080000161
在上述方程式中，HETP是等于一个理论板的高度，并且v如上所定义。HETP可以通过示踪实验测定，其中使用在给定线速度v和特征长度L(色谱床高度)下的相应峰的方差
Figure BDA0003366501080000162
在许多情况下，色谱装置不仅包含固定相/色谱床。可以存在辅助元件，如阀、管、流量分配器等。这些辅助元件，即流动相流经并且与色谱床不同的色谱装置的部分，被称为“外部系统”。这些辅助元件对色谱装置的流体动力学性质的影响可以考虑如下所述。
根据本发明的优选实施方案，在步骤(iv)中，色谱装置可以视为假设的搅拌罐(ST)、假设的分布式活塞流管(DPF或PFP)和色谱床的组合，其中DPF布置在ST的下游，并且色谱床布置在DPF的下游，如图1所示。(或者，色谱装置可以视为假设的搅拌罐(ST)和假设的分布式活塞流管(DPF或PFP)中的仅一种与色谱床的组合。)因此，优选将外部系统视为一系列ST和DPF(外部系统“ST+DPF”)。即，根据本发明的优选实施方案，基于以下方程式计算c(z,t)：
Figure BDA0003366501080000163
Figure BDA0003366501080000164
Figure BDA0003366501080000165
其中
VSYS＝VST+VDPF
c(t＝0，z)＝0
Figure BDA0003366501080000166
Figure BDA0003366501080000167
在上述方程式中，zDPF是(假设的)DPF中的位置，
Figure BDA0003366501080000168
是zDPF可以取的最大值(DPF的出口)，z是色谱床中的位置，
Figure BDA0003366501080000169
是(假设的)ST入口处的至少一种化合物的浓度，
Figure BDA00033665010800001610
是ST出口处的至少一种化合物的浓度，VST是ST的体积，F是通过ST的流动相的体积流速，cDPF是DPF中的至少一种化合物的浓度，
Figure BDA00033665010800001611
是DPF入口处的至少一种化合物的浓度，
Figure BDA0003366501080000171
是DPF出口处的至少一种化合物的浓度，c(z＝0,t)是色谱床入口处的至少一种化合物的浓度，
Figure BDA0003366501080000172
是DPF的轴向分散系数，其可以以与色谱床的分散系数Dax类似的方式测定，VSYS是除色谱床的体积Vb之外的流动相可到达的色谱装置的总体积，VST是搅拌罐的体积，并且VDPF是DPF的体积。其它表达式如上所定义。
根据该优选实施方案，外部系统的贡献集中在柱的前面，这意味着假设的搅拌罐的出口等于假设的DPF/PFP的入口，并且DPF/PFP的出口等于色谱床的入口(参见图1)。
VSYS可以基于色谱设备的几何形状来测定。具体地，VSYS可以在没有色谱介质的情况下通过应用示踪物信号的第一矩的分析来测定。
VSYS＝Fμp
其中如上所述，F表示体积流速并且μp表示示踪物峰的第一矩。在脉冲注入之后离开系统的示踪物物质的全部浓度分布的回归得到描述外部系统的流体动态行为所必需的全部参数集。如果ST和DPF的组合被用于描述该行为，则误差最小化拟合程序得到
Figure BDA0003366501080000173
VST和VDPF。
在根据本发明方法的步骤(iv)中，基于至少一种化合物在固定相上的吸附等温线计算在色谱装置的预定位置z处和预定时间t时的至少一种化合物在流动相中的浓度c(z,t)。技术人员可以根据其背景知识基于吸附等温线进行该步骤(iv)。
如上所述，步骤(iv)中的c(z,t)的计算可以基于偏微分方程式(PDE，取决于时间和空间)。为了求解这些方程式，可以将PDE变换成常微分方程式(ODE)。这通常通过用数值方法描述空间相关性来完成。然后，将一个PDE转换为n个ODE，其中n是离散化的程度。使用的数值方法可以是(但不限于)有限差分方法、正交配置或对有限元的正交配置。
在大多数情况下，所得到的n个ODE的系统不能分析地求解。现有技术的方式是在离散时间步骤的数值积分。存在各种不同的积分方法，并且可以根据需要来使用。这些方法为(但不限于)隐式Euler方法、显式Euler方法、变步长隐式Euler方法和Runge-Kutta方法。
各种商业软件捆绑提供了解析上述PDE系统的可能性，在步骤(iv)中的c(z,t)的计算可以基于所述PDE系统。这些包括Aspen Custom
Figure BDA0003366501080000181
在另一方面，本发明涉及获得至少一种色谱方法参数的方法，所述至少一种色谱方法参数选自固定相、流动相和色谱装置，所述方法包括以下步骤：(I)在本发明的色谱方法中将测定至少一种化合物的浓度的方法执行n次，其中n是2或更大的整数，其中n次执行关于步骤(ib)至步骤(id)中的至少一个彼此不同；以及(II)基于步骤(I)的结果选择至少一个固定相、至少一个流动相和/或至少一个色谱装置。
可以由操作人员进行步骤(II)。或者，步骤(II)可以是自动化的，例如通过使用计算机。
通过机械模型对色谱过程的完整描述(例如分离问题)对于参数优化和放大是非常有益的。可以预测的过程窗口直接与测定的参数空间相关。在不需要在中试规模上耗费时间和材料的实验工作的情况下，可以直接预测优化的关于生产规模的工艺参数。另外，通过使用优化的工艺参数集，可以提高总的工艺效率。关于本文公开的方式，实验室规模的参数测定的实验工作也显著降低。基于使用的色谱介质的表征，可以确认和执行所公开的方式的有效性。
根据本发明的优选实施方案，进行步骤(I)，使得在n次执行的每一次中，在步骤(ia)中选择至少两种不同的化合物，并且在n次执行的每一次中，所述至少两种不同的化合物是相同的。通过该优选实施方案，可以在一组色谱方法参数中找到用于将几种化合物彼此分离的最佳参数。
在另一方面，本发明涉及色谱方法，其包括在色谱方法中测定至少一种化合物的浓度的上述方法，以及(v)进行色谱法的步骤。
通过使用上述方法，可以可靠地预测浓度c(z,t)，使得可以根据步骤(iv)中获得的c(z,t)的结果来控制或调整色谱方法。
根据本发明的优选实施方案，步骤(iv)包括计算在若干时间点t时在色谱装置的出口处的化合物在流动相中的浓度cout(t)，并且步骤(v)包括在其中cout(t)>0.0mmol/L、优选地其中cout(t)>0.00mmol/L的时间t时收集流动相。根据本发明，可以在步骤(iv)中计算至少一种化合物的穿透曲线，并且可以根据所计算的穿透曲线来收集流动相。特别优选在其中cout(t)为显著浓度(即至少0.01μmol/L、优选至少0.001μmol/L、特别优选至少0.0001μmol/L的浓度)的时间t时收集流动相。
在另一方面，本发明涉及色谱方法，其包括获得至少一种色谱方法参数的上述方法，以及(III)基于在步骤(II)中选择的至少一种色谱参数进行色谱法的步骤。
本发明提供了快速、准确且可靠地计算色谱方法中的至少一种化合物的浓度的方法。本发明方法可以用作获得最佳色谱参数的捷径。这特别有助于色谱方法从实验室模式放大至工业规模。
在常规的放大方法中，必须在多个中间放大步骤中获取大量的数据。与此相反，当使用根据本发明的方法时，可以以更容易的方式放大至工业规模。此外，与现有技术的方法相比，可以最小化色谱方法期间的产物损失，并且减少获得所需的模型参数的实验工作。
图1示出了根据本发明的优选实施方案的色谱装置的图示。
图2示出了对于实施例1的不同床停留时间，
Figure BDA0003366501080000191
S和Fractogel EMD SO3 -(M)的通过实验测定的动态结合容量。
图3示出了实施例2的等温线测定工作流程。
图4示出了实施例2的牛血清白蛋白在
Figure BDA0003366501080000192
Q上的平衡吸附数据。
图5示出了在实施例2a的8小时平衡后从
Figure BDA0003366501080000193
S洗脱的细胞培养物上清液级分的尺寸排阻色谱图。
图6示出了实施例2a的基于水凝胶接枝的短切(6mm)纤维的色谱介质在20mM的盐浓度下多种组分的平衡吸附数据。该图表示Langmuir等温线拟合。
图7示出了实施例2b的根据电导率和pH的单克隆抗体的单体的平衡吸附数据图。
图8示出了实施例2b的根据电导率和pH的单克隆抗体的二聚体的平衡吸附数据图。
图9示出了实施例4的根据线流速的色谱床的轴向分散系数Dax。
图10示出了实施例4的根据线流速的外部系统“ST+DPF”(参见图1)的DPF的轴向分散系数
Figure BDA0003366501080000201
图11示出了计算的穿透曲线(虚线)与实施例5的通过实验确定的穿透曲线(实线)的比较。
图12(a)示出了包括实施例6的Langmuir等温线拟合的平衡吸附数据。
图12(b)示出了实施例6的平衡结合常数对盐浓度的依赖性。
图12(c)示出了实施例6的最大吸附容量对盐浓度的依赖性。
图13示出了示例性色谱设备。
图14示意性地示出了本发明的优选实施方案。
本发明还通过以下非限制性实施例进行例示。
实施例
实施例1：步骤(iib)和步骤(iii)
在下文中，示出了在某些条件下将膜吸附剂(
Figure BDA0003366501080000203
S)与普通色谱树脂(Fractogel EMD SO3 -(M))进行比较的参考计算。
参数集
Figure BDA0003366501080000202
使用爱因斯坦-斯托克斯方程式计算体相扩散系数。特别地，将静脉内免疫球蛋白(IVIG；r＝5.2nm)溶解在在298K的温度下粘度η为1.05mPa·s的磷酸钠缓冲液(20mM，pH＝7)中。
使用逆体积尺寸排阻色谱法(iSEC)测定孔隙率值。简而言之，用50柱体积(CV)的所需缓冲液(磷酸钠缓冲液(20mM，pH＝7))对色谱床进行平衡，然后进样含有具有窄分子量分布的支链淀粉分子(2mg/mL)的溶液(100μL)。平均分子量，与所应用的支链淀粉样品的平均流体动力学半径直接相关，对于每次进样是变化的，覆盖宽的范围(Mn＝320-740,000g/moL)。记录洗脱曲线并通过RI检测器分析。
使用以下相关性计算有效扩散系数。
Figure BDA0003366501080000211
Figure BDA0003366501080000212
通过如上所述的iSEC测定内部孔隙率εp的值。
Figure BDA0003366501080000213
通过扫描电子显微镜测定扩散路径长度。特别地，使用扫描电子显微镜(SEM,FEIQuanta 200F)研究色谱介质的表面形态。在研究之前用金涂覆样品。使用2kV至20kV的加速电压和1.0至8.0的点尺寸在高真空下获得图像。使用Everhart-Thornley检测器检测二次电子。所得图像用于测量孔半径(
Figure BDA0003366501080000216
S)和颗粒半径(Fractogel EMD SO3 -(M))。这些值反映最大扩散路径长度。
这些值得到以下特征最大扩散时间。
Figure BDA0003366501080000214
当tres>3tdiff时，每分钟5柱体积的体积流速(对应于12s的床停留时间tres)对于
Figure BDA0003366501080000215
S是合适的。然而，当tres＜＜tdiff时，对于Fractogel EMD SO3 -(M)，12秒的停留时间tres太短。对于Fractogel EMD SO3 -(M)，动态结合容量随着床停留时间的增加而显著增加。
为了证明，已经使用不同的床停留时间记录使用两种固定相的IVIG的动态结合容量。两种介质的床体积均为1mL。结果示于图2中。
可以看出，对于
Figure BDA0003366501080000221
S，在床停留时间tres的研究范围内，质量传输不受扩散的限制，因为动态结合容量相对于床停留时间tres几乎不变。
实施例2：获得平衡吸附数据(步骤(iia))
在实施例2中，获得牛血清白蛋白(BSA)在
Figure BDA0003366501080000222
Q上的平衡吸附数据。
对于
Figure BDA0003366501080000223
Q(平均孔径为3μm且配体密度为2-5
Figure BDA0003366501080000224
)，用0.1至5g/L牛血清白蛋白(BSA)进行基于如Antibodies 2018,7(1),13(“Evaluation of ContinuousMembrane Chromatography Concepts with an Enhanced Process SimulationApproach”,Steffen Zobel,Dominik Stein,Jochen Strube)中所示的间歇实验的平衡吸附数据的测定。使用的缓冲液是20mM TRIS HCl缓冲液，pH＝7，NaCl浓度为0至0.3M NaCl。使用HCl或NaOH调节pH值。将直径为20cm且高度为0.024-0.028cm的圆形
Figure BDA0003366501080000225
Q膜吸附剂(MA)样品在具有各自的pH和盐浓度的20mM TRIS HCl缓冲液中平衡30分钟。缓冲液的体积是MA的体积的200倍。在30分钟的平衡时间之后，将MA用纸擦拭并转移到12孔板腔中。将BSA溶解在对应于实验pH和盐浓度的TRIS HCl缓冲液中。通过UV/Vis光谱在280nm测量BSA进料溶液的浓度，并将4mL添加至12孔板中的MA中。在至少8小时的停留时间之后，测量上清液浓度，再次将MA用纸擦拭并转移到新的孔板中。随后，用4mL 20mM TRIS HCl和1MNaCl洗脱MA至少4小时。在4小时洗脱时间之后，测量上清液浓度。在图3中示意性地描绘了上述过程。
获得的三种不同盐浓度的数据集示于图4中。
实施例2a：获得几种化合物的平衡吸附数据
实施例2的方法对于多组分分析也是可行的。突出的实例是同时测定单克隆抗体(mAb)以及它们的聚集体和污染物的平衡吸附数据。间歇实验可以以相同的方式进行，但必须以允许区分所有组分(mAb单体、聚集体和其它污染物)的方式分析上清液和洗脱液。例如，这可以通过尺寸排阻色谱法实现。
所获得的尺寸排阻色谱图的所得峰(参见本实施例的图5)可以使用适当的校准来评估，以测定在图4中所示的间歇实验期间目标组分的浓度。这得到平衡吸附数据。对于给定的盐浓度，在图6中示出了实例。
实施例2b：获得变化的盐浓度和变化的pH的平衡吸附数据
在上述实施例2中，仅改变盐浓度。按照相同的方法，也可以改变其它的影响因素如pH，从而得到多维吸附数据图。图7和图8示出了单克隆抗体IgQ及其二聚体根据pH和盐浓度在
Figure BDA0003366501080000234
Q上的平衡吸附数据。
实施例3：将数据集拟合成SMA等温线(步骤(iia))
将实施例2中获得的数据集用于计算蛋白质特征电荷νi和平衡常数k，此外，在三种不同盐浓度(cS＝0.05、0.15、0.25M)下使用计算机辅助最小二乘回归将空间因子σi对SMA吸附等温线进行拟合，以在所研究的盐浓度区域中获得必要的吸附模型参数。离子容量Λ为0.97mol/L(
Figure BDA0003366501080000231
Q)。
Figure BDA0003366501080000232
吸附常数：k＝7.55
空间因子：σi＝46.04
特征电荷：νi＝2.72
盐浓度：c1＝0.05M
实施例4：测定流体动力学行为和轴向分散系数
选择来自GE Healthcare的
Figure BDA0003366501080000235
Explorer作为色谱装置(步骤(id))。
如下测定参数VSYS、VST、VDPF和
Figure BDA0003366501080000233
在不存在色谱介质的情况下，进行丙酮(在反渗透水中的2体积％)或mAb(在磷酸钾(KPi)缓冲液中的4mg/mL，10mM、20mM NaCl，pH＝6)的脉冲进样。使用不同的体积流速和缓冲液条件进行实验。按照矩的方法评估所得的峰信号，并使用最小二乘拟合程序回归以获得所需值。该程序的结果在图9和图10中给出。
实施例5：蛋白质纯化过程的预测(步骤(iv))
使用实施例2、实施例3和实施例4中获得的模型参数集预测牛血清白蛋白在
Figure BDA0003366501080000241
Q上的穿透曲线。
基于以下方程式计算至少一种化合物的浓度c(z,t)：
Figure BDA0003366501080000242
Figure BDA0003366501080000243
Figure BDA0003366501080000244
其中
VSYS＝VST+VDPF
c(t＝0,z)＝0
Figure BDA0003366501080000245
Figure BDA0003366501080000246
以上提供了该程序的细节。
相应的实验在来自GE Healthcare的
Figure BDA0003366501080000247
Explorer上进行。将具有2.8cm直径和3.7mL体积的
Figure BDA0003366501080000248
Q实验室装置进行平衡，加载1.43·10-5M BSA溶液并用20mMTRIS HCl缓冲液洗涤。流速为11mL/min。平衡为39mL，随后直到333mL才加载并且直到388.5mL进行洗涤步骤。(在本文，“平衡”用于将色谱介质设定为结合条件，“加载步骤”是在色谱介质上加载进料/蛋白质溶液，并且“洗涤步骤”是指冲洗出未结合的组分。)将获得的液相色谱(LC)信号与在1％、5％和10％穿透时的模拟结果进行比较。穿透可以以百分比值给出，其中X％的穿透是指经由出口离开色谱装置的流动相的总体积，在出口处X％的化合物与流动相一起离开装置。
Figure BDA0003366501080000249
对于所有比较的穿透点，实现了高预测准确性(>90％)。结果示于图11中。
实施例6：将数据集拟合成Langmuir等温线(步骤(iia))
考虑到不同的NaCl浓度，将IVIG在水凝胶接枝的色谱膜上获得的平衡吸附数据的数据集拟合成Langmuir等温线。结果示于图12(a)至图12(c)中。
从图12(a)可以看出，Langmuir拟合以高准确性近似等温线吸附数据。

Claims (14)

1.在色谱方法中测定至少一种化合物的浓度的方法，所述方法包括以下步骤：
(ia)选择所述至少一种化合物；
(ib)选择固定相；
(ic)选择流动相；
(id)选择具有包括所述固定相和所述流动相的色谱床的色谱装置；
(iia)获得所述至少一种化合物在所述固定相上的吸附等温线；
(iib)获得所述至少一种化合物在所述流动相中的最大扩散时间tdiff；
(iii)选择所述至少一种化合物在所述色谱床中的最小停留时间tres，使得满足方程式I
方程式I：tres>tdiff
(iv)基于所述吸附等温线计算在所述色谱装置的预定位置z处和在预定时间t时所述至少一种化合物在所述流动相中的浓度c(z,t)。
2.根据权利要求1所述的方法，
其中在不考虑所述至少一种化合物在所述流动相中的扩散的情况下进行步骤(iv)。
3.根据权利要求1或2所述的方法，
其中选择所述化合物在所述色谱床中的最小停留时间tres，使得满足方程式I-1
方程式I-1：tres>2·tdiff。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，
其中在步骤(iv)中，基于以下方程式计算c(z,t)
Figure FDA0003366501070000011
其中Z是包括以下项的和
Figure FDA0003366501070000021
以及
Figure FDA0003366501070000022
其中
q(z,t)表示所述至少一种化合物通过所述固定相的结合容量，
εb是所述色谱床的体相孔隙率，以及
v是所述流动相在所述色谱床中的速度。
5.根据权利要求4所述的方法，
其中，所述和Z还包括项
Figure FDA0003366501070000023
其中Dax是所述至少一种化合物在所述色谱床中的轴向分散系数。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，
其中获得所述吸附等温线的步骤(iia)包括一个或多个实验室实验。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，
其中所述停留时间tres为2.5秒至20.0秒。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，
其中所述固定相是色谱膜或整料。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，
其中所述至少一种化合物包括蛋白质和/或药物。
10.获得至少一种色谱方法参数的方法，所述至少一种色谱方法参数选自固定相、流动相和色谱装置，所述方法包括以下步骤：
(I)将根据前述权利要求中任一项所述的方法执行n次，其中n是2或更大的整数，其中所述n次执行关于步骤(ib)至步骤(id)中的至少一个彼此不同；以及
(II)基于步骤(I)的结果选择至少一个固定相、至少一个流动相和/或至少一个色谱装置。
11.根据权利要求10所述的方法，
其中进行步骤(I)，使得在所述n次执行的每一次中，在步骤(ia)中选择至少两种不同的化合物，并且在所述n次执行的每一次中，所述至少两种不同的化合物是相同的。
12.色谱方法，包括
在根据权利要求1至9中任一项所述的色谱方法中测定至少一种化合物的浓度的方法，以及
(v)进行色谱法的步骤。
13.根据权利要求12所述的色谱方法，
其中步骤(iv)包括计算在若干时间点t时在所述色谱装置的出口处所述化合物在所述流动相中的浓度cout(t)，并且步骤(v)包括收集其中cout(t)>0.0mmol/L的时间t时的所述流动相。
14.色谱方法，包括
根据权利要求10或11所述的获得至少一种色谱方法参数的方法，以及
(III)基于在步骤(II)中选择的所述至少一种色谱参数进行色谱法的步骤。
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