CN101918430A - 非糖基化蛋白质的纯化 - Google Patents

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Abstract

本发明用于纯化已经在原核细胞中重组产生的非糖基化异源多肽的方法，其中所述方法包括三个层析步骤，其中第一个层析步骤选自i)疏水电荷诱导层析，或ii)疏水作用层析，或iii)亲和层析，或iv)离子交换层析，第二个层析步骤选自i)阴离子交换层析，或ii)阳离子交换层析，或iii)羟基磷灰石层析，或iv)疏水作用层析，并且第三个层析步骤选自i)疏水电荷诱导层析，或ii)阴离子交换层析，或iii)阳离子交换层析，或iv)疏水作用层析，其中第一个层析步骤在多肽能够与金属配体相互作用的情况下是亲和层析，第二个层析步骤在多肽具有低于6.0的等电点的情况下不是羟基磷灰石层析，并且第三个层析步骤在多肽具有低或高等电点的情况下以流通模式进行。

Description

非糖基化蛋白质的纯化
发明领域
本发明涉及多肽纯化的领域。报道了利用三个层析步骤的组合纯化非糖基化多肽的一般方法。
发明背景
蛋白质在今天的医药领域中起重要作用。对于人类应用，每一药学物质必须满足不同的标准。为了保证生物药剂对人类的安全性，必须特异性地去除可能引起严重危害的核酸、病毒和宿主细胞蛋白质。为了满足管理规定，制造方法后必须进行一个或更多纯化步骤。其中，纯度、通量和产量在决定适当的纯化方法中起重要作用。
很好地建立了不同方法，并且所述方法广泛用于蛋白质纯化，如使用亲硫配体、Cu-螯合物或微生物蛋白质的亲和层析(例如A蛋白或G蛋白亲和层析)、离子交换层析(例如阳离子交换层析、阴离子交换层析和混合模式层析)、亲硫吸附、疏水相互作用或芳香族吸附层析、大小排阻层析和电泳方法(如凝胶电泳、毛细管电泳)(Vijayalakshmi，M.A.，Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。
例如可通过原核细胞如大肠杆菌(E.coli.)产生重组多肽。重组产生的多肽占原核细胞多肽含量的大多数并且在原核细胞中经常沉积为不可溶的聚集物，即沉积为所谓的包含体。为了分离重组多肽，必须崩解细胞并从细胞碎片中分离所述包含体后将该包含体中所含的重组多肽溶解。对于增溶离液剂，使用如尿素或盐酸胍。尤其是在碱性条件下，为了切割二硫键，加入还原剂，如二硫赤藓糖醇、二硫苏糖醇或β-巯基乙醇。在将聚集的多肽溶解后，必须重新建立生物活性必需的重组多肽的球形结构。在这个所谓的复性过程中，例如通过针对合适的缓冲液进行透析来缓慢降低变性剂的浓度，其允许变性的多肽重新折叠成生物活性结构。复性后是重组多肽纯化到预期使用的可接受纯度。例如，为了用作治疗蛋白，必须建立高于90％的纯度。从大肠杆菌中获得的重组产生的多肽一般伴随有核酸、内毒素、来自生产细胞的多肽和非复性的重组多肽。
在可获得许多不同层析方法的情况下，必须测试许多组合以寻找合适的纯化方法。在这些组合中，可使用不用的顺序，甚至不同数量的层析方法。因此，期望拥有确定层析步骤的合适顺序用以纯化非糖基化的多肽的方法。
在WO 2007/075283中报道了靶分子纯化的多步骤系统和方法。在WO2007/016250中报道了用于纯化包含目的蛋白的化合物的方法。在WO2006/101441中报道了仅包括一个或很少程序步骤的纯化重组蛋白的方法。Rege等(Rege，K.，Biotechnol.Bioeng.93(2006)618-630)报道了用于重组蛋白质纯化的高通量方法开发。在KR 2002/080108中报道了用于从重组大肠杆菌中纯化人生长激素的方法。
发明概述
本发明的第一个方面是用于纯化已经在原核细胞中重组产生的非糖基化异源多肽的方法，其中所述方法包括以下顺序的以下三个层析步骤：
a)选自以下的第一个层析步骤
i)疏水电荷诱导层析，
ii)疏水作用层析，
iii)亲和层析，或
iv)离子交换层析，
b)选自以下的第二个层析步骤
i)阴离子交换层析，
ii)阳离子交换层析，
iii)羟基磷灰石层析，
iv)疏水作用层析，或
v)疏水电荷诱导层析，
c)选自以下的第三个层析步骤
i)疏水电荷诱导层析，
ii)阴离子交换层析，
iii)阳离子交换层析，或
iv)疏水作用层析，
由此，
-在多肽能够与金属配体相互作用的情况下，第一个层析步骤是亲和层析，
-在多肽具有低于6.0的等电点的情况下第二个层析步骤不是羟基磷灰石层析步骤，
-在多肽具有低或高等电点的情况下可以以流通模式进行第三个层析步骤，
-任选地第三个层析步骤可用于多肽的浓缩，
并在步骤c)后获得纯化的非糖基化异源多肽。
本发明的方法包括至少三个层析步骤，由此对于每一步骤，可不依赖于为前述步骤或以下步骤所选的层析材料选择层析材料，由此仅需要考虑所给出的条件。因此，本发明的方法提供了用于纯化非糖基化多肽的灵活的和可交换顺序的层析步骤，由此在非糖基化多肽经历本发明方法后获得的纯度同样独立于所选层析步骤顺序。
在一个实施方案中，原核细胞是大肠杆菌细胞。在另一实施方案中，亲和层析是金属螯合层析。在进一步实施方案中，方法在步骤a)或步骤b)或步骤c)后包括额外的步骤d)：将所述多肽聚乙二醇化。在一个实施方案中，所述步骤a)和b)是阳离子交换层析。又在进一步的实施方案中是选自生长因子激动剂或拮抗剂，或干扰素或干扰素变体的非糖基化异源多肽。
本发明的第二方面是在原核细胞中重组产生非糖基化异源多肽的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)在适合于表达异源多肽的情况下培养包含编码异源多肽的核酸的原核细胞，
b)从培养基或原核细胞中回收异源多肽，
c)利用本发明的方法纯化异源多肽，并由此获得非糖基化异源多肽。
在一个实施方案中，本发明的方法的特征在于至少两个不同顺序的三个层析步骤产生具有相当纯度的纯化的非糖基化异源多肽。在一个实施方案中，可在具有低，即6.0或更低，或高，即8.0或更高等电点的多肽的情况下以流通模式进行第三个层析步骤。
发明详述
一般层析方法及其用途为本领域技术人员所知。参阅例如，Chromatography，第5版，Part A：Fundamentals and Techniques，Heftmann，E.(编辑)，Elsevier Science Publishing Company，New York，(1992)；Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences，Deyl，Z.(编辑)，Elsevier Science BV，Amsterdam，The Netherlands，(1998)；Chromatography Today，Poole，C.F.，和Poole，S.K.，Elsevier Science Publishing Company，New York，(1991)，Scopes，Protein Purification：Principles and Practice(1982)；Sambrook，J.，等(编辑)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989；Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel，F.M.，等(编辑).，John Wiley & Sons，Inc.，New York；或Freitag，R.，Chromatographical processes in the downstream processing of(recombinant)proteins，Meth.Biotechnol.24(2007)421-453(Animal cell biotechnology第2版)。
很好地建立并广泛使用了纯化多肽的方法。可单独或组合使用它们。此类方法例如是使用硫醇配体与络合金属离子(例如Ni(II)-和Cu(II)-亲和材料)或微生物来源蛋白质(例如A蛋白或G蛋白亲和层析)的亲和层析、离子交换层析(例如阳离子交换，羧甲基树脂)、阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合模式交换层析、亲硫吸附(例如β巯基乙醇和其它SH配体)、疏水作用或芳香族吸附层析(例如具有苯基琼脂糖、氮杂-arenophilic树脂或间-氨基苯基硼酸)、大小排阻层析和制备电泳方法(如凝胶电泳、毛细管电泳)(Vijayalakshmi，M.A.，Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。
本申请中所用的术语“缓冲的”表示溶液，其中因添加或释放酸性或碱性物质导致pH的改变被缓冲物质拉平。可使用产生此类效果的任何缓冲物质。优选使用药学上可接受的缓冲物质，例如磷酸或其盐、乙酸或其盐、柠檬酸或其盐、吗啉或其盐、2-(N-吗啉代)甲磺酸或其盐、组氨酸或其盐、甘氨酸或其盐，或三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)或其盐。尤其优选的是磷酸或其盐，或乙酸或其盐，或柠檬酸或其盐，或组氨酸或其盐。任选地，缓冲溶液可包含额外的盐，例如氯化钠、硫酸钠、氯化钾、硫酸钾、柠檬酸钠或柠檬酸钾。
如本申请中所用，术语“膜”表示微孔膜或大孔膜。膜本身由聚合材料例如聚乙烯、聚丙烯、乙烯乙酸乙烯酯共聚物、聚四氟乙烯、聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚酰胺(尼龙，例如ZetaporeTM、N66PosidyneTM)、聚酯、乙酸纤维素、再生纤维素、纤维素复合物、聚砜、聚醚砜、聚芳基砜、聚苯基砜、聚丙烯腈、聚偏1，1-二氟乙烯、非针织和针织织物(例如
Figure BPA00001184046500051
)、纤维材料、或无机材料如zeolithe、SiO2、Al2O3、TiO2或羟基磷灰石。
如本申请中所用，术语“层析材料”一方面表示可在不进一步修饰为层析材料的情况下使用的固体材料，如羟基磷灰石，或亲和层析材料，并还表示包含大核心材料的材料，层析官能团优选通过共价键附着大核心材料。大核心材料理解为不参与层析过程，即待分离多肽与层析材料的层析官能团之间的相互作用。仅提供层析官能团附着的三维框架，并且其保证含有待分离物质的溶液可接近层析官能团。优选地，所述大核心材料是固相。因此，优选地所述“层析材料”是层析官能团优选通过共价键附着的固相。优选地，所述“层析官能团”是可电离疏水基团，或疏水基团，或复杂基团，其中不同层析官能团组合以结合特定类型多肽或共价结合的带电基团。
“固相”表示非流体物质，并包括由如聚合物制成的颗粒包括微粒和珠子)、金属制成的颗粒(顺磁性、铁磁性颗粒)、玻璃和陶瓷；凝胶物质如硅石、矾土和聚合物凝胶；沸石和其它多孔物质。固相可以是静止组分，如填充的层析柱，或可以是非静止组分，如珠子和微粒。此类颗粒包括聚合物颗粒如聚苯乙烯和聚(异丁烯酸甲酯)；金颗粒如金纳米颗粒和金胶体；和陶瓷颗粒如硅石、玻璃和金属氧化物颗粒。参阅例如Martin，C.R.，等，Analytical Chemistry-News & Features，May 1(1998)322A-327A。
在本申请中可互换使用的术语“疏水电荷诱导层析”或“HCIC”表示使用“疏水电荷诱导层析材料”的层析方法。“疏水电荷诱导层析材料”是包含可在一个pH范围内与待分离物质形成疏水键并在其它pH范围内带正电或负电的层析官能团的层析材料，即HCIC使用可电离疏水基团作为层析官能团。一般地，多肽在中性pH条件下结合疏水电荷诱导材料，然后通过pH值的改变产生电荷斥力进行回收。示例性“疏水电荷诱导层析材料”是BioSepra MEP或HEA Hypercel(Pall Corp.，USA)。
在本申请中可互换使用的术语“疏水作用层析”或“HIC”表示其中使用“疏水作用层析材料”的层析方法。“疏水作用层析材料”是其中疏水基团，如丁基、辛基或苯基结合为层析官能团的层析材料。可根据其表面暴露的氨基酸侧链的疏水性分离多肽，所述氨基酸侧链可与疏水作用层析材料的疏水基团相互作用。温度、溶剂和溶剂的离子强度可影响多肽与层析材料之间的相互作用。因为氨基侧链的运动增加并且在较低温度下埋入多肽内部的疏水性氨基酸侧链变得易接近，所以温度升高例如支持多肽与疏水作用层析材料之间的相互作用。对kosmotropic盐促进和离液盐降低的疏水作用也是一样。“疏水作用层析材料”是例如Phenylsepharose CL-4B、6FF、HP、Phenyl Superose、Octylsepharose CL-4B、4FF和Butylsepharose 4FF(均可从Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH，Germany获得)，其可通过缩水甘油醚偶联大批材料获得。
如本申请所用，术语“亲和层析”表示使用“亲和层析材料”的层析方法。在亲和层析中，基于其生物学活性或化学结构(其依赖静电相互作用的形成、疏水键和/或与层析官能团的氢键形成)分离多肽。为了从亲和层析材料中回收特异性结合的多肽，加入竞争配体或改变层析条件，如缓冲液的pH值、极性或离子强度。“亲和层析材料”是包含复杂层析官能团的层析材料，其中复杂层析官能团组合了不同单个层析官能团以结合特定类型多肽。该层析材料根据其层析官能团的特异性特异地结合特定类型的多肽。示例性“亲和层析材料”是“金属螯合层析材料”，如含Ni(II)-NTA或Cu(II)-NTA的材料，用于结合含有六组氨酸标签的融合多肽，或具有许多表面暴露组氨酸、半胱氨酸和/或色氨酸残基的多肽，或“抗体结合层析材料”如A蛋白，或“酶结合层析材料”，如包含酶底物类似物、酶辅因子或酶抑制剂作为层析官能团的层析材料，或“凝集素结合层析材料”，如包含多糖、细胞表面受体、糖蛋白或完整细胞作为层析官能团的层析材料。
如本申请所用，术语“金属螯合层析”表示使用“金属螯合层析材料”的层析方法。金属螯合层析基于结合大批材料作为层析官能团的金属离子，如Cu(II)、Ni(II)或Zn(II)与多肽表面暴露的氨基酸侧链(尤其是含咪唑的侧链和含巯基的侧链)的电子供体基团之间螯合物的形成。螯合物在那些侧链至少部分未被质子化的pH值处形成。通过pH值的改变，即通过质子化作用从层析材料中回收结合的多肽。示例性“金属螯合层析材料”是HiTrap Chelating HP(Amersham Pharmacia Biotec Europe GmbH，Germany)或Fraktogel EMD(EMD Chemicals Inc，USA)。
如本申请所用，术语“离子交换层析”表示使用“离子交换层析材料”的层析方法。术语“离子交换层析材料”根据在“阳离子交换层析”中是否交换阳离子表示“阳离子交换层析材料”或在“阴离子交换层析”中是否交换阴离子表示“阴离子交换层析材料”。如本申请所用，术语“离子交换层析材料”表示携带共价结合带电基团作为层析官能团的固定高分子量固相。对于总的电荷中性，没有共价结合的抗衡离子与其结合。“离子交换层析材料”具有将其非共价结合的抗衡离子交换成周围溶液的类似荷电离子的能力。根据其可交换抗衡离子的电荷，“离子交换层析材料”被称为“阳离子交换层析材料”或“阴离子交换层析材料”。进一步根据荷电基团的性质，例如在具有磺酸基(S)或羧甲基基团(CM)的阳离子交换层析材料的情况下，称为“离子交换层析材料”。根据荷电基团的化学性质，根据共价结合的带电取代基的强度，“离子交换层析材料”还可分类为强或弱离子交换层析材料。例如，强阳离子交换层析材料具有磺酸基团作为层析官能团，并且弱阳离子交换层析材料具有羧酸基团作为层析官能团。例如可从多个公司以名字下获得“阳离子交换层析材料”，如Bio-Rex，Macro-Prep CM(获自Biorad Laboratories，Hercules，CA，USA)、弱阳离子交换剂WCX 2(获自Ciphergen，Fremont，CA，USA)、
Figure BPA00001184046500081
MAC-3(获自Dow化学公司-液体分离，Midland，MI，USA)、Mustang C(获自Pall Corporation，East Hills，NY，USA)、Cellulose CM-23、CM-32、CM-52、hyper-D和partisphere (获自Whatman plc，Brentford，UK)、IRC 76、IRC 747、IRC748，GT 73(获自Tosoh Bioscience GmbH，Stuttgart，Germany)、CM 1500，CM 3000(获自BioChrom Labs，Terre Haute，IN，USA)和CM-SepharoseTM Fast Flow(获自GE Healthcare-Amersham Biosciences Europe GmbH，Freiburg，Germany)。
如本申请所用，术语“羟基磷灰石层析”表示使用特定形式磷酸钙作为层析材料的层析方法。示例性羟基磷灰石层析材料是Bio-Gel HT、Bio-Gel HTP、Macro-Prep Ceramic(获自Biorad Laboratories)、羟基磷灰石Type I、Type II，HA Ultrogel(Sigma Aldrich Chemical Corp.，USA)、羟基磷灰石Fast Flow and High Resolution(Calbiochem)或TSK凝胶HA-1000(Tosoh Haas Corp.，USA)。
“多肽”是自然产生或合成产生的肽键连接的氨基酸残基的聚合物。少于约20个氨基酸残基的多肽称为“肽”。“蛋白质”是包含一条或更多多肽链的分子，其中至少一条包含100个或更多氨基酸残基。多肽和蛋白质还可包含非氨基酸成分，如碳水化合物基团。碳水化合物基团和其它非氨基酸组分可通过产生所述多肽或蛋白质的细胞添加，并且根据细胞类型会发生变化。多肽和蛋白质此处以其氨基酸主链结构定义；一般不明确说明取代基如碳水化合物基团，但其仍然可以存在。
本申请中可互换使用的术语“抗体”和“免疫球蛋白”表示一般包含两条轻链和两条重链的分子。每条重链和轻链包含可变区(一般是链的氨基末端部分)，其含有与抗原相互作用的特异性结合区(CDR，互补决定区)。每条重链和轻链还包含恒定区(一般地，链的羧基末端部分)，其可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的多种细胞、一些吞噬细胞和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。通常，免疫球蛋白的轻链和重链是完整链，每条链基本上由可变区和完整的恒定区组成。一般地，轻链包含轻链可变域、铰链区和轻链恒定域，而重链包含重链可变区、铰链区和由CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和任选地CH4结构域组成的重链恒定域。抗体可以多种形式存在，包括例如Fv、Fab和F(ab)2以及单链(例如Huston，J.S.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(1988)5879-5883；Bird等，Science 242(1988)423-426；和一般地，Hood等，Immunology，Benjamin N.Y.，第2版(1984)以及Hunkapiller和Hood，Nature 323(1986)15-16)。根据重链恒定区的氨基酸序列，将免疫球蛋白分为不同种类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。这些种类中的一些可进一步分为亚类(同种型)，即IgG分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，或IgA分为IgA1和IgA2。根据免疫球蛋白隶属的免疫球蛋白类别，免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)和μ(IgM)。
本发明中使用的术语“结合-和-洗脱模式”及其语法等同物表示层析方法的操作方式，其中使含有目的物质的溶液与固定相，优选固相接触，由此目的物质结合固定相。结果，目的物质停留在固定相上，而非目的物质从流动相或上清液中去除。然后在第二步中从固定相中洗脱目的物质，并由此用洗脱液从固定相中将其回收。这不一定表示去除了100％的非目的物质，而是基本上去除了100％的非目的物质，即去除了至少50％的非目的物质，优选去除了至少75％的非目的物质，优选去除了至少90％的非目的物质，优选去除了高于95％的非目的物质。
如本发明所用，术语“流通模式”及其语法等同物表示层析方法的操作模式，其中使含有目的物质的溶液与固定相，优选固相接触，其中目的物质不结合所述固定相。因此，在流动相或上清液中获得目的物质。溶液中也存在的非目的物质结合固定相并从所述溶液中去除。这并不一定表示100％的非目的物质从溶液中去除，而是基本上100％非目的物质从中去除，即至少50％的非目的物质从所述溶液中去除，优选至少75％的非目的物质从所述溶液中去除，优选至少90％的非目的物质从所述溶液中去除，优选高于95％的非目的物质从所述溶液中去除。
本申请中可互换使用的术语“连续洗脱”和“连续洗脱方法”表示层析方法，其中例如引起洗脱的物质浓度，即结合物质从层析材料上的溶出持续升高或降低，即通过系列小步骤改变浓度，每个改变不大于引起洗脱物质浓度的2％的改变，优选不大于1％。在该“连续洗脱”中，可线性改变，或指数改变，或渐进改变一个或更多条件，例如pH、离子强度、盐浓度和/或层析方法的流量。优选地所述改变是线性的。
本申请中可互换使用的术语“分步洗脱”和“分步洗脱方法”表示层析方法，其中例如引起洗脱的物质浓度，即结合物质从层析材料的溶出一次性升高或降低，即直接从一个值/水平直接升高或降低到另一个值/水平。在该“分步洗脱”中，一个或更多条件，例如pH、离子强度、盐浓度和/或层析方法的流量均可一次性从第一个例如起始值改变到第二个值例如最终值。步骤中的改变大于引起洗脱物质浓度的5％，优选10％的改变。“分步洗脱”与线性改变相反，表示增量(即逐步)改变条件。在“分步洗脱方法”中是在每次增加后收集新的级分。每一增加后，维持条件直至洗脱方法中的下一步。
“分离的多肽”是基本没有污染性细胞组分，如碳水化合物、脂类或与天然与该多肽结合的其它蛋白质杂质的多肽。通常，分离的多肽的制剂含有高度纯化形式，即至少约80％纯，至少约90％纯，至少约95％纯，高于95％纯或高于99％纯的多肽。显示特定蛋白质制剂含有分离多肽的一种方式是通过在蛋白质制剂的十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶的考马斯亮蓝染色后呈现单条带。然而，术语“分离的”并不排除同一多肽以可选物理形式，如二聚体、衍生形式、未正确折叠形式、不正确的二硫键形式或乱序形式存在。
“异源DNA”或“异源多肽”指给定细胞中不天然存在的DNA分子或多肽，或DNA分子群或多肽群。特定细胞异源的DNA分子可含有来自细胞物种的DNA(即内源DNA)，只要细胞的DNA与非细胞的DNA(即外源DNA)组合。例如，认为含有有效连接包含启动子的细胞DNA区段的编码多肽的非细胞DNA区段的DNA分子是异源DNA分子。相反，异源DNA分子可包含与外源启动子有效连接的内源结构基因。由非细胞DNA分子编码的肽或多肽是“异源”肽或多肽。
目前已经惊奇地发现根据本发明方法可进行已经在原核细胞中重组产生的非糖基化多肽的纯化。已经发现仅需要少的确定数目的最多三个层析步骤，并且还发现必须测试仅确定数目的不同层析方法以建立层析纯化方法，其允许将非糖基化的重组产生的多肽纯化至允许使用所述非糖基化的重组产生的多肽用于治疗目的的纯度。
因此，本发明第一方面提供用于纯化已经在原核细胞中重组产生的非糖基化异源多肽的方法，其包括以下顺序的以下步骤：
a)选自以下的第一个层析步骤
i)疏水电荷诱导层析，
ii)疏水作用层析，
iii)亲和层析，或
iv)离子交换层析，
b)选自以下的第二个层析步骤
i)阴离子交换层析，
ii)阳离子交换层析，
iii)羟基磷灰石层析，
iv)疏水作用层析，或
v)疏水电荷诱导层析，
c)选自以下的第三个层析步骤
i)疏水电荷诱导层析，
ii)阴离子交换层析，
iii)阳离子交换层析，或
iv)疏水作用层析。
在一个实施方案中是本发明方法步骤c)后获得的纯化的非糖基化异源多肽。由于不同多肽的不同特征(取决于其物理性质，如等电点(Ip)或表面暴露的氨基酸残基的分布)，并非所有的层析方法均适合于所有的多肽。因此，以下条件应用于本发明的方法：
-在多肽能够与金属配体相互作用的情况下，第一个层析步骤是亲和层析或疏水电荷诱导层析，
-在多肽具有低于6.0的等电点的情况下第二个层析步骤不是羟基磷灰石层析步骤，
-在多肽具有低或高等电点的情况下以流通模式进行第三个层析步骤，
-任选地第三个层析步骤可用于浓缩多肽溶液。
将在下文示例本发明的方法。仅给出这些实例来示例本发明的方法，而不是限制本发明的范围，该范围在所附权利要求中给出。
IGF-1激动剂
第一个示例性多肽是例如在WO 2006/066891中报道的IGF-1激动剂。
为了纯化IGF-1激动剂，已经进行了本发明方法的一个顺序的三个层析步骤。该顺序包括层析步骤：
1)疏水电荷诱导层析(a-i)，
2)羟基磷灰石层析(b-iii)，和
3)疏水电荷诱导层析(c-i)。
因为多肽具有六组氨酸标记和高于6.0的等电点，所以该顺序满足了本发明方法的条件。
起始材料具有纯度为50％(由HPLC测定)的IGF-1激动剂。在利用如上描述的层析步骤进行本发明纯化方法后获得了高于97％的纯度(由HPLC测定)。已经以结合-和-洗脱模式进行了所有的三个层析步骤。
为了显示本发明方法的多样性，已经根据本发明方法通过不同顺序的层析步骤纯化了IGF-1激动剂，所述顺序为：
1)疏水作用层析(a-ii)，
2)阳离子交换层析(b-ii)，和
3)阴离子交换层析(c-ii)。
在利用如上描述的层析步骤进行本发明纯化方法后获得了97％的纯度(由HPLC测定)。已经以结合-和-洗脱模式进行了第一个和第二个层析步骤，并已经以流通模式进行了第三个层析步骤。
因此，已经惊奇地发现利用不同顺序的三个层析步骤可将相同分子纯化至相似纯度。此外已经发现了可以不同洗脱模式，即以结合-和-洗脱模式或以流通模式进行最后的层析步骤。还发现可将不同层析步骤以分步洗脱或连续洗脱进行。
因此，本发明的另一方面是用于纯化多肽，尤其是如WO 2006/066891中报道的IGF-1或IGF-1变体的方法，其包括一个顺序的连续三个层析步骤，其中第一个层析步骤是疏水电荷诱导层析，第二个层析步骤选自羟基磷灰石层析或阳离子交换层析，并且第三个层析步骤选自疏水电荷诱导层析或阴离子交换层析。
干扰素
第二个示例性多肽是例如在EP 0 043 980中报道的干扰素α-2a(IFNα-2a)。
为了纯化IFNα-2a，已经进行了根据本发明方法的一个顺序的三个层析步骤。该顺序包括层析步骤：
1)疏水电荷诱导层析(a-i)，
2)阴离子交换层析(b-ii)，和
3)疏水作用层析(c-iv)。
因为重组产生的IFNα-2a没有与金属螯合层析材料相互作用的标记并具有高于6.0的等电点，所以该顺序满足了本发明方法的条件。
起始材料具有49％的纯度(由HPLC测定)。在利用如上描述的层析步骤进行本发明纯化方法后获得了高于99％的纯度(由HPLC测定)。已经以结合-和-洗脱模式进行了层析步骤。
因此，本发明的另一方面是用于纯化IFNα-2a的方法，其包括一个顺序的连续三个层析步骤，其中第一个层析步骤是疏水电荷诱导层析步骤，第二个层析步骤是阴离子交换层析步骤，并且第三个层析步骤是疏水电荷诱导层析步骤。
已经通过不同顺序的层析步骤纯化了IFNα-2a用于比较：
1)疏水作用层析(a-ii)，
2)阳离子交换层析(b-ii)，和
3)疏水作用层析(c-iv)。
在利用如上描述的层析步骤进行本纯化方法后获得了高于97％的纯度(由HPLC测定)。
因此，本发明的另一方面是用于纯化IFNα-2a的方法，其包括一个顺序的三个连续层析步骤，其中第一个层析步骤是疏水作用层析，第二个层析步骤是阳离子交换层析步骤，并且第三个层析步骤是疏水作用层析。
聚乙二醇化的干扰素
本发明的方法不仅应用于非糖基化的重组产生的多肽，其进一步还适合于聚乙二醇化的非糖基化多肽的产生。对于示例性聚乙二醇化的干扰素，参阅例如EP 0 809 996。
因此，本发明的另一方面是用于产生已经在原核细胞中重组产生的非糖基化的聚乙二醇化的异源多肽的方法，其包括以下顺序的以下步骤：
a)提供已经在原核细胞中重组产生的非糖基化的异源多肽，
b)选自以下的第一个层析步骤
i)疏水电荷诱导层析，
ii)疏水作用层析，
iii)亲和层析，或
iv)离子交换层析，
c)选自以下的第二个层析步骤
i)阴离子交换层析，
ii)阳离子交换层析，
iii)羟基磷灰石层析，或
iv)疏水作用层析，
d)选自以下的第三个层析步骤
i)疏水电荷诱导层析，
ii)阴离子交换层析，
iii)阳离子交换层析，或
iv)疏水作用层析，
由此在步骤d)后聚乙二醇化后获得所述非糖基的异源多肽。
由于不同多肽的不同特征(取决于其物理性质，如等电点(Ip)或表面暴露的氨基酸残基的分布)，并非所有的层析方法均适合于所有的多肽。因此，以下条件应用于本发明的方法：
-在多肽能够与金属配体相互作用的情况下，第一个层析步骤是亲和层析或疏水电荷诱导层析，
-在多肽具有低于6.0的等电点的情况下第二个层析步骤不是羟基磷灰石层析步骤，
-在多肽具有低或高等电点的情况下以流通模式进行第三个层析步骤。
在EP 0 809 996中报道了示例性聚乙二醇化的IFN。
为了产生聚乙二醇化的IFN，已经进行了根据本发明方法的一个顺序的三个层析步骤。该顺序包括层析步骤：
1)疏水作用层析(b-ii)，
2)阳离子交换层析(c-ii)，和
3)阴离子交换层析(d-ii)，
并且在步骤3)后纯化的非糖基化和非聚乙二醇化IFN被聚乙二醇化。
起始材料具有58％的纯度(由HPLC测定)。在利用如上描述的层析步骤进行本发明纯化方法后获得了高于90％的纯度(由HPLC测定)。已经以结合-和-洗脱模式进行了所有的层析步骤。
为了显示本发明生产方法的多样性，也已经在聚乙二醇化前通过本发明方法其它顺序的层析步骤纯化了聚乙二醇化的多肽IFN：
1)金属亲和层析(b-iii)，
2)阳离子交换层析(c-ii)，和
3)阴离子交换层析(d-ii)，
并且在步骤3)后纯化的非糖基化和非聚乙二醇化IFN被聚乙二醇化。
在利用如上描述的层析步骤进行完本发明纯化方法后获得了高于90％的纯度(由HPLC测定)。已经以结合-和-洗脱模式进行了所有的层析步骤。
因此，本发明的另一方面是用于制备聚乙二醇化IFNα-2a的方法，其包括一个顺序的连续层析步骤，其中第一个层析步骤选自疏水作用层析或金属亲和层析，第二个层析步骤是阳离子交换层析，并且第三个层析步骤是阴离子交换层析，并且其中在第三个层析步骤后纯化的非糖基化和非聚乙二醇化的IFN被聚乙二醇化。
已经通过不同顺序的如下三个层析步骤进行了聚乙二醇化IFN的制备用于比较：
1)疏水作用层析(b-ii)，
2)阳离子交换层析(c-ii)，和
3)疏水电荷诱导层析(d-i)，并且在步骤3)后纯化的非糖基化和非聚乙二醇化IFN是聚乙二醇化的。
在利用如上描述的层析步骤进行完本发明纯化方法后获得了高于89％的纯度(由HPLC测定)。
因此，本发明的另一方面是用于制备聚乙二醇化干扰素，尤其是IFNα-2a的方法，其包括一个顺序的三个连续层析步骤，其中第一个层析步骤是疏水作用层析，第二个层析步骤是阳离子交换层析，并且第三个层析步骤是疏水电荷诱导层析，并且其中在第三个层析步骤后纯化的非糖基化和非聚乙二醇化的IFN被聚乙二醇化。
埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、链霉菌属(Streptomyces)或芽孢杆菌属(Bacillus)例如适合用作原核宿主生物。在一个实施方案中，原核细胞是大肠杆菌细胞。优选地，所述大肠杆菌细胞是大肠杆菌XL1-blue细胞，或大肠杆菌BL21(DE3)细胞，或大肠杆菌K-12细胞。在另一实施方案中是选自生长因子激动剂或拮抗剂，或干扰素或干扰素变体的非糖基化异源多肽。
本发明的另一方面是用于在原核细胞中重组产生非糖基化异源多肽的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
a)在适合于表达所述异源多肽的情况下培养包含编码异源多肽的核酸的原核细胞，
b)从培养基或原核细胞中回收所述异源多肽，
c)利用包括以下顺序的以下步骤的方法纯化所述异源多肽：
α)选自以下的第一个层析步骤
i)疏水电荷诱导层析，
ii)疏水作用层析，
iii)亲和层析，或
iv)离子交换层析，
β)选自以下的第二个层析步骤
i)阴离子交换层析，
ii)阳离子交换层析，
iii)羟基磷灰石层析，或
iv)疏水作用层析，或
v)疏水电荷诱导层析，
γ)选自以下的第三个层析步骤
i)疏水电荷诱导层析，
ii)阴离子交换层析，
iii)阳离子交换层析，或
iv)疏水作用层析。
在一个实施方案中是在步骤c)后获得的非糖基化异源多肽。由于不同多肽的不同特征(取决于其物理性质，如等电点(Ip)或表面暴露的氨基酸残基的分布)，并非所有的层析方法均适合于所有的多肽。因此，以下条件应用于本发明的方法：
-在多肽能够与金属配体相互作用的情况下，第一个层析步骤是亲和层析或疏水电荷诱导层析，
-在多肽具有低于6.0的等电点的情况下第二个层析步骤不是羟基磷灰石层析步骤，
-在多肽具有低或高等电点的情况下以流通模式进行第三个层析步骤。
如本申请中所用，术语“在合适条件下”表示用于培养表达多肽的细胞并且本领域技术人员已知或容易测定的条件。本领域技术人员已知的是这些条件可根据培养细胞的类型和表达多肽的类型而变化。一般地，在例如在20℃和40℃之间的温度下培养细胞，并且培养足以允许有效生产的一段时间，例如4到28天。
在一个实施方案中，以结合和洗脱模式进行所述层析步骤。如本发明中所用，术语“结合和洗脱模式”表示纯化方法的操作方式，其中将含有待纯化目的物质的溶液与固定相，优选固相接触，由此目的物质结合所述固定相。结果，目的物质停留在固定相，而非目的物质随流通去除或从上清液中去除。然后任选地在洗涤步骤后，在第二步从固定相中洗脱目的物质，并由此用洗脱液从固定相中将其回收。
术语“聚乙二醇化”表示在多肽N末端的聚乙二醇残基和/或固有的赖氨酸残基处共价键的形成。本领域中广泛已知蛋白质的聚乙二醇化并例如由Veronese，F.M.，Biomaterials 22(2001)405-417进行了评论。可使用不同官能团和不同分子量的聚乙二醇、线性和分支的PEG以及不同连接基团连接PEG(也参阅Francis，G.E.，等，Int.J.Hematol.68(1998)1-18；Delgado，C.，等，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Systems 9(1992)249-304)。激活的PEG衍生物为本领域所知并且在例如Morpurgo，M.，等，J.Bioconjug.Chem.7(1996)363-368描述了PEG-乙烯基砜。线性链和分支链PEG种类适合于聚乙二醇化片段的制备。活性PEG试剂的实例是碘代-乙酰基-甲氧基-PEG，或甲氧基-PEG-乙烯基砜。
在本发明方法的一个实施方案中是第三个层析步骤后获得的多肽溶液中内毒素，和/或大肠杆菌DNA，和/或大肠杆菌细胞蛋白质的含量与第一个层析步骤前的含量相比降低了。
在另一实施方案中，本发明方法是用于在原核细胞中通过包含体重组产生非糖基化异源多肽的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)在适合于表达所述异源多肽并形成含有所述异源多肽的包含体的情况下培养包含编码所述异源多肽的核酸的原核细胞，
b)从所述原核细胞中回收所述包含体，
c)从所述包含体中溶解并复性所述异源多肽，
d)通过本发明第一方面的方法纯化所述异源多肽。
在一个实施方案中是在步骤d)后获得的非糖基化异源多肽。在细胞质中发现了包含体并且其含有在水中不可溶的聚集形式的表达多肽。一般地，包含体的此类蛋白质是变性形式(例如随机连接的二硫键)。例如在细胞裂解后通过离心从其它细胞组分中分离这些包含体。根据本发明，在变性条件下洗涤所述包含体。这些变性剂为本领域所熟知并且例如是盐酸胍的高度浓缩溶液(例如约6mol/l)或尿素的高度浓缩溶液(例如约8mol/l)。所述变性剂优选用作缓冲液。洗涤后，溶解包含体。
术语“聚乙二醇化”表示聚乙二醇残基在多肽N末端和/或固有赖氨酸残基的共价连接。本领域中广泛已知蛋白质的聚乙二醇化并例如由Veronese，F.M.，Biomaterials 22(2001)405-417进行了评论。可使用不同官能团和不同分子量的聚乙二醇、线性和分支的PEG以及不同连接基团连接PEG(也参阅Francis，G.E.，等，Int.J.Hematol.68(1998)1-18；Delgado，C.，等，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Systems 9(1992)249-304)。在一个实施方案中通过使用NHS激活的线性或分支PEG分子(分子量在5kDa到40kDa之间)，利用例如WO 00/44785中描述的聚乙二醇化试剂进行聚乙二醇化。也可根据Lu，Y.，等，Reactive Polymers 22(1994)221-229在固相进行聚乙二醇化。根据WO 94/01451也可产生非随机的N末端聚乙二醇化的多肽。
激活的PEG衍生物为本领域所知并且例如在Morpurgo，M.，等，J.Bioconjug.Chem.7(1996)363-368中描述了PEG-乙烯基砜。线性链和分支链PEG种类适合于聚乙二醇化片段的制备。活性PEG试剂的实例是碘代-乙酰基-甲氧基-PEG，或甲氧基-PEG-乙烯基砜(m优选为从约450到约900的整数，并且R是C1-到C6-烷基，线性的或分支的，具有一到六个碳原子，如甲基、乙基、异丙基等，由此在一个实施方案中R＝甲基)：
Figure BPA00001184046500201
这些碘-激活物质的用途为本领域所知并由例如Hermanson，G.T.，在Bioconjugate Techniques，Academic Press，San Diego(1996)第147-148页所述。
在一个实施方案中，PEG种类是激活的PEG酯，例如N-羟基琥珀酰亚胺基丙酸酯，或N-羟基琥珀酰亚胺基丁酸酯，或N-羟基琥珀酰亚胺如PEG-NHS(Monfardini，C.，等，Bioconjugate Chem.6(1995)62-69)。在一个实施方案中，激活的N-羟基琥珀酰亚胺酯是
Figure BPA00001184046500202
使用烷氧基-PEG-N-羟基琥珀酰亚胺，如甲氧基-PEG-N-羟基琥珀酰亚胺(MW 30000；Shearwater Polymers，Inc.)，其中R和m如上定义。在一个实施方案中，PEG种类是甲氧基聚乙二醇丁酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯。术语“烷氧基”指烷基醚基团，其中所述术语“烷基”表示直链或支链的烷基，其含有最多4个碳原子，如甲氧基、乙氧基、正丙氧基等，优选甲氧基。
本发明的一方面是用于纯化已经在原核细胞中重组产生的非糖基化异源多肽的方法，其特征在于所述方法包括以下顺序的以下步骤：
a)选自以下的第一个层析步骤
i)疏水电荷诱导层析，
ii)疏水作用层析，
iii)亲和层析，或
iv)离子交换层析，
b)选自以下的第二个层析步骤
i)阴离子交换层析，
ii)阳离子交换层析，
iii)羟基磷灰石层析，
iv)疏水作用层析，或
v)疏水电荷诱导层析，
c)选自以下的第三个层析步骤
i)疏水电荷诱导层析，
ii)阴离子交换层析，
iii)阳离子交换层析，或
iv)疏水作用层析，
由此，
-在多肽能够与金属配体相互作用的情况下，所述第一个层析步骤是亲和层析或疏水电荷诱导层析，
-在多肽具有低于6.0的等电点的情况下，所述第二个层析步骤不是羟基磷灰石层析步骤，
-在多肽具有低或高等电点的情况下，以流通模式进行所述第三个层析步骤，
并且条件是三个层析步骤的组合不是
-亲和层析、离子交换层析和疏水作用层析，
-疏水作用层析、阳离子交换层析和阴离子交换层析，
-阳离子交换层析、阴离子交换层析和疏水作用层析，
-阳离子交换层析、疏水作用层析和阳离子交换层析，
-阴离子交换层析、疏水作用层析和疏水作用层析。
在本发明方法的一个实施方案中是在第三个层析步骤后获得的非糖基化异源多肽。
如本申请所用，术语“相当的”表示两个结果彼此在10％内。例如，90％的纯度和95％的纯度是相当的，因为95％在90％纯度的10％内(90％+90％的10％＝90％+9％＝99％)。
提供以下实施例、参考文献和附图帮助理解本发明，其真实范围在所附权利要求中给出。应理解可在所述步骤中进行修改，而不背离本发明的精神。
附图简述
图1第一次HCIC之前(a)和之后(b)IGF-1激动剂的反相HPLC层析图。
图2羟基磷灰石层析步骤之前(a)和之后(b)IGF-1激动剂的反相HPLC层析图。
图3第二次HCIC之前(a)和之后(b)IGF-1激动剂的反相HPLC层析图。
图4HIC之前(a)和之后(b)IGF-1激动剂的反相HPLC层析图。
图5阳离子交换层析步骤之前(a)和之后(b)IGF-1激动剂的反相HPLC层析图。
图6阴离子交换层析步骤之前(a)和之后(b)IGF-1激动剂的反相HPLC层析图。
实验部分
材料和方法：
除非另有说明，根据层析材料制造商手册进行不同的层析方法。
重组DNA技术：
如Sambrook，J.，等，Molecular cloning：A laboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989中所述，使用标准方法操作DNA。根据制造商的说明书使用分子生物学试剂。
蛋白质测定：
使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，以320nm的参考波长测定280nm处的光密度(OD)来测定蛋白质浓度。
大小排阻HPLC：
利用ASI-100HPLC系统(Dionex，Idstein，Germany)上的Tosoh Haas TSK 3000SWXL柱进行层析法。通过UV二极管阵列检测器(Dionex)在280nm处监测洗脱峰。在将浓缩样品溶解到1mg/ml后，用200mM磷酸二氢钾和250mM氯化钾组成的缓冲液pH 7.0洗涤所述柱，直至达到稳定基线。使用0.5ml/分钟的流速在室温无梯度条件下进行分析测定30分钟。用Chromeleon(Dionex，Idstein，Germany)手工积分层析图。
反相HPLC(RP-HPLC)：
通过RP-HPLC分析纯度。使用乙腈/水性TFA梯度在Poroshell柱上进行测定。以在215nm处的UV吸收监测洗脱图谱。基于洗脱蛋白质的总峰面积计算洗脱物质的百分比。
DNA阈值系统：
参阅例如Merrick，H.，和Hawlitschek，G.，Biotech Forum Europe 9(1992)398-403。
宿主细胞蛋白质测定：
用血清白蛋白和链霉抗生物素蛋白的混合物包被微量滴定板的孔壁。针对HCP的山羊来源的多克隆抗体结合微量滴定板的孔壁。洗涤步骤后，微量滴定板的不同孔与HCP校准系列的不同浓度和样品溶液温育。温育后，用缓冲液洗涤去除未结合的样品材料。为了检测，所述孔与抗体过氧化物酶缀合物温育以检测结合的宿主细胞蛋白。通过与ABTS温育和405nm处的检测来检测固定的过氧化物酶活性。
用于分离、溶解和复性包含体的一般方法：
除了在引用的参考文献中进行的方法外，例如可根据Rudolph等(Rudolph等，Folding Proteins，In：T.E.Creighton(编辑)：Protein function：A Practical Approach，57(1996))中的方法进行内含体的制备。将所述内含体储存在-70℃。也可根据Rudolph等(错误！未找到引用源。)的方法进行包含体的溶解。
实施例1
IGF-1激动剂的纯化
在大肠杆菌中表达多肽。首先在HCIC柱上应用多肽，然后在羟基磷灰石柱上，最后在第二个HCIC柱上应用所述多肽。
层析条件如下：
第1个柱：
树脂：具有MEP-Hypercel(Pall Corporation，USA)的HCIC作为单步洗脱
上样：每ml柱体积10mg多肽
缓冲液A：25mM三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液，调整至pH9.0
缓冲液B：10mM乙酸钠缓冲液，调整至pH5.0
在第一个步骤中将含有IGF-1激动剂的溶液应用到含有疏水电荷诱导层析材料(来自Pall Corporation的MEP-Hypercel)的柱上。
在图1中，给出了HCIC之前和之后的IGF-1激动剂的反相层析图。
第2个柱：
树脂：羟基磷灰石层析(Biorad Laboratories，USA)
上样：每ml柱体积6.5mg多肽
缓冲液A：5mM磷酸钾缓冲液，调整至pH6.5
缓冲液B：补充有1M氯化钠的10mM MES缓冲液，调整至pH6.5
图2给出了羟基磷灰石层析步骤之前和之后的反相层析图。
第3个柱：
树脂：具有HEA-Hypercel的HCIC(Pall Corporation，USA)
上样：每ml柱体积20mg多肽
缓冲液A：20mM乙酸钠缓冲液，调整至pH4.0
图3给出了第二个HCIC步骤之前和之后的反相层析图。
柱 产率[％]   HPLC测定的纯度[％]
  起始   49.2
  HCIC步骤   15.7   86.6
  羟基磷灰石层析步骤 62.5 97.0
  HCIC步骤   94.2   97.7
实施例2
IGF-1激动剂的纯化-与实施例1的比较实施例
将多肽首先应用于HIC柱上，然后是阳离子交换层析，最后是以流通模式运行的阴离子交换层析。
第一个柱：
树脂：具有Super Butyl Toyopearl的HIC(Tosoh Haas Corp.，USA)
上样：每ml柱体积5mg多肽
缓冲液A：补充有1M氯化钾的50mM磷酸钾缓冲液，调整至pH8.0
缓冲液B：2-丙醇5-10％(w/v)，调整至pH4.0
以从0％(v/v)到100％(v/v)缓冲液B的线性梯度进行洗脱超过30柱体积。
图4给出了HIC步骤之前和之后的反相层析图。
第2个柱：
树脂：具有CM-Sepharose FF的阳离子交换层析(GE-Healthcare.，USA)
上样：每ml柱体积4.1mg多肽
缓冲液A：50mM乙酸，调整至pH5.8
缓冲液B：补充有1M氯化钠的100mM三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液，调整至pH9.5
如下进行洗脱：起始时换成15％(v/v)的缓冲液B，将15％(v/v)缓冲液B维持5个柱体积，然后在20个柱体积内线性梯度至55％(v/v)缓冲液B，最后将55％(v/v)缓冲液B维持10个柱体积。
图5给出了阳离子交换层析步骤之前和之后的反相层析图。
第3个柱：
树脂：流通模式的具有Q-Sepharose的阴离子交换层析(GE-Healthcare.，USA)
上样：每ml柱体积20mg多肽
缓冲液A：25mM三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液，调整至pH9.5
缓冲液B：10mM乙酸(pH3.6)。
图6给出了阴离子交换层析步骤之前和之后的反相层析图。
柱 产率[％]   HPLC测定的纯度[％]
  起始   49.6
  HIC步骤   16.7   约90
  阳离子交换层析步骤 14.2 90.1
  阴离子交换层析步骤 93.8 97.0
实施例3
干扰素的纯化
多肽首先应用到HIC柱上，然后阴离子交换柱，最后是阳离子交换柱。
层析条件如下：
第1个柱：
树脂：具有Butyl Sepharose的HIC(GE-Healthcare.，USA)作为单步洗脱
上样：每ml柱体积8mg多肽
缓冲液A：20mM磷酸钾缓冲液，调整至pH8.0
第2个柱：
树脂：具有Q-Sepharose FF的阴离子交换层析(GE-Healthcare，USA)
上样：每ml柱体积1.5mg多肽
缓冲液A：30mM乙酸铵，调整至pH 5.9
缓冲液B：1.8mM乙酸铵，调整至pH 3.5
如下进行洗脱：起始时换成15％(v/v)的缓冲液B，将15％(v/v)缓冲液B维持3个柱体积，然后在37.5个柱体积内线性梯度至90％(v/v)缓冲液B。
第3个柱：
树脂：具有SP-Sepharose的阳离子交换层析作为单步洗脱
上样：每ml柱体积2.84mg多肽
缓冲液A：补充有250mM氯化钠的50mM硼酸盐缓冲液，调整至pH9.0
柱 产率[％]   HPLC测定的纯度[％]
  起始   48.8
  HIC步骤   13.4   69.3
  阴离子交换层析步骤 55.0 97.5
  阳离子交换层析步骤 89.5 约100
实施例4
干扰素的纯化-与实施例3的比较实施例
多肽首先应用到HIC柱上，然后是阳离子交换柱，最后是阴离子交换柱。
层析条件如下：
第1个柱：
树脂：具有Butyl Sepharose的HIC(GE-Healthcare，USA)
上样：每ml柱体积8mg多肽
缓冲液A：补充有2m氯化钾的20mM磷酸钾缓冲液，调整至pH 8.0
缓冲液B：20mM磷酸钾缓冲液，调整至pH 8.0
第2个柱：
树脂：具有CM Toyopearl的阳离子交换层析(Tosoh Hass Corp.，USA)
上样：每ml柱体积5mg多肽
缓冲液A：平衡：75mM乙酸钠，调整至pH 4.0
         洗涤：15mM乙酸钠，调整至pH 5.5
缓冲液B：30mM乙酸钠，调整至pH 7.0
第3个柱：
树脂：具有Q-Sepharose的阴离子交换层析
上样：每ml柱体积的3mg多肽
缓冲液A：30mM乙酸铵缓冲液，调整至pH 6.8
缓冲液B：1)25mM乙酸铵，调整至pH 6.5
2)补充有3mM乙酸的1.8mM乙酸铵，调整至pH 4.5
柱 产率[％]   HPLC测定的纯度[％]
  起始   58
  HIC步骤   2.3   71.6
  阳离子交换层析步骤 28.3 88.3
  阴离子交换层析步骤 95.3 93.2
实施例5
干扰素的纯化-与实施例3和实施例4的比较实施例
多肽首先应用到金属螯合柱上，然后是阳离子交换柱，最后是阴离子交换柱。
层析条件如下：
第1个柱：
树脂：铜螯合Sepharose(GE-Healthcare，USA)作为单步洗脱
上样：每ml柱体积51mg多肽
缓冲液A：平衡：补充有150mM氯化钠和20mM磷酸钠缓冲液的300mM盐酸胍，调整至pH 6.45
洗涤：补充有100mM氯化钠的50mM乙酸，调整至pH4.95
缓冲液B：补充有100mM氯化钠的50mM乙酸，调整至pH 3.9
第2个柱：
树脂：具有CM Toyopearl的阳离子交换层析(Tosoh Hass Corp.，USA)作为单步洗脱
上样：每ml柱体积5mg多肽
缓冲液A：平衡：75mM乙酸钠，调整至pH 4.0
洗涤：15mM乙酸钠，调整至pH5.5
缓冲液B：30mM乙酸钠，调整至pH7.0
第3个柱
树脂：具有Q-Sepharose的阴离子交换层析
上样：每ml柱体积3mg多肽
缓冲液A：30mM乙酸铵缓冲液，调整至pH 6.8
缓冲液B：1)25mM乙酸铵缓冲液，调整至pH 6.5
2)补充有3mM乙酸的1.8mM乙酸铵，调整至pH 4.5
如下进行洗脱：起始时变为10％(v/v)缓冲液B，将15％(v/v)缓冲液B维持3个柱体积，然后在27.5个柱体积内线性梯度至90％(v/v)缓冲液B。
柱 产率[％]   HPLC测定的纯度[％]
  起始   47.3
  金属螯合层析步骤 3.2 59.8
  阳离子交换层析步骤 28.3 88.3
  阴离子交换层析步骤 95.3 93.2

Claims (16)

1.用于纯化已经在原核细胞中重组产生的非糖基化异源多肽的方法，
其特征在于所述方法包括以下顺序的以下步骤：
a)选自以下的第一个层析步骤
i)疏水电荷诱导层析，
ii)疏水作用层析，
iii)亲和层析，或
iv)离子交换层析，
b)选自以下的第二个层析步骤
i)阴离子交换层析，
ii)阳离子交换层析，
iii)羟基磷灰石层析，或
iv)疏水作用层析，或
v)疏水电荷诱导层析，
c)选自以下的第三个层析步骤
i)疏水电荷诱导层析，
ii)阴离子交换层析，
iii)阳离子交换层析，或
iv)疏水作用层析，
其中，
-在多肽能够与金属配体相互作用的情况下，所述第一个层析步骤是亲和层析或疏水电荷诱导层析，
-在多肽具有低于6.0的等电点的情况下，所述第二个层析步骤不是羟基磷灰石层析步骤，
-在多肽具有低或高等电点的情况下，以流通模式进行所述第三个层析步骤。
2.权利要求1的方法，其特征在于所述原核细胞是大肠杆菌细胞。
3.前述权利要求任何一项的方法，其特征在于所述亲和层析是金属螯合层析。
4.前述权利要求任何一项的方法，其特征在于所述非糖基化异源多肽选自生长因子激动剂或拮抗剂，或干扰素或干扰素变体。
5.前述权利要求任何一项的方法，其特征在于所述方法在步骤c)后包括额外的步骤，其为d)聚乙二醇化所述多肽。
6.前述权利要求任何一项的方法，其特征在于所述步骤a)和b)是阳离子交换层析步骤。
7.在原核细胞中重组产生非糖基化异源多肽的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
a)在适合于表达所述异源多肽的条件下培养包含编码所述异源多肽的核酸的原核细胞，
b)从培养基或原核细胞中回收所述异源多肽，
c)利用权利要求1的方法纯化所述异源多肽。
8.用于通过包含体在原核细胞中重组产生非糖基化异源多肽的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
a)在适合于表达所述异源多肽并形成含有所述异源多肽的包含体的条件下培养包含编码所述异源多肽的核酸的所述原核细胞，
b)从所述原核细胞中回收所述包含体，
c)从所述包含体中溶解并复性所述异源多肽，
d)通过权利要求1的方法纯化所述异源多肽。
9.前述权利要求任何一项的方法，其特征在于在第三个层析步骤后获得的多肽溶液中内毒素、和/或大肠杆菌DNA、和/或大肠杆菌细胞蛋白质的含量与第一个层析步骤之前的含量相比降低了。
10.用于纯化IGF-1或IGF-1变体的方法，其包括一个顺序的三个连续层析步骤，其中第一个层析步骤是疏水电荷诱导层析，第二个层析步骤选自羟基磷灰石层析或阳离子交换层析，并且第三个层析步骤选自疏水电荷诱导层析或阴离子交换层析。
11.用于纯化IFNα-2a的方法，其包括一个顺序的三个连续层析步骤，其中第一个层析步骤是疏水电荷诱导层析，第二个层析步骤是阴离子交换层析，并且第三个层析步骤是疏水电荷诱导层析。
12.用于纯化IFNα-2a的方法，其包括一个顺序的三个连续层析步骤，其中第一个层析步骤是疏水作用层析，第二个层析步骤是阳离子交换层析，并且第三个层析步骤是疏水作用层析。
13.用于制备已经在原核细胞中重组产生的非糖基化的聚乙二醇化的异源多肽的方法，其包括以下顺序的以下步骤：
a)提供已经在原核细胞中重组产生的非糖基化的异源多肽，
b)选自以下的第一个层析步骤
i)疏水电荷诱导层析，
ii)疏水作用层析，
iii)亲和层析，或
iv)离子交换层析，
c)选自以下的第二个层析步骤
i)阴离子交换层析，
ii)阳离子交换层析，
iii)羟基磷灰石层析，或
iv)疏水作用层析，
d)选自以下的第三个层析步骤
i)疏水电荷诱导层析，
ii)阴离子交换层析，
iii)阳离子交换层析，或
iv)疏水作用层析，
其中在步骤d)后将所述非糖基的异源多肽聚乙二醇化。
14.用于制备聚乙二醇化IFNα-2a的方法，其包括一个顺序的三个连续层析步骤，其中第一个层析步骤选自疏水作用层析或金属亲和层析，第二个层析步骤是阳离子交换层析，并且第三个层析步骤是阴离子交换层析，并且其中在第三个层析步骤后将纯化的非糖基化和非聚乙二醇化的IFNα-2a聚乙二醇化。
15.用于制备聚乙二醇化干扰素的方法，其包括一个顺序的三个连续层析步骤，其中第一个层析步骤是疏水作用层析，第二个层析步骤是阳离子交换层析，并且第三个层析步骤是疏水电荷诱导层析，并且其中在第三个层析步骤后将纯化的非糖基化和非聚乙二醇化的IFN聚乙二醇化。
16.用于纯化已经在原核细胞中重组产生的非糖基化异源多肽的方法，其特征在于所述方法包括以下顺序的以下步骤：
a)选自以下的第一个层析步骤
i)疏水电荷诱导层析，
ii)疏水作用层析，
iii)亲和层析，或
iv)离子交换层析，
b)选自以下的第二个层析步骤
i)阴离子交换层析，
ii)阳离子交换层析，
iii)羟基磷灰石层析，或
iv)疏水作用层析，或
v)疏水电荷诱导层析，
c)选自以下的第三个层析步骤
i)疏水电荷诱导层析，
ii)阴离子交换层析，
iii)阳离子交换层析，或
iv)疏水作用层析，
其中，
-在多肽能够与金属配体相互作用的情况下，所述第一个层析步骤是亲和层析或疏水电荷诱导层析，
-在多肽具有低于6.0的等电点的情况下，所述第二个层析步骤不是羟基磷灰石层析步骤，
-在多肽具有低或高等电点的情况下，以流通模式进行所述第三个层析步骤，
并且其中至少两个不同顺序的三个层析步骤产生具有相当纯度的纯化的非糖基化异源多肽。
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