KR20220069942A - 예상되는 용리 완충액 염 농도를 사용하는 양이온 크로마토그래피 - Google Patents
예상되는 용리 완충액 염 농도를 사용하는 양이온 크로마토그래피 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 제1 및 제2 표적 단백질(P1, P2)을 포함하는 표적 용리 부피(238)를 생성하는 크로마토그래피 방법에 관한 것이다. 방법은 다음 단계를 포함한다:
- 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼(230)을 제공하는 단계(102);
- 단백질 용액(202)을 컬럼에 적용하는 단계(104), 단백질 용액은 제1 표적 단백질(P1), 제2 표적 단백질 및 선택적으로 하나 이상의 추가 단백질(P3, P4, P5, P6)을 포함함;
- 최적화 기준을 입력하는 단계(106);
- 최적화 기준과 가장 일치하는 표적 용리 부피를 제공하도록 적합화된 용리 완충액 염 농도(222)를 계산하기 위해 크로마토그래피 시뮬레이션을 계산하는 단계(108);
- 적어도 계산된 염 농도 및 입력 최적화 기준의 함수로서 표적 용리 부피의 풀링 경계를 계산하는 단계(110);
- 계산된 염 농도를 갖는 용리 완충액(226)을 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계(112);
- 용리를 수행하는 단계(114); 및
- 계산된 표적 용리 부피를 수집하는 단계(116).
- 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼(230)을 제공하는 단계(102);
- 단백질 용액(202)을 컬럼에 적용하는 단계(104), 단백질 용액은 제1 표적 단백질(P1), 제2 표적 단백질 및 선택적으로 하나 이상의 추가 단백질(P3, P4, P5, P6)을 포함함;
- 최적화 기준을 입력하는 단계(106);
- 최적화 기준과 가장 일치하는 표적 용리 부피를 제공하도록 적합화된 용리 완충액 염 농도(222)를 계산하기 위해 크로마토그래피 시뮬레이션을 계산하는 단계(108);
- 적어도 계산된 염 농도 및 입력 최적화 기준의 함수로서 표적 용리 부피의 풀링 경계를 계산하는 단계(110);
- 계산된 염 농도를 갖는 용리 완충액(226)을 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계(112);
- 용리를 수행하는 단계(114); 및
- 계산된 표적 용리 부피를 수집하는 단계(116).
Description
본 발명은 크로마토그래피 분야, 특히 특정 단백질을 얻기 위한 양이온 크로마토그래피 분야에 관한 것이다.
양이온 교환 크로마토그래피는 순 표면 전하에 기초하여 분자를 분리하기 위해 일반적으로 사용되는 이온 교환 크로마토그래피의 한 형태이다. 순 양의 표면 전하를 갖는 분자(예를 들어 단백질 또는 펩타이드)에 대한 친화도를 갖는 음으로 하전된 이온 교환 수지는 분취용 및 분석용 목적 모두에 사용된다.
단백질의 순 표면 전하는 단백질의 등전점("pI")에 의해 좌우되는 방식으로 pH에 따라 변한다. 상이한 pI 값을 갖는 단백질은 주어진 pH에서 상이한 하전 정도를 가질 것이고 크로마토그래피 컬럼의 이온 교환 매질의 입자상의 음으로 하전된 표면 기에 대해 상이한 친화도를 가질 것이다. 따라서, 상이한 pI 값을 갖는 단백질은 상이한 강도로 크로마토그래피 수지에 결합하여, 이들의 분리를 촉진할 것이다.
그러나, 분리될 필요가 있는 모든 단백질 및 펩타이드가 크로마토그래피 컬럼에서 명확한 분리를 허용할 만큼 충분하게 상이한 pI 값을 갖는 것은 아니다. 더욱이, 분리는 또한 컬럼과 상호작용하는 아미노산 측 잔기의 수에 따라 달라질 수 있다: 입체적 요인으로 인해, 단백질의 하전된 모든 기가 결합에 참여할 수 있는 것은 아니다. 특히, 크로마토그래피 컬럼에서 다른 유형의 번역 후 변형(posttranslational modification, PTM)을 포함하는 단백질 및 단백질 글리코형의 분할은 어려운 일이다.
글리코실화는 단백질의 가장 흔한 번역 후 변형(PTM) 중 하나이다. 글리코실화는 단백질의 아미노산 골격, 특히 세린/트레오닌(O-글리코실화) 또는 아스파라긴(N-글리코실화) 아미노산 잔기에 올리고당(글리칸)을 공유 부착하는 것을 포함한다. 글리칸 잔기는 단백질 안정성, 용해도, 항원성, 접힘 및 혈청 반감기에 영향을 미칠 수 있으므로 단백질의 생물학적 기능에 큰 영향을 미친다. 단백질 글리코실화 및 기타 여러 형태의 PTM(예를 들어 인산화, 메틸화, 석신이미드화, 산화, N-말단 메티오닌-손실 등)은 다양한 효소 및 기질을 포함하는 복잡한 과정에서 생성되고, 숙주 유기체, 생산 세포주 및 배양 조건에 의존한다.
글리코실화 및 기타 유형의 PTM은 치료 단백질의 중요한 품질 속성이다. 구조적 변화를 통한 PTM은 단백질 및 펩타이드의 치료적 가치(효능) 예를 들어 MAb의 보체 의존성 세포 세포독성(complement dependent cell cytotoxicity, CDCC) 및 항체 의존성 세포 세포독성(antibody-dependent cell cytotoxicity, ADCC) 활성을 조절할 수 있다.
따라서, 글리코실화 및/또는 다른 형태의 PTM을 거친 단백질 변이체 분리에 사용되는 현재 크로마토그래피 기술의 문제점은 특정 PTM을 갖는 단백질을 선택적으로 용리하는 것에 관해 또는 PTM의 유형, 수 및/또는 위치에 대해서만 서로 상이한 원하는 비율의 둘 이상의 단백질 변이체를 포함하는 용리 달성에 관해 심각한 문제점이다.
본 발명의 목적은 독립항에 명시된 이온 교환 크로마토그래피 및 상응하는 크로마토그래피 제어 시스템을 사용하여 둘 이상의 표적 단백질을 포함하는 표적 용리 부피를 얻는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 구체예는 종속 청구항에 주어진다. 본 발명의 구체예들은 상호 배타적이지 않다면 자유롭게 조합될 수 있다.
한 양태에서, 본 발명은 제1 및 제2 표적 단백질을 포함하는 목표 용리 부피를 생성하는 크로마토그래피 방법에 관한 것이다. 방법은 다음 단계를 포함한다:
-
양이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 제공하는 단계;
-
단백질 용액을 컬럼에 적용하는 단계; 단백질 용액은 적어도 제1 표적 단백질, 제2 표적 단백질 및 선택적으로 하나 이상의 추가 단백질을 포함함;
-
최적화 기준을 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어에 입력하는 단계; 최적화 기준은 표적 용리 부피에 포함된 제1 및 제2 표적 단백질에 대한 표적 용리 부피의 원하는 특성이다; 예를 들어, 최적화 기준은 용리 부피에 포함된 둘 이상의 표적 단백질의 정량적 특성 및/또는 정성적 특성일 수 있다; 정량적 특성은 예를 들어 용리 부피 중의 표적 단백질의 절대량(예를 들어 농도) 또는 둘 이상의 표적 단백질의 상대량(예를 들어 비율)일 수 있다; 추가로 또는 대안적으로, 기준은 하나 이상의 정성적 특성, 예를 들어 표적 단백질 중 하나 또는 둘 모두의 순도이거나 이를 포함할 수 있다; 최적화 기준은 두 표적 단백질의 하나 이상의 정성적 및 하나 이상의 정량적 특성의 함수로서 계산된 파생 점수 값일 수 있다.
크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어는 최적화 기준과 가장 일치하는 표적 용리 부피가 얻어질 수 있도록 크로마토그래피 컬럼으로부터 제1 및 제2 표적 단백질을 용리하도록 적합화된 용리 완충액 염 농도를 계산하도록 구성된다. 계산은 다수의 상이한 용리 완충액 염 농도의 함수로서 다수의 크로마토그래피 시뮬레이션을 계산하는 것을 포함한다.
크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어는 적어도 계산된 염 농도 및 입력 최적화 기준의 함수로서 목표 용리 부피의 풀링 경계(pooling border)를 계산하도록 추가로 구성된다.
방법은 다음 단계를 추가로 포함한다:
-
계산된 염 농도를 갖는 용리 완충액을 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계;
-
적용된 용리 완충액으로 용리를 수행하는 단계; 및
-
계산된 풀링 경계를 사용하여 별도의 분획으로서 계산된 표적 용리 부피를 수집하는 단계.
이러한 특징은 단백질이 매우 유사한 pI 값을 가질 수 있고 일부 용리 조건하에 중첩되는 용리 프로파일을 가질 수 있음에도 불구하고, 본 발명의 구체예가 사전 정의된 양, 비율 및/또는 순도의 둘 이상의 관심 단백질을 포함하는 표적 용리 부피를 얻도록 할 수 있으므로 유리할 수 있다.
어떠한 이론에도 얽매이지 않고, 출원인은 용리 완충액의 염 농도가 모두에게 적합한 용리 염 농도가 아니기 때문에 이러한 효과가 달성된다고 가정한다. 오히려, 염 농도는 원하는 최적화 기준, 특히 둘 이상의 관심 표적 단백질의 절대량 또는 상대량 및/또는 순도에 대해 구체적으로 계산적으로 예측된 농도이다. 이는 용출액 중의 특정 표적 단백질의 양 제거 또는 감소를 위한 추가 공정 단계 회피 및/또는 둘 이상의 개별적으로 용리된 표적 단백질을 원하는 비율로 재조합하기 위해 특정 관심 표적 단백질을 농축하는 추가 공정 단계 회피를 허용할 수 있다.
출원인은 일부 제약 적용 시나리오에서, 사전 정의된 비율 및/또는 순도에 제공된 둘 이상의 표적 단백질의 혼합물로 구성된 약물을 제공하는 것이 바람직함을 관찰했다. 예를 들어, 약물은 P1 및 P2로 지칭되는 특정 단백질 P의 두 PTM-변이체의 혼합물로 구성될 수 있고, 이에 의해 약물은 변이체 P1 및 P2가 특정 양 비율로 제공되는 경우 가장 효과적이다. 본 발명의 구체예는 둘 이상의 관심 단백질이 단일 크로마토그래피 실행에서 원하는 비율, 양 및/또는 순도로 용이하에 용리되도록 세포의 전체 단백질로부터 특정 관심 단백질을 추출 및/또는 상향 농축하기 위해 어떻게든 수행될 수 있는 크로마토그래피 단계를 수행하는 것을 허용할 수 있다.
크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어는 최적화 기준에 최적인 염 농도를 확인하기 위해 여러 상이한 (가상/후보) 용리 완충액 염 농도에 대해 컬럼에 적용된 단백질의 다중 크로마토그래피 실행을 시뮬레이션함으로써 이 바람직한 효과를 얻을 수 있다. 이 계산적으로 확인된 염 농도는 이후 생성되거나 선택된 용리 완충액의 염 농도가 계산된 염 농도와 동일하도록 실제 크로마토그래피 과정에 사용될 용리 완충액을 생성하거나 선택하기 위해 사용된다.
본 발명의 구체예에 의해 얻어진 용리 완충액은 "표준"/"모두에게 적합한" 용리 완충액이 아니라, 경우에 따라 유연하게 정의될 수 있는 최적화 기준에 구체적으로 적합화된 용리 완충액이다.
구체예에 따르면, 최적화 기준은 다음을 포함하는 군으로부터 선택된다:
a)
표적 용리 부피 중의 제1 및 제2 표적 단백질의 양의 원하는 비율 또는 비율 범위; 특히, 비율은 5:95 내지 1:1, 특히 1:95 내지 1:1 범위 내의 임의의 비율일 수 있음;
b)
표적 용리 부피 중의 제2 표적 단백질의 원하는 양 또는 양 범위와 조합된 제1 표적 단백질의 원하는 양 또는 양 범위; 예를 들어, 양은 절대량 또는 농도일 수 있음;
c)
다음과 조합된 제1 표적 단백질의 원하는 순도 또는 순도 범위:
d)
위에서 언급한 기준 중 둘 이상의 조합. 예를 들어, 복잡한 점수 계산 알고리즘은 원하는 표적 단백질 비율에 대한 일치 M1을 갖고 둘 이상의 표적 단백질의 원하는 순도에 대한 일치 M2를 갖는 용리 완충액에 대한 점수 값을 계산하기 위해 사용될 수 있고, 이에 의해 M1은 총 점수에 대해 약 70%의 영향을 미치고 M2는 총 점수에 대해 약 30%의 영향을 미친다. 또 다른 예에 따르면, 최적화 기준은 표적 단백질 중 하나 이상의 요구되는 최소 절대량, 원하는 비율 범위 (예를 들어 1:2.0 내지 1:2.5) 및 표적 단백질 중 하나 이상에 대한 최소 순도 점수의 조합이다.
이는 사용자가 염 농도가 각각의 사용 사례 시나리오에 최적화된 용리 완충액을 확인하고 사용할 수 있게 할 수 있다. 예를 들어, 연구 환경에서, 단백질 순도 측면은 임상 사용 사례 시나리오보다 덜 중요할 수 있다. 바람직한 구체예에 따르면, 시뮬레이션 소프트웨어는 예를 들어 각 개별 크로마토그래피 실행에 대해 사용자가 최적화 기준을 입력 및/또는 수정할 수 있게 하는 GUI를 생성하도록 구성된다. 이는 크로마토그래피 과정을 상이한 사용 사례 시나리오, 상이한 표적 단백질 및 표적 단백질 조합 및 기타 많은 요인에 유연하게 적합화하는 것을 허용할 수 있다.
구체예에 따르면, 적용된 단백질 용액은 하나 이상의 추가 단백질을 포함한다. 추가 단백질은 표적 단백질과 중첩되는 용리 프로파일을 가질 수 있고 용출액을 오염시킬 수 있다. 시뮬레이션 및/또는 풀링 경계의 계산에서 표적 단백질의 순도, 특히 표적 단백질의 양 및/또는 화학적 특성을 고려하여, 표적 단백질의 허용 가능한 순도 수준이 달성되도록 표적 단백질 및 오염 추가 단백질을 용리하는 것을 허용하는 용리 완충액 염 농도을 확인하고 사용할 수 있다.
구체예에 따르면, 다수의 상이한 용리 완충액 염 농도는, 예를 들어 상이한 염 농도를 갖지만 다른 것은 (예를 들어 pH 값과 관련하여) 동일한 염 완충액 사양을 생성하기 위한 사전 정의된 프로그램 루틴을 기반으로 자동으로 생성된다. 이러한 자동으로 생성된 버퍼 염 농도는 "가상" 또는 "후보" 용리 완충액 염 농도로 지칭될 수도 있다. 예를 들어, 계산된 염 농도는 최적화 기준을 가장 잘 충족시키는 것으로 계산적으로 확인된 다수의 후보 용리 염 농도 중 하나이다. 예를 들어, 용리 완충액 염 농도의 계산은 다수의 상이한 후보 용리 염 농도의 함수로서 표적 용리 부피 중의 하나 이상의 표적 단백질의 양 및/또는 순도 예측하는 것, 및 용리 완충액 염 농도로서 원하는 양 및/또는 순도의 하나 이상의 표적 단백질을 포함하는 표적 용리 부피를 수집하는 데 가장 적합한 후보 용리 완충액 염 농도 중 하나를 확인하는 것을 포함할 수 있다. 이 확인된 염 농도는 "계산된" 용리 완충액 염 농도로서 사용되고 염 농도가 계산되고 확인된 용리 완충액 염 농도와 동일한 용리 완충액을 선택하거나 생성하기 위해 사용된다. 이러한 선택되거나 생성된 용리 완충액은 적용된 용리 완충액으로 용리를 실제로 수행하기 위해 사용된다.
크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어에 입력되는 원하는 최적화 기준은, 구체예에 따라, 절대량(예를 들어 표적 단백질 각각의 농도) 또는 상대량(예를 들어 둘 이상의 표적 단백질의 농도 비율 또는 질량 비율)으로서 명시될 수 있다.
구체예에 따르면, 방법은 분석 목적을 위해 사용된다. 바람직한 구체예에 따르면, 방법은 분취 목적을 위해 사용된다.
바람직한 구체예에 따르면, 계산된 염 농도는 제1 표적 단백질을 용리하도록 적합화되고 적용된 단백질 용액에 포함된 추가 단백질 중 어느 하나로부터 제1 표적 단백질 및/또는 제2 표적 단백질을 분리하는 데 가장 적합한 다수의 후보 염 농도 중 하나이다.
이들 특징은 출원인이 표적 단백질이 표적 용리 부피에 원하는 양, 비율 및/또는 순도로 포함되도록 둘 이상의 관심 단백질("표적 단백질")을 용리하기에 적합한 용리 완충액 중의 염의 농도를 예측을 허용하도록 충분히 잘 쉽게 얻을 수 있거나 알려진 입력 데이터 값의 세트에 기반하여 크로마토그래피 과정을 시뮬레이션할 수 있음을 관찰했으므로 유리할 수 있다. 바람직하게는, 계산된 염 농도는 단백질 용액에 포함된 추가 단백질로부터 제1 표적 단백질을 분리하기에 가장 또는 거의 가장 적합하다.
염 농도가 예측된 적합하거나 최적인 염 농도에 해당하는 용리 완충액으로 적용된 단백질 용액을 용리함으로써, 매우 유사한 극성을 포함하여 매우 유사한 화학적 특성을 갖는 단백질 및 단백질 변이체를 분리할 수 있는 고분해능 단백질 크로마토그래피를 수행할 수 있다. 더욱이, 계산된 용리 완충액 염 농도는 그 자체가 추가의 예측을 수행하기 위한, 특히 원하는 양의 하나 이상의 표적 단백질을 포함할 용리 부피의 풀링 경계를 매우 정확하게 예측하기 위한 입력으로서 사용될 수 있다. 적합하거나 최적인 염 농도로 예측될 용리 완충액 염 농도는 원하는 절대량 또는 상대량 및/또는 원하는 순도로 둘 이상의 표적 단백질을 제공하는 것으로 예측된 다수의 후보 용리 염 농도 중 하나로서 계산될 수 있다. 따라서, 계산적으로 확인된 "최적" 용리 완충액 염 농도의 함수로서 풀링 경계의 예측에 기반하여, 원하는 양, 비율 및/또는 순도의 하나 이상의 표적 단백질을 포함하는 총 용리 부피의 분획을 구체적으로 수집하는 것이 가능하다.
이는 하나 이상의 표적 단백질이 하나 이상의 매우 유사한 다른 단백질로부터, 예를 들어 다른 글리코형으로부터 분리되어야 할 때, 또는 원하는 비율(상대량)의 둘 이상의 매우 유사한 표적 단백질의 혼합물이 얻어져야 하는 경우에 특히 유용할 수 있다.
본 발명의 구체예에 따른 방법은 이전에 양이온 크로마토그래피에 의해 분리될 수 없었던 매우 유사한 단백질 변이체가 이제 단일 크로마토그래피 실행에서 분리될 수 있다는 장점을 가질 수 있고: 첫 번째 단계에서, 적합한 용리 완충액 염 농도가 예측된 다음 용리가 예측된 염 농도를 갖는 용리 완충액을 사용하여 수행된다. 이는 단백질이 다른 화학적으로 매우 유사한 단백질로부터 분리될 필요가 있거나, 매우 유사한 화학적 특성을 갖는 둘 이상의 단백질이 특정 상대량으로 얻어질 필요가 있는 임의의 상황에서 매우 유리할 수 있다. 예를 들어, 재조합 제약 단백질의 글리코실화 패턴은 흔히 이러한 단백질의 품질 및 효능에 강한 영향을 미친다. 흔히, 특정 표적 단백질, 예를 들어 특정 글리코실화 패턴을 갖는 항체 또는 항체 단편을 생산하기 위해 사용되는 세포주는 이 특정 글리코형뿐만 아니라, 임의의 글리코실화가 없는 것을 포함하는 하나 이상의 다른 글리코형을 생산한다. 적합한 용리 완충액 염 농도를 먼저 예측하고, 예측된 염 농도를 갖는 용리 완충액으로 용리를 수행한 다음 풀링 경계를 예측하고 수집함으로써, 본 발명의 구체예는 구체적으로 하나 이상의 관심 글리코형 및 이미 적합한 농도인 이러한 글리코형을 얻는 것을 허용할 수 있다.
이 표적 용리 부피가 원하는 양, 비율 및/또는 순도로 둘 이상의 표적 단백질을 포함하도록 표적 용리 부피의 풀링 경계를 예측하는 것은 표적 단백질(들)의 농도 증가 또는 감소를 위해 추가 단계를 피할 수 있으므로 유익할 수 있다. 이는 원하는 농도의 하나 이상의 표적 단백질을 얻는 과정을 가속화하고 또한 회피될 수 있는 모든 추가 처리 단계가 표적 용리 부피에 포함된 표적 단백질(들)을 오염시키거나 손상시킬 위험을 감소시키므로 표적 단백질의 품질을 향상시킨다.
본 발명의 구체예는 항체 또는 항체 단편과 같은 치료 또는 진단 단백질 또는 단백질 단편 분리에 특히 적합하다. 본 발명의 구체예는 원하는 양의 하나 이상의 표적 단백질을 선택적으로 수득하기 위한 본 발명의 구체예에 따른 크로마토그래피 방법을 사용하여 바이오의약품의 품질, 순도, 안정성 및 효능을 보장하기 위해 사용될 수 있다.
구체예에 따르면, 컬럼에 적용된 단백질 용액은 하나 이상의 염 및 하나 이상의 단백질을 포함하는 수계 용액이다.
구체예에 따르면, 다수의 크로마토그래피 시뮬레이션은 다수의 상이한 용리 완충액 염 농도의 함수 및 다수의 상이한 용리 완충액 pH 값의 함수로서 계산된다. 염 농도의 계산은 용리 완충액 염 농도 및 용리 완충액 pH 값의 조합을 계산하는 것을 포함하고, 이들은 조합으로 최적화 기준과 가장 일치하는 표적 용리 부피가 얻어질 수 있도록 크로마토그래피 컬럼으로부터 제1 및 제2 표적 단백질을 용리하도록 적합화된다. 크로마토그래피 시뮬레이션은 용리 완충액 염 농도 및 용리 완충액 pH 값의 조합의 조합을 확인하기 위해 수행된다. 표적 용리 부피의 풀링 경계는 적어도 용리 완충액 염 농도 및 용리 완충액 pH 값의 계산된 조합 및 입력 최적화 기준의 함수로서 계산된다. 컬럼에 적용된 용리 완충액은 계산된 염 농도 및 계산된 pH 값을 갖는다.
출원인은 염 농도 이외에도, 또한 pH 값이 여러 상이한 단백질의 용리 프로파일에 상당한 영향을 미침을 관찰했다. 염 농도로서, pH 값은 특정한 원하는 값으로 수비게 설정될 수 있다. 시뮬레이션을 수행하기 위해 사용되는 하나 이상의 모델은 일반적으로 완충액의 염 농도 및 pH 값 모두를 고려하고, 여러 상이한 염 농도 및 상이한 pH 값의 조합을 기반으로 하는 다중 크로마토그래피 실행 및/또는 크로마토그래피 용리 단계의 계산이 모델을 적합화하거나 복잡한 추가 프로그램 루틴을 구현할 필요 없이 수행될 수 있다. 추가로, 염 농도와 pH 값 사이의 복잡한 상호 관계 및 용리 프로파일에 대한 이들의 결합된 영향이 시뮬레이션 과정에서 고려될 수 있다. 더욱이, 염 농도 및 pH 값 모두의 변화를 기반으로 하는 시뮬레이션은 방대한 데이터 공간을 포함할 수 있으므로 최적화 기준을 준수할 수 있는 용액 완충액을 확인할 가능성이 높아진다. 예를 들어, 시뮬레이션이 10 가지 상이한 염 농도에 대해 수행되고 각 염 농도가 10 가지 상이한 pH 값에 기반하여 시뮬레이션되는 경우, 시뮬레이션은 10x10=100 가지의 상이한 시뮬레이션 및 해당하는 이론/후보 용리 완충액 사양을 포함한다.
구체예에 따르면, 방법은 선택되거나 제조된 용리 완충액이 최적화 기준을 가장 잘 충족시키는 것으로 시뮬레이션에서 확인된 염 농도 및 pH 값을 갖도록 용리 완충액을 자동으로 또는 수동으로 선택 또는 제조하는 것을 포함한다. 선택되거나 제조된 용리 완충액은 단백질을 용리시키기 위해 컬럼에 적용되는 버퍼로서 사용된다.
단일 표적 단백질 사례 시나리오
본원에 기재된 추가 사용 사례 시나리오에 따르면, 표적 용리 부피는 단지 단일 (제1) 표적 단백질 및 선택적으로 하나 이상의 추가(오염) 단백질을 포함한다. 최적화 기준은 원하는 표적 단백질의 원하는 절대량 및/또는 표적 단백질의 원하는 순도이다. 특히, 제1 표적 단백질의 원하는 양은 용리 완충액의 수집된 부피 중의 제1 단백질의 원하는 농도 또는 이의 파생 값의 형태로 명시될 수 있다.
예를 들어, 원하는 농도가 제공되는 경우, 표적 용리 부피가 표적 단백질을 원하는 농도로 포함하는 용리 부피로서 계산될 수 있고, 이에 의해 풀링 경계가 표적 용리 부피 중의 용리된 표적 단백질의 평균 농도가 원하는 농도와 동일하도록 선택된다. 표적 용리 부피의 수집 동안, 컬럼을 떠나는 용리 완충액 중의 제1 표적 단백질 농도는 원하는 농도보다 높거나 낮을 수 있다.
원하는 절대량이 제공되는 경우, 표적 용리 부피는 원하는 양의 제1 표적 단백질을 포함하는 최소 용리 부피로서 계산될 수 있다.
단일 표적 단백질의 표적 용리 부피를 위한 풀링 경계를 계산하기 위한 본 발명의 구체예 사용은 수집된 표적 용리 부피가 원하는 농도 및/또는 절대량의 (단일) 표적 단백질을 이미 포함하여, 표적 단백질 농축 또는 희석을 위한 추가 단계가 회피될 수 있도록 표적 단백질을 수집하는 것을 허용하므로 유리할 수 있다. 추가로, 출원인은 본 발명의 구체예에 따른 크로마토그래피 방법이 표적 용리 부피의 풀링 경계를 매우 정확하게 예측할 수 있게 함으로써, 순수하고 예측 가능한 방식으로 표적 단백질을 제공하고 컬럼을 떠나는 용리 완충액의 수집을 지나치게 늦게 시작하거나 수집을 지나치게 일찍 종료하여 표적 단백질의 상당 부분을 손실할 위험을 최소화함을 관찰했다.
다중 표적 단백질 사례, 일반적 양태
구체예에 따르면, 적용된 단백질 용액은 제1 표적 단백질, 제2 표적 단백질 및 0, 하나 이상의 추가 단백질을 포함한다. 최적화 기준은 제1 및 제2 표적 단백질의 상대량의 형태로, 예를 들어 제1 표적 단백질 및 제2 표적 단백질의 비율의 형태로 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어에 입력된다. 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어는 적어도 계산된 염 농도 및 입력된 원하는 비율의 함수로서 표적 용리 부피의 풀링 경계를 계산한다. 방법은 원하는 비율의 제1 및 제2 표적 단백질을 포함하는 표적 용리 부피를 생성하기 위해 사용된다.
이는 특히 매우 유사한 화학적 특성을 갖는 두 단백질, 예를 들어 두 글리코형이 모든 다른 단백질로부터 분리되어야 하고 특정 비율로 얻어져야 하는 사용 사례 시나리오에서 유리할 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 항체 단편과 같은 생의학적 활성 화합물의 일부 글리코형은 둘 이상의 상이한 글리코형이 특정 비율로 적용되는 경우 특히 효과적인 것으로 관찰되었다. 종래 기술 접근법에서, 이러한 표적 단백질이 매우 유사한 화학적 특성을 갖는 경우에 정의된 상대량의 둘 이상의 표적 단백질을 갖는 순수한 단백질 용액을 얻는 것은 흔히 매우 시간 소모적이고 때로는 실행 불가능했다. 이는 기존의 크로마토그래피 접근법으로 이러한 단백질을 서로 분리할 수 없었기 때문이다. 오히려, 두 단백질 모두 용리가 진행됨에 따라 변하는 비율로 용리 완충액에서 얻어졌고 이는 원하는 값으로 설정될 수 없었다. 본 발명의 구체예는 제1 표적 단백질의 용리 거동의 계산 및 예측을 수행하고, 제2 표적 단백질(및 적어도 하나 이상의 표적 단백질의 순도가 고려되어야 하는 경우에 존재할 경우 추가 컬럼에 적용된 단백질 중 임의의 것)의 용리 거동의 계산 및 예측을 수행하고, 제1 및 제2 표적 단백질을 원하는 비율, 양 및/또는 순도로 포함하는 표적 용리 부피의 풀링 경계를 자동으로 계산 및 예측하도록 구성되는 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어를 이용한다. 예를 들어, 컬럼을 떠나는 용리 완충액 중의 제1 및 제2 표적 단백질 및 존재할 경우 또한 선택적으로 적용된 단백질 용액에 포함된 추가 단백질 각각의 농도는 제1 및 제2 표적 단백질 모두에 대해 향후 일련의 시점(예를 들어 매초 또는 매분)에 대해 에측될 수 있다. 얻어진 예측된 농도 값은 내삽 및/또는 외삽될 수 있고 다양한 후보 풀링 경계에 대한 둘 이상의 표적 단백질의 절대량 및/또는 상대량 및/또는 순도가 얻어질 수 있다. 이후, 원하는 양 및/또는 순도의 제1 및 제2 표적 단백질을 포함하는 표적 용리 부피를 정의하는 풀링 경계는 풀링 경계에 따라 표적 용리 부피의 수집을 시작 및 종료하기 위해 출력되고 사용될 수 있다.
구체예에 따르면, 제1 및 제2 표적 단백질은 낮은 분해능 인자, 특히 0.75 미만, 일부 예에서 0.6 미만 또는 심지어 0.5 미만의 분해능 인자를 갖는 단백질이다.
본원에서 사용된 분해능 인자는 크로마토그래피 컬럼의 용출액 중의 두 가지 유형의 분자의 피크 분리 정도를 나타내는 수치 값, 예컨대 0.8, 1.0 또는 3.0이다. 일반적으로, 분해능은 두 신호를 분리하는 능력이다. 크로마토그래피 관점에서, 이는 두 가지 상이한 분자 유형의 두 피크를 분리하는 능력이다. 분해능 R은 다음에 의해 주어진다
여기서 t r 1과 t r 2 및 w 1과 w 2는 각각 바로 인접한 두 피크의 시간 t 및 폭 w이다. 피크가 충분하게 가까운 경우, 이는 관련 문제이고, 폭 w는 두 피크에 대해 거의 동일하다. 두 유형의 분자의 가우스 분포를 가정하면, 1의 분해능 계수는 첫 번째 피크 면적의 2.5 퍼센트가 두 번째 피크 면적과 중첩됨을 나타낸다. 유사하게, 1.5의 분해능은 1.5Х 4 x σ의 체류 시간 차이를 나타내고, 여기서 σ는 0.15 %의 중첩에 해당하는 가우스 분포의 표분 편차이다. 일반적으로, 분해능 계수가 더 높을수록, 두 분자를 더 잘 분리할 수 있다. 본 발명의 구체예는 매우 낮은 분해능 인자, 예를 들어 0.5 미만의 분해능 인자를 갖는 단백질도 분리할 수 있는 것으로 관찰되었다.
본 발명의 구체예는 매우 낮은 분해능 인자를 갖는 경우에도 단백질을 분리할 수 있는 것으로 관찰되었다. 또한 컬럼에 로딩된 개별 단백질의 화학적 성질 및 양을 고려하고, 적용될 단백질의 유형 및 양에 대해 구체적으로 최적 용리 완충액 염 농도를 계산적으로 예측하고, 예측된 최적 염 농도를 갖는 용리 완충액으로 용리를 수행함으로써, 본 발명의 구체예는 심지어 매우 유사한 단백질을 서로 분리할 수 있고 및/또는 하나 이상의 표적 단백질을 정확히 원하는 양 및/또는 순도로 포함하는 표적 용리 부피를 정확하게 예측할 수 있음이 관찰되었다.
구체예에 따르면, 제1 및 제2 표적 단백질은 동일한 아미노산 서열을 갖지만 상이한 유형, 수 또는 위치의 PTM을 갖는 단백질의 변이체이다. 특히, 제1 및 제2 표적 단백질은 글리코형이다.
구체예에 따르면, 제1 및 제2 표적 단백질은 동일한 아미노산 서열을 갖고 FAB 단편 상에 상이한 수의 글리코실 기를 포함하는 항체 단량체이다.
일부 구체예에 따르면, 용리 과정은 다수의 상이한 용리 완충액("계단")이 순차적으로 적용되는 계단식 용리 과정이다. 이 경우에, (가장 적합한) 용리 염 농도의 계산적 확인, 계산된 용리 염 농도의 함수로서 표적 용리 부피의 풀링 경계의 계산 및 계산된 염 농도를 갖는 용리 완충액의 적용이 단계 각각에 대해 수행된다.
예를 들어, 다수의 크로마토그래피 시뮬레이션 각각은 둘 이상의 용리 단계를 사용하는 크로마토그래피 과정의 시뮬레이션일 수 있고, 이에 의해 각 용리 단계에서, 상이한 용리 염 농도를 갖는 용리 완충액이 사용된다. 계산된 용리 완충액 염 농도는 일련의 상이한 용리-단계 특이적 용리 완충액 염 농도이다. 크로마토그래피 컬럼에 계산된 염 농도를 갖는 용리 완충액을 적용하는 것은 계산된 일련의 용리-단계 특이적 염 농도에 따라 상이한 염 농도를 갖는 일련의 용리 완충액의 단계적으로 적용하는 것을 포함한다.
구체예에 따르면, 적용된 단백질 용액은 각각의 둘 이상의 표적 단백질 및 존재하는 경우 각각의 하나 이상의 추가 단백질을, 적어도 0.5중량%, 특히 적어도 1중량%, 특히 적어도 2중량%의 각각의 농도로 포함한다.
출원인은 단백질 농도가, 특히 상기 명시된 범위 이내인 경우, 단백질의 용리 거동에 영향을 미침을 관찰했다. "최소량 임계값"으로도 지칭되는 위에서 언급한 임계값을 초과하는 컬럼에 적용된 단백질 용액에 포함된 단백질 각각의 농도를 고려하여, 적합한 용리 완충액 염 농도의 예측의 정확성이 증가될 수 있다. 컬럼에 적용된 단백질은 다양한 방식으로 서로 간에 및 고정상과 상호작용할 수 있다. 일부 단백질은 다른 것이 컬럼 수지에 결합하는 것을 차단할 수 있고, 고정상에 대한 결합과 관련하여 다른 단백질과 경쟁하거나, 결합을 촉진할 수 있다. 단백질 용액에 포함된 모든 단백질(즉, 농도가, 존재하는 경우, 위에서 언급한 최소 양 임계값을 초과하는 모든 표적 단백질 및 모든 추가 단백질)의 화학적 특성 및 농도를 고려하여, 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어의 계산 및 예측의 정확성이 크게 증가될 수 있다.
바람직하게는, 컬럼에 적용된 단백질 용액은 단지 하나 이상의 표적 단백질 및 일반적으로 또한 하나 이상의 비표적 단백질을 포함하는 사전 정제된 단백질 용액이다. 예를 들어, 처음에는, 전체 단백질이 세포 배양물, 예를 들어 하나 이상의 관심 표적 단백질을 생산하도록 변형된 세포 배양물로부터 추출될 수 있다. 다음 단계에서, 이 세포 배양 단백질 추출물은 단지 작은 수의 단백질, 바람직하게는 단지 하나 이상의 표적 단백질 및 가능한 한 적은 다른 단백질을 얻기 위해 사전 정제된다. 그러나, 흔히 사전 정제 단계에서 하나 이상의 표적 단백질을 순수한 형태로 얻는 것이 가능하지 않다. 예를 들어, 세포 배양 단백질 추출물은 수천 가지 다른 유형의 단백질을 포함할 수 있다. 사전 정제 단계에서, 단백질 추출물은 친화도 크로마토그래피 컬럼에 적용되어 제한된 단백질 세트, 예를 들어 특정 단백질 서열을 갖거나 특정 에피토프를 갖는 모든 단백질을 얻는다. 따라서, 양이온 크로마토그래피 컬럼에 적용된 단백질 용액은 세포 배양 추출물 또는 기타 공급원에 친화도 크로마토그래피와 같은 사전 정제 과정을 수행하여 얻어진 단백질 용액일 수 있다.
예를 들어, 친화도 크로마토그래피 컬럼을 사용한 사전 정제 접근법의 결과로 얻은 단백질 용액 중의 단백질은 특정 단백질의 모든 글리코형, 예를 들어 임의의 글리코실 기가 없는 글리코형, 하나의 글리코실 기를 포함하는 두 번째 글리코형, 여러 상이한 유형의 글리코실 기를 포함하는 두 번째 글리코형, 첫 번째 글리코형과 동일한 글리코실 기를 포함하지만 상이한 위치에 있는 세 번째 글리코형 등으로 구성될 수 있다. 선택적으로, 단백질 용액은 바람직하지 않거나/관심이 없지만 어떤 이유로든 사전 정제 단계 동안 제거에 실패한 추가 단백질을 추가로 포함할 수 있다.
일반적으로, 양이온 크로마토그래피 컬럼에 적용된 단백질 용액에 포함된 단백질 유형의 수는 제한되고 세포 배양 추출물 중의 단백질 수보다 훨씬 작다. 예를 들어, 양이온 크로마토그래피 컬럼에 적용된 단백질 용액에 포함된 단백질 유형의 수는 일반적으로 10 미만, 흔히 5 미만이다.
구체예에 따르면, 컬럼에 적용된 단백질 용액은 제1 P1 및 제2 P2 표적 단백질 및 오염 단백질으로 간주되는 추가 단백질 P3을 포함한다. 컬럼의 고정상에 대한 제2 표적 단백질 P2 및 추가 단백질 P3의 친화도는 고정상에 대한 제1 표적 단백질의 친화도와 유사하여 P1, P2 및 P3의 중첩되는 용리 거동을 유발한다.
예를 들어, 단백질 P1, P2 및 P3은 동일한 단백질의 글리코형 또는 기타 PTM 변이체이고 따라서 고정상에 대해 유사한 친화도를 갖는다. P3로부터 P1 및 P2를 분리하고 원하는 비율로 P1 및 P2를 제공하는 것은 일반적으로 종래 기술의 양이온 크로마토그래피 접근법에서 실현 가능하지 않았다. 본 발명의 구체예는 먼저 적합한 용리 염 농도를 예측한 다음, 이 최적 염 농도 및 다른 파라미터 값을 기반으로 풀링 경계를 특히 정확한 방식으로 예측하는 것을 허용할 수 있고, 이는 표적 단백질을 다른 단백질과 더욱 정확하게 분리하도록 허용하거나- 이 경우 피크가 강하게 중첩하는 것이 물리적으로 불가능함 - 적어도 (P3 오염과 관련하여) 허용 가능한 정도의 순도로 원하는 비율의 두 표적 단백질 P1 및 P2를 포함하는 표적 용리 부피를 수집하는 것을 허용한다.
구체예에 따르면, 컬럼에 적용된 단백질 용액 중의 단백질의 총량은 컬럼의 최대 단백질 로드 용량과 동일하거나 이보다 작고, 특히 최대 단백질 로드 용량의 50% 내지 100%, 예를 들어 50% 내지 90% 범위이다.
출원인은 이 양 범위 이내에서, 크로마토그래피 절차가 적용된 단백질 용액에 포함된 단백질의 농도 및 화학적 특성에 특히 민감함을 관찰했다. 적용된 단백질 용액에 포함된 단백질 각각의 양을 고려하여, 가장 적합한 용리 염 농도에 대한 예측 정확도가 크게 증가한 것으로 관찰되었다.
구체예에 따르면, 계산된 표적 용리 부피의 풀링 경계는 수집 시작 시간 오프셋 및 수집 중지 시간 오프셋 형태로 명시된다. 방법은 다음 단계를 포함한다:
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크로마토그래피 컬럼을 포함하는 자동화된 크로마토그래피 시스템으로, 용리의 시작 이후 경과된 시간을 지속적으로 모니터링하는 단계;
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경과된 시간이 수집 시작 시간 오프셋과 같을 때 크로마토그래피 시스템으로 용리된 용리 완충액의 수집을 자동으로 시작하는 단계; 및
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경과된 시간이 수집 중지 시간 오프셋과 같을 때 크로마토그래피 시스템으로 용리된 용리 완충액의 수집을 중지하는 단계.
구체예에 따르면, 방법은 적용된 단백질 용액에 포함된 제1 및 제2 표적 단백질 각각의 양 및 선택적으로 또한 적용된 단백질 용액에 포함된 하나 이상의 추가 단백질 각각의 양을, 존재하는 경우, 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어에 입력하는 것을 포함한다.
시뮬레이션은 적어도 다음을 포함하는 파라미터 값의 세트의 함수로서 계산된다:
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제공된 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼의 치수; 예를 들어, 길이, 직경 및 높이 또는 총 부피가 제공될 수 있다; 또한 치수가 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어에 알려진 사전 정의된 컬럼 유형의 세트 중 하나를 선택할 수 있다; 및
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제1 및 제2 표적 단백질의 양 및 선택적으로 또한 컬럼에 적용된 하나 이상의 추가 단백질의 양. 예를 들어, 제1 및 제2 표적 단백질 및 단백질 용액에 포함된 임의의 추가 단백질의 양은 적합한 단백질 분석 예를 들어 280 nm에서 UV 측정에 의한 총 단백질 양에 의해 시뮬레이션을 계산하기 전에 측정될 수 있고; 상이한 글리코실화 패턴으로 인한 상이한 컬럼에 적용된 단백질의 약간 상이한 분자량은 양이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피(CEX- HPLC)에 의해 결정될 수 있다. 이 분자량 정보는 예를 들어 컬럼에 적용된 특정 단백질의 단백질 분자의 수 / 몰 농도를 계산하기 위해 및/또는 표적 용리 부피 중의 표적 단백질 비율이 예를 들어 요청된 양, 비율 또는 순도를 충족하는지 여부를 확인하기 위해 사용될 수 있다.
출원인은 컬럼에 적용된 단백질의 양이 경우에 따라 크게 다를 수 있음을 관찰했다. 컬럼에 적용된 개별 단백질의 양 및 컬럼 치수를 고려하는 것은 특히 정확하게 원하는 양 및/또는 순도로 표적 단백질을 포함하는 표적 용리 부피를 얻기에 가장 적합한 용리 완충액 염 농도를 계산 및 예측하는 것을 허용할 수 있다. 이후, 이러한 특정 계산적으로 결정된 염 농도는 크로마토그래피 절차 수행에 실제로 사용되는 용리 완충액의 염 농도로서 사용된다. 추가로, 계산적으로 결정된 용리 완충액 염 농도는 원하는 양 및/또는 순의 표적 단백질을 포함하는 표적 용리 부피의 풀링 경계를 예측하기 위해 사용된다. 계산적으로 예측된 풀링 경계는 인간 또는 자동화된 용리 완충액 수집 유닛으로 출력될 수 있고, 이에 의해 원하는 양 및/또는 순도의 하나 이상의 표적 단백질을 얻는 것을 용이하게 한다.
따라서, 본 발명의 구체예에 의해 얻어진 용리 완충액은 "표준"/"모두에게 적합한" 용리 완충액이 아니라, 단백질 용액에 포함된 단백질의 유형 및 양에 특이적으로 적합화되고 컬럼의 치수에 적합화된 용리 완충액이다. 출원인은 각각의 개별 경우에서 용리 염 농도를 사용된 컬럼 및 컬럼에 적용된 단백질의 양에 적합화시키는 것이 상이한 단백질을 분리하는 크로마토그래피 컬럼의 능력을 크게 증가시킬 수 있음을 관찰했다.
구체예에 따르면, 시뮬레이션은 ("후보 염 농도"로도 지칭될 수 있는) 다수의 상이한 염 농도 및 ("후보 pH 값"으로도 지칭될 수 있는) 다수의 상이한 용리 완충액 pH 값 모두의 함수로서 수행된다. 시뮬레이션의 결과로서 특정 염 농도 및 pH 값의 조합이 최적화 기준을 가장 잘 충족시킴이 확인된다. 이러한 염 농도 및 pH 값의 쌍은 실제로 단백질을 용리하는 데 사용되는 용리 완충액의 염 농도 및 pH 값으로서 사용된다.
구체예에 따르면, 파라미터의 세트는 추가로 다음을 포함한다:
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용리 완충액의 사전 정의된 pH 값; 예를 들어, pH 값은 이전에 표적 단백질 또는 유사한 단백질을 용리하기 위해 이미 성공적으로 사용된 용리 완충액의 pH 값일 수 있다;
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컬럼을 통한 용리 완충액의 유속;
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적용된 단백질 용액의 단백질의 화학적 특성.
컬럼을 통한 용리 완충액의 유속은 미리 설정된 속도로 컬럼을 통해 용리 완충액을 펌핑하도록 구성된 용리 완충액 펌프에 의해 설정된 유속일 수 있다. 유속은 예를 들어 ml/분으로 명시될 수 있다. 컬럼 직경이 알려져 있으므로 유속은 예를 들어 mm/sec로도 지정될 수 있고 유속을 mm/sec 값으로부터 ml/분으로 유도할 수 있다.
일부 구체예에서, 펌프에 의해 생성된 유속은 펌프를 구성함으로써 사용자에 의해 설정될 수 있다. 일부 구체예에서, 사용자는 각각의 크로마토그래피 실행을 위해 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어에서 수동으로 (펌프의 디스플레이에 표시될 수 있는) 용리 완충액 유속을 입력한다. 다른 구체예에서, 용리 완충액 유속은 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어의 구성 파일에 저장되고 사용자가 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어의 구성 파일 및 펌프의 설정에서 용리 완충액 유속을 수정할 때까지 다중 크로마토그래피 실행을 위해 재사용된다.
컬럼에 적용된 표적 단백질 및 선택적으로 또한 하나 이상의 추가 단백질의 양뿐만 아니라 화학적 특성을 고려하는 것은 시뮬레이션 및 예측의 정확성을 더욱 증가시킬 수 있다.
구체예에 따르면, 사용자에게 실제로 출력되는 풀링 경계는 쉬운 이해를 위해 다른 형식으로 변환될 수 있다. 예를 들어, 수집 시작 시간 오프셋 및 수집 중지 시간 오프셋은, 또한 예측될 수 있고 광학적으로 측정된 280 nm 피크 신호와 경험적으로 비교될 수 있는, "280 nm 피크"(용출액 중의 총 단백질 농도의 피크를 나타냄)의 시작으로부터 출발하는 시간 오프셋으로 지정될 수 있다. 마찬가지로, 수집 시작 시간 오프셋 및 수집 중지 시간 오프셋은 "컬럼 부피"로 명시될 수 있다.
양이온-크로마토그래피 실행을 시뮬레이션하고 특정 단백질의 용리 프로파일을 예측하기 위한 많은 상이한 계산 접근법이 존재하며 시뮬레이션을 수행하고 본 발명의 구체예에 따른 표적 용리 경계를 예측하기 위해 사용될 수 있다.
예를 들어, Wittkopp F, Peeck L, Hafner M, Frech C.는 J Chromatogr A. 2018;1545:32-47. doi:10.1016의 "Modeling and simulation of protein elution in linear pH and salt gradients on weak, strong and mixed cation exchange resins applying an extended Donnan ion exchange model"에서 선형 크로마토그래피에서 단일클론 항체의 이온 교환 크로마토그래피의 모델링 및 시뮬레이션을 위한 Donnan 평형 이온 교환 (DIX) 모델의 적용을 설명한다. 이 간행물은 낮은 단백질 농도에서 크로마토그래피 컬럼 내부의 조건에 대한 설명을 다루지만 단백질 분리의 최적화와 관련이 없다.
또 다른 예에 따르면, Muller-Spath T, Strohlein G, Aumann L, 등은 "Model simulation and experimental verification of a cation-exchange IgG capture step in batch and continuous chromatography", J Chromatogr A. 2011;1218(31):5195-5204, doi:10.1016에서 정제된 mAbs의 기공률, 머무름 인자 및 물질 전달 파라미터와 같은 모델 파라미터를 사용하는 집중 동역학 모델에 기반하여 단일 컬럼 배치 및 다중컬럼 연속 크로마토그래피(MCSGP)를 사용하는 단일클론 항체 (mAb) 정제 과정의 양이온 교환 포획 단계의 시뮬레이션을 설명한다.
구체예에 따르면, 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어는 시뮬레이션 계산 및/또는 표적 용리 부피의 풀링 경계 계산을 위한 수학적 모델의 조합을 사용하도록 구성된다. 모델은 다음을 포함한다:
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컬럼의 간극 부피에서 용리 완충액의 단백질 각각의 농도, 염 농도 및 pH-값을 상호 관련시키도록 구성된 컬럼 모델; 및
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컬럼의 고정상의 기공 부피에서 용리 완충액의 단백질 각각의 농도, 염 농도 및 pH 값을 상호 관련시키도록 구성된 기공 모델; 및
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고정상의 단백질 각각의 농도, 용리 완충액 염 농도 및 단백질 용액의 단백질 각각(표적 및 선택적으로 추가)의 화학적 특성의 적어도 일부를 상호 관련시키도록 구성된 반응 모델.
다수의 상이한 컬럼 모델, 기공 모델 및 반응 모델이 문헌에 설명된다. 이러한 모델 중 다수가 지속적으로 개선된다. 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 모델의 예를 설명하는 참조 목록은 예를 들어 도 4C의 설명에 개시된다.
예를 들어, 컬럼 모델은 Schmidt Traub et al., "Preparative Chromatography" 2012, Viley-VCH에 따라 구현될 수 있다. 기공 모델은 Schmidt Traub et al., "Preparative Chromatography" 2012, Viley-VCH에 따라 구현될 수 있다. 반응 모델은 Kluters et al., "Application of linear pH gradients for the modeling of ion exchange chromatography: separation of monoclonal antibody monomer", J Sep Sci, 2016 Feb, 93(4), 663-675에 따라 구현될 수 있다. 반응 모델의 파라미터 및/또는 모델 자체는 실험 데이터의 설명을 용이하게 하기 위해 다양한 수준의 복잡성에서 수정될 수 있다. 이는 예를 들어 Huuk 등의 "Modeling of complex antibody elution behavior under high protein load densities in ion exchange chromatography using an asymmetric activity coefficient" Biotechnol. J., 12: 1600336. doi:10.1002/biot.201600336에서 입증된다. 이 간행물은 일반화된 이온 교환 등온선이 높은 단백질 로딩 조건에서 단일 단백질 종의 분리를 모델링하는 데 어떻게 사용될 수 있는지를 설명한다.
기공 모델, 컬럼 모델 및 반응 모델은 염 농도 및 단백질 농도를 통해 상호 관련된다. 컬럼 모델 및 기공 모델은 염 농도 
에 의해 상호 연결되므로, 기공 모델의 방정식이 컬럼 모델에 삽입될 수 있다.
반응 모델의 첫 번째 식은 
항을 통해 컬럼 모델에 삽입될 수 있다. 결합 강도 및 따라서 단백질의 화학적 특성을 설명하는 파라미터는 평형 상수 Keq 및 결합 자리의 수 v이다. 둘 모두 v (반응 모델의 두 번째 식)를 통해 pH에 의존한다.
따라서, 원하는 양, 비율 및/또는 순도의 표적 단백질을 용리하기 위해 필요한 용리 완충액의 염 농도는 pH 값, 적용된 단백질의 양 및 화학적 특성, 컬럼 치수 및 펌프에 의해 정의된 용리 완충액 유속과 같은 파라미터의 세트를 기반으로 계산될 수 있다.
표적 단백질 또는 추가 단백질의 단백질 양은 크로마토그래피 컬럼을 떠나는 이동상 중의 이 단백질의 농도의 시간 경과에 따른 적분이다. 계산 소프트웨어는 염 농도 cSALT를 변경하고 최적화 기준에 가장 일치하는 단백질 용리 프로파일을 제공하는 염 농도를 식별하기 위해 염 농도의 함수로서 표적 단백질 및 임의로 또한 하나 이상의 추가의 용리 프로파일의 예측을 수행한다.
컬럼 모델
구체예에 따르면, 컬럼 모델에서 명시된 상호 관계는 다음에 따른 컬럼 모델 공식을 포함한다:
이에 의해, i는 특정 단백질에 대한 인덱스이고, t는 시간이고, x는 세로 컬럼 축을 따른 컬럼 내 위치이고, cSALT는 컬럼의 이동상(즉, 무시할 만한 양의 적용된 단백질 용액을 포함하는 용리 완충상) 중의 자유 (미결합) 염 이온(일반적으로 양이온 교환 크로마토그래피에 대해 Na+)의 농도이고, cPROT_i는 컬럼의 이동상 중의 단백질 i의 농도이고, qPROT_i는 고정상에 결합된 단백질 i의 농도이고, uint는 컬럼과 고정상 입자 사이의 흐름에 의해 얻을 수 있는 속도로 정의되는 틈새 유속이고, εcol은 간극 기공률(컬럼 단면의 개기공 면적)이다. 이는 간극 부피 및 컬럼 부피의 비율로서 정의되고, 이에 의해 간극 부피는 입자 외부의 컬럼 내 용리 완충액 부피이고, εp는 입자 기공률(입자 자체 내부 기공률(기공 부피)로 정의됨)이고, Dax는 축방향 분산 계수이다. 축방향 분산 계수는 컬럼의 종방향을 따라 불활성 미량 물질의 퍼짐 정도의 측정치이다. Dax는 픽의 법칙에 설명된 바와 같이 축방향 분산을 기재한다.
기공률 εcol, ε_p 및 분산 계수 Dax는 용리 단백질 피크의 분리에 영향을 미칠 수 있는 파라미터이다. 기공률은 일반적으로 고정되고 컬럼에 포함된 크로마토그래피 수지에 의해 결정된다. 바람직하게는, 이들은 기본 값, 예를 들어 구성 파일로서 저장되지만, 상이한 고정상 재료가 사용되는 경우에 수정될 수 있다.
따라서, 본 발명의 구체예에 따르면, 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼의 치수는 수직 컬럼 위치 x에 의해 반영된 컬럼 내 위치뿐만 아니라 틈새 유속(기공 모델에서 컬럼 직경에 대한 유동의 정규화)을 통해 고려된다. 컬럼의 길이와 직경의 조합은 컬럼의 총 부피를 한정한다.
틈새 유속은 컬럼을 통한 용리 완충액의 유속으로부터 계산적으로 유도된다.
예를 들어, 사용자는 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어에 용리 완충액 유속 "ebfr"을 [mm/s] 단위로 입력할 수 있다. 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어는 틈새 유속 u(int) [mm/s]을 다음 공식에 따라 계산한다:
u(int) = ebfr/εcol
여기서 εcol은 간극 컬럼 기공률이다 (단위 없음).
용리 완충액 유속(컬럼을 통해 용리 완충액을 펌핑하도록 구성된 펌프에 의해 정의될 수 있음)으로부터 틈새 유속을 얻는 방법에 대한 구체적인 예는 Schmidt-Traub, Henner, ed. "Preparative chromatography: of fine chemicals and pharmaceutical agents", John Wiley & Sons, 2006에 기재된다.
기공 모델
구체예에 따르면, 기공 모델에 명시된 상호 관계는 다음에 따른 기공 모델 공식을 포함한다:
이에 의해, i는 특정 단백질에 대한 인덱스이고, t는 시간이고, x는 세로 컬럼 축을 따른 컬럼 내 위치이고, cSALT는 컬럼의 이동상 중의 자유 (미결합) 염 이온의 농도이고, cPROT_i는 컬럼의 이동상 중의 단백질 i의 농도이고, qPROT_i는 고정상에 결합된 단백질 i의 농도이고, εcol은 간극 컬럼 기공률이고, ε_p는 입자 기공률이고, keff는 유효 물질 전달 계수이고 (간극 이동상으로부터 기공 부피로의 단백질의 이동을 기재함), 
는 2.7 내지 3.3 범위, 특히 3.0의 수치 값이고, 
는 크로마토그래피 비드의 반경이다. 파라미터 z는 컬럼 재료의 기하학적 측면에 따라 다르다. 파라미터 z를 얻는 방법에 대한 구체적인 예는 Schmidt-Traub, Henner, ed. Preparative chromatography: of fine chemicals and pharmaceutical agents. John Wiley & Sons, 2006, 페이지 338-339에 기재된다.
한 예에 따르면, 틈새 유속은 다음과 같이 컬럼을 통한 용리 완충액의 유속과 관련될 수 있다:
부피 유량 up (mL/분)으로도 지칭되는 컬럼을 통한 유속은 컬럼을 통해 펌핑되는 이동상의 부피를 기재한다. 크로마토그래피 컬럼 치수에 대한 유속의 정규화를 위해, 유속은 컬럼 부피 및 길이를 사용하여 컬럼 직경과 관련하여 정규화될 수 있다. 유속 u의 단위는 다음 공식에 따라 (mm/s)로 변경된다:
틈새 유속은 간극 컬럼 부피만을 (즉, 다공성 크로마토그래피 비드 사이의 부피만을) 고려하여 크로마토그래피 비드의 기공률에 관한 유속을 추가적으로 정규화한다. 사용된 크로마토그래피 컬럼의 간극 부피 및 총 컬럼 부피의 비율은 
이다:
따라서 파라미터 
는 간극 부피 및 총 컬럼 부피의 분율이다.
컬럼의 고정상은 비드의 매트릭스로 설명될 수 있다. 컬럼 안의 모든 비드의 총 부피는 "비드 부피"로 지칭되고 여기서 각 비드의 부피는 비드의 고정상 물질에 의해 소모된 부피 및 비드에 포함된 기공의 부피를 모두 포함한다. 크로마토그래피 컬럼의 간극 부피 
는 컬럼의 총 부피 빼기 컬럼에 포함된 모든 비드의 총 비드 부피 
로 정의된다. 구체예에 따르면, 컬럼 모델 및 코어 모델이 조합된다. 예를 들어, 구체예에 따르면, 적어도 계산된 염 농도의 함수로서 표적 용리 부피를 계산하는 것은 고정상 중의 염 농도 및 단백질 i의 농도의 함수로서 간극 부피 중의 단백질 i의 농도를 계산하기 위한 컬럼 모델 공식 및 기공 모델 공식을 포함한다.
구체예에 따르면, 적어도 계산된 염 농도의 함수로서 표적 용리 부피의 풀링 경계의 계산은 다수의 상이한 용리 시간 t에서 위치 x=컬럼 길이에서 제1 표적 단백질의 농도를 계산하기 위해 컬럼 모델 공식 및 기공 모델 공식을 사용하는 것을 포함한다.
반응 모델
구체예에 따르면, 반응 모델에서 명시된 상호 관계는 다음을 포함한다:
- 다음에 따른 제1 반응 모델 공식:
- 다음에 따른 제2 반응 모델 공식:
- 다음에 따른 제3 반응 모델 공식:
이에 의해, i는 특정 단백질에 대한 인덱스이고, t는 시간이고, x는 수직 컬럼 축을 따른 컬럼 내 위치이고, cSALT는 컬럼의 이동상 중의 자유 (미결합) 염 이온의 농도이고, cPROT_i는 컬럼의 이동상 중의 단백질 i의 농도이고, qPROT_i는 고정상에 결합된 단백질 i의 농도이고, Kkin은 반응 속도이고 (탈착 속도의 역수 값으로 정의되고 고정상의 리간드로부터 이온을 대체하는 단백질의 반응 속도를 설명함), Keq는 평형 상수이고 (즉, 고정상의 특정 단백질 i의 몰 농도를 이동상의 단백질 i의 몰 농도로 나눈 값), Λ는 리간드 밀도이고 (컬럼 부피당 몰 단위의 리간드 수로 정의됨), 
_i는 결합 자리의 수이고 (즉, 고정상에 대한 단백질 결합에 참여하는 단백질 i의 결합 자리의 수), σ_i는 차폐 계수이고 (즉, 단백질 i가 고정상에 결합할 때 차폐되는 단백질 i의 결합된 단백질 분자당 리간드의 수), N_(carb,i)는 고정상과 상호작용하는 단백질 i의 카르복시 자리의 수이고, N_(his,i)은 고정상과 상호작용하는 단백질 i의 히스티딘 자리의 수이고, N_(N-term,i)은 고정상과 상호작용하는 단백질 i의 N 말단 자리의 수이고, N_(ami,i)은 고정상과 상호작용하는 단백질 i의 아미노 자리의 수이고, pH는 용리 완충액의 pH 값이고, 
는 단백질 i의 흡수 및 미결합 상태 사이의 표준 자유 깁스 엔탈피 차이이고, 
은 염의 흡수 및 미결합 상태 사이의 표준 자유 깁스 엔탈피 차이이고, 
는 고정상과 상호작용하는 단백질 i의 모든 카르복실-기의 평균 산 해리 상수(Ka)이고, 
는 고정상과 상호작용하는 단백질 i의 모든 히스티딘-아미노-산의 평균 Ka이고,
는 고정상과 상호작용하는 단백질 i의 모든 N-말단 α-아미노 기의 평균 Ka이고, 
는 단백질 i의 모든 아미노 산의 평균 Ka이고, R은 기체 상수이고, T는 컬럼 및 용리 완충액의 온도이다. 고정상 중의 특정 단백질 "i"의 농도("qPROT(i)")는 제1 및 제2 반응 모델 공식을 사용하여 세 번째 반응 모델 공식을 qPROT(i)로 분석하여 용리 완충액의 pH 값의 함수로서 계산된다.
염 농도는 제1 반응 모델 공식을 통해 고정상에서 결합된 단백질의 양에 영향을 미친다: 낮은 염 농도에서 단백질은 크로마토그래피 컬럼에 결합하고, 더 높은 염 농도에서 단백질은 염 이온에 의해 대체되어 용리된다. 반응 모델에서 결합 자리의 수 ν 및 평형 상수 Keq로 구성된 단백질의 결합 강도에 따라, 단백질이 상이한 염 농도에서 용리된다. 적절한 염 농도를 선택함으로써, 표적 단백질은 원하지 않는 단백질이 크로마토그래피 컬럼에 결합된 상태로 있는 동안 용리될 수 있다. 이러한 파라미터 값 중 일부는 단백질 특이적이고 문헌으로부터 유도될 수 있다. 이러한 파라미터 중 일부는 단백질 및 모델 특이적이다. 이들은 또한 문헌으로부터 유도되거나 사용된 각 모델을 공개한 저자에 의해 일반적으로 설명된 몇 가지 예비 경험적 보정 단계를 수행하여 얻을 수 있다. 예를 들어, 고정상과 상호작용하는 단백질 i의 카르복시 자리의 수를 나타내는 N_(carb,i)과 같은 파라미터는 단백질 특이적이지만 시뮬레이션을 수행하기 위해 사용되는 모델에 따라서도 달라진다. 고정상과 실제로 상호작용하는 카르복실 자리의 수는 사용된 반응 모델에 설명된 입체 효과에 의해 제한된다. 고정상과 상호작용하는 각 자리의 수는 단백질 특이적 및 모델 특이적 경험적 테스트를 사용하여 결정된다. 일부 단백질의 경우, 파라미터 값은 이미 문헌으로부터 파생될 수 있다. 깁스 에너지 
G0 P/RT 및 
G0 s/RT는 또한 단백질 용액 중의 단백질 각각에 대해 실험적으로 결정될 수 있거나 문헌으로부터 유도될 수 있다.
pH 값은 단백질의 결합 자리 v의 수에 영향을 미친다 (두 번째 식). 결합 자리 v의 수는 평형 상수 Keq에 영향을 미친다 (세 번째 식). 이에 의해, pH 값은 반응 모델의 식 1의 염 농도에 연결된다.
따라서, 반응 모델은 pH 값 및 단백질의 화학적 특성의 기여도를, 예를 들어 단백질의 특정 기의 pKa에 관해서 및 단백질의 결합 자리 v에 관해서 고려한다. 반응 모델은 또한 염 농도를 고려하여, 이에 의해 용리 완충액 염 농도를 용리될 단백질의 화학적 특성과 상호 연관시킨다. 염 농도 cSALT는 결합 자리 v의 수를 통해 단백질 결합 특징에 직접 연결된 첫 번째 식의 일부이다.
그러나, 위에 기재된 반응 모델은 반응 모델을 구현할 수 있는 많은 가능한 방법 중 하나일 뿐이다. 양이온 크로마토그래피 실행의 모델링 및 시뮬레이션은 진행 중인 연구 분야이므로, 시뮬레이션을 수행하기 위해 본원에 기재된 공식 및 모델의 다양한 수정이 마찬가지로 사용될 수 있다. 현재 문헌에 기재된 대안의 컬럼, 기공 및 반응 모델을 사용할 수도 있고, 향후 적어도 여러 상이한 용리 완충액 염 농도의 함수로서, 바람직하게는 컬럼에 적용될 단백질의 양 및 화학적 특성과 같은 추가 파라미터의 함수로서 크로마토그래피 시뮬레이션을 수행하기 위해 사용될 수 있는 새로운 컬럼, 기공 및 반응 모델이 개발되고 게시될 수 있다.
한 구체예에 따르면, 예를 들어 도 7을 참조하여 기재된 단백질 P1-P3의 다음의 모델 특이적 화학적 특성 값이 제공되고 적합한 용리 완충액 염 농도 및 풀링 경계의 계산 동안 반응 모델에 의해 입력으로서 사용된다:
추가로, 다음 입력 파라미터 값이 반응 모델에 예를 들어 GUI, 구성 파일 또는 기타 데이터 소스를 통해 제공될 수 있다:
차폐 인자는 변이체 1에서 변이체 3으로 더 작아지는데 이는 감소하는 글리코실화 등급 및 따라서 변이체 1로부터 변이체 3까지의 단백질 크기에 일치한다.
위에서 언급한 파라미터 값은 GUI를 통해 사용자에 의해 제공될 수 있고 및/또는 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어의 구성 파일에서 지정될 수 있다.
모델 파라미터를 획득 및/또는 추정하기 위한 다양한 접근법이 존재한다. 예를 들어, 2015년 11월 9일에 최초 공개된 Simon Kluters 등의 연구 논문 "Application of linear pH gradients for the modeling of ion exchange chromatography: Separation of monoclonal antibody monomer from aggregates" (https://doi.org/10.1002/jssc.201500994)은 크로마토그래피 컬럼에서 이온 교환의 기계론적 모델 및 이 모델의 파라미터가 어떻게 얻어질 수 있는지를 설명한다.
추가 양태에서, 본 발명은 시뮬레이션 소프트웨어를 포함하는 크로마토그래피 제어 시스템에 관한 것이다. 예를 들어, 크로마토그래피 제어 시스템은 크로마토그래피 시스템의 수동 제어를 인도하기 위해, 또는 제어 시스템의 완전 자동 또는 반자동 제어를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 시뮬레이션 소프트웨어는 원하는 제1 양의 제1 표적 단백질을 포함하는 표적 용리 부피의 풀링 경계를 얻는 방법을 수행하도록 구성된다. 크로마토그래피 제어 시스템은 다음을 위해 구성된다:
- 최적화 기준을 수용하고 최적화 기준을 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어에 입력하는 단계, 최적화 기준은 표적 용리 부피에 포함된 제1 및 제2 표적 단백질에 대한 표적 용리 부피의 원하는 특성임;
- 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어를 사용하여, 최적화 기준과 가장 일치하는 표적 용리 부피가 얻어질 수 있도록 크로마토그래피 컬럼으로부터 제1 및 제2 표적 단백질을 용리하도록 적합화된 용리 완충액 염 농도를 계산하는 단계, 계산은 다수의 상이한 용리 완충액 염 농도로서 다수의 크로마토그래피 시뮬레이션을 계산하는 것을 포함함;
- 적어도 계산된 염 농도 및 입력 최적화 기준의 함수로서 표적 용리 부피의 풀링 경계를 계산하는 단계;
- 계산된 염 농도 및 풀링 경계를 출력하는 단계 및/또는
- 계산된 표적 용리 부피가 계산된 풀링 경계에 따라 별도의 분획으로 자동으로 수집되도록 용리 부피 수집 유닛을 제어하는 단계.
구체예에 따르면, 시스템은 다음을 위해 추가로 구성된다:
- 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼의 치수를 수용하는 단계; 및
- 제1 및 제2 표적 단백질의 양 및 선택적으로 또한 컬럼에 적용된 하나 이상의 추가 단백질의 양을 수용하는 단계;
시뮬레이션 및/또는 풀링 경계는 적어도 다음을 포함하는 파라미터 값의 세트의 함수로서 계산된다:
·
제공된 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼의 치수; 및
·
제1 및 제2 표적 단백질의 양 및 선택적으로 또한 컬럼에 적용된 하나 이상의 추가 단백질의 양.
구체예에 따르면, 파라미터의 세트는 추가로 다음을 포함한다:
·
용리 완충액의 사전 정의된 pH 값,
·
컬럼을 통한 용리 완충액의 유속;
·
적용된 단백질 용액의 단백질의 화학적 특성.
본 발명의 구체예에 따르면, 제1 단백질의 원하는 제1 양은 원하는 제1 단백질의 원하는 절대량으로 명시된다. 특히, 제1 표적 단백질의 원하는 양은 용리 완충액의 수집된 부피 중의 제1 단백질의 원하는 농도 또는 이의 파생 값의 형태로 명시될 수 있다.
다른 구체예에 따르면, 적용된 단백질 용액은 제1 표적 단백질, 제2 표적 단백질 및 0, 하나 이상의 추가 단백질을 포함한다. 제1 단백질의 원하는 제1 양은 상대량 형태로 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어에 입력된다. 상대량은 제1 표적 단백질 및 제2 표적 단백질의 비율이다. 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어는 적어도 계산된 염 농도 및 입력된 원하는 비율의 함수로서 표적 용리 부피의 풀링 경계를 계산한다. 방법은 원하는 비율의 제1 및 제2 표적 단백질을 포함하는 표적 용리 부피를 생성하기 위해 사용된다.
구체예에 따르면, 다수의 크로마토그래피 시뮬레이션은 다수의 상이한 용리 완충액 염 농도의 함수 및 다수의 상이한 용리 완충액 pH 값의 함수로서 계산된다. 염 농도의 계산은 용리 완충액 염 농도 및 용리 완충액 pH 값의 조합을 계산하는 것을 포함하고, 이들은 조합으로 최적화 기준과 가장 일치하는 표적 용리 부피가 얻어질 수 있도록 크로마토그래피 컬럼으로부터 제1 및 제2 표적 단백질을 용리하도록 적합화된다. 크로마토그래피 시뮬레이션은 용리 완충액 염 농도 및 용리 완충액 pH 값의 조합의 조합을 확인하기 위해 수행된다. 표적 용리 부피의 풀링 경계의 계산은 적어도 용리 완충액 염 농도 및 용리 완충액 pH 값의 계산된 조합 및 입력 최적화 기준의 함수로서 계산된다. 계산된 용리 완충액에 추가하여 계산된 pH 값이 출력된다.
구체예에 따르면, 크로마토그래피 제어 시스템은 출력 용리 염 농도를 갖는 용리 완충액을 자동으로 생성하도록 완충액 혼합 유닛을 제어하기 위해 구성된다.
추가로, 또는 대안적으로, 크로마토그래피 제어 시스템은 상이한 염 농도를 갖는 다수의 이용 가능한 용리 완충액으로부터 하나를 자동으로 선택하도록 적합화된 용리 완충액 선택 유닛을 제어하기 위해 구성되고, 선택된 용리 완충액은 출력 염 농도를 갖는다.
추가로, 또는 대안적으로, 크로마토그래피 제어 시스템은 조합으로 계산되고 출력된 염 농도 및 pH 값 모두를 갖는 용리 완충액을 자동으로 생성하도록 완충액 혼합 유닛을 제어하기 위해 구성된다.
추가로, 또는 대안적으로, 크로마토그래피 제어 시스템은 계산된 표적 용리 부피가 계산된 풀링 경계에 따라 별도의 분획으로 자동으로 수집되도록 크로마토그래피 시스템의 용리 부피 수집 유닛을 제어하기 위해 구성된다.
추가로, 또는 대안적으로, 크로마토그래피 제어 시스템은 상이한 염 농도 및 상이한 pH 값을 갖는 다수의 이용 가능한 용리 완충액으로부터 하나를 자동으로 선택하도록 적합화된 용리 완충액 선택 유닛을 제어하기 위해 구성되고, 선택된 용리 완충액은 조합으로 계산되고 출력된 염 농도 및 pH 값을 모두 포함한다.
추가로, 또는 대안적으로, 크로마토그래피 제어 시스템은 자동으로 생성되거나 선택된 용리 완충액을 크로마토그래피 컬럼에 자동으로 적용하도록 구성된 완충액 적용 유닛을 제어하기 위해 구성되고, 적용된 용리 완충액은 출력 염 농도를 갖거나 조합으로 계산되고 출력된 염 농도 및 pH 값 모두를 갖는다.
추가 양태에서, 본 발명은 크로마토그래피 제어 시스템을 포함하고 위에 언급된 완충액 혼합 유닛 및/또는 용리 완충액 선택 유닛 및/또는 완충액 적용 유닛 및/또는 자동화된 용리 부피 수집 유닛을 추가로 포함하는 크로마토그래피 시스템에 관한 것이다.
추가 양태에서, 본 발명은 크로마토그래피 제어 시스템을 포함하고 출력된 용리 염 농도를 갖는 용리 완충액을 자동으로 생성하도록 적합화된 완충액 혼합 유닛을 추가로 포함하는 크로마토그래피 시스템에 관한 것이다.
추가로 또는 대안적으로, 크로마토그래피 시스템은 상이한 염 농도를 갖는 다수의 이용 가능한 용리 완충액 중 하나를 자동으로 선택하도록 적합화된 용리 완충액 선택 유닛을 추가로 포함하고, 선택된 용리 완충액은 출력 염 농도를 갖는다.
추가로 또는 대안적으로, 크로마토그래피 시스템은 자동으로 생성되거나 선택된 용리 완충액을 크로마토그래피 컬럼에 자동으로 적용하도록 구성된 완충액 적용 유닛을 추가로 포함한다.
추가로 또는 대안적으로, 크로마토그래피 시스템은 출력 풀링 경계에 따라 컬럼을 떠나는 용출된 버퍼의 분획 수집을 자동으로 시작하고 정지하도록 구성된 자동화된 용리 부피 수집 유닛을 추가로 포함한다.
추가 양태에서, 본 발명은 제1 및 제2 표적 단백질을 포함하는 표적 용리 부피가 얻어지도록 크로마토그래피 과정을 관리하는 컴퓨터 프로그램에 관한 것이다. 컴퓨터 프로그램은 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어를 포함하고 다음을 위해 구성된다:
- 표적 용리 부피에 포함된 제1 및 제2 표적 단백질에 대한 표적 용리 부피의 원하는 특성인 최적화 기준을 수용하는 단계;
- 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어를 사용하여, 최적화 기준과 가장 일치하는 표적 용리 부피가 얻어질 수 있도록 크로마토그래피 컬럼으로부터 제1 및 제2 표적 단백질을 용리하도록 적합화된 용리 완충액 염 농도를 계산하는 단계, 계산은 다수의 상이한 용리 완충액 염 농도로서 다수의 크로마토그래피 시뮬레이션을 계산하는 것을 포함함;
- 적어도 계산된 염 농도 및 입력 최적화 기준의 함수로서 표적 용리 부피의 풀링 경계를 계산하는 단계; 및
- 최적화 기준에 따라 제1 및 제2 표적 단백질을 포함하는 표적 용리 부피가 얻어지도록 사용자가 크로마토그래피 시스템을 제어할 수 있도록 하기 위해 계산된 염 농도 및/또는 풀링 경계를 출력하고 및/또는 최적화 기준에 따라 제1 및 제2 표적 단백질을 포함하는 표적 용리 부피가 얻어지도록 크로마토그래피 시스템을 자동으로 또는 반자동으로 제어하기 위해 계산된 염 농도 및/또는 풀링 경계를 사용하는 단계.
구체예에 따르면, 컴퓨터 프로그램은 크로마토그래피 시스템의 하나 이상의 유닛을 자동으로 또는 반자동으로 제어하기 위한 제어 명령을 생성하도록 추가로 구성된다.
구체예에 따르면, 컴퓨터 프로그램은 크로마토그래피 시스템의 하나 이상의 유닛을 자동으로 또는 반자동으로 제어하기 위한 제어 명령을 생성하도록 추가로 구성된다.
본원에서 사용된 "표적 단백질"은 원하는 절대량 또는 상대량으로 양이온 크로마토그래피에 의해 얻어져야 하는 특정 PTM을 갖는 단백질 또는 단백질 변이체이다.
본원에서 사용된 단백질의 "용리 프로파일"은 일정 기간에 걸친 용출액 중의 단백질의 농도의 표시이다.
적용된 단백질 용액에 포함된 하나 이상의 "추가 단백질"은 하나 이상의 추가 표적 단백질 및/또는 하나 이상의 비표적 단백질을 포함할 수 있고, 이에 의해 "비표적 단백질"은 그 존재가 바람직하지 않은 단백질인데, 예를 들어 크로마토그래피 실행 동안 하나 이상의 표적 단백질로부터 제거될 오염으로 간주되기 때문이다.
본원에서 사용된"표적 용리 부피"는 크로마토그래피 컬럼를 통과하고 나중에 컬럼을 떠난 후 수집된 표적 완충액의 특정 부피이다. 표적 용리 부피는 원하는 절대량 또는 상대량의 하나 이상의 표적 단백질을 포함한다. 표적 용리 부피는 다음에 의해 결정된다
본원에서 사용된 "이온 교환 크로마토그래피"는 이온 교환체에 대한 친화도에 기초하여 이온 및 단백질 또는 펩타이드와 같은 극성 분자를 분리하는 크로마토그래피 과정이다. 그러나, 이온 크로마토그래피는 단백질의 등전점으로부터 한 단위 떨어진 조건에서 수행되어야 한다. 따라서, 주어진 조건에서 매우 유사한 등전점을 갖는 분자의 분리는 큰 도전이다.
용어 "양이온 교환 크로마토그래피"는 관심 분자가 양으로 하전되거나 양의 극성을 갖는 경우 사용되는 이온 교환 크로마토그래피의 유형을 지칭한다. 크로마토그래피에 대한 pH가 pI보다 낮기 때문에 분자는 양으로 하전되거나 양의 극성을 갖는다. 이러한 유형의 크로마토그래피에서, 고정상은 음으로 하전되고 양으로 하전된 분자가 로딩되어 이에 이끌린다. 양이온 교환 크로마토그래피는 분리하기를 원하는 분자가 양이온인 경우 사용된다. 이후 결합된 분자는 컬럼으로부터 용리되고 "용리 완충액"으로 지칭되는 용리제를 사용하여 수집될 수 있다. 이온 크로마토그래피의 사용의 주요 장점 중 하나는 다른 분리 기술과 달리 분리 동안 관련된 단지 하나의 상호작용이다.
본원에서 사용된 "크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어"는 크로마토그래피 과정의 일부 양태, 특히 용리 완충액의 권장 염 농도 및/또는 원하는 양의 하나 이상의 표적 단백질을 포함하는 용리 부피의 권장 용리 경계를 시뮬레이션(예측)하기 위한 컴퓨터 해석 가능 코드를 포함하는 임의의 유형의 소프트웨어, 예를 들어 응용 프로그램, 스크립트, 더 큰 소프트웨어 제품군의 소프트웨어 모듈 또는 소프트웨어 플랫폼이다.
본원에서 사용된 "용리 완충액"은 용리된 단백질이 컬럼을 떠나는 용리 완충액에 포함되고 용출액의 다른 분획에서 컬럼을 떠나는 다른 단백질과 별도로 수집될 수 있도록, 컬럼으로부터 크로마토그래피 컬럼에 결합된 하나 이상의 분자를 용리시키기 위해 크로마토그래피 컬럼에 적용되는, "용리제"로도 지칭되는 수성 용액을 지칭한다.
"계산된 표적 용리 부피"는 입력된 원하는 절대량 또는 상대량으로 하나 이상의 표적 단백질을 포함하는 것으로 예측된 용리 부피이다. 예를 들어, 계산된 표적 용리 부피는 예측된 풀링 경계를 통해 명시될 수 있다.
예측된 "풀링 경계"는 하나 이상의 표적 단백질을 원하는 양으로 포함하는 용리 부피를 얻기 위해 크로마토그래피 컬럼을 떠나는 표적 용리 완충액 부피의 어느 부분을 별도로 수집할 필요가 있는지를 나타내는 데이터 값이다. 일부 구체예에 따르면, 풀링 경계는 표적 용리 완충액 부피의 수집이 시작되는 시간을 나타내는 시작 시간의 형태 및 표적 부피의 수집이 정지되는 시간을 나타내는 정지 시간의 형태로 지정된다. 다른 구체예에 따르면, 풀링 경계는 표적 부피의 수집이 시작될 때 컬럼을 횡단하고 떠나는 용리 완충액 부피를 나타내는 시작 용리 완충액 부피의 형태 및 표적 부피의 수집이 정지될 때 컬럼을 횡단하고 떠나는 용리 완충액 부피를 나타내는 정지 용리 완충액 부피의 형태로 지정된다. 예를 들어, 표적 용리 부피의 풀링 경계는 "컬럼 부피의 3.5 배" 및 "컬럼 부피의 4.6 배"일 수 있고 표적 용리 부피는 3.5 컬럼 부피의 용리 완충액이 컬럼에 이미 적용되고 컬럼을 떠난 후 컬럼을 떠나는 용리 완충액을 선택적으로 수집하고 4.6 부피 이상의 컬럼 부피가 컬럼에 적용되고 떠나려고 할 때 수집을 정지하여 얻어질 수 있다. 예측된 풀링 경계가 시간 또는 부피로 지정되는지 여부는 각 구현에 따라 다르다.
본원에서 사용된 "글리코형"은 부착된 상이한 글리칸을 갖거나, 상이한 수 및 위치의 글리칸을 갖는 여러 상이한 형태의 당단백질 (또는 당펩타이드 또는 기타 생물학적 글리코사이드) 중 임의의 것이다.
단백질의 "순도"는 단백질이 다른 어떤 것, 특히 다른 단백질과 혼합되지 않은 상태의 정도를 나타낸다. 예를 들어, 용리 부피에서 99%의 순도를 갖는 특정 단백질 P1은 용리 부피가 용리 완충액 분획 및 비용리-버퍼 분획으로 구성되고, 이에 따라 99%의 비용리-버퍼 분획이 단백질 P1로 구성되고 1%의 비용리 -버퍼 분획이 다른 물질, 예를 들어 적용된 단백질 용액에 포함된 단백질 P2, P3, …, 중 하나 이상의 다른 것으로 구성됨을 의미한다. 단백질의 순도는 주어진 풀링 경계 내에서 수집된 용출액 중의 모든 단백질의 농도가 알려진 경우 (예를 들어 예측되거나 실험적으로 결정됨) 암시적으로 주어진다. 순도는 하나 이상의 표적 단백질에 대해 최적화 기준으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 이상적인 경우, 표적 용리 부피에서 얻을 모든 표적 단백질의 순도는 100%이지만, 실제로, 최적화 기준은 개별 사례에 따라 달라지는 최소 순도 기준, 예를 들어 99% 이하를 필요로 할 수 있다.
이하에서 본 발명의 구체예는 도면을 참조하여 단지 예로서 더 상세하게 설명된다:
도 1은 본 발명의 구체예에 따른 방법의 흐름도를 나타낸다;
도 2는 크로마토그래피 시스템을 나타낸다;
도 3은 또 다른 크로마토그래피 시스템을 나타낸다;
도 4A는 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어에 의해 사용될 모델을 선택하기 위한 GUI를 나타낸다
도 4B,C는 각각의 모델 유형을 추가로 도시한다;
도 4D-E는 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어에서 데이터를 입력하기 위한 GUI를 나타낸다;
도 5A는 제1 단백질 용액에 대해 얻은 용리 플롯이다;
도 5B는 다수의 상이한 후보 용리 염 농도가 주어진 제1 단백질 용액 중의 표적 단백질의 수율 및 순도 및 조합된 순도-수율-목표 파라미터에 대한 예측된 결과를 나타낸다;
도 5C는 다수의 상이한 후보 용리 염 농도가 주어진 제1 단백질 용액 중의 표적 단백질의 조합된 순도/수율-목표 파라미터에 대해 예측된 결과가 있는 플롯을 나타낸다;
도 6A는 제2 단백질 용액에 대해 얻은 용리 플롯이다;
도 6B는 다수의 상이한 후보 용리 염 농도가 주어진 제2 단백질 용액 중의 제1 및 제2 표적 단백질의 수율 및 순도 및 조합된 순도-수율-목표 파라미터에 대해 예측된 결과를 나타낸다;
도 6C는 다수의 상이한 후보 용리 염 농도가 주어진 제2 단백질 용액 중의 제1 및 제2 표적 단백질의 조합된 순도/수율-목표 파라미터에 대해 예측된 결과가 있는 플롯을 나타낸다;
도 6D는 예측된 단백질 비율과 측정된 단백질 비율의 비교를 나타낸다;
도 6E는 단백질 P1 및 P2의 분할을 나타낸다;
도 7은 두 표적 단백질 P1, P2 및 추가 단백질 P3의 예를 나타낸다;
도 8A는 상대적 풀 조성에 대한 단백질 로드의 영향을 예시하는 플롯이다;
도 8B는 상대적 풀 조성에 대한 용리 완충액 염 농도의 영향을 예시하는 플롯이다;
도 9는 예측된 용리 완충액 염 농도에 의한 표적 단백질 비율에 대한 단백질 로드의 영향의 보상을 예시하는 플롯이다; 그리고
도 10A-C는 두 단백질의 용리 프로파일에 대한 상이한 염 농도의 효과를 나타낸다.
도 1은 본 발명의 구체예에 따른 방법의 흐름도를 나타낸다;
도 2는 크로마토그래피 시스템을 나타낸다;
도 3은 또 다른 크로마토그래피 시스템을 나타낸다;
도 4A는 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어에 의해 사용될 모델을 선택하기 위한 GUI를 나타낸다
도 4B,C는 각각의 모델 유형을 추가로 도시한다;
도 4D-E는 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어에서 데이터를 입력하기 위한 GUI를 나타낸다;
도 5A는 제1 단백질 용액에 대해 얻은 용리 플롯이다;
도 5B는 다수의 상이한 후보 용리 염 농도가 주어진 제1 단백질 용액 중의 표적 단백질의 수율 및 순도 및 조합된 순도-수율-목표 파라미터에 대한 예측된 결과를 나타낸다;
도 5C는 다수의 상이한 후보 용리 염 농도가 주어진 제1 단백질 용액 중의 표적 단백질의 조합된 순도/수율-목표 파라미터에 대해 예측된 결과가 있는 플롯을 나타낸다;
도 6A는 제2 단백질 용액에 대해 얻은 용리 플롯이다;
도 6B는 다수의 상이한 후보 용리 염 농도가 주어진 제2 단백질 용액 중의 제1 및 제2 표적 단백질의 수율 및 순도 및 조합된 순도-수율-목표 파라미터에 대해 예측된 결과를 나타낸다;
도 6C는 다수의 상이한 후보 용리 염 농도가 주어진 제2 단백질 용액 중의 제1 및 제2 표적 단백질의 조합된 순도/수율-목표 파라미터에 대해 예측된 결과가 있는 플롯을 나타낸다;
도 6D는 예측된 단백질 비율과 측정된 단백질 비율의 비교를 나타낸다;
도 6E는 단백질 P1 및 P2의 분할을 나타낸다;
도 7은 두 표적 단백질 P1, P2 및 추가 단백질 P3의 예를 나타낸다;
도 8A는 상대적 풀 조성에 대한 단백질 로드의 영향을 예시하는 플롯이다;
도 8B는 상대적 풀 조성에 대한 용리 완충액 염 농도의 영향을 예시하는 플롯이다;
도 9는 예측된 용리 완충액 염 농도에 의한 표적 단백질 비율에 대한 단백질 로드의 영향의 보상을 예시하는 플롯이다; 그리고
도 10A-C는 두 단백질의 용리 프로파일에 대한 상이한 염 농도의 효과를 나타낸다.
도 1은 본 발명의 구체예에 따른 크로마토그래피 방법의 흐름도를 나타낸다.
이 방법은 원하는 절대량 또는 상대량 및/또는 순도의 둘 이상의 표적 단백질을 포함하는 표적 용리 부피를 얻기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 표적 단백질 P1 및 표적 단백질 P2를 각각 특정 농도 또는 양으로 얻기 위해 방법이 수행될 수 있으며, 이에 의해 표적 단백질 P1은 바람직하게는 표적 용리 부피 내에서 최소 순도를 갖는다. 추가로, 또는 대안적으로, 방법은 원하는 비율의 둘 이상의 표적 단백질을 포함하는 표적 용리 부피를 얻기 위해 사용될 수 있다.
제1 단계(100)에서, 방법은 예를 들어 도 2 및 3에 나타난 바와 같이 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼(230)을 제공하는 것을 포함한다. 자체 충전형 컬럼 및 사전 충전형 컬럼 제작에 사용될 수 있는 다수의 상업적으로 입수 가능한 크로마토그래피 수지 재료가 존재한다.
예를 들어, PorosTM XS (Thermo ScientificTM)는 자체 충전형 컬럼, 예를 들어 KronLab로부터 구입한 크로마토그래피 컬럼에서 크로마토그래피 수지 재료로서 사용될 수 있다. 대안적으로, 구입한 사전 충전형 컬럼, 예를 들어 KronLab로부터 구입한 Repligen®(예를 들어 치수가 길이= 5 cm 및 직경= 0.5 cm 또는 길이 = 10 cm 및 직경 = 0.5 cm)이 사용될 수 있다. 대규모 실행의 경우, 컬럼 치수는 더 작은 실험실 규모 실행의 컬럼 치수와 상당히 상이할 수 있다. 예를 들어, 대규모 실행에서 사용된 컬럼의 컬럼 치수는 길이= 22.5 cm 및 직경= 25cm일 수 있다.
크로마토그래피 컬럼은 샘플 펌프 및 내부 분획화가 있는 AKTA Avant 25 및 150 크로마토그래피 시스템(GE Healthcare)과 같은 자동화 또는 반자동화 크로마토그래피 시스템 내에 설치될 수 있다.
다음으로 단계(102)에서, 둘 이상의 표적 단백질 및 선택적으로 하나 이상의 비표적 단백질(불순물로 간주됨)을 포함하는 단백질 용액이 컬럼에 적용된다. 단백질 용액은 제1 표적 단백질 P1, 제2 표적 단백질 P2, 및 선택적으로 비표적 단백질인 하나 이상의 추가 단백질 P3, P4, P5, P6을 포함한다.
크로마토그래피 컬럼에 적용될 단백질 용액을 생성하기 위해, 하나 이상의 사전 처리 및 사전 정제 단계가 수행된다. 먼저, 세포 배양물을 수확하고 수확된 세포의 프로데옴을 얻는다. 글리코실화 항체 및 많은 다른 유형의 단백질의 복잡한 혼합물을 포함한다. 항체 분획을 선택적으로 얻기 위해, 세포 배양 추출물은 항체 및 항체 단편을 선택적으로 결합하도록 적합화된 제1 사전 정제 컬럼에 적용된다.
한 예에 따르면, 제1 사전 정제 컬럼은 단일클론 항체 (mAb) 정제를 위한 수지, 예를 들어 샘플의 로딩 전에 평형화된 단백질 A 수지를 포함한다. 이 예 및 많은 다른 예에서 제1 사전 정제 컬럼의 로드 밀도는 수지 리터당 약 23 g 단백질이다. 항체 분율이 용리되었고 바이러스 불활성화 단계 후 용출액의 pH가 다시 증가되었다. 용액이 4°C에서 밤새 인큐베이션되었고 0.2 μm 멸균 필터에서 여과되었다. 여과된 단백질 A 용출액은 제2 사전 정제 컬럼, 예를 들어 혼합 모드 크로마토그래피 수지로 채워진 컬럼에 대한 로드 물질로서 사용되었다. 단백질 불순물을 제거하기 위해, 혼합 모드 크로마토그래피가 사용되었다. 컬럼은 로딩 전에 평형화되었다. 로드 밀도는 수지 리터당 25 g 단백질이었고 유속은 시간당 150 cm였다. 그 후 통과 용출액의 pH가 감소되고 풀이 0.2 μm 멸균 필터에서 여과되었다.
이러한 사전 처리 단계 및 사전 정제 단계의 결과로서, 크로마토그래피 컬럼(230)에 적용될 단백질 용액이 얻어진다. 단백질 용액은 사용되는 사전 정제 단계의 수 및 성질로 인해 화학적 성질이 일반적으로 잘 알려진 몇 가지 유형의 단백질만을 포함한다. 사전 처리 단계 및 사전 정제 단계의 성질 및 수는 세포 배양의 유형 및 세포 배양 단백질 추출물을 제공하기 위해 사용된 세포에 의존할 수 있고 및/또는 하나 이상의 관심 단백질 유형에 의존할 수 있다. 일반적으로, 또한 일련의 다중 정제 단계는 하나 이상의 표적 단백질을 완전히 정제할 수 없을 것이며, 표적 단백질 또는 단백질이 화학적 특성이 세포 배양 추출물 중의 하나 이상의 다른 단백질과 매우 유사한 글리코형 또는 다른 유형의 PTM 기반 단백질 변이체인 경우에 특히 그러하다.
추가로, 질량 분석법과 같은 분석 테스트가 컬럼(230)에 적용될 단백질 용액에 포함된 각 단백질 유형의 수뿐만 아니라 양을 결정하기 위해 사용될 수 있다.
이후 단계(104)에서, 컬럼에 이미 적용되거나 적용될 단백질 용액 중의 각 단백질의 양은 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어(204)에 입력된다.
추가로, 단계(106)에서 제1 및 제2 표적 단백질의 원하는 제1 양(214) 및 존재하는 경우 선택적으로 또한 비표적 단백질의 상대량이 사용자에 의해 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어에 입력된다. 추가로, 일부 다른 값이 사용자 인터페이스를 통해 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어에 입력될 수 있거나 구성 파일 또는 다른 수단을 통해 제공될 수 있다. 예를 들어, 이러한 다른 값은 원하는 최적화 기준 (제1 및/또는 제2 표적 단백질의 양 및/또는 순도), 용리 완충액의 pH 값, 컬럼을 통한 용리 완충액 펌핑에 사용될 펌프에 지정된 용리 완충액 유속, 단백질 용액 중의 단백질 각각의 화학적 특성, 컬럼에 이미 적용되거나 적용될 단백질 용액 중의 개별 단백질의 양; 및 컬럼의 치수를 포함할 수 있다. 파라미터의 수 및 성질은 다수의 상이한 용리 완충액 염 농도에서 크로마토그래피 실행을 시뮬레이션하기 위한 시뮬레이션 소프트웨어에 의해 사용된 모델에 의존할 수 있다.
단백질 양, 컬럼 치수, 용리 완충액의 pH 값, 고정상의 기공률, 용리 완충액 유속 등과 같은 일부 입력된 파라미터는 구성 파일에 저장되거나 GUI를 통해 입력될 수 있고 각각의 적용 시나리오 및 단백질 용액에 적합화될 수 있다. 보정된 모델 파라미터와 같은 일부 파라미터(예를 들어 등온선, N, ΔGp0, ΔGs0, pKa, 리간드 밀도)는 재사용될 수 있고 일반적으로 구성 파일에 저장된다.
이는 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어가 많은 상이한 후보 용리 완충액 염 농도의 함수로서 그리고 구체적으로 컬럼에 로딩될 단백질의 양 및 화학적 특성에 기반하여 하나 이상의 상이한 후보 용리 부피에 대해 하나 이상의 표적 단백질의 농도 및/또는 순도 값을 시뮬레이션할 수 있게 한다.
예를 들어, 농도가 계산되는 용리 완충액 중의 염은 소듐-염, 예를 들어 소듐-아세테이트일 수 있다.
용리 완충액의 권장 pH 값은 예를 들어 문헌 또는 예비 경험적 테스트로부터 유도될 수 있다. 일반적으로 단백질 크로마토그래피의 경우, 용리 완충액의 pH 범위는 pH 2.5 내지 10이 일반적이다. 양이온 교환 크로마토그래피의 경우, 용리 완충액의 pH 범위는 pH 4 내지 9가 일반적이다. 바람직하게는, 시뮬레이션 소프트웨어에 입력되는 pH 값은 크로마토그래피 분리 또는 현재 분리될 것과 같은 유사한 단백질의 분석 수행에 잘 작동하는 것으로 알려진 pH 값이다. 본원에 기재된 예에서, 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어에 입력되고 실제로 사용되는 용리 완충액의 pH 값이기도 한 pH 값은 5.30 내지 5.70의 범위에 있다.
일반적으로, pH 값은 시뮬레이션 동안 변하지 않는다. 실제로 사용되는 용리 완충액의 pH 값은 예를 들어 pH 미터로, 예를 들어 WTW Sentix Mic 프로브로 제어될 수 있다.
단백질의 화학적 특성은 적합한 용리 완충액 염 농도를 계산하기 위해 크로마토그래피 과정 시뮬레이션에 사용되는 임의의 예측 모델과 무관한 특성(예를 들어 pK 또는 아미노산 모이어티의 수 및 성질)을 포함할 수 있다.
단백질의 화학적 특성은 크로마토그래피 과정 시뮬레이션에 사용되는 예측 모델에 대해 특이적인 특성을 추가로 포함할 수 있다.
단백질의 모델-특이적 화학적 특성을 얻기 위해, 크로마토그래피 데이터(크로마토그램) 및 해당하는 오프라인 분석 데이터(예를 들어 HPLC 데이터)가 사용될 수 있다.
예를 들어, 단백질의 크로마토그래피 모델-특이적 특성 값을 얻기 위한 상이한 크로마토그래피 모델링 워크플로우가 문헌에 기재되어 있다. 등온선의 비선형 범위에서 상승된 단백질 농도에서 작동할 때, 상이한 모델이 크로마토그램에 동일한 방식으로 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어 피크 극대점의 위치가 차폐 계수, 
또는 Keq에 따라 변한다. 등온선의 선형 범위에서 파라미터의 추정을 위해, 야마모토 방정식(Yamamoto equation)이 예를 들어 M. R
dt, F. Gillet, S. Heege, J. Hitzler, B. Kalbfuss, B. Guιlat, "Combined Yamamoto approach for simultaneous estimation of adsorption isotherm and kinetic parameters in ion-exchange chromatography", Journal of Chromatography A, 1413 (2015) 68-76 및 S. Yamamoto, K. Nakanishi, R. Matsuno, T. Kamikuno, "Ion-exchange chromatography of proteins - Prediction of Elution Curves and Operating Conditions", I. Theoredical Considerations, Biotechnology and Bioengineering, 25 (1983) 1465-1483에 기재된 바와 같이 적용될 수 있다.
구체예에 따르면, 등온선의 선형 범위에서의 실험은 다음 세 가지 방법 중 하나 이상으로 평가된다: 1) 크로마토그램의 곡선 피팅에 의한 파라미터 추정 (T. Hahn, T. Huuk, V. Heuveline, J. Hubbuch, Simulating and Optimizing Preparative Protein Chromatography with ChromX, Journal of Chemical Education, 92 (2015) 1497-1502); 2) Yamamoto 등에 의해 설명된 log(GH)/log(c(Na+)) 플롯을 사용하는 로그 그래프 평가 (T. Ishihara, T. Kadoya, H. Yoshida, T. Tamada, S. Yamamoto, Rational methods for predicting human monoclonal antibodies retention in protein A affinity chromatography and cation exchange chromatography: Structure-based chromatography design for monoclonal antibodies, Journal of Chromatography A, 1093 (2005) 126-138.) 및 3) GH(c(Na+)) 플롯의 비로그 그래프 평가 (M. Schmidt, M. Hafner, C. Frech, Modeling of salt and pH gradient elution in ion-exchange chromatography, Journal of Separation Science, 37 (2014) 5-13). 이 시점에서 양호한 상관관계가 관찰되지 않는 경우, 선택된 모델이 적용에 적합하지 않을 수 있다.
다음 단계는 선형 구배 데이터의 평가 결과가 사용되어 파라미터 평가를 개선할 수 있는 고단백질에서의 실험 추가이다. 크로마토그램 곡선 피팅이 모델과 실험 데이터 간에 양호한 상관관계를 야기하는 경우, 파라미터 세트는 보정 데이터 세트에 포함되지 않은 중요한 공정 파라미터 조합에서 검증 실행을 수행하여 테스트될 수 있다. 만족스러운 모델이 발견되지 않는 경우, 모델 방정식을 확장해야 하거나 데이터세트를 더 작은 설계 공간으로 축소해야 한다. 이하에서, 단백질 본 발명의 구체예에 따른 단백질의 모델 특이적 화학적 특성의 일부의 획득이 설명될 것이다.
일부 구체예에 따르면, 모델-특이적 단백질 특성을 얻기 위해 야마모토 평가가 수행되었다. 예를 들어, 선형 구배 용리 실험의 그래프 log(GH)/log(c(Na+)) 평가는 다른 곳에서 기재된 바와 같이 수행되었다 (M. Schmidt, M. Hafner, C. Frech, Modeling of salt and pH gradient elution in ion-exchange chromatography, Journal of Separation Science, 37 (2014) 5-13., T. Ishihara, T. Kadoya, H. Yoshida, T. Tamada, S. Yamamoto, Rational methods for predicting human monoclonal antibodies retention in protein A affinity chromatography and cation exchange chromatography: Structure-based chromatography design for monoclonal antibodies, Journal of Chromatography A, 1093 (2005) 126-138). 염 구배에 대해 정규화된 구배 기울기 GH는 다음과 같이 계산될 수 있다:
VG는 구배 부피, VC는 컬럼 부피, εcol 간극 컬럼 기공률, εp 비드 기공률 및 kD 배제 계수. KD는 0.6으로 가정되었다 (F. Wittkopp, L. Peeck, M. Hafner, C. Frech, Modeling and simulation of protein elution in linear pH and salt gradients on weak, strong and mixed cation exchange resins applying an extended Donnan ion exchange model, J Chromatogr A, 1545 (2018) 32-47). 결합 자리의 수는 log(GH)/log(c(Na+))를 플로팅하고 기울기에서 1을 빼서 결정될 수 있다 (M. Schmidt, M. Hafner, C. Frech, Modeling of salt and pH gradient elution in ion-exchange chromatography, Journal of Separation Science, 37 (2014) 5-13). 평형 상수는 1가 염에 대한 동일한 그래프로써 계산될 수 있다:
단백질의 자유 깁스 에너지 ΔG0 P/RT 및 염의 자유 깁스 에너지 ΔG0 s/RT는 다음 식에 따라 ln(Keq)/ν를 플로팅하여 기울기 및 y-절편으로부터 결정될 수 있다:
모든 계산은 소프트웨어의 내부 선형 회귀 함수를 적용하여 Microsoft Excel에서 수행되었다.
구체예에 따르면, 추가 단계에서, GH/c(Na+) 곡선 피팅이 수행되었다. GH/c(Na+) 곡선 피팅은 미분 방정식을 계산하여 이전의 간행물에 따라 수행되었다 (S. Kluters, F. Wittkopp, M. Johnck, C. Frech, Application of linear pH gradients for the modeling of ion exchange chromatography: Separation of monoclonal antibody monomer from aggregates, J Sep Sci, 39 (2016) 663-675; and M. Schmidt, M. Hafner, C. Frech, Modeling of salt and pH gradient elution in ion-exchange chromatography, Journal of Separation Science, 37 (2014) 5-13):
여기서 GHsalt는 염 구배에 대한 정규화된 구배 기울기이고, cSALT는 컬럼의 이동상 중의 자유 (미결합) 염 이온의 농도이고, 
는 용리 피크 최대에서 용리 완충액 중의 염의 농도이고, qPROT_i는 고정상에서 결합된 단백질 i의 농도이고, Keq_i는 평형 상수이고 (즉, 고정상 중의 특정 단백질 i의 몰 농도를 이동상 중의 단백질 i의 몰 농도로 나눈 값), Λ는 리간드 밀도이고 (컬럼 부피당 몰 단위의 리간드의 수로 정의됨), 
i는 결합 자리의 수이고 (즉, 고정상에 대한 단백질 결합에 참여하는 단백질 i의 결합 자리의 수), σi는 차폐 계수이다.
위에서 언급한 계산은, 예를 들어, Berkeley Madonna®에서, 예를 들어 소프트웨어의 내부 4차 Runge-Kutta 알고리즘 및 0.01 mol/L Na+의 시간 스테핑을 적용하여 수행될 수 있다. 파라미터 추측 값은 야마모토 평가의 이전에 결정된 파라미터에 따라 선택되었고 더 이상의 개선이 달성되지 않을 때까지 변경되었다.
구체예에 따르면, 다음 단계에서, 크로마토그램 곡선 피팅이 수행되었다. 이 단계는 예를 들어 GoSilico의 ChromX에서 수행될 수 있다. 예를 들어 30 셀의 선형 SUPG 공간 이산화와 함께 집중 비율 수송 분산 모델이 적용되었다. 초기 시간 스테핑은 IDAS 기능을 사용하여 0.2 s로 설정되었다. 전역 최적화를 위해 소프트웨어 표준 값이 있는 ASA 알고리즘이 사용되었다. 결정적 최적화를 위해, IOPT 알고리즘이 사용되었다. 분율 데이터는 AKTA 시스템에 의해 측정된 절대 UV 신호의 퍼센트로서 임포트되었다. 실험 데이터와 시뮬레이션의 시간적 일치는 염 실험 데이터와 시뮬레이션 데이터의 상관관계에 의해 확인되었다. 파라미터 추정에 대한 한계는 이전 결과에 따라 선택되고 최적화 기능이 경계에 가까운 값을 계산할 때 적합화될 수 있다. 모델 파라미터는 소프트웨어의 추정 기능을 사용하여 결정되었다. 풀 분석 측정은 각 풀링 기준과 함께 최적화 기능을 사용하여 고려되었다. 상이한 길이의 컬럼 앞에 연속 교반 탱크 반응기를 추가하여 상이한 Akta 시스템에 의한 분산액에 대한 영향이 고려되었다. 라틴 하이퍼큐브 샘플링은 샘플링 기능을 사용하여 1000 개의 모집단 크기로 수행되었다. 모든 계산은 또한 다른 소프트웨어 패키지 예를 들어 CADET에서 수행될 수 있다.
다른 경우에, 모델 특이적 단백질 파라미터는 문헌으로부터 직접 얻을 수 있고 예를 들어 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어의 구성 파일에 저장될 수 있다.
예를 들어 GUI를 통해 및/또는 구성 파일을 통해 또는 추가의 데이터 소스를 통해, 모든 입력 파라미터를 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어에 제공한 후, 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어는 단계(108)에서 크로마토그래피 컬럼으로부터 제1 표적 단백질을 용리하도록 적합화된 용리 완충액 염 농도를 계산한다.
특히, 본 발명의 구체예에 따르면, 용리 완충액 염 농도의 계산은 다수의 후보 용리 완충액 염 농도 각각에 대한 함수로서 하나 이상의 표적 단백질의 양 및/또는 순도를 계산하는 것, 각각의 후보 용리 염 농도와 관련하여 후보 용리 염 농도 각각에 대해 계산된 하나 이상의 표적 단백질의 양 및/또는 순도를 출력하는 것 및 사용자 또는 소프트웨어 기능으로부터, 하나 이상의 표적 단백질의 양 및/또는 순도가 단계(106)에서 입력된 하나 이상의 표적 단백질의 원하는 양(들) 및/또는 순도와 가장 잘 일치하는 후보 용리 염 농도 중 하나의 선택을 수신하는 것을 포함할 수 있다.
크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어는 적어도: 용리 완충액의 사전 정의된 pH 값; 제공된 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼의 치수; 적용된 단백질(P1-P6)의 투입량; 및 적용된 단백질 용액의 단백질의 화학적 특성을 포함하는 파라미터 값의 세트의 함수로서 염 농도를 계산하도록 구성된다. 위에서 언급한 바와 같이, 이러한 파라미터 값은 GUI를 통해 및/또는 구성 파일을 통해 또는 기타 데이터 소스를 통해 제공될 수 있다.
원하는 절대량 또는 상대량 및/또는 순도의 제1 및/또는 제2 표적 단백질을 포함하는 용리 표적 부피를 얻기에 (가장) 적합한 용리 염 농도를 계산한 후, 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어는 단계(110)에서 적어도 계산된 염 농도 및 제1 표적 단백질의 입력 원하는 양의 함수로서 원하는 양 및/또는 원하는 순도의 둘 이상의 표적 단백질을 포함하는 표적 용리 부피의 풀링 경계를 계산한다. 바람직하게는, 크로마토그래피 시뮬레이션 프로그램은 많은 상이한 후보 용리 염 농도에 대해 얻어진 단백질 양 및 순도를 기반으로 가장 적합한 용리 염 농도를 계산할 때 및/또는 단계(108)에서 얻은 용리 염 농도를 기반으로 표적 용리 부피를 계산할 때 하나 이상의 크로마토그래피 모델을 사용한다.
다음으로 단계(112)에서, 자동화된 또는 반자동화된 크로마토그래피 시스템에 포함된 펌프는 pH 값이 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어에 입력된 pH 값과 동일하고 염 농도가 단계(108)에서 계산된 염 농도와 동일한 용리 완충액을 적용한다.
한 예에 따르면, "용리 완충액 A"는 계산된 염 농도에 따라 제조되고, 이에 의해 완충액은 0.04 mol/L Na-아세테이트로 구성된다.
또 다른 예에 따르면, "용리 완충액 B"는 계산된 염 농도에 따라 제조되고, 이에 의해 완충액은 1 mol/L Na-아세테이트 용액으로 구성된다. 완충액은 예를 들어 30% 아세트산 (Merck Chemicals GmbH) 및 Na-아세테이트*3H2O (Merck Chemicals GmbH)를 사용하여 5.30 및 5.70의 pH 값을 야기하도록 제조될 수 있다.
크로마토그래피는 용리 완충액을 컬럼에 연속적으로 적용하고 풀링 경계를 예측하기 위해 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어에 의해 사용된 속도로 컬럼을 통해 용리 완충액을 펌핑함으로써 단계(114)에서 수행된다. 흔히, 시작 풀링 경계에 도달할 때까지 적용되어야 하는 용리 완충액의 부피는 크로마토그래피 컬럼의 부피의 수배이다.
이후 단계(116)에서, 인간 사용자 또는 자동화된 또는 반자동화된 크로마토그래피 시스템은 계산된 표적 용리 부피를 단계(110)에서 계산된 풀링 경계를 사용하여 별도의 분획으로 수집한다. 예를 들어, 빈 용기를 들고 있는 로봇 팔은 용기가 계산된 표적 용리 부피의 시작 풀링 경계에서 컬럼을 떠나는 용출액 수집을 시작하도록 컬럼의 출구 아래로 용기를 이동하고 정지 풀링 경계에 도달 시 용출액의 수집이 정지하도록 출구로부터 용기를 제거하도록 구성될 수 있다. 용기에 수집된 용출액은 원하는 양 및/또는 순도의 하나 이상의 표적 단백질을 포함하는 표적 용리 부피이다.
일부 구체예에 따르면, 단계(104 -110)는 단백질 용액이 컬럼에 실제로 적용되기 전에 수행된다. 이 경우에, 하나 이상의 선택적 단계를 수행하는 것이 가능하다. 예를 들어, 컬럼(230)은 단백질 용액이 실제로 샘플에 적용되기 전에 pH 및 전도도 판독값이 안정화될 때까지 단계(112)에서 사용될 용리 완충액으로 평형화될 수 있다. 예를 들어, 컬럼의 평형은 실제 단백질 용액이 적용되기 전에 평형 목적을 위해 적용되는 3-5 컬럼 부피의 용리 완충액을 필요로 할 수 있다.
도 2는 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어(204)가 있는 컴퓨터 시스템(200) 및 양이온 크로마토그래피 컬럼(230)을 포함하는 크로마토그래피 시스템을 나타낸다. 도 2에 나타난 구체예에서, 크로마토그래피 시스템은 제1 표적 단백질 P1 및 제2 표적 단백질 P2를 선택적으로 얻기 위해 사용된다. 표적 단백질은 이 도면에 예시된 적용 시나리오에서 비표적 단백질인 추가 단백질 P3-P6을 포함하는 단백질 용액(202)에 포함된다. 단백질 용액이 컬럼에 적용되기 전에, 단백질 용액(202) 중의 각각의 단백질 P1-P6의 농도가 결정된다. 또한, 개별 단백질 P1-P6의 여러 화학적 특성이 문헌으로부터 파생되거나 실험적으로 결정된다.
크로마토그래피 시뮬레이션 프로그램(204)은 사용자가 예를 들어 입력 필드(214)를 통해, 원하는 최적화 기준, 예를 들어 제1 및 제2 표적 단백질 P1, P2의 양 및/또는 원하는 순도 또는 양 및 순도의 파생 값을 특정할 수 있게 하는 GUI(202)를 포함한다. 추가로, GUI는 하나 이상의 추가 데이터 입력 필드(215, 216)를 포함하여 사용자가 단백질 용액(202)에 포함된 단백질 P2-P6 각각의 성질 및 양을 명시할 수 있게 하고, 컬럼(230)의 치수 및 용리 완충액의 pH와 같은 추가 파라미터 값, 단백질 P1-P6 각각의 일부 화학적 특성, 크로마토그래피 시뮬레이션에 사용될 예측 모델의 유형 등을 명시할 수 있게 한다.
크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어는 크로마토그래피 과정의 하나 이상의 양태를 모델링하도록 구성된 다수의 예측 모델(206-210)을 포함할 수 있다. 시뮬레이션 소프트웨어(204) 또는 크로마토그래피 시뮬레이션 모델(206-210)에 의해 사용되는 파라미터 중 일부는 구성 파일(220)에서 명시될 수 있다.
크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어(204)는 원하는 양 및/또는 순도에서 표적 용리 부피 내에서 표적 단백질 P1, P2를 얻기에 가장 적합한 용리 완충액 염 농도(222)를 예측하도록 구성된다. 예를 들어, 시뮬레이션 소프트웨어(204)는, 다수의 상이한 후보 용리 완충액 염 농도 각각에 대해, 전체 용리 과정 동안 단백질 각각의 양 및 순도 프로파일을 암시적으로 제공하는 단백질 용액에 포함된 단백질 각각에 대한 예상 용리 곡선을 시뮬레이션하도록 구성될 수 있다. 시뮬레이션은 크로마토그래피 과정의여러 상이한 양태를 각각 설명하는 다수의 상이한 모델의 조합을 기반으로 할 수 있다. 이러한 시뮬레이션에 기반하여, 사용자 또는 소프트웨어 기능은 원하는 양 및/또는 순도의 표적 단백질 P1을 용리하기 위해 가장 적합한 후보 용리 완충액 염 농도 중 하나를 선택할 수 있다.
한 구체예에 따르면, 계산된 용리 염 농도(222)는 GUI(212, 218)를 통해 사용자에게 출력되고 사용자는 시뮬레이션 소프트웨어에 입력된 pH를 갖고 소프트웨어(204)에 의해 출력된 염 농도(222)를 갖는 용리 완충액(226)을 생성한다. 추가로, GUI는 원하는 양 및/또는 순도로 표적 단백질을 포함하는 것으로 예측된 표적 용리 부피의 풀링 경계(224)를 출력할 수 있다.
용리 완충액 염 농도가 컬럼에 적용되는 단백질 P1-P6 각각의 양에 대해 구체적으로 계산되었기 때문에 용리 완충액(226)은 모든 다른 단백질로부터 표적 단백질 P1, P2을 분리하는 데 특히 적합하다. 따라서, 용리 완충액은 "표준"/"모두에게 적합한" 용리 완충액이 아니라, 단백질 용액에 포함된 단백질의 유형 및 양에 특이적으로 적합화된 용리 완충액이다. 출원인은 용리 염 농도를 각 개별 사례에서 컬럼에 적용된 단백질의 성질 및 양에 적합화하는 것이 (이는 다시 세포 배양 추출 및 사전 정제 과정의 다양한 양태에 따라 달라질 수 있음) 상이한 단백질을 분리하는 크로마토그래피 컬럼(232)의 능력을 크게 증가시킬 수 있음을 관찰했다.
사용자는 먼저 단백질 용액(202)을 컬럼(230)에 적용한 다음 용리 완충액(226)을 적용한다. 용리 완충액(226) 및 단백질 용액(202)은 컬럼(230)을 통해 스며나온다. 이에 의해, 상이한 단백질 P1-P6의 분자는 화학적 특성에 따라 컬럼(230)의 고정상(228)과 상호작용한다. 고정상 및 또한 용리 완충액과 단백질 분자의 상호작용은 용리 프로파일, 즉 주어진 시간에 컬럼을 떠나는 각 단백질의 양을 결정한다. 컬럼의 출구(238)를 떠나는 용출액을 수집하기 위해 사용되는 용기(232, 234, 236)를 교환함으로써, 용출액의 상이한 분획(238, 240)을 얻을 수 있다. 바람직한 구체예에 따르면, 용기의 교환은 원하는 양 및/또는 순도의 표적 단백질을 포함하는 것으로 예측된 표적 용리 부피가 동일한 용기 내에 수집되도록 조정된다. 이는 예측된 표적 용리 부피의 풀링 경계가 수집이 컬럼의 출구 아래에 배치되고 아래로부터 제거되는 시간을 결정함을 의미한다.
단백질 용액의 부피는 적용된 용리 완충액의 부피보다 훨씬 더 작으므로 많은 크로마토그래피 시뮬레이션 모델에서 무시된다.
일부 구체예에서, 용리 완충액(226)은 사실상 동일한 pH 값을 갖지만 상이한 염 농도를 갖는 일련의 둘 이상의 상이한 용리 완충액이다. 이러한 상이한 용리 완충액은 또한 "용리 계단"으로도 지칭된다. 예를 들어, 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어는 상이한 용리 계단에 대해 가장 적합한 염 농도를 계산하기 위해 구성될 수 있다.
도 3은 추가의 크로마토그래피 시스템을 나타낸다. 도 3에 나타난 크로마토그래피 시스템은 도 2에 나타난 것과 동일할 수 있고, 여기서 소프트웨어(204)는 단일 표적 단백질을 원하는 양으로 얻기 것이 아니라, 두 표적 단백질 P1, P2를 원하는 비율로 얻기 위해 사용된다.
도 3에 나타난 시스템의 구성요소 및 특징은 기본적으로 도 2에 나타난 시스템의 구성요소 및 특징에 해당한다. 따라서 도 2의 묘사에서 이러한 특징과 관련하여 제공된 설명은 반복되지 않을 것이다.
도 2에 나타난 GUI와 대조적으로, 시뮬레이션 소프트웨어(204)에 의해 생성되고 도 3에 나타난 GUI(212)는 사용자가 데이터 입력 필드(304)를 통해 두 표적 단백질 P1, P2의 원하는 상대량을 특정할 수 있게 한다. 선택적으로, 사용자는 표적 단백질 P1, P2 각각에 대해 필요한 최소 순도 수준을 특정할 수 있다. 두 표적 단백질을 원하는 비율로, 그리고 선택적으로 원하는 순도로 포함하는 표적 용리 부피를 제공하기에 가장 적합한 용리 완충액 염 농도(222)의 계산은, 다수의 상이한 후보 용리 완충액 염 농도에 기반하는 다수의 크로마토그래피 과정 시뮬레이션, 표적 용리 부피 중의 두 표적 단백질의 상대량 및 선택적으로 또한 순도 결정, 및 P1 및 P2를 원하는 상대량 및 순도로 포함하는 표적 용리 부피를 제공하기에 가장 적합한 후보 용리 완충액 염 농도 중 하나 출력을 포함한다. 각각의 시뮬레이션은 주어진 후보 용리 완충액 염 농도를 기반으로 단백질 P1-P6 각각에 대한 용리 프로파일을 예측한 다음, 단백질 함량이 상대 표적 단백질 양 및 순도에 대해 사용자 정의 요건을 충족시키는 표적 용리 부피의 풀링 경계를 결정하기 위해 단백질 P1-P6 각각의 용리 프로파일을 분석하는 것을 포함할 수 있다.
도 4A는 사용자가 크로마토그래피 과정의 상이한 양태에 대해 다수의 상이한 크로마토그래피 과정 시뮬레이션 모델을 선택할 수 있게 하는 GUI(400)를 도시한다. 도 4B는 각 모델에 의해 시뮬레이션된 크로마토그래피 과정의 양태를 예시한다.
예를 들어, GUI는 사용자가 다수의 대체 컬럼 모델로부터 "분산 수송" 모델을 선택할 수 있게 한다. 본원에서 사용된 "컬럼 모델"은 컬럼의 간극 부피에서 용리 완충액의 단백질 각각의 농도 염 농도 및 pH 값의 상호 관계를 설명하는 모델이다.
GUI(400)는 또한 사용자가 다수의 대안적 기공 모델로부터 "LumpedRate" 모델을 선택할 수 있게 한다. 본원에서 사용된 "기공 모델"은 컬럼의 고정상(228)의 기공 부피에서 용리 완충액의 단백질 각각의 농도, 염 농도 및 pH 값의 상호 관계를 설명한다.
GUI(400)는 또한 사용자가 "등온선 모델"로도 지칭되는 다수의 대안적 반응 모델로부터 "IEC 2015" 모델을 선택할 수 있게 한다. 본원에서 사용된 "반응 모델"은 고정상(228)의 단백질 각각의 농도, 용리 완충액 염 농도 및 단백질 용액 중의 단백질 각각의 화학적 특성의 적어도 일부의 상호 관계의 설명이다.
상이한 모델은 문헌으로부터 유도될 수 있고 및/또는 실험적으로 결정된 단백질 특이적 모델 파라미터에 기반할 수 있다.
도 4C는 본 발명의 한 구체예에 따라 GUI(400)를 통해 선택될 수 있는 모델 유형 각각의 이면에 있는 수학적 개념을 더 상세히 도시한다. 그러나, 대체 모델이 발표되었고 도 4B에 나타난 모델 중 적어도 일부가 향후 적합화되고 개선될 수 있다. 따라서, 본 발명은 예시 목적으로 본원에 설명된 임의의 특정 모델 또는 수학 공식으로 제한되지 않는다.
도 4D는 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어(204)에 의해 생성되고 사용자가 크로마토그래피 컬럼(230) 및 그 안에 포함된 고정상(228)의 세부사항을 지정할 수 있게 하는 그래픽 사용자 인터페이스(402)를 나타낸다. 예를 들어, 사용자는 컬럼(230)의 길이 및 부피뿐만 아니라 간극 컬럼 기공률, 축방향 분산, 고정상(228)의 비드 반경 및 비드 기공률을 지정할 수 있다. 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어(204)에 의해 생성된 추가 그래픽 사용자 인터페이스(404)는 사용자가 모델 특이적 화학적 특성, 예를 들어 고정상의 이온 용량 (리간드 밀도에 해당), 카르복실 기, 히스티딘 기, 아미노 기 등의 산 해리 상수를 지정할 수 있게 한다. GUI의 데이터 입력 필드는 GUI(400)를 통해 사용자에 의해 선택된 모델의 유형에 따라 달라질 수 있다.
도 4E는 사용자가 용리 완충액의 염의 유형, 용리 완충액의 pH 값, 단백질 용액에 포함된 단백질의 수 및 유형, 그뿐만 아니라 하나 이상의 단백질 특이적 원하는 절대량 또는 상대량, 원하는 순도 수준 및 모델-특이적 또는 모델-의존성 화학적 특성 값을 지정할 수 있게 하는 GUI(406)를 나타낸다.
도 5A는 컬럼에 적용된 단백질 용액에 포함된 다중 단백질 P1, P2 및 P3의 시뮬레이션된 용리 프로파일을 나타내는 용리 플롯(500)이다. 단백질 P1, P2 및 P3은 예를 들어 도 7A-7D를 참조하여 더 상세히 기재된 단백질 P1, P2 및 P3일 수 있다.
단백질 P1은 표적 단백질로서 제공되고 사용자는 P1이 사전 정의된 농도 및 사전 정의된 순도로 얻어져야 함을 명시했다. 다른 단백질 P2 및 P3은 비표적 단백질이다. 이는 P2 및 P3이 P1의 충분한 순도를 보장하기 위해 농도가 가능한 한 낮아야 하는 바람직하지 않은 오염물질로 간주됨을 의미한다.
플롯(500)은 플롯(500)을 제공하는 시뮬레이션에서 사용된 후보 용리 염 농도를 나타내는 곡선(502)을 포함한다. 플롯에서 유도할 수 있는 바와 같이, 후보 용리 완충액은 실제로 다양한 염 농도를 갖는 일련의 다수의 상이한 후보 용리 완충액("용리 계단")이다. 용리 완충액 염 농도가 0.35 mol/l 이상으로 상승하는 즉시, 표적 단백질 P1 및 비표적 단백질 P2는 컬럼으로부터 분리되기 시작하고 용출액에서 관찰 가능하다. 이는 각각의 단백질 P1에 대한 용리 프로파일(508) 및 단백질 P2에 대한 용리 프로파일(506)로부터 유도될 수 있다. 염 농도가 0.9 mol/l 이상으로 상승하면, 용리 프로파일(504)로부터 도출할 수 있는 바와 같이 P3도 용리된다.
크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어는 각 단계에서 후보 용리 염 농도 각각에 대해 그리고 단백질 함량이 표적 단백질 양 및 순도와 관련하여 사용자 정의 요건을 충족하는 용리 부피를 포함하는 풀링 경계 결정에 대해 용리 프로파일(504-508)을 시뮬레이션(예측)하도록 구성된다. 결정된 풀링 경계는 점선(512, 514)으로 표시된다. 두 라인은 단백질 P1의 피크를 포함하는 표적 용리 부피를 정의한다. 표적 용리 부피는 또한 단백질 P2의 일부 양을 포함한다. 그러나, 풀링 경계(514)에서 용출액의 수집을 중단함으로써, 표적 용리 부피 중의 P1의 순도가 사용자 정의 순도 요건을 충족하는지 확인될 수 있는데, 이 지점 이후 비표적 단백질 P2의 상대량 증가가 표적 용리 부피에 포함될 것이기 때문이다.
도 5A에 나타난 플롯은 단일 표적 단백질 P1에 대한 최적화 기준을 참조하여 설명되었다. 그러나, 다른 사용 사례 시나리오에서, 또한 단백질 P2가 표적 단백질로 간주될 수 있고 (예를 들어 도 6A 참조) 최적화 기준은 두 표적 단백질 P1, P2의 양 및/또는 순도와 관련된 기준일 수 있는 반면 P3만이 오염물질로 간주된다. 이 형우에, 풀링 경계는 새로운 최적화 기준에 맞추어질 것이다.
도 5B는 다수의 상이한 후보 용리 염 농도가 주어진 제1 단백질 용액 중의 표적 단백질 P1의 수율 및 순도 및 조합된 순도-수율-목표 파라미터에 대한 예측된 결과를 나타낸다. "순도"는 후보 염 농도가 주어진 표적 용리 부피 중의 P1의 예측된 순도를 나타낸다. "수율"은 후보 염 농도가 주어진 표적 용리 부피 중의 표적 단백질 P1의 예측된 양을 나타낸다. "목표"는 P1의 예측된 양 및 순도의 조합으로부터 파생된 집계 값이다. 예를 들어, 도 5B에 표시된 "목표"는 다음과 같이 계산된 "복합 목표"이다:
단일 목표 SO = F * (목표)Power + A, 여기서 F("인자")는 수치 값이고, POWER는 수치 값이고, A("첨가됨")도 수치 값이다.
복합 목표는 곱셈 또는 덧셈에 의해 단일 목표를 결합하여 생성될 수 있다.
예를 들어, 다음 파라미터가 선택될 수 있다: POWER= 1, F = 1 및 A = 0. 그러나, 이들 파라미터 각각은 또한 상이한 값을 가질 수 있다.
용리 완충액 염 농도 0.342544에 대해 반복 10에서 계산된 목표 SO1은 표적 용리 부피 중의 단백질 P1의 예측된 순도이고, 이에 따라 용리 풀 부피는 135 mL에서 시작하고 147 mL에서 종료된다. 예측된 순도 SO1은 값 0.751832를 갖는다. 목표 SO2는 용리 완충액 염 농도 0.342544에 대해 반복 10에서 계산된 단백질 P1의 수율이다. 예측된 수율 SO2는 값 0.836734를 갖는다.
복합 목표 CO1은 SO1 및 SO2를 집계하여, 예를 들어 SO1 + SO2를 계산하여 계산될 수 있다. 또 다른 예에 따르면, 복합 목표 CO2는 SO1 * SO2로 계산된다.
결과는 표 510의 형태로 제시된다. 표의 첫 번째 열("반복")은 각각의 크로마토그래피 시뮬레이션에 대한 기초로서 사용되는 후보 용리 완충액 염 농도의 식별자 또는 (다중 단계에 대해) 후보 용리 완충액 염 농도의 세트를 포함한다. 추가 열("염 농도")은 특정 용리 단계에서 사용될 후보 용리 완충액 염 농도를 나타낸다. 추가 열("순도 단백질 1")은 주어진 후보 용리 완충액 염 농도에 대해 예측된 순도 값을 나타낸다. 추가 열("단백질 1 수율")은 주어진 후보 용리 완충액 염 농도에 대해 예측된 단백질 P1의 양(예를 들어 농도)을 나타낸다. 추가 열("목표")은 최적화될 (여기서: 최소화될) 그리고 표적 단백질 P1의 예측된 순도 및 예측된 수율의 함수로서 계산되는 목표를 나타낸다.
표(510)의 각 행은 하나의 후보 용리 완충액 염 농도 및 각각의 예측에 해당한다. 표(510)의 행은 목표 값에 따라 정렬되고 최적 (여기서: 최소) 목표를 갖고 따라서 가장 높은 순도 및 수율을 갖는 행이 표에서 첫 번째 행으로 나타난다. 이 도면에 나타난 예에서, "순도" 또는 "수율"에 대한 수치 값이 가능한 한 낮은 것은 순도 또는 수율이 가능한 한 높음을 의미한다. 이는 "반복" 번호가 23인 시뮬레이션의 후보 용리 완충액 염 농도 0.345가 주어진 단백질 용액에 대해 최적 염 농도인 것으로 간주됨을 의미한다. 결과적으로, "실제" 용리에 실제로 사용될 용리 완충액은 0.345의 염 농도를 갖도록 선택된다. 단일 값이 더 높은 시뮬레이션, 예를 들어 반복 10도 있다. 여기서 순도는 반복 23보다 높지만 수율은 더 낮다. 순도 및 수율 간의 최상의 절충안은 (파레토 법칙) 반복 23이다.
도 5C는 다수의 상이한 후보 용리 염 농도가 주어진 제1 단백질 용액 중의 표적 단백질의 조합된 순도/수율-목표 파라미터에 대해 예측된 결과가 있는 플롯(518)을 나타낸다. 곡선(520)은 도 5B를 참조하여 기재된 순도/수율 유도 목표를 나타낸다. 따라서, 도 5C의 플롯(518)은 표(510)의 열보다는 곡선 형태로 다수의 상이한 후보 용리 완충액 염 농도 및 각각의 시뮬레이션에 기반하여 얻어진 순도-수율 목표를 도시한다. 데이터 지점(516)은 이 목표의 최소값이 반복 23에서 얻어지고 이 특정 시뮬레이션 #23에 사용된 후보 용리 완충액 염 농도가 표적 용리 부피를 얻기 위한 실제 용리 완충액 염 농도로서 사용되어야 함을 나타낸다. 플롯 5A에서 풀링 경계(512, 514)에 의해 구획되는 용리 표적 부피에 해당하는 용리 완충액 단계의 용리 완충액 염 농도는 번호가 #23인 시뮬레이션에서 예측된 최적 염 농도에 해당한다.
도 6A는 제2 단백질 용액에 대해 얻은 용리 플롯(600)이다. 제2 단백질 용액은 또흔 세 가지 단백질 P1, P2 및 P3을 포함한다. 단백질 P1, P2 및 P3은 예를 들어 도 7A-7D를 참조하여 더 상세히 기재된 단백질 P1, P2 및 P3일 수 있다.
도 5A에 설명된 상황과 대조적으로, 단백질 P1 및 P2는 모두 표적 단백질로 간주된다. 사용자는 그래픽 사용자 인터페이스를 통해 55:45의 비율로 단백질 P1 및 P2를 얻는 데 관심이 있음을 명시한다. 추가로, 얻어진 표적 용리 부피는 가능한 한 순수해야 하며, 표적 용리 부피가 가능한 한 적은 P3 및 임의의 기타 단백질을 포함해야 함을 의미한다.
단백질 P1의 시뮬레이션된 용리 프로파일은 곡선(608)으로 나타나고, 단백질 P2의 시뮬레이션된 용리 프로파일은 곡선(606)으로 나타나고, 단백질 P3의 시뮬레이션된 용리 프로파일은 곡선(604)으로 나타나고, 용리 완충액 염 농도 단계는 곡선(602)로 나타난다. 두 표적 단백질 P1 및 P2의 양 및 순도 및 다수의 상이한 후보 용리 완충액 농도 각각에 대한 양-및-순도 유도 목표의 시뮬레이션은 다중 단계 각각에 대한 최적 용리 완충액 염 농도를 나타내고 제1 및 제2 표적 단백질 P1, P2를 원하는 상대량으로 포함하는 표적 용리 부피를 정의하고 명시된 순도 요건을 충족하는 풀링 경계(612, 614)를 나타낸다. 추가로, 플롯(600)은 예측된 단백질 피크를 용리 과정 동안 경험적으로 얻은 총 단백질 피크와 비교하기 위해 사용될 수 있는 단백질의 총량을 나타내는 시뮬레이션된 합계 신호(610)를 포함한다.
도 6B는 다수의 상이한 후보 용리 염 농도가 주어진 제2 단백질 용액 중의 표적 단백질 P1 및 P2의 수율 및 순도 및 조합된 순도-수율-목표 파라미터에 대한 예측된 결과를 나타낸다. "순도"는 후보 용리 완충액 염 농도 각각에 대해 예측된 표적 용리 부피 중의 각각의 표적 단백질 P1, P2의 순도를 나타낸다.
결과는 표 617의 형태로 제시된다. 표의 첫 번째 열("반복")은 각각의 크로마토그래피 시뮬레이션에 대한 기초로서 사용되는 후보 용리 완충액 염 농도의 식별자 또는 (다중 단계에 대해) 후보 용리 완충액 염 농도의 세트를 포함한다. 추가 열("염 농도")은 특정 용리 단계에서 사용될 후보 용리 완충액 염 농도를 나타낸다. 추가 열("순도 단백질 1", "순도 단백질 2")은 주어진 후보 용리 완충액 염 농도에 대해 단백질 P1, P2 각각에 대해 예측된 순도 값을 나타낸다. 추가 열("목표")은 최적화될 (여기서: 최소화될) 그리고 표적 단백질 P1 및 P2의 예측된 순도 및 예측된 상대량의 함수로서 계산되는 목표를 나타낸다.
("복합 목표"로도 지칭되는) "목표"는 예를 들어 P1 및 P2의 예측된 상대량 및 P1 및 P2의 원하는 순도 수준의 조합으로부터 유도된 집계 값일 수 있다. 예를 들어, "목표" CO는 두 개의 단일 목표를 더하거나 곱하여 두 개의 단일 목표 SO1, SO2로부터 계산될 수 있다. 예를 들어, CO는 CO = SO1 + SO2로서 또는 CO = SO1 * SO2로서 계산될 수 있다.
따라서, SO1은 주어진 후보 용리 완충액 염 농도에 대해 예측된 표적 용리 부피 중의 P1의 순도, 예를 들어, 1:0.55이고, 이에 의해 용리 표적 부피는 112 mL에서 시작하여 127 mL에서 종료하는 것으로 예측되었다. SO2는 2:0.45이고 용리 표적 부피 중의 P2의 원하는 순도이고, 이에 따라 용리 표적 부피는 112 mL에서 시작하고 127 mL에서 종료되는 것으로 예측된다.
선택적으로, 계산된 목표 CO와 표적 값 사이의 오차는 목표와 표적 값 사이의 점별 제곱 편차를 계산하는 "참조 비교" 비용 함수를 사용하여 계산될 수 있다.
표(617)의 각 행은 하나의 후보 용리 완충액 염 농도 및 각각의 예측에 해당한다. 표(617)의 행은 목표 값에 따라 정렬되고 최적(여기서는: 최소) 목표를 가지며 따라서 가장 높은 순도 및 가장 일치하는 P1:P2 비율을 갖는 행이 표에서 첫 번째 행으로 나타난다. 가능한 한 작은 "목표" 파라미터의 값은 단일 목표와 해당하는 표적 값 사이의 차이가 가능한 한 작음을 의미한다. 이는 "반복" 번호가 35인 시뮬레이션의 후보 용리 완충액 염 농도 0.388이 주어진 단백질 용액에 대해 최적 염 농도인 것으로 간주됨을 의미한다. 결과적으로, "실제" 용리에 실제로 사용될 용리 완충액은 0.388의 염 농도를 갖도록 선택된다.
도 6C는 다수의 상이한 후보 용리 염 농도가 주어진 제1 단백질 용액 중의 표적 단백질의 조합된 순도/수율-목표 파라미터에 대해 예측된 결과가 있는 플롯(618)을 나타낸다. 곡선(620)은 도 6B를 참조하여 기재된 순도/수율 유도 목표를 나타낸다. 따라서, 도 6C의 플롯(618)은 표(617)의 열보다는 곡선 형태로 다수의 상이한 후보 용리 완충액 염 농도 및 각각의 시뮬레이션에 기반하여 얻어진 순도-수율 목표를 도시한다. 데이터 지점(616)은 이 목표의 최소값이 반복 35에서 얻어지고 이 특정 시뮬레이션 #35에 사용된 후보 용리 완충액 염 농도가 실제 용리 완충액 염 농도로서 사용되어야 함을 나타낸다. 플롯 6A에서 풀링 경계(612, 614)에 의해 구획되는 용리 표적 부피에 해당하는 용리 완충액 단계의 용리 완충액 염 농도는 번호 #35인 시뮬레이션에서 예측된 최적 염 농도에 해당한다.
도 6D는 제2 단백질 용액에 대해 얻은 P1 및 P2의 예측된 단백질 비율과 측정된 단백질 비율의 비교를 나타낸다. 풀링 경계(612, 614)에 의해 구획되는 표적 용리 부피 중의 단백질 P1의 예측된 농도는 시뮬레이션 #35에서 사용된 0.388 mol/리터의 후보 용리 완충액 농도를 기반으로 51%인 것으로 예측된다. 용리가 0.388 mol/리터의 염 농도를 갖는 용리 완충액으로 수행될 때 표적 용리 부피 중의 P1의 실험적으로 측정된 농도는 56%이다. 마찬가지로, 표적 용리 부피 중의 단백질 P2의 예측된 농도는 49%이다. 표적 용리 부피 중의 P2의 실험적으로 측정된 농도는 44 %이다. 따라서, 예측된 풀링 경계에 의해 정의된 표적 용리 부피 중의 예측된 농도의 정확도는 매우 높다.
도 6E는 단백질 P1, P2 및 P3의 실험적으로 얻어진 분할을 나타낸다. 플롯(624)은 각각의 단백질 P1, P2, P3의 용리에 의해 유도된 광학 피크(626, 628, 630)를 도시한다. 플롯으로부터 유추할 수 있는 바와 같이, P1 및 P2의 피크는 강하게 중첩된다. 45g/리터의 단백질 로드에서 40 컬럼 부피의 구배 중의 두 단백질 P1, P2에 대한 분해능 R은 약 0.43, 즉 매우 낮은 것으로 관찰되었다. 본 발명의 구체예는 이들 단백질이 낮은 분해능 값을 갖는 경우에도 두 단백질을 먼저 분리한 다음 원하는 비율로 단백질을 재조합할 필요 없이 둘 이상의 단백질을 원하는 비율로 얻기 위해 사용될 수 있다.
도 7은 두 표적 단백질 P1, P2 및 원하지 않은 오염으로 간주되는 추가 단백질 P3의 예를 나타낸다.
도 7A는 본원에서 "Gant"로 지칭되는 항체에 연결된 "BSM"로 지칭된 뇌 셔틀 분자로 구성된 단백질 700 "bsGant"의 예시를 나타낸다. 뇌 셔틀 분자는 항체와 같은 큰 분자의 뇌 침투를 증가시킬 수 있는 분자이다. 뇌에 대한 큰 분자의 접근은 혈액과 뇌 조직 사이의 문지기인 혈액 뇌 장벽(BBB)에 의해 제한되어 어떤 분자가 뇌에 들어갈 수 있는지를 조심스럽게 걸러낸다. 출원인에 의해 조작된 일부 항체는 표면에 위치한 단백질 수용체 중 하나에 결합하여 혈액 뇌 장벽을 통과할 수 있다. 뇌 셔틀 분자는 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 본질적인 능력에 관계없이 잠재적으로 하나 이상의 치료 분자를 뇌로 전달할 수 있다. bsGant 단백질은 국제 특허 출원 WO 2017/055540에 상세하게 설명되며 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
"bsGant" 항체는 단량체 면역글로불린 G (IgG) Fc-융합 단백질이다. "bsGant" 항체 생산에 사용된 세포 배양은 Fab 글리코실화 정도가 상이한 세 가지 상이한 변이체로 이 항체를 생산한다. Fab 글리코실화는 완전하지 않아, 비글리코실화, 모노글리코실화 및 디글리코실화 항체의 혼합물을 유발한다.
구체예에 따르면, 하나 이상의 표적 단백질은 단량체 bsGant 단백질의 상이한 글리코형이다 (상기 정의된 바와 같음).
한 예에 따르면, 하나 이상의 표적 단백질은 특허 출원 WO 2017/055540에 기재된 bsGant "항체 0015"의 상이한 글리코형이다. 이 항체는 WO 2017/055540에 개시된, SEQ ID NO: 01의 아미노산 서열을 갖는 경쇄, SEQ ID NO: 02의 아미노산 서열을 갖는 중쇄, SEQ ID NO: 03의 아미노산 서열을 갖는 경쇄, 및 SEQ ID NO: 04의 아미노산 서열을 포함하는 항체 Fab 단편을 포함하는 이중특이 항체이다. SEQ ID NO: 01은 N-말단 fab의 비-도메인 교환된 경쇄에 상응하는 215 aa 잔기 폴리펩타이드에 관한 것이고, SEQ ID NO: 02는 두 개의 중쇄에 상응하는 455 aa 잔기 폴리펩타이드이고, SEQ ID NO: 03은 추가 C-말단 fab 단편의 도메인 교환된 경쇄 fab 단편에 상응하는 215 aa 잔기 폴리펩타이드이고, SEQ ID NO: 04는 추가 C-말단 fab 단편의 도메인 교환된 중쇄 fab 단편에 상응하는 229 aa 잔기 단편이다.
도 7B는 본원에서 "단백질 P1"로도 지칭되는 디-글리코실화 항체 변이체를 나타낸다.
도 7C는 본원에서 "단백질 P2"로도 지칭되는 모노-글리코실화 항체 변이체를 나타낸다.
도 7D는 본원에서 "단백질 P3"으로도 지칭되는 비-글리코실화 항체 변이체를 나타낸다.
세 가지 변이체의 근접 용리 조건은 원하는 항체 변이체를 분리 및/또는 추가 정제하기 위해 사용되는 크로마토그래피 프로토콜에 특정한 과제를 부과한다.
항체의 Fc-영역에서 글리코실화 패턴의 차이는 입체형태, 약동학 및 결합 특징의 차이를 유발할 수 있다. Fab-영역의 글리코실화는 리간드 결합 강도 및 조직 침투에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 글리코실화 패턴은 의료 영역에서 사용되는 다수의 항체에 대해 특별한 관심사이다. 글리코실화 패턴은 발현 벡터, 세포주, 세포 배양 방식 및 세포 배양 조건, 정제 과정 및 기타 요인에 따라 달라질 수 있다. 글리코실화 변이체는 전하가 약간만 다를 수 있으므로, 이온 교환 수지를 사용하는 분리가 가능하지만 용리 조건이 최적화되어야 한다.
출원인은 크로마토그래피 컬럼에 적용된 단백질 로드 밀도가 생성물 풀 조성에 영향을 미치는 추가의 중요한 공정 파라미터임을 관찰했다. 본 발명의 구체예는 항체 변이체의 원하는 비율, 예를 들어 제약학적으로 특히 효과적인 55:45의 P1:P2 비율을 얻는 것을 허용할 수 있다.
세 가지 단백질 P1, P2 및 P3을 포함하는 단백질 용액을 분리하는 과제는 생성물 풀("표적 용리 부피")이 약 55%:45%의 P1 대 P2의 비율을 포함해야 한다는 것이다. 이 분리의 수율은 단백질 용액이 50% 이상의 P2를 포함하기 때문에 이 상대량 기준으로 인해 제한된다 (표 1 참조). 이 경우에 단백질 P3은 생성물 특이적 불순물, 즉 글리코실화가 없는 단백질 700 단백질이다.
출원인은 컬럼에 적용될 단백질 용액 중의 단백질 P1, P2 및 P3의 상대량 및 절대량이 경우에 따라 크게 다를 수 있으며 이는 특정 단백질 제조에 잘 작동하는 크로마토그래피 프로토콜이 이러한 세 가지 단백질 변이체의 상이한 준비에서 단백질 분리에 실패할 수 있으므로 추가의 과제를 부과할 수 있음을 관찰했다.
예를 들어, 세 가지 단백질 P1, P2 및 P3을 선택적으로 포함하는 단백질 용액은 세 가지 글리코실화 변이체에서 단백질 700을 생성하도록 유전적으로 저작된 세포 배양물을 수확함으로써 얻을 수 있따. 모든 글리코형은 로딩 전에 평형화된 단백질 A 수지에서 포획되었다. 원료 단백질 추출물의 로드 밀도는 수지 리터당 23 g 단백질이었다. 항체 분율이 용리되었고 바이러스 불활성화 단계 후 용출액의 pH가 다시 증가되었고 용액이 4°C에서 밤새 인큐베이션되었고 0.2 μm 멸균 필터에서 여과되었다. 여과된 단백질 A 용출액은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 대한 로드 물질로 사용되었다. 단백질 불순물을 제거하기 위해, 혼합 모드 크로마토그래피 수지가 사용되었다. 컬럼은 로딩 전에 평형화되었다. 로드 밀도는 수지 리터당 25 g 단백질이었고 유속은 시간당 150 cm였다. 그 후 통과 용출액의 pH가 감소되고 풀이 0.2 μm 멸균 필터에서 여과되었다.
이 접근법은 여섯 가지 상이한 세포 배양 추출물에 대해 여러 번 반복되었고 양이온 컬럼에 적용될 각각의 수득된 단백질 용액은 아래 "표 1"에 요약된다:
단일 글리코실화 변이체를 단리하기 위해, PorosXS 풀을 물로 희석하고 높은 단백질 로드 밀도에서 결합 및 용리 모드에서 PorosXS 수지를 사용하여 재처리했다. 컬럼은 376 mM 소듐 아세테이트 pH 5.5로 평형화되었고 로드 밀도는 수지 리터당 80 g이었다. 통과 흐름은 분획화되고 분석되었다. 통과 흐름 시작 시 분획은 98.0%의 순도를 갖는 변이체 1(단백질 용액 4)을 포함했다. 변이체 2 및 3을 용리하기 위해 6.25 CV에서 376 mM 소듐 아세테이트 pH 5.5로부터 616 mM 소듐 아세테이트 pH 5.5까지의 구배가 사용되었다. 용리 피크는 97.6%의 순도를 갖는 변이체 2(단백질 용액 5) 및 96.5%의 순도를 갖는 변이체 3(단백질 용액 6)을 포함했다.
글리코실화 변이체 분석은 1 ml/분 유속으로 pH 5.3에서 염 구배 용리로 분석 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼(Mono S 5/50 GL, GE Healthcare)에 100 μg 샘플을 주입하여 수행되었다. 이전의 피크 식별은 질량 분석법으로 수행되었다.
모델 206-210의 다양한 모델 파라미터의 기계론적 모델링에 필요한 시스템 및 수지 파라미터는 A. Osberghaus, S. Hepbildikler, S. Nath, M. Haindl, E. von Lieres, J. Hubbuch, Determination of parameters for the steric mass action model--a comparison between two approaches, Journal of Chromatography A, 1233 (2012) 54-65에 기재된 것과 같은 여러 상이한 추적자를 사용한 펄스 실험에 의해 결정되었다. 크기 1000의 라틴 하이퍼큐브 샘플링은 용리 풀의 불순물 프로파일에 대한 공정 파라미터(pH 값, 로드 조성, 용리 단계의 염 농도)의 영향을 연구하기 위해 수행되었다. 다양한 로드 밀도에 대해, 주입 부피가 변경되었다. 시뮬레이션은 ChromX를 사용하여 300 cm/h의 유속에서 5 초 시간 단계, 30 개 축 셀, 5 cm 컬럼 길이로 수행되었다. 각각의 가상 환경 실험에 대해 용리 풀 중의 개별 단백질의 불순물 프로파일 및 용리 프로파일이 고정된 부피로 풀링 결정을 사용하여 계산되었다. 결과는 불순물 풀 농도를 종속 변수로, 공정 파라미터를 독립 변수로 하는 선형 회귀 분석을 사용하여 MATLAB에서 분석되었다.
도 8A는 용리 표적 부피 중의 상대적 단백질 조성에 대한 단백질 로드의 영향을 도시하는 플롯(802)을 나타낸다. 40%의 용리 완충액 염 농도를 가정하면, 여러 상이한 단백질 로드에서 용출액 중의 단백질 P1의 상대량이 곡선(802)에 도시된다. 용출액 중의 단백질 P2의 상대량은 곡선(804)에서 도시된다.
도 8B는 용리 표적 부피 중의 상대적 단백질 조성에 대한 용리 완충액 염 농도의 영향을 도시하는 플롯(808)을 나타낸다. 컬럼에 적용된 45 g/L의 총 단백질 로드를 가정하면, 여러 상이한 염 농도에서 용출액 중의 단백질 P1의 상대량이 곡선(810)에 도시된다. 용출액 중의 단백질 P2의 상대량은 곡선(812)에서 도시된다. 본 발명의 구체예는 컬럼에 로딩된 개별 단백질의 양 및 유형에 특이적으로 적합화된 용리 완충액 염 농도를 계산적으로 확인하고, 이에 의해 각 단백질의 용리 프로파일을 예측하고 원하는 양 및 원하는 순도의 원하는 단백질을 포함하는 표적 용리 부피를 수집하는 능력을 상당히 개선하는 것을 허용한다.
경험적 테스트는 본 발명의 구체예에 따른 크로마토그래피 방법이 원하는 풀 조성 및 따라서 분자 특징규명 및 공정 설계 공간의 정의에 중요할 수 있는 생성물 품질을 예측할 수 있음을 보여준다.
도 9는 용리 완충액 염 농도 적합화에 의한 단백질 로드의 영향의 보상을 도시하는 플롯(900)이다. 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어는 다수의 증가하는 양의 컬럼에 로딩된 단백질 각각에 대해 (x-축), 두 표적 단백질 P1, P2를 55:45의 원하는 비율로 포함하는 표적 용리 부피로 제공할 수 있는 용리 완충액 염 농도(902)를 계산적으로 예측하기 위해 사용되었다. 플롯(900)으로부터 유도될 수 있는 바와 같이, 두 표적 단백질 P1, P2의 상대량을 나타내는 예측된 곡선(904, 906)은 경험적으로 측정된 상대량(910, 908)과 기본적으로 동일하다. 예측된 용리 염 농도는 세포 배양 단백질 추출물 제조 및 사전 정제 단계(이는 경우에 따라 크게 다를 수 있음)에 의해 얻은 단백질 양과 관계없이, 일정한 원하는 비율이 두 표적 단백질 P1 및 P2가 표적 용리 부피에 포함됨을 보장할 수 있었다.
출원인은 단백질 로드에 의존하는 용리 완충액 염 농도 시뮬레이션 및 선택이 시뮬레이션 정확도를 상당히 증가시킬 수 있고 많은 유형의 표적 단백질에 대해 최적화 기준을 지원하는 염 농도를 확인할 수 있게 함을 관찰했다. 출원인은 단백질 로드 밀도 및 염 몰농도 모두가 단백질의 용리 프로파일에 강한 영향을 미침을 발견했다. 이 지식을 결합하여, 염 농도는 개별 단백질 로드 밀도에 대해 특이적으로 선택된 공정 조정 파라미터로서 사용될 수 있다. 단백질 로드 밀도에 의존하는 용리 염 몰농도의 최적화는 또한 일정한 생성물 품질을 보장하 수 있다.
도 10A-C는 두 단백질 P1, P2의 용리 프로파일에 대한 용리 완충액 염 농도의 효과를 나타낸다.
예를 들어, 첫 번째 시뮬레이션은 도 10A에 나타난 바와 같이 낮은 용리 완충액 염 농도를 가정할 수 있다. 용리 완충액은 단백질 P1 및 P2를 완전히 또는 최적화 기준으로서 제공된 원하는 단백질 비율에 따라 분리할 수 없다. 두 단백질 모두 컬럼 세척 (CIP) 단계에서 용리된다. "풀링" 단계에서 얻은 용출액에는 기본적으로 단백질 P1 및 P2가 없다.
두 번째 시뮬레이션은 도 10B에 나타난 바와 같이 높은 용리 완충액 염 농도를 기반으로 할 수 있다. 이 용리 완충액은 또한 두 단백질을 완전히 분리하거나 원하는 비율로 두 단백질을 포함하는 용출액을 제공할 수 없다. 풀링 단계에서 얻은 용출액은 다량의 단백질 P1 및 P2를 모두 포함하지만, 원하는 비율은 아니다 (원하는 비율은 1:1이 아니라고 가정).
세 번째 시뮬레이션은 도 10C에 나타난 바와 같이 중간 용리 완충액 염 농도를 기반으로 할 수 있다. 이 용리 완충액은 두 단백질을 완전히 분리한다. 풀링 단계에서 얻은 용출액은 다량의 단백질 P1을 포함하고 기본적으로 단백질 P2가 없다.
P1:P2의 원하는 비율이 예를 들어 약 1:2인 경우, 시뮬레이션 소프트웨어는 도 10B에 나타난 것보다 낮지만 도 10C에 나타난 것보다 높은 여러 상이한 용리 완충액 염 농도를 기반으로 추가 시뮬레이션을 수행하여 단백질 P1 및 P2에 대해 예측된 용리 프로파일을 얻고 P1:P2 단백질 비율이 원하는 비율과 가장 잘 일치하는 풀링된 용리 부피를 제공하는 염 농도 중 하나를 확인하도록 구성될 수 있다.
Claims (22)
- 제1(P1) 및 제2(P2) 표적 단백질을 포함하는 표적 용리 부피(238)를 생성하는 크로마토그래피 방법으로서, 다음 단계를 포함하는 방법:
- 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼(230)을 제공하는 단계(100);
- 단백질 용액(202)을 상기 컬럼에 적용하는 단계(102), 단백질 용액은 적어도 제1 표적 단백질(P1) 및 제2 표적 단백질(P2) 및 선택적으로 하나 이상의 추가 단백질(P3, P4, P5, P6)을 포함함;
- 최적화 기준을 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어(204)에 입력하는 단계(106), 최적화 기준은 표적 용리 부피에 포함된 제1 및 제2 표적 단백질에 대한 표적 용리 부피의 원하는 특성임;
- 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어로, 최적화 기준과 가장 일치하는 표적 용리 부피가 얻어질 수 있도록 크로마토그래피 컬럼으로부터 제1 및 제2 표적 단백질을 용리하도록 적합화된 용리 완충액 염 농도(222)를 계산하는 단계(108), 이 계산은 다수의 상이한 용리 완충액 염 농도로서 다수의 크로마토그래피 시뮬레이션을 계산하는 것을 포함함;
- 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어로, 적어도 계산된 염 농도 및 입력 최적화 기준의 함수로서 표적 용리 부피의 풀링 경계를 계산하는 단계(110);
- 계산된 염 농도를 갖는 용리 완충액(226)을 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계(112);
- 적용된 용리 완충액을 사용하여 용리를 수행하는 단계(114); 및
- 계산된 풀링 경계를 사용하여 별도의 분획으로서 계산된 표적 용리 부피를 수집하는 단계(116). - 제1항에 있어서, 최적화 기준은 다음을 포함하는 군으로부터 선택되는, 크로마토그래피 방법:
a) 표적 용리 부피 중의 제1 및 제2 표적 단백질의 양의 원하는 비율 또는 비율 범위;
b) 표적 용리 부피 중의 제2 표적 단백질의 원하는 양 또는 양 범위와 조합된 제1 표적 단백질의 원하는 양 또는 양 범위;
c) 다음과 조합된 제1 표적 단백질의 원하는 순도 또는 순도 범위:
표적 용리 부피 중의 제1 및 제2 단백질의 양의 원하는 비율
표적 용리 부피 중의 제2 표적 단백질의 원하는 양 또는 양 범위;
표적 용리 부피 중의 제2 표적 단백질의 원하는 순도 또는 순도 범위;
d) 위에서 언급한 기준 중 둘 이상의 조합. - 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
적용된 단백질 용액(202)은 하나 이상의 추가 단백질(P3,P4, P5, P6)을 포함하는, 크로마토그래피 방법. - 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
- 다수의 크로마토그래피 시뮬레이션은 다수의 상이한 용리 완충액 염 농도의 함수 및 다수의 상이한 용리 완충액 pH 값의 함수로서 계산되고, 방법은 다음을 추가로 포함하고:
- 계산(108)은 용리 완충액 염 농도(222) 및 용리 완충액 pH 값의 조합을 계산하는 것을 포함하고 이들은 조합으로 최적화 기준과 가장 일치하는 표적 용리 부피가 얻어질 수 있도록 크로마토그래피 컬럼으로부터 제1 및 제2 표적 단백질을 용리하도록 적합화되고, 크로마토그래피 시뮬레이션은 용리 완충액 염 농도(222) 및 용리 완충액 pH의 조합의 조합을 확인하기 위해 수행되고;
- 표적 용리 부피의 풀링 경계는 적어도 용리 완충액 염 농도 및 용리 완충액 pH 값의 계산된 조합 및 입력 최적화 기준의 함수로서 계산되고;
- 컬럼에 적용된 용리 완충액(226)은 계산된 염 농도 및 계산된 pH 값을 갖는, 크로마토그래피 방법. - 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 표적 단백질은 0.75 미만, 및/또는 0.5 미만의 분해능 인자를 갖는 단백질인, 방법.
- 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 표적 단백질은 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질의 글리코실화 변이체인, 방법.
- 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 표적 단백질은 동일한 아미노산 서열을 갖고 FAB 단편 상에 상이한 수의 글리코실 기를 포함하는 항체 단량체인, 방법.
- 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 적용된 단백질 용액은 각각의 표적 단백질(P1, P2), 및 존재하는 경우 각각의 추가 단백질(P3-P6)을 적어도 0.5중량%, 특히 적어도 1중량%, 특히 적어도 2중량%의 각각의 농도로 포함하는, 방법.
- 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 적용된 단백질 용액에 포함되는 제2 표적 단백질(P2) 및 존재하는 경우 추가 단백질(P3-P6) 중 하나 이상은 용리 거동 중첩을 유발하는, 고정상에 대한 제1 표적 단백질의 친화도와 유사한 컬럼의 고정상에 대한 친화도를 갖는, 방법.
- 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 컬럼에 적용된 단백질 용액 중의 단백질의 총량은 컬럼의 최대 단백질 로드 용량과 동일하거나 이보다 작고, 특히 최대 단백질 로드 용량의 50% 내지 100%, 예를 들어 50% 내지 90% 범위인, 방법.
- 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 계산된 표적 용리 부피의 풀링 경계는 수집 시작 시간 오프셋 및 수집 중지 시간 오프셋의 형태로 명시되고, 다음 단계를 포함하는 방법:
- 크로마토그래피 컬럼을 포함하는 자동화된 크로마토그래피 시스템으로, 용리의 시작 이후 경과된 시간을 지속적으로 모니터링하는 단계;
- 경과된 시간이 수집 시작 시간 오프셋과 같을 때 크로마토그래피 시스템으로 용리된 용리 완충액의 수집을 자동으로 시작하는 단계; 및
- 경과된 시간이 수집 중지 시간 오프셋과 같을 때 크로마토그래피 시스템으로 용리된 용리 완충액의 수집을 중지하는 단계. - 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
- 다수의 크로마토그래피 시뮬레이션 각각은 둘 이상의 용리 단계를 사용하는 크로마토그래피 과정의 시뮬레이션이고, 이에 의해 각 용리 단계에서, 상이한 용리 염 농도를 갖는 용리 완충액이 사용되고,
- 계산된 용리 완충액 염 농도는 일련의 상이한 용리-단계 특이적 용리 완충액 염 농도이고,
- 크로마토그래피 컬럼에 계산된 염 농도를 갖는 용리 완충액을 적용하는 것은 계산된 일련의 용리-단계 특이적 염 농도에 따라 상이한 염 농도를 갖는 일련의 용리 완충액의 단계적으로 적용하는 것을 포함하는, 방법. - 전술한 청구항 중 어느 한 항의 크로마토그래피 방법으로서, 다음 단계를 포함하는 방법:
- 적용된 단백질 용액에 포함된 제1 및 제2 표적 단백질(P1-P2) 각각의 양 및 존재하는 경우, 선택적으로 또한 적용된 단백질 용액에 포함된 하나 이상의 추가 단백질(P3-P6) 각각의 양을 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어(204)에 입력하는 단계(104);
- 시뮬레이션이 적어도 다음을 포함하는 파라미터 값의 세트의 함수로서 계산되는 단계:
· 제공된 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼의 치수; 및
· 제1 및 제2 표적 단백질의 양 및 선택적으로 또한 컬럼에 적용된 하나 이상의 추가 단백질의 양. - 제12항에 있어서, 파라미터의 세트는 다음을 추가로 포함하는 크로마토그래피 방법:
- 용리 완충액의 사전 정의된 pH 값,
- 컬럼을 통한 용리 완충액의 유속;
- 적용된 단백질 용액의 단백질(P1, P2, P3-P6)의 화학적 특성. - 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어는 시뮬레이션 계산 및/또는 표적 용리 부피의 풀링 경계 계산을 위한 수학적 모델의 조합을 사용하도록 구성되고, 모델은 다음을 포함하는 방법:
- 컬럼(230)의 간극 부피에서 용리 완충액의 단백질 각각의 농도, 염 농도 및 pH-값을 상호 관련시키도록 구성된 컬럼 모델(206); 및
- 컬럼(230)의 고정상의 기공 부피에서 용리 완충액의 단백질 각각의 농도, 염 농도 및 pH 값을 상호 관련시키도록 구성된 기공 모델(208); 및
- 고정상(228)의 단백질 각각의 농도, 용리 완충액 염 농도 및 단백질 용액의 단백질 각각의 화학적 특성의 적어도 일부를 상호 관련시키도록 구성된 반응 모델(210). - 시뮬레이션 소프트웨어를 포함하는 크로마토그래피 제어 시스템으로서, 시뮬레이션 소프트웨어는 제1(P1) 및 제2(P2) 표적 단백질을 포함하는 표적 용리 부피(238)의 풀링 경계를 얻기 위한 방법을 수행하도록 구성되고, 크로마토그래피 제어 시스템은 다음을 위해 구성되는 크로마토그래피 제어 시스템:
- 최적화 기준을 수용하고 최적화 기준을 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어(204)에 입력하는 단계(106), 최적화 기준은 표적 용리 부피에 포함된 제1 및 제2 표적 단백질에 대한 표적 용리 부피의 원하는 특성임;
- 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어를 사용하여, 최적화 기준과 가장 일치하는 표적 용리 부피가 얻어질 수 있도록 크로마토그래피 컬럼으로부터 제1 및 제2 표적 단백질을 용리하도록 적합화된 용리 완충액 염 농도(222)를 계산하는 단계(108), 계산은 다수의 상이한 용리 완충액 염 농도로서 다수의 크로마토그래피 시뮬레이션을 계산하는 것을 포함함;
- 적어도 계산된 염 농도 및 입력 최적화 기준의 함수로서 표적 용리 부피의 풀링 경계를 계산하는 단계(110);
- 계산된 염 농도 및 풀링 경계를 출력하는 단계. - 제16항에 있어서, 시스템은 추가로 다음을 위해 구성되는 크로마토그래피 제어 시스템:
- 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼(230)의 치수를 수용하는 단계;
- 제1 및 제2 표적 단백질의 양 및 선택적으로 또한 컬럼에 적용된 하나 이상의 추가 단백질의 양을 수용하는 단계(105);
- 여기서 시뮬레이션 및/또는 풀링 경계는 적어도 다음을 포함하는 파라미터 값의 세트의 함수로서 계산됨:
· 제공된 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼의 치수; 및
· 제1 및 제2 표적 단백질의 양 및 선택적으로 또한 컬럼에 적용된 하나 이상의 추가 단백질의 양. - 제16항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
- 다수의 크로마토그래피 시뮬레이션은 다수의 상이한 용리 완충액 염 농도의 함수 및 다수의 상이한 용리 완충액 pH 값의 함수로서 계산되고, 방법은 다음을 추가로 포함하고:
- 계산(108)은 용리 완충액 염 농도(222) 및 용리 완충액 pH 값의 조합을 계산하는 것을 포함하고 이들은 조합으로 최적화 기준과 가장 일치하는 표적 용리 부피가 얻어질 수 있도록 크로마토그래피 컬럼으로부터 제1 및 제2 표적 단백질을 용리하도록 적합화됨;
- 표적 용리 부피의 풀링 경계의 계산(110)은 적어도 용리 완충액 염 농도 및 용리 완충액 pH 값의 계산된 조합 및 입력 최적화 기준의 함수로서 계산되고;
- 계산된 pH 값은 계산된 용리 완충액(226) 이외의 출력인 크로마토그래피 제어 시스템. - 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
크로마토그래피 제어 시스템은 출력 용리 염 농도를 갖는 용리 완충액을 자동으로 생성하도록 완충액 혼합 유닛을 제어하기 위해 구성되고; 및/또는
크로마토그래피 제어 시스템은 제18항에 따라 조합으로 계산되고 출력된 염 농도 및 pH 값 모두를 갖는 용리 완충액을 자동으로 생성하도록 완충액 혼합 유닛을 제어하기 위해 구성되고; 및/또는
크로마토그래피 제어 시스템은 상이한 염 농도를 갖는 다수의 이용 가능한 용리 완충액으로부터 하나를 자동으로 선택하도록 적합화된 용리 완충액 선택 유닛을 제어하기 위해 구성되고, 선택된 용리 완충액은 출력 염 농도를 갖고; 및/또는
크로마토그래피 제어 시스템은 상이한 염 농도 및 상이한 pH 값을 갖는 다수의 이용 가능한 용리 완충액으로부터 하나를 자동으로 선택하도록 적합화된 용리 완충액 선택 유닛을 제어하기 위해 구성되고, 선택된 용리 완충액은 제18항에 따라 조합으로 계산되고 출력된 염 농도 및 pH 값을 모두 포함하고; 및/또는
크로마토그래피 제어 시스템은 자동으로 생성되거나 선택된 용리 완충액을 크로마토그래피 컬럼에 자동으로 적용하도록 구성된 완충액 적용 유닛을 제어하기 위해 구성되고, 적용된 용리 완충액은 출력 염 농도를 갖거나 제18항에 따라 조합으로 계산되고 출력된 염 농도 및 pH 값 모두를 갖고;
크로마토그래피 제어 시스템은 계산된 표적 용리 부피가 계산된 풀링 경계에 따라 별도의 분획으로 자동으로 수집되도록 크로마토그래피 시스템의 용리 부피 수집 유닛을 제어하기 위해 구성되는, 크로마토그래피 제어 시스템. - 제19항의 크로마토그래피 제어 시스템을 포함하고, 완충액 혼합 유닛 및/또는 용리 완충액 선택 유닛 및/또는 완충액 적용 유닛 및/또는 자동화된 용리 부피 수집 유닛을 추가로 포함하는 크로마토그래피 시스템.
- 제1(P1) 및 제2(P2) 표적 단백질을 포함하는 표적 용리 부피(238)가 얻어지도록 크로마토그래피 과정을 관리하기 위한 컴퓨터 프로그램으로서, 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어를 포함하고 다음을 위해 구성되는 컴퓨터 프로그램:
- 표적 용리 부피에 포함된 제1 및 제2 표적 단백질에 대해 표적 용리 부피의 원하는 특성인 최적화 기준을 수용하는 단계(106);
- 크로마토그래피 시뮬레이션 소프트웨어를 사용하여, 최적화 기준과 가장 일치하는 표적 용리 부피가 얻어질 수 있도록 크로마토그래피 컬럼으로부터 제1 및 제2 표적 단백질을 용리하도록 적합화된 용리 완충액 염 농도(222)를 계산하는 단계(108), 계산은 다수의 상이한 용리 완충액 염 농도로서 다수의 크로마토그래피 시뮬레이션을 계산하는 것을 포함함;
- 적어도 계산된 염 농도 및 입력 최적화 기준의 함수로서 표적 용리 부피의 풀링 경계를 계산하는 단계(110); 및
- 최적화 기준에 따라 제1 및 제2 표적 단백질을 포함하는 표적 용리 부피가 얻어지도록 사용자가 크로마토그래피 시스템을 제어할 수 있도록 하기 위해 계산된 염 농도 및/또는 풀링 경계를 출력하고 및/또는 최적화 기준에 따라 제1 및 제2 표적 단백질을 포함하는 표적 용리 부피가 얻어지도록 크로마토그래피 시스템을 자동으로 또는 반자동으로 제어하기 위해 계산된 염 농도 및/또는 풀링 경계를 사용하는 단계. - 제21항에 있어서, 크로마토그래피 시스템의 하나 이상의 유닛을 자동으로 또는 반자동으로 제어하기 위한 제어 명령을 생성하도록 추가로 구성된, 컴퓨터 프로그램.
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