JP2022547203A - 予測される溶出緩衝液の塩濃度を使用するカチオンクロマトグラフィー - Google Patents
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-
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-
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Abstract
本発明は、第１および第２の標的タンパク質（Ｐ１、Ｐ２）を含む標的溶出体積（２３８）を生成するクロマトグラフィー方法に関する。本方法は、カチオン交換クロマトグラフィーカラム（２３０）を提供すること（１０２）；第１の標的タンパク質（Ｐ１）と、第２の標的タンパク質と、任意に１種以上のさらなるタンパク質（Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６）とを含むタンパク質溶液（２０２）をカラムに適用すること（１０４）；最適化基準を入力すること（１０６）；最適化基準に最もよく合致する標的溶出体積を提供するように適合された溶出緩衝液の塩濃度（２２２）を計算するためのクロマトグラフィーシミュレーションを計算すること（１０８）；少なくとも計算された塩濃度および入力された最適化基準の関数として標的溶出体積のプーリング境界を計算すること（１１０）；計算された塩濃度を有する溶出緩衝液（２２６）をクロマトグラフィーカラムに適用すること（１１２）；溶出を実施すること（１１４）；および計算された標的溶出体積を収集すること（１１６）、を含む。【選択図】図２
Description
発明の分野
本発明は、クロマトグラフィーの分野に関し、より詳細には、特定のタンパク質を得るためのカチオンクロマトグラフィーの分野に関する。
本発明は、クロマトグラフィーの分野に関し、より詳細には、特定のタンパク質を得るためのカチオンクロマトグラフィーの分野に関する。
背景と関連技術
カチオン交換クロマトグラフィーは、その正味の表面電荷に基づいて分子を分離するための一般的に使用されるイオン交換クロマトグラフィーの一形態である。正味の正の表面電荷を有する分子（例えば、タンパク質またはペプチド）に対して親和性を有する負に帯電したイオン交換樹脂は、調製目的および分析目的の両方に使用される。
カチオン交換クロマトグラフィーは、その正味の表面電荷に基づいて分子を分離するための一般的に使用されるイオン交換クロマトグラフィーの一形態である。正味の正の表面電荷を有する分子（例えば、タンパク質またはペプチド）に対して親和性を有する負に帯電したイオン交換樹脂は、調製目的および分析目的の両方に使用される。
タンパク質の正味の表面電荷は、タンパク質の等電点（「ｐＩ」）によって決定される様式でｐＨと共に変化する。異なるｐＩ値を有するタンパク質は、所与のｐＨで異なる程度の電荷を有し、それによりクロマトグラフィーカラム内のイオン交換媒体の粒子上の負に帯電した表面基に対して異なる親和性を有する。したがって、異なるｐＩ値を有するタンパク質は、異なる強度でクロマトグラフィー樹脂に結合し、それらの分離を容易にする。
しかしながら、分離する必要があるすべてのタンパク質およびペプチドが、クロマトグラフィーカラムでの明確な分離を可能にするために十分な異なるｐＩ値を有するわけではない。さらに、分離はさらに、カラムと相互作用するアミノ酸側の残基の数に依存し得る：立体的要因のために、タンパク質のすべての荷電基が結合に関与できるわけではない。特に、クロマトグラフィーカラムにおいて、タンパク質グリコフォームおよび他の種類の翻訳後修飾（ＰＴＭ）を含むタンパク質の分解能は課題である。
グリコシル化は、タンパク質の最も一般的な翻訳後修飾（ＰＴＭ）の１つである。グリコシル化は、タンパク質のアミノ酸骨格、特にセリン／トレオニン（Ｏ－グリコシル化）またはアスパラギン（Ｎ－グリコシル化）アミノ酸残基へのオリゴ糖（グリカン）の共有結合を伴う。グリカン残基は、タンパク質の安定性、溶解度、抗原性、折畳みおよび血清半減期に影響を及ぼし得るので、タンパク質の生物学的機能に大きな影響を持つ。タンパク質のグリコシル化および多くの他の形態のＰＴＭ（例えば、リン酸化、メチル化、スクシンイミド化、酸化、Ｎ末端メチオニン喪失など）は、様々な酵素および基質を含む複雑なプロセスで創出され、宿主生物、産生細胞株、および培養条件に依存する。
グリコシル化および他の種類のＰＴＭは、治療用タンパク質の重要な品質属性である。コンフォメーション変化によるＰＴＭは、タンパク質およびペプチドの治療的価値（効力）、例えばＭＡｂの補体依存性細胞傷害（ＣＤＣＣ）および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を調節し得る。
したがって、グリコシル化および／または他の形態のＰＴＭを受けたタンパク質バリアントを分離するために使用される現在のクロマトグラフィー技術の問題は、特定のＰＴＭを有するタンパク質を選択的に溶出することになる場合、またはＰＴＭの種類、数および／または位置に関してのみ互いに異なる２種以上のタンパク質バリアントを所望の比で含む溶出を得ることになる場合、深刻な問題である。
概要
本発明の目的は、独立請求項に記載のイオン交換クロマトグラフィーおよび対応するクロマトグラフィー制御システムを使用して、２種以上の標的タンパク質を含む標的溶出体積を得るための方法を提供することである。本発明の実施形態は、従属請求項に記載されている。本発明の実施形態は、それらが互いに排他的でない場合、互いに自由に組み合され得る。
本発明の目的は、独立請求項に記載のイオン交換クロマトグラフィーおよび対応するクロマトグラフィー制御システムを使用して、２種以上の標的タンパク質を含む標的溶出体積を得るための方法を提供することである。本発明の実施形態は、従属請求項に記載されている。本発明の実施形態は、それらが互いに排他的でない場合、互いに自由に組み合され得る。
一態様では、本発明は、第１および第２の標的タンパク質を含む標的溶出体積を生成するクロマトグラフィー方法に関する。方法は、
－ カチオン交換クロマトグラフィーカラムを提供することと、
－ タンパク質溶液をカラムに適用すること（タンパク質溶液は、少なくとも第１の標的タンパク質、第２の標的タンパク質、および任意に１種以上のさらなるタンパク質を含む）と、
－ クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアに最適化基準を入力すること（最適化基準は、標的溶出体積に含まれる第１および第２の標的タンパク質に関する標的溶出体積の所望の特性である、例えば、最適化基準は、溶出体積に含まれる２種以上の標的タンパク質の定量的特性および／または定性的特性であり得る。定量的特性は、例えば、溶出体積中の標的タンパク質の絶対量（例えば濃度）または２種以上の標的タンパク質の相対量（例えば、比率）であり得る、加えてまたは代替的に、基準は、１つ以上の定性的特性、例えば標的タンパク質の一方または両方の純度であり得るか、またはそれを含み得る、最適化基準は、２種の標的タンパク質の１つ以上の定性的特性および１つ以上の定量的特性の関数として計算された導関数スコア値であり得る）とを含む。
－ カチオン交換クロマトグラフィーカラムを提供することと、
－ タンパク質溶液をカラムに適用すること（タンパク質溶液は、少なくとも第１の標的タンパク質、第２の標的タンパク質、および任意に１種以上のさらなるタンパク質を含む）と、
－ クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアに最適化基準を入力すること（最適化基準は、標的溶出体積に含まれる第１および第２の標的タンパク質に関する標的溶出体積の所望の特性である、例えば、最適化基準は、溶出体積に含まれる２種以上の標的タンパク質の定量的特性および／または定性的特性であり得る。定量的特性は、例えば、溶出体積中の標的タンパク質の絶対量（例えば濃度）または２種以上の標的タンパク質の相対量（例えば、比率）であり得る、加えてまたは代替的に、基準は、１つ以上の定性的特性、例えば標的タンパク質の一方または両方の純度であり得るか、またはそれを含み得る、最適化基準は、２種の標的タンパク質の１つ以上の定性的特性および１つ以上の定量的特性の関数として計算された導関数スコア値であり得る）とを含む。
クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアは、最適化基準に最もよく合致する標的溶出体積を得ることができるように、クロマトグラフィーカラムから第１および第２の標的タンパク質を溶出するように適合された溶出緩衝液の塩濃度を計算するように構成される。計算は、複数の異なる溶出緩衝液の塩濃度の関数として、複数のクロマトグラフィーシミュレーションを計算することを含む。
クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアは、少なくとも計算された塩濃度および入力された最適化基準の関数として、標的溶出体積のプーリング境界を計算するようにさらに構成される。
本方法は、
－ 計算された塩濃度を有する溶出緩衝液をクロマトグラフィーカラムに適用することと、
－ 適用された溶出緩衝液で溶出を実施することと、
－ 計算されたプーリング境界を使用して、計算された標的溶出体積を別個の画分として収集することとを、さらに含む。
－ 計算された塩濃度を有する溶出緩衝液をクロマトグラフィーカラムに適用することと、
－ 適用された溶出緩衝液で溶出を実施することと、
－ 計算されたプーリング境界を使用して、計算された標的溶出体積を別個の画分として収集することとを、さらに含む。
２種以上の目的のタンパク質が高度に類似したｐＩ値を有し得、いくつかの溶出条件下で重なり合う溶出プロファイルを有し得るとしても、本発明の実施形態は、これらタンパク質を所定の量、比率および／または純度で含む標的溶出体積を得ることを可能にするので、これらの特徴は有利であり得る。
いかなる理論にも拘束される意図はないが、本出願人は、溶出緩衝液の塩濃度が１つですべてに適合する溶出塩濃度ではないため、この結果が達成されると想定する。むしろ、塩濃度は、所望の最適化基準、特に２種以上の目的の標的タンパク質の絶対量または相対量および／または純度について具体的に計算的に予測される濃度である。これにより、溶出液中の特定の標的タンパク質の量を除去または減少させるための追加のプロセス工程を回避すること、および／または２種以上の別々に溶出された標的タンパク質を所望の比で再び組み合わせるために特定の目的の標的タンパク質を濃縮する追加のプロセス工程を回避することが可能になり得る。
出願人は、いくつかの医薬適用シナリオでは、所定の比および／または純度で提供される２種以上の標的タンパク質の混合物からなる薬物を形成することが望ましいことを観察した。例えば、薬物は、Ｐ１およびＰ２と呼ばれる特定のタンパク質Ｐの２種のＰＴＭバリアントの混合物からなり得、そのため、バリアントＰ１およびＰ２が特定の量比で提供される場合、薬物は最も効果的である。本発明の実施形態は、１回のクロマトグラフィー実行で２種以上の目的のタンパク質が所望の比、量および／または純度で容易に溶出されるように、細胞の全タンパク質から特定の目的のタンパク質を抽出および／または濃縮するためにいずれにしても実施され得るクロマトグラフィー工程を実施することを可能にし得る。
クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアは、最適化基準に対して最適な塩濃度を同定するために、様々な（仮定／候補）溶出緩衝液の塩濃度についてカラムに適用されるタンパク質の複数のクロマトグラフィー実行をシミュレートすることによって、この望ましい結果を達成することができる。次いで、この計算的に同定された塩濃度を使用して、実際のクロマトグラフィープロセスに使用される溶出緩衝液を創出または選択し、その結果、創出または選択された溶出緩衝液の塩濃度は計算された塩濃度と同一になる。
本発明の実施形態によって得られる溶出緩衝液は、「標準の」／「１つですべてに適合する」溶出緩衝液ではなく、むしろ場合によって柔軟に定義され得る最適化基準に具体的に適合した溶出緩衝液である。
実施形態によれば、最適化基準は、
ａ）標的溶出体積中の第１および第２の標的タンパク質の量の、所望の比または比の範囲（特に、比率は５：９５～１：１、特に１：９５～１：１の範囲内の任意の比であり得る）；
ｂ）標的溶出体積中の第２の標的タンパク質の所望の量または量の範囲と組み合わせた、第１の標的タンパク質の所望の量または量の範囲（例えば、量は絶対量または濃度であり得る）；
ｃ）
■ 標的溶出体積中の第１および第２のタンパク質の量の所望の比；
■ 標的溶出体積中の第２の標的タンパク質の所望の量または量の範囲；
■ 標的溶出体積中の第２の標的タンパク質の所望の純度または純度の範囲；
と組み合わせた、第１の標的タンパク質の所望の純度または純度の範囲；
ｄ）上記基準のうちの２つ以上の組合せ。例えば、複合スコア計算アルゴリズムを使用して、所望の標的タンパク質比に関してマッチＭ１を有し、２種以上の標的タンパク質の所望の純度に関してマッチＭ２を有する溶出緩衝液のスコア値を計算することができ、Ｍ１は総スコアに対して約７０％の影響を有し、Ｍ２は総スコアに対して約３０％の影響を有する。別の例によれば、最適化基準は、１種以上の標的タンパク質の必要な最小絶対量、所望の比の範囲（例えば、１：２．０～１：２．５）、および１種以上の標的タンパク質の最小純度スコアの組合せ
を含む群から選択される。
ａ）標的溶出体積中の第１および第２の標的タンパク質の量の、所望の比または比の範囲（特に、比率は５：９５～１：１、特に１：９５～１：１の範囲内の任意の比であり得る）；
ｂ）標的溶出体積中の第２の標的タンパク質の所望の量または量の範囲と組み合わせた、第１の標的タンパク質の所望の量または量の範囲（例えば、量は絶対量または濃度であり得る）；
ｃ）
■ 標的溶出体積中の第１および第２のタンパク質の量の所望の比；
■ 標的溶出体積中の第２の標的タンパク質の所望の量または量の範囲；
■ 標的溶出体積中の第２の標的タンパク質の所望の純度または純度の範囲；
と組み合わせた、第１の標的タンパク質の所望の純度または純度の範囲；
ｄ）上記基準のうちの２つ以上の組合せ。例えば、複合スコア計算アルゴリズムを使用して、所望の標的タンパク質比に関してマッチＭ１を有し、２種以上の標的タンパク質の所望の純度に関してマッチＭ２を有する溶出緩衝液のスコア値を計算することができ、Ｍ１は総スコアに対して約７０％の影響を有し、Ｍ２は総スコアに対して約３０％の影響を有する。別の例によれば、最適化基準は、１種以上の標的タンパク質の必要な最小絶対量、所望の比の範囲（例えば、１：２．０～１：２．５）、および１種以上の標的タンパク質の最小純度スコアの組合せ
を含む群から選択される。
これにより、ユーザは、それぞれの使用事例シナリオに対して塩濃度が最適化された溶出緩衝液を同定して使用することができる。例えば、研究環境では、タンパク質純度の態様は、臨床使用事例シナリオよりも重要ではない場合がある。好ましい実施形態によれば、シミュレーションソフトウェアは、例えば個々のクロマトグラフィー実行に対して、ユーザが最適化基準を入力および／または修正することを可能にするＧＵＩを生成するように構成される。これにより、クロマトグラフィープロセスを様々な使用事例シナリオ、様々な標的タンパク質および標的タンパク質の組合せ、ならびに他の多くの要因に柔軟に適合させることができる。
実施形態によれば、適用されるタンパク質溶液は、１種以上のさらなるタンパク質を含む。さらなるタンパク質は、標的タンパク質と重なり合う溶出プロファイルを有し得、溶出液を汚染し得る。標的タンパク質の純度、特にシミュレーションおよび／またはプーリング境界の計算における標的タンパク質の量および／または化学的特性を考慮することによって、標的タンパク質の許容可能なレベルの純度が達成されるように、標的タンパク質および汚染しているさらなるタンパク質を溶出することを可能にする溶出緩衝液の塩濃度を同定および使用することが可能である。
実施形態によれば、複数の異なる溶出緩衝液の塩濃度は、例えば、異なる塩濃度を有するが、その以外の点（例えば、ｐＨ値に関して）では同一である塩緩衝液の仕様を創出するための所定のプログラムルーチンに基づいて、自動的に創出される。これらの自動的に創出された緩衝液の塩濃度は、「仮定の」または「候補」溶出緩衝液の塩濃度と呼ばれることもある。例えば、計算された塩濃度は、最適化基準を最もよく満たすように計算的に同定された複数の候補溶出塩濃度のうちの１つである。例えば、溶出緩衝液の塩濃度の計算は、複数の異なる候補溶出塩濃度の関数として、標的溶出体積中の１種以上の標的タンパク質の量および／または純度を予測することと、溶出緩衝液の塩濃度として、所望の量および／または純度で１種以上の標的タンパク質を含む標的溶出体積を収集するのに最も適している候補溶出緩衝液の塩濃度の１つを同定することとを含み得る。この同定された塩濃度は、「計算された」溶出緩衝液の塩濃度として使用され、その塩濃度が計算され同定された溶出緩衝液の塩濃度と同一である溶出緩衝液を選択または創出するために使用される。この選択または創出された溶出緩衝液は、適用される溶出緩衝液で実際に溶出を実施するために使用される。
クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアに入力される所望の最適化基準は、実施形態に応じて、絶対量（例えば、各標的タンパク質の濃度）または相対量（例えば、２種以上の標的タンパク質の濃度比または質量比）として指定することができる。
実施形態によれば、方法は分析目的に使用される。好ましい実施形態によれば、方法は調製目的で使用される。
好ましい実施形態によれば、第１の標的タンパク質を溶出するように適合された計算された塩濃度は、適用されるタンパク質溶液に含まれるさらなるタンパク質のいずれか１種から第１の標的タンパク質および／または第２の標的タンパク質を分離するのに最も適した複数の候補塩濃度のうちの１つである。
本出願人が、既知のまたは容易に得ることができる入力データ値のセットに基づいてクロマトグラフィープロセスを十分によくシミュレートし、２種以上の目的のタンパク質（「標的タンパク質」）を溶出するのに適した溶出緩衝液中の塩の濃度を予測することを可能にし、これらの標的タンパク質が標的溶出体積中に所望の量、比および／または純度で含まれるようにすることが可能であることを観察したので、これらの特徴は有利であり得る。好ましくは、計算された塩濃度は、タンパク質溶液に含まれるさらなるタンパク質から第１の標的タンパク質を分離するのに最もよく、またはほぼ最も適している。
適用されるタンパク質溶液を、その塩濃度が予測された適切または最適な塩濃度に対応する溶出緩衝液で溶出することによって、高度に類似した極性を含む高度に類似した化学的特性を有するタンパク質およびタンパク質バリアントを分離することができる高分解能タンパク質クロマトグラフィーを実施することが可能である。さらに、計算された溶出緩衝液の塩濃度自体を、さらなる予測を実施するための、特に所望の量で１種以上の標的タンパク質を含むであろう溶出体積のプーリング境界を非常に正確に予測するための入力として使用することができる。適切または最適な塩濃度であると予測される溶出緩衝液の塩濃度を、２種以上の標的タンパク質を所望の絶対量もしくは相対量および／または所望の純度で提供すると予測される複数の候補溶出塩濃度のうちの１つとして計算することができる。したがって、計算的に同定される「最適な」溶出緩衝液の塩濃度の関数としてのプーリング境界の予測に基づいて、１種以上の標的タンパク質を所望の量、比および／または純度で含む総溶出体積の画分を具体的に収集することが可能である。
これは、１種以上の標的タンパク質を１種以上の高度に類似した他のタンパク質、例えば他のグリコフォームから分離する必要がある場合、または所望の比（相対量）を有する２種以上の高度に類似した標的タンパク質の混合物を得る場合に特に有用であり得る。
本発明の実施形態による方法は、以前はカチオンクロマトグラフィーによって分離することができなかった高度に類似したタンパク質バリアントを、ここでは１回のクロマトグラフィー実行で分離することができるという利点を有し得る：第１の工程において、適切な溶出緩衝液の塩濃度が予測され、次いで、予測された塩濃度を有する溶出緩衝液を使用して溶出が実施される。これは、あるタンパク質を他の化学的に高度に類似したタンパク質から分離する必要があるか、または高度に類似した化学的特性を有する２種以上のタンパク質を特定の相対量で得る必要がある任意の状況において非常に有利であり得る。例えば、組換え医薬タンパク質のグリコシル化パターンは、それらのタンパク質の品質および有効性に強い影響を及ぼすことが多い。多くの場合、特定の標的タンパク質、例えば特定のグリコシル化パターンを有する抗体または抗体断片を産生するために使用される細胞株は、この特定のグリコフォームを産生するだけでなく、グリコシル化を欠くものを含む１種以上の他のグリコフォームも産生する。適切な溶出緩衝液の塩濃度を最初に予測し、予測された塩濃度を有する溶出緩衝液で溶出を実施し、次いでプーリング境界を予測して収集することによって、本発明の実施形態は、１種以上の目的のグリコフォームを指定し、これらのグリコフォームを既に適切な濃度で得ることができ得る。
この標的溶出体積が２種以上の標的タンパク質を所望の量、比および／または純度で含むように標的溶出体積のプーリング境界を予測することは、標的タンパク質（複数可）の濃度を増加または減少させるための追加の工程を回避することができるので有益であり得る。これは、１種以上の標的タンパク質を所望の濃度で得るプロセスを加速させ、また、すべての追加の処理工程が回避され得るので、標的タンパク質の品質を高め、標的溶出体積に含まれる標的タンパク質（複数可）を汚染するか、そうでなければ損傷するリスクを低減させる。
本発明の実施形態は、抗体または抗体断片などの治療用または診断用タンパク質またはタンパク質断片を分離するのに特に適している。本発明の実施形態は、所望の量で１種以上の標的タンパク質を選択的に得るための本発明の実施形態によるクロマトグラフィー方法を使用することによって、バイオ医薬品の品質、純度、安全性および有効性を保証するために使用され得る。
実施形態によれば、カラムに適用されるタンパク質溶液は、１種以上の塩および１種以上のタンパク質を含む水系溶液である。
実施形態によれば、複数のクロマトグラフィーシミュレーションは、複数の異なる溶出緩衝液の塩濃度の関数として、および複数の異なる溶出緩衝液のｐＨ値の関数として計算される。塩濃度の計算は、最適化基準に最もよく合致する標的溶出体積を得ることができるように、クロマトグラフィーカラムから第１および第２の標的タンパク質を溶出するように組み合わせて適合された溶出緩衝液の塩濃度と溶出緩衝液のｐＨ値との組合せを計算することを含む。クロマトグラフィーシミュレーションは、溶出緩衝液の塩濃度と溶出緩衝液のｐＨ値との組合せを同定するために実施される。標的溶出体積のプーリング境界は、少なくとも溶出緩衝液の塩濃度と溶出緩衝液のｐＨ値との計算された組合せおよび入力された最適化基準の関数として計算される。カラムに適用される溶出緩衝液は、計算された塩濃度および計算されたｐＨ値を有する。
出願人は、塩濃度に加えて、ｐＨ値も様々なタンパク質の溶出プロファイルに有意な影響を及ぼすことを観察した。塩濃度のように、ｐＨ値は特定の所望の値に容易に設定され得る。シミュレーションを実施するために使用される１つ以上のモデルは、典型的には、緩衝液の塩濃度およびｐＨ値の両方を考慮に入れ、異なる塩濃度および異なるｐＨ値の組合せに基づく複数のクロマトグラフィー実行および／またはクロマトグラフィー溶出工程の計算は、モデルを適合させるか、または複雑な追加のプログラムルーチンを実装する必要なく実施することができる。さらに、塩濃度とｐＨ値との間の複雑な相互関係、および溶出プロファイルに対するそれらの複合的な影響をシミュレーションプロセスにおいて考慮することができる。さらに、塩濃度とｐＨ値の両方の変動に基づくシミュレーションは、膨大なデータ空間をカバーし得、したがって、最適化基準に従うことができる溶液緩衝液を同定する可能性が高くなる。例えば、シミュレーションが１０個の異なる塩濃度について実施され、各塩濃度が１０個の異なるｐＨ値に基づいてシミュレーションされる場合、シミュレーションは、１０×１０＝１００個の異なるシミュレーションおよび対応する理論的／候補溶出緩衝液の仕様を含む。
実施形態によれば、方法は、選択または調製された溶出緩衝液が最適化基準を最もよく満たすようにシミュレーションにおいて同定された塩濃度およびｐＨ値を有するように、溶出緩衝液を自動的にまたは手動で選択または調製することを含む。選択または調製された溶出緩衝液は、タンパク質を溶出するためにカラムに適用される緩衝液として使用される。
単一の標的タンパク質の事例シナリオ
本明細書に記載のさらなる使用事例シナリオによれば、標的溶出体積は、ただ１種の（第１の）標的タンパク質、および、任意に、１種以上のさらなる（夾雑）タンパク質を含む。最適化基準は、所望の標的タンパク質の所望の絶対量および／または標的タンパク質の所望の純度である。特に、第１の標的タンパク質の所望の量は、溶出緩衝液の収集される体積中の第１のタンパク質の所望の濃度またはその微分値の形態で指定することができる。
本明細書に記載のさらなる使用事例シナリオによれば、標的溶出体積は、ただ１種の（第１の）標的タンパク質、および、任意に、１種以上のさらなる（夾雑）タンパク質を含む。最適化基準は、所望の標的タンパク質の所望の絶対量および／または標的タンパク質の所望の純度である。特に、第１の標的タンパク質の所望の量は、溶出緩衝液の収集される体積中の第１のタンパク質の所望の濃度またはその微分値の形態で指定することができる。
例えば、所望の濃度が提供される場合、標的溶出体積は、所望の濃度で標的タンパク質を含む溶出体積として計算することができ、そのため、標的溶出体積中の溶出された標的タンパク質の平均濃度が所望の濃度と同一になるようにプーリング境界が選択される。標的溶出体積の収集中、カラムを出る溶出緩衝液中の第１の標的タンパク質濃度は、所望の濃度よりも高いまたは低いことがあり得る。
所望の絶対量が提供される場合、標的溶出体積を、所望の量で第１の標的タンパク質を含む最小溶出体積として計算することができる。
単一の標的タンパク質の標的溶出体積のプーリング境界を計算するために本発明の実施形態を使用することは、収集された標的溶出体積が所望の濃度および／または絶対量で（単一の）標的タンパク質を既に含むように標的タンパク質を収集することを可能にするので有利であり得、標的タンパク質を濃縮または希釈するための追加の工程を回避することができる。さらに、本出願人は、本発明の実施形態によるクロマトグラフィー方法が、標的溶出体積のプーリング境界を非常に正確に予測することを可能にし、それによって標的タンパク質を純粋で予測可能な様式で提供し、カラムを出る溶出緩衝液の収集を開始するのが遅すぎるか、または収集を終了するのが早すぎることによって標的タンパク質の有意な部分を失うリスクを最小限に抑えることを観察した。
複数の標的タンパク質の場合、一般的な態様
実施形態によれば、適用されるタンパク質溶液は、第１の標的タンパク質と、第２の標的タンパク質と、０、１種またはそれ以上のさらなるタンパク質とを含む。最適化基準は、第１および第２の標的タンパク質の相対量の形態、例えば第１の標的タンパク質と第２の標的タンパク質との比の形態で、クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアに入力される。クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアは、少なくとも計算された塩濃度および入力された所望の比の関数として、標的溶出体積のプーリング境界を計算する。方法は、第１と第２の標的タンパク質との所望の比を含む標的溶出体積を生成するために使用される。
実施形態によれば、適用されるタンパク質溶液は、第１の標的タンパク質と、第２の標的タンパク質と、０、１種またはそれ以上のさらなるタンパク質とを含む。最適化基準は、第１および第２の標的タンパク質の相対量の形態、例えば第１の標的タンパク質と第２の標的タンパク質との比の形態で、クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアに入力される。クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアは、少なくとも計算された塩濃度および入力された所望の比の関数として、標的溶出体積のプーリング境界を計算する。方法は、第１と第２の標的タンパク質との所望の比を含む標的溶出体積を生成するために使用される。
これは、高度に類似した化学的特性を有する２種のタンパク質、例えば２種のグリコフォームが他のすべてのタンパク質から分離され、特定の比率で得られるべきである使用事例シナリオにおいて特に有利であり得る。例えば、抗体または抗体断片などの生物医学的に活性な化合物のいくつかのグリコフォームは、２種以上の異なるグリコフォームが特定の比率で適用される場合に特に有効であることが観察されている。先行技術の手法では、２種以上の標的タンパク質が高度に類似した化学的特性を有する場合、これらの標的タンパク質の規定された相対量を有する純粋なタンパク質溶液を得ることは、多くの場合非常に時間がかかり、時には実行不可能であった。これは、従来のクロマトグラフィー手法では、これらのタンパク質を互いに分離することができなかったためである。むしろ、両方のタンパク質は、溶出が進行するにつれて変化し、所望の値に設定することができない比率で溶出緩衝液中に得られた。本発明の実施形態は、第１の標的タンパク質の溶出挙動の計算および予測を実施し、第２の標的タンパク質（カラムに適用されるさらなるタンパク質のいずれか１種、存在する場合には、少なくとも１種以上の標的タンパク質の純度が考慮されるべきである場合）の溶出挙動の計算および予測を実施し、所望の比、量および／または純度で第１および第２の標的タンパク質を含む標的溶出体積のプーリング境界を自動的に計算および予測するように構成されているクロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアを利用する。例えば、カラムを出る溶出緩衝液中の、適用されたタンパク質溶液に含まれる第１および第２の標的タンパク質ならびに、任意に、存在する場合には、またさらなるタンパク質のそれぞれの濃度を、第１および第２の標的タンパク質の両方について将来の一連の時点（例えば、毎秒または毎分）について予測することができる。得られた予測濃度値を内挿および／または外挿することができ、様々な候補プーリング境界に対する２種以上の標的タンパク質の絶対量および／または相対量および／または純度を得ることができる。次いで、所望の量および／または純度で第１および第２の標的タンパク質を含む標的溶出体積を規定するプーリング境界を出力し、プーリング境界に従って標的溶出体積の収集を開始および終了するために使用することができる。
実施形態によれば、第１および第２の標的タンパク質は、低分解能係数、特に０．７５未満、いくつかの例では０．６未満またはさらには０．５未満の分解能係数を有するタンパク質である。
本明細書で使用される分解能係数は、クロマトグラフィーカラムの溶出液中の２種類の分子のピーク分離の程度を示す０．８、１．０、または３．０などの数値である。一般に、分解能は２つのシグナルを分離する能力である。クロマトグラフィーに関して、これは、２つの異なる種類の分子の２つのピークを分離する能力である。分解能Ｒは次式で与えられる：
式中、ｔｒ１およびｔｒ２ならびにｗ１およびｗ２は、それぞれ、２つの直接隣接するピークの時間ｔおよび幅ｗである。ピークが十分に近い場合、これは妥当な問題であり、幅ｗは両方のピークに対してほぼ同じである。両方の種類の分子のガウス分布を仮定すると、分解能係数１は、第１のピークの面積の２．５％が第２のピークの面積と重なり合うことを示す。同様に、分解能１．５は、１．５×４×σの保持時間の差を示し、σはガウス分布の標準偏差であり、０．１５％の重なり合いに相当する。一般に、分解能係数が高いほど、２種の分子を良好に分離することができる。本発明の実施形態は、非常に低い分解能係数、例えば０．５未満の分解能係数を有するタンパク質さえも分離することができることが観察されている。
本明細書で使用される分解能係数は、クロマトグラフィーカラムの溶出液中の２種類の分子のピーク分離の程度を示す０．８、１．０、または３．０などの数値である。一般に、分解能は２つのシグナルを分離する能力である。クロマトグラフィーに関して、これは、２つの異なる種類の分子の２つのピークを分離する能力である。分解能Ｒは次式で与えられる：
本発明の実施形態は、タンパク質が非常に低い分解能係数を有する場合でさえ、それらを分離することができることが観察されている。カラムに負荷される個々のタンパク質の化学的性質および量も考慮することにより、適用されるタンパク質の種類および量に特異的に最適な溶出緩衝液の塩濃度を計算的に予測することによって、および予測された最適塩濃度を有する溶出緩衝液で溶出を実施することによって、本発明の実施形態は、高度に類似したタンパク質さえも互いに分離することができ、および／または１種以上の標的タンパク質を正確に所望の量および／または純度で含む標的溶出体積を正確に予測することができることが観察された。
実施形態によれば、第１および第２の標的タンパク質は、同一のアミノ酸配列を有するが、異なる種類、数または位置のＰＴＭを有するタンパク質のバリアントである。特に、第１および第２の標的タンパク質はグリコフォームである。
実施形態によれば、第１および第２の標的タンパク質は、同一のアミノ酸配列を有し、ＦＡＢ断片上に異なる数のグリコシル基を含む抗体モノマーである。
いくつかの実施形態によれば、溶出プロセスは、複数の異なる溶出緩衝液（「段階」）が順次適用される段階的溶出プロセスである。この場合（最も適切な）溶出塩濃度の計算的同定、計算された溶出塩濃度の関数としての標的溶出体積のプーリング境界の計算、および計算された塩濃度を有する溶出緩衝液の適用が、各段階に対して実施される。
例えば、複数のクロマトグラフィーシミュレーションの各々は、２つ以上の溶出ステップを使用するクロマトグラフィープロセスのシミュレーションとすることができ、各溶出ステップでは、異なる溶出塩濃度を有する溶出緩衝液が使用される。計算される溶出緩衝液の塩濃度は、異なる溶出ステップに特異的な一連の溶出緩衝液の塩濃度である。計算された塩濃度を有する溶出緩衝液をクロマトグラフィーカラムに適用することは、溶出ステップに特異的な一連の計算された塩濃度に従って、異なる塩濃度を有する一連の溶出緩衝液を段階的に適用することを含む。
実施形態によれば、適用されるタンパク質溶液は、２種以上の標的タンパク質の各々、および存在する場合には、１種以上のさらなるタンパク質の各々を、少なくとも０．５重量％、特に少なくとも１重量％、特に少なくとも２重量％のそれぞれの濃度で含む。
出願人は、特に上記の範囲内にある場合、タンパク質濃度がタンパク質の溶出挙動に影響を及ぼすことを観察した。カラムに適用されるタンパク質溶液に含まれる各タンパク質の濃度が、「最小量閾値」とも呼ばれる上記閾値を超えることを考慮することにより、適切な溶出緩衝液の塩濃度の予測の精度を高めることができる。カラムに適用されたタンパク質は、多数の様式で互いにおよび固定相と相互作用し得る。いくつかのタンパク質は、他のタンパク質がカラム樹脂に結合するのを阻止し得るか、固定相への結合に関して他のタンパク質と競合し得るか、またはそれらの結合を促進し得る。タンパク質溶液（すなわち、もしあれば、その濃度が上述の最小量閾値を超えるすべての標的タンパク質およびすべてのさらなるタンパク質）に含まれるすべてのタンパク質の化学的特性および濃度を考慮することによって、クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアの計算および予測の精度を大幅に高めることができる。
好ましくは、カラムに適用されるタンパク質溶液は、１種以上の標的タンパク質のみ、典型的には１種以上の非標的タンパク質も含む予備精製タンパク質溶液である。例えば、最初に、１種以上の目的の標的タンパク質を産生するように改変された細胞培養物などの細胞培養物から、タンパク質全体を抽出することができる。次の工程で、この細胞培養タンパク質抽出物は、少数のタンパク質のみ、好ましくは１種以上の標的タンパク質のみ、および可能な限り少ない他のタンパク質を得るために予備精製される。しかしながら、多くの場合、予備精製工程において純粋な形態で１種以上の標的タンパク質を得ることは不可能である。例えば、細胞培養タンパク質抽出物は、何千もの異なる種類のタンパク質を含み得る。予備精製工程では、タンパク質抽出物をアフィニティー・クロマトグラフィー・カラムに適用して、限られたタンパク質のセット、例えば特定のタンパク質配列を有するか、または特定のエピトープを有するすべてのタンパク質を得る。したがって、カチオン・クロマトグラフィー・カラムに適用されるタンパク質溶液は、細胞培養抽出物または他の供給源に対してアフィニティークロマトグラフィーなどの予備精製プロセスを実施することによって得られるタンパク質溶液であり得る。
例えば、アフィニティー・クロマトグラフィー・カラムを用いた予備精製手法の結果として得られるタンパク質溶液中のタンパク質は、特定のタンパク質のすべてのグリコフォーム、例えば、グリコシル基を含まないグリコフォーム、１つのグリコシル基を含む第２のグリコフォーム、異なる種類のグリコシル基を含む第２のグリコフォーム、第１のグリコフォームと同じグリコシル基を含むが異なる位置にある第３のグリコフォームなどからなることができる。任意に、タンパク質溶液は、さらに、望ましくない／目的ではないが、何らかの理由で予備精製工程中に除去を失敗したさらなるタンパク質を含み得る。
典型的には、カチオン・クロマトグラフィー・カラムに適用されるタンパク質溶液に含まれるタンパク質の種類の数は限られており、細胞培養抽出物中のタンパク質数よりもはるかに少ない。例えば、カチオン・クロマトグラフィー・カラムに適用されるタンパク質溶液に含まれるタンパク質の種類の数は、典型的には１０未満、多くの場合５未満である。
実施形態によれば、カラムに適用されるタンパク質溶液は、第１のＰ１および第２のＰ２標的タンパク質、ならびに夾雑タンパク質と考えられるさらなるタンパク質Ｐ３を含む。第２の標的タンパク質Ｐ２およびさらなるタンパク質Ｐ３のカラムの固定相に対する親和性は、第１の標的タンパク質の固定相に対する親和性と同様であり、Ｐ１、Ｐ２およびＰ３の重なり合う溶出挙動をもたらす。
例えば、タンパク質Ｐ１、Ｐ２およびＰ３は、同じタンパク質のグリコフォームまたは他のＰＴＭバリアントであり、したがって固定相に対して同様の親和性を有する。Ｐ１およびＰ２をＰ３から分離し、Ｐ１およびＰ２を所望の比で提供することは、典型的には、先行技術のカチオンクロマトグラフィー手法では実現不可能であった。本発明の実施形態は、最初に適切な溶出塩濃度を予測することを可能にし、次いで、この最適塩濃度および他のパラメータ値に基づいて、特に正確な様式で、標的タンパク質を他のタンパク質からより正確に分離することを可能にするプーリング境界を予測するか、または、それが物理的に不可能であり、かつピークが強く重なり合っている場合には、２種の標的タンパク質Ｐ１およびＰ２を（Ｐ３による汚染に関して）許容可能な程度の所望の比で含む標的溶出体積を少なくとも収集することを可能にする。
実施形態によれば、カラムに適用されるタンパク質溶液中のタンパク質の総量は、カラムの最大タンパク質負荷容量と同一またはそれよりも小さく、特に最大タンパク質負荷容量の５０％～１００％、例えば５０％～９０％の範囲内である。
出願人は、この量の範囲内で、クロマトグラフィー手順が、適用されるタンパク質溶液に含まれるタンパク質の濃度および化学的特性に対して特に敏感であることを観察した。適用されるタンパク質溶液に含まれる各タンパク質の量を考慮することにより、最適な溶出塩濃度に関する予測精度が大幅に向上することが観察された。
実施形態によれば、標的溶出体積の計算されたプーリング境界は、収集開始時間オフセットおよび収集停止時間オフセットの形態で指定される。本方法は、
－ クロマトグラフィーカラムを備える自動クロマトグラフィーシステムによって、溶出の開始から経過した時間を連続的にモニタリングすること、
－ 経過時間が収集開始時間オフセットに等しい時に、クロマトグラフィーシステムにより、溶出される溶出緩衝液の収集を自動的に開始すること、および
－ 経過時間が収集停止時間オフセットに等しい時に、クロマトグラフィーシステムにより、溶出される溶出緩衝液の収集を停止すること
を含む。
－ クロマトグラフィーカラムを備える自動クロマトグラフィーシステムによって、溶出の開始から経過した時間を連続的にモニタリングすること、
－ 経過時間が収集開始時間オフセットに等しい時に、クロマトグラフィーシステムにより、溶出される溶出緩衝液の収集を自動的に開始すること、および
－ 経過時間が収集停止時間オフセットに等しい時に、クロマトグラフィーシステムにより、溶出される溶出緩衝液の収集を停止すること
を含む。
実施形態によれば、方法は、適用されるタンパク質溶液に含まれる第１および第２の標的タンパク質のそれぞれの量、ならびに任意に、存在する場合には、適用されるタンパク質溶液に含まれる１種以上のさらなるタンパク質のそれぞれの量も、クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアに入力することを含む。
シミュレーションは、少なくとも以下を含むパラメータ値のセットの関数として計算される：
－ 提供されるカチオン交換クロマトグラフィーカラムの寸法（例えば、長さ、直径および高さまたは全体積が提供され得る。その寸法はクロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアに知られている所定のカラム種類のセットのうちの１つを選択することも可能である）、および
－ カラムに適用される第１および第２の標的タンパク質の量、ならびに任意に、１種以上のさらなるタンパク質の量。例えば、タンパク質溶液に含まれる第１および第２の標的タンパク質ならびに任意のさらなるタンパク質の量は、シミュレーションの計算の前に、適切なタンパク質分析、例えば２８０ｎｍでのＵＶ測定によって総タンパク質量を測定することができる、カラムに適用される様々なタンパク質の異なるグリコシル化パターンに起因してわずかに異なる分子量は、カチオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＣＥＸ－ＨＰＬＣ）によって決定することができる。この分子量情報は、例えば、カラムに適用される特定のタンパク質のタンパク質分子の数／モル濃度を計算するために、および／または標的溶出体積中の標的タンパク質の比が、例えば要求される量、比または純度を満たすかどうかを検証するために使用することができる。
－ 提供されるカチオン交換クロマトグラフィーカラムの寸法（例えば、長さ、直径および高さまたは全体積が提供され得る。その寸法はクロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアに知られている所定のカラム種類のセットのうちの１つを選択することも可能である）、および
－ カラムに適用される第１および第２の標的タンパク質の量、ならびに任意に、１種以上のさらなるタンパク質の量。例えば、タンパク質溶液に含まれる第１および第２の標的タンパク質ならびに任意のさらなるタンパク質の量は、シミュレーションの計算の前に、適切なタンパク質分析、例えば２８０ｎｍでのＵＶ測定によって総タンパク質量を測定することができる、カラムに適用される様々なタンパク質の異なるグリコシル化パターンに起因してわずかに異なる分子量は、カチオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＣＥＸ－ＨＰＬＣ）によって決定することができる。この分子量情報は、例えば、カラムに適用される特定のタンパク質のタンパク質分子の数／モル濃度を計算するために、および／または標的溶出体積中の標的タンパク質の比が、例えば要求される量、比または純度を満たすかどうかを検証するために使用することができる。
出願人は、カラムに適用されるタンパク質の量が場合によって大きく異なり得ることを観察した。カラムに適用される個々のタンパク質の量およびカラムの寸法を考慮することにより、所望の量および／または純度で標的タンパク質を含む標的溶出体積を特に正確に得るために最も適した溶出緩衝液の塩濃度を計算および予測することが可能になり得る。次いで、この特定の計算的に決定された塩濃度を、クロマトグラフィー手順を実施するために実際に使用される溶出緩衝液の塩濃度として使用する。さらに、計算的に決定された溶出緩衝液の塩濃度は、所望の量および／または純度で標的タンパク質を含む標的溶出体積のプーリング境界を予測するために使用される。計算的に予測されたプーリング境界は、ヒトまたは自動の溶出緩衝液収集ユニットに出力することができ、それによって所望の量および／または純度で１種以上の標的タンパク質の取得を容易にする。
したがって、本発明の実施形態により得られる溶出緩衝液は、「標準の」／「１つですべてに適合する」溶出緩衝液ではなく、むしろタンパク質溶液に含まれるタンパク質の種類および量に特に適合し、カラムの寸法に適合した溶出緩衝液である。出願人は、使用されるカラムおよびカラムに適用されるタンパク質の量に溶出塩濃度をそれぞれの場合に適合させることにより、クロマトグラフィーカラムが異なるタンパク質を分離する能力が大幅に増加し得ることを観察した。
実施形態によれば、シミュレーションは、複数の異なる塩濃度（「候補塩濃度」と呼ばれることもある）および複数の異なる溶出緩衝液のｐＨ値（「候補ｐＨ値」と呼ばれることもある）の両方の関数として実施される。シミュレーションの結果として、最適化基準を最もよく満たす特定の塩濃度とｐＨ値との組合せが同定される。この塩濃度とｐＨ値の対を、実際にタンパク質の溶出に使用される溶出緩衝液の塩濃度とｐＨ値として使用する。
実施形態によれば、パラメータのセットは以下をさらに含む：
－ 溶出緩衝液の所定のｐＨ値（例えば、ｐＨ値は、標的タンパク質または以前に類似のタンパク質を溶出するために既に首尾よく使用された溶出緩衝液のｐＨ値であり得る）、
－ カラムを通る溶出緩衝液の流量、
－ 適用されるタンパク質溶液のタンパク質の化学的特性。
－ 溶出緩衝液の所定のｐＨ値（例えば、ｐＨ値は、標的タンパク質または以前に類似のタンパク質を溶出するために既に首尾よく使用された溶出緩衝液のｐＨ値であり得る）、
－ カラムを通る溶出緩衝液の流量、
－ 適用されるタンパク質溶液のタンパク質の化学的特性。
カラムを通る溶出緩衝液の流量は、溶出緩衝液を予め設定された速度でカラムに圧送するように構成された溶出緩衝液ポンプによって設定された流量であり得る。流量は、例えばｍｌ／分で指定することができる。流量はまた、カラム直径が既知であるので、例えばｍｍ／秒で指定することができ、ｍｍ／秒の値からｍｌ／分の流量を導出することを可能にする。
いくつかの実施形態では、ポンプによって生成される流量は、ユーザによりポンプを構成することによって設定することができる。いくつかの実施形態では、ユーザは、クロマトグラフィー実行ごとに、クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアにおいて溶出緩衝液の流量（ポンプのディスプレイに表示され得る）を手動で入力する。他の実施形態では、溶出緩衝液の流量は、クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアの構成ファイルに格納されており、ユーザがクロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアの構成ファイルおよびポンプの設定で溶出緩衝液の流量を変更するまで、複数のクロマトグラフィー実行に再使用される。
カラムに適用される標的タンパク質、および任意に１種以上のさらなるタンパク質もの量だけでなく、化学的特性も考慮すると、シミュレーションおよび予測の精度をさらに高めることができる。
実施形態によれば、ユーザへ実際に出力されるプーリング境界は、理解を容易にするために異なるフォーマットに変換されてもよい。例えば、収集開始時間オフセットおよび収集停止時間オフセットは、「２８０ｎｍピーク」（溶出液中の総タンパク質濃度のピークを示す）の始まりから開始する時間オフセットとして指定することができ、このピークは予測することもでき、光学的に測定された２８０ｎｍのピークシグナルと経験的に比較することができる。同様に、収集開始時刻オフセットおよび収集停止時刻オフセットは、「カラム体積」で指定することができる。
カチオンクロマトグラフィー実行をシミュレートし、特定のタンパク質の溶出プロファイルを予測するための多くの異なる計算手法が存在し、本発明の実施形態によるシミュレーションの実施および標的溶出境界の予測のために使用することができる。
例えば、Ｗｉｔｔｋｏｐｐ Ｆ、Ｐｅｅｃｋ Ｌ、Ｈａｆｎｅｒ Ｍ、Ｆｒｅｃｈ Ｃ．「Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｌｉｎｅａｒ ｐＨ ａｎｄ ｓａｌｔ ｇｒａｄｉｅｎｔｓ ｏｎ ｗｅａｋ，ｓｔｒｏｎｇ ａｎｄ ｍｉｘｅｄ ｃａｔｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｒｅｓｉｎｓ ａｐｐｌｙｉｎｇ ａｎ ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｄｏｎｎａｎ ｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｍｏｄｅｌ」、Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ．２０１８；１５４５：３２～４７．ｄｏｉ：１０．１０１６には、線形クロマトグラフィーにおけるモノクローナル抗体のイオン交換クロマトグラフィーのモデリングおよびシミュレーション用のドナン平衡イオン交換（ＤＩＸ）モデルの適用が記載されている。この刊行物は、低タンパク質濃度でのクロマトグラフィーカラム内の条件の説明を扱っているが、タンパク質分離の最適化に関するものではない。
別の例によれば、Ｍｕｌｌｅｒ－Ｓｐａｔｈ Ｔ、ＳｔｒｏｈｌｅｉｎＧ、Ａｕｍａｎｎ Ｌら、「Ｍｏｄｅｌ ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｔｉｏｎ－ｅｘｃｈａｎｇｅ ＩｇＧ ｃａｐｔｕｒｅ ｓｔｅｐ ｉｎ ｂａｔｃｈ ａｎｄ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」、Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ．２０１１；１２１８（３１）：５１９５～５２０４、ｄｏｉ：１０．１０１６には、精製モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の空隙率、保持係数および物質移動パラメータなどのモデルパラメータを使用する集中速度モデルに基づくシングルカラムバッチおよびマルチカラム連続クロマトグラフィー（ＭＣＳＧＰ）を使用するｍＡｂ精製プロセスのカチオン交換捕捉工程のシミュレーションが記載されている。
実施形態によれば、クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアは、シミュレーションを計算するため、および／または標的溶出体積のプーリング境界を計算するために数学的モデルの組合せを使用するように構成される。モデルは、以下を含む：
－ カラムの間隙体積における溶出緩衝液中の各タンパク質の濃度、塩濃度およびｐＨ値を相互に関連付けるように構成されたカラムモデル、および
－ カラムの固定相の細孔体積における溶出緩衝液中の各タンパク質の濃度、塩濃度およびｐＨ値を相互に関連付けるように構成された細孔モデル、および
－ 固定相の各タンパク質の濃度、溶出緩衝液の塩濃度、およびタンパク質溶液中の各（標的および任意にさらなる）タンパク質の化学的特性のうちの少なくともいくつかを相互に関連付けるように構成された反応モデル。
－ カラムの間隙体積における溶出緩衝液中の各タンパク質の濃度、塩濃度およびｐＨ値を相互に関連付けるように構成されたカラムモデル、および
－ カラムの固定相の細孔体積における溶出緩衝液中の各タンパク質の濃度、塩濃度およびｐＨ値を相互に関連付けるように構成された細孔モデル、および
－ 固定相の各タンパク質の濃度、溶出緩衝液の塩濃度、およびタンパク質溶液中の各（標的および任意にさらなる）タンパク質の化学的特性のうちの少なくともいくつかを相互に関連付けるように構成された反応モデル。
複数の異なるカラムモデル、細孔モデルおよび反応モデルが文献に記載されている。これらのモデルの多くは、継続的に改良されている。本発明の文脈で使用され得るモデルの例を記載する参考文献のリストは、例えば図４Ｃの説明に開示されている。
例えば、カラムモデルは、Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｔｒａｕｂら、「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」２０１２、Ｖｉｌｅｙ－ＶＣＨに従って実装することができる。細孔モデルは、Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｔｒａｕｂら、「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」２０１２、Ｖｉｌｅｙ－ＶＣＨに従って実装することができる。反応モデルは、Ｋｌｕｔｅｒｓら、「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｎｅａｒ ｐＨ ｇｒａｄｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｏｎｏｍｅｒ」、Ｊ Ｓｅｐ Ｓｃｉ、２０１６年２月、９３（４）、６６３～６７５に従って実装することができる。反応モデルのパラメータおよび／またはモデル自体は、実験データの説明を容易にするために複雑さを様々なレベルで修正することができる。これは、例えば、Ｈｕｕｋらによる「Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｕｎｄｅｒ ｈｉｇｈ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｏａｄ ｄｅｎｓｉｔｉｅｓ ｉｎ ｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｕｓｉｎｇ ａｎ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．、１２：１６００３３６．ｄｏｉ：１０．１００２／ｂｉｏｔ．２０１６００３３６において実証されている。この刊行物は、一般化されたイオン交換等温線が、高タンパク質負荷条件での単一タンパク質種の分離をモデル化するためにどのように使用され得るかを記載している。
細孔モデル、カラムモデルおよび反応モデルは、塩濃度およびタンパク質濃度を介して相互に連結される。カラムモデルおよび細孔モデルは塩濃度
よって相互に連結されるので、細孔モデルの式をカラムモデルに挿入することができる。
反応モデルの第１の式は、
項を介してカラムモデルに挿入することができる。タンパク質の結合強度、つまり化学的特性を記載するパラメータは、平衡定数Ｋｅｑおよび結合部位の数ｖである。両方とも、ｖ（反応モデルの第２の式）を介してｐＨに依存する。
したがって、所望の量、比および／または純度の標的タンパク質を溶出するために必要とされる溶出緩衝液の塩濃度は、ｐＨ値、適用されるタンパク質の量および化学的特性、カラム寸法、ならびにポンプによって規定される溶出緩衝液の流量などのパラメータのセットに基づいて計算することができる。
標的タンパク質、または任意のさらなるタンパク質のタンパク質の量は、クロマトグラフィーカラムを出る移動相中のこのタンパク質の濃度の経時的積分値である。計算ソフトウェアは、塩濃度ｃＳＡＬＴを変化させ、最適化基準に最もよく合致するタンパク質溶出プロファイルを提供する塩濃度を同定するために、標的タンパク質の溶出プロファイルの予測を実施し、任意に塩濃度の関数としてさらに１つ以上の予測も実施する。
カラムモデル
実施形態によれば、カラムモデルで指定される相互関係は、以下のカラムモデルの式を含む。
実施形態によれば、カラムモデルで指定される相互関係は、以下のカラムモデルの式を含む。
ここで、ｉは特定のタンパク質のインデックスであり、ｔは時間であり、ｘはカラムの垂直軸に沿ったカラム内の位置であり、ｃＳＡＬＴはカラムの移動相（すなわち、適用されるタンパク質溶液の無視できる量を含む溶出緩衝液相）中の遊離（未結合）塩イオン（典型的にはカチオン交換クロマトグラフィーのＮａ＋）の濃度であり、ｃＰＲＯＴ＿ｉはカラムの移動相中のタンパク質ｉの濃度であり、ｑＰＲＯＴ＿ｉは固定相中の結合したタンパク質ｉの濃度であり、ｕｉｎｔは固定相粒子間のカラム内を通る流れによって得られる速度として定義される間隙流速であり、εｃｏｌは間隙空隙率（カラムの断面における開孔面積）である。これは、間隙体積とカラム体積との比として定義され、間隙体積は粒子の外側のカラム内の溶出緩衝液体積である）、εｐは粒子空隙率（粒子自身の内部空隙率（細孔体積）として定義される）、Ｄａｘは軸方向分散係数である。軸方向分散係数は、カラムの長手方向に沿った不活性トレース材料の広がりの程度の尺度である。Ｄａｘは、フィック（Ｆｉｃｋ）の法則に記載されているように軸方向の分散を記載する。
空隙率εｃｏｌ、ε＿ｐおよび分散係数Ｄａｘは、溶出タンパク質のピークの分離に影響を及ぼし得るパラメータである。空隙率は通常固定され、カラムに含まれるクロマトグラフィー樹脂によって決定される。好ましくは、それらはデフォルト値として、例えば構成ファイルに格納されるが、異なる固定相材料が使用される場合に変更することができる。
したがって、本発明の実施形態によれば、カチオン交換クロマトグラフィーカラムの寸法は、間隙流速（細孔モデルにおけるカラム直径に対する流れの正規化）およびカラムの垂直位置ｘによって反映されるカラム内の位置を介して考慮される。カラムの長さと直径の組合せは、カラムの総体積を規定する。
間隙流速は、カラムを通る溶出緩衝液の流量から計算的に導出される。
例えば、ユーザは、［ｍｍ／秒］で溶出緩衝液の流量「ｅｂｆｒ」をクロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアに入力することができる。クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアは、以下の式に従って間隙流速ｕ（ｉｎｔ）［ｍｍ／秒］を計算する：
式中、εｃｏｌは間隙カラム空隙率（単位なし）である。
溶出緩衝液の流量（カラムを通って溶出緩衝液を圧送するように構成されたポンプによって規定され得る）から間隙流速をどのように得るかについての具体例は、Ｓｃｈｍｉｄｔ－Ｔｒａｕｂ、Ｈｅｎｎｅｒ編．「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ｏｆ ｆｉｎｅ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｇｅｎｔｓ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、２００６において記載されている。
細孔モデル
実施形態によれば、細孔モデルで指定される相互関係は、以下の細孔モデルの式を含む：
ここで、ｉは特定のタンパク質のインデックスであり、ｔは時間であり、ｘはカラムの垂直軸に沿ったカラム内の位置であり、ｃＳＡＬＴはカラムの移動相中の遊離（未結合）塩イオンの濃度であり、ｃＰＲＯＴ＿ｉはカラムの移動相中のタンパク質ｉの濃度であり、ｑＰＲＯＴ＿ｉは固定相中の結合したタンパク質ｉの濃度であり、εｃｏｌは間隙カラム空隙率であり、ε＿ｐは粒子空隙率であり、ｋｅｆｆは有効物質移動係数（間隙移動相から細孔体積へのタンパク質の移動を記載する）であり、ｚ２．７～３．３の範囲内の数値、特に３．０r_pはクロマトグラフィービーズの半径である。パラメータｚは、カラム材料の幾何学的態様に依存する。パラメータｚを得る方法についての具体例は、Ｓｃｈｍｉｄｔ－Ｔｒａｕｂ、Ｈｅｎｎｅｒ編、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ｏｆ ｆｉｎｅ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｇｅｎｔｓ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、２００６、３３８～３３９頁において記載されている。
実施形態によれば、細孔モデルで指定される相互関係は、以下の細孔モデルの式を含む：
一例によれば、間隙流速は、以下のようにカラムを通る溶出緩衝液の流量に関連付けることができる：
カラムを通る流量は、体積流量ｕｐ（ｍＬ／分）とも呼ばれ、カラムを通って圧送される移動相の体積を記載する。流量をクロマトグラフィーカラムの寸法に正規化するために、カラム体積および長さを使用してカラム直径に関して流量を正規化することができる。流速ｕの単位は、以下の式に従って（ｍｍ／秒）に変更する：
間隙流速は、間隙カラム体積Ｖｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ（すなわち、多孔質クロマトグラフィービーズ間の体積のみ）のみを考慮することによって、クロマトグラフィービーズの空隙率に関する流速をさらに正規化する。使用されるクロマトグラフィーカラムの間隙体積と総カラム体積との比は以下、εｃｏｌの通りである：
。
カラムを通る流量は、体積流量ｕｐ（ｍＬ／分）とも呼ばれ、カラムを通って圧送される移動相の体積を記載する。流量をクロマトグラフィーカラムの寸法に正規化するために、カラム体積および長さを使用してカラム直径に関して流量を正規化することができる。流速ｕの単位は、以下の式に従って（ｍｍ／秒）に変更する：
したがって、パラメータεcolは、間隙体積および総カラム体積の割合である。
カラムの固定相は、ビーズのマトリックスとして記載することができる。カラム内のすべてのビーズの総体積は「ビーズ体積」Ｖｂｅａｄｓと呼ばれ、各ビーズの体積は、ビーズの固定相材料によって使われる体積とビーズに含まれる細孔の体積との両方を含む。クロマトグラフィーカラムの間隙体積Ｖｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌは、カラムの総体積Ｖｃｏｌから、カラムに含まれるすべてのビーズの総ビーズ体積Ｖｂｅａｄｓを引いたものとして規定される。実施形態によれば、カラムモデルとコアモデルとが組み合わされる。例えば、実施形態によれば、少なくとも計算された塩濃度の関数としての標的溶出体積の計算は、塩濃度ｃＳＡＬＴおよび固定相のタンパク質ｉの濃度ｑＰＲＯＴ＿ｉの関数としての間隙体積中のタンパク質ｉの濃度を計算するために、カラムモデルの式および細孔モデルの式を使用することを含む。
実施形態によれば、少なくとも計算された塩濃度の関数としての標的溶出体積のプーリング境界の計算は、複数の異なる溶出時間ｔでの位置ｘ＝カラム長での第１の標的タンパク質の濃度を計算するために、カラムモデルの式および細孔モデルの式を使用することを含む。
反応モデル
実施形態によれば、反応モデルで指定される相互関係は、以下を含む：
以下に従う第１の反応モデルの式：
以下に従う第２の反応モデルの式：
以下に従う第３の反応モデルの式：
。
実施形態によれば、反応モデルで指定される相互関係は、以下を含む：
以下に従う第１の反応モデルの式：
ここで、ｉは特定のタンパク質のインデックスであり、ｔは時間であり、ｘはカラムの垂直軸に沿ったカラム内の位置であり、ｃＳＡＬＴはカラムの移動相中の遊離（未結合）塩イオンの濃度であり、ｃＰＲＯＴ＿ｉはカラムの移動相中のタンパク質ｉの濃度であり、ｑＰＲＯＴ＿ｉは固定相中の結合したタンパク質ｉの濃度であり、Ｋｋｉｎは速度論的速度（脱着速度の逆数として定義され、固定相のリガンドからイオンを置き換えるタンパク質の反応の速度を記載する）であり、Ｋｅｑは平衡定数（すなわち、固定相中の特定のタンパク質ｉのモル濃度を移動相中のタンパク質ｉのモル濃度で割ったもの）であり、Λはリガンド密度（カラム体積当たりのｍｏｌ単位のリガンドの数として定義される）であり、ν＿ｉは結合部位の数（すなわち、固定相へのタンパク質結合に関与するタンパク質ｉの結合部位の数）であり、σ＿ｉは遮蔽係数（すなわち、タンパク質ｉが固定相に結合する場合に遮蔽されるタンパク質ｉの結合したタンパク質分子当たりのリガンドの数）であり、Ｎ＿（ｃａｒｂ，ｉ）は固定相と相互作用するタンパク質ｉのカルボキシ部位の数であり、Ｎ＿（ｈｉｓ，ｉ）は固定相と相互作用するタンパク質ｉのヒスチジン部位の数であり、Ｎ＿（Ｎ－ｔｅｒｍ、ｉ）は固定相と相互作用するタンパク質ｉのＮ末端部位の数であり、Ｎ＿（ａｍｉ，ｉ）は固定相と相互作用するタンパク質ｉのアミノ部位の数であり、ｐＨは溶出緩衝液のｐＨ値であり、
はタンパク質ｉの吸収状態と非結合状態との間の標準ギブス（Ｇｉｂｂｓ）自由エンタルピーの差であり、
は塩の吸収状態と非結合状態との間の標準ギブス自由エンタルピーの差であり、
は固定相と相互作用するタンパク質ｉのすべてのカルボキシル基の平均酸解離定数（Ｋａ）であり、
は固定相と相互作用するタンパク質ｉのすべてのヒスチジン－アミノ酸の平均Ｋａであり、
は固定相と相互作用するタンパク質ｉのすべてのＮ末端α－アミノ基の平均Ｋａであり、
はタンパク質ｉのすべてのアミノ基の平均Ｋａであり、Ｒは気体定数であり、Ｔはカラムおよび溶出緩衝液の温度である。固定相中の特定のタンパク質「ｉ」の濃度（「ｑＰＲＯＴ（ｉ）」）は、第１および第２の反応モデルの式を使用して第３の反応モデルの式をｑＰＲＯＴ（ｉ）に対して解くことによって、溶出緩衝液のｐＨ値の関数として計算される。
塩濃度ｃＳＡＬＴは、第１の反応モデルの式を介して固定相に結合したタンパク質ｑＰＲＯＴ＿ｉの量に影響を及ぼす：低い塩濃度では、タンパク質はクロマトグラフィーカラムに結合し、より高い塩濃度では、タンパク質は塩イオンによって置き換えられ、溶出される。反応モデルにおいては結合部位の数νおよび平衡定数Ｋｅｑで構成されるタンパク質の結合強度に応じて、タンパク質は異なる塩濃度で溶出する。適切な塩濃度を選択することにより、クロマトグラフィーカラムに望ましくないタンパク質を結合させたままで、標的タンパク質を溶出させることができる。これらのパラメータ値のいくつかはタンパク質特異的であり、文献から導出することができる。これらのパラメータのいくつかは、タンパク質およびモデル特異的である。それらはまた、文献から導出されてもよく、または使用されるそれぞれのモデルを公表した著者によって通常記載されるいくつかの予備的な経験的較正工程を実施することによって得ることができる。例えば、固定相と相互作用するタンパク質ｉのカルボキシ部位の数を示すＮ＿（ｃａｒｂ，ｉ）のようなパラメータは、タンパク質特異的であるが、シミュレーションを実施するために使用されるモデルにも依存する。固定相と実際に相互作用するカルボキシル部位の数は、使用される反応モデルに記載されている立体効果によって制限される。固定相と相互作用するそれぞれの部位の数は、タンパク質特異的およびモデル特異的な経験的試験を使用して決定される。いくつかのタンパク質については、パラメータ値は文献からすぐに導出することができる。ギブスエネルギーΔＧ０
Ｐ／ＲＴおよびΔＧ０
ｓ／ＲＴはまた、タンパク質溶液中の各タンパク質対して経験的に決定されてもよく、または文献から導出されてもよい。
ｐＨ値は、タンパク質の結合部位ｖの数に影響を及ぼす（第２の式）。結合部位ｖの数は、平衡定数Ｋｅｑに影響を及ぼす（第３の式）。これにより、ｐＨ値は、反応モデルの式１の塩濃度に関連付けられる。
したがって、反応モデルは、例えばタンパク質中のある特定の基のｐＫａおよびタンパク質の結合部位ｖに関して、ｐＨ値およびタンパク質の化学的特性の寄与を考慮に入れる。反応モデルはまた、塩濃度を考慮に入れ、それによって溶出緩衝液の塩濃度を溶出されるタンパク質の化学的特性と相互に関連付ける。塩濃度ｃＳＡＬＴは、第１の式の一部であり、結合部位ｖの数を介してタンパク質結合特性に直接連結される。
しかしながら、上述した反応モデルは、反応モデルを実装することができる多くの可能な様式のうちの１つにすぎない。カチオンクロマトグラフィー実行のモデル化およびシミュレーションは現在進行中の研究分野であるため、シミュレーションを実施するために本明細書に記載の式およびモデルの様々な修正を同様に使用することができる。現在文献に記載されている代替のカラム、細孔および反応モデルを使用することも可能であり、将来において、少なくともいくつかの異なる溶出緩衝液の塩濃度の関数として、好ましくはカラムに適用されるタンパク質の量および化学的特性などのさらなるパラメータの関数として、クロマトグラフィーシミュレーションを実施するために使用することができる、新しいカラム、細孔および反応モデルが開発および公表される可能性がある。
一実施形態によれば、例えば図７を参照して記載されるタンパク質Ｐ１～Ｐ３の以下のモデル特異的な化学的特性値が提供され、適切な溶出緩衝液の塩濃度およびプーリング境界の計算中に反応モデルによって入力として使用される：
さらに、以下の入力パラメータ値を、例えばＧＵＩ、構成ファイルまたは他のデータソースを介して反応モデルに提供することができる：
遮蔽係数はバリアント１からバリアント３へと小さくなり、これは、グリコシル化の減少の程度、したがってバリアント１からバリアント３へのタンパク質サイズと一致する。
上述のパラメータ値は、ＧＵＩを介してユーザによって提供され得、および／またはクロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアの構成ファイルで指定され得る。
モデルパラメータを取得および／または推定するための様々な手法が存在する。例えば、研究論文Ｓｉｍｏｎ Ｋｌｕｔｅｒｓらの２０１５年１１月９日に最初に公表された「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｎｅａｒ ｐＨ ｇｒａｄｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｏｎｏｍｅｒ ｆｒｏｍ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ」（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｊｓｓｃ．２０１５００９９４）は、クロマトグラフィーカラムにおけるイオン交換の機構モデルおよびこのモデルのパラメータをどのように得ることができるかを記載している。
さらなる態様では、本発明は、シミュレーションソフトウェアを含むクロマトグラフィー制御システムに関する。例えば、クロマトグラフィー制御システムは、クロマトグラフィーシステムの手動制御を案内するため、または制御システムの完全自動もしくは半自動制御を提供するために使用することができる。シミュレーションソフトウェアは、所望の第１の量の第１の標的タンパク質を含む標的溶出体積のプーリング境界を得る方法を実施するように構成される。クロマトグラフィー制御システムは、以下のために構成される：
－ 最適化基準を受け取り、最適化基準をクロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアに入力すること（最適化基準は、標的溶出体積に含まれる第１および第２の標的タンパク質に関する標的溶出体積の所望の特性である）、
－ クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアを使用して、最適化基準に最もよく合致する標的溶出体積を得ることができるように、クロマトグラフィーカラムから第１および第２の標的タンパク質を溶出するように適合された溶出緩衝液の塩濃度を計算すること（計算することは、複数の異なる溶出緩衝液の塩濃度の関数として複数のクロマトグラフィーシミュレーションを計算することを含む）、
－ 少なくとも計算された塩濃度および入力された最適化基準の関数として標的溶出体積のプーリング境界を計算すること、
－ 計算された塩濃度およびプーリング境界を出力すること、および／または
－ 計算された標的溶出体積が計算されたプーリング境界に従って別個の画分として自動的に収集されるように、溶出体積収集ユニットを制御すること。
－ 最適化基準を受け取り、最適化基準をクロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアに入力すること（最適化基準は、標的溶出体積に含まれる第１および第２の標的タンパク質に関する標的溶出体積の所望の特性である）、
－ クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアを使用して、最適化基準に最もよく合致する標的溶出体積を得ることができるように、クロマトグラフィーカラムから第１および第２の標的タンパク質を溶出するように適合された溶出緩衝液の塩濃度を計算すること（計算することは、複数の異なる溶出緩衝液の塩濃度の関数として複数のクロマトグラフィーシミュレーションを計算することを含む）、
－ 少なくとも計算された塩濃度および入力された最適化基準の関数として標的溶出体積のプーリング境界を計算すること、
－ 計算された塩濃度およびプーリング境界を出力すること、および／または
－ 計算された標的溶出体積が計算されたプーリング境界に従って別個の画分として自動的に収集されるように、溶出体積収集ユニットを制御すること。
実施形態によれば、システムは、以下のために構成される：
－ カチオン交換クロマトグラフィーカラムの寸法を受け取ること、および
－ カラムに適用される第１および第２の標的タンパク質の量、ならびに任意に、１種以上のさらなるタンパク質の量も受け取ること。
－ カチオン交換クロマトグラフィーカラムの寸法を受け取ること、および
－ カラムに適用される第１および第２の標的タンパク質の量、ならびに任意に、１種以上のさらなるタンパク質の量も受け取ること。
シミュレーションおよび／またはプーリング境界は、少なくとも以下を含むパラメータ値のセットの関数として計算される：
● 提供されるカチオン交換クロマトグラフィーカラムの寸法、および
● カラムに適用される第１および第２の標的タンパク質の量、ならびに任意に、１種以上のさらなるタンパク質の量。
● 提供されるカチオン交換クロマトグラフィーカラムの寸法、および
● カラムに適用される第１および第２の標的タンパク質の量、ならびに任意に、１種以上のさらなるタンパク質の量。
実施形態によれば、パラメータのセットは以下をさらに含む：
● 溶出緩衝液の所定のｐＨ値、
● カラムを通る溶出緩衝液の流量、
● 適用されるタンパク質溶液のタンパク質の化学的特性。
● 溶出緩衝液の所定のｐＨ値、
● カラムを通る溶出緩衝液の流量、
● 適用されるタンパク質溶液のタンパク質の化学的特性。
本発明の実施形態によれば、第１のタンパク質の所望の第１の量が、所望の第１のタンパク質の所望の絶対量として指定される。特に、第１の標的タンパク質の所望の量は、溶出緩衝液の収集される体積中の第１のタンパク質の所望の濃度またはその微分値の形態で指定することができる。
他の実施形態によれば、適用されるタンパク質溶液は、第１の標的タンパク質と、第２の標的タンパク質と、０、１種またはそれ以上のさらなるタンパク質とを含む。第１のタンパク質の所望の第１の量は、相対量の形態でクロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアに入力される。相対量は、第１の標的タンパク質と第２の標的タンパク質との比である。クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアは、少なくとも計算された塩濃度および入力された所望の比の関数として、標的溶出体積のプーリング境界を計算する。方法は、第１と第２の標的タンパク質との所望の比を含む標的溶出体積を生成するために使用される。
実施形態によれば、複数のクロマトグラフィーシミュレーションは、複数の異なる溶出緩衝液の塩濃度の関数として、および複数の異なる溶出緩衝液のｐＨ値の関数として計算される。塩濃度の計算は、最適化基準に最もよく合致する標的溶出体積を得ることができるように、クロマトグラフィーカラムから第１および第２の標的タンパク質を溶出するように組み合わせて適合された溶出緩衝液の塩濃度と溶出緩衝液のｐＨ値との組合せを計算することを含む。クロマトグラフィーシミュレーションは、溶出緩衝液の塩濃度と溶出緩衝液のｐＨ値との組合せを同定するために実施される。標的溶出体積のプーリング境界の計算は、少なくとも溶出緩衝液の塩濃度と溶出緩衝液のｐＨ値との計算された組合せおよび入力最適化基準の関数として計算される。計算されたｐＨ値は、計算された溶出緩衝液に加えて出力される。
実施形態によれば、クロマトグラフィー制御システムは、出力された溶出塩濃度を有する溶出緩衝液を自動的に生成することについて緩衝液混合ユニットを制御するように構成される。
加えてまたは代替的に、クロマトグラフィー制御システムは、異なる塩濃度を有する複数の利用可能な溶出緩衝液のうちの１つを自動的に選択するように適合された溶出緩衝液選択ユニットを制御するように構成され、選択される溶出緩衝液は出力された塩濃度を有する。
加えてまたは代替的に、クロマトグラフィー制御システムは、組み合わせて計算および出力された塩濃度およびｐＨ値の両方を有する溶出緩衝液を自動的に生成することについて緩衝液混合ユニットを制御するように構成される。
加えてまたは代替的に、クロマトグラフィー制御システムは、計算された標的溶出体積が計算されたプーリング境界に従って別個の画分として自動的に収集されるように、クロマトグラフィーシステムの溶出体積収集ユニットを制御するように構成される。
加えてまたは代替的に、クロマトグラフィー制御システムは、異なる塩濃度および異なるｐＨ値を有する複数の利用可能な溶出緩衝液のうちの１つを自動的に選択するように適合された溶出緩衝液選択ユニットを制御するように構成され、選択される溶出緩衝液は計算および出力された塩濃度とｐＨ値の両方を組み合わせて有する。
加えてまたは代替的に、クロマトグラフィー制御システムは、自動的に生成または選択された溶出緩衝液をクロマトグラフィーカラムに自動的に適用するように構成された緩衝液適用ユニットを制御するように構成され、適用される溶出緩衝液は、出力された塩濃度を有するか、または計算および出力された塩濃度とｐＨ値の両方を組み合わせて有する。
さらなる態様では、本発明は、クロマトグラフィー制御システムを備え、上述の緩衝液混合ユニットおよび／または溶出緩衝液選択ユニットおよび／または緩衝液適用ユニットおよび／または自動溶出体積収集ユニットをさらに備えるクロマトグラフィーシステムに関する。
さらなる態様では、本発明は、クロマトグラフィー制御システムを備え、出力された溶出塩濃度を有する溶出緩衝液を自動的に生成するように適合された緩衝液混合ユニットをさらに備えるクロマトグラフィーシステムに関する。
加えてまたは代替的に、クロマトグラフィーシステムは、異なる塩濃度を有する複数の利用可能な溶出緩衝液のうちの１つを自動的に選択するように適合された溶出緩衝液選択ユニットをさらに備え、選択される溶出緩衝液は出力された塩濃度を有する。
加えてまたは代替的に、クロマトグラフィーシステムは、自動的に生成または選択された溶出緩衝液をクロマトグラフィーカラムに自動的に適用するように構成された緩衝液適用ユニットをさらに備える。
加えてまたは代替的に、クロマトグラフィーシステムは、出力されたプーリング境界に従って、カラムを出る溶出緩衝液の画分の収集を自動的に開始および停止するように構成された自動溶出体積収集ユニットをさらに備える。
さらなる態様では、本発明は、第１および第２の標的タンパク質を含む標的溶出体積が得られるようにクロマトグラフィープロセスを管理するためのコンピュータプログラムに関する。コンピュータプログラムは、クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアを含み、以下のために構成される：
－ 標的溶出体積に含まれる第１および第２の標的タンパク質に関する標的溶出体積の所望の特性である最適化基準を受け取ること、
－ クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアを使用して、最適化基準に最もよく合致する標的溶出体積を得ることができるように、クロマトグラフィーカラムから第１および第２の標的タンパク質を溶出するように適合された溶出緩衝液の塩濃度を計算すること（計算することは、複数の異なる溶出緩衝液の塩濃度の関数として複数のクロマトグラフィーシミュレーションを計算することを含む）、
－ 少なくとも計算された塩濃度および入力された最適化基準の関数として標的溶出体積のプーリング境界を計算すること、ならびに
－ 最適化基準に従って第１および第２の標的タンパク質を含む標的溶出体積が得られるように、ユーザがクロマトグラフィーシステムを制御することを可能にするために、計算された塩濃度および／もしくはプーリング境界を出力すること、ならびに／または最適化基準に従って第１および第２の標的タンパク質を含む標的溶出体積が得られるように、クロマトグラフィーシステムを自動的もしくは半自動的に制御するために、計算された塩濃度および／もしくはプーリング境界を使用すること。
－ 標的溶出体積に含まれる第１および第２の標的タンパク質に関する標的溶出体積の所望の特性である最適化基準を受け取ること、
－ クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアを使用して、最適化基準に最もよく合致する標的溶出体積を得ることができるように、クロマトグラフィーカラムから第１および第２の標的タンパク質を溶出するように適合された溶出緩衝液の塩濃度を計算すること（計算することは、複数の異なる溶出緩衝液の塩濃度の関数として複数のクロマトグラフィーシミュレーションを計算することを含む）、
－ 少なくとも計算された塩濃度および入力された最適化基準の関数として標的溶出体積のプーリング境界を計算すること、ならびに
－ 最適化基準に従って第１および第２の標的タンパク質を含む標的溶出体積が得られるように、ユーザがクロマトグラフィーシステムを制御することを可能にするために、計算された塩濃度および／もしくはプーリング境界を出力すること、ならびに／または最適化基準に従って第１および第２の標的タンパク質を含む標的溶出体積が得られるように、クロマトグラフィーシステムを自動的もしくは半自動的に制御するために、計算された塩濃度および／もしくはプーリング境界を使用すること。
実施形態によれば、コンピュータプログラムは、クロマトグラフィーシステムの１つ以上のユニットを自動的または半自動的に制御するための制御コマンドを生成するようにさらに構成される。
実施形態によれば、コンピュータプログラムは、クロマトグラフィーシステムの１つ以上のユニットを自動的または半自動的に制御するための制御コマンドを生成するようにさらに構成される。
「標的タンパク質」は、本明細書で使用される場合、所望の絶対量または相対量でカチオンクロマトグラフィーによって得られる特定のＰＴＭを有するタンパク質またはタンパク質バリアントである。
タンパク質の「溶出プロファイル」は、本明細書で使用される場合、ある期間にわたる溶出液中のタンパク質の濃度の指標である。
適用されるタンパク質溶液に含まれる１種以上の「さらなるタンパク質」は、１種以上のさらなる標的タンパク質および／または１種以上の非標的タンパク質を含み得、「非標的タンパク質」は、例えば、クロマトグラフィー実行中に１種以上の標的タンパク質から除去される汚染物質と見なされるため、その存在が望ましくないタンパク質である。
「標的溶出体積」は、本明細書で使用される場合、クロマトグラフィーカラムを通過し、その後カラムを出た後に収集された標的緩衝液の特定の体積である。標的溶出体積は、１種以上の標的タンパク質を所望の絶対量または相対量で含む。標的溶出体積は以下によって決定される
「イオン交換クロマトグラフィー」は、本明細書で使用される場合、イオン交換体に対するそれらの親和性に基づいてイオンおよび極性分子、例えばタンパク質またはペプチドを分離するクロマトグラフィープロセスである。しかしながら、イオンクロマトグラフィーは、タンパク質の等電点から１単位離れた条件で行われなければならない。したがって、所与の条件で高度に類似した等電点を有する分子の分離は大きな課題である。
「カチオン交換クロマトグラフィー」という用語は、目的の分子が正に帯電しているかまたは正の極性を有する場合に使用されるイオン交換クロマトグラフィーの一種を指す。クロマトグラフィーのｐＨがｐＩ未満であるため、分子は正に帯電しているか、または正の極性を有する。この種類のクロマトグラフィーでは、固定相は負に帯電し、正に帯電した分子がそれに引き寄せられるように負荷される。分離する所望の分子がカチオンである場合、カチオン交換クロマトグラフィーが使用される。次いで、結合した分子をカラムから溶出させ、本明細書で「溶出緩衝液」と呼ばれる溶出液を使用して収集することができる。イオンクロマトグラフィーを使用する主な利点の１つは、他の分離技術とは対照的に、分離中に関与する相互作用が１つだけであることである。
「クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェア」は、本明細書で使用される場合、クロマトグラフィープロセスのいくつかの態様、特に溶出緩衝液の推奨塩濃度および／または１種以上の標的タンパク質の所望の量を含む溶出体積の推奨溶出境界をシミュレート（予測）するためのコンピュータ解釈可能なコードを含む、任意の種類のソフトウェア、例えばアプリケーションプログラム、スクリプト、より大きなソフトウェアスイートまたはソフトウェアプラットフォームのソフトウェアモジュールである。
「溶出緩衝液」は、本明細書で使用される場合、溶出されるタンパク質がカラムを出る溶出緩衝液中に含まれ、溶出液の異なる画分でカラムを出る他のタンパク質とは別に収集され得るように、クロマトグラフィーカラムに結合した１種以上の分子をカラムから溶出するためにクロマトグラフィーカラムに適用される「溶出剤」とも呼ばれる水性溶液を指す。
「計算された標的溶出体積」は、１種以上の標的タンパク質を入力された所望の絶対量または相対量で含むと予測される溶出体積である。例えば、計算された標的溶出体積は、予測されたプーリング境界を介して指定することができる。
予測される「プーリング境界」は、１種以上の標的タンパク質を所望の量で含む溶出体積を得るために、クロマトグラフィーカラムを出る標的溶出緩衝液体積のどの部分を別に収集する必要があるかを示すデータ値である。いくつかの実施形態によれば、プーリング境界は、標的溶出緩衝液体積の収集が開始されるべき時間を示す開始時間の形態、および標的体積の収集が停止されるべき時間を示す停止時間の形態で指定される。他の実施形態によれば、プーリング境界は、標的体積の収集が開始されるべきときにカラムを横断してカラムを出た溶出緩衝液体積を示す開始溶出緩衝液体積の形態で、および標的体積の収集が停止されるべきときにカラムを横断してカラムを出た溶出緩衝液体積を示す停止溶出緩衝液体積の形態で指定される。例えば、標的溶出体積のプーリング境界が、「カラム体積の３．５倍」および「カラム体積の４．６倍」であるとすると、標的溶出体積は、３．５カラム体積の溶出緩衝液が既にカラムに適用され、カラムを出た後に、カラムを出つつある溶出緩衝液を選択的に収集し、カラム体積の４．６倍を超えてカラムに適用され、カラムを出ようとしているときに収集を停止することによって得ることができる。予測されるプーリング境界が時間または量として指定されるかどうかは、それぞれの実装に依存する。
「グリコフォーム」は、本明細書で使用される場合、異なるグリカンが結合しているか、またはグリカンの数もしくは位置が異なる糖タンパク質（または糖ペプチドまたは他の生物学的グリコシド）のいくつかの異なる形態のいずれかである。
タンパク質の「純度」は、このタンパク質が他のものと混合されていない状態、特に他のタンパク質と混合されていない状態の程度を示す。例えば、溶出体積中９９％の純度を有する特定のタンパク質Ｐ１は、溶出体積が溶出緩衝液画分と非溶出緩衝液画分とからなり、非溶出緩衝液画分の９９％がタンパク質Ｐ１からなり、非溶出緩衝液画分の１％が他の物質、例えば適用されたタンパク質溶液に含まれるタンパク質Ｐ２、Ｐ３、．．．の１種以上の他のものからなることを意味する。所与のプーリング境界内で収集された溶出液中のすべてのタンパク質の濃度が既知である場合（例えば、予測または経験的に決定される）、タンパク質の純度は暗黙的に与えられる。純度は、１種以上の標的タンパク質に関する最適化基準として使用され得る。例えば、理想的な場合、標的溶出体積で得られるすべての標的タンパク質の純度は１００％であるが、実際には、最適化基準は、個々の場合に依存する最小純度基準、例えば９９％以下を必要とし得る。
以下の本発明の実施形態は、図面を参照して、単なる例として、より詳細に説明される。
本発明の実施形態による方法のフローチャートを示す。
クロマトグラフィーシステムを示す。
別のクロマトグラフィーシステムを示す。
クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアによって使用されるモデルを選択するためのＧＵＩを示す。
それぞれのモデルの種類をさらに示す。
それぞれのモデルの種類をさらに示す。
クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアにデータを入力するためのＧＵＩを示す。
クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアにデータを入力するためのＧＵＩを示す。
第１のタンパク質溶液について得られた溶出プロットである。
複数の異なる候補溶出塩濃度が与えられた場合の第１のタンパク質溶液中の標的タンパク質の収率および純度ならびに組み合わせた純度－収率－目的パラメータの予測結果を示す。
複数の異なる候補溶出塩濃度が与えられた場合の第１のタンパク質溶液中の標的タンパク質の組み合わせた純度／収率－目的パラメータの予測結果のプロットを示す。
第２のタンパク質溶液について得られた溶出プロットである。
複数の異なる候補溶出塩濃度が与えられた場合の第２のタンパク質溶液中の第１および第２の標的タンパク質の収率および純度ならびに組み合わせた純度－収率－目的パラメータの予測結果を示す。
複数の異なる候補溶出塩濃度が与えられた場合の第２のタンパク質溶液中の第１および第２の標的タンパク質の組み合わせた純度／収率－目的パラメータの予測結果のプロットを示す。
予測されたタンパク質比と測定されたタンパク質比との比較を示す。
タンパク質Ｐ１およびＰ２の分解能を示す。
２種の標的タンパク質Ｐ１、Ｐ２およびさらなるタンパク質Ｐ３の例を示す。
図８Ａは、相対プール組成に対するタンパク質負荷の影響を示すプロットである。図８Ｂは、相対プール組成に対する溶出緩衝液の塩濃度の影響を示すプロットである。
予測された溶出緩衝液の塩濃度による標的タンパク質比に対するタンパク質負荷の影響の補償を例示するプロットである。
２種のタンパク質の溶出プロファイルに対する異なる塩濃度の影響を示す。
２種のタンパク質の溶出プロファイルに対する異なる塩濃度の影響を示す。
２種のタンパク質の溶出プロファイルに対する異なる塩濃度の影響を示す。
図１は、本発明の実施形態によるクロマトグラフィー方法のフローチャートを示す。
方法は、所望の絶対もしくは相対量および／または純度の２種以上の標的タンパク質を含む標的溶出体積を得るために使用することができる。例えば、方法は、標的タンパク質Ｐ１および標的タンパク質Ｐ２をそれぞれある特定の濃度または量で得るために実施することができ、標的タンパク質Ｐ１は、好ましくは標的溶出体積内で最小純度を有する。加えてまたは代替的に、方法は、所望の比の２種以上の標的タンパク質を含む標的溶出体積を得るために使用することができる。
第１の工程１００において、方法は、例えば図２および図３に示されるカチオン交換クロマトグラフィーカラム２３０を提供することを含む。自己充填カラムおよび充填済カラムを製造するために使用することができる多数の市販のクロマトグラフィー樹脂材料が存在する。
例えば、Ｐｏｒｏｓ（商標）ＸＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））は、自己充填カラム、例えばＫｒｏｎＬａｂから購入したクロマトグラフィーカラムにおいて、クロマトグラフィー樹脂材料として使用することができる。あるいは、例えば、ＫｒｏｎＬａｂから購入した充填済カラムＲｅｐｌｉｇｅｎ（登録商標）（例えば、長さ＝５ｃｍおよび直径＝０．５ｃｍ、または長さ＝１０ｃｍおよび直径＝０．５ｃｍの寸法を有する）を使用することができる。大規模な実行の場合、カラム寸法は、より小規模な実験室規模の実行の場合のカラム寸法とは著しく異なり得る。例えば、大規模な実行に使用されるカラムのカラム寸法は、長さ＝２２．５ｃｍおよび直径＝２５ｃｍであり得る。
クロマトグラフィーカラムは、サンプルポンプおよび内部分画を備えたＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ２５および１５０クロマトグラフィーシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの自動または半自動クロマトグラフィーシステム内に設置することができる。
次に、工程１０２において、２種以上の標的タンパク質、および任意に１種以上の非標的タンパク質（不純物と見なされる）を含むタンパク質溶液がカラムに適用される。タンパク質溶液は、第１の標的タンパク質Ｐ１、第２の標的タンパク質Ｐ２、および任意に非標的タンパク質Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６である１種以上のさらなるタンパク質を含む。
クロマトグラフィーカラムに適用されるタンパク質溶液を作成するために、１つ以上の前処理および予備精製ステップが実施される。最初に、細胞培養物を回収し、回収した細胞のプロテオームを得る。プロテオームは、グリコシル化抗体と多くの他の種類のタンパク質との複合混合物を含む。抗体画分を選択的に得るために、細胞培養抽出物は、抗体および抗体断片を選択的に結合するように適合された第１の予備精製カラムに適用される。
一例によれば、第１の予備精製カラムは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）精製のための樹脂、例えば試料の負荷前に平衡化されたプロテインＡ樹脂を含む。この例および多くの他の例における第１の予備精製カラムの負荷密度は、樹脂１リットル当たり約２３ｇのタンパク質である。抗体画分を溶出し、ウイルス不活化工程後、溶出液のｐＨを再び上昇させた。溶液を４℃で一晩インキュベートし、０．２μｍ滅菌フィルタで濾過した。濾過したプロテインＡ溶出液を負荷物質として第２の予備精製カラム、例えば混合モードクロマトグラフィー樹脂を充填したカラムに使用した。タンパク質不純物を除去するために、混合モードクロマトグラフィーを使用した。負荷前にカラムを平衡化した。負荷密度は、樹脂１リットル当たり２５ｇのタンパク質であり、流量は１５０ｃｍ／時間であった。その後、フロースルー溶出液のｐＨを低下させ、プールを０．２μｍ滅菌フィルタで濾過した。
これらの前処理および予備精製工程の結果として、クロマトグラフィーカラム２３０に適用されるタンパク質溶液が得られる。タンパク質溶液は、使用される予備精製工程の数および性質に起因して、化学的性質が通常周知である数種のタンパク質のみを含む。前処理および予備精製工程の性質および数は、細胞培養物の種類および細胞培養タンパク質抽出物を提供するために使用される細胞に依存し得、および／または１種以上目的のタンパク質に依存し得る。典型的には、一連の複数の精製工程もまた、特に１種以上の標的タンパク質がグリコフォームまたは他の種類のＰＴＭベースのタンパク質バリアントであり、その化学的特性が細胞培養抽出物中の１種以上の他のタンパク質に高度に類似している場合、１種以上の標的タンパク質を完全には精製することができない。
また、カラム２３０に適用されるタンパク質溶液に含まれる各タンパク質種の数だけでなく量も決定するために、質量分析などの分析試験を使用してもよい。
次いで、工程１０４において、既に適用されたかまたはカラムに適用されるタンパク質溶液中の各タンパク質の量が、クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェア２０４に入力される。
さらに、工程１０６において、第１および第２の標的タンパク質の所望の第１の量２１４、および任意に、存在する場合には、非標的タンパク質のそれぞれの量も、ユーザによってクロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアに入力される。さらに、いくつかの他の値は、ユーザインターフェースを介してクロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアに入力され得、または構成ファイルもしくは他の手段を介して提供され得る。例えば、これらの他の値は、所望の最適化基準（第１および／または第２の標的タンパク質の量および／または純度）、溶出緩衝液のｐＨ値、溶出緩衝液をカラムに圧送するために使用されるポンプで指定された溶出緩衝液の流量、タンパク質溶液中の各タンパク質の化学的特性、既に適用されたかまたはカラムに適用されるタンパク質溶液中の個々のタンパク質の量、およびカラムの寸法を含むことができる。パラメータの数および性質は、複数の異なる溶出緩衝液の塩濃度でのクロマトグラフィー実行をシミュレートするためのシミュレーションソフトウェアにより使用されるモデルに依存し得る。
タンパク質の量、カラム寸法、溶出緩衝液のｐＨ値、固定相の空隙率、溶出緩衝液の流量などのいくつかの入力パラメータは、構成ファイルに格納されるか、またはＧＵＩを介して入力することができ、それぞれの適用シナリオおよびタンパク質溶液に適合され得る。較正されたモデルパラメータ（例えば、等温線、Ｎ、ΔＧｐ０、ΔＧｓ０、ｐＫａ、リガンド密度）のようないくつかのパラメータは再使用することができ、通常、構成ファイルに格納される。
これにより、クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアは、多くの異なる候補溶出緩衝液の塩濃度の関数として、特にカラムに負荷されるタンパク質の量および化学的特性に基づいて、１つ以上の異なる候補溶出体積に対して１種以上の標的タンパク質の濃度および／または純度値をシミュレートすることができる。
例えば、濃度が計算される溶出緩衝液中の塩は、ナトリウム塩、例えば酢酸ナトリウムであり得る。
溶出緩衝液の推奨ｐＨ値は、例えば文献または予備的な経験的試験から導出され得る。一般的にタンパク質クロマトグラフィーでは、ｐＨ２．５と１０の間の溶出緩衝液のｐＨ範囲が通常である。カチオン交換クロマトグラフィーの場合、ｐＨ４と９の間の溶出緩衝液のｐＨ範囲が通常である。好ましくは、シミュレーションソフトウェアに入力されるｐＨ値は、クロマトグラフィー分離または現在分離されるものと同様の類似のタンパク質の分析を実施するために良好に機能することが公知のｐＨ値である。ここで説明する例では、クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアに入力され、実際に使用される溶出緩衝液のｐＨ値でもあるｐＨ値は、５．３０～５．７０の範囲にある。
典型的には、ｐＨ値はシミュレーション中に変化しない。実際に使用される溶出緩衝液のｐＨ値は、例えばｐＨメーター、例えばＷＴＷ Ｓｅｎｔｉｘ Ｍｉｃプローブを用いて制御することができる。
タンパク質の化学的特性は、適切な溶出緩衝液の塩濃度（例えば、ｐＫまたはアミノ酸部分の数および性質）を計算するためのクロマトグラフィープロセスをシミュレートするために使用される任意の予測モデルとは無関係の特性を含むことができる。
タンパク質の化学的特性は、さらに、クロマトグラフィープロセスをシミュレートするために使用される予測モデルに特異的な特性を含むことができる。
タンパク質のモデル特異的な化学的特性を得るために、クロマトグラフィーデータ（クロマトグラム）および対応するオフライン分析データ（例えばＨＰＬＣデータ）を使用することができる。
例えば、タンパク質のクロマトグラフィーモデルに特異的な特性値を得るために、異なるクロマトグラフィー・モデリング・ワークフローが文献に記載されている。等温線の非線形範囲の高いタンパク質濃度で作業する場合、異なるモデルが同じようにクロマトグラムに影響し得る。例えば、ピーク最大値の位置は、遮蔽係数、νまたはＫｅｑに応じて変化する。等温線の線形範囲内のパラメータを推定するために、例えば、Ｍ．Ｒｕｄｔ、Ｆ．Ｇｉｌｌｅｔ、Ｓ．Ｈｅｅｇｅ、Ｊ．Ｈｉｔｚｌｅｒ、Ｂ．Ｋａｌｂｆｕｓｓ、Ｂ．Ｇｕｅｌａｔ、「Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｙａｍａｍｏｔｏ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｓｏｔｈｅｒｍ ａｎｄ ｋｉｎｅｔｉｃ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｉｎ ｉｏｎ－ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ、１４１３（２０１５）６８～７６およびＳ．Ｙａｍａｍｏｔｏ、Ｋ．Ｎａｋａｎｉｓｈｉ、Ｒ．Ｍａｔｓｕｎｏ、Ｔ．Ｋａｍｉｋｕｎｏ、「Ｉｏｎ－ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ－Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｃｕｒｖｅｓ ａｎｄ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ」、Ｉ．Ｔｈｅｏｒｅｄｉｃａｌ Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２５（１９８３）１４６５～１４８３に記載されているように、Ｙａｍａｍｏｔｏ方程式を適用することができる。
実施形態によれば、等温線の線形範囲内の実験は、以下の３つの方法のうちの１つ以上で評価される：１）クロマトグラムのカーブフィッティングによるパラメータ推定（Ｔ．Ｈａｈｎ、Ｔ．Ｈｕｕｋ、Ｖ．Ｈｅｕｖｅｌｉｎｅ、Ｊ．Ｈｕｂｂｕｃｈ、Ｓｉｍｕｌａｔｉｎｇ ａｎｄ Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｗｉｔｈ ＣｈｒｏｍＸ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ、９２（２０１５）１４９７～１５０２）；２）Ｙａｍａｍｏｔｏらにより記載されたｌｏｇ（ＧＨ）／ｌｏｇ（ｃ（Ｎａ＋））プロットを使用した対数グラフ評価（Ｔ．Ｉｓｈｉｈａｒａ、Ｔ．Ｋａｄｏｙａ、Ｈ．Ｙｏｓｈｉｄａ、Ｔ．Ｔａｍａｄａ、Ｓ．Ｙａｍａｍｏｔｏ、Ｒａｔｉｏｎａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ ｃａｔｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｄｅｓｉｇｎ ｆｏｒ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ、１０９３（２００５）１２６～１３８）、および３）ＧＨ（ｃ（Ｎａ＋））プロットの非対数グラフ評価（Ｍ．Ｓｃｈｍｉｄｔ、Ｍ．Ｈａｆｎｅｒ、Ｃ．Ｆｒｅｃｈ、Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ｓａｌｔ ａｎｄ ｐＨ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｉｏｎ－ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、３７（２０１４）５～１３）。この点で良好な相関が観察されない場合、選択されたモデルは用途に適していない可能性がある。
次の段階は、高タンパク質での実験の追加であり、線形勾配データの評価の結果を使用してパラメータ推定を改善し得る。クロマトグラムのカーブフィッティングがモデルと実験データとの間に良好な相関をもたらす場合、パラメータセットは、較正データセットに含まれていない重要なプロセスパラメータの組合せで検証実行を実施することによって試験することができる。満足できるモデルが見つからない場合、モデルの式を拡張するか、またはデータセットをより小さい設計空間に縮小する必要がある。以下では、本発明の実施形態によるタンパク質のモデル特異的な化学的特性のいくつかの取得について記載する。
いくつかの実施形態によれば、Ｙａｍａｍｏｔｏ評価を、モデル特異的なタンパク質特性を得るために実施した。例えば、線形勾配溶出実験のｌｏｇ（ＧＨ）／ｌｏｇ（ｃ（Ｎａ＋））のグラフによる評価を、他の箇所に記載されているように実施した（Ｍ．Ｓｃｈｍｉｄｔ、Ｍ．Ｈａｆｎｅｒ、Ｃ．Ｆｒｅｃｈ、Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ｓａｌｔ ａｎｄ ｐＨ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｉｏｎ－ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、３７（２０１４）５～１３、Ｔ．Ｉｓｈｉｈａｒａ、Ｔ．Ｋａｄｏｙａ、Ｈ．Ｙｏｓｈｉｄａ、Ｔ．Ｔａｍａｄａ、Ｓ．Ｙａｍａｍｏｔｏ、Ｒａｔｉｏｎａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ ｃａｔｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｄｅｓｉｇｎ ｆｏｒ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ、１０９３（２００５）１２６～１３８）。塩の勾配の正規化勾配の傾きＧＨは、以下のように計算することができる。
ＶＧは勾配の体積、ＶＣはカラム体積、εｃｏｌは間隙カラム空隙率、εｐはビーズ空隙率、およびｋＤは排除係数である。ＫＤは０．６と仮定した（Ｆ．Ｗｉｔｔｋｏｐｐ、Ｌ．Ｐｅｅｃｋ、Ｍ．Ｈａｆｎｅｒ、Ｃ．Ｆｒｅｃｈ、Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｌｉｎｅａｒ ｐＨ ａｎｄ ｓａｌｔ ｇｒａｄｉｅｎｔｓ ｏｎ ｗｅａｋ，ｓｔｒｏｎｇ ａｎｄ ｍｉｘｅｄ ｃａｔｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｒｅｓｉｎｓ ａｐｐｌｙｉｎｇ ａｎ ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｄｏｎｎａｎ ｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｍｏｄｅｌ、Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ、１５４５（２０１８）３２～４７）。結合部位の数は、ｌｏｇ（ＧＨ）／ｌｏｇ（ｃ（Ｎａ＋））をプロットし、傾きから１を引くことによって決定することができる（Ｍ．Ｓｃｈｍｉｄｔ、Ｍ．Ｈａｆｎｅｒ、Ｃ．Ｆｒｅｃｈ、Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ｓａｌｔ ａｎｄ ｐＨ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｉｏｎ－ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、３７（２０１４）５～１３）。平衡定数は、一価の塩についての同じグラフを用いて計算することができる。
タンパク質および塩のギブス自由エネルギー（それぞれΔＧ０
Ｐ／ＲＴおよびΔＧ０
ｓ／ＲＴ）は、以下の式に従ってｌｎ（Ｋｅｑ）／νをプロットすることによって傾きおよびｙ切片から決定することができる。
すべての計算は、ソフトウェアの内部線形回帰関数を適用してＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌで実施した。
実施形態によれば、さらなる段階において、ＧＨ／ｃ（Ｎａ＋）カーブフィッティングを実施した。ＧＨ／ｃ（Ｎａ＋）曲線を、以前の刊行物に従って微分方程式を計算することによって実施した（Ｓ．Ｋｌｕｔｅｒｓ、Ｆ．Ｗｉｔｔｋｏｐｐ、Ｍ．Ｊｏｈｎｃｋ、Ｃ．Ｆｒｅｃｈ、Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｎｅａｒ ｐＨ ｇｒａｄｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｏｎｏｍｅｒ ｆｒｏｍ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ、Ｊ Ｓｅｐ Ｓｃｉ、３９（２０１６）６６３～６７５；およびＭ．Ｓｃｈｍｉｄｔ、Ｍ．Ｈａｆｎｅｒ、Ｃ．Ｆｒｅｃｈ、Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ｓａｌｔ ａｎｄ ｐＨ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｉｏｎ－ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、３７（２０１４）５～１３）：
式中、ＧＨｓａｌｔは塩勾配の正規化された勾配の傾きであり、ｃＳＡＬＴはカラムの移動相中の遊離（未結合）塩イオンの濃度であり、ｃＳＡＬＴ、ｅｌｕは溶出ピーク最大での溶出緩衝液中の塩の濃度であり、ｑＰＲＯＴ＿ｉは固定相中の結合したタンパク質ｉの濃度であり、Ｋｅｑ＿ｉは平衡定数（すなわち、固定相中の特定のタンパク質ｉのモル濃度を移動相中のタンパク質ｉのモル濃度で割ったもの）であり、Λはリガンド密度（カラム体積当たりのｍｏｌ単位のリガンドの数として定義される）であり、νｉは結合部位の数（すなわち、固定相へのタンパク質結合に関与するタンパク質ｉの結合部位の数）であり、σｉは遮蔽係数である。
上述の計算は、例えばＢｅｒｋｅｌｅｙ Ｍａｄｏｎｎａ（登録商標）において、例えばソフトウェアの内部四次ルンゲークッタ（Ｒｕｎｇｅ－Ｋｕｔｔａ）アルゴリズムおよび０．０１ｍｏｌ／Ｌ Ｎａ＋のタイムステッピングを適用することによって実施することができる。Ｙａｍａｍｏｔｏ評価の事前に決定されたパラメータに対してパラメータ推定値を選択し、さらなる改善が達成されなくなるまで変動させた。
実施形態によれば、次の段階において、クロマトグラム・カーブ・フィッティングを実施した。この段階は、例えば、ＧｏＳｉｌｉｃｏのＣｈｒｏｍＸで実施することができる。集中速度輸送分散モデルを、例えば３０セルの線形ＳＵＰＧ空間離散化を用いて適用した。ＩＤＡＳ機能を使用して初期タイムステッピングを０．２秒に設定した。大域的最適化のために、ソフトウェア標準値を有するＡＳＡアルゴリズムを使用した。確定最適化のために、ＩＯＰＴアルゴリズムを使用した。分画データは、ＡＫＴＡシステムによって測定された絶対ＵＶシグナルのパーセントとしてインポートした。実験データとシミュレーションとの時間的対応は、塩の実験データとシミュレーションデータとを相関させることによって確認した。パラメータ推定の限界は、以前の結果に基づいて選択され、最適化関数が境界に近い値を計算したときに適合され得る。モデルパラメータを、ソフトウェアの推定機能を使用して決定した。それぞれのプーリング基準で最適化関数を使用してプール分析測定値を検討した。異なるＡＫＴＡシステムによる分散への影響を、異なる長さを有するカラムの前に連続撹拌タンク反応器を加えることによって検討した。サンプリング機能を使用して１０００の集団サイズでラテン超方格サンプリングを実施した。すべての計算は、他のソフトウェアパッケージ、例えばＣＡＤＥＴで実施することもできる。
他の場合では、モデル特異的なタンパク質パラメータを文献から直接取得し、例えばクロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアの構成ファイルに格納することができる。
例えばＧＵＩを介して、および／または構成ファイルを介して、またはさらなるデータソースを介して、クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアにすべての入力パラメータを提供した後、クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアは、工程１０８において、クロマトグラフィーカラムから第１の標的タンパク質を溶出するように適合された溶出緩衝液の塩濃度を計算する。
特に、本発明の実施形態によれば、溶出緩衝液の塩濃度の計算は、複数の候補溶出緩衝液の塩濃度のそれぞれについての関数として、１種以上の標的タンパク質の量および／または純度を計算することと、候補溶出塩濃度のそれぞれについて計算された１種以上の標的タンパク質の量および／または純度をそれぞれの候補溶出塩濃度と関連付けて出力することと、１種以上の標的タンパク質の量および／または純度が工程１０６で入力された１種以上の標的タンパク質の所望の量および／または純度と最もよく合致する候補溶出塩濃度のうちの１つの選択をユーザからまたはソフトウェアの機能から受け取ることとを含み得る。
クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアは、塩濃度を、少なくとも以下を含むパラメータ値のセットの関数として計算するように構成される：溶出緩衝液の所定のｐＨ値、提供されるカチオン交換クロマトグラフィーカラムの寸法、適用されるタンパク質（Ｐ１～Ｐ６）の投入量、および適用されるタンパク質溶液のタンパク質の化学的特性。上述したように、これらのパラメータ値は、ＧＵＩを介して、および／または構成ファイルを介して、または他のデータソースを介して提供することができる。
所望の絶対量または相対量および／または純度で第１および／または第２の標的タンパク質を含む溶出標的体積を得るのに（最も）適した溶出塩濃度を計算した後、クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアは、工程１１０において、少なくとも計算された塩濃度および第１の標的タンパク質の入力された所望の量の関数として、所望の量および／または所望の純度で１種以上の標的タンパク質を含む標的溶出体積のプーリング境界を計算する。好ましくは、クロマトグラフィー・シミュレーション・プログラムは、多くの異なる候補溶出塩濃度について得られたタンパク質の量および純度に基づいて最適な溶出塩濃度を計算する場合、および／または工程１０８で得られた溶出塩濃度に基づいて標的溶出体積を計算する場合に、１つ以上のクロマトグラフィーモデルを使用する。
次に工程１１２において、自動または半自動クロマトグラフィーシステムに含まれるポンプは、ｐＨ値がクロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアに入力されたｐＨ値と同一であり、塩濃度が工程１０８で計算された塩濃度と同一である溶出緩衝液を適用する。
一例によれば、「溶出緩衝液Ａ」は、計算された塩濃度に従って調製され、緩衝液は０．０４ｍｏｌ／Ｌ酢酸Ｎａからなる。
別の例によれば、「溶出緩衝液Ｂ」は、計算された塩濃度に従って調製され、緩衝液は１ｍｏｌ／Ｌ酢酸Ｎａ溶液からなる。緩衝液は、例えば３０％酢酸（Ｍｅｒｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＧｍｂＨ）および酢酸Ｎａ＊３Ｈ２０（Ｍｅｒｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＧｍｂＨ）を用いて調製することができ、ｐＨ値は５．３０および５．７０である。
クロマトグラフィーは、工程１１４において、溶出緩衝液をカラムに連続的に適用し、クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアによってプーリング境界を予測するために使用された速度で溶出緩衝液をカラムに圧送することによって実施される。多くの場合、開始プーリング境界に達するまでに適用する必要がある溶出緩衝液の体積は、クロマトグラフィーカラムの体積の何倍でもある。
次いで、工程１１６において、ヒトユーザまたは自動もしくは半自動クロマトグラフィーシステムは、工程１１０で計算されたプーリング境界を使用して、計算された標的溶出体積を別個の画分として収集する。例えば、空の容器を保持するロボットアームは、計算された標的溶出体積の開始プーリング境界でカラムを出る溶出液の収集を開始するように容器をカラムの出口の下に移動させ、停止プーリング境界に達するときに溶出液の収集が停止するように容器を出口から取り外すように構成され得る。容器に収集された溶出液は、所望の量および／または純度で１種以上の標的タンパク質を含む標的溶出体積である。
いくつかの実施形態によれば、工程１０４～１１０は、タンパク質溶液が実際にカラムに適用される前に実施される。この場合、１つ以上の任意の工程を実施することが可能である。例えば、タンパク質溶液が試料に実際に適用される前にｐＨおよび導電率の読み取り値が安定するまで、カラム２３０を工程１１２で使用される溶出緩衝液で平衡化することができる。例えば、カラムの平衡化は、実際のタンパク質溶液が適用される前に平衡化目的で適用される３～５カラム体積の溶出緩衝液を必要とし得る。
図２は、クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェア２０４およびカチオン・クロマトグラフィー・カラム２３０を備えたコンピュータシステム２００を含むクロマトグラフィーシステムを示す。図２に示す実施形態では、クロマトグラフィーシステムは、第１の標的タンパク質Ｐ１および第２の標的タンパク質Ｐ２を選択的に得るために使用される。標的タンパク質は、この図に示される適用シナリオにおいて非標的タンパク質である追加のタンパク質Ｐ３～Ｐ６を含むタンパク質溶液２０２に含まれる。タンパク質溶液をカラムに適用する前に、タンパク質溶液２０２中の各タンパク質Ｐ１～Ｐ６の濃度を決定する。さらに、個々のタンパク質Ｐ１～Ｐ６のいくつかの化学的特性は、文献から導出されるか、または実験的に決定される。
クロマトグラフィー・シミュレーション・プログラム２０４は、ユーザが、例えば入力フィールド２１４を介して、所望の最適化基準、例えば第１および第２の標的タンパク質Ｐ１、Ｐ２の量および／もしくは所望の純度、または量および純度の微分値を指定することを可能にするＧＵＩ２１２を含む。さらに、ＧＵＩは、ユーザがタンパク質溶液２０２に含まれるタンパク質Ｐ２～Ｐ６のそれぞれの性質および量を指定し、カラム２３０の寸法ならびに溶出緩衝液のｐＨ、タンパク質Ｐ１～Ｐ６のそれぞれの化学的特性、クロマトグラフィーをシミュレートするために使用される予測モデルの種類などの追加のパラメータ値を指定することを可能にする１つ以上の追加のデータ入力フィールド２１５、２１６を備える。
クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアは、クロマトグラフィープロセスの１つ以上の態様をモデル化するように構成された複数の予測モデル２０６～２１０を含むことができる。シミュレーションソフトウェア２０４またはクロマトグラフィー・シミュレーション・モデル２０６～２１０によって使用されるパラメータのいくつかは、構成ファイル２２０で指定することができる。
クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェア２０４は、所望の量および／または純度で標的溶出体積内に標的タンパク質Ｐ１、Ｐ２を得るのに最も適した溶出緩衝液の塩濃度２２２を予測するように構成される。例えば、シミュレーションソフトウェア２０４は、複数の異なる候補溶出緩衝液の塩濃度のそれぞれについて、タンパク質溶液に含まれる各タンパク質の予想溶出曲線をシミュレートするように構成され得、これは全溶出プロセス中の各タンパク質の量および純度プロファイルを暗黙的に提供する。シミュレーションは、クロマトグラフィープロセスの異なる態様をそれぞれ説明する複数の異なるモデルの組合せに基づくことができる。これらのシミュレーションに基づいて、ユーザまたはソフトウェア機能は、所望の量および／または純度で標的タンパク質Ｐ１を溶出するのに最も適した候補溶出緩衝液の塩濃度の１つを選択することができる。
一実施形態によれば、計算された溶出塩濃度２２２は、ＧＵＩ２１２、２１８を介してユーザに出力され、ユーザは、シミュレーションソフトウェアに入力されたｐＨおよびソフトウェア２０４によって出力された塩濃度２２２を有する溶出緩衝液２２６を創出する。さらに、ＧＵＩは、所望の量および／または純度で標的タンパク質を含むと予測された標的溶出体積のプーリング境界２２４を出力することができる。
溶出緩衝液の塩濃度は、カラムに適用されるタンパク質Ｐ１～Ｐ６のそれぞれの量に対して特異的に計算されたので、溶出緩衝液２２６は、標的タンパク質Ｐ１、Ｐ２を他のすべてのタンパク質から分離するのに特に適している。したがって、溶出緩衝液は、「標準の」／「１つですべてに適合する」溶出緩衝液ではなく、むしろタンパク質溶液に含まれるタンパク質の種類および量に特に適合した溶出緩衝液である。出願人は、溶出塩濃度を、それぞれの個々の場合で、カラムに適用されるタンパク質の性質および量（これもまた細胞培養抽出物および予備精製手順の様々な態様に依存し得る）に適合させることにより、異なるタンパク質を分離するクロマトグラフィーカラム２３２の能力が大幅に増加し得ることを観察した。
ユーザは、まずカラム２３０にタンパク質溶液２０２を適用し、次いで溶出緩衝液２２６を適用する。溶出緩衝液２２６およびタンパク質溶液２０２は、カラム２３０を通ってしみ出す。それにより、様々なタンパク質Ｐ１～Ｐ６の分子は、それらの化学的特性に応じてカラム２３０の固定相２２８と相互作用する。タンパク質分子と固定相および溶出緩衝液との相互作用は、それらの溶出プロファイル、すなわち所与の時間でカラムを出るそれぞれのタンパク質の量を決定する。カラムの出口２３８を出る溶出液を収集するために使用される容器２３２、２３４、２３６を変更することによって、溶出液の異なる画分２３８、２４０を得ることができる。好ましい実施形態によれば、容器の交換は、所望の量および／または純度で標的タンパク質を含むと予測される標的溶出体積が同じ容器内に収集されるようなコーディネートである。これは、予測された標的溶出体積のプーリング境界が、収集物がカラムの出口の下に配置され、その下から除去される時間を決定することを意味する。
タンパク質溶液の体積は、適用される溶出緩衝液の体積よりもはるかに小さいため、多くのクロマトグラフィー・シミュレーション・モデルでは無視される。
いくつかの実施形態では、溶出緩衝液２２６は、実際には、同じｐＨ値を有するが異なる塩濃度を有する一連の２つ以上の異なる溶出緩衝液である。これらの異なる溶出緩衝液は、「溶出ステップ」とも呼ばれる。例えば、クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアは、異なる溶出ステップに最も適した塩濃度を計算するように構成することができる。
図３は、さらなるクロマトグラフィーシステムを示す。図３に示すクロマトグラフィーシステムは、図２に示すものと同じとすることができ、ソフトウェア２０４は、所望の量の単一の標的タンパク質を得るためではなく、むしろ所望の比の２種の標的タンパク質Ｐ１、Ｐ２を得るために使用される。
図３に示すシステムの構成要素および特徴は、基本的に、図２に示すシステムの構成要素および特徴に対応する。したがって、図２の説明においてこれらの特徴に関して提供される説明は繰り返されない。
図２に示すＧＵＩとは対照的に、シミュレーションソフトウェア２０４によって生成され、図３に示すＧＵＩ２１２は、ユーザがデータ入力フィールド３０４を介して２種の標的タンパク質Ｐ１、Ｐ２の所望の相対量を指定することを可能にする。任意に、ユーザは、標的タンパク質Ｐ１、Ｐ２のそれぞれに必要な最小純度レベルを指定してもよい。所望の比、および任意に所望の純度で２種の標的タンパク質を含む標的溶出体積を提供するのに最も適した溶出緩衝液の塩濃度２２２の計算は、複数の異なる候補溶出緩衝液の塩濃度に基づいて複数のクロマトグラフィープロセスをシミュレートすることと、標的溶出体積中の２種の標的タンパク質の相対量および任意に純度も決定することと、所望の相対量および純度でＰ１およびＰ２を含む標的溶出体積を提供するのに最も適した候補溶出緩衝液の塩濃度の１つを出力することとを含む。各シミュレーションは、所与の候補溶出緩衝液の塩濃度に基づいてタンパク質Ｐ１～Ｐ６のそれぞれの溶出プロファイルを予測することと、次いで、タンパク質含量が相対的な標的タンパク質の量および純度に関してユーザ定義の要件を満たす標的溶出体積のプーリング境界を決定するためにタンパク質Ｐ１～Ｐ６のそれぞれの溶出プロファイルを分析することとを含み得る。
図４Ａは、ユーザがクロマトグラフィープロセスの異なる態様について複数の異なるクロマトグラフィープロセスのシミュレーションモデルを選択することを可能にするＧＵＩ４００を示す。図４Ｂは、それぞれのモデルによってシミュレートされたクロマトグラフィープロセスの態様を示す。
例えば、ＧＵＩは、ユーザが複数の代替的なカラムモデルからモデル「輸送分散型」を選択することを可能にする。「カラムモデル」は、本明細書で使用される場合、カラムの間隙体積における溶出緩衝液中の各タンパク質の濃度、塩濃度およびｐＨ値の相互関係を記述するモデルである。
ＧＵＩ４００はさらに、ユーザが複数の代替的な細孔モデルからモデル「集中速度」を選択することを可能にする。「細孔モデル」は、本明細書で使用される場合、カラムの固定相２２８の細孔体積における溶出緩衝液中の各タンパク質の濃度、塩濃度およびｐＨ値の相互関係を記述するものである。
ＧＵＩ４００はさらに、ユーザが「等温線モデル」とも呼ばれる複数の代替的な反応モデルからモデル「ＩＥＣ２０１５」を選択することを可能にする。「反応モデル」は、本明細書で使用される場合、固定相２２８の各タンパク質の濃度、溶出緩衝液の塩濃度、およびタンパク質溶液中の各タンパク質の化学的特性のうちの少なくともいくつかの相互関係を記述するものである。
様々なモデルを文献から導出することができ、および／または実験的に決定されるタンパク質特異的なモデルパラメータに基づくことができる。
図４Ｃは、本発明の一実施形態によるＧＵＩ４００を介して選択することができる各モデルタイプの背後にある数学的概念をより詳細に示す。しかしながら、代替的なモデルが公表されており、図４Ｂに示すモデルの少なくともいくつかが将来適合され、改善され得る可能性がある。したがって、本発明は、例示を目的として本明細書に記載されている、いかなる特定のモデルまたは数式にも限定されない。
図４Ｄは、クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェア２０４によって生成され、ユーザがクロマトグラフィーカラム２３０およびそこに含まれる固定相２２８の詳細を指定することを可能にするグラフィカル・ユーザ・インターフェース４０２を示す。例えば、ユーザは、カラム２３０の長さおよび体積、ならびに固定相２２８の間隙カラム空隙率、軸方向分散、ビーズ半径およびビーズ空隙率を指定することができる。クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェア２０４によって生成されるさらなるグラフィカル・ユーザ・インターフェース４０４は、ユーザがモデル特異的な化学的特性、例えば、固定相のイオン容量（リガンド密度に対応する）、カルボキシル基、ヒスチジン基、アミノ基などの酸解離定数を指定することを可能にする。ＧＵＩのデータ入力フィールドは、ＧＵＩ４００を介してユーザによって選択されるモデルの種類に依存し得る。
図４Ｅは、ユーザが溶出緩衝液の塩の種類、溶出緩衝液のｐＨ値、タンパク質溶液に含まれるタンパク質の数および種類、ならびに１種以上のタンパク質に特異的な所望の絶対量または相対量、所望の純度レベルおよびモデル特異的またはモデル非依存的な化学的特性値を指定することを可能にするＧＵＩ４０６を示す。
図５Ａは、カラムに適用されたタンパク質溶液に含まれる複数のタンパク質Ｐ１、Ｐ２およびＰ３のシミュレートされた溶出プロファイルを示す溶出プロット５００である。タンパク質Ｐ１、Ｐ２およびＰ３は、例えば、図７Ａ～図７Ｄを参照してより詳細に記載されるタンパク質Ｐ１、Ｐ２およびＰ３であり得る。
タンパク質Ｐ１は、標的タンパク質として提供され、ユーザは、Ｐ１が所定の濃度および所定の純度で得られるべきであると指定している。他のタンパク質Ｐ２およびＰ３は、非標的タンパク質である。これは、Ｐ１の十分な純度を確保するために、Ｐ２およびＰ３が望ましくない汚染物質と見なされ、その濃度が可能な限り低くなければならないことを意味する。
プロット５００は、プロット５００を提供するシミュレーションで使用された候補溶出塩濃度を示す曲線５０２を含む。プロットから導出することができるように、候補溶出緩衝液は、実際には、異なる塩濃度を有する一連の複数の異なる候補溶出緩衝液である（「溶出ステップ」）。溶出緩衝液の塩濃度が０．３５ｍｏｌ／ｌを超えて上昇するとすぐに、標的タンパク質Ｐ１および非標的タンパク質Ｐ２がカラムから離れ始め、溶出液中で観察可能になる。これは、タンパク質Ｐ１に対する溶出プロファイル５０８およびタンパク質Ｐ２に対する溶出プロファイル５０６のそれぞれから導出することができる。塩濃度が０．９ｍｏｌ／ｌを超えて上昇すると、溶出プロファイル５０４から導出可能なように、Ｐ３も溶出される。
クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアは、それぞれのステップにおける候補溶出塩濃度のそれぞれについて溶出プロファイル５０４～５０８をシミュレート（予測）し、タンパク質含有量が標的タンパク質の量および純度に関するユーザ定義の要件を満たす溶出体積を含むプーリング境界を決定するように構成される。決定されたプーリング境界を、点線５１２、５１４によって示す。２本の線は、タンパク質Ｐ１のピークを含む標的溶出体積を規定する。標的溶出体積はまた、いくらかの量のタンパク質Ｐ２を含む。しかしながら、プーリング境界５１４で溶出液の収集を停止することにより、標的溶出体積中のＰ１の純度がユーザ定義の純度要件を満たすことを確実にすることができ、これは、この時点の後、標的溶出体積中に含まれる非標的タンパク質Ｐ２の相対量が増加するためである。
図５Ａに示すプロットは、単一の標的タンパク質Ｐ１に関する最適化基準を参照して記載された。しかしながら、他の使用事例シナリオでは、タンパク質Ｐ２も標的タンパク質と見なすことができ（例えば、図６Ａを参照）、最適化基準は、２種の標的タンパク質Ｐ１、Ｐ２の量および／または純度に関連する基準であり得、一方、Ｐ３のみが汚染物質と見なされる。この場合、プーリング境界は新しい最適化基準に適合される。
図５Ｂは、複数の異なる候補溶出塩濃度が与えられた場合の第１のタンパク質溶液中の標的タンパク質Ｐ１の収率および純度ならびに組み合わされた純度－収率－目的パラメータの予測結果を示す。「純度」は、候補塩濃度が与えられた場合の標的溶出体積中のＰ１の予測純度を示す。「収率」は、候補塩濃度が与えられた場合の標的溶出体積中の標的タンパク質Ｐ１の予測量を示す。「目的」は、Ｐ１の予測量と純度との組合せから導出される集計値である。例えば、図５Ｂに示す「目的」は、以下のように計算される「複合目的」である。
単一目的ＳＯ＝Ｆ×（目的）Ｐｏｗｅｒ＋Ａ、式中、Ｆ（「係数」）は数値、ＰＯＷＥＲは数値、Ａ（「加数」）も数値である。
複合目的は、乗算または加算によって単一の目的を組み合わせることによって生成することができる。
例えば、以下のパラメータを選択することができる：ＰＯＷＥＲ＝１、Ｆ＝１およびＡ＝０。しかしながら、これらのパラメータのそれぞれは異なる値を有してもよい。
溶出緩衝液の塩濃度０．３４２５４４について反復１０で計算された目的ＳＯ１は、標的溶出体積中のタンパク質Ｐ１の予測純度であり、溶出プール体積は１３５ｍＬで開始し、１４７ｍＬで終了する。予測純度ＳＯ１は値０．７５１８３２を有する。目的ＳＯ２は、溶出緩衝液の塩濃度０．３４２５４４について反復１０で計算されたタンパク質Ｐ１の収率である。予測収率ＳＯ２は、値０．８３６７３４を有する。
複合目的ＣＯ１は、ＳＯ１およびＳＯ２を集計することによって、例えばＳＯ１＋ＳＯ２を計算することによって計算することができる。別の例によれば、複合目的ＣＯ２は、ＳＯ１×ＳＯ２として計算される。
結果は表５１０の形態で提示される。表の第１の列（「反復」）は、それぞれのクロマトグラフィーシミュレーションの基礎として使用される候補溶出緩衝液の塩濃度の識別子または候補溶出緩衝液の塩濃度のセット（複数のステップの場合）を含む。さらなる列（「塩濃度」）は、特定の溶出ステップで使用される候補溶出緩衝液の塩濃度を示す。さらなる列（「純度タンパク質１」）は、所与の候補溶出緩衝液の塩濃度について予測された純度値を示す。さらなる列（「収率タンパク質１」）は、所与の候補溶出緩衝液の塩濃度について予測されたタンパク質Ｐ１の量（例えば濃度）を示す。さらなる列（「目的」）は、最適化（ここでは、最小化）されるべきであり、標的タンパク質Ｐ１の予測純度および予測収率の関数として計算される目的を示す。
表５１０の各行は、１つの候補溶出緩衝液の塩濃度およびそれぞれの予測に対応する。表５１０の行は目的値に従ってソートされ、最適な（ここでは、最小の）目的を有する、つまり最も高い純度および収率を有する行が表の最初の行として現れる。この図に示す例では、「純度」または「収率」の数値が可能な限り低いことが、純度または収率が可能な限り高いことを意味する。これは、「反復」番号２３のシミュレーションの候補溶出緩衝液の塩濃度０．３４５が、所与のタンパク質溶液に対して最適塩濃度であると考えられることを意味する。結果として、「現実の」溶出に実際に使用される溶出緩衝液は、０．３４５の塩濃度を有するように選択される。ある単独の値がより高いシミュレーション、例えば反復１０もある。ここでは、純度は反復２３よりも高いが、収率はより低い。純度と収率との間の最良の妥協点（パレート（Ｐａｒｅｔｏ）の法則）は、反復２３である。
図５Ｃは、複数の異なる候補溶出塩濃度が与えられた場合の第１のタンパク質溶液中の標的タンパク質の組み合わされた純度／収率－目的パラメータの予測結果のプロット５１８を示す。曲線５２０は、図５Ｂを参照して記載した純度／収率から導出される目的を表す。したがって、図５Ｃのプロット５１８は、複数の異なる候補溶出緩衝液の塩濃度およびそれぞれのシミュレーションに基づいて得られた純度－収率目的を、表５１０の列ではなく曲線の形態で示す。データポイント５１６は、反復２３でこの目的の最小値が得られ、この特定のシミュレーション＃２３に使用された候補溶出緩衝液の塩濃度が、標的溶出体積を得るための実際の溶出緩衝液の塩濃度として使用されるべきであることを示す。プロット５Ａのプーリング境界５１２、５１４によって区切られた溶出標的体積に対応する溶出緩衝液ステップの溶出緩衝液の塩濃度は、番号＃２３を有するシミュレーションで予測された最適塩濃度に対応する。
図６Ａは、第２のタンパク質溶液について得られた溶出プロット６００である。第２のタンパク質溶液はまた、３種のタンパク質Ｐ１、Ｐ２およびＰ３を含む。タンパク質Ｐ１、Ｐ２およびＰ３は、例えば、図７Ａ～図７Ｄを参照してより詳細に記載されるタンパク質Ｐ１、Ｐ２およびＰ３であり得る。
図５Ａに記載される状況とは対照的に、タンパク質Ｐ１およびＰ２の両方が標的タンパク質であると考えられる。ユーザは、５５：４５の比でタンパク質Ｐ１およびＰ２を得ることに関心があることをグラフィカル・ユーザ・インターフェースを介して指定する。さらに、得られる標的溶出体積は可能な限り純粋であるべきであり、これは標的溶出体積がＰ３および任意の他のタンパク質を可能な限り少量しか含まないべきであることを意味する。
タンパク質Ｐ１のシミュレートされた溶出プロファイルは曲線６０８として示され、タンパク質Ｐ２のシミュレートされた溶出プロファイルは曲線６０６として示され、タンパク質Ｐ３のシミュレートされた溶出プロファイルは曲線６０４として示され、溶出緩衝液の塩濃度ステップは曲線６０２として示される。２種の標的タンパク質Ｐ１およびＰ２の量および純度、ならびに複数の異なる候補溶出緩衝液の濃度のそれぞれについての量および純度から導出される目的のシミュレーションは、複数のステップのそれぞれについて最適な溶出緩衝液の塩濃度を明らかにし、所望の相対量で第１および第２の標的タンパク質Ｐ１、Ｐ２を含み、指定された純度要件を満たす標的溶出体積を規定するプーリング境界６１２、６１４を明らかにする。さらに、プロット６００は、予測されたタンパク質ピークを溶出プロセス中に経験的に得られた総タンパク質ピークと比較するために使用することができるタンパク質の総量を示すシミュレートされた合計シグナル６１０を含む。
図６Ｂは、複数の異なる候補溶出塩濃度が与えられた場合の第２のタンパク質溶液中の標的タンパク質Ｐ１およびＰ２の収率および純度ならびに組み合わされた純度－収率－目的パラメータの予測結果を示す。「純度」は、各候補溶出緩衝液の塩濃度について予測される標的溶出体積中のそれぞれの標的タンパク質Ｐ１、Ｐ２の純度を示す。
結果は表６１７の形態で提示される。表の第１の列（「反復」）は、それぞれのクロマトグラフィーシミュレーションの基礎として使用される候補溶出緩衝液の塩濃度の識別子または候補溶出緩衝液の塩濃度のセット（複数のステップの場合）を含む。さらなる列（「塩濃度」）は、特定の溶出ステップで使用される候補溶出緩衝液の塩濃度を示す。さらなる列（「純度タンパク質１」、「純度タンパク質２」）は、所与の候補溶出緩衝液の塩濃度についてタンパク質Ｐ１、Ｐ２のそれぞれについて予測された純度値を示す。さらなる列（「目的」）は、最適化（ここでは、最小化）されるべきであり、標的タンパク質Ｐ１およびＰ２の予測純度および予測相対量の関数として計算される目的を示す。
「目的」（「複合目的」とも呼ばれる）は、例えば、Ｐ１およびＰ２の予測相対量とＰ１およびＰ２の所望の純度レベルとの組合せから導出される集約値であり得る。例えば、「目標」ＣＯは、２つの単一の目標ＳＯ１、ＳＯ２から、２つの単一の目標を加算または乗算することによって計算することができる。例えば、ＣＯは、ＣＯ＝ＳＯ１＋ＳＯ２またはＣＯ＝ＳＯ１×ＳＯ２として計算することができる。
それにより、ＳＯ１は、所与の候補溶出緩衝液の塩濃度、例えば１：０．５５について予測された標的溶出体積中のＰ１の純度であり、溶出標的体積は１１２ｍＬで開始し、１２７ｍＬで終了すると予測されている。ＳＯ２は２：０．４５であり、これは溶出標的体積中のＰ２の所望の純度であり、溶出標的体積は１１２ｍＬで開始し、１２７ｍＬで終了すると予測されている。
任意に、計算された目的ＣＯと標的値との間の誤差は、目的値と標的値との間の点ごとの二乗偏差を計算する「基準比較」コスト関数を使用して計算することができる。
表６１７の各行は、１つの候補溶出緩衝液の塩濃度およびそれぞれの予測に対応する。表６１７の行は目的値に従ってソートされ、最適な（ここでは、最小の）目的を有する、つまり最も高い純度および最良一致のＰ１：Ｐ２比を有する行が表の最初の行として現れる。「目的」パラメータの値が可能な限り小さいことは、単一の目的と対応する標的値との間の差が可能な限り小さいことを意味する。これは、「反復」番号３５のシミュレーションの候補溶出緩衝液の塩濃度０．３８８が、所与のタンパク質溶液に対して最適塩濃度であると考えられることを意味する。結果として、「現実の」溶出に実際に使用される溶出緩衝液は、０．３８８の塩濃度を有するように選択される。
図６Ｃは、複数の異なる候補溶出塩濃度が与えられた場合の第１のタンパク質溶液中の標的タンパク質の組み合わされた純度／収率－目的パラメータの予測結果のプロット６１８を示す。曲線６２０は、図６Ｂを参照して記載した純度／収率から導出される目的を表す。したがって、図６Ｃのプロット６１８は、複数の異なる候補溶出緩衝液の塩濃度およびそれぞれのシミュレーションに基づいて得られた純度－収率目的を、表６１７の列ではなく曲線の形態で示す。データポイント６１６は、反復３５でこの目的の最小値が得られ、この特定のシミュレーション＃３５に使用された候補溶出緩衝液の塩濃度が実際の溶出緩衝液の塩濃度として使用されるべきであることを示す。プロット６Ａのプーリング境界６１２、６１４によって区切られた溶出標的体積に対応する溶出緩衝液ステップの溶出緩衝液の塩濃度は、番号＃３５を有するシミュレーションで予測された最適塩濃度に対応する。
図６Ｄは、第２のタンパク質溶液について得られたＰ１およびＰ２の予測されたタンパク質比と測定されたタンパク質比との比較を示す。プーリング境界６１２、６１４によって区切られた標的溶出体積中のタンパク質Ｐ１の予測濃度は、シミュレーション＃３５で使用された０．３８８ｍｏｌ／リットルの候補溶出緩衝液の濃度に基づいて５１％と予測される。塩濃度０．３８８ｍｏｌ／リットルを有する溶出緩衝液で溶出を実施する場合、標的溶出体積中のＰ１の経験的に測定された濃度は５６％である。同様に、標的溶出体積中のタンパク質Ｐ２の予測濃度は４９％である。標的溶出体積中のＰ２の経験的に測定された濃度は４４％である。したがって、予測されるプーリング境界によって規定される標的溶出体積中の予測濃度の精度は非常に高い。
図６Ｅは、タンパク質Ｐ１、Ｐ２およびＰ３の経験的に得られた分解能を示す。プロット６２４は、それぞれのタンパク質Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３の溶出によって誘導される光学的ピーク６２６、６２８、６３０を示す。プロットから推測できるように、Ｐ１とＰ２のピークは大きく重なり合う。４５ｇ／リットルのタンパク質負荷で４０カラム体積の勾配での２種のタンパク質Ｐ１、Ｐ２の分解能Ｒは約０．４３、すなわち非常に低いことが観察された。本発明の実施形態は、２種以上のタンパク質が低い分解能値を有する場合であっても、２種以上のタンパク質を所望の比で得るために使用することができ、最初に２種のタンパク質を分離し、次いで所望の比でタンパク質を再結合する必要はない。
図７は、２種の標的タンパク質Ｐ１、Ｐ２、および望ましくない汚染と見なされるさらなるタンパク質Ｐ３の例を示す。
図７Ａは、本明細書で「Ｇａｎｔ」と呼ばれる抗体に連結された「ＢＳＭ」と呼ばれる脳シャトル分子からなるタンパク質７００「ｂｓＧａｎｔ」の図を示す。脳シャトル分子は、脳への抗体などの大きな分子の浸透を増加させることができる分子である。脳への大きな分子のアクセスは、血液脳関門（ＢＢＢ）、すなわち脳に入ることができる分子を慎重にフィルタにかける血液と脳組織との間のゲートキーパによって制限される。本出願人によって操作されたいくつかの抗体は、その表面に位置するタンパク質受容体の１つに結合することによって血液脳関門を通過することができる。脳シャトル分子は、血液脳関門を通過するそれらの固有の能力にかかわらず、潜在的に１つ以上の治療用分子を脳に輸送することができる。ｂｓＧａｎｔタンパク質は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願ＷＯ２０１７／０５５５４０に詳細に記載されている。
「ｂｓＧａｎｔ」抗体は、単量体免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）Ｆｃ融合タンパク質である。「ｂｓＧａｎｔ」抗体を産生するために使用される細胞培養物は、Ｆａｂグリコシル化の程度が異なる３種の異なるバリアントとしてこの抗体を産生する。Ｆａｂグリコシル化は完全ではなく、非グリコシル化抗体、モノグリコシル化抗体およびジグリコシル化抗体の混合物をもたらす。
実施形態によれば、１種以上の標的タンパク質は（上記で定義したような）単量体ｂｓＧａｎｔタンパク質の異なるグリコフォームである。
一例によれば、１種以上の標的タンパク質は、特許出願ＷＯ２０１７／０５５５４０に記載されているｂｓＧａｎｔ「抗体００１５」の異なるグリコフォームである。この抗体は、配列番号０１のアミノ酸配列を有する軽鎖と、配列番号０２のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号０３のアミノ酸配列を有する軽鎖と、ＷＯ２０１７／０５５５４０に開示された配列番号０４のアミノ酸配列を含む抗体Ｆａｂ断片とを含む二重特異性抗体である。配列番号０１は、Ｎ末端ｆａｂの非ドメイン交換軽鎖に対応する２１５ａａ残基ポリペプチドに関し、配列番号０２は、２つの重鎖に対応する４５５ａａ残基ポリペプチドであり、配列番号０３は、追加のＣ末端ｆａｂ断片のドメイン交換軽鎖ｆａｂ断片に対応する２１５ａａ残基ポリペプチドであり、配列番号０４は、追加のＣ末端ｆａｂ断片のドメイン交換重鎖ｆａｂ断片に対応する２２９ａａ残基断片である。
図７Ｂは、本明細書で「タンパク質Ｐ１」とも呼ばれるジグリコシル化抗体バリアントを示す。
図７Ｃは、本明細書で「タンパク質Ｐ２」とも呼ばれるモノグリコシル化抗体バリアントを示す。
図７Ｄは、本明細書で「タンパク質Ｐ３」とも呼ばれる非グリコシル化抗体バリアントを示す。
３種のバリアントの密接する溶出条件は、所望の抗体バリアントを分離および／またはさらに精製するために使用されるクロマトグラフィープロトコルに特有の課題を課す。
抗体のＦｃ領域におけるグリコシル化パターンの違いは、立体配座、薬物動態および結合特性に違いをもたらし得る。Ｆａｂ領域のグリコシル化は、リガンド結合強度および組織浸透に影響を及ぼし得る。したがって、グリコシル化パターンは、医療分野で使用される複数の抗体にとって特に興味深い。グリコシル化パターンは、発現ベクター、細胞株、細胞培養モード、ならびに細胞培養条件、精製プロセスおよび他の因子に依存し得る。グリコシル化バリアントは電荷がわずかしか異ならない場合があるため、イオン交換樹脂を使用する分離は可能であるが、溶出条件を最適化する必要がある。
出願人は、クロマトグラフィーカラムに適用されるタンパク質負荷密度が、プロダクトプール組成に影響を及ぼすさらなる重要なプロセスパラメータであることを観察した。本発明の実施形態は、薬学的に特に有効な、所望の比の抗体バリアント、例えば５５：４５のＰ１：Ｐ２の比を得ることを可能にし得る。
３種のタンパク質Ｐ１、Ｐ２およびＰ３を含むタンパク質溶液を分離する課題は、プロダクトプール（「標的溶出体積」）が約５５％：４５％のＰ１とＰ２との比を含有すべきであることである。この分離の収率は、タンパク質溶液が５０％を超えるＰ２を含有するので、この相対量基準のために制限される（表１を参照）。この場合のタンパク質Ｐ３は、プロダクト特異的な不純物、すなわちグリコシル化されていないタンパク質７００タンパク質である。
出願人は、カラムに適用されるタンパク質溶液中のタンパク質Ｐ１、Ｐ２およびＰ３の相対量および絶対量が場合によって大きく異なる可能性があり、このことは、特定のタンパク質調製ではうまく機能したクロマトグラフィープロトコルがこれらの３種のタンパク質バリアントの異なる調製ではタンパク質を分離することができない可能性があるとして、さらなる課題を課す可能性があることを観察した。
例えば、３種のタンパク質Ｐ１、Ｐ２およびＰ３を選択的に含むタンパク質溶液は、３種のグリコシル化バリアントでタンパク質７００を産生するように遺伝子的に操作された細胞培養物を回収することによって得ることができる。すべてのグリコフォームを、負荷前に平衡化したプロテインＡ樹脂で捕捉した。未処理のタンパク質抽出物の負荷密度は、樹脂１リットル当たりタンパク質２３ｇであった。抗体を溶出し、ウイルス不活化工程後、溶出液のｐＨを再び上昇させ、溶液を４℃で一晩インキュベートし、０．２μｍの滅菌フィルタで濾過した。濾過したプロテインＡ溶出液を負荷物質として混合モードクロマトグラフィー樹脂に使用した。タンパク質不純物を除去するために、混合モードクロマトグラフィー樹脂を使用した。負荷前にカラムを平衡化した。負荷密度は、樹脂１リットル当たり２５ｇのタンパク質であり、流量は１５０ｃｍ／時間であった。その後、フロースルー溶出液のｐＨを低下させ、プールを０．２μｍ滅菌フィルタで濾過した。
この手法を６つの異なる細胞培養抽出物で複数回繰り返し、カチオンカラムに適用されるそれぞれに得られたタンパク質溶液を以下の「表１」に要約する。
シングルグリコシル化バリアントを単離するために、ＰｏｒｏｓＸＳプールを水で希釈し、高タンパク質負荷密度で結合および溶出モードにてＰｏｒｏｓＸＳ樹脂を使用して再処理した。カラムを３７６ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．５で平衡化し、負荷密度は樹脂１リットル当たり８０ｇであった。フロースルーを分画し、分析した。フロースルーの開始時の画分は、純度９８．０％のバリアント１を含有した（タンパク質溶液４）。バリアント２および３を溶出するために、６．２５ＣＶで３７６ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．５から６１６ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．５までの勾配を使用した。溶出ピークは、純度９７．６％のバリアント２（タンパク質溶液５）および純度９６．５％のバリアント３（タンパク質溶液６）を含有した。
グリコシル化バリアント分析は、分析用カチオン交換クロマトグラフィーカラム（Ｍｏｎｏ Ｓ ５／５０ ＧＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に１００μｇの試料を注入し、ｐＨ５．３で１ｍｌ／分の流速で塩勾配溶出させることによって実施した。事前のピーク同定は、質量分析によって行った。
モデル２０６～２１０の様々なモデルパラメータの機構モデリングに必要なシステムおよび樹脂パラメータは、Ａ．Ｏｓｂｅｒｇｈａｕｓ、Ｓ．Ｈｅｐｂｉｌｄｉｋｌｅｒ、Ｓ．Ｎａｔｈ、Ｍ．Ｈａｉｎｄｌ、Ｅ．ｖｏｎ Ｌｉｅｒｅｓ、Ｊ．Ｈｕｂｂｕｃｈ、Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｔｅｒｉｃ ｍａｓｓ ａｃｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌ－ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｗｏ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ、１２３３（２０１２）５４～６５に記載されているような異なるトレーサを用いたパルス実験によって決定した。サイズ１０００のラテン超方格サンプリングを実施して、溶出プール中の不純物プロファイルに対するプロセスパラメータ（ｐＨ値、負荷組成、溶出ステップの塩濃度）の影響を調べた。負荷密度を変化させるために、注入体積を変化させた。シミュレーションは、ＣｈｒｏｍＸを使用して、３００ｃｍ／ｈの流量で５秒のタイムステップ、３０個の軸方向セル、５ｃｍのカラム長で実施した。各ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ実験について、溶出プール中の不純物プロファイルおよび個々のタンパク質の溶出プロファイルを、固定体積を用いたプーリング決定を使用して計算した。結果を、不純物プール濃度を従属変数とし、プロセスパラメータを独立変数とする線形回帰分析を使用してＭＡＴＬＡＢで分析した。
図８Ａは、溶出標的体積中の相対タンパク質組成に対するタンパク質負荷の影響を示すプロット８０２を示す。４０％の溶出緩衝液の塩濃度を仮定すると、異なるタンパク質負荷での溶出液中のタンパク質Ｐ１の相対量が曲線８０２に示される。溶出液中のタンパク質Ｐ２の相対量を曲線８０４に示す。
図８Ｂは、溶出標的体積中の相対タンパク質組成に対する溶出緩衝液の塩濃度の影響を示すプロット８０８を示す。カラムに適用される総タンパク質負荷が４５ｇ／Ｌであると仮定すると、異なる塩濃度での溶出液中のタンパク質Ｐ１の相対量が曲線８１０に示される。溶出液中のタンパク質Ｐ２の相対量を曲線８１２に示す。本発明の実施形態は、カラムに負荷される個々のタンパク質の量および種類に特異的に適合された溶出緩衝液の塩濃度を計算的に同定することを可能にし、それにより、各タンパク質の溶出プロファイルを予測し、所望の量および所望の純度で所望のタンパク質を含む標的溶出体積を収集する能力を有意に改善する。
経験的試験は、本発明の実施形態によるクロマトグラフィー方法が、所望のプール組成、ひいては分子特徴付けおよびプロセス設計空間の定義にとって重要であり得るプロダクト品質を予測することができることを示している。
図９は、溶出緩衝液の塩濃度を適合させることによるタンパク質負荷の影響の補償を示すプロット９００である。クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアは、カラム（ｘ軸）に負荷された複数の増加するタンパク質の量のそれぞれについて、５５：４５の所望の比で２種の標的タンパク質Ｐ１、Ｐ２を含む標的溶出体積を提供することができた溶出緩衝液の塩濃度９０２を計算的に予測するために使用された。プロット９００から導出することができるように、２種の標的タンパク質Ｐ１、Ｐ２の相対量を示す予測曲線９０４、９０６は、経験的に測定された相対量９１０、９０８と基本的に同一である。予測された溶出塩濃度により、細胞培養タンパク質抽出物を調製することによって得られたタンパク質の量および予備精製工程（場合によっては著しく異なり得る）に関係なく、２種の標的タンパク質Ｐ１およびＰ２の一定の所望の比が標的溶出体積に含まれることを確実にすることができた。
出願人は、タンパク質負荷に応じて溶出緩衝液の塩濃度をシミュレーションおよび選択することにより、シミュレーション精度が大幅に向上し、多くの種類の標的タンパク質の最適化基準をサポートする塩濃度を同定できることを観察した。出願人は、タンパク質負荷密度および塩モル濃度の両方がタンパク質の溶出プロファイルに強い影響を及ぼすことを観察した。この知識を組み合わせることにより、塩濃度は、個々のタンパク質負荷密度に対して特異的に選択されるプロセス・ステアリング・パラメータとして使用することができる。タンパク質負荷密度に応じた溶出塩モル濃度の最適化はまた、一定のプロダクト品質を確保することを可能にし得る。
図１０Ａ～図１０Ｃは、２種のタンパク質Ｐ１、Ｐ２の溶出プロファイルに対する溶出緩衝液の塩濃度の影響を示す。
例えば、第１のシミュレーションは、図１０Ａに示すように、低い溶出緩衝液の塩濃度を想定することができる。溶出緩衝液は、タンパク質Ｐ１およびＰ２を完全に、および最適化基準として提供される所望のタンパク質比に従って分離することができない。両方のタンパク質はカラム洗浄（ＣＩＰ）工程で溶出する。「プーリング」段階で得られた溶出液は、基本的にタンパク質Ｐ１およびＰ２を含まない。
第２のシミュレーションは、図１０Ｂに示すように、高い溶出緩衝液の塩濃度に基づくことができる。この溶出緩衝液もまた、２種のタンパク質を完全に分離することも、２種のタンパク質を所望の比で含む溶出液を提供することもできない。プーリング段階で得られる溶出液は、タンパク質Ｐ１およびＰ２の両方を大量に含むが、所望の比率（所望の比率は１：１以外であると仮定する）では含まない。
第３のシミュレーションは、図１０Ｃに示すように、中程度の溶出緩衝液の塩濃度に基づくことができる。この溶出緩衝液は、２種のタンパク質を完全に分離する。プーリング段階で得られる溶出液は、大量のタンパク質Ｐ１を含み、基本的にタンパク質Ｐ２を含まない。
Ｐ１：Ｐ２の所望の比が例えば約１：２である場合、シミュレーションソフトウェアは、タンパク質Ｐ１およびＰ２の予測溶出プロファイルを得るために、図１０Ｂに示すものよりも低いが図１０Ｃに示すものよりも高いいくつかの異なる溶出緩衝液の塩濃度に基づいてさらなるシミュレーションを実施し、Ｐ１：Ｐ２のタンパク質比が所望の比に最もよく一致するプール溶出体積を提供する塩濃度の１つを同定するように構成することができる。
Claims (22)
- 第１の標的タンパク質（Ｐ１）および第２の標的タンパク質（Ｐ２）を含む標的溶出体積（２３８）を生成するクロマトグラフィー方法であって、
－ カチオン交換クロマトグラフィーカラム（２３０）を提供すること（１００）と；
－ 少なくとも前記第１の標的タンパク質（Ｐ１）と、前記第２の標的タンパク質（Ｐ２）と、任意に１種以上のさらなるタンパク質（Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６）とを含むタンパク質溶液（２０２）を、前記カラムに適用すること（１０２）と；
－ 前記標的溶出体積に含まれる前記第１の標的タンパク質および前記第２の標的タンパク質に関する前記標的溶出体積の所望の特性である最適化基準を、クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェア（２０４）に入力すること（１０６）と；
－ 前記クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアによって、前記最適化基準に最もよく合致する標的溶出体積を得ることができるように、前記クロマトグラフィーカラムから前記第１の標的タンパク質および前記第２の標的タンパク質を溶出するように適合された溶出緩衝液の塩濃度（２２２）を計算すること（１０８）であって、複数の異なる溶出緩衝液の塩濃度の関数として複数のクロマトグラフィーシミュレーションを計算することを含む、溶出緩衝液の塩濃度（２２２）を計算すること（１０８）と；
－ 前記クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアによって、前記標的溶出体積のプーリング境界を、少なくとも計算された前記塩濃度および入力された前記最適化基準の関数として計算すること（１１０）と；
－ 計算された前記塩濃度を有する溶出緩衝液（２２６）を、前記クロマトグラフィーカラムに適用すること（１１２）と；
－ 適用された前記溶出緩衝液を使用して溶出を実施すること（１１４）と；
－ 計算された前記プーリング境界を使用して、計算された前記標的溶出体積を別個の画分として収集すること（１１６）と
を含む、方法。 - 前記最適化基準が、
ａ）前記標的溶出体積中の前記第１の標的タンパク質および前記第２の標的タンパク質の量の所望の比または比の範囲；
ｂ）前記標的溶出体積中の前記第２の標的タンパク質の所望の量または量の範囲と組み合わせた、前記第１の標的タンパク質の所望の量または量の範囲；
ｃ）
■ 前記標的溶出体積中の前記第１のタンパク質および前記第２のタンパク質の量の所望の比；
■ 前記標的溶出体積中の前記第２の標的タンパク質の所望の量または量の範囲；
■ 前記標的溶出体積中の前記第２の標的タンパク質の所望の純度または純度の範囲
と組み合わせた、前記第１の標的タンパク質の所望の純度または純度の範囲；
ｄ）上記基準のうちの２つ以上の組合せ
を含む群から選択される、請求項１に記載のクロマトグラフィー方法。 - 適用される前記タンパク質溶液（２０２）が、前記１種以上のさらなるタンパク質（Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６）を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー方法。
- － 前記複数のクロマトグラフィーシミュレーションが、前記複数の異なる溶出緩衝液の塩濃度の関数として、および複数の異なる溶出緩衝液のｐＨ値の関数として計算され、
前記方法が、以下を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー方法：
－ 前記計算すること（１０８）が、前記最適化基準に最もよく合致する標的溶出体積を得ることができるように、前記クロマトグラフィーカラムから前記第１の標的タンパク質および前記第２の標的タンパク質を溶出するように組み合わせて適合された溶出緩衝液の塩濃度（２２２）と溶出緩衝液のｐＨ値との組合せを計算することを含み、前記クロマトグラフィーシミュレーションが、前記溶出緩衝液の塩濃度（２２２）と前記溶出緩衝液のｐＨとの前記組合せの組合せを同定するために実施され、
－ 前記標的溶出体積の前記プーリング境界が、少なくとも前記溶出緩衝液の塩濃度と前記溶出緩衝液のｐＨ値との計算された前記組合せと、入力された前記最適化基準との関数として計算され；
－ 前記カラムに適用される前記溶出緩衝液（２２６）が、計算された前記塩濃度および計算された前記ｐＨ値を有する。 - 前記第１の標的タンパク質および前記第２の標的タンパク質が、０．７５未満および／または０．５未満の分解能係数を有するタンパク質である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１の標的タンパク質および前記第２の標的タンパク質が、同一のアミノ酸配列を有するタンパク質のグリコシル化バリアントである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１の標的タンパク質および前記第２の標的タンパク質が、
同一のアミノ酸配列を有し、かつＦＡＢ断片上に異なる数のグリコシル基を含む、抗体モノマー
である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。 - 適用される前記タンパク質溶液が、前記標的タンパク質（Ｐ１、Ｐ２）の各々、および存在する場合には前記さらなるタンパク質（Ｐ３～Ｐ６）の各々を、少なくとも０．５重量％、特に少なくとも１重量％、特に少なくとも２重量％のそれぞれの濃度で含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 適用される前記タンパク質溶液に含まれる前記第２の標的タンパク質（Ｐ２）、および存在する場合には前記さらなるタンパク質（Ｐ３～Ｐ６）のうちの１種以上が、固定相に対する前記第１の標的タンパク質の親和性と同様な前記カラムの固定相に対する親和性を有し、重なり合う溶出挙動をもたらす、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記カラムに適用される前記タンパク質溶液中のタンパク質の総量が、前記カラムの最大タンパク質負荷容量と同一またはそれより小さく、特に、前記最大タンパク質負荷容量の５０％～１００％、例えば５０％～９０％の範囲内である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的溶出体積の計算された前記プーリング境界が、収集開始時間オフセットおよび収集停止時間オフセットの形態で指定され、
前記方法が、
－ 前記クロマトグラフィーカラムを備える自動クロマトグラフィーシステムによって、前記溶出の開始から経過した時間を連続的にモニタリングすること；
－ 前記経過した時間が前記収集開始時間オフセットに等しい時に、前記クロマトグラフィーシステムにより、溶出される前記溶出緩衝液の前記収集を自動的に開始すること；および
－ 前記経過した時間が前記収集停止時間オフセットに等しい時に、前記クロマトグラフィーシステムにより、溶出される前記溶出緩衝液の前記収集を停止すること
を含む、
前記請求項のいずれか一項に記載の方法。 - － 前記複数のクロマトグラフィーシミュレーションの各々が、２つ以上の溶出ステップを使用するクロマトグラフィープロセスのシミュレーションであり、それにより各溶出ステップにおいて、異なる溶出塩濃度の溶出緩衝液が用いられ、
－ 計算された前記溶出緩衝液の塩濃度が、異なる溶出ステップに特異的な一連の溶出緩衝液の塩濃度であり、
－ 計算された前記塩濃度を有する前記溶出緩衝液を前記クロマトグラフィーカラムに前記適用することが、計算された溶出ステップに特異的な前記一連の塩濃度に従って、前記異なる塩濃度を有する一連の溶出緩衝液を段階的に適用することを含む、
前記請求項のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー方法。 - 前記方法が、
－ 適用される前記タンパク質溶液に含まれる前記第１の標的タンパク質および前記第２の標的タンパク質（Ｐ１～Ｐ２）の各々の量、および任意に、存在する場合には、適用される前記タンパク質溶液に含まれる１種以上のさらなるタンパク質（Ｐ３～Ｐ６）の各々の量も、前記クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェア（２０４）に入力すること（１０４）
を含み；
－ 前記シミュレーションが、少なくとも、
● 提供される前記カチオン交換クロマトグラフィーカラムの寸法、および
● 前記カラムに適用される前記第１の標的タンパク質および前記第２の標的タンパク質の量、ならびに任意に、前記１種以上のさらなるタンパク質の量
を含むパラメータ値のセットの関数として計算される、
前記請求項のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー方法。 - 前記パラメータの前記セットが、
－ 前記溶出緩衝液の所定のｐＨ値、
－ 前記カラムを通る前記溶出緩衝液の流量、
－ 適用される前記タンパク質溶液の前記タンパク質（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３～Ｐ６）の化学的特性
をさらに含む、請求項１２に記載のクロマトグラフィー方法。 - 前記クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアが、前記シミュレーションｒを計算するためおよび／または前記標的溶出体積の前記プーリング境界を計算するために、数学的モデルの組合せを使用するように構成され、
前記モデルが、
－ 前記カラム（２３０）の間隙体積における前記溶出緩衝液中の前記タンパク質の各々の濃度、前記塩濃度、および前記ｐＨ値を相互に関連付けるように構成された、カラムモデル（２０６）；および
－ 前記カラム（２３０）の前記固定相の細孔体積における前記溶出緩衝液中の前記タンパク質の各々の濃度、前記塩濃度、および前記ｐＨ値を相互に関連付けるように構成された、細孔モデル（２０８）；および
－ 前記固定相（２２８）の前記タンパク質の各々の濃度、前記溶出緩衝液の塩濃度、および前記タンパク質溶液中の前記タンパク質の各々の前記化学的特性のうちの少なくともいくつかを相互に関連付けるように構成された、反応モデル（２１０）
を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。 - 第１の標的タンパク質（Ｐ１）および第２の標的タンパク質（Ｐ２）を含む標的溶出体積（２３８）のプーリング境界を得る方法を実施するように構成されているシミュレーションソフトウェアを含む、クロマトグラフィー制御システムであって、
－ 前記標的溶出体積に含まれる前記第１の標的タンパク質および前記第２の標的タンパク質に関する前記標的溶出体積の所望の特性である最適化基準を受け取り（１０６）、前記最適化基準を前記クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェア（２０４）に入力すること；
－ 前記クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアを使用して、前記最適化基準に最もよく合致する標的溶出体積を得ることができるように、前記クロマトグラフィーカラムから前記第１の標的タンパク質および前記第２の標的タンパク質を溶出するように適合された溶出緩衝液の塩濃度（２２２）を計算すること（１０８）であって、複数の異なる溶出緩衝液の塩濃度の関数として複数のクロマトグラフィーシミュレーションを計算することを含む、溶出緩衝液の塩濃度（２２２）を計算すること（１０８）；
－ 少なくとも計算された前記塩濃度および入力された前記最適化基準の関数として、前記標的溶出体積の前記プーリング境界を計算すること（１１０）；
－ 計算された前記塩濃度および前記プーリング境界を出力すること
のために構成されている、クロマトグラフィー制御システム。 - 前記システムが、
－ カチオン交換クロマトグラフィーカラム（２３０）の寸法を受け取ること；
－ 前記カラムに適用される前記第１の標的タンパク質および前記第２の標的タンパク質の量、ならびに任意に、前記１種以上のさらなるタンパク質の量を受け取ること（１０５）
のためにさらに構成され；
－ 前記シミュレーションおよび／または前記プーリング境界が、少なくとも、
● 提供される前記カチオン交換クロマトグラフィーカラムの前記寸法、および
● 前記カラムに適用される前記第１の標的タンパク質および前記第２の標的タンパク質の前記量、ならびに任意に、前記１種以上のさらなるタンパク質の前記量
を含むパラメータ値のセットの関数として計算される、
請求項１６に記載のクロマトグラフィー制御システム。 - － 前記複数のクロマトグラフィーシミュレーションが、前記複数の異なる溶出緩衝液の塩濃度の関数として、および複数の異なる溶出緩衝液のｐＨ値の関数として計算され、
前記方法が、以下をさらに含む、請求項１６または１７に記載のクロマトグラフィー制御システム：
－ 前記計算すること（１０８）が、前記最適化基準に最もよく合致する標的溶出体積を得ることができるように、前記クロマトグラフィーカラムから前記第１の標的タンパク質および前記第２の標的タンパク質を溶出するように組み合わせて適合された溶出緩衝液の塩濃度（２２２）と溶出緩衝液のｐＨ値との組合せを計算することを含み、
－ 前記標的溶出体積の前記プーリング境界を計算すること（１１０）が、少なくとも前記溶出緩衝液の塩濃度と前記溶出緩衝液のｐＨ値との計算された前記組合せと、入力された前記最適化基準との関数として計算され；
－ 計算された前記ｐＨ値が、計算された前記溶出緩衝液（２２６）に加えて出力される。 - 前記クロマトグラフィー制御システムが、出力された前記溶出塩濃度を有する溶出緩衝液を自動的に生成することについて、緩衝液混合ユニットを制御するように構成される；および／または
前記クロマトグラフィー制御システムが、請求項１８に記載の組み合わせて計算されて出力される前記塩濃度および前記ｐＨ値の両方を有する溶出緩衝液を自動的に生成することについて、緩衝液混合ユニットを制御するように構成される；および／または
前記クロマトグラフィー制御システムが、異なる塩濃度を有する複数の利用可能な溶出緩衝液のうちの１つを自動的に選択するように適合された溶出緩衝液選択ユニットを制御するように構成され、選択される前記溶出緩衝液が、出力された前記塩濃度を有する；および／または
前記クロマトグラフィー制御システムが、異なる塩濃度および異なるｐＨ値を有する複数の利用可能な溶出緩衝液のうちの１つを自動的に選択するように適合された溶出緩衝液選択ユニットを制御するように構成され、選択される前記溶出緩衝液が、請求項１８に記載の組み合わせて計算されて出力される前記塩濃度および前記ｐＨ値の両方を有する；および／または
前記クロマトグラフィー制御システムが、自動的に生成または選択された溶出緩衝液を前記クロマトグラフィーカラムに自動的に適用するように構成された緩衝液適用ユニットを制御するように構成されており、適用された前記溶出緩衝液が、出力された前記塩濃度を有するか、または請求項１８に記載の組み合わせて計算されて出力される前記塩濃度および前記ｐＨ値の両方を有する；および／または
前記クロマトグラフィー制御システムが、計算された前記標的溶出体積を計算された前記プーリング境界に従って別個の画分として自動的に収集するように、クロマトグラフィーシステムの溶出体積収集ユニットを制御するように構成される、
請求項１６から１８のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー制御システム。 - 請求項１９に記載のクロマトグラフィー制御システムを含み、前記緩衝液混合ユニットおよび／または前記溶出緩衝液選択ユニットおよび／または前記緩衝液適用ユニットおよび／または前記自動溶出体積収集ユニットをさらに含む、クロマトグラフィーシステム。
- 第１の標的タンパク質（Ｐ１）および第２の標的タンパク質（Ｐ２）を含む標的溶出体積（２３８）が得られるようにクロマトグラフィープロセスを管理するためのコンピュータプログラムであって、前記コンピュータプログラムが、クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアを含み、かつ
－ 前記標的溶出体積に含まれる第１の標的タンパク質および第２の標的タンパク質に関する標的溶出体積の所望の特性である最適化基準を受け取ること（１０６）；
－ 前記クロマトグラフィー・シミュレーション・ソフトウェアを使用して、前記最適化基準に最もよく合致する標的溶出体積を得ることができるように、前記クロマトグラフィーカラムから前記第１の標的タンパク質および前記第２の標的タンパク質を溶出するように適合された溶出緩衝液の塩濃度（２２２）を計算すること（１０８）であって、複数の異なる溶出緩衝液の塩濃度の関数として複数のクロマトグラフィーシミュレーションを計算することを含む、溶出緩衝液の塩濃度（２２２）を計算すること（１０８）；
－ 少なくとも計算された前記塩濃度および入力された前記最適化基準の関数として前記標的溶出体積の前記プーリング境界を計算すること（１１０）；ならびに
－ 前記最適化基準に従って前記第１の標的タンパク質および前記第２の標的タンパク質を含む標的溶出体積が得られるように、ユーザがクロマトグラフィーシステムを制御することを可能にするために、計算された前記塩濃度および／もしくは前記プーリング境界を出力すること、ならびに／または前記最適化基準に従って前記第１の標的タンパク質および前記第２の標的タンパク質を含む標的溶出体積が得られるように、クロマトグラフィーシステムを自動的もしくは半自動的に制御するために、計算された前記塩濃度および／もしくは前記プーリング境界を使用すること
のために構成された、コンピュータプログラム。 - クロマトグラフィーシステムの１つ以上のユニットを自動的または半自動的に制御するための制御コマンドを生成するようにさらに構成された、請求項２１に記載のコンピュータプログラム。
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