CN103703015B - 阳离子和阴离子交换层析法 - Google Patents

阳离子和阴离子交换层析法 Download PDF

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Abstract

本文报道了一种用于纯化多肽的方法，所述方法包括以下步骤：i)将包含多肽的溶液施加于离子交换层析材料，和ii)用包含变性剂的溶液回收所述多肽，并由此纯化所述多肽，其中所述离子交换层析材料包含已经连接有离子配体的交联的聚(苯乙烯‑二乙烯基苯)基质，并且其中所述施加于离子交换层析材料的包含多肽的溶液不含有变性剂，并且用恒定电导率的包含变性剂的溶液回收吸附在离子交换层析材料上的多肽。

Description

阳离子和阴离子交换层析法
本文中报道了通过用包含变性剂的溶液从离子层析材料洗脱多肽来纯化所述多肽的离子交换层析法。
发明背景
蛋白质在当今的医疗方案中发挥重要作用。现有技术中熟知生产重组多肽的表达系统。主要在原核细胞(诸如大肠杆菌)和哺乳动物细胞(诸如CHO细胞、NS0细胞、Sp2/0细胞、COS细胞、HEK细胞、BHK细胞、PER.细胞等)中生产用于药物应用的多肽。
对于人类应用，每种药用物质必须符合不同的标准。为确保生物药剂对人类的安全性，例如，必须除去可导致严重伤害的核酸、病毒和宿主细胞蛋白质。为满足监管规格，在制造过程后必须有一个或多个纯化步骤。除了其它因素以外，纯度、处理量和产量在确定适当的纯化过程中起重要作用。
已经确定地建立了不同的方法，并广泛用于蛋白质纯化，例如使用微生物蛋白质的亲和层析法(例如蛋白A或蛋白G亲和层析法)、离子交换层析法(例如阳离子交换(磺丙基或羧甲基树脂)、阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合模式离子交换)、亲硫吸附(例如用β-巯基乙醇和其它SH配体)、疏水相互作用或芳族吸附层析法(例如用苯基-琼脂、aza-arenophilic树脂或间-氨基苯基硼酸)、金属螯合亲和层析法(例如用Ni(II)-和Cu(II)-亲和材料)、尺寸排阻层析法，和电泳方法(例如凝胶电泳、毛细管电泳)(参见例如Vijayalakshmi，M.A.，Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。
Necina，R.，等人(Biotechnol.Bioeng.60(1998)689-698)报道了用表现出高电荷密度的离子交换介质从细胞培养物上清液直接捕获人单克隆抗体。在WO 89/05157中，报道了一种通过对细胞培养基直接进行阳离子交换处理而纯化产物免疫球蛋白的方法。Danielsson，A.，等人，J.Immun.Meth.115(1988)79-88描述了从小鼠腹水中一步纯化单克隆IgG抗体。在WO 2004/024866中报道了一种通过离子交换层析法纯化多肽的方法，其中使用梯度洗涤使目标多肽与一种或多种污染物分开。在EP 0 530 447中，报道了一种通过3个层析步骤的组合来纯化IgG单克隆抗体的方法。Wang，等人(Wang，H.，等人，Peptides26(2005)1213-1218)报道了通过两步阳离子交换层析法纯化在大肠杆菌中表达的hTFF3。
在WO 2010/063717中报道了多肽纯化。在WO 2008/002235中报道了蛋白纯化和鉴别。Cole，D.R.，报道了在含脲的缓冲液中的胰岛素层析法(J.Biol.Chem.235(1960)2294-2299)。在US4,129,560中报道了一种使用非离子型去污剂纯化高分子量肽的方法。在WO2004/031213中报道了一种制备生长激素及其拮抗剂(其具有较低水平的其异形体杂质)的方法。在US 6,451,987中报道了蛋白质和肽的离子交换层析法。在EP 0 013 826中报道了一种纯化胰岛素的方法和如此制备的胰岛素。
发明概述
已经发现，用包含变性剂/离液剂的溶液可以从离子交换层析材料(阳离子和/或阴离子交换层析材料)回收多肽，其中在从离子交换层析材料回收多肽的过程中，施加的溶液的电导率维持恒定，即使电导率保持恒定。
本文报道的一个方面是，一种通过离子交换层析法以结合和洗脱模式得到或纯化多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
-通过施加包含变性剂的溶液，从离子交换层析材料回收多肽，并由此得到或纯化多肽，
其中所述离子交换层析材料包含已经连接有离子配体的交联的聚(苯乙烯-二乙烯基苯)基质。
在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：
-通过施加包含变性剂的溶液，从第一离子交换层析材料回收多肽，
-将所述回收的多肽施加于第二离子交换层析材料，和
-通过施加包含变性剂的溶液，从所述第二离子交换层析材料回收多肽，并由此得到或纯化多肽。
在一个实施方案中，所述第一离子交换层析材料是阴离子交换层析材料，并且所述第二离子交换层析材料是阳离子交换层析材料。
在一个实施方案中，所述第一离子交换层析材料是阳离子交换层析材料，并且所述第二离子交换层析材料是阴离子交换层析材料。
在一个实施方案中，所述变性剂是脲或脲衍生物。
在一个实施方案中，所述变性剂是2种或3种变性剂的混合物。
在一个实施方案中，在所述回收中施加的溶液具有恒定的电导率。
在一个实施方案中，在所述洗涤步骤中施加的溶液具有恒定的电导率。
在一个实施方案中，在所述回收中施加的溶液具有恒定的pH值。
在一个实施方案中，在所述洗涤步骤中施加的溶液具有恒定的pH值。
在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：
-将包含天然形式的多肽的溶液施加于离子交换层析材料，和
-通过施加包含变性剂的溶液，从离子交换层析材料回收多肽，并由此得到或纯化多肽。
在一个实施方案中，所述离子交换层析材料是阳离子交换层析材料。在一个实施方案中，所述配体是磺丙基或羧甲基。
在一个实施方案中，所述离子交换层析材料是阴离子交换层析材料。在一个实施方案中，所述配体是聚乙烯亚胺或季铵化的乙烯亚胺。
在一个实施方案中，所述多肽是抗体、或抗体片段、或包含至少一个抗体结构域的融合多肽。
在一个实施方案中，所述多肽是四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白。在一个实施方案中，所述四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白具有SEQ ID NO：01、或SEQ ID NO：02、或SEQ IDNO：03、或SEQ ID NO：04的氨基酸序列。
本文报道的一个方面是，一种用于生产多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
-培养原核或真核细胞，所述细胞包含编码所述多肽的核酸，
-从细胞或/和培养基回收所述多肽，
-通过以包涵体形式回收所述多肽，溶解和/或重折叠所述多肽，
-用本文报道的离子交换层析法纯化所述多肽，并由此生产所述多肽。
发明详述
本文报道了用于纯化多肽的以结合和洗脱模式运行的可缩放的离子交换层析法，其中用包含变性剂的溶液从离子交换层析材料回收多肽，其中在回收步骤中使用的溶液的电导率维持恒定。
术语“施加于”及其语法等效词表示纯化方法的部分步骤，其中将含有待纯化的目标物质的溶液与固定相接触。这表示：a)将溶液加到固定相所在的层析装置，或b)将固定相加到包含目标物质的溶液。在情况a)中，含有待纯化的目标物质的溶液流过固定相，允许固定相和溶液中的物质之间的相互作用。取决于条件，例如pH、电导率、盐浓度、温度和/或流速，溶液的一些物质与固定相结合，并因而从溶液中除去。其它物质留在溶液中。留在溶液中的物质可在流通液中找到。“流通液”指在通过层析装置后得到的与其来源无关的溶液。它可以是含有目标物质的施加的溶液，或用于冲洗柱或用于洗脱结合于固定相的一种或多种物质的缓冲液。在一个实施方案中，所述层析装置是柱或盒。通过本领域技术人员熟悉的方法(例如沉淀、盐析、超滤、渗滤、低压冻干法、亲和层析法或减少溶剂体积)进行纯化步骤后，可以从溶液回收目标物质，以得到纯化的或甚至基本上均质形式的目标物质。在情况b)中，将固定相(例如作为固体)加入含有待纯化的目标物质的溶液中，允许固定相或溶液中的物质之间的相互作用。在相互作用后，通过例如过滤除去固定相，目标物质结合于固定相并与之一起从溶液除去，或者目标物质不结合于固定相且留在溶液中。
如本申请中所用的术语“缓冲的”表示这样的溶液：其中由于酸性或碱性物质的加入或释放导致的pH改变被缓冲物质拉平。可使用任何导致此类效应的缓冲物质。在一个实施方案中，所述缓冲物质选自磷酸或其盐、乙酸或其盐、柠檬酸或其盐、吗啉、2-(N-吗啉代)乙磺酸或其盐、咪唑或其盐、组氨酸或其盐、甘氨酸或其盐或三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)或其盐。在一个实施方案中，所述缓冲物质选自咪唑或其盐或者组氨酸或其盐。任选地，缓冲的溶液也可包含额外的无机盐。在一个实施方案中，所述无机盐选自氯化钠、硫酸钠、氯化钾、硫酸钾、柠檬酸钠和柠檬酸钾。
“多肽”是由通过肽键连接的氨基酸组成的聚合物，无论是天然产生的还是合成的。具有少于约20个氨基酸残基的多肽可称为“肽”，而由两个或更多个多肽组成、或包含一个多于100个氨基酸残基的多肽的分子可称为“蛋白质”。多肽也可包含非氨基酸组分，例如糖基、金属离子或羧酸酯。非氨基酸组分可由在其中表达多肽的细胞添加，并可随细胞类型而改变。本文中以其氨基酸主链结构或编码其氨基酸主链结构的核酸的方式来限定多肽。添加物例如糖基通常不进行详细说明，但可存在。
术语“抗体”表示包含至少两条轻多肽链和两条重多肽链的蛋白。每条重多肽链和轻多肽链包含含有用于与抗原相互作用的结合结构域的可变区(一般为多肽链的氨基端部分)。每条重多肽链和轻多肽链还包含恒定区(一般为多肽链的羧基端部分)，所述恒定区可介导抗体与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞、一些吞噬细胞和经典补体系统的第一组分(Clq))的结合。通常，轻多肽链和重多肽链是各自基本上由可变区(即VL或VH)和完整恒定区(即在轻多肽链的情况下为CL，或在重多肽链的情况下为CH1、CH2、CH3、和任选的CH4)组成的完整链。可以将根据本发明的抗体的可变区移植至其它同利型的恒定区。例如，可以将编码1-同种型的重链可变区的多核苷酸移植至编码另一种重链类型(或亚类)的恒定区的多核苷酸。
抗体可以以多种形式存在，包括，例如，Fv、Fab和F(ab)2以及单链(例如Huston，J.S.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85(1988)5879-5883；Bird，R.E.，等人，Science242(1988)423-426；和，一般而言，Hood，等人，Immunology，Benjamin N.Y.，第2版，TheBenjamin/Cummings Publishing Company，Inc.(1984)，和Hunkapiller，T.和Hood，L.，Nature323(1986)15-16)。在一个实施方案中，所述抗体选自单克隆抗体、分离的重链或轻链、或仅由恒定区及其片段组成的重链或轻链。
术语“恒定的”表示，特定值维持在具有至多10％的相对变化的水平。在一个实施方案中，所述回收步骤中的溶液的电导率维持恒定，具有至多±10％的变化。在一个实施方案中，所述回收步骤中的溶液的电导率维持恒定，具有至多±5％的变化。在一个实施方案中，所述回收步骤中的溶液的电导率维持恒定，具有至多±2％的变化。
术语“结合和洗脱模式”表示实施层析纯化方法的方式。本文中将含有待纯化的目标多肽的溶液施加于固定相，特别是固相，由此目标多肽与固定相相互作用并被保留在其上。非目标物质分别随流通液或上清被除去。然后在第二步骤中，通过施加洗脱溶液从固定相回收目标多肽。
术语“包涵体”表示聚集的目标多肽的致密的细胞内团，它构成总细胞蛋白质的重要部分，包括原核细胞的全部细胞组分。
术语“变性的”表示这样的多肽形式：其中这些具有非天然的二级、三级和/或四级结构。处于此非天然形式的多肽可为可溶性的，但伴随地处于无生物活性的构象。或者多肽可为不可溶性的，并处于无生物活性的构象，具有例如错配的或未形成的二硫键。此不可溶多肽可以但不一定包含于包涵体内。
术语“重折叠的”表示从变性形式得到的多肽。通常，重折叠的目标是，生产与没有重折叠步骤生产的蛋白质相比具有更高活性水平的蛋白质。折叠的蛋白质分子在处于具有最低自由能的构象时是最稳定的。大部分水溶性蛋白质以这样的方式折叠：大部分疏水性氨基酸位于分子内部，远离水。将蛋白质维持在一起的弱键可以被多种导致多肽解折叠(即变性)的处理破坏。折叠的蛋白质是氨基酸本身和它们的环境之间的多种类型的相互作用(包括离子键、范德华相互作用、氢键、二硫键和共价键)的产物。
本文中使用的术语“变性的”或“变性化的”表示这样的多肽：其中存在于它的天然或重折叠状态的分子中的离子键和共价键以及范德华相互作用被破坏。多肽的变性可以如下完成：例如通过用8M脲、还原剂例如巯基乙醇、热、pH、温度和其它化学试剂处理。例如8M脲等试剂会破坏氢键和疏水键，并且如果也加入了巯基乙醇，在半胱氨酸之间形成的二硫桥(S-S)被还原为两个-S-H基团。在其天然或重折叠状态下含有二硫键的多肽的重折叠也可涉及存在于蛋白质的半胱氨酸残基上的-S-H基团的氧化，以重新形成二硫键。
术语“离液剂”或“变性剂”可以互换使用，表示扭曲多肽的三维结构的化合物。该过程也称为变性。离液剂会扭曲/破坏通过诸如氢键或范德华力等非共价力形成的相互作用。在一个实施方案中，所述离液剂选自：丁醇、乙醇、1-和2-丙醇、盐酸胍、氯化镁、十二烷基/月桂基硫酸钠、脲和硫脲。
术语“处于天然形式”表示这样的多肽形式：其中它具有二级、三级和/或四级结构，呈所述结构时，多肽具有它的生物活性。
术语“离子交换层析材料”表示固定的高分子量基质，其承载共价结合的带电荷取代基。就总体电荷中性而言，非共价结合的抗衡离子通过离子相互作用与带电荷的取代基结合。“离子交换层析材料”具有用它的非共价结合的抗衡离子交换周围溶液的带类似电荷的结合配偶体或离子的能力。取决于它的可交换的抗衡离子的电荷，“离子交换层析材料”被称作“阳离子交换层析材料”或“阴离子交换层析材料”。取决于带电荷基团(取代基)的性质，例如在阳离子交换材料的情况下，“离子交换层析材料”被称作磺酸或磺丙基树脂(S)或羧甲基树脂(CM)。取决于带电荷基团/取代基的化学性质，“离子交换层析材料”又可以分类为强或弱离子交换材料，这取决于共价结合的带电荷取代基的强度。例如，强阳离子交换材料具有磺酸基(诸如磺丙基)作为带电荷取代基，弱阳离子交换材料具有羧酸基团(诸如羧甲基)作为带电荷取代基。强阴离子交换材料具有季铵基，弱阴离子交换材料具有二乙基氨基乙基作为带电荷取代基。
通常，离子交换层析步骤的位置可在多肽的多步纯化次序中变化。
确定地建立并广泛使用用于纯化多肽的方法。它们被单独地或组合地使用。此类方法是：例如，使用具有络合的金属离子(例如使用Ni(II)-和Cu(II)-亲和材料)的硫醇配体或微生物衍生的蛋白质(例如蛋白A或蛋白G亲和层析法)的亲和层析法、离子交换层析法(例如阳离子交换(羧甲基树脂)、阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合模式交换层析法)、亲硫吸附(例如使用β-巯基乙醇和其它SH配体)、疏水相互作用或芳族吸附层析法(例如使用苯基琼脂糖、aza-arenophilic树脂或间-氨基苯基硼酸)、尺寸排阻层析法和制备电泳方法(例如凝胶电泳、毛细管电泳)。
免疫球蛋白的纯化方法通常包括多步骤层析部分。在第一个步骤中，通过亲和层析法(例如用蛋白A)从免疫球蛋白级分分离非免疫球蛋白多肽和蛋白质。然后可以进行离子交换层析法。最后，可以进行第三个层析步骤以从同类的多聚体和片段分离免疫球蛋白单体。有时聚集体的量高(5％或更多)且不可能在第三个纯化步骤中有效地分离它们，需要进一步的纯化步骤。
已经发现，用包含变性剂的溶液可以从离子交换层析材料回收多肽，所述离子交换层析材料包含已经连接有离子配体的交联的聚(苯乙烯-二乙烯基苯)基质，其中所述溶液的电导率在回收过程中保持恒定。该发现是非常惊人的，因为通常使用离子强度的增加来从离子交换层析材料回收多肽。同时，此层析材料具有足够的结合能力用于工业生产规模分离。
因此，本文报道的一个方面是，一种用于得到或纯化多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
-通过施加包含变性剂的溶液，从离子交换层析材料回收多肽，并由此得到或纯化多肽，
其中所述离子交换层析材料包含已经连接有离子配体的交联的聚(苯乙烯-二乙烯基苯)基质。
由于使用变性剂回收结合的多肽，施加于离子交换层析材料的包含多肽的溶液不含有变性剂。用包含变性剂(诸如脲或脲衍生物)和恒定电导率的溶液回收被保留在离子交换层析材料上的多肽。
因而，以结合和洗脱模式运行本文报道的方法，即首先使多肽与离子交换层析材料结合，此后，在另一个步骤中，从离子交换层析材料回收所述多肽。在本文报道的方法中可以包括间歇洗涤步骤。在这些洗涤步骤中，施加的溶液基本上不含有变性剂。术语“基本上不含有变性剂”表示，变性剂可以存在于施加的(洗涤)溶液中，但是其浓度低于从离子交换材料回收多肽所需的浓度。
在本文报道的方法中，除了用于从离子交换层析材料回收多肽的溶液以外，所有溶液度没有(即不含)变性剂。在一个实施方案中，所述包含变性剂的溶液是水溶液。在另一个实施方案中，所述包含变性剂的溶液不包含(即没有)有机溶剂和/或脂族醇。在另一个实施方案中，所述包含变性剂的溶液由水、变性剂、缓冲物质和任选的一种或两种或三种无机盐组成。
术语“变性剂”或“离液剂”在本申请中可以互换使用，表示使多肽从它的天然形式转化成非天然(即变性)形式的化合物。变性剂通常是离液剂。示例性的变性剂是脲和脲衍生物、胍和胍衍生物、四烷基铵盐、长链磺酸酯和高氯酸锂。
脲的加入(更精确地讲，脲的浓度的变化)不会影响溶液的电导率，即在加入脲或改变脲浓度以后，溶液的电导率保持恒定。
在一个实施方案中，所述变性剂是脲或脲衍生物。
在一个实施方案中，所述变性剂是脲。在一个实施方案中，所述脲具有4mol/l至9mol/l的浓度。
在一个实施方案中，所述变性剂是硫脲。在一个实施方案中，所述硫脲具有1.5mol/l至3mol/l的浓度。
在一个实施方案中，所述变性剂是2种或3种变性剂的混合物。在一个实施方案中，所述变性剂是脲和硫脲的混合物。在一个实施方案中，所述变性剂是脲和胍盐的混合物。
在本文报道的方面的一个实施方案中，用于纯化或得到多肽的方法包括以下步骤：
-将第一溶液施加于离子交换层析材料以产生经调节的离子交换层析材料，
-将包含多肽的第二溶液施加于经调节的离子交换层析材料，
-任选地，将第三溶液施加于所述离子交换层析材料，
-用包含变性剂的第四溶液从所述离子交换层析材料回收并从而纯化或得到多肽。
所述第一和第二溶液基本上不含有变性剂。所述第三溶液基本上不含有变性剂。
可以在真核和原核细胞(诸如CHO细胞、HEK细胞和大肠杆菌)中重组生产多肽。如果在原核细胞中生产多肽，通常以不溶性包涵体的形式得到多肽。可容易地从原核细胞和培养基回收包涵体。在可以进行纯化和/或重折叠操作之前，必须使在包涵体中得到的不可溶形式的多肽溶解。
因而，本文报道的第二方面是，一种用于生产多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
-培养原核或真核细胞，所述细胞包含编码所述多肽的核酸，
-从原核或真核细胞或/和培养基回收多肽，
-任选地，如果以包涵体的形式回收多肽，则溶解和/或重折叠所述多肽，
-用本文报道的离子交换层析法纯化所述多肽，并由此生产多肽。
在一个实施方案中，所述离子交换层析法包括以下步骤：
-将第一溶液施加于离子交换层析材料以产生经调节的离子交换层析材料，
-将包含多肽的第二溶液施加于经调节的离子交换层析材料，
-任选地，将第三溶液(洗涤步骤)施加于所述离子交换层析材料，
-用包含一种或多种变性剂的第四溶液从所述离子交换层析材料回收并从而生产所述多肽，
其中第一至第三溶液不含有变性剂。
下面呈现如上报道的全部方面的不同实施方案。
在一个实施方案中，所述第一溶液包含第一缓冲物质，所述第二溶液包含第二缓冲物质，所述第三溶液包含第三缓冲物质，所述第四溶液包含第四缓冲物质，其中所述第四缓冲物质包含一种或多种变性剂。
在一个实施方案中，所述第二缓冲物质和所述第三缓冲物质和所述第四缓冲物质都是不同的缓冲物质。
在一个实施方案中，所述第一溶液和/或所述第二溶液和/或所述第三溶液不含有变性剂。在一个实施方案中，所述第三溶液基本上不含有变性剂。
在一个实施方案中，所述第一溶液的施加进行3-20个柱体积。在一个实施方案中，所述第一溶液的施加进行3-10个柱体积。
在一个实施方案中，所述第二溶液的施加进行1-10个柱体积。
在一个实施方案中，所述第三溶液的施加进行1-10个柱体积。
在第一步骤中用缓冲溶液调节离子交换层析材料。该溶液不含有(即不包含)变性剂。调节性的第一缓冲溶液的缓冲物质可以与包含多肽的第二溶液的缓冲物质相同或不同。
此后，将包含多肽的第二溶液施加于经调节的离子交换层析材料。在该步骤中，多肽被保留在离子交换层析材料上。该溶液不包含变性剂。加载性的(即第二)缓冲溶液的缓冲物质可以与第三溶液的缓冲物质相同或不同。
在给离子交换层析材料加载多肽以后，任选地可以将洗涤性的(即第三)溶液施加于加载的离子交换层析材料。该溶液基本上不含有变性剂。
最后，为了从离子交换层析材料回收多肽，将包含一种或多种变性剂的回收性的(即第四)溶液施加于层析材料。
在一个实施方案中，所述纯化或得到多肽的方法是柱层析法。
在一个实施方案中，所述回收步骤中的溶液的电导率是恒定的。
在一个实施方案中，所述回收步骤中的溶液的pH值是恒定的。
在不同步骤中施加于离子交换层析材料的体积彼此独立地是3-20个柱体积，在一个实施方案中，是4-10个柱体积。
在一个实施方案中，所述离子交换层析材料由用官能团衍生化的聚苯乙烯二乙烯基苯制成。在一个实施方案中，所述阴离子交换层析材料是用季铵化的聚乙烯亚胺官能团衍生化的聚苯乙烯二乙烯基苯。在一个实施方案中，所述阳离子交换层析材料是用磺丙基官能团衍生化的聚苯乙烯二乙烯基苯。
在下面用在WO 2012/028526中报道的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白和在WO2012/007495中报道的抗-TSLP受体抗体举例说明了本文报道的方法。
提供以下实施例和附图以帮助理解本发明，本发明的真实范围在所附权利要求书中阐述。应当理解，可以在不脱离本发明的精神的情况下对所述操作进行修改。
附图说明
图1.使用氯化钠电导率梯度在阴离子交换层析柱上纯化SEQ ID NO：01的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白的层析图。
图2.使用具有恒定电导率和恒定pH值的脲梯度在阴离子交换层析柱上纯化SEQID NO：01的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白的层析图。
图3.使用具有恒定电导率和恒定pH值的脲梯度在阴离子交换层析柱上纯化SEQID NO：02的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白的层析图。
图4.使用脲洗涤、异丙醇洗涤和盐酸胍梯度洗脱在阴离子交换层析柱上纯化SEQID NO：01的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白的层析图。
图5.使用脲洗涤、盐酸胍洗涤和氯化钠梯度洗脱在阴离子交换层析柱上纯化SEQID NO：01的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白的层析图。
图6.使用脲洗涤、盐酸胍洗涤和氯化钠梯度洗脱在阴离子交换层析柱上纯化SEQID NO：02的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白的层析图。
图7.使用具有恒定电导率和恒定pH值的脲梯度在阳离子交换层析柱上纯化SEQID NO：01的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白的层析图。
图8.使用Tris缓冲液洗涤和脲梯度洗脱在阴离子交换层析柱上纯化抗-TSLP受体抗体的层析图。
实施例1
材料和方法：
除非另有说明，根据层析材料制造商的手册进行不同的层析法。
重组DNA技术：
用标准方法操作DNA，如Sambrook，J.，等人，Molecular Cloning：A LaboratoryManual；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)所述。根据制造商的说明书，使用分子生物学试剂。
蛋白质确定：
通过使用320nm的参考波长使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数确定在280nm处的光密度(OD)，确定蛋白质浓度。
尺寸排阻-HPLC：
用Tosoh Haas TSK 3000 SWXL柱在ASI-100HPLC系统(Dionex，Idstein，德国)上进行层析法。通过UV二极管阵列检测器(Dionex)在280nm监测洗脱峰。在将浓缩的样品溶解到1mg/ml后，用由200mM磷酸二氢钾和250mM氯化钾组成的pH7.0的缓冲液洗涤柱，直到达到稳定的基线。在等度条件下用0.5ml/min的流速在室温下进行分析运行30min。使用Chromeleon(Dionex，Idstein，德国)人工积分层析图。
反相HPLC(RP-HPLC)：
通过RP-HPLC分析纯度。使用乙腈/TFA水溶液梯度在Phenomenex C18柱上进行测定。监测洗脱谱作为在215nm处的UV吸光度。基于洗脱的蛋白质的总峰面积，计算洗脱的物质的百分比。
DNA-阈值-系统：
参见例如Merrick，H.，和Hawlitschek，G.，Biotech Forum Europe9(1992)398-403。
宿主细胞蛋白质确定：
用血清白蛋白和抗生蛋白链菌素的混合物包被微量滴定板的孔壁。将源自山羊的抗HCP多克隆抗体结合到微量滴定板的孔壁。在洗涤步骤后，用不同浓度的HCP校准序列和样品溶液温育微量滴定板的不同孔。在温育后，通过用缓冲溶液洗涤来除去未结合的样品材料。为了检测，用抗体过氧化物酶缀合物温育孔，以检测结合的宿主细胞蛋白质。通过与ABTS温育并在405nm检测，检测固定的过氧化物酶活性。
DNA确定：
将生物素结合到微量滴定板。加入抗生蛋白链菌素、单链DNA和生物素化的单链DNA结合蛋白的反应混合物。结合蛋白能结合DNA，并被生物素化。以此方式，可能从样品混合物特异性地除去DNA。抗生蛋白链菌素结合微量滴定板上的生物素以及与单链DNA结合蛋白偶联的生物素。向此总复合物加入与脲酶偶联的DNA特异性抗体。脲的加入会导致脲水解，这会引起pH的局部变化。可以将此变化检测为以改变的表面电势。表面电势的变化与结合的DNA的量成比例。通过蛋白水解酶K消化和用SDS变性，得到单链DNA。
用于分离、溶解和重折叠得自包涵体的多肽的一般方法：
除了在引用的文献中进行的方法以外，例如可以根据Rudolph，等人(Rudolph，R.，等人，Folding Proteins，见：Creighton，T.E，(编)：Protein function：A PracticalApproach，Oxford University Press(1997)57-99)的方法进行包涵体的制备。在-70℃储存包涵体。同样可以根据Rudolph，等人(Rudolph，R.，等人，Folding Proteins，见：Creighton，T.E.，(编)：Protein function：A Practical Approach，Oxford UniversityPress(1997)57-99)的方法进行包涵体的溶解。
实施例2(对比实施例)
使用氯化钠电导率梯度在阴离子交换层析柱上纯化SEQ ID NO：01的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白
树脂：HQ
载荷：443mg多肽
柱载荷：30mg/ml
洗脱方法：0M至1M氯化钠线性梯度
结果：
从图1可以看出不可在确定的峰中得到融合蛋白。分析结果显示在下表中。
表.
实施例3
使用具有恒定电导率和恒定pH值的脲梯度在阴离子交换层析柱上纯化SEQ IDNO：01的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白
树脂：HQ
载荷：366mg多肽
柱载荷：24.8mg/ml
洗脱方法：0M至6M脲的线性梯度
结果：
从图2可以看出可以在确定的峰中得到融合蛋白。分析结果显示在下表中。
表.
实施例4
使用具有恒定电导率和恒定pH值的脲梯度在阴离子交换层析柱上纯化SEQ IDNO：02的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白
树脂：HQ
洗脱方法：0M至6M脲的线性梯度
结果：
从图3可以看出，可以在确定的峰中得到融合蛋白。分析结果显示在下表中。
表.
实施例5(对比实施例)
使用脲洗涤、异丙醇洗涤和盐酸胍梯度洗脱在阴离子交换层析柱上纯化SEQ IDNO：01的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白
树脂：Q-FF(GE Healthcare)
载荷：281mg多肽
柱载荷：15mg/ml
平衡：30mM磷酸钾缓冲液pH8.0；5.94mS/cm
脲洗涤：6M脲溶液pH8.0；435μS/cm
2-丙醇洗液：20％(v/v)2-丙醇
洗脱溶液：6M盐酸胍pH8.0；LF=278mS/cm
洗涤步骤：用5个柱体积的6M脲溶液洗涤；
用5个柱体积的20％2-丙醇洗涤
洗脱方法：0M至6M盐酸胍的线性梯度，用10个柱体积
结果：
从图4可以看出，在洗涤步骤中用脲溶液和2-丙醇溶液不可以得到融合蛋白。使用盐酸胍溶液仅可以影响洗脱。
实施例6(对比实施例)
使用脲洗涤、盐酸胍洗涤和氯化钠梯度洗脱在阴离子交换层析柱上纯化SEQ IDNO：01的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白
树脂：Q-FF(GE Healthcare)
载荷：280mg多肽
柱载荷：20mg/ml
平衡：30mM磷酸钾缓冲液pH8.0；5.9mS/cm
脲洗涤：6M脲溶液pH8.0；435μS/cm
盐酸胍溶液：0.1M盐酸胍pH8.0
洗脱溶液：在50mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)中的1M氯化钠；91.7mS/cm
洗涤步骤：用5个柱体积的6M脲溶液洗涤；
用5个柱体积的0.1M盐酸胍溶液洗涤
洗脱方法：0M至1M氯化钠的线性梯度，用10个柱体积
结果：
从图5可以看出，在每个洗涤步骤中，仅可以得到小部分融合蛋白。分析结果显示在下表中。
表.
n.d.=未测出
实施例7(对比实施例)
使用脲洗涤、盐酸胍洗涤和氯化钠梯度洗脱在阴离子交换层析柱上纯化SEQ IDNO：02的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白
树脂：Q-FF(GE Healthcare)
载荷：239mg多肽
柱载荷：15mg/ml
平衡：30mM磷酸钾缓冲液pH8.0；5.9mS/cm
脲洗涤：6M脲溶液pH8.0
盐酸胍溶液：0.1M盐酸胍pH8.0
洗脱溶液：在20mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)中的0.35M氯化钠
洗涤步骤：使用4个柱体积的6M脲溶液洗涤；
使用4个柱体积的0.1M盐酸胍溶液洗涤
洗脱方法：使用0.35M氯化钠不连续洗脱7个柱体积
结果：
从图6可以看出，在每个洗涤步骤中，仅可以得到小部分融合蛋白。3次运行的分析结果显示在下表中。
表.
n.d.=未测出
实施例8a
使用具有恒定电导率和恒定pH值的脲梯度在阳离子交换层析柱上纯化SEQ IDNO：01的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白
树脂：HS
载荷：5.58g多肽
洗液1：50mM甲酸钠，调节至pH3.0
洗液2：1M氯化钠，30mM磷酸钾缓冲液，调节至pH8.0
洗液3：30mM磷酸钾缓冲液，调节至pH8.0
洗脱溶液：在10mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)中的6M脲
洗脱方法：用洗液1进行3个柱体积，
用洗液2进行20个柱体积，
用洗液3进行5个柱体积，
用0M至6M脲的线性梯度进行10个柱体积
结果：
从图7可以看出，可以在确定的峰中得到融合蛋白。分析结果显示在下表中。
表.
实施例8b
使用具有恒定电导率和恒定pH值的脲梯度在阳离子交换层析材料上、随后用阴离子交换层析柱纯化SEQ ID NO：01的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白
树脂：HQ
载荷：在实施例8a(参见上文)中得到的3.19g多肽
结果：
第二个层析步骤的分析结果显示在下表中。
表.
实施例9
使用Tris缓冲液洗涤和脲梯度洗脱在阴离子交换层析柱上纯化抗-TSLP受体抗体
树脂：HQ
载荷：189mg多肽
Tris洗液：含有10mM氯化钠的5mM Tris缓冲液pH8.4；4mS/cm
洗脱溶液：含有10mM氯化钠和6M脲的5mM Tris缓冲液pH8.4；4mS/cm
洗涤步骤：用3个柱体积的Tris缓冲溶液洗涤
洗脱方法：0M至6M脲的线性梯度，用30个柱体积
结果：
从图8可以看出，能够获得抗体。

Claims (33)

1.纯化多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
-在恒定电导率和恒定pH下用包含变性剂梯度的溶液从离子交换层析材料回收所述多肽，并由此纯化所述多肽，特征在于所述变性剂是脲或脲衍生物，
其中所述离子交换层析材料包含已经连接有离子配体的交联的聚(苯乙烯-二乙烯基苯)基质，
其中所述多肽具有选自SEQ ID NO:01、SEQ ID NO:02、SEQ ID NO:03和SEQ ID NO:04的氨基酸序列的组的氨基酸序列。
2.生产多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
-培养原核或真核细胞，所述细胞包含编码所述多肽的核酸，
-从细胞或/和培养基回收所述多肽，
-用包含以下步骤的离子交换层析法纯化所述多肽
-在恒定电导率和恒定pH下用包含变性剂梯度的溶液从离子交换层析材料回收所述多肽，并由此生产多肽，特征在于所述变性剂是脲或脲衍生物，
其中所述离子交换层析材料包含已经连接有离子配体的交联的聚(苯乙烯-二乙烯基苯)基质，
其中所述多肽具有选自SEQ ID NO:01、SEQ ID NO:02、SEQ ID NO:03和SEQ ID NO:04的氨基酸序列的组的氨基酸序列。
3.通过离子交换层析法以结合和洗脱模式得到或纯化多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
-通过施加包含变性剂梯度的溶液，在恒定电导率和恒定pH下从离子交换层析材料回收多肽，并由此得到或纯化所述多肽，特征在于所述变性剂是脲或脲衍生物，
其中所述离子交换层析材料包含已经连接有离子配体的交联的聚(苯乙烯-二乙烯基苯)基质，
其中所述多肽具有选自SEQ ID NO:01、SEQ ID NO:02、SEQ ID NO:03和SEQ ID NO:04的氨基酸序列的组的氨基酸序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述变性剂是脲。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述脲具有4mol/l至9mol/l的浓度。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述变性剂是硫脲。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述硫脲具有1.5mol/l至3mol/l的浓度。
8.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述变性剂是2种或3种变性剂的混合物。
9.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述变性剂是脲和硫脲的混合物。
10.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，在洗涤步骤中施加的溶液具有恒定的电导率。
11.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，在所述回收中施加的溶液具有恒定的pH值。
12.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，在洗涤步骤中施加的溶液具有恒定的pH值。
13.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
-将包含天然形式多肽的溶液施加于离子交换层析材料，和
-通过施加包含变性剂梯度的溶液，在恒定电导率和恒定pH下从离子交换层析材料回收所述多肽，并由此得到或纯化所述多肽，特征在于所述变性剂是脲或脲衍生物。
14.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述多肽是抗体、或抗体片段、或包含至少一个抗体结构域的融合多肽。
15.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述离子交换层析材料是阳离子交换层析材料。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述离子配体是磺丙基配体或羧甲基配体。
17.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述离子交换层析材料是阴离子交换层析材料。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述离子配体是乙烯亚胺配体或季铵化的配体。
19.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
-通过施加包含变性剂的溶液，从第一离子交换层析材料回收所述多肽，
-将所述回收的多肽施加于第二离子交换层析材料，和
-通过施加包含变性剂的溶液，从所述第二离子交换层析材料回收多肽，并由此得到或纯化所述多肽。
20.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述包含变性剂的溶液以线性梯度使用。
21.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述包含变性剂的溶液以至少0M变性剂到至多9M变性剂的线性梯度使用。
22.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，
所述第一离子交换层析材料是阴离子交换层析材料，并且所述第二离子交换层析材料是阳离子交换层析材料，或
所述第一离子交换层析材料是阳离子交换层析材料，并且所述第二离子交换层析材料是阴离子交换层析材料。
23.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，在施加于所述第二离子交换层析材料之前，将所述回收的多肽重折叠。
24.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述纯化包括以下步骤：
-将第一溶液施加于所述离子交换层析材料，
-将包含所述多肽的第二溶液施加于所述离子交换层析材料，和
-用包含变性剂的第四溶液回收并由此生产或纯化所述多肽，
其中所述第一溶液包含第一缓冲物质，所述第二溶液包含第二缓冲物质，并且所述第四溶液包含第四缓冲物质，其中所述第四缓冲物质包含变性剂。
25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，在施加所述第二溶液以后和施加所述第四溶液之前，包括以下步骤：
-将第三溶液施加于所述离子交换层析材料，
其中所述第三溶液包含第三缓冲物质。
26.根据权利要求24-25中任一项所述的方法，其特征在于，所述第二缓冲物质和所述第三缓冲物质和所述第四缓冲物质都是不同的缓冲物质。
27.根据权利要求24-25中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一溶液和/或所述第二溶液和/或所述第三溶液不含有变性剂。
28.根据权利要求24-25中任一项所述的方法，其特征在于，所述第三溶液基本上不含有变性剂。
29.根据权利要求24-25中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一溶液的施加进行3-20个柱体积。
30.根据权利要求24-25中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一溶液的施加进行3-10个柱体积。
31.根据权利要求24-25中任一项所述的方法，其特征在于，所述第二溶液的施加进行1-10个柱体积。
32.根据权利要求24-25中任一项所述的方法，其特征在于，所述第三溶液的施加进行1-10个柱体积。
33.脲或脲衍生物梯度在恒定电导率和恒定pH下从离子交换层析材料回收多肽中的用途，所述离子交换层析材料包含交联的聚(苯乙烯-二乙烯基苯)基质，其中所述多肽具有选自SEQ ID NO:01、SEQ ID NO:02、SEQ ID NO:03和SEQ ID NO:04的氨基酸序列的组的氨基酸序列。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2014108240A (ru) 2011-08-25 2015-09-27 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Укороченный тетранектин-аполипопротеин а-i гибридный белок, содержащая его липидная частица и их применения
CN103980351B (zh) * 2014-05-27 2016-05-18 上海第一生化药业有限公司 加压素、加压素鞣酸盐的制备方法
EP3591574A3 (en) * 2018-07-06 2020-01-15 Universität Zürich Method and computer program for clustering large multiplexed spatially resolved data of a biological sample
CN109851667A (zh) * 2018-12-29 2019-06-07 江苏万邦医药科技有限公司 一种德谷胰岛素前体的纯化方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004026251A2 (en) * 2002-09-20 2004-04-01 Pharmacia Corporation Process for decreasing aggregate levels of pegylated protein
WO2008002235A1 (en) * 2006-06-30 2008-01-03 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Protein purification and identification

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2629568C3 (de) * 1976-07-01 1981-09-10 Hoechst Ag, 6000 Frankfurt Verfahren zur Reinigung von Insulin, seinen Analogen und Derivaten
AU5397579A (en) 1978-12-26 1980-07-03 Eli Lilly And Company Purifying insulin
US5118796A (en) 1987-12-09 1992-06-02 Centocor, Incorporated Efficient large-scale purification of immunoglobulins and derivatives
DE4118912C1 (zh) 1991-06-08 1992-07-02 Biotest Pharma Gmbh, 6072 Dreieich, De
DE4124896C1 (zh) 1991-07-26 1993-01-21 Eloma Gmbh Bedarfsartikel Zur Gemeinschaftsverpflegung, 8031 Maisach, De
US5463029A (en) * 1992-11-23 1995-10-31 Immunex Corporation Purification of fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3
US6451987B1 (en) 1999-03-15 2002-09-17 Novo Nordisk A/S Ion exchange chromatography of proteins and peptides
EP1335938B1 (en) 2000-11-10 2010-09-22 F. Hoffmann-La Roche Ltd. Apolipoprotein construct
EP1501369B1 (en) * 2002-04-26 2015-06-24 Genentech, Inc. Non-affinity purification of proteins
US20040048315A1 (en) * 2002-08-28 2004-03-11 Pharmacia Corporation Method for the preparation of growth hormone and antagonist thereof having lower levels of isoform impurities thereof
ES2527616T3 (es) 2002-09-11 2015-01-27 Genentech, Inc. Purificación de anticuerpos anti-HER2
GB0224082D0 (en) 2002-10-16 2002-11-27 Celltech R&D Ltd Biological products
WO2007108955A1 (en) * 2006-03-20 2007-09-27 Medarex, Inc. Protein purification
CN100586958C (zh) 2006-12-20 2010-02-03 上海莱士血液制品股份有限公司 高纯度载脂蛋白a-i的制备方法
US8013122B2 (en) * 2006-12-20 2011-09-06 Kieu Hoang Method of purifying apolipoprotein A-1
AU2009324204B2 (en) * 2008-12-02 2014-10-16 Novo Nordisk Health Care Ag Polypeptide purification
NZ602971A (en) * 2010-04-23 2014-11-28 Serum Inst India Ltd Simple method for simultaneous removal of multiple impurities from culture supernatants to ultralow levels
WO2012007495A1 (en) 2010-07-15 2012-01-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies specifically binding to human tslpr and methods of use
KR20130117760A (ko) 2010-08-30 2013-10-28 에프. 호프만-라 로슈 아게 테트라넥틴-아포지단백질 a-i 입자의 제조 방법, 이에 의해 제조된 지질 입자 및 이의 용도
WO2012028523A2 (en) 2010-08-30 2012-03-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Prokaryotic expression construct
RU2013112562A (ru) 2010-08-30 2014-10-10 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Тетранектин-аполипопротеин а-i, содержащие его липидные частицы и его применение
RU2631001C2 (ru) 2010-08-30 2017-09-15 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Способ получения полипептида

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004026251A2 (en) * 2002-09-20 2004-04-01 Pharmacia Corporation Process for decreasing aggregate levels of pegylated protein
WO2008002235A1 (en) * 2006-06-30 2008-01-03 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Protein purification and identification

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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The Chromatography of Insulin in Urea-containing Buffer;COLE R. DAVID;《JBC》;19601231;第235卷(第8期);第2294页、图4、讨论和梗概部分

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