CN114341634B - 利用预测的洗脱缓冲液盐浓度的阳离子色谱 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种产生包括第一靶蛋白质和第二靶蛋白质(P1，P2)的目标洗脱体积(238)的色谱方法。所述方法包括：提供(102)阳离子交换色谱柱(230)；在所述柱上施加(104)蛋白质溶液(202)，所述蛋白质溶液包含所述第一靶蛋白质(P1)、所述第二靶蛋白质以及任选地一种或多种另外的蛋白质(P3、P4、P5、P6)；输入(106)优化标准；计算(108)色谱模拟以用于计算洗脱缓冲液盐浓度(222)，所述洗脱缓冲液盐浓度适于提供与所述优化标准最佳匹配的目标洗脱体积；根据至少计算出的盐浓度和输入的优化标准来计算(110)所述目标洗脱体积的汇集边界；在所述色谱柱上施加(112)具有所述计算出的盐浓度的洗脱缓冲液(226)；执行(114)洗脱；并且收集(116)计算出的目标洗脱体积。

Description

利用预测的洗脱缓冲液盐浓度的阳离子色谱
技术领域
本发明涉及色谱领域，并且特别地涉及用于获得特定蛋白质的阳离子色谱领域。
背景技术
阳离子交换色谱是离子交换色谱的一种形式，通常用于基于分子的净表面电荷对分子进行分离。对具有净正表面电荷的分子(例如蛋白质或肽)具有亲和力的带负电荷的离子交换树脂用于制备和分析目的两者。
蛋白质的净表面电荷随pH而变化，其方式由蛋白质的等电点(“pI”)决定。具有不同pI值的蛋白质在给定的pH下会具有不同程度的电荷，从而对色谱柱中离子交换介质颗粒上带负电荷的表面基团具有不同的亲和力。因此，具有不同pI值的蛋白质会以不同的强度与色谱树脂结合，从而有助于这些蛋白质的分离。
然而，并非所有需要分离的蛋白质和肽都具有足够不同的pI值以便在色谱柱中实现清晰的分离。此外，分离可能还取决于与柱相互作用的氨基酸侧残基的数量：由于位阻因素，并非蛋白质的所有带电基团都可以参与结合。特别地，在色谱柱中分解蛋白质糖型和包含其他类型翻译后修饰(PTM)的蛋白质是一项挑战。
糖基化是最常见的蛋白质翻译后修饰(PTM)之一。糖基化涉及寡糖(聚糖)与蛋白质的氨基酸骨架，特别是与丝氨酸/苏氨酸(O-糖基化)或天冬酰胺(N-糖基化)氨基酸残基的共价附接。聚糖残基对蛋白质的生物学功能有重大影响，因为聚糖残基可能影响蛋白质的稳定性、溶解性、抗原性、折叠和血清半衰期。蛋白质糖基化和许多其他形式的PTM(例如磷酸化、甲基化、琥珀酰亚胺化、氧化、N端蛋氨酸损失等)是在涉及各种酶和底物的复杂过程中形成的，并且取决于宿主生物体、生产细胞系和培养条件。
糖基化和其他类型的PTM是治疗性蛋白质的关键质量属性。通过构象变化的PTM可以调节蛋白质和肽的治疗价值(效力)，例如MAb的补体依赖性细胞毒性(CDCC)和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性。
因此，当涉及选择性洗脱具有特定PTM的蛋白质时，或者当涉及获得包含仅在PTM的类型、数量和/或位置方面彼此不同的两种或更多种蛋白质变体的期望比率的洗脱液时，用于分离经受糖基化和/或其他形式的PTM的蛋白质变体的当前色谱技术存在的问题是严重的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于使用离子交换色谱和如独立权利要求所述的对应的色谱控制系统来获得包含两种或更多种靶蛋白质的目标洗脱体积的方法。在从属权利要求中给出了本发明的实施例。如果本发明的实施例不是互相排斥的，则可以彼此自由地组合。
在一个方面，本发明涉及一种产生包含第一靶蛋白质和第二靶蛋白质的目标洗脱体积的色谱方法。该方法包括：
-提供阳离子交换色谱柱；
-在该柱上施加蛋白质溶液，该蛋白质溶液包含至少第一靶蛋白质、第二靶蛋白质以及任选地一种或多种另外的蛋白质；
-将优化标准输入到色谱模拟软件中；优化标准是目标洗脱体积的关于目标洗脱体积中所包含的第一靶蛋白质和第二靶蛋白质的期望性质；例如，优化标准可以是洗脱体积中所包含的两种或更多种靶蛋白质的定量性质和/或定性性质；定量性质可以是例如洗脱体积中靶蛋白质的绝对量(例如浓度)或者该两种或更多种靶蛋白质的相对量(例如比率)；另外或替代性地，该标准可以是或可以包含一个或多个定性性质，例如该靶蛋白质中的一种或两种靶蛋白质的纯度；优化标准还可以是根据该两种靶蛋白质的一种或多种定性性质和一种或多种定量性质所计算的导数评分值。
色谱模拟软件被配置为计算适于从色谱柱洗脱第一靶蛋白质和第二靶蛋白质的洗脱缓冲液盐浓度，使得能够获得与优化标准最匹配的目标洗脱体积。该计算包括根据多种不同的洗脱缓冲液盐浓度来计算多个色谱模拟。
色谱模拟软件被进一步配置为根据至少计算出的盐浓度和输入的优化标准来计算目标洗脱体积的汇集边界(pooling border)。
该方法进一步包括：
-在色谱柱上施加具有计算出的盐浓度的洗脱缓冲液；
-使用施加的洗脱缓冲液执行洗脱；并且
-使用计算出的汇集边界收集计算出的目标洗脱体积作为单独的级分。
这些特征可以是有利的，因为本发明的实施例允许获得包含预定义的量、比率和/或纯度的两种或更多种感兴趣蛋白质的目标洗脱体积，即使这些蛋白质可能具有高度相似的pI值并且在一些洗脱条件下可能具有重叠的洗脱图。
无意受制于任何理论，本申请人假设达到这种效果是因为洗脱缓冲液的盐浓度不是万能的洗脱盐浓度。相反，该盐浓度是专门针对期望的优化标准(特别是两种或更多种感兴趣靶蛋白质的绝对量或相对量和/或纯度)通过计算预测的浓度。这可以允许避免用于去除洗脱液中的特定靶蛋白质或减少洗脱液中特定靶蛋白质的量的附加处理步骤，并且/或者避免浓缩感兴趣的特定靶蛋白质以便将两种或更多种单独洗脱的靶蛋白质重新组合为期望的比率的附加处理步骤。
本申请人已经观察到，在一些药物应用场景中，期望提供由以预定义的比例和/或纯度提供的两种或更多种靶蛋白质的混合物组成的药物。例如，药物可以由被称为P1和P2的特定蛋白质P的两种PTM变体的混合物组成，因此如果以特定的量比提供变体P1和P2，则该药物最有效。本发明的实施例可以允许执行这样的色谱步骤，该色谱步骤无论如何都可以被执行用于从细胞的全部蛋白质中提取和/或上浓缩感兴趣的特定蛋白质，使得该两种或更多种感兴趣的蛋白质易于在单次色谱运行中被洗脱为期望的比率、量和/或纯度。
色谱模拟软件可以通过以下方式来实现这种期望的效果：模拟针对不同的(假设的/候选的)洗脱缓冲液盐浓度施加在柱上的蛋白质的多次色谱运行，以识别对于优化标准而言最佳的盐浓度。该通过计算识别的盐浓度然后用于形成或选择待用于实际色谱过程的洗脱缓冲液，使得所形成或选择的洗脱缓冲液的盐浓度与计算出的盐浓度相同。
通过本发明的实施例获得的洗脱缓冲液不是“标准的”/“万能的”洗脱缓冲液，而是专门适用于优化标准的洗脱缓冲液，可以根据具体情况灵活定义该优化标准。
根据实施例，该优化标准选自包含以下各项的组：
a)目标洗脱体积中第一靶蛋白质和第二靶蛋白质的量的期望的比率或比率范围；特别地，该比率可以是5:95至1:1、特别是1:95至1:1的范围中的任何比率；
b)目标洗脱体积中第一靶蛋白质的期望的量或量范围与第二靶蛋白质的期望的量或量范围的组合；例如：该量可以是绝对量或浓度；
c)第一靶蛋白质的期望的纯度或纯度范围与以下各项的组合：
■目标洗脱体积中第一蛋白质和第二蛋白质的量的期望的比率
■目标洗脱体积中第二靶蛋白质的期望的量或量范围；
■目标洗脱体积中第二靶蛋白质的期望的纯度或纯度范围；
d)上述标准中的两个或更多个标准的组合。例如，复杂的评分计算算法可用于计算这样的洗脱缓冲液的评分值，该洗脱缓冲液具有关于期望的靶蛋白质比率的匹配M1并且具有关于该两种或更多种靶蛋白质的期望纯度的匹配M2，其中M1对总评分的影响为约70％，而M2对总评分的影响为约30％。根据另一实例，优化标准是以下各项的组合：靶蛋白质中的一种或多种靶蛋白质的期望的最小绝对量、期望的比率范围(例如1:2.0至1:2.5)以及靶蛋白质中的一种或多种靶蛋白质的最低纯度评分。
这可以允许用户识别和使用这样的洗脱缓冲液，该洗脱缓冲液的盐浓度是针对相应的用例场景被优化的。例如，在研究环境中，蛋白质纯度方面可能不如在临床用例场景中那样重要。根据优选实施例，模拟软件被配置为生成GUI，该GUI使得用户能够(例如针对每次单独的色谱运行)输入和/或修改优化标准。这可以允许根据不同的用例场景、不同的靶蛋白质和靶蛋白质组合以及许多其他因素来灵活地调适色谱过程。
根据实施例，所施加的蛋白质溶液包含该一种或多种另外的蛋白质。该另外的蛋白质可能具有与靶蛋白质重叠的洗脱图，并且可能污染洗脱液。通过考虑靶蛋白质的纯度，特别是模拟中和/或汇集边界计算中靶蛋白质的量和/或化学性质，可以识别和使用洗脱缓冲液盐浓度，这允许洗脱靶蛋白质和具有污染性的另外的蛋白质，从而达到靶蛋白质的可接受的纯度水平。
根据实施例，自动形成该多种不同的洗脱缓冲液盐浓度，例如基于用于形成具有不同的盐浓度但在其他方面(例如关于pH值)相同的盐缓冲规范的预定义程序例程。这些自动形成的缓冲液盐浓度也可以被称为“假设的”或“候选的”洗脱缓冲液盐浓度。例如，计算出的盐浓度是多种候选洗脱盐浓度中已通过计算被识别为最佳地满足优化标准的一种候选洗脱盐浓度。例如，洗脱缓冲液盐浓度的计算可以包括：根据多种不同的候选洗脱盐浓度来预测目标洗脱体积中该一种或多种靶蛋白质的量和/或纯度，并且识别候选洗脱缓冲液盐浓度中最适用于收集这样的目标洗脱体积的一种洗脱缓冲液盐浓度作为该洗脱缓冲液盐浓度，该目标洗脱体积包含呈期望的量和/或纯度的该一种或多种靶蛋白质。该识别的盐浓度用作该“计算出的”洗脱缓冲液盐浓度，并且用于选择或形成这样的洗脱缓冲液，该洗脱缓冲液的盐浓度与该计算出和识别的洗脱缓冲液盐浓度相同。该选择或形成的洗脱缓冲液用于实际使用所施加的洗脱缓冲液来执行洗脱。
可以取决于实施例而将输入到色谱模拟软件中的期望的优化标准指定为绝对量(例如靶蛋白质中的每种靶蛋白质的浓度)或相对量(例如两种或更多种靶蛋白质的浓度比或质量比)。
根据实施例，该方法用于分析目的。根据优选实施例，该方法用于制备目的。
根据优选实施例，适于洗脱第一靶蛋白质的计算出的盐浓度是多种候选盐浓度中这样的一种盐浓度，该盐浓度最适用于将第一靶蛋白质和/或第二靶蛋白质与所施加的蛋白质溶液中所含有的另外的蛋白质中的任何一种另外的蛋白质分离。
这些特征可能是有利的，因为本申请人已观察到，可以基于已知的或容易获得的输入数据值的集合来充分地模拟色谱过程，以允许预测洗脱缓冲液中这样的盐浓度，该盐浓度适于洗脱两种或更多种感兴趣的蛋白质(“靶蛋白质”)，使得这些靶蛋白质以期望的量、比率和/或纯度被包含在目标洗脱体积中。优选地，该计算出的盐浓度最适用于或大致最适用于将第一靶蛋白质与蛋白质溶液中所含有的另外的蛋白质分离。
通过使用其盐浓度与预测的合适的或最佳的盐浓度相对应的洗脱缓冲液来洗脱所施加的蛋白质溶液，可以执行高分辨率蛋白质色谱，该高分辨率蛋白质色谱能够分离具有高度相似的化学性质(包含高度相似的极性)的蛋白质和蛋白质变体。此外，该计算出的洗脱缓冲液盐浓度本身可用作输入，以用于执行进一步的预测，特别是用于高度准确地预测将包含呈期望的量的该一种或多种靶蛋白质的洗脱体积的汇集边界。被预测为合适的或最佳的盐浓度的洗脱缓冲液盐浓度可以被计算为多种候选洗脱盐浓度中这样的一种洗脱盐浓度，该洗脱盐浓度被预测为提供呈期望的绝对量或相对量和/或呈期望的纯度的该两种或更多种靶蛋白质。因此，基于根据通过计算识别的“最佳的”洗脱缓冲液盐浓度而对汇集边界进行的预测，可以专门收集包含呈期望的量、比率和/或纯度的该一种或多种靶蛋白质的总洗脱体积的级分。
这在以下情况下可以是特别有用的：当一种或多种靶蛋白质需要与一种或多种高度相似的其他蛋白质(例如，与其他糖型)分离时，或者在应获得具有期望的比率(相对量)的两种或更多种高度相似的靶蛋白质的混合物的情况下。
根据本发明的实施例的方法可以具有以下优点：先前不能通过阳离子色谱分离的高度相似的蛋白质变体现在可以在单次色谱运行中被分离：在第一步中，预测合适的洗脱缓冲液盐浓度，然后使用具有所预测的盐浓度的洗脱缓冲液执行洗脱。这在任何以下情况下可以是非常有利的：在需要将蛋白质与其他化学性高度相似的蛋白质分离的情况下，或者在需要以特定的相对量获得具有高度相似的化学性质的两种或更多种蛋白质的情况下。例如，重组药物蛋白质的糖基化模式通常对这些蛋白质的质量和功效具有很大影响。通常，用于生产特定靶蛋白质的细胞系(例如具有特定糖基化模式的抗体或抗体片段)不仅会产生这种特定的糖型，还会产生一种或多种其他糖型，包含缺乏任何糖基化的那些糖型。通过首先预测合适的洗脱缓冲液盐浓度，使用具有所预测的盐浓度的洗脱缓冲液执行洗脱，然后预测和收集汇集边界，本发明的实施例可以允许特定的一种或多种感兴趣的糖型并且获得已具有合适的浓度的这些糖型。
预测目标洗脱体积的汇集边界，使得该目标洗脱体积包含呈期望的量、比率和/或纯度的该两种或更多种靶蛋白质可以是有益的，因为可以避免用于增加或降低靶蛋白质的浓度的附加步骤。这加速了获得呈期望的浓度的一种或多种靶蛋白质的过程，并且还提高了靶蛋白质的质量，因为每一个可以避免的附加的加工步骤都降低了污染或以其他方式破坏目标洗脱体积中所含有的靶蛋白质的风险。
本发明的实施例特别适用于分离治疗性或诊断性蛋白质或蛋白质片段，诸如抗体或抗体片段。本发明的实施例可用于通过使用根据本发明的实施例的色谱方法选择性地获得呈期望的量的一种或多种靶蛋白质来确保生物药物产品的质量、纯度、安全性和功效。
根据实施例，施加在柱上的蛋白质溶液是包含一种或多种盐和一种或多种蛋白质的水基溶液。
根据实施例，根据该多种不同的洗脱缓冲液盐浓度并根据多个不同的洗脱缓冲液pH值来计算该多个色谱模拟。盐浓度的计算包括计算洗脱缓冲液盐浓度和洗脱缓冲液pH值的组合，该洗脱缓冲液盐浓度和该洗脱缓冲液pH值的组合适于从色谱柱洗脱第一靶蛋白质和第二靶蛋白质，使得能够获得与优化标准最匹配的目标洗脱体积。执行色谱模拟以识别洗脱缓冲液盐浓度和洗脱缓冲液pH值的组合。根据至少洗脱缓冲液盐浓度和洗脱缓冲液pH值的计算出的组合以及输入的优化标准来计算目标洗脱体积的汇集边界。施加在柱上的洗脱缓冲液具有计算出的盐浓度和计算出的pH值。
本申请人已观察到，除了盐浓度之外，pH值对不同蛋白质的洗脱图也具有显著影响。作为盐浓度，可以很容易地将pH值设定为特定的期望值。用于执行模拟的该一个或多个模型通常考虑缓冲液的盐浓度和pH值两者，从而可以基于不同的盐浓度和不同的pH值的组合来执行多次色谱运行和/或色谱洗脱步骤的计算，而无需调适模型或实施复杂的附加程序例程。另外，在模拟过程中可以考虑盐浓度与pH值之间复杂的相互关联以及它们对洗脱图的综合影响。此外，基于盐浓度和pH值两者的变化的模拟可覆盖巨大的数据空间，因此该模拟识别能够符合优化标准的溶液缓冲液的可能性增加。例如，如果针对10种不同的盐浓度执行模拟，并且基于10种不同的pH值来模拟每种盐浓度，则该模拟包含10x 10＝100种不同的模拟和对应的理论上的/候选的洗脱缓冲液规格。
根据实施例，该方法包括自动地或手动地选择或制备洗脱缓冲液，使得所选择或所制备的洗脱缓冲液具有已在模拟中被识别为最符合优化标准的盐浓度和pH值。所选择或所制备的洗脱缓冲液用作被施加在柱上以洗脱蛋白质的缓冲液。
单一靶蛋白质案例场景
根据本文所描述的进一步的用例场景，目标洗脱体积包含仅单一(第一)靶蛋白质以及任选地一种或多种另外的(污染性)蛋白质。优化标准是期望的靶蛋白质的期望的绝对量和/或靶蛋白质的期望的纯度。特别地，可以以所收集的洗脱缓冲液体积中第一蛋白质的期望浓度或其导数值的形式指定第一靶蛋白质的期望的量。
例如，在提供期望浓度的情况下，可以将目标洗脱体积计算为包含呈期望浓度的靶蛋白质的洗脱体积，由此选择汇集边界，使得目标洗脱体积中洗脱的靶蛋白质的平均浓度与期望浓度相同。在收集目标洗脱体积期间，离开柱的洗脱缓冲液中第一靶蛋白质的浓度可能高于或低于期望浓度。
在提供期望的绝对量的情况下，可以将目标洗脱体积计算为包含呈期望的量的第一靶蛋白质的最小洗脱体积。
使用本发明的实施例来计算单一靶蛋白质的目标洗脱体积的汇集边界可以是有利的，因为这允许收集靶蛋白质，使得所收集的目标洗脱体积已经包含呈期望的浓度和/或绝对量的(单一)靶蛋白质，因此可以避免用于浓缩或稀释靶蛋白质的附加步骤。另外，本申请人已观察到根据本发明的实施例的色谱方法允许高度准确地预测目标洗脱体积的汇集边界，由此以纯的、可预测的方式提供靶蛋白质，并且使因过晚开始收集离开柱的洗脱缓冲液或过早终止该收集而损失显著部分的靶蛋白质的风险降至最低。
多种靶蛋白案例，一般方面
根据实施例，所施加的蛋白质溶液包含第一靶蛋白质、第二靶蛋白质和零种、一种或多种另外的蛋白质。将优化标准以第一靶蛋白质和第二靶蛋白质的相对量的形式(例如以第一靶蛋白质和第二靶蛋白质的比率的形式)输入到色谱模拟软件中。色谱模拟软件根据至少所计算的盐浓度和所输入的期望比率来计算目标洗脱体积的汇集边界。该方法用于产生包含期望比率的第一靶蛋白质和第二靶蛋白质的目标洗脱体积。
这可以是有利的，特别是在这样的用例场景中，其中具有高度相似的化学性质的两种蛋白质(例如两种糖型)应与所有其他蛋白质分离，并且应以特定比率获得。例如，已经观察到如果以特定比率施加两种或更多种不同的糖型，则生物医学活性化合物的一些糖型(诸如抗体或抗体片段)特别有效。在现有技术的方法中，在这些靶蛋白质具有高度相似的化学性质的情况下，获得具有定义的相对量的两种或更多种靶蛋白质的纯蛋白质溶液通常非常耗时并且有时是不可行的。这是因为常规的色谱方法无法将这些蛋白质彼此分离。相反，在洗脱缓冲液中获得的两种蛋白质的比例随着洗脱的进行而变化，并且无法被设定为期望的值。本发明的实施例利用了这样的色谱模拟软件，该色谱模拟软件被配置为：执行对第一靶蛋白质的洗脱行为的计算和预测，执行对第二靶蛋白质(以及至少在要考虑一种或多种靶蛋白质的纯度的情况下，施加在柱上的如果存在的另外的蛋白质中的任何一种蛋白质)的洗脱行为的计算和预测，以及自动计算和预测包含呈期望的比率、量和/或纯度的第一靶蛋白质和第二靶蛋白质的目标洗脱体积的汇集边界。例如，可以针对对于第一靶蛋白质和第二靶蛋白质两者而言的一系列未来时间点(例如每一秒或每一分钟)来预测：离开柱的洗脱缓冲液中的第一靶蛋白质和第二靶蛋白质的浓度，以及任选地还有所施加的蛋白质溶液中所包含的如果存在的另外的蛋白质中的每种另外的蛋白质的浓度。可以对所获得的预测的浓度值进行内插和/或外推，并且可以获得用于各种候选汇集边界的该两种或更多种靶蛋白质的绝对量和/或相对量和/或纯度。然后，可以输出对包含呈期望的量和/或纯度的第一靶蛋白质和第二靶蛋白质的目标洗脱体积进行定义的汇集边界，并且将该汇集边界用于根据该汇集边界开始和结束对目标洗脱体积的收集。
根据实施例，第一靶蛋白质和第二靶蛋白质是这样的蛋白质，该蛋白质具有低分辨率因数，特别是小于0.75的分辨率因数，并且在一些实例中具有小于0.6或甚至小于0.5的分辨率因数。
如本文所用，分辨率因数是数值，诸如0.8、1.0或3.0，其指示色谱柱的洗脱液中两种类型的分子的峰分离程度。一般来说，分辨率是分离两个信号的能力。在色谱方面，这是分离两种不同的分子类型的两个峰的能力。分辨率R由下式给出
其中tr1和tr2以及w1和w2分别是两个紧邻峰的时间t和宽度w。如果峰足够接近(这是相关问题)，则这两个峰的宽度w几乎相同。假设两种类型的分子均呈高斯分布，则分辨率因数1指示第一个峰的面积的2.5％与第二个峰的面积重叠。类似地，分辨率为1.5指示保留时间差为1.5×4×σ，其中σ是高斯分布的标准偏差，其对应于0.15％的重叠。一般来说，分辨率因数越高，则两个分子的分离效果越好。已观察到本发明的实施例能够分离甚至具有非常低的分辨率因数(例如小于0.5的分辨率因数)的蛋白质。
已观察到，即使在蛋白质具有非常低的分辨率因数的情况下，本发明的实施例也能够分离这些蛋白质。通过还考虑被加载到柱上的各种蛋白质的化学性质和量，经由通过计算来预测专门针对待施加的蛋白质的类型和量的最佳洗脱缓冲液盐浓度，并且通过使用具有所预测的最佳盐浓度的洗脱缓冲液来执行洗脱，已观察到本发明的实施例能够将甚至高度相似的蛋白质彼此分离和/或准确地预测包含确切地呈期望的量和/或纯度的一种或多种靶蛋白质的目标洗脱体积。
根据实施例，第一靶蛋白质和第二靶蛋白质是具有相同氨基酸序列但具有不同的类型、数量或位置的PTM的蛋白质的变体。特别地，第一靶蛋白质和第二靶蛋白质是糖型。
根据实施例，第一靶蛋白质和第二靶蛋白质是具有相同氨基酸序列并且在FAB片段上包含不同数量的糖基基团的抗体单体。
根据一些实施例，洗脱过程是逐步洗脱过程，其中按顺序施加多种不同的洗脱缓冲液(“步骤”)。在这种情况下，针对这些步骤中的每个步骤执行：(最合适的)洗脱盐浓度的计算识别，根据计算出的洗脱盐浓度进行的目标洗脱体积的汇集边界的计算，以及具有计算出的盐浓度的洗脱缓冲液的施加。
例如，该多个色谱模拟中的每个色谱模拟可以是使用两个或更多个洗脱步骤的色谱过程的模拟，其中在每个洗脱步骤中，使用具有不同的洗脱盐浓度的洗脱缓冲液。计算出的洗脱缓冲液盐浓度是一系列不同的、特定于洗脱步骤的洗脱缓冲液盐浓度。在色谱柱上施加具有计算出的盐浓度的洗脱缓冲液包括：根据该计算出的一系列特定于洗脱步骤的盐浓度，逐步施加具有不同的盐浓度的一系列洗脱缓冲液。
根据实施例，所施加的蛋白质溶液包含该两种或更多种靶蛋白质中的每种靶蛋白质以及如果存在的该一种或多种另外的蛋白质中的每种另外的蛋白质，其各自的浓度为至少0.5重量％，特别是至少1重量％，特别是至少2重量％。
本申请人已观察到蛋白质浓度(特别是在处于上面指定的范围内的情况下)对蛋白质的洗脱行为有影响。通过考虑施加在柱上的蛋白质溶液中所含有的蛋白质中的每种蛋白质的浓度超过上述阈值(也称为“最小量阈值”)，可以提高预测合适的洗脱缓冲液盐浓度的准确性。被施加在柱上的蛋白质可以多种方式彼此相互作用以及与固定相相互作用。一些蛋白质可能会阻止其他蛋白质与柱树脂结合，可能会关于与固定相的结合而与其他蛋白质竞争或促进其他蛋白质的结合。通过考虑蛋白质溶液中所含有的所有蛋白质的化学性质以及浓度(即，所有靶蛋白质和浓度超过上述最小量阈值的如果存在的所有另外的蛋白质)，可以显著提高色谱模拟软件的计算和预测的准确性。
优选地，被施加在柱上的蛋白质溶液是预纯化的蛋白质溶液，其包含仅一种或多种靶蛋白质并且通常还包含一种或多种非靶蛋白质。例如，首先，可以从细胞培养物中提取全部蛋白质(例如被修饰为产生一种或多种感兴趣靶蛋白质的细胞培养物)。在下一步中，预纯化该细胞培养物蛋白质提取物以便获得仅少量蛋白质，优选地仅该一种或多种靶蛋白质以及尽可能少的其他蛋白质。然而，通常无法在预纯化步骤中获得纯的形式的该一种或多种靶蛋白质。例如，细胞培养物蛋白质提取物可以包含数千种不同类型的蛋白质。在预纯化步骤中，将蛋白质提取物施加在亲和色谱柱上以获得有限的一组蛋白质，例如所有具有特定蛋白质序列或具有特定表位的蛋白质。因此，被施加在阳离子色谱柱上的蛋白质溶液可以是这样的蛋白质溶液，该蛋白质溶液是通过对细胞培养物提取物或其他来源执行预纯化过程(诸如亲和色谱)而获得的。
例如，作为使用亲和色谱柱的预纯化方法的结果获得的蛋白质溶液中的蛋白质可以由特定蛋白质的所有糖型组成，例如不含任何糖基基团的糖型、包含一个糖基基团的第二糖型、包含不同类型的糖基基团的第二糖型、包含与第一糖型相同的糖基基团但处于不同的位置的第三糖型等等。任选地，蛋白质溶液还可以包含这样的另外的蛋白质，该另外的蛋白质是不期望有的/不感兴趣的，但是在预纯化步骤期间由于任何原因该另外的蛋白质的去除失败。
通常，被施加在阳离子色谱柱上的蛋白质溶液中所含有的蛋白质类型的数量是有限的，并且远小于细胞培养物提取物中的蛋白质数量。例如，被施加在阳离子色谱柱上的蛋白质溶液中所含有的蛋白质类型的数量通常低于10、通常低于5。
根据实施例，被施加在柱上的蛋白质溶液包含第一P1靶蛋白质和第二P2靶蛋白质以及被视为污染性蛋白质的另外的蛋白质P3。第二靶蛋白质P2和该另外的蛋白质P3对柱的固定相的亲和力类似于第一靶蛋白质对该固定相的亲和力，引起P1、P2和P3的洗脱行为重叠。
例如，蛋白质P1、P2和P3是同一蛋白质的糖型或其他PTM变体，因此对固定相具有相似的亲和力。将P1和P2与P3分离并提供呈期望比率的P1和P2对于现有技术的阳离子色谱方法通常是不可行的。本发明的实施例可以允许首先预测合适的洗脱盐浓度，然后基于该最佳盐浓度和其他参数值以这样的特别准确的方式来预测汇集边界：该方式允许更确切地将靶蛋白质与其他蛋白质分离，或者——如果这由于峰强烈重叠而实际上是不可能的——允许至少收集包含呈期望的比率且具有可接受程度的纯度(相对于P3引起的污染)的该两种靶蛋白质P1和P2的目标洗脱体积。
根据实施例，被施加至柱的蛋白质溶液中的蛋白质总量等于或小于该柱的最大蛋白质负载容量，并且特别地是在最大蛋白质负载容量的50％至100％、例如50％至90％的范围内。
本申请人已观察到，在该量范围内，色谱程序对所施加的蛋白质溶液中所含有的蛋白质的浓度和化学性质特别敏感。通过考虑所施加的蛋白质溶液中所含有的蛋白质中的每种蛋白质的量，观察到关于最合适的洗脱液盐浓度的预测准确性显著提高。
根据实施例，以收集开始时间偏移和收集停止时间偏移的形式指定目标洗脱体积的计算出的汇集边界。该方法包括：
-由包括色谱柱的自动化色谱系统连续监测自洗脱开始以来经过的时间；
-当该经过的时间等于收集开始时间偏移时，由色谱系统自动开始收集经洗脱的洗脱缓冲液；并且
-当该经过的时间等于收集停止时间偏移时，由色谱系统停止收集经洗脱的洗脱缓冲液。
根据实施例，该方法包括：将施加的蛋白质溶液中所包含的第一靶蛋白质和第二靶蛋白质中的每一者的量，并且任选地还将施加的蛋白质溶液中所包含的如果存在的一种或多种另外的蛋白质中的每一者的量输入到色谱模拟软件中。
根据参数值的集合计算的模拟包括至少：
-提供的阳离子交换色谱柱的尺寸；例如，可以提供长度、直径和高度或总体积；还可以选择预定义的柱类型集合中这样的一个柱类型，该柱类型的尺寸对于色谱模拟软件来说是已知的；以及
-第一靶蛋白质和第二靶蛋白质的量，以及任选地还有施加到柱上的该一种或多种另外的蛋白质的量。例如，第一靶蛋白质和第二靶蛋白质以及蛋白质溶液中所包含的任何另外的蛋白质的量可以在计算模拟之前通过合适的蛋白质分析来测量，例如在280nm处通过UV测量的蛋白质总量；被施加在柱上的不同蛋白质由于不同的糖基化模式而略有不同的分子量可以通过阳离子交换高效液相色谱(CEX-HPLC)来确定。可以使用该分子量信息，例如以便计算被施加在柱上的特定蛋白质的蛋白质分子数/摩尔浓度并且/或者验证目标洗脱体积中的靶蛋白质比率是否满足例如要求的量、比率或纯度。
本申请人已观察到，被施加在柱上的蛋白质的量可因情况而大为不同。考虑被施加在柱上的各种蛋白质的量以及柱尺寸可以允许特别准确地计算和预测最适用于获得包含呈期望的量和/或纯度的靶蛋白质的目标洗脱体积的洗脱缓冲液盐浓度。然后，该特定的通过计算确定的盐浓度被用作实际用于执行色谱程序的洗脱缓冲液的盐浓度。另外，通过计算确定的洗脱缓冲液盐浓度用于预测包含呈期望的量和/或纯度的靶蛋白质的目标洗脱体积的汇集边界。通过计算预测的汇集边界可以被输出给人或自动化的洗脱缓冲液收集单元，从而有助于获得呈期望的量和/或纯度的该一种或多种靶蛋白质。
因此，通过本发明的实施例获得的洗脱缓冲液不是“标准的”/“万能的”洗脱缓冲液，而是专门适合于蛋白质溶液中所含有的蛋白质的类型和量并且适合于柱的尺寸的洗脱缓冲液。本申请人已观察到，在每种个别的情况下将洗脱液盐浓度调适为适于所使用的柱并且适于被施加在柱上的蛋白质的量可以大大提高色谱柱分离不同蛋白质的能力。
根据实施例，根据多种不同的盐浓度(其也可被称为“候选盐浓度”)和多个不同的洗脱缓冲液pH值(其也可被称为“候选pH值”)两者来执行模拟。作为模拟的结果，识别了最符合优化标准的特定的盐浓度和pH值的组合。该对盐浓度和pH值被用作实际用于洗脱蛋白质的洗脱缓冲液的盐浓度和pH值。
根据实施例，该参数集合进一步包括：
-洗脱缓冲液的预定义的pH值；例如，该pH值可以是先前已成功用于洗脱靶蛋白质或类似蛋白质的洗脱缓冲液的pH值；
-洗脱缓冲液通过柱的流速；
-施加的蛋白质溶液的蛋白质的化学性质。
洗脱缓冲液通过柱的流速可以是由洗脱缓冲液泵设定的流速，该洗脱缓冲液泵被配置为以预设速率泵送洗脱缓冲液通过柱。可以例如以ml/分钟为单位指定该流速。也可以在已知柱直径并且该柱直径允许根据mm/sec值得出以ml/min为单位的流速的情况下例如以mm/sec为单位指定该流速。
在一些实施例中，由泵生成的流速可以由用户通过配置泵来设定。在一些实施例中，用户在色谱模拟软件中为每次色谱运行手动输入洗脱缓冲液流速(其可显示在泵的显示器上)。在其他实施例中，洗脱缓冲液流速被存储在色谱模拟软件的配置文件中并且被重复使用以用于多次色谱运行，直到用户修改色谱模拟软件的配置文件中和泵的设定中的洗脱缓冲液流速。
不仅考虑靶蛋白质的量而且考虑靶蛋白质的化学性质以及任选地还考虑被施加至柱的该一种或多种另外的蛋白质可以进一步提高模拟和预测的准确性。
根据实施例，可以将实际输出给用户的汇集边界转换成不同的格式以易于理解。例如，收集开始时间偏移和收集停止时间偏移可以被指定为从“280nm峰”(指示洗脱液中总蛋白质浓度的峰)的起始开始的时间偏移，该峰也可被预测并且可以根据经验与通过光学方式测量的280nm峰值信号进行比较。同样，收集开始时间偏移和收集停止时间偏移可以在“柱体积”中被指定。
根据本发明的实施例，存在用于模拟阳离子色谱运行和用于预测特定蛋白质的洗脱图的许多不同的计算方法，并且这些计算方法可用于执行模拟和用于预测目标洗脱边界。
例如，Wittkopp F,Peeck L,Hafner M,Frech C.在“Modeling and simulationof protein elution in linear pH and salt gradients on weak,strong and mixedcation exchange resins applying an extended Donnan ion exchange model”,JChromatogr A.2018；1545:32-47.doi:10.1016中描述了Donnan平衡离子交换(DIX)模型在线性色谱中用于单克隆抗体的离子交换色谱的建模和模拟的应用。该出版物描述了低蛋白质浓度下色谱柱内的条件，但不涉及蛋白质分离的优化。
根据另一个实例，Müller- T,/>G,Aumann L等人在“Modelsimulation and experimental verification of a cation-exchange IgG capturestep in batch and continuous chromatography”,J Chromatogr A.2011；1218(31):5195-5204,doi:10.1016中描述了基于使用模型参数(诸如纯化的mAb的孔隙度、保留因数和传质参数)的集总动力学模型使用单柱批量和多柱连续色谱(MCSGP)的单克隆抗体(mAb)纯化过程的阳离子交换捕获步骤的模拟。
根据实施例，色谱模拟软件被配置为使用用于计算模拟和/或用于计算目标洗脱体积的汇集边界的数学模型的组合。这些模型包括：
-柱模型，该柱模型被配置为将柱间隙体积中的洗脱缓冲液中的蛋白质中的每种蛋白质的浓度、盐浓度和pH值相互关联；和
-孔隙模型，该孔隙模型被配置为将柱的固定相的孔隙体积中的洗脱缓冲液中的蛋白质中的每种蛋白质的浓度、盐浓度和pH值相互关联；和
-反应模型，该反应模型被配置为将固定相中的蛋白质中的每种蛋白质的浓度、洗脱缓冲液盐浓度和蛋白质溶液中的(目标以及任选地另外的)蛋白质中的每种蛋白质的至少一些化学性质相互关联。
文献中描述了多种不同的柱模型、孔隙模型和反应模型。这些模型中的许多模型都在不断完善之中。例如在图4C的描述中公开了描述可在本发明的上下文中使用的模型的实例的参考文献列表。
例如，可以根据Schmidt Traub等人,“Preparative Chromatography”2012,Viley-VCH实施柱模型。可以根据Schmidt Traub等人,“Preparative Chromatography”2012,Viley-VCH实施孔隙模型。可以根据Kluters等人,“Application of linear pHgradients for the modeling of ion exchange chromatography:separation ofmonoclonal antibody monomer”,J Sep Sci,2016Feb,93(4),663-675实施反应模型。反应模型的参数和/或模型本身可以在各种复杂性水平处进行修改，以有助于对实验数据的描述。例如，这在Huuk等人的“Modeling of complex antibody elution behavior underhigh protein load densities in ion exchange chromatography using anasymmetric activity coefficient”Biotechnol.J.,12:1600336.doi:10.1002/biot.201600336中得到了证明。该出版物描述了如何可以将广义离子交换等温线用于对在高蛋白质负载条件下的单一蛋白质种类的分离进行建模。
孔隙模型、柱模型和反应模型经由盐浓度和蛋白质浓度相互联系。柱模型和孔隙模型通过盐浓度相互联系，因此孔隙模型的方程可以被插入到柱模型中。
反应模型的第一个方程可以经由项被插入到柱模型中。描述蛋白质的结合强度以及因此描述蛋白质的化学性质的参数是平衡常数Keq和结合位点的数量v。两者都经由v依赖于pH(反应模型的第二个方程)。
因此，洗脱期望的量、比率和/或纯度的靶蛋白质所需的洗脱缓冲液的盐浓度可以基于参数(如pH值、所施加的蛋白质的量和化学性质、柱尺寸和由泵定义的洗脱缓冲液流速)的集合进行计算。
靶蛋白质或任选的另外的蛋白质的蛋白质量是离开色谱柱的流动相中的该蛋白质的浓度随时间变化的积分。计算软件改变盐浓度c盐，并且根据该盐浓度执行对靶蛋白质的洗脱图的预测，以及任选地也执行对一种或多种另外的蛋白质的洗脱图的预测，以用于识别提供最匹配优化标准的蛋白质洗脱图的盐浓度。
柱模型
根据实施例，柱模型中所指定的相互关联包含根据以下的柱模型公式：
其中，i为特定蛋白质的指数，t为时间，x为柱中沿着竖向柱轴线的位置，c盐为柱的流动相(即，包含可忽略量的施加的蛋白质溶液的洗脱缓冲液相)中游离(未结合的)盐离子(通常为用于阳离子交换色谱的Na+)的浓度，c蛋白质_i为柱的流动相中蛋白质i的浓度，q蛋白质_i为固定相中结合的蛋白质i的浓度，u间隙为被定义为固定相颗粒之间通过流过柱的流获得的速度的间隙流速度，ε柱为间隙孔隙度(柱的横截面中的开孔面积)。其被定义为间隙体积与柱体积的比率，其中间隙体积是柱中颗粒外部的洗脱缓冲液体积)，εp为颗粒孔隙度(被定义为颗粒自身的内部孔隙度(孔隙体积))，D轴向为轴向分散系数。轴向分散系数是惰性痕量材料沿柱的纵向方向扩散的程度的量度。D轴向描述了如菲克定律所述的在轴向方向上的分散。
孔隙度ε柱、ε_p和分散系数D轴向是可影响洗脱蛋白质峰的分离的参数。孔隙度通常是固定的，并且由柱中所包含的色谱树脂确定。优选地，它们被存储为默认值，例如被存储在配置文件中，但可以在使用不同的固定相材料的情况下进行修改。
因此，根据本发明的实施例，经由间隙流速度(孔隙模型中流量归一化为柱直径)以及柱中由竖向柱位置X所反映的位置来考虑阳离子交换色谱柱的尺寸。柱的长度和直径的组合定义了柱的总体积。
间隙流速度是根据洗脱缓冲液流过柱的流速通过计算得出的。
例如，用户可以将以[mm/s]为单位的洗脱缓冲液流速“ebfr”输入到色谱模拟软件中。色谱模拟软件根据以下公式计算间隙流速度u(间隙)[mm/s]：
u(间隙)＝ebfr/ε柱
其中ε柱为间隙柱孔隙度(无单位)。
Schmidt-Traub,Henner,编辑“Preparative chromatography:of finechemicals and pharmaceutical agents”,John Wiley&Sons,2006中描述了如何从洗脱缓冲液流速(其可以由被配置为将洗脱缓冲液泵送通过柱的泵来定义)获得间隙流速的具体实例。
孔隙模型
根据实施例，孔隙模型中所指定的相互关联包含根据以下的孔隙模型公式：
其中，i为特定蛋白质的指数，t为时间，x为柱中沿着竖向柱轴线的位置，c盐为柱的流动相中的游离(未结合的)盐离子的浓度，c蛋白质_i为柱的流动相中的蛋白质i的浓度，q蛋白质_i为固定相中结合的蛋白质i的浓度，ε柱为间隙柱孔隙度，ε_p为颗粒孔隙度，k有效为有效传质系数(描述蛋白质从间隙流动相进入孔隙体积中的运动)，z为2.7至3.3的范围中的数值，特别是3.0，rp为色谱珠的半径。参数z取决于柱材料的几何方面。Schmidt-Traub,Henner,编辑Preparative chromatography:of fine chemicals and pharmaceuticalagents.John Wiley&Sons,2006,第338-339页中描述了如何获得参数z的具体实例。
根据一个实例，间隙流速度可以与洗脱缓冲液流过柱的流速相关，如下所示：
流过柱的流速(也被称为体积流量up(mL/min))描述了被泵送通过柱的流动相的体积。为了将流速归一化为色谱柱尺寸，可以使用柱体积和长度关于柱直径对流速进行归一化。流速度u的单位根据以下公式变为(mm/s)：
通过仅考虑间隙柱体积V间隙(即，仅多孔色谱珠之间的体积)，间隙流速度还关于色谱珠的孔隙度对流速度进行归一化。所用色谱柱的间隙体积和总柱体积的比率为ε柱：
参数ε柱由此是间隙体积和总柱体积的分数。
柱的固定相可以被描述为珠的基体。柱中所有珠的总体积被称为“珠体积”V珠，其中每个珠的体积包含珠的固定相材料所消耗的体积以及珠中所包含的孔隙的体积两者。色谱柱的间隙体积V间隙被定义为柱的总体积V柱减去柱中所包含的所有珠的总珠体积V珠。根据实施例，组合了柱模型和核心模型。例如，根据实施例，根据至少计算出的盐浓度来计算目标洗脱体积包括：可以根据盐浓度c盐和固定相中蛋白质i的浓度q蛋白质_i，使用柱模型公式和孔隙模型公式来计算间隙体积中蛋白质i的浓度。
根据实施例，根据至少计算出的盐浓度来计算目标洗脱体积的汇集边界包括：使用柱模型公式和孔隙模型公式来计算在多个不同的洗脱时间t时在位置x＝柱长度处第一靶蛋白质的浓度。
反应模型
根据实施例，反应模型中所指定的相互关联包括：
-根据以下的第一反应模型公式：
-根据以下的第二反应模型公式：
-根据以下的第三反应模型公式：
其中，i为特定蛋白质的指数，t为时间，x为柱中沿着竖向柱轴线的位置，c盐为柱的流动相中游离(未结合的)盐离子的浓度，c蛋白质_i为柱的流动相中蛋白质i的浓度，q蛋白质_i为固定相中结合的蛋白质i的浓度，K动力学为动力学速率(被定义为解吸速率的倒数值，并且描述蛋白质从固定相的配体中置换离子的反应速度)，K平衡为平衡常数(即，固定相中特定蛋白质i的摩尔浓度除以流动相中蛋白质i的摩尔浓度)，Λ为配体密度(被定义为每柱体积mol的配体数量)，ν_i为结合位点的数量(即，参与蛋白质与固定相结合的蛋白质i的结合位点的数量)，σ_i为屏蔽因数(即，当蛋白质i与固定相结合时被屏蔽的蛋白质i的每个结合蛋白质分子的配体数量)，N_(羧基,i)为蛋白质i的与固定相相互作用的羧基位点的数量，N_(组氨酸,i)为蛋白质i的与固定相相互作用的组氨酸位点的数量，N_(N-端,i)为蛋白质i的与固定相相互作用的N端位点的数量，N_(氨基,i)为蛋白质i的与固定相相互作用的氨基位点的数量，pH为洗脱缓冲液的pH值，为蛋白质i的吸收状态和未结合状态之间标准游离吉布斯焓的差，/>为盐的吸收状态和未结合状态之间的标准游离吉布斯焓的差，为蛋白质i的与固定相相互作用的所有羧基基团的平均酸解离常数(Ka)，/>为蛋白质i的与固定相相互作用的所有组氨酸氨基酸的平均Ka，/>为蛋白质i的与固定相相互作用的所有N端α-氨基基团的平均Ka，/>为蛋白质i的所有氨基基团的平均Ka，R为气体常数，并且T为柱和洗脱缓冲液的温度。固定相中特定蛋白质“i”的浓度(“q蛋白质(i)”)通过使用第一个反应模型公式和第二个反应模型公式将第三个反应模型公式解析为q蛋白质(i)根据洗脱缓冲液的pH值来计算。
盐浓度c盐经由第一个反应模型公式影响固定相中结合的蛋白质q蛋白质_i的量：在低盐浓度下，蛋白质与色谱柱结合，在高盐浓度下，蛋白质被盐离子置换并被洗脱。取决于蛋白质的结合强度(其在反应模型中由结合位点ν的数量和平衡常数K平衡组成)，蛋白质在不同的盐浓度下洗脱。通过选择适当的盐浓度，可以洗脱靶蛋白质，而不需要的蛋白质仍然结合在色谱柱上。这些参数值中的一些参数值是特定于蛋白质的，并且可以从文献中获得。这些参数中的一些参数是特定于蛋白质和模型的。它们也可以从文献中获得，或者可以通过执行一些初步的经验校准步骤来获得，已发表所使用的相应模型的作者通常描述了这些初步的经验校准步骤。例如，像N_(羧基,i)这样的参数指示蛋白质i的与固定相相互作用的羧基位点的数量是特定于蛋白质的，但也取决于用于执行模拟的模型。实际与固定相相互作用的羧基位点的数量受到所用反应模型中所描述的空间效应的限制。使用特定于蛋白质的经验测试和特定于模型的经验测试来确定与固定相相互作用的相应位点的数量。对于一些蛋白质，参数值已经可以从文献中得出。吉布斯能ΔG0 P/RT和ΔG0 s/RT也可以针对蛋白质溶液中的蛋白质中的每种蛋白质根据经验确定，或者可以从文献中得出。
pH值影响蛋白质的结合位点的数量v(第二个方程)。结合位点的数量v影响平衡常数K平衡(第三个方程)。因此，pH值与反应模型的方程1的盐浓度有关。
因此，反应模型考虑了pH值和蛋白质化学性质的贡献，例如就蛋白质中某些基团的pKa值而言以及就蛋白质的结合位点v而言。反应模型还考虑了盐浓度，从而将洗脱缓冲液盐浓度与待洗脱的蛋白质的化学性质相互关联。盐浓度c盐是第一个方程的一部分，它经由结合位点的数量v与蛋白质结合特性直接相关。
然而，上述反应模型只是如何可以实现反应模型的多种可能方式中的一种方式。阳离子色谱运行的建模和模拟是一个正在进行中的研究领域，因此同样可以使用本文描述的用于执行模拟的公式和模型的各种修改。还可以使用当前在文献中描述的替代性柱模型、孔隙模型和反应模型，并且未来将可能开发和发布新的柱模型、孔隙模型和反应模型，这些新的柱模型、孔隙模型和反应模型可能可以用于根据至少几种不同的洗脱缓冲液盐浓度以及优选地根据另外的参数(诸如待施加在柱上的蛋白质的量和化学性质)来执行色谱模拟。
根据一个实施例，提供了蛋白质P1至P3的例如参考图7描述的以下特定于模型的化学性质值，并且在计算合适的洗脱缓冲液盐浓度和汇集边界期间，这些化学性质值由反应模型用作输入：
另外，以下输入参数值可以被提供给反应模型，例如经由GUI、配置文件或其他数据源被提供：
屏蔽因数从变体1到变体3变小，这与降低糖基化的等级相一致，并且因而与变体1到变体3的蛋白质大小相一致。
上述参数值可以由用户经由GUI提供并且/或者可以在色谱模拟软件的配置文件中被指定。
存在用于获得和/或估计模型参数的各种方法。例如，Simon Kluters等人于2015年11月9日首次发表的研究论文“Application of linear pH gradients for themodeling of ion exchange chromatography:Separation of monoclonal antibodymonomer from aggregates”(https://doi.org/10.1002/jssc.201500994)描述了一种色谱柱中的离子交换的机械模型以及如何可以获得该模型的参数。
在进一步的方面，本发明涉及一种包含模拟软件的色谱控制系统。例如，该色谱控制系统可用于引导对色谱系统的手动控制，或用于提供对控制系统的全自动化或半自动化的控制。该模拟软件被配置用于执行一种获得包含期望的第一量的第一靶蛋白质的目标洗脱体积的汇集边界的方法。
该色谱控制系统配置用于：
-接收优化标准并将该优化标准输入到色谱模拟软件中，该优化标准是目标洗脱体积的关于目标洗脱体积中所包含的第一靶蛋白质和第二靶蛋白质的期望性质；
-使用色谱模拟软件计算适于从色谱柱洗脱第一靶蛋白质和第二靶蛋白质的洗脱缓冲液盐浓度，使得能够获得与优化标准最匹配的目标洗脱体积，该计算包括根据多种不同的洗脱缓冲液盐浓度来计算多个色谱模拟；
-根据至少计算出的盐浓度和输入的优化标准来计算目标洗脱体积的汇集边界；
-输出计算出的盐浓度和汇集边界；并且/或者
-控制洗脱体积收集单元，使得根据计算出的汇集边界自动收集计算出的目标洗脱体积作为单独的级分。
根据实施例，该系统被进一步配置用于：
-接收阳离子交换色谱柱的尺寸；并且
-接收第一靶蛋白质和第二靶蛋白质的量，并且任选地还接收施加在柱上的该一种或多种另外的蛋白质的量；
根据参数值的集合计算模拟和/或汇集边界，该参数值的集合包括至少：
●提供的阳离子交换色谱柱的尺寸；以及
●第一靶蛋白质和第二靶蛋白质的量，以及任选地还有施加到柱上的该一种或多种另外的蛋白质的量。
根据实施例，该参数集合进一步包括：
●洗脱缓冲液的预定义的pH值，
●洗脱缓冲液通过柱的流速；
●施加的蛋白质溶液的蛋白质的化学性质。
根据本发明的实施例，第一蛋白质的期望的第一量被指定为期望的第一蛋白质的期望的绝对量。特别地，可以以所收集的洗脱缓冲液体积中第一蛋白质的期望浓度或其导数值的形式指定第一靶蛋白质的期望的量。
根据其他实施例，施加的蛋白质溶液包含第一靶蛋白质、第二靶蛋白质和零个、一个或多个另外的蛋白质。将第一蛋白质的期望的第一量以相对量的形式输入到色谱模拟软件中。该相对量是第一靶蛋白质与第二靶蛋白质的比率。色谱模拟软件根据至少所计算的盐浓度和所输入的期望比率来计算目标洗脱体积的汇集边界。该方法用于产生包含期望比率的第一靶蛋白质和第二靶蛋白质的目标洗脱体积。
根据实施例，根据该多种不同的洗脱缓冲液盐浓度并根据多个不同的洗脱缓冲液pH值来计算该多个色谱模拟。盐浓度的计算包括计算洗脱缓冲液盐浓度和洗脱缓冲液pH值的组合，该洗脱缓冲液盐浓度和该洗脱缓冲液pH值的组合适于从色谱柱洗脱第一靶蛋白质和第二靶蛋白质，使得能够获得与优化标准最匹配的目标洗脱体积。执行色谱模拟以识别洗脱缓冲液盐浓度和洗脱缓冲液pH值的组合。根据至少洗脱缓冲液盐浓度和洗脱缓冲液pH值的计算出的组合以及输入的优化标准来计算目标洗脱体积的汇集边界的计算。在计算出的洗脱缓冲液之外，还输出计算出的pH值。
根据实施例，色谱控制系统被配置为将缓冲液混合单元控制为自动生成具有输出洗脱盐浓度的洗脱缓冲液。
另外或替代性地，色谱控制系统被配置为控制洗脱缓冲液选择单元，该洗脱缓冲液选择单元适于从具有不同的盐浓度的多种可用洗脱缓冲液中自动选出一种可用洗脱缓冲液，被选择的洗脱缓冲液具有输出盐浓度。
另外或替代性地，色谱控制系统被配置为将缓冲液混合单元控制为自动生成具有计算出并被输出的盐浓度和pH值两者的组合的洗脱缓冲液。
另外或替代性地，色谱控制系统被配置为控制色谱系统的洗脱体积收集单元，使得根据计算出的汇集边界自动收集计算出的目标洗脱体积作为单独的级分。
另外或替代性地，色谱控制系统被配置为控制洗脱缓冲液选择单元，该洗脱缓冲液选择单元适于从具有不同的盐浓度和不同的pH值的多种可用洗脱缓冲液中自动选出一种可用洗脱缓冲液，被选择的洗脱缓冲液具有计算出并被输出的盐浓度和pH值两者的组合。
另外或替代性地，色谱控制系统被配置为控制缓冲液施加单元，该缓冲液施加单元被配置为在色谱柱上自动施加自动生成或选择的洗脱缓冲液，施加的洗脱缓冲液具有输出盐浓度或具有计算出并被输出的盐浓度和pH值两者的组合。
在进一步的方面，本发明涉及一种色谱系统，该色谱系统包括色谱控制系统，并且进一步包括上述缓冲液混合单元和/或洗脱缓冲液选择单元和/或缓冲液施加单元和/或自动化洗脱体积收集单元。
在进一步的方面，本发明涉及一种色谱系统，该色谱系统包括色谱控制系统，并且进一步包括缓冲液混合单元，该缓冲液混合单元适于自动生成具有输出洗脱盐浓度的洗脱缓冲液。
另外或替代性地，该色谱系统进一步包括洗脱缓冲液选择单元，该洗脱缓冲液选择单元适于从具有不同盐浓度的多种可用洗脱缓冲液中自动选出一种可用洗脱缓冲液，被选择的洗脱缓冲液具有输出盐浓度。
另外或替代性地，该色谱系统进一步包括缓冲液施加单元，该缓冲液施加单元被配置为在色谱柱上自动施加自动生成或选择的洗脱缓冲液。
另外或替代性地，该色谱系统进一步包括自动化的洗脱体积收集单元，该自动化的洗脱体积收集单元被配置为根据输出汇集边界自动开始和停止收集离开柱的被洗脱的缓冲液的级分。
在进一步的方面，本发明涉及一种计算机程序，该计算机程序用于管理色谱过程，使得获得包含第一靶蛋白质和第二靶蛋白质的目标洗脱体积。该计算机程序包括色谱模拟软件并被配置用于：
-接收优化标准，该优化标准是目标洗脱体积的关于目标洗脱体积中所包含的第一靶蛋白质和第二靶蛋白质的期望性质；
-使用该色谱模拟软件计算适于从色谱柱洗脱第一靶蛋白质和第二靶蛋白质的洗脱缓冲液盐浓度，使得能够获得与优化标准最匹配的目标洗脱体积，该计算包括根据多种不同的洗脱缓冲液盐浓度来计算多个色谱模拟；
-根据至少计算出的盐浓度和输入的优化标准来计算目标洗脱体积的汇集边界；并且
-输出计算出的盐浓度和/或汇集边界，以使用户能够控制色谱系统，从而获得包含符合优化标准的第一靶蛋白质和第二靶蛋白质的目标洗脱体积，并且/或者使用计算出的盐浓度和/或汇集边界用于自动或半自动地控制色谱系统，从而获得包含符合优化标准的第一靶蛋白质和第二靶蛋白质的目标洗脱体积。
根据实施例，该计算机程序进一步被配置用于生成用于自动或半自动地控制色谱系统的一个或多个单元的控制命令。
根据实施例，该计算机程序进一步被配置用于生成用于自动或半自动地控制色谱系统的一个或多个单元的控制命令。
如本文所用，“靶蛋白质”是具有特定PTM的蛋白质或蛋白质变体，其应通过阳离子色谱以期望的绝对量或相对量获得。
如本文所用，蛋白质的“洗脱图”是对洗脱液中历经一段时间的蛋白质浓度的指示。
施加的蛋白质溶液中所包含的该一种或多种“另外的蛋白质”可以包含一种或多种另外的靶蛋白质和/或一种或多种非靶蛋白质，其中“非靶蛋白质”是不期望其存在的蛋白质，例如因为它被视为在色谱运行期间要从该一种或多种靶蛋白质中去除的污染物。
如本文所用，“目标洗脱体积”是已经通过色谱柱并且随后在离开该柱后已经被收集的目标缓冲液的特定体积。目标洗脱体积包含呈期望的绝对量或相对量的该一种或多种靶蛋白质。目标洗脱体积由以下确定
如本文所用，“离子交换色谱”是这样的色谱过程，该过程基于离子和极性分子(诸如蛋白质或肽)对离子交换剂的亲和力来分离该离子和该极性分子。然而，离子色谱必须在距离蛋白质等电点一个单位的条件下进行。因此，在给定条件下分离具有高度相似的等电点的分子是一项巨大的挑战。
术语“阳离子交换色谱”是指当感兴趣的分子带正电或具有正极性时所使用的一种离子交换色谱。分子带正电或具有正极性是因为用于色谱的pH小于pI。在这种类型的色谱中，固定相带负电，并且带正电的分子被加载以被固定相吸引。当要分离的期望分子是阳离子时，使用阳离子交换色谱。然后可以从柱上洗脱结合的分子并使用本文中被称为“洗脱缓冲液”的洗脱剂来收集。与其他分离技术相比，使用离子色谱的主要优势之一是在分离期间涉及仅一种相互作用。
如本文所用，“色谱模拟软件”是任何类型的软件，例如应用程序、脚本、更大的软件套件或软件平台的软件模块，该软件模块包含用于模拟(预测)色谱过程的一些方面的计算机可解译的代码，特别是洗脱缓冲液的推荐的盐浓度和/或包含期望量的一种或多种靶蛋白质的洗脱体积的推荐的洗脱边界。
如本文所用，“洗脱缓冲液”是指水基溶液，也被称为“洗脱剂”，其被施加在色谱柱上以便从色谱柱上洗脱与该柱结合的一个或多个分子，使得洗脱的蛋白质被包含在离开该柱的洗脱缓冲液中，并且可以在不同的洗脱液级分中与离开该柱的其他蛋白质分开地收集该洗脱的蛋白质。
“计算的目标洗脱体积”是被预测为以输入的期望的绝对量或相对量包含一种或多种靶蛋白质的洗脱体积。例如，计算出的目标洗脱体积可以经由所预测的汇集边界而被指定。
预测的“汇集边界”是这样的数据值，该数据值指示离开色谱柱的目标洗脱缓冲液体积的哪一部分需要被单独收集以便获得以期望量包含该一种或多种靶蛋白质的洗脱体积。根据一些实施例，如下所述指定汇集边界：以指示要开始收集目标洗脱缓冲液体积的时间的开始时间的形式，以及以指示要停止收集目标体积的时间的停止时间的形式。根据其他实施例，如下所述指定汇集边界：以指示当要开始收集目标体积时已经穿过并离开柱的洗脱缓冲液体积的开始洗脱缓冲液体积的形式，以及以指示当要停止收集目标体积时洗脱缓冲液体积已经穿过并离开柱的停止洗脱缓冲液体积的形式。例如，目标洗脱体积的汇集边界可以为“3.5倍柱体积”和“4.6倍柱体积”，并且目标洗脱体积可以通过以下方式获得：在3.5柱体积的洗脱缓冲液已被施加到柱上并已离开柱之后选择性地收集离开柱的洗脱缓冲液，并且当超过4.6倍柱体积已被施加到柱上并即将离开柱时停止收集。将预测的汇集边界指定为时间还是体积取决于相应的实现方式。
如本文所用，“糖型”是附接有不同的聚糖或具有不同的聚糖数量或位置的糖蛋白(或糖肽或其他生物糖苷)的几种不同形式中的任一种形式。
蛋白质的“纯度”指示该蛋白质未与任何其他物质(特别是与其他蛋白质)混合的状态程度。例如，在洗脱体积中纯度为99％的特定蛋白质P1意味着洗脱体积由洗脱缓冲液级分和非洗脱缓冲液级分组成，其中非洗脱缓冲液级分的99％由蛋白质P1组成，并且非洗脱缓冲液级分的1％由其他物质(例如施加的蛋白质溶液中所含有的一种或多种其他的蛋白质P2、P3、……)组成。如果在给定的汇集边界内收集的洗脱液中所有蛋白质的浓度是已知的(例如预测的或通过经验确定的)，则蛋白质的纯度是隐含地给出的。纯度可用作关于一种或多种靶蛋白质的优化标准。例如，在理想情况下，在目标洗脱体积中待获得的所有靶蛋白质的纯度为100％，但实际上，优化标准可能需要取决于个别情况的最低纯度标准，例如99％或更小。
附图说明
在以下实施例中，仅通过示例，参考附图更详细地解释本发明，其中：
图1描绘了根据本发明的实施例的方法的流程图；
图2描绘了色谱系统；
图3描绘了另一个色谱系统；
图4A描绘了用于选择待由色谱模拟软件使用的模型的GUI；
图4B,C进一步示出了相应的模型类型；
图4D-E描绘了用于在色谱模拟软件中输入数据的GUI；
图5A是针对第一蛋白质溶液获得的洗脱图表；
图5B描绘了在给定多种不同的候选洗脱盐浓度的情况下第一蛋白质溶液中靶蛋白质的收率和纯度以及组合的纯度-收率-目标参数的预测的结果；
图5C描绘了带有在给定多种不同的候选洗脱盐浓度的情况下第一蛋白质溶液中靶蛋白质的组合的纯度/收率-目标参数的预测的结果的图表；
图6A是针对第二蛋白质溶液获得的洗脱图表；
图6B描绘了在给定多种不同的候选洗脱盐浓度的情况下第二蛋白质溶液中第一靶蛋白质和第二靶蛋白质的收率和纯度以及组合的纯度-收率-目标参数的预测的结果；
图6C描绘了带有在给定多种不同的候选洗脱盐浓度的情况下第二蛋白质溶液中第一靶蛋白质和第二靶蛋白质的组合的纯度/收率-目标参数的预测的结果的图表；
图6D描绘了预测的蛋白质比率和测量的蛋白质比率的比较；
图6E描绘了蛋白质P1和P2的分辨率；
图7描述了两种靶蛋白质P1、P2和另外的蛋白质P3的实例；
图8A是示出蛋白质负载对相对汇集物(pool)组成的影响的图表；
图8B是示出洗脱缓冲液盐浓度对相对汇集物组成的影响的图表；
图9是示出蛋白质负载对靶蛋白质比率的影响通过预测的洗脱缓冲液盐浓度的补偿的图表；并且
图10A-C描绘了不同的盐浓度对两种蛋白质的洗脱图的影响。
具体实施方式
图1描绘了根据本发明的实施例的色谱方法的流程图。
该方法可用于获得目标洗脱体积，该目标洗脱体积包含两种或更多种靶蛋白质的期望的绝对量或相对量和/或纯度。例如，可以执行该方法以分别获得呈一定浓度或量的靶蛋白质P1和靶蛋白质P2，其中靶蛋白质P1优选地在目标洗脱体积内具有最低纯度。另外或替代性地，该方法可用于获得包含期望比率的两种或更多种靶蛋白质的目标洗脱体积。
在第一步骤100中，该方法包括提供如例如图2和图3中所描绘的阳离子交换色谱柱230。存在大量可用于制造自装柱以及预装柱的市售色谱树脂材料。
例如，PorosTM XS(Thermo ScientificTM)可用作自装柱中(例如从KronLab购买的色谱柱中)的色谱树脂材料。替代性地，可以使用例如从(例如其尺寸为：长度＝5cm并且直径＝0.5cm或长度＝10cm并且直径＝0.5cm)购买、从KronLab购买的预装柱。对于大规模运行，色谱柱尺寸可能与用于较小的实验室规模运行的色谱柱尺寸显著不同。例如，大规模运行中所使用的柱的柱尺寸可以为：长度＝22.5cm并且直径＝25cm。
色谱柱可以安装在自动化或半自动化的色谱系统内，诸如带有样品泵和内部分馏的Avant 25和150色谱系统(GE Healthcare)。
接下来在步骤102中，将包含两种或更多种靶蛋白质以及任选地一种或多种非靶蛋白质(被视为杂质)的蛋白质溶液施加在柱上。蛋白质溶液包含第一靶蛋白质P1、第二靶蛋白质P2以及任选地一种或多种另外的蛋白质，该一种或多种另外的蛋白质为非靶蛋白质P3、P4、P5、P6。
为了生成待被施加在色谱柱上的蛋白质溶液，执行一个或多个预处理和预纯化步骤。首先，收获细胞培养物并获得所收获的细胞的蛋白质组。其包含糖基化抗体和许多其他类型的蛋白质的复杂混合物。为了选择性地获得抗体级分，将细胞培养物提取物施加在适于选择性结合抗体和抗体片段的第一预纯化柱上。
根据一个实例，第一预纯化柱包含用于单克隆抗体(mAb)纯化的树脂，例如在加载样品之前被平衡的蛋白质A树脂。在该实例和许多其他实例中，第一预纯化柱的负载密度为约每升树脂23g蛋白质。抗体级分被洗脱，并且在病毒灭活步骤之后，洗脱液的pH再次升高。将溶液在4℃下温育过夜，并且通过0.2μm无菌过滤器过滤。经过滤的蛋白质A洗脱液用作第二预纯化柱(例如填充有混合模式色谱树脂的柱)的负载材料。为了去除蛋白质杂质，使用混合模式色谱。加载之前已平衡柱。负载密度为每升树脂25g蛋白质，并且流速为每小时150cm。之后，流通洗脱液的pH降低，并且通过0.2μm无菌过滤器过滤汇集物。
作为这些预处理和预纯化步骤的结果，获得了待被施加在色谱柱230上的蛋白质溶液。由于所使用的预纯化步骤的数量和性质，蛋白质溶液包含仅几种类型的其化学性质通常是众所周知的蛋白质。预处理和预纯化步骤的性质和数量可以取决于用于提供细胞培养物蛋白质提取物的细胞培养物和细胞的类型，并且/或者可以取决于一种或多种类型的感兴趣的蛋白质。通常，一系列的多个纯化步骤也将不能完全纯化该一种或多种靶蛋白质，特别是在这样的情况下不能完全纯化该一种或多种靶蛋白质：该一种或多种靶蛋白质是糖型或其他类型的基于PTM的蛋白质变体，其化学性质与细胞培养物提取物中的一种或多种其他的蛋白质高度相似。
另外，可以使用诸如质谱法的分析测试，以便不仅确定待施加在柱230上的蛋白质溶液中所含有的每种蛋白质类型数目还确定其量。
然后在步骤104中，将已被施加或待被施加在柱上的蛋白质溶液中的每种蛋白质的量输入到色谱模拟软件204中。
另外，在步骤106中，由用户将第一靶蛋白质和第二靶蛋白质的期望的第一量214以及任选地还有如果存在的非靶蛋白质的相应量输入到色谱模拟软件中。另外，一些其他值可以经由用户界面被输入到色谱模拟软件中，或者可以经由配置文件或其他方式被提供。例如，这些其他值可以包括：期望的优化标准(第一靶蛋白质和/或第二靶蛋白质的量和/或纯度)，洗脱缓冲液的pH值，在待用于将洗脱缓冲液泵送通过柱的泵中指定的洗脱缓冲液流速，蛋白质溶液中的蛋白质中的每种蛋白质的化学性质，已被施加或待被施加在柱上的蛋白质溶液中各种蛋白质的量；以及柱的尺寸。参数的数量和性质可以取决于模拟软件所使用的用于在多种不同的洗脱缓冲液盐浓度下模拟色谱运行的模型。
一些输入参数，诸如蛋白质的量、柱尺寸、洗脱缓冲液的pH值、固定相的孔隙度、洗脱缓冲液流速等，可以被存储在配置文件中或者经由GUI被输入，并且可以被调适以适于相应的应用场景和蛋白质溶液。一些参数，如经校准的模型参数(例如等温线、N、ΔGp0、ΔGs0、pKa、配体密度)可以被重复使用，并且通常被存储在配置文件中。
这可以使色谱模拟软件能够根据许多不同的候选洗脱缓冲液盐浓度并且具体基于待被加载到柱上的蛋白质的量和化学性质来模拟一种或多种不同的候选洗脱体积的一种或多种靶蛋白质的浓度值和/或纯度值。
例如，计算出其浓度的洗脱缓冲液中的盐可以是钠盐，例如乙酸钠。
洗脱缓冲液的推荐的pH值可以例如从文献中或从初步经验测试中得出。对于一般的蛋白质色谱，洗脱缓冲液的pH范围通常在pH 2.5至10之间。对于阳离子交换色谱，洗脱缓冲液的pH范围通常在pH 4至9之间。优选地，被输入到模拟软件中的pH值是已知对于执行对类似蛋白质(如当前待被分离的那些蛋白质)的色谱分离或分析而言表现良好的pH值。在这里描述的实例中，被输入到色谱模拟软件中并且也是实际使用的洗脱缓冲液的pH值的pH值在5.30至5.70的范围内。
通常，在模拟期间pH值不改变。可以控制实际使用的洗脱缓冲液的pH值，例如利用pH计来控制，例如利用WTW Sentix Mic探头来控制。
蛋白质的化学性质可以包含这样的性质：该性质独立于用于模拟色谱过程以计算合适的洗脱缓冲液盐浓度的任何预测性模型(例如pK或氨基酸部分的数量和性质)。
蛋白质的化学性质还可以包含对用于模拟色谱过程的预测性模型具有特定性的性质。
为了获得蛋白质的特定于模型的化学性质，可以使用色谱数据(色谱图)以及对应的离线分析数据(例如HPLC数据)。
例如，文献中描述了不同的色谱建模工作流程，以便获得蛋白质的特定于色谱模型的性质值。当在等温线的非线性范围内在升高的蛋白质浓度下工作时，不同的模型可以相同的方式影响色谱图。例如，峰最大值的位置取决于屏蔽因数ν或K平衡而变化。为了估计等温线的线性范围中的参数，可以应用Yamamoto方程，如例如M.Rüdt,F.Gillet,S.Heege,J.Hitzler,B.Kalbfuss,B.Guélat,“Combined Yamamoto approach for simultaneousestimation of adsorption isotherm and kinetic parameters in ion-exchangechromatography”,Journal of Chromatography A,1413(2015)68-76和S.Yamamoto,K.Nakanishi,R.Matsuno,T.Kamikuno,“Ion-exchange chromatography of proteins-Prediction of Elution Curves and Operating Conditions”,I.TheoredicalConsiderations,Biotechnology and Bioengineering,25(1983)1465-1483中所描述的。
根据实施例，在等温线的线性范围中的实验用以下三种方法中的一种或多种方法来评估：1)通过色谱图的曲线拟合进行参数估计(T.Hahn,T.Huuk,V.Heuveline,J.Hubbuch,Simulating and Optimizing Preparative Protein Chromatography withChromX,Journal of Chemical Education,92(2015)1497-1502)；2)使用Yamamoto等人描述的log(GH)/log(c(Na+))图表进行对数图形评估(T.Ishihara,T.Kadoya,H.Yoshida,T.Tamada,S.Yamamoto,Rational methods for predicting human monoclonalantibodies retention in protein A affinity chromatography and cation exchangechromatography:Structure-based chromatography design for monoclonalantibodies,Journal of Chromatography A,1093(2005)126-138.)；以及3)GH(c(Na+))图表的非对数图形评估(M.Schmidt,M.Hafner,C.Frech,Modeling of salt and pHgradient elution in ion-exchange chromatography,Journal of SeparationScience,37(2014)5-13)。如果此时未观察到良好的相关性，则所选模型可能不适用于该应用。
下一步是添加高蛋白质实验，由此线性梯度数据的评估结果可用于改进参数估计。如果色谱图曲线拟合引致模型与实验数据之间具有良好的相关性，则可以通过在校准数据集中未包含的重要工艺参数组合处执行验证运行来测试参数集。如果未找到满意的模型，则要么必须扩展模型方程，要么必须将数据集缩小至更小的设计空间。在下文中，将描述根据本发明的实施例的蛋白质的一些特定于模型的化学性质的获得。
根据一些实施例，执行Yamamoto评估以获得特定于模型的蛋白质性质。例如，如别处所述执行线性梯度洗脱实验的图形log(GH)/log(c(Na+))评估(M.Schmidt,M.Hafner,C.Frech,Modeling of salt and pH gradient elution in ion-exchangechromatography,Journal of Separation Science,37(2014)5-13.,T.Ishihara,T.Kadoya,H.Yoshida,T.Tamada,S.Yamamoto,Rational methods for predicting humanmonoclonal antibodies retention in protein A affinity chromatography andcation exchange chromatography:Structure-based chromatography design formonoclonal antibodies,Journal of Chromatography A,1093(2005)126-138)。盐梯度的归一化梯度斜率GH可以计算如下：
VG为梯度体积，VC为柱体积，ε柱为间隙柱孔隙度，εp为珠孔隙度并且kD为排除因数。假设KD为0.6(F.Wittkopp,L.Peeck,M.Hafner,C.Frech,Modeling and simulation ofprotein elution in linear pH and salt gradients on weak,strong and mixedcation exchange resins applying an extended Donnan ion exchange model,JChromatogr A,1545(2018)32-47)。可以通过绘制log(GH)/log(c(Na+))并从斜率中减去1来确定结合位点的数量(M.Schmidt,M.Hafner,C.Frech,Modeling of salt and pHgradient elution in ion-exchange chromatography,Journal of SeparationScience,37(2014)5-13)。对于一价盐，可以利用相同的图表计算平衡常数：
蛋白质的自由吉布斯能ΔG0 P/RT和盐的自由吉布斯能ΔG0 s/RT可以通过根据以下方程绘制ln(Keq)/ν从斜率和y截距来确定：
所有计算均在Microsoft Excel中应用软件的内部线性回归函数来执行。
根据实施例，在进一步的步骤中，执行GH/c(Na+)曲线拟合。根据先前的出版物通过计算微分方程来执行GH/c(Na+)曲线(S.Kluters,F.Wittkopp,M.Johnck,C.Frech,Application of linear pH gradients for the modeling of ion exchangechromatography:Separation of monoclonal antibody monomer from aggregates,JSep Sci,39(2016)663-675；以及M.Schmidt,M.Hafner,C.Frech,Modeling of salt andpH gradient elution in ion-exchange chromatography,Journal of SeparationScience,37(2014)5-13)：
其中GH盐为盐梯度的归一化的梯度斜率，c盐为柱的流动相中游离(未结合的)盐离子的浓度，c盐,洗脱为洗脱峰最大值处洗脱缓冲液中盐的浓度，q蛋白质_i为固定相中结合的蛋白质i的浓度，K平衡_i为平衡常数(即，固定相中特定蛋白质i的摩尔浓度除以流动相中蛋白质i的摩尔浓度)，Λ为配体密度(被定义为每柱体积的配体摩尔数)，νi为结合位点的数量(即，参与蛋白质与固定相结合的蛋白质i的结合位点的数量)，σi为屏蔽因数。
上述计算可以例如在Berkeley中执行，例如通过应用软件的内部四阶Runge-Kutta算法和0.01mol/L Na+的时间步长来执行。参数猜测值是根据先前确定的Yamamoto评估的参数来选择的，并且不断变化直到无法再实现进一步的改进。
根据实施例，在下一步中，执行色谱图曲线拟合。该步骤可以例如在来自GoSilico的ChromX中执行。应用了集总速率传输分散性模型，例如利用30个小区的线性SUPG空间离散化。使用IDAS函数将初始时间步长设定为0.2s。对于全局优化，使用了具有软件标准值的ASA算法。对于确定性优化，使用了IOPT算法。分数数据以通过系统测量的绝对UV信号的百分比形式被导入。通过将盐实验数据和模拟数据相关联，确认了实验数据和模拟数据的时间对应关系。可以根据先前的结果选择参数估计的极限，并且在优化函数计算值接近边界时对该参数估计的极限进行调适。使用软件的估计功能确定了模型参数。使用具有相应汇集标准的优化函数考虑了汇集物分析测量值。通过在不同长度的柱之前添加连续搅拌釜反应器考虑了不同的/>系统对分散的影响。在种群大小为1000的情况下使用采样函数执行了拉丁超立方体采样。所有计算也可以在其他软件包(例如CADET)中执行。
在其他情况下，特定于模型的蛋白质参数可以直接从文献中获得，并且存储在例如色谱模拟软件的配置文件中。
在向色谱模拟软件提供所有输入参数(例如经由GUI和/或经由配置文件或经由另外的数据源)之后，色谱模拟软件在步骤108中计算适于从色谱柱洗脱第一靶蛋白质的洗脱缓冲液盐浓度。
特别地，根据本发明的实施例，洗脱缓冲液盐浓度的计算可以包括：根据多种候选洗脱缓冲液盐浓度中的每种洗脱缓冲液盐浓度来计算该一种或多种靶蛋白质的量和/或纯度，输出针对候选洗脱盐浓度中的每种洗脱盐浓度所计算的该一种或多种靶蛋白质的与相应的候选洗脱盐浓度相关联的量和/或纯度，以及从用户或从软件功能接收对候选洗脱盐浓度中在该一种或多种靶蛋白质的量和/或纯度与步骤106中输入的该一种或多种靶蛋白质的期望的量和/或纯度最匹配时的一种洗脱盐浓度的选择。
色谱模拟软件被配置为根据参数值的集合来计算盐浓度，该参数值的集合包括至少：洗脱缓冲液的预定义的pH值；所提供的阳离子交换色谱柱的尺寸；所施加的蛋白质(P1至P6)的输入量；以及所施加的蛋白质溶液中的蛋白质的化学性质。如上所述，这些参数值可以经由GUI和/或经由配置文件或经由其他数据源来提供。
在计算出(最)适用于获得包含呈期望的绝对量或相对量和/或纯度的第一靶蛋白质和/或第二靶蛋白质的洗脱目标体积的洗脱盐浓度之后，色谱模拟软件在步骤110中根据至少计算出的盐浓度和输入的第一靶蛋白质的期望量来计算包括呈期望的量和/或呈期望的纯度的两种一种或更多种靶蛋白质的目标洗脱体积的汇集边界。优选地，当基于针对许多不同的候选洗脱盐浓度获得的蛋白质的量和纯度来计算最适合的洗脱盐浓度时并且/或者当基于在步骤108中获得的洗脱盐浓度来计算目标洗脱体积时，色谱模拟程序使用一种或多种色谱模型。
接下来在步骤112中，自动化或半自动化的色谱系统中所包含的泵施加洗脱缓冲液，该洗脱缓冲液的pH值与已被输入到色谱模拟软件中的pH值相同，并且该洗脱缓冲液的盐浓度与在步骤108中计算出的盐浓度相同。
根据一个实例，根据计算出的盐浓度来制备“洗脱缓冲液A”，其中该缓冲液由0.04mol/L乙酸钠组成。
根据另一个实例，根据计算出的盐浓度来制备“洗脱缓冲液B”，其中该缓冲液由1mol/L乙酸钠溶液组成。可以例如用30％乙酸(Merck Chemicals GmbH)和乙酸钠*3H20(Merck Chemicals GmbH)制备缓冲液，得到5.30和5.70的pH值。
在步骤114中通过以下方式来执行色谱：在柱上连续施加洗脱缓冲液，并且以色谱模拟软件用于预测汇集边界的速率泵送洗脱缓冲液通过柱。通常，在达到起始汇集边界之前需要施加的洗脱缓冲液的体积是色谱柱体积的许多倍。
然后在步骤116中，人类用户或者自动化或半自动化的色谱系统使用在步骤110中计算出的汇集边界收集计算出的目标洗脱体积作为单独的级分。例如，可以将保持空容器的机械臂配置为：在柱的出口下方移动该容器，使得在计算出的目标洗脱体积的开始汇集边界处该容器开始收集离开柱的洗脱液；并且将该容器从该出口移除，使得当到达停止汇集边界时停止收集洗脱液。被收集在容器中的洗脱液是包含呈期望的量和/或纯度的该一种或多种靶蛋白质的目标洗脱体积。
根据一些实施例，在蛋白质溶液被实际施加在柱上之前执行步骤104至110。在这种情况下，可以执行一个或多个任选步骤。例如，在蛋白质溶液被实际施加在样品上之前，可以用待在步骤112中使用的洗脱缓冲液来平衡柱230，直到pH和电导率读数稳定。例如，在施加实际的蛋白质溶液之前，柱的平衡可能需要被施加用于平衡目的的3至5个柱体积的洗脱缓冲液。
图2示出了色谱系统，该色谱系统包括具有色谱模拟软件204的计算机系统200以及阳离子色谱柱230。在图2所描绘的实施例中，色谱系统用于选择性地获得第一靶蛋白质P1和第二靶蛋白质P2。靶蛋白质被包含在蛋白质溶液202中，该蛋白质溶液包含附加的蛋白质P3至P6，这些附加的蛋白质在该图所示的应用场景中为非靶蛋白质。在将蛋白质溶液施加在柱上之前，确定蛋白质溶液202中蛋白质P1至P6中的每种蛋白质的浓度。此外，各种蛋白质P1至P6的几个化学性质从文献中得出或通过实验确定。
色谱模拟程序204包含GUI 202，其使得用户能够例如经由输入字段214指定期望的优化标准，例如第一靶蛋白质P1和第二靶蛋白质P2的量和/或期望的纯度，或者该量和该纯度的导数值。此外，GUI包含一个或多个附加数据输入字段215、216，使得用户能够指定蛋白质溶液202中所含有的蛋白质P2至P6中的每种蛋白质的性质和量，能够指定柱230的尺寸和附加的参数值，诸如洗脱缓冲液的pH、蛋白质P1至P6中的每种蛋白质的一些化学性质、待用于模拟色谱的预测性模型的类型等。
色谱模拟软件可以包含被配置用于对色谱过程的一个或多个方面进行建模的多个预测性模型206至210。由模拟软件204或由色谱模拟模型206至210使用的参数中的一些参数可以在配置文件220中被指定。
色谱模拟软件204被配置为预测最适用于以期望的量和/或纯度获得目标洗脱体积内的靶蛋白质P1、P2的洗脱缓冲液盐浓度222。例如，模拟软件204可以被配置为对于多种不同的候选洗脱缓冲液盐浓度中的每种洗脱缓冲液盐浓度模拟蛋白质溶液中所含有的蛋白质中的每种蛋白质的预期洗脱图，该预期洗脱图隐含地提供在整个洗脱过程期间蛋白质中的每种蛋白质的量和纯度曲线。该模拟可以基于分别描述色谱过程的不同方面的多个不同模型的组合。基于这些模拟，用户或软件功能可以选择最适用于以期望的量和/或纯度洗脱靶蛋白质P1的候选洗脱缓冲液盐浓度中的一种洗脱缓冲液盐浓度。
根据一个实施例，计算出的洗脱盐浓度222经由GUI 212、218被输出给用户，并且用户创建洗脱缓冲液226，该洗脱缓冲液具有被输入到模拟软件中的pH，并且具有由软件204输出的盐浓度222。此外，GUI可以输出被预测为包含呈期望的量和/或纯度的靶蛋白质的目标洗脱体积的汇集边界224。
洗脱缓冲液226特别适用于将靶蛋白质P1、P2与所有其他蛋白质分离，因为洗脱缓冲液盐浓度是专门针对施加至柱的蛋白质P1至P6中的每种蛋白质的量而计算的。因此，洗脱缓冲液不是“标准”/“万能”洗脱缓冲液，而是专门适于蛋白质溶液中所含有的蛋白质的类型和量的洗脱缓冲液。本申请人已观察到，将洗脱盐浓度调适为适于在每种个别情况下被施加至柱的蛋白质的性质和量(这又可以取决于细胞培养物提取和预纯化程序的各个方面)可以大大提高色谱柱232分离不同的蛋白质的能力。
用户首先在柱230上施加蛋白质溶液202，然后施加洗脱缓冲液226。洗脱缓冲液226和蛋白质溶液202渗透通过柱230。因此，不同的蛋白质P1至P6的分子根据它们的化学性质与柱230的固定相228相互作用。蛋白质分子与固定相以及与洗脱缓冲液的相互作用决定了它们的洗脱图，即，在给定时间离开柱的相应蛋白质的量。通过改变用于收集离开柱的出口238的洗脱液的容器232、234、236，可以获得洗脱液的不同级分238、240。根据优选的实施例，容器的交换是这样的坐标，使得被预测为包含呈期望的量和/或纯度的靶蛋白质的目标洗脱体积被收集在同一容器内。这意味着，预测的目标洗脱体积的汇集边界决定了将收集物放置在柱出口下方和从柱出口下方移除的时间。
蛋白质溶液的体积远小于所施加的洗脱缓冲液的体积，因而在许多色谱模拟模型中被忽略。
在一些实施例中，洗脱缓冲液226实际上是一系列具有相同pH值但具有不同盐浓度的两种或更多种不同的洗脱缓冲液。这些不同的洗脱缓冲液也被称为“洗脱步骤”。例如，色谱模拟软件可以被配置为针对不同的洗脱步骤计算最合适的盐浓度。
图3描绘了进一步的色谱系统。图3中描绘的色谱系统可以与图2中描绘的色谱系统相同，其中软件204不是用于获得呈期望量的单一靶蛋白质，而是用于获得呈期望比率的两种靶蛋白质P1、P2。
图3中描绘的系统的部件和特征基本上对应于图2中描绘的系统的部件和特征。因此将不再重复在图2的描述中关于这些特征所提供的解释。
与图2中描绘的GUI相比，由模拟软件204生成并在图3中描绘的GUI 212使得用户能够经由数据输入字段304指定两种靶蛋白质P1、P2的期望的相对量。任选地，用户可以为靶蛋白质P1、P2中的每种靶蛋白质指定所需的最低纯度水平。最适用于提供包含呈期望的比率以及任选地呈期望的纯度的两种靶蛋白质的目标洗脱体积的洗脱缓冲液盐浓度222的计算包括：模拟基于多种不同的候选洗脱缓冲液盐浓度的多个色谱过程；确定目标洗脱体积中该两种靶蛋白质的相对量以及任选地还有该两种靶蛋白质的纯度；并且输出最适用于提供包含呈期望的相对量和纯度的P1和P2的目标洗脱体积的候选洗脱缓冲液盐浓度中的一种洗脱缓冲液盐浓度。每个模拟可以包括：基于给定的候选洗脱缓冲液盐浓度来预测蛋白质P1至P6中的每种蛋白质的洗脱图，然后分析蛋白质P1至P6中的每种蛋白质的洗脱图以确定目标洗脱体积的汇集边界，该目标洗脱体积的蛋白质含量满足用户定义的关于靶蛋白质的相对量和纯度的要求。
图4A描绘了GUI 400，其使得用户能够针对色谱过程的不同方面选择多个不同的色谱过程模拟模型。图4B示出了由相应的模型模拟的色谱过程的各个方面。
例如，GUI使得用户能够从多个替代性柱模型中选择“传输分散性”模型。如本文所用，“柱模型”是描述柱间隙体积中的洗脱缓冲液中的蛋白质中的每种蛋白质的浓度、盐浓度和pH值的相互关联的模型。
GUI 400进一步使得用户能够从多个替代性孔隙模型中选择模型“LumpedRate”。如本文所用，“孔隙模型”描述了柱的固定相228的孔隙体积中的洗脱缓冲液中的蛋白质中的每种蛋白质的浓度、盐浓度和pH值的相互关联。
GUI 400进一步使得用户能够从多个替代性反应模型(也被称为“等温线模型”)中选择模型“IEC 2015”。如本文所用，“反应模型”描述固定相228中每种蛋白质的浓度、洗脱缓冲液盐浓度和蛋白质溶液中每种蛋白质的至少一些化学性质的相互关联。
不同的模型可以从文献中得出并且/或者可以基于通过实验确定的特定于蛋白质的模型参数。
图4C更详细地示出了根据本发明的一个实施例的可以经由GUI 400选择的模型类型中的每个模型类型背后的数学概念。然而，替代性模型已被公布，并且未来可能对图4B中描绘的模型中的至少一些模型进行调适和改进。因此，本发明不限于本文出于说明目的描述的任何特定的模型或数学公式。
图4D描绘了图形用户界面402，该图形用户界面由色谱模拟软件204生成，并且使得用户能够指定色谱柱230和该色谱柱中所含有的固定相228的细节。例如，用户可以指定柱230的长度和体积以及固定相228的间隙柱孔隙度、轴向分散、珠半径和珠孔隙度。由色谱模拟软件204生成的进一步的图形用户界面404使得用户能够指定特定于模型的化学性质，例如固定相的离子容量(其对应于配体密度)，羧基基团、组氨酸基团、氨基基团等的酸解离常数。GUI的数据输入字段可以取决于用户经由GUI 400选择的模型的类型。
图4E描绘了GUI 406，其使得用户能够指定洗脱缓冲液的盐的类型、洗脱缓冲液的pH值、蛋白质溶液中所包含的蛋白质的数量和类型以及一种或多种特定于蛋白质的期望的绝对量或相对量、期望的纯度水平和特定于模型或与模型无关的化学性质值。
图5A是洗脱图表500，示出了被施加在柱上的蛋白质溶液中所包含的多种蛋白质P1、P2和P3的模拟的洗脱图。蛋白质P1、P2和P3可以是例如参考图7A至图7D更详细描述的蛋白质P1、P2和P3。
提供蛋白质P1作为靶蛋白质，并且用户已指定应当以预定义的浓度和预定义的纯度获得P1。其他蛋白质P2和P3为非靶蛋白质。这意味着，P2和P3被视为不期望有的污染物，其浓度应当尽可能低以确保P1的纯度足够高。
图表500包含曲线502，该曲线指示在提供图表500的模拟中所使用的候选洗脱盐浓度。从图表中可以得出，候选洗脱缓冲液实际上是一系列具有不同盐浓度的多种不同的候选洗脱缓冲液(“洗脱步骤”)。一旦洗脱缓冲液盐浓度升高至0.35mol/l以上，靶蛋白质P1以及非靶蛋白质P2就开始从柱上脱离并且可在洗脱液中被观察到。这可以从蛋白质P1的相应洗脱图508和蛋白质P2的相应洗脱图506中得出。一旦盐浓度升高至0.9mol/l以上，则如可从洗脱图504中得出的，P3也会被洗脱。
色谱模拟软件被配置为模拟(预测)相应步骤中每种候选洗脱盐浓度的洗脱图504至508并用于确定包含洗脱体积的汇集边界，该洗脱体积的蛋白质含量满足用户定义的关于靶蛋白质的量和纯度的要求。所确定的汇集边界由虚线512、514指示。该两条线定义了包含蛋白质P1的峰的目标洗脱体积。该目标洗脱体积还包含一定量的蛋白质P2。然而，通过在汇集边界514处停止收集洗脱液，可以确保目标洗脱体积中P1的纯度满足用户定义的纯度要求，因为在该点之后，相对量递增的非靶蛋白质P2将被包含在目标洗脱体积中。
参考针对单种靶蛋白P1的优化标准描述了图5A中描绘的图表。然而，在其他用例场景中，蛋白质P2也可以被视为靶蛋白质(参见例如图6A)，并且优化标准可以是与两种靶蛋白质P1、P2的量和/或纯度相关的标准，而只有P3被视为污染物。在这种情况下，汇集边界将被调适为适于新的优化标准。
图5B描绘了在给定多种不同的候选洗脱盐浓度的情况下第一蛋白质溶液中靶蛋白质P1的收率和纯度以及组合的纯度-收率-目标参数的预测结果。“纯度”指示在给定候选盐浓度的情况下目标洗脱体积中P1的预测的纯度。“收率”指示在给定候选盐浓度的情况下目标洗脱体积中靶蛋白质P1的预测的量。“目标”是从P1的预测的量和纯度的组合得出的总值。例如，图5B中描绘的“目标”是“复合目标”，计算如下：
Single Objective SO＝F*(Objective)Power+A，其中F(“因数”)为数值，POWER为数值，并且A(“加数”)也是数值。
可以通过经由乘法或加法组合单个的目标来生成复合目标。
例如，可以选择以下参数：POWER＝1,F＝1并且A＝0。然而，这些参数中的每个参数也可以具有不同的值。
在迭代10中针对洗脱缓冲液盐浓度0.342544计算出的目标SO1是目标洗脱体积中蛋白质P1的预测的纯度，其中洗脱汇集物体积开始于135mL并结束于147mL。预测的纯度SO1具有的值为0.751832。目标SO2是在迭代10中针对洗脱缓冲液盐浓度0.342544计算出的蛋白质P1的收率。预测的收率SO2具有的值为0.836734。
复合目标CO1可以通过汇总SO1和SO2来计算，例如计算SO1+SO2。根据另一个实例，复合目标CO2被计算为SO1*SO2。
结果以表510的形式呈现。该表的第一列(“迭代”)包含用作相应色谱模拟的基础的候选洗脱缓冲液盐浓度或候选洗脱缓冲液盐浓度集合(用于多个步骤)的标识符。另一列(“盐浓度”)指示待在特定的洗脱步骤中使用的候选洗脱缓冲液盐浓度。另一列(“纯度蛋白质1”)指示针对给定的候选洗脱缓冲液盐浓度所预测的纯度值。另一列(“收率蛋白质1”)指示针对给定的候选洗脱缓冲液盐浓度所预测的蛋白质P1的量(例如浓度)。另一列(“目标”)指示待优化(此处为：最小化)的并且根据靶蛋白质P1的预测的纯度和预测的收率计算的目标。
表510中的每一行对应于一种候选洗脱缓冲液盐浓度和相应的预测。表510中的行根据目标值排序，并且具有最佳(此处为：最小)目标且因而具有最高纯度和收率的行作为表中的第一行出现。在该图所描绘的实例中，“纯度”或“收率”的数值尽可能低意味着纯度或收率尽可能高。这意味着“迭代”次数为23的模拟的候选洗脱缓冲液盐浓度0.345被视为给定蛋白质溶液的最佳盐浓度。因此，选择实际待用于“真实”洗脱的洗脱缓冲液，使得其具有的盐浓度为0.345。还有这样的一些模拟，其中单个值更高，例如迭代10。此处纯度高于迭代23中的纯度，但收率较低。纯度与收率之间的最佳折衷(帕累托原理)是迭代23。
图5C描绘了图表518，该图表带有在给定多种不同的候选洗脱盐浓度的情况下第一蛋白质溶液中靶蛋白质的组合的纯度/收率-目标参数的预测的结果。曲线520代表参考图5B描述的纯度/收率得出的目标。因此，图5C的图表518以曲线而非表格510的列的形式示出了基于多种不同的候选洗脱缓冲液盐浓度和相应模拟获得的纯度-收率目标。数据点516指示该目标的最小值是在迭代23处获得的，并且用于该特定模拟#23的候选洗脱缓冲液盐浓度应用作用于获得目标洗脱体积的实际洗脱缓冲液盐浓度。与图表5A中由汇集边界512、514界定的洗脱目标体积相对应的洗脱缓冲液步骤的洗脱缓冲液盐浓度对应于带有编号#23的模拟中所预测的最佳盐浓度。
图6A是针对第二蛋白质溶液所获得的洗脱图表600。第二蛋白质溶液还包含三种蛋白质P1、P2和P3。蛋白质P1、P2和P3可以是例如参考图7A至图7D更详细描述的蛋白质P1、P2和P3。
与图5A中描述的情况相比，蛋白质P1和P2两者都被视为靶蛋白质。用户经由图形用户界面指定他或她有兴趣以55:45的比率获得蛋白质P1和P2。另外，获得的目标洗脱体积应尽可能纯，这意味着目标洗脱体积应包含尽可能少的P3和任何其他蛋白质。
蛋白质P1的模拟的洗脱图被描绘为曲线608，蛋白质P2的模拟的洗脱图被描绘为曲线606，蛋白质P3的模拟的洗脱图被描绘为曲线604，并且洗脱缓冲液盐浓度步骤被描绘为曲线602。针对多种不同的候选洗脱缓冲液浓度中的每种洗脱缓冲液浓度对两种靶蛋白质P1和P2的量和纯度以及量和纯度得出的目标的模拟揭示了多个步骤中的每个步骤的最佳洗脱缓冲液盐浓度，并且揭示了定义包含呈期望的相对量的第一靶蛋白质P1和第二靶蛋白质P2的目标洗脱体积并且满足指定的纯度要求的汇集边界612、614。另外，图表600包含模拟的总和信号610，该信号指示可用于将预测的蛋白质峰与在洗脱过程期间根据经验获得的总蛋白质峰进行比较的蛋白质总量。
图6B描绘了在给定多种不同的候选洗脱盐浓度的情况下第二蛋白质溶液中靶蛋白质P1和P2的收率和纯度以及组合的纯度-收率-目标参数的预测结果。“纯度”指示针对候选洗脱缓冲液盐浓度中的每种洗脱缓冲液盐浓度所预测的目标洗脱体积中相应靶蛋白质P1、P2的纯度。
结果以表617的形式呈现。该表的第一列(“迭代”)包含用作相应色谱模拟的基础的候选洗脱缓冲液盐浓度或候选洗脱缓冲液盐浓度集合(用于多个步骤)的标识符。另一列(“盐浓度”)指示待在特定的洗脱步骤中使用的候选洗脱缓冲液盐浓度。其他列(“纯度蛋白质1”、“纯度蛋白质2”)指示对于给定的候选洗脱缓冲液盐浓度针对蛋白质P1、P2中的每中蛋白质预测的纯度值。另一列(“目标”)指示待优化(此处为：最小化)的并且根据靶蛋白质P1和P2的预测的纯度和预测的相对量计算的目标。
“目标”(也被称为“复合目标”)可以是例如从P1和P2的预测的相对量以及P1和P2的期望的纯度水平的组合得出的总值。例如，“目标”CO可以通过将两个单一目标SO1、SO2相加或相乘而从该两个单一目标计算得出。例如，CO可以被计算为CO＝SO1+SO2或CO＝SO1*SO2。
因此，SO1是针对给定的候选洗脱缓冲液盐浓度所预测的目标洗脱体积中P1的纯度，例如1:0.55，由此已预测洗脱目标体积开始于112mL并结束于127mL。SO2为2:0.45是洗脱目标体积中的期望的P2纯度，因此已预测洗脱目标体积开始于112mL并结束于127mL。
任选地，计算出的目标CO与目标值之间的误差可以使用“参考比较”成本函数来计算，该函数计算目标与目标值之间的逐点平方偏差。
表617中的每一行对应于一种候选洗脱缓冲液盐浓度和相应的预测。表617中的行根据目标值进行排序，并且具有最佳(此处为：最小)目标且因而具有最高纯度和最匹配的P1:P2比率的行作为表中的第一行出现。“目标”参数的值尽可能小意味着单一目标与对应的目标值之间的差尽可能小。这意味着“迭代”次数为35的模拟的候选洗脱缓冲液盐浓度0.388被视为给定蛋白质溶液的最佳盐浓度。因此，选择实际待用于“真实”洗脱的洗脱缓冲液，使得其具有的盐浓度为0.388。
图6C描绘了图表618，该图表带有在给定多种不同的候选洗脱盐浓度的情况下第一蛋白质溶液中靶蛋白质的组合的纯度/收率-目标参数的预测的结果。曲线620代表参考图6B描述的纯度/收率得出的目标。因此，图6C的图表618以曲线而非表格617的列的形式示出了基于多种不同的候选洗脱缓冲液盐浓度和相应模拟获得的纯度-收率目标。数据点616指示该目标的最小值在迭代35处获得，并且用于该特定模拟#35的候选洗脱缓冲液盐浓度应当用作实际洗脱缓冲液盐浓度。与图表6A中由汇集边界612、614界定的洗脱目标体积相对应的洗脱缓冲液步骤的洗脱缓冲液盐浓度对应于带有编号#35的模拟中所预测的最佳盐浓度。
图6D描绘了针对第二蛋白质溶液获得的P1和P2的预测的和测量的蛋白质比率的比较。基于模拟#35中所使用的0.388mol/升的候选洗脱缓冲液浓度，由汇集边界612、614界定的目标洗脱体积中的蛋白质P1的预测的浓度预测为51％。当利用盐浓度为0.388mol/升的洗脱缓冲液执行洗脱时，目标洗脱体积中P1的根据经验测量的浓度为56％。同样，目标洗脱体积中蛋白质P2的预测的浓度为49％。目标洗脱体积中P2的根据经验测量的浓度为44％。因此，由预测的汇集边界定义的目标洗脱体积中的预测的浓度的准确性非常高。
图6E描绘了根据经验获得的蛋白质P1、P2和P3的分辨率。图表624示出了由相应蛋白质P1、P2、P3的洗脱引起的光学峰626、628、630。从图表中可以看出，P1和P2的峰强烈重叠。观察到两种蛋白质P1、P2在45g/升的蛋白质负载下在40柱体积的梯度中的分辨率R为约0.43，即非常低。即使在这些蛋白质具有低分辨率值并且无需首先分离两种蛋白质然后以期望的比率重新组合蛋白质的情况下，本发明的实施例也可用于获得呈期望的比率的两种或更多种蛋白质。
图7描绘了两种靶蛋白质P1、P2和另一种被视为不期望有的污染物的蛋白质P3的实例。
图7A示出了蛋白质700“bsGant”的图示，其由与本文中被称为“Gant”的抗体连接的被称为“BSM”的脑穿梭分子组成。脑穿梭分子是一种能够增进大分子(诸如抗体)渗透到大脑中的分子。大分子进入大脑受到血脑屏障(BBB)的限制，血脑屏障是血液与脑组织之间的看门者，可仔细过滤哪些分子可以进入大脑。本申请人工程设计的一些抗体能够通过与位于血脑屏障表面的蛋白质受体之一结合而穿过血脑屏障。脑穿梭分子可以潜在地将一种或多种治疗分子输送到大脑中，而不管它们穿过血脑屏障的内在能力如何。bsGant蛋白在国际专利申请WO 2017/055540中有详细描述，该国际专利申请通过引用其整体并入本文。
“bsGant”抗体是单体免疫球蛋白G(IgG)Fc融合蛋白。用于生产“bsGant”抗体的细胞培养物以三种不同的变体形式生产这种抗体，这些变体的Fab糖基化程度不同。Fab糖基化是不完全的，引致非糖基化抗体、单糖基化抗体和双糖基化抗体的混合物。
根据实施例，该一种或多种靶蛋白质是单体bsGant蛋白的不同糖型(如上定义)。
根据一个实例，一种或多种靶蛋白质是专利申请WO 2017/055540中描述的bsGant“抗体0015”的不同糖型。该抗体是双特异性抗体，其包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:01的轻链、具有氨基酸序列SEQ ID NO:02的重链、具有氨基酸序列SEQ ID NO:03的轻链以及WO2017/055540中所公开的包含SEQ ID NO:04的氨基酸序列的抗体Fab片段。SEQ ID NO:01涉及与N端fab的非结构域交换轻链相对应的215个aa残基多肽，SEQ ID NO:02是与两条重链相对应的455个aa残基多肽，SEQ ID NO:03是与附加C端fab片段的结构域交换的轻链fab片段相对应的215个aa残基多肽，并且SEQ ID NO:04是与附加C端fab片段的结构域交换的重链fab片段相对应的229个aa残基片段。
图7B示出了二糖基化的抗体变体，在本文中也被称为“蛋白质P1”。
图7C示出了单糖基化的抗体变体，在本文中也被称为“蛋白质P2”。
图7D示出了非糖基化的抗体变体，在本文中也被称为“蛋白质P3”。
这三种变体的紧密洗脱条件对用于分离和/或进一步纯化期望的抗体变体的色谱方案提出了特殊挑战。
抗体的Fc区中的糖基化模式的差异会引致构象、药代动力学以及结合特征方面的差异。Fab区的糖基化可影响配体结合强度和组织渗透。因此，对于医学领域中所使用的多种抗体，糖基化模式是尤其令人感兴趣的。糖基化模式可以取决于表达载体、细胞系、细胞培养模式以及细胞培养条件、纯化过程和其他因素。由于糖基化变体在电荷方面可能仅略有不同，因此可以使用离子交换树脂进行分离，但必须优化洗脱条件。
本申请人已观察到，施加在色谱柱上的蛋白质负载密度是影响产物汇集物组成的另一个关键工艺参数。本发明的实施例可以允许获得期望比率的抗体变体，例如P1:P2的比率为55:45，这在药学上特别有效。
分离包含三种蛋白质P1、P2和P3的蛋白质溶液的挑战在于产物汇集物(“目标洗脱体积”)应当包含约55％:45％的P1与P2的比率。由于蛋白质溶液含有超过50％的P2(见表1)，因此这种相对量标准限制了这种分离的收率。在这种情况下，蛋白质P3是一种特定于产物的杂质，即没有糖基化的蛋白质700蛋白质。
本申请人已观察到，待被施加在柱上的蛋白质溶液中蛋白质P1、P2和P3的相对量和绝对量可能因情况而大为不同，并且这可能会带来进一步的挑战，因为对于特定的蛋白质制剂表现良好的色谱方案可能无法分离这三种蛋白质变体的不同制剂上的蛋白质。
例如，选择性地包含三种蛋白质P1、P2和P3的蛋白质溶液可以通过收获经遗传工程改造以产生三种糖基化变体中的蛋白质700的细胞培养物来获得。所有糖型都被捕获在蛋白质A树脂上，该树脂在加载之前已被平衡。粗蛋白质提取物的负载密度为每升树脂23g蛋白质。抗体被洗脱，并且在病毒灭活步骤之后，洗脱液的pH再次升高，溶液在4℃下温育过夜并通过0.2μm无菌过滤器过滤。经过滤的蛋白A洗脱液用作混合模式色谱树脂的负载材料。为了去除蛋白质杂质，使用了混合模式的色谱树脂。加载之前已平衡柱。负载密度为每升树脂25g蛋白质，并且流速为每小时150cm。之后，流通洗脱液的pH降低，并且通过0.2μm无菌过滤器过滤汇集物。
该方法对六种不同的细胞培养物提取物重复多次，并且将分别获得的待施加在阳离子柱上的蛋白质溶液汇总在下面的“表1”中：
为了分离单一的糖基化变体，PorosXS汇集物用水稀释并且在高蛋白质负载密度下使用PorosXS树脂以结合和洗脱模式被重新处理。该柱用376mM乙酸钠pH 5.5平衡，并且负载密度为80g每升树脂。将流过的流分馏并进行分析。流过开始时的级分包含纯度为98.0％的变体1(蛋白质溶液4)。为了洗脱变体2和3，在6.25CV中使用了从376mM乙酸钠pH5.5到616mM乙酸钠pH 5.5的梯度。洗脱峰含有纯度为97.6％的变体2(蛋白质溶液5)和纯度为96.5％的变体3(蛋白质溶液6)。
通过将100μg样品注射在分析阳离子交换色谱柱(Mono S 5/50GL,GEHealthcare)上在pH 5.3下以1ml/min流速度利用盐梯度洗脱执行糖基化变体分析。先前的峰识别是通过质谱法完成的。
模型206至210的各种模型参数的机械建模所需的系统和树脂参数利用不同的示踪剂通过脉冲实验来确定，如A.Osberghaus,S.Hepbildikler,S.Nath,M.Haindl,E.vonLieres,J.Hubbuch,Determination of parameters for the steric mass actionmodel--a comparison between two approaches,Journal of Chromatography A,1233(2012)54-65中所描述的。执行了大小为1000的拉丁超立方体采样，以研究工艺参数(pH值、负载组成、洗脱步骤的盐浓度)对洗脱汇集物中的杂质谱的影响。对于不同的负载密度，注射体积发生了变化。使用ChromX以300cm/h的流速以5秒时间步长、30个轴向小区、5cm柱长度执行了模拟。对于每个计算机模拟实验，使用具有固定体积的汇集决策计算了洗脱汇集物中各种蛋白质的杂质谱和洗脱图。在MATLAB中使用线性回归分析以杂质汇集物浓度为因变量并且以工艺参数为自变量分析了结果。
图8A示出了说明蛋白质负载对洗脱目标体积中的相对蛋白质组成的影响的图表802。假设洗脱缓冲液盐浓度为40％，不同的蛋白质负载下洗脱液中蛋白质P1的相对量示出在曲线802中。洗脱液中蛋白质P2的相对量示出在曲线804中。
图8B示出了说明洗脱缓冲液盐浓度对洗脱目标体积中的相对蛋白质组成的影响的图表808。假设施加在柱上的总蛋白质负载为45g/L，不同盐浓度下洗脱液中蛋白质P1的相对量示出在曲线810中。洗脱液中蛋白质P2的相对量示出在曲线812中。本发明的实施例允许通过计算识别洗脱缓冲液盐浓度，该洗脱缓冲液盐浓度专门适于加载在柱上的各种蛋白质的量和类型，从而显著提高预测每种蛋白质的洗脱图和收集包含呈期望量和期望纯度的期望蛋白质的目标洗脱体积的能力。
经验测试表明，根据本发明的实施例的色谱方法能够预测期望的汇集物组成，并且因此能够预测对于分子表征和工艺设计空间的定义可能很重要的产品质量。
图9是说明通过调适洗脱缓冲液盐浓度补偿蛋白质负载的影响的图表900。色谱模拟软件用于通过计算预测对于加载在柱上的多种量递增的蛋白质中的每种蛋白质(x轴)而言能够提供以期望的比率55:45包含两种靶蛋白质P1、P2的目标洗脱体积的洗脱缓冲液盐浓度902。如可从图表900中得出的，指示两种靶蛋白质P1、P2的相对量的预测曲线904、906与根据经验测量的相对量910、908基本相同。预测的洗脱盐浓度能够确保无论通过制备细胞培养物蛋白质提取物和预纯化步骤(可能因情况而大为不同)获得的蛋白质的量如何，恒定的期望比率的两种靶蛋白质P1和P2都被包含在目标洗脱体积中。
本申请人已观察到，根据蛋白质负载模拟和选择洗脱缓冲液盐浓度可以显著提高模拟准确性，并且允许识别支持多种类型的靶蛋白质的优化标准的盐浓度。本申请人已观察到，蛋白质负载密度和盐摩尔浓度两者都对蛋白质的洗脱图有很强的影响。通过结合这些知识，盐浓度可以用作专门为各种蛋白质负载密度选择的过程控制参数。根据蛋白质负载密度优化洗脱盐摩尔浓度也允许确保恒定的产品质量。
图10A-C描绘了洗脱缓冲液盐浓度对两种蛋白质P1、P2的洗脱图的影响。
例如，第一模拟可以假设低洗脱缓冲液盐浓度，如图10A所描绘的。洗脱缓冲液无法完全或根据作为优化标准提供的期望的蛋白质比率来分离蛋白质P1和P2。两种蛋白质都在柱清洗(CIP)步骤中被洗脱。在“汇集”阶段中获得的洗脱液基本上不含蛋白质P1和P2。
第二模拟可以基于高洗脱缓冲液盐浓度，如图10B所描绘的。该洗脱缓冲液也不可能完全分离两种蛋白质或提供包含呈期望比率的两种蛋白质的洗脱液。在汇集阶段中获得的洗脱液包含大量的但不是期望比率(假设期望比率不是1:1)的蛋白质P1和P2两者。
第三模拟可以基于中等洗脱缓冲液盐浓度，如图10C所描绘的。这种洗脱缓冲液将两种蛋白质完全分离。汇集阶段中获得的洗脱液包含大量的蛋白质P1并且基本上不含蛋白质P2。
如果P1:P2的期望比率为例如约1:2，则模拟软件可以被配置为基于低于图10B中描绘的浓度但高于图10C中描绘的浓度的几种不同的洗脱缓冲液盐浓度来执行进一步的模拟，以获得蛋白质P1和P2的预测的洗脱图，并且识别提供其P1:P2蛋白质比率最匹配期望比率的汇集的洗脱体积的盐浓度中的一种盐浓度。

Claims (23)

1.一种产生包括第一靶蛋白质和第二靶蛋白质的目标洗脱体积(238)的色谱方法，所述第一靶蛋白质和所述第二靶蛋白质是具有相同氨基酸序列的蛋白质的糖基化变体，所述方法包括：
-提供(100)阳离子交换色谱柱(230)；
-在所述色谱柱上施加(102)蛋白质溶液(202)，所述蛋白质溶液包含至少所述第一靶蛋白质和所述第二靶蛋白质以及任选地一种或多种另外的蛋白质；
-将优化标准输入(106)色谱模拟软件(204)中，所述优化标准是所述目标洗脱体积相对于所述目标洗脱体积中所包含的所述第一靶蛋白质和所述第二靶蛋白质的期望性质；
-通过所述色谱模拟软件计算(108)适于从所述色谱柱洗脱所述第一靶蛋白质和所述第二靶蛋白质的洗脱缓冲液盐浓度(222)，使得能够获得与所述优化标准最佳匹配的目标洗脱体积，所述计算包括根据多个不同的洗脱缓冲液盐浓度来计算多个色谱模拟；
-通过所述色谱模拟软件根据至少计算出的盐浓度和输入的优化标准来计算(110)所述目标洗脱体积的汇集边界；
-在所述色谱柱上施加(112)具有所述计算出的盐浓度的洗脱缓冲液(226)；
-使用施加的洗脱缓冲液执行(114)所述洗脱；并且
-使用计算出的汇集边界收集(116)计算出的目标洗脱体积作为单独的级分，
其中，所述优化标准选自包括以下各项的组：
a)所述目标洗脱体积中所述第一靶蛋白质和所述第二靶蛋白质的量的期望的比率或比率范围；
b)所述目标洗脱体积中所述第一靶蛋白质的期望的量或量范围与所述第二靶蛋白质的期望的量或量范围的组合；
c)所述第一靶蛋白质的期望的纯度或纯度范围与以下各项的组合：
·所述目标洗脱体积中第一蛋白质和第二蛋白质的量的期望的比率；
·所述目标洗脱体积中所述第二靶蛋白质的期望的量或量范围；
·所述目标洗脱体积中所述第二靶蛋白质的期望的纯度或纯度范围；
d)上述标准中的两个或更多个标准的组合。
2.根据权利要求1所述的色谱方法，
其中施加的蛋白质溶液(202)包含所述一种或多种另外的蛋白质。
3.根据权利要求1所述的色谱方法，
-其中根据多个不同的洗脱缓冲液盐浓度来计算多个色谱模拟进一步包括根据所述多个不同的洗脱缓冲液盐浓度和多个不同的洗脱缓冲液pH值来计算所述多个色谱模拟，所述方法进一步包括：
-其中所述计算(108)包括计算洗脱缓冲液盐浓度(222)和洗脱缓冲液pH值的组合，所述洗脱缓冲液盐浓度和所述洗脱缓冲液pH值的组合适于从所述色谱柱洗脱所述第一靶蛋白质和所述第二靶蛋白质，使得能够获得与所述优化标准最佳匹配的目标洗脱体积，其中执行所述色谱模拟以识别所述洗脱缓冲液盐浓度(222)和洗脱缓冲液pH的组合；
-其中根据至少所述洗脱缓冲液盐浓度和所述洗脱缓冲液pH值的计算出的组合以及所述输入的优化标准来计算所述目标洗脱体积的汇集边界；并且
-其中施加在所述柱上的所述洗脱缓冲液(226)具有计算出的盐浓度和计算出的pH值。
4.根据权利要求1所述的方法，所述第一靶蛋白质和所述第二靶蛋白质是具有小于0.75或小于0.5的分辨率因数的蛋白质，其中所述分辨率因数指示两种类型的分子的峰的分离程度。
5.根据权利要求1所述的方法，所述第一靶蛋白质和所述第二靶蛋白质是具有相同氨基酸序列并且在FAB片段上包含不同数量的糖基基团的抗体单体。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述施加的蛋白质溶液包含各自浓度为至少0.5重量％的所述第一靶蛋白质和所述第二靶蛋白质中的每种靶蛋白质和如果存在的所述另外的蛋白质中的每种蛋白质。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述施加的蛋白质溶液包含各自浓度为至少1重量％的所述第一靶蛋白质和所述第二靶蛋白质中的每种靶蛋白质和如果存在的所述另外的蛋白质中的每种蛋白质。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述施加的蛋白质溶液包含各自浓度为至少2重量％的所述第一靶蛋白质和所述第二靶蛋白质中的每种靶蛋白质和如果存在的所述另外的蛋白质中的每种蛋白质。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述施加的蛋白质溶液中所包含的所述第二靶蛋白质和如果存在的所述另外的蛋白质中的一种或多种另外的蛋白质对所述柱的固定相具有的亲和力类似于所述第一靶蛋白质对所述固定相的亲和力，引致重叠洗脱行为。
10.根据权利要求1所述的方法，其中对所述柱施加的所述蛋白质溶液中的蛋白质的总量等于或小于所述柱的最大蛋白质负载容量，并且在所述最大蛋白质负载容量的50％至100％的范围内。
11.根据权利要求1所述的方法，其中对所述柱施加的所述蛋白质溶液中的蛋白质的总量等于或小于所述柱的最大蛋白质负载容量，并且在所述最大蛋白质负载容量的50％至90％的范围内。
12.根据权利要求1所述的方法，其中以收集开始时间偏移和收集停止时间偏移的形式指定所述目标洗脱体积的计算出的汇集边界，所述方法包括：
-由包括所述色谱柱的自动化色谱系统连续监测自所述洗脱开始以来经过的时间；
-当经过的时间等于所述收集开始时间偏移时，由所述色谱系统自动开始收集经洗脱的洗脱缓冲液；并且
-当所述经过的时间等于所述收集停止时间偏移时，由所述色谱系统停止收集所述经洗脱的洗脱缓冲液，
其中所述收集开始时间偏移和收集停止时间偏移分别为从洗脱开始到指示洗脱液中总蛋白质浓度的峰的起始的时间偏移和从洗脱开始到指示洗脱液中总蛋白质浓度的峰的结束的时间偏移。
13.根据权利要求1所述的色谱方法，
-其中所述多个色谱模拟中的每个色谱模拟是使用两个或更多个洗脱步骤的色谱过程的模拟，由此在每个洗脱步骤中，使用具有不同的洗脱盐浓度的洗脱缓冲液，
-其中计算出的洗脱缓冲液盐浓度是一系列不同的、特定于洗脱步骤的洗脱缓冲液盐浓度，并且
-其中在所述色谱柱上施加具有计算出的盐浓度的洗脱缓冲液包括：根据计算出的一系列特定于洗脱步骤的盐浓度逐步施加一系列具有所述不同的盐浓度的洗脱缓冲液。
14.根据权利要求1所述的色谱方法，所述方法包括：
-将所述施加的蛋白质溶液中所包含的所述第一靶蛋白质和所述第二靶蛋白质中的每一者的量，并且任选地还将所述施加的蛋白质溶液中所包含的如果存在的一种或多种另外的蛋白质中的每种蛋白质的量输入(104)色谱模拟软件(204)中；
-所述模拟根据参数值的集合来计算，所述参数值的集合包括至少：
·提供的阳离子交换色谱柱的尺寸；以及
·所述第一靶蛋白质和所述第二靶蛋白质的量，以及任选地还有施加到所述柱上的所述一种或多种另外的蛋白质的量。
15.根据权利要求14所述的色谱方法，参数值的集合进一步包括：
-所述洗脱缓冲液的预定义的pH值，
-所述洗脱缓冲液通过所述柱的流速；
-所述施加的蛋白质溶液的蛋白质的化学性质。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述色谱模拟软件被配置成使用用于计算所述模拟r和/或用于计算所述目标洗脱体积的汇集边界的数学模型的组合，所述模型包括：
-柱模型(206)，所述柱模型被配置成将所述柱(230)的间隙体积中的所述蛋白质中的每种蛋白质的浓度、所述洗脱缓冲液中的盐浓度和pH值相互关联；以及
-孔模型(208)，所述孔模型被配置成将所述柱(230)的固定相的孔体积中的所述蛋白质中的每种蛋白质的浓度、所述洗脱缓冲液中的盐浓度和pH值相互关联；以及
-反应模型(210)，所述反应模型被配置成将所述固定相(228)中所述蛋白质中的每种蛋白质的浓度、所述洗脱缓冲液盐浓度和所述蛋白质溶液中所述蛋白质中的每种蛋白质的化学性质中的至少一些化学性质相互关联。
17.一种色谱控制系统，所述色谱控制系统包括模拟软件，所述模拟软件被配置用于执行获得目标洗脱体积(238)的汇集边界的方法，所述目标洗脱体积包含第一靶蛋白质和第二靶蛋白质，所述第一靶蛋白质和所述第二靶蛋白质是具有相同氨基酸序列的蛋白质的糖基化变体，所述色谱控制系统被配置用于：
-接收(106)优化标准并将所述优化标准输入色谱模拟软件(204)中，所述优化标准是所述目标洗脱体积相对于所述目标洗脱体积中所包含的所述第一靶蛋白质和所述第二靶蛋白质的期望性质；
-使用所述色谱模拟软件计算(108)适于从所述色谱柱洗脱所述第一靶蛋白质和所述第二靶蛋白质的洗脱缓冲液盐浓度(222)，使得能够获得与所述优化标准最佳匹配的目标洗脱体积，所述计算包括根据多个不同的洗脱缓冲液盐浓度来计算多个色谱模拟；
-根据至少计算出的盐浓度和输入的优化标准来计算(110)所述目标洗脱体积的汇集边界；
-输出所述计算出的盐浓度和汇集边界，
其中，所述优化标准选自包括以下各项的组：
a)所述目标洗脱体积中所述第一靶蛋白质和所述第二靶蛋白质的量的期望的比率或比率范围；
b)所述目标洗脱体积中所述第一靶蛋白质的期望的量或量范围与所述第二靶蛋白质的期望的量或量范围的组合；
c)所述第一靶蛋白质的期望的纯度或纯度范围与以下各项的组合：
·所述目标洗脱体积中第一蛋白质和第二蛋白质的量的期望的比率；
·所述目标洗脱体积中所述第二靶蛋白质的期望的量或量范围；
·所述目标洗脱体积中所述第二靶蛋白质的期望的纯度或纯度范围；
d)上述标准中的两个或更多个标准的组合。
18.根据权利要求17所述的色谱控制系统，所述系统进一步被配置用于：
-接收阳离子交换色谱柱(230)的尺寸；
-接收(105)所述第一靶蛋白质和所述第二靶蛋白质的量，并且任选地还接收施加到所述柱上的一种或多种另外的蛋白质的量；
-其中根据参数值的集合来计算所述模拟和/或所述汇集边界，所述参数值的集合包括至少：
·提供的阳离子交换色谱柱的尺寸；以及
·所述第一靶蛋白质和所述第二靶蛋白质的量，以及任选地还有施加到所述柱上的所述一种或多种另外的蛋白质的量。
19.根据权利要求17至18中任一项所述的色谱控制系统，
-其中根据多个不同的洗脱缓冲液盐浓度来计算多个色谱模拟进一步包括根据所述多个不同的洗脱缓冲液盐浓度和多个不同的洗脱缓冲液pH值来计算所述多个色谱模拟，所述方法进一步包括：
-其中所述计算(108)包括计算洗脱缓冲液盐浓度(222)和洗脱缓冲液pH值的组合，所述洗脱缓冲液盐浓度和所述洗脱缓冲液pH值的组合适于从所述色谱柱洗脱所述第一靶蛋白质和所述第二靶蛋白质，使得能够获得与所述优化标准最佳匹配的目标洗脱体积；
-其中所述计算(110)所述目标洗脱体积的汇集边界是根据至少所述洗脱缓冲液盐浓度和所述洗脱缓冲液pH值的计算出的组合以及所述输入的优化标准来计算；并且
-其中在计算出的洗脱缓冲液(226)之外还输出计算出的pH值。
20.根据权利要求19所述的色谱控制系统，其中
所述色谱控制系统被配置成将缓冲液混合单元控制为自动生成具有输出的洗脱盐浓度的洗脱缓冲液；和/或
所述色谱控制系统被配置成将缓冲液混合单元控制为自动生成具有被计算出并被输出的所述盐浓度和所述pH值两者的组合的洗脱缓冲液；和/或
所述色谱控制系统被配置成控制洗脱缓冲液选择单元，所述洗脱缓冲液选择单元适于从具有不同的盐浓度的多种可用洗脱缓冲液中自动选择出一种可用洗脱缓冲液，选择出的洗脱缓冲液具有所述输出的盐浓度；和/或
所述色谱控制系统被配置成控制洗脱缓冲液选择单元，所述洗脱缓冲液选择单元适于从具有不同的盐浓度和不同的pH值的多种可用洗脱缓冲液中自动选择出一种可用洗脱缓冲液，选择出的洗脱缓冲液具有被计算出并被输出的所述盐浓度和pH值两者的组合；和/或
所述色谱控制系统被配置成控制缓冲液施加单元，所述缓冲液施加单元被配置成在所述色谱柱上自动施加自动生成或选择出的洗脱缓冲液，施加的洗脱缓冲液具有所述输出的盐浓度或具有被计算出并被输出的所述盐浓度和pH值两者的组合；
所述色谱控制系统被配置成控制色谱系统的洗脱体积收集单元，使得根据计算出的汇集边界自动收集计算出的目标洗脱体积作为单独的级分。
21.一种色谱系统，所述色谱系统包括根据权利要求20所述的色谱控制系统，并且进一步包括缓冲液混合单元和/或洗脱缓冲液选择单元和/或缓冲液施加单元和/或自动化洗脱体积收集单元。
22.一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，所述计算机程序被配置用于管理色谱过程，使得获得包含第一靶蛋白质和第二靶蛋白质的目标洗脱体积(238)，所述第一靶蛋白质和所述第二靶蛋白质是具有相同氨基酸序列的蛋白质的糖基化变体，所述计算机程序包括色谱模拟软件和可执行指令，所述可执行指令被处理器执行时使所述处理器：
-接收(106)优化标准，所述优化标准是目标洗脱体积相对于所述目标洗脱体积中所包含的第一靶蛋白质和第二靶蛋白质的期望性质；
-使用所述色谱模拟软件计算(108)适于从所述色谱柱洗脱所述第一靶蛋白质和所述第二靶蛋白质的洗脱缓冲液盐浓度(222)，使得能够获得与所述优化标准最佳匹配的目标洗脱体积，所述计算包括根据多个不同的洗脱缓冲液盐浓度来计算多个色谱模拟；
-根据至少计算出的盐浓度和输入的优化标准来计算(110)所述目标洗脱体积的汇集边界；并且
-输出所述计算出的盐浓度和/或所述汇集边界，以使用户能够控制色谱系统，从而获得包含符合所述优化标准的所述第一靶蛋白质和所述第二靶蛋白质的目标洗脱体积，并且/或者使用所述计算出的盐浓度和/或所述汇集边界用于自动或半自动地控制色谱系统，从而获得包含符合所述优化标准的所述第一靶蛋白质和所述第二靶蛋白质的目标洗脱体积，
其中，所述优化标准选自包括以下各项的组：
a)所述目标洗脱体积中所述第一靶蛋白质和所述第二靶蛋白质的量的期望的比率或比率范围；
b)所述目标洗脱体积中所述第一靶蛋白质的期望的量或量范围与所述第二靶蛋白质的期望的量或量范围的组合；
c)所述第一靶蛋白质的期望的纯度或纯度范围与以下各项的组合：
·所述目标洗脱体积中第一蛋白质和第二蛋白质的量的期望的比率；
·所述目标洗脱体积中所述第二靶蛋白质的期望的量或量范围；
·所述目标洗脱体积中所述第二靶蛋白质的期望的纯度或纯度范围；
d)上述标准中的两个或更多个标准的组合。
23.根据权利要求22所述的计算机可读存储介质，所述可执行指令被处理器执行时使所述处理器进一步生成用于自动或半自动地控制色谱系统的一个或多个单元的控制命令。
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