KR20140062044A - 양이온 및 음이온 교환 크로마토그래피 방법 - Google Patents

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KR20140062044A
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미카엘라 메어
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에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

본 발명은 i) 폴리펩타이드를 포함하는 용액을 이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하고, ii) 상기 폴리펩타이드를, 변성제를 포함하는 용액으로 회수하고 이에 의해 상기 폴리펩타이드를 정제시키는 단계를 포함하며, 이때 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질이 이온성 리간드가 결합된 가교결합된 폴리(스타이렌-다이비닐벤젠)의 기질을 포함하고, 여기에서 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용된 상기 폴리펩타이드를 포함하는 용액에 변성제가 없고, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질에 흡착된 폴리펩타이드를 일정한 전도도로, 변성제를 포함하는 용액으로 회수하는 폴리펩타이드의 정제 방법을 보고한다.

Description

양이온 및 음이온 교환 크로마토그래피 방법{CATION AND ANION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY METHOD}
본 발명은 변성제를 포함하는 용액으로 이온 크로마토그래피 물질로부터 폴리펩타이드를 용리시킴에 의한 상기 폴리펩타이드의 정제를 위한 이온 교환 크로마토그래피 방법을 보고한다.
단백질은 오늘날의 의료 포트폴리오에 중요한 역할을 한다. 재조합 폴리펩타이드의 생산을 위한 발현 시스템들은 최첨단 기술 수준으로 널리 공지되어 있다. 약학적 용도에 사용하기 위한 폴리펩타이드는 주로 원핵생물 세포, 예를 들어 에스케리키아 콜라이, 및 포유동물 세포, 예를 들어 CHO 세포, NS0 세포, Sp2/0 세포, COS 세포, HEK 세포, BHK 세포, PER.C6(등록상표) 세포 등에서 생산된다.
인간 용도의 경우 모든 약학 물질은 명백한 기준을 충족해야 한다. 인간에 대한 생물약제의 안전성을 보장하기 위해서, 예를 들어 심각한 위해를 일으킬 수 있는 핵산, 바이러스 및 숙주 세포 단백질들은 제거되어야 한다. 규제 명세서를 충족하기 위해서, 상기 제조 공정에 하나 이상의 정제 단계가 뒤따라야 한다. 다른 것들 중에서도, 순도, 처리량 및 수율은 적합한 정제 공정을 결정하는데 중요한 역할을 한다.
단백질 정제를 위한 다양한 방법들, 예를 들어 미생물 단백질에 의한 친화성 크로마토그래피(예를 들어 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피), 이온 교환 크로마토그래피(예를 들어 양이온 교환(설포프로필 또는 카복시메틸 수지), 음이온 교환(아미노 에틸 수지) 및 혼합된 방식의 이온 교환), 호황성(thiophilic) 흡착(예를 들어 베타-머캅토에탄올 및 다른 SH 리간드), 소수성 상호작용 또는 방향족 흡착 크로마토그래피(예를 들어 페닐-세파로스, 아자-아레노필릭 수지, 또는 m-아미노페닐보론산), 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피(예를 들어 Ni(II)- 및 Cu(II)-친화성 물질), 크기 배제 크로마토그래피, 및 전기영동 방법(예를 들어 젤 전기영동, 모세관 전기영동)이 잘 확립되어 있으며 광범위하게 사용되고 있다(예를 들어 문헌[Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102]을 참조하시오).
넥시나 알(Necina, R.) 등(문헌[Biotechnol. Bioeng. 60 (1998) 689-698])은 높은 전하 밀도를 나타내는 이온 교환 매질에 의해 세포 배양 상등액으로부터 인간 단클론 항체를 직접 포획함을 보고하였다. WO 89/05157은 세포 배양 배지에 양이온 교환 처리를 직접 가함으로써 생성물 면역글로불린을 정제시키는 방법을 보고한다. 마우스 복수로부터의 단클론 IgG 항체의 1-단계 정제가 문헌[Danielsson, A., et al., J. Immun. Meth. 115 (1988) 79-88]에 개시되어 있다. 구배 세척을 사용하여 하나 이상의 오염물질로부터 관심 폴리펩타이드를 분리시키는 이온 교환 크로마토그래피에 의한 폴리펩타이드의 정제 방법이 WO 2004/024866에 보고되어 있다. EP 0 530 447에서 3 개의 크로마토그래피 단계들의 조합에 의한 IgG 단클론 항체의 정제 방법을 보고한다. 왕(Wang) 등(문헌[Wang, H., et al., Peptides 26 (2005) 1213-1218])은 2-단계 양이온 교환 크로마토그래피에 의한, 에스케리키아 콜라이에서 발현된 hTFF3의 정제를 보고한다.
WO 2010/063717에서 폴리펩타이드 정제를 보고한다. 단백질 정제 및 확인이 WO 2008/002235에 보고되어 있다. 콜(Cole, D.R.,)은 유레아-함유 완충제 중의 인슐린의 크로마토그래피를 보고한다(문헌[J. Biol. Chem. 235 (1960) 2294-2299]). 미국특허 제 4,129,560 호에서, 비-이온성 세제를 사용하는 고분자량 펩타이드의 정제 방법을 보고한다. 성장 호르몬 및 보다 낮은 수준의 그의 동형 불순물을 갖는 그의 길항물질의 제조 방법이 WO 2004/031213에 보고되어 있다. 미국특허 제 6,451,987 호에서 단백질 및 펩타이드의 이온 교환 크로마토그래피를 보고한다. 인슐린의 정제 방법 및 그렇게 제조된 인슐린이 EP 0 013 826에 보고되어 있다.
폴리펩타이드를 변성제/카오트로픽제(chaotropic agent)를 포함하는 용액에 의해 이온 교환 크로마토그래피 물질(양이온 및/또는 음이온 교환 크로마토그래피 물질)로부터 회수할 수 있으며, 이때 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하는 동안 상기 적용되는 용액의 전도도가 일정하게 유지되는 것으로, 즉 상기 전도도가 일정하게 지속되는 것으로 밝혀졌다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 하기의 단계를 포함하는 결합-및-용리 방식으로 이온 교환 크로마토그래피에 의해 폴리펩타이드를 수득하거나 정제하는 방법을 보고한다:
- 변성제를 포함하는 용액을 적용시킴으로써 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하고 이에 의해 상기 폴리펩타이드를 수득하거나 정제하며,
이때 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 이온성 리간드들이 결합된 가교결합된 폴리(스타이렌-다이비닐벤젠)의 기질을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 방법은 하기의 단계들을 포함한다:
- 변성제를 포함하는 용액을 적용시킴으로써 상기 폴리펩타이드를 제 1 이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 회수하고,
- 상기 회수된 폴리펩타이드를 제 2 이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용시키고,
- 변성제를 포함하는 용액을 적용시킴으로써 상기 제 2 이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하고 이에 의해 상기 폴리펩타이드를 수득하거나 정제한다.
하나의 실시태양에서, 상기 제 1 이온 교환 크로마토그래피 물질은 음이온 교환 크로마토그래피 물질이고 상기 제 2 이온 교환 크로마토그래피 물질은 양이온 교환 크로마토그래피 물질이다.
하나의 실시태양에서, 상기 제 1 이온 교환 크로마토그래피 물질은 양이온 교환 크로마토그래피 물질이고 상기 제 2 이온 교환 크로마토그래피 물질은 음이온 교환 크로마토그래피 물질이다.
하나의 실시태양에서, 상기 변성제는 유레아 또는 유레아-유도체이다.
하나의 실시태양에서, 상기 변성제는 2 개 또는 3 개의 변성제들의 혼합물이다.
하나의 실시태양에서, 상기 회수에 적용되는 용액은 일정한 전도도를 갖는다.
하나의 실시태양에서, 상기 세척 단계에 적용되는 용액은 일정한 전도도를 갖는다.
하나의 실시태양에서, 상기 회수에 적용되는 용액은 일정한 pH-값을 갖는다.
하나의 실시태양에서, 상기 세척 단계에 적용되는 용액은 일정한 pH-값을 갖는다.
하나의 실시태양에서 상기 방법은 하기의 단계들을 포함한다:
- 고유한 형태의 상기 폴리펩타이드를 포함하는 용액을 이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용시키고,
- 변성제를 포함하는 용액을 적용시킴으로써 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하고 이에 의해 상기 폴리펩타이드를 수득하거나 정제한다.
하나의 실시태양에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 양이온 교환 크로마토그래피 물질이다. 하나의 실시태양에서 상기 리간드는 설포프로필 또는 카복시메틸이다.
하나의 실시태양에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 음이온 교환 크로마토그래피 물질이다. 하나의 실시태양에서, 상기 리간드는 폴리에틸렌이민 또는 4급화된 에틸렌이민이다.
하나의 실시태양에서, 상기 폴리펩타이드는 항체, 또는 항체 단편, 또는 하나 이상의 항체 도메인을 포함하는 융합 폴리펩타이드이다.
하나의 실시태양에서, 상기 폴리펩타이드는 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 융합 단백질이다. 하나의 실시태양에서, 상기 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 융합 단백질은 서열번호 01, 또는 서열번호 02, 또는 서열번호 03 또는 서열번호 04의 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 하기의 단계들을 포함하는 폴리펩타이드의 생산 방법이다:
- 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 원핵생물 또는 진핵생물 세포를 배양하고,
- 상기 세포 또는/및 배양 배지로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하고,
- 상기 폴리펩타이드가 봉입체의 형태로 회수되는 경우 상기 폴리펩타이드를 용해시키고/시키거나 리폴딩시키고,
- 상기 폴리펩타이드를 본 발명에 보고된 바와 같은 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제시키고 이에 의해 상기 폴리펩타이드를 생산한다.
도 1은 염화 나트륨 전도도 구배에 의한, 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼 상에서의 서열번호 01의 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 융합 단백질의 정제에 대한 크로마토그램이다.
도 2는 일정한 전도도 및 일정한 pH-값에서 유레아 구배에 의한, 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼 상에서의 서열번호 01의 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 융합 단백질의 정제에 대한 크로마토그램이다.
도 3은 일정한 전도도 및 일정한 pH-값에서 유레아 구배에 의한, 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼 상에서의 서열번호 02의 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 융합 단백질의 정제에 대한 크로마토그램이다.
도 4는 유레아 세척, 아이소프로판올 세척 및 구아니디늄 하이드로클로라이드 구배 용리에 의한, 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼 상에서의 서열번호 01의 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 융합 단백질의 정제에 대한 크로마토그램이다.
도 5는 유레아 세척, 구아니디늄 하이드로클로라이드 세척 및 염화 나트륨 구배 용리에 의한, 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼 상에서의 서열번호 01의 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 융합 단백질의 정제에 대한 크로마토그램이다.
도 6은 유레아 세척, 구아니디늄 하이드로클로라이드 세척 및 염화 나트륨 구배 용리에 의한, 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼 상에서의 서열번호 02의 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 융합 단백질의 정제에 대한 크로마토그램이다.
도 7은 일정한 전도도 및 일정한 pH-값에서 유레아 구배에 의한, 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼 상에서의 서열번호 01의 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 융합 단백질의 정제에 대한 크로마토그램이다.
도 8은 트리스 완충제 세척 및 유레아 구배 용리에 의한, 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼 상에서의 항-TSLP 수용체 항체의 정제에 대한 크로마토그램이다.
본 발명은 폴리펩타이드의 정제를 위한, 결합-및-용리 방식으로 수행되는 규모 조절이 가능한 이온 교환 크로마토그래피 방법을 보고하며, 여기에서 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 상기 폴리펩타이드의 회수는 변성제를 포함하는 용액에 의하며, 상기 회수 단계에 사용된 용액의 전도도는 일정하게 유지된다.
"에 적용하는"이란 용어 및 그의 문법적 상당 어구는 정제하고자 하는 관심 물질을 함유하는 용액을 정지상과 접촉되게 하는 정제 방법의 부분적인 단계를 나타낸다. 이는 a) 상기 용액을 상기 정지상이 배치된 크로마토그래피 장치에 가하거나, 또는 b) 정지상을 상기 관심 물질을 포함하는 용액에 가함을 나타낸다. a)의 경우에, 상기 정제하고자 하는 관심 물질을 함유하는 용액을 상기 정지상에 통과시켜 상기 정지상과 상기 용액 중의 물질간의 상호작용을 허용한다. 상기 용액 중 일부 물질은 조건, 예를 들어 pH, 전도도, 염 농도, 온도 및/또는 유속에 따라 상기 정지상에 결합하며, 따라서 상기 용액으로부터 제거된다. 다른 물질들은 용액 중에 남아있는다. 상기 용액 중에 남아있는 물질들은 통과액 중에서 발견될 수 있다. 상기 "통과액"은 그의 기원에 관계없이 상기 크로마토그래피 장치의 통과 후 수득된 용액을 나타낸다. 상기 통과액은 상기 컬럼의 플러싱에 사용되거나 또는 상기 정지상에 결합된 하나 이상의 물질의 용리를 일으키기 위해 사용되는, 관심 물질 또는 완충제를 함유하는 상기 적용된 용액일 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 크로마토그래피 장치는 컬럼 또는 카세트이다. 상기 관심 물질을 당해 분야의 숙련가에게 친숙한 방법, 예를 들어 침전, 염석, 한외여과, 투석, 동결건조, 친화성 크로마토그래피, 또는 용매 부피 감소에 의해 상기 정제 단계 후에 상기 용액으로부터 회수하여, 정제되거나 또는 심지어 실질적으로 동질 형태의 관심 물질을 수득할 수 있다. b)의 경우에, 상기 정지상을, 예를 들어 고체로서 상기 정제하고자 하는 관심 물질을 함유하는 용액에 가하여 상기 정지상과 상기 용액 중 물질 간의 상호작용을 허용한다. 상기 상호작용 후에 상기 정지상을, 예를 들어 여과에 의해 제거하며, 상기 관심 물질은 상기 정지상에 결합되어 상기 정지상과 함께 상기 용액으로부터 제거되거나 또는 상기 정지상과 결합되지 않고 상기 용액 중에 남아있는다.
본 출원 내에 사용된 바와 같은 "완충된"이란 용어는 산성 또는 염기성 물질의 첨가 또는 방출로 인한 pH의 변화를 완충제 물질에 의해 평형화 한 용액을 나타낸다. 상기와 같은 효과를 생성시키는 임의의 완충제 물질을 사용할 수 있다. 하나의 실시태양에서 상기 완충제 물질을 인산 또는 그의 염, 아세트산 또는 그의 염, 시트르산 또는 그의 염, 모폴린, 2-(N-모폴리노)에탄설폰산 또는 그의 염, 이미다졸 또는 그의 염, 히스티딘 또는 그의 염, 글리신 또는 그의 염, 및 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(TRIS) 또는 그의 염 중에서 선택한다. 하나의 실시태양에서 상기 완충제 물질을 이미다졸 또는 그의 염 및 히스티딘 또는 그의 염 중에서 선택한다. 임의로 상기 완충된 용액은 또한 추가적인 무기염을 포함할 수도 있다. 하나의 실시태양에서 상기 무기염을 염화 나트륨, 황산 나트륨, 염화 칼륨, 황산 칼륨, 나트륨 시트레이트, 및 칼륨 시트레이트 중에서 선택한다.
"폴리펩타이드"는, 천연으로 생성되었든지 또는 합성으로 생성되었든지 간에, 펩타이드 결합에 의해 결합된 아미노산들로 이루어지는 중합체이다. 약 20 미만의 아미노산 잔기의 폴리펩타이드를 "펩타이드"라 칭할 수 있는 반면, 2 개 이상의 폴리펩타이드로 이루어지거나 또는 100 초과의 아미노산 잔기의 하나의 폴리펩타이드를 포함하는 분자는 "단백질"이라 칭할 수 있다. 폴리펩타이드는 또한 비-아미노산 성분, 예를 들어 탄수화물 기, 금속 이온, 또는 카복실산 에스터를 포함할 수 있다. 상기 비-아미노산 성분은, 상기 폴리펩타이드가 발현되는 세포에 의해 첨가될 수 있으며, 상기 세포의 유형에 따라 다양할 수 있다. 폴리펩타이드들은 그들의 아미노산 주쇄 구조 또는 상기를 암호화하는 핵산에 의해서 본 발명에서 정의된다. 탄수화물 기와 같은 첨가는 일반적으로 명시되지 않지만, 그럼에도 불구하고 존재할 수도 있다.
"항체"란 용어는 2 개 이상의 경 폴리펩타이드 쇄 및 2 개의 중 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 단백질을 나타낸다. 상기 중 및 경 폴리펩타이드 쇄들은 각각 항원과의 상호작용을 위한 결합 도메인을 함유하는 가변 영역(일반적으로 상기 폴리펩타이드 쇄의 아미노 말단 부분)을 함유한다. 상기 중 및 경 폴리펩타이드 쇄는 각각 상기 항체의, 숙주 조직 또는 면역계의 다양한 세포, 일부 식세포 및 전통적인 보체 시스템의 제 1 성분(C1q)을 포함한 인자들에의 결합을 매개할 수 있는 불변 영역(일반적으로 카복시 말단 부분)을 포함한다. 전형적으로, 상기 경 및 중 폴리펩타이드 쇄들은 완전한 쇄이며, 이들은 각각 가변 영역, 즉 VL 또는 VH, 및 완전한 불변 영역, 즉 경 폴리펩타이드 쇄의 경우에 CL 또는 중 폴리펩타이드 쇄의 경우에 CH1, CH2, CH3 및 임의로 CH4로 필수적으로 이루어진다. 본 발명에 따른 항체의 가변 영역들은 다른 아이소타입의 불변 영역에 그래프트화될 수 있다. 예를 들어 상기 1-아이소타입의 중쇄의 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 또 다른 중쇄 부류(또는 하위부류)의 불변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 그래프트화할 수 있다.
항체는 다양한 형태로, 예를 들어 Fv, Fab 및 F(ab)2뿐만 아니라 단일 쇄(예를 들어 문헌[Huston, J.S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 5879-5883]; 문헌[Bird, R.E., et al., Science 242 (1988) 423-426]; 및 일반적으로 문헌[Hood, et al., Immunology, Benjamin N.Y., 2nd edition, The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. (1984)], 및 문헌[Hunkapiller, T. and Hood, L., Nature 323 (1986) 15-16])로 존재할 수 있다. 하나의 실시태양에서 상기 항체는 단클론 항체, 단리된 중쇄 또는 경쇄, 및 오직 불변 영역들로 이루어지는 중쇄 또는 경쇄뿐만 아니라 이들의 단편 중에서 선택된다.
"불변"이란 용어는 어떤 값이 10% 이하의 상대적인 변화로 일정한 수준으로 유지됨을 나타낸다. 하나의 실시태양에서, 상기 회수 단계에서 상기 용액의 전도도는 +/-10% 이하의 변화로 일정하게 유지된다. 하나의 실시태양에서 상기 회수 단계에서 상기 용액의 전도도는 +/-5% 이하의 변화로 일정하게 유지된다. 하나의 실시태양에서 상기 회수 단계에서 상기 용액의 전도도는 +/-2% 이하의 변화로 일정하게 유지된다.
"결합-및-용리 방식"이란 용어는 크로마토그래피 정제 방법을 수행하는 방식을 나타낸다. 본 발명에서 정제하고자 하는 관심 폴리펩타이드를 함유하는 용액을 정지상, 특히 고체상에 적용하며, 이때 상기 관심 폴리펩타이드는 상기 정지상과 상호작용하고 상기 상 위에서 유지된다. 관심이 없는 물질은 각각 통과액 또는 상등액과 함께 제거된다. 상기 관심 폴리펩타이드는 그 후에 용리액을 적용함으로써 제 2 단계에서 상기 정지상으로부터 회수된다.
"봉입체"란 용어는 응집된 관심 폴리펩타이드의 밀집된 세포내 덩어리를 나타내며, 원핵생물 세포의 모든 세포 성분들을 포함하여, 전체 세포 단백질의 상당 부분을 구성한다.
"변성된"이란 용어는 고유의 것이 아닌 2차, 3차 및/또는 4차 구조를 갖는 폴리펩타이드의 형태들을 나타낸다. 상기 비-고유 형태의 폴리펩타이드는 용해성일 수 있으나 동시에 생물학적으로 불활성인 형태로 존재할 수도 있다. 또는 상기 폴리펩타이드는 불용성일 수 있으며, 예를 들어 불합치되거나 형성되지 않은 다이설파이드 결합을 갖는 생물학적으로 불활성인 형태로 존재할 수도 있다. 상기 불용성 폴리펩타이드는 봉입체 중에 함유될 수 있지만, 함유될 필요는 없다.
"리폴딩된"이란 용어는 변성된 형태로 수득되는 폴리펩타이드를 지칭한다. 전형적으로, 상기 리폴딩의 목표는, 리폴딩 단계 없이 수행되는 경우보다 더 높은 수준의 활성을 갖는 단백직을 생성시키는 것이다. 폴딩된 단백질 분자는 최소의 자유 에너지를 갖는 형태에서 가장 안정하다. 대부분의 수용성 단백질들은 소수성 아미노산의 대부분이 물과 떨어져 상기 분자의 내부 부분에 있는 방식으로 폴딩된다. 단백질을 함께 유지시키는 약한 결합은, 폴리펩타이드가 펴지게 하는, 즉 변성되게 하는 다수의 처리에 의해 파괴될 수 있다. 폴딩된 단백질은 상기 아미노산 자체와 그의 환경간의 다수의 유형의 상호작용들, 예를 들어 이온 결합, 반데르 발스 상호작용, 수소 결합, 다이설파이드 결합 및 공유 결합의 산물이다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "변성된" 또는 "변질된"이란 용어들은 분자 중에 고유의 상태로 또는 리폴딩된 상태로 존재하는 이온 및 공유 결합 및 반데르 발스 상호작용이 파괴된 폴리펩타이드를 지칭한다. 폴리펩타이드의 변성은 예를 들어 8M 유레아, 환원제, 예를 들어 머캅토에탄올, 열, pH, 온도 및 다른 화학물질들에 의한 처리에 의해 수행될 수 있다. 8M 유레아와 같은 시약은 수소 결합과 소수성 결합을 모두 파괴하며, 머캅토에탄올이 또한 첨가되는 경우, 시스테인들 간에 형성된 다이설파이드 가교(S-S)는 2 개의 -S-H 기로 환원된다. 고유의 상태로 또는 리폴딩된 상태로 다이설파이드 결합을 함유하는 폴리펩타이드의 리폴딩은 또한 상기 단백질이 다이설파이드 결합을 재형성하는, 시스테인 잔기 상에 존재하는 -S-H 기의 산화를 수반할 수 있다.
"카오트로픽제" 또는 "변성제"(이들은 호환적으로 사용될 수 있다)란 용어는 폴리펩타이드의 3-차원 구조를 비트는 화합물을 나타낸다. 상기 과정을 또한 변성이라 칭한다. 상기 카오트로픽제는 수소결합 또는 반데르 발스력과 같은 비-공유력에 의해 상호작용을 비틀고/파괴한다. 하나의 실시태양에서 상기 카오트로픽제는 부탄올, 에탄올, 1- 및 2-프로판올, 구아니디늄 클로라이드, 마그네슘 클로라이드, 나트륨 도데실/나트륨 라우릴 설페이트, 유레아, 및 티오유레아를 포함하는 군 중에서 선택된다.
"고유의 형태"란 용어는 폴리펩타이드가 그의 생물 활성을 갖고 있는 2차, 3차 및/또는 4차 구조를 갖는 상기 폴리펩타이드의 형태를 나타낸다.
"이온 교환 크로마토그래피 물질"이란 용어는 공유적으로 결합된 하전된 치환체를 갖는 고정된 고 분자량 기질을 나타낸다. 전체 전하 중성의 경우 공유적으로 결합되지 않은 대이온들은 이온성 상호작용에 의해 상기 하전된 치환체에 결합된다. 상기 "이온 교환 크로마토그래피 물질"은 그의 공유결합되지 않은 대이온들을 주위 용액의 유사하게 하전된 결합짝 또는 이온들과 교환하는 능력을 갖는다. 상기 "이온 교환 크로마토그래피 물질"은 그의 교환 가능한 대이온의 전하에 따라 "양이온 교환 크로마토그래피 물질"로서 또는 "음이온 교환 크로마토그래피 물질"로서 지칭된다. 상기 하전된 기(치환체)의 성질에 따라 상기 "이온 교환 크로마토그래피 물질"은, 예를 들어 양이온 교환 물질의 경우에, 설폰산 또는 설포프로필 수지(S) 또는 카복시메틸 수지(CM)로서 지칭된다. 상기 하전된 기/치환체의 화학적 성질에 따라, 상기 "이온 교환 크로마토그래피 물질"을 상기 공유 결합된 하전된 치환체의 강도에 따라 강한 또는 약한 이온 교환 물질로서 추가로 분류할 수 있다. 예를 들어, 강한 양이온 교환 물질은 하전된 치환체로서, 설폰산 기, 예를 들어 설포프로필 기를 가지며, 약한 양이온 교환 물질은 하전된 치환체로서, 카복실산 기, 예를 들어 카복시메틸 기를 갖는다. 강한 음이온 교환 물질은 4급 암모늄 기를 갖고, 약한 음이온 교환 물질은 하전된 치환체로서 다이에틸아미노에틸 기를 갖는다.
일반적으로, 이온 교환 크로마토그래피 단계의 위치는 폴리펩타이드의 다-단계 정제 순서에 있어서 가변적이다.
폴리펩타이드의 정제 방법은 널리 확립되어 있으며 광범위하게 사용된다. 상기 방법들을 단독으로 또는 함께 사용한다. 상기와 같은 방법은 예를 들어 착화된 금속 이온을 갖는 티올 리간드(예를 들어 Ni(II)- 및 Cu(II)-친화성 물질) 또는 미생물-유래된 단백질(예를 들어 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피)을 사용하는 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피(예를 들어 양이온 교환(카복시메틸 수지), 음이온 교환(아미노 에틸 수지) 및 혼합된-방식의 교환 크로마토그래피), 호황성 흡착(예를 들어 베타-머캅토에탄올 및 다른 SH 리간드에 의한), 소수성 상호작용 또는 방향족 흡착 크로마토그래피(예를 들어 페닐-세파로스, 아자-아레노필릭 수지, 또는 m-아미노페닐보론산), 크기 배제 크로마토그래피, 및 예비 전기영동 방법(예를 들어 젤 전기영동, 모세관 전기영동)이다.
면역글로불린의 정제 과정은 일반적으로 다단계 크로마토그래피 부분을 포함한다. 첫 번째 단계에서 비-면역글로불린 폴리펩타이드 및 단백질을, 예를 들어 단백질 A와의 친화성 크로마토그래피에 의해 상기 면역글로불린 분획으로부터 분리시킨다. 그 후에 이온 교환 크로마토그래피를 수행할 수 있다. 마지막으로 세 번째 크로마토그래피 단계를 수행하여 면역글로불린 단량체를 동일한 부류의 다량체 및 단편으로부터 분리시킬 수 있다. 때때로 응집체의 양이 많고(5% 이상) 상기 응집체를 상기 세 번째 정제 단계에서 효율적으로 분리시킬 수 없는 경우 추가의 정제 단계가 필요하다.
폴리펩타이드를, 이온성 리간드가 결합된 가교결합된 폴리(스타이렌-다이비닐벤젠)의 기질을 포함하는 이온 교환 크로마토그래피 물질로부터, 변성제를 포함하는 용액으로 회수할 수 있으며, 이때 상기 용액의 전도도는 상기 회수 동안 일정하게 유지되는 것으로 밝혀졌다. 이러한 발견은 일반적으로 이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 폴리펩타이드를 회수하기 위해 이온 강도의 증가가 사용되기 때문에 매우 놀라운 것이었다. 동시에 상기 크로마토그래피 물질은 산업적인 생산 규모의 분리에 충분한 결합 능력을 갖는다.
따라서, 본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 하기의 단계를 포함하는 폴리펩타이드의 수득 또는 정제 방법을 보고한다:
- 변성제를 포함하는 용액을 적용시킴으로써 이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하고 이에 의해 상기 폴리펩타이드를 수득하거나 정제하며,
이때 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 이온성 리간드들이 결합된 가교결합된 폴리(스타이렌-다이비닐벤젠)의 기질을 포함한다.
변성제는 상기 결합된 폴리펩타이드의 회수에 사용되기 때문에, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용되는 상기 폴리펩타이드를 포함하는 용액은 변성제가 없다. 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 유지된 폴리펩타이드를 유레아 또는 유레아-유도체와 같은 변성제 및 일정한 전도도를 갖는 용액으로 회수한다.
따라서 본 발명에 보고된 바와 같은 방법은 결합-및-용리 방식으로 수행된다, 즉 상기 폴리펩타이드를 먼저 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질에 결합시키고 그 후에, 추가의 단계에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 회수한다. 간헐적인 세척 단계가 본 발명에 보고된 바와 같은 방법에 포함될 수 있다. 이들 세척 단계에서 적용되는 용액(들)은 변성제가 실질적으로 없다. "변성제가 실질적으로 없는"이란 용어는 변성제가 상기 적용된 (세척) 용액 중에 존재할 수 있지만 상기 이온 교환 물질로부터 상기 폴리펩타이드의 회수에 필요한 농도 이하의 농도로 존재할 수 있음을 나타낸다.
본 발명에 보고된 바와 같은 방법에서 모든 용액은, 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하기 위한 용액을 제외하고, 변성제가 없다, 즉 상기 변성제를 함유하지 않는다. 하나의 실시태양에서 상기 변성제를 포함하는 용액은 수성 용액이다. 추가의 실시태양에서 상기 변성제를 포함하는 용액은 유기 용매 및/또는 지방족 알콜을 포함하지 않는다, 즉 상기 용매 및/또는 알콜이 없다. 추가의 실시태양에서 상기 변성제를 포함하는 용액은 물, 변성제, 완충제 물질, 및 임의로 1 또는 2 또는 3 개의 무기염으로 이루어진다.
"변성제" 또는 "카오트로픽제"(이들은 본 출원 내에서 호환적으로 사용될 수 있다)란 용어는 폴리펩타이드를 그의 고유의 형태로부터 비-고유, 즉 변성된 형태로 이동시키는 화합물을 나타낸다. 변성제는 일반적으로 카오트로픽제이다. 예시적인 변성제는 유레아 및 유레아-유도체, 구아니딘 및 구아니딘-유도체, 테트라알킬 암모늄염, 장쇄 설폰산 에스터, 및 리튬 퍼클로레이트이다.
유레아의 첨가, 보다 정확하게는 유레아 농도의 변화는 용액의 전도도에 영향을 미치지 않는다, 즉 용액의 전도도는 유레아의 첨가 시 또는 유레아 농도의 변화 시 일정하게 남아있는다.
하나의 실시태양에서 상기 변성제는 유레아 또는 유레아-유도체이다.
하나의 실시태양에서 상기 변성제는 유레아이다. 하나의 실시태양에서 상기 유레아는 4 몰/ℓ 내지 9 몰/ℓ의 농도를 갖는다.
하나의 실시태양에서 상기 변성제는 티오유레아이다. 하나의 실시태양에서 상기 티오유레아는 1.5 몰/ℓ 내지 3 몰/ℓ의 농도를 갖는다.
하나의 실시태양에서 상기 변성제는 2 또는 3 개 변성제들의 혼합물이다. 하나의 실시태양에서 상기 변성제는 유레아 및 티오유레아의 혼합물이다. 하나의 실시태양에서 상기 변성제는 유레아 및 구아니디늄염의 혼합물이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 태양의 하나의 실시태양에서 폴리펩타이드의 정제 또는 수득 방법은 하기의 단계들을 포함한다:
- 제 1 용액을 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용시켜 콘디셔닝된 이온 교환 크로마토그래피 물질을 생성시키고,
- 상기 폴리펩타이드를 포함하는 제 2 용액을 상기 콘디셔닝된 이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용시키고,
- 임의로 제 3 용액을 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용시키고,
- 변성제를 포함하는 제 4 용액으로 상기 폴리펩타이드를 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 회수하고 이에 의해 정제하거나 수득한다.
상기 제 1 및 제 2 용액들은 변성제가 실질적으로 없다. 상기 제 3 용액은 변성제가 실질적으로 없다.
폴리펩타이드는 진핵생물 및 원핵생물 세포, 예를 들어 CHO 세포, HEK 세포 및 에스케리키아 콜라이에서 재조합적으로 생산될 수 있다. 상기 폴리펩타이드가 원핵생물 세포에서 생산되는 경우, 이는 일반적으로 불용성 봉입체의 형태로 수득된다. 상기 봉입체를 상기 원핵생물 세포 및 배양 배지로부터 쉽게 회수할 수 있다. 상기 봉입체 중의 불용성 형태로 수득된 폴리펩타이드를 용해시켜야 하며 그 후에 정제 및/또는 리폴딩 과정을 수행할 수 있다.
따라서, 본 발명에 보고된 바와 같은 두 번째 태양은 하기의 단계들을 포함하는 폴리펩타이드의 생산 방법이다:
- 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 원핵생물 또는 진핵생물 세포를 배양하고,
- 상기 원핵생물 또는 진핵생물 세포 또는/및 배양 배지로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하고,
- 상기 폴리펩타이드가 봉입체의 형태로 회수되는 경우 상기 폴리펩타이드를 용해시키고/시키거나 리폴딩시키고,
- 상기 폴리펩타이드를 본 발명에 보고된 바와 같은 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제시키고 이에 의해 상기 폴리펩타이드를 생산한다.
하나의 실시태양에서 상기 이온 교환 크로마토그래피 방법은 하기의 단계들을 포함한다:
- 제 1 용액을 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용시켜 콘디셔닝된 이온 교환 크로마토그래피 물질을 생성시키고,
- 상기 폴리펩타이드를 포함하는 제 2 용액을 상기 콘디셔닝된 이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용시키고,
- 임의로 제 3 용액(세척 단계)을 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용시키고,
- 하나 이상의 변성제를 포함하는 제 4 용액으로 상기 폴리펩타이드를 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 회수하고 이에 의해 생산하며, 이때
상기 제 1 내지 제 3 용액들은 변성제가 없다.
하기에 이전에 보고된 바와 같은 모든 태양들의 상이한 실시태양들을 나타낸다.
하나의 실시태양에서 상기 제 1 용액은 제 1 완충제 물질을 포함하고, 상기 제 2 용액은 제 2 완충제 물질을 포함하고, 상기 제 3 용액은 제 3 완충제 물질을 포함하고, 상기 제 4 용액은 제 4 완충제 물질을 포함하고, 이때 상기 제 4 완충제 물질은 하나 이상의 변성제를 포함한다.
하나의 실시태양에서 상기 제 2 완충제 물질 및 제 3 완충제 물질 및 제 4 완충제 물질은 모두 상이한 완충제 물질들이다.
하나의 실시태양에서 상기 제 1 용액 및/또는 상기 제 2 용액 및/또는 제 3 용액은 변성제가 없다. 하나의 실시태양에서 상기 제 3 용액은 변성제가 실질적으로 없다.
하나의 실시태양에서 상기 제 1 용액의 적용은 3 내지 20 컬럼 부피만큼이다.
하나의 실시태양에서 상기 제 1 용액의 적용은 3 내지 10 컬럼 부피만큼이다.
하나의 실시태양에서 상기 제 2 용액의 적용은 1 내지 10 컬럼 부피만큼이다.
하나의 실시태양에서 상기 제 3 용액의 적용은 1 내지 10 컬럼 부피만큼이다.
상기 이온 교환 크로마토그래피 물질을 첫 번째 단계에서 완충된 용액으로 콘디셔닝한다. 상기 용액은 변성제가 없다, 즉 상기 변성제를 포함하지 않는다. 상기 콘디셔닝, 제 1 완충제 용액의 완충제 물질은 상기 폴리펩타이드를 포함하는 제 2 용액의 완충제 물질과 동일하거나 상이할 수 있다.
그 후에 상기 폴리펩타이드를 포함하는 제 2 용액을 상기 콘디셔닝된 이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용시킨다. 이 단계에서 상기 폴리펩타이드를 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질 상에 유지시킨다. 상기 용액은 변성제를 포함하지 않는다. 상기 로딩용, 즉 제 2 완충제 용액의 완충제 물질은 상기 제 3 용액의 완충제 물질과 동일하거나 상이할 수 있다.
상기 폴리펩타이드와 함께 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질의 로딩 후에 임의로 세척, 즉 제 3 용액을 상기 로딩된 이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용시킬 수 있다. 상기 용액은 변성제가 실질적으로 없다.
최종적으로 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하기 위해서, 하나 이상의 변성제를 포함하는 회수, 즉 제 4 용액을 상기 크로마토그래피 물질에 적용시킨다.
하나의 실시태양에서 폴리펩타이드의 정제 또는 수득 방법은 컬럼 크로마토그래피 방법이다.
하나의 실시태양에서 상기 회수 단계에서 상기 용액의 전도도는 일정하다.
하나의 실시태양에서 상기 회수 단계에서 상기 용액의 pH-값은 일정하다.
상기 상이한 단계들에서 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용되는 부피는 서로 독립적으로 3 내지 20 컬럼 부피, 하나의 실시태양에서 4 내지 10 컬럼 부피이다.
하나의 실시태양에서 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질은 작용기들로 유도체화된 폴리스타이렌 다이비닐 벤젠으로 제조된다. 하나의 실시태양에서 상기 음이온 교환 크로마토그래피는 4급화된 폴리 에틸렌이민 작용기로 유도체화된 폴리스타이렌 다이비닐 벤젠이다. 하나의 실시태양에서 상기 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 설포프로필 작용기로 유도체화된 폴리스타이렌 다이비닐 벤젠이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 방법들은 하기에 WO 2012/028526에 보고된 바와 같은 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 융합 단백질 및 WO 2012/007495에 보고된 바와 같은 항-TSLP 수용체 항체와 함께 예시된다.
하기의 실시예들 및 도면들은 본 발명의 이해를 돕기 위해서 제공되며, 본 발명의 진정한 범위는 첨부된 청구의 범위에 나열된다. 본 발명의 진의로부터 이탈됨 없이 나열된 과정에서 변형들을 수행할 수 있음은 물론이다.
실시예 1
물질 및 방법:
달리 지시되지 않는 한 다양한 크로마토그래피 방법들을 상기 크로마토그래피 물질 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하였다.
재조합 DNA 기법:
문헌[Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)]에 개시된 바와 같은 표준 방법들을 사용하여 DNA를 조작하였다. 상기 분자 생물학적 시약들을 제조사의 설명서에 따라 사용하였다.
단백질 측정:
단백질 농도를 아미노산 서열을 기준으로 계산된 몰 소광 계수를 사용하여, 320 ㎚의 비교 파장과 함께 280 ㎚에서 광학 밀도(OD)를 측정함으로써 측정하였다.
크기-배제-HPLC:
크로마토그래피를 ASI-100 HPLC 시스템(다이오넥스(Dionex), 독일 이드스타인 소재) 상에서 토소 하스(Tosoh Haas) TSK 3000 SWXL 컬럼을 사용하여 수행하였다. 용리 피크들을 UV 다이오드 배열 검출기(다이오넥스)에 의해 280 ㎚에서 모니터하였다. 상기 농축된 샘플을 1 ㎎/㎖로 용해시킨 후에, 상기 컬럼을 안정한 기준선에 도달될 때까지 200 mM 칼륨 이수소 포스페이트 및 250 mM 염화 칼륨 pH 7.0으로 이루어진 완충제로 세척하였다. 상기 분석 실험들을 실온에서 30 분에 걸쳐 0.5 ㎖/분의 유속을 사용하여 등용매 조건 하에서 수행하였다. 상기 크로마토그램들을 크로멜레온(Chromeleon)(다이오넥스, 독일 이드스타인 소재)으로 수동으로 통합시켰다.
역상 HPLC(RP-HPLC):
순도를 RP-HPLC에 의해 분석한다. 상기 분석을 아세토나이트릴/수성 TFA 구배를 사용하여 페노메넥스(Phenomenex) C18 컬럼 상에서 수행한다. 용리 프로파일을 215 ㎚에서 UV 흡광도로서 모니터한다. 상기 용리된 물질들의 백분율을 상기 용리된 단백질들의 전체 피크 면적을 기준으로 계산한다.
DNA-한계-시스템:
예를 들어 문헌[Merrick, H., and Hawlitschek, G., Biotech Forum Europe 9 (1992) 398-403]을 참조하시오.
숙주 세포 단백질 측정:
미세 적정 플레이트 웰들의 벽을 혈청 알부민 및 스트렙트아비딘의 혼합물로 코팅한다. HCP에 대한 염소 유래된 다클론 항체를 상기 미세 적정 플레이트 웰들의 벽에 결합시킨다. 세척 단계 후에 상기 미세 적정 플레이트의 상이한 웰들을 상이한 농도의 HCP 보정 서열 및 샘플 용액과 함께 배양한다. 배양 후에 결합되지 않은 샘플 물질을 완충액에 의한 세척에 의해 제거한다. 검출을 위해서 상기 웰들을 항체 퍼옥시다제 접합체와 함께 배양하여 결합된 숙주 세포 단백질을 검출한다. 상기 고정된 퍼옥시다제 활성을 ABTS와의 배양 및 405 ㎚에서의 검출에 의해 검출한다.
DNA 측정:
비오틴을 미세적정 플레이트에 결합시켰다. 스트렙트아비딘, 단일-가닥 DNA 및 비오틴화된 단일-가닥 DNA 결합 단백질의 반응 혼합물을 가하였다. 상기 결합 단백질은 DNA와 결합할 수 있었으며 비오틴화되었다. 이러한 방식으로 상기 샘플 혼합물로부터 DNA를 특이적으로 제거하는 것이 가능하였다. 상기 스트렙트아비딘은 상기 미세적정 플레이트 상의 비오틴뿐만 아니라 단일-가닥 DNA 결합 단백질에 결합된 비오틴과 결합하였다. 유레아제에 결합된 DNA-특이적 항체를 상기 전체 복합체에 가하였다. 유레아의 첨가 결과 상기 유레아의 가수분해가 발생하였으며 이는 pH의 국소적인 변화를 야기하였다. 이러한 변화는 변경된 표면 전위로서 검출될 수 있다. 상기 표면 전위의 변화는 결합된 DNA의 양에 비례하였다. 단일 가닥 DNA를 프로테이나제 K 절단 및 SDS에 의한 변성에 의해 수득하였다.
봉입체로부터 폴리펩타이드의 단리, 용해 및 리폴딩을 위한 일반적인 방법:
상기 방법 외에, 봉입체의 제조를 상기 인용된 문헌에서 수행할 수 있다, 예를 들어 루돌프(Rudolph) 등(문헌[Rudolph, R., et al., Folding Proteins, In: Creighton, T.E., (ed.): Protein function: A Practical Approach, Oxford University Press (1997) 57-99])에 의한 방법에 따라 수행할 수 있다. 상기 봉입체를 -70 ℃에서 보관하였다. 상기 봉입체의 용해를 마찬가지로 루돌프 등(문헌[Rudolph, R., et al., Folding Proteins, In: Creighton, T.E., (ed.): Protein function: A Practical Approach, Oxford University Press (1997) 57-99])에 의한 방법에 따라 수행할 수 있다.
실시예 2(비교 실시예)
염화 나트륨 전도도 구배에 의한 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼 상에서 서열번호 01의 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 융합 단백질의 정제
수지: POROS(등록상표) HQ
로드: 443 ㎎ 폴리펩타이드
컬럼 로드: 30 ㎎/㎖
용리 방법: 선형 구배 0 M에서 1 M 염화 나트륨
결과:
도 1로부터 알 수 있는 바와 같이 상기 융합 단백질을 한정된 피크로 수득할 수 없다. 분석 결과를 하기 표 1에 나타낸다.
[표 1]
Figure pct00001
실시예 3
일정한 전도도 및 일정한 pH-값에서 유레아 구배에 의한 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼 상에서 서열번호 01의 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 융합 단백질의 정제
수지: POROS(등록상표) HQ
로드: 366 ㎎ 폴리펩타이드
컬럼 로드: 24.8 ㎎/㎖
용리 방법: 선형 구배 0 M에서 6 M 유레아
결과:
도 2로부터 알 수 있는 바와 같이 상기 융합 단백질을 한정된 피크로 수득할 수 있다. 분석 결과를 하기 표 2에 나타낸다.
[표 2]
Figure pct00002
실시예 4
일정한 전도도 및 일정한 pH -값에서 유레아 구배에 의한 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼 상에서 서열번호 02의 테트라넥틴 - 아포지방단백질 A-I 융합 단백질의 정제
수지: POROS(등록상표) HQ
용리 방법: 선형 구배 0 M에서 6 M 유레아
결과:
도 3으로부터 알 수 있는 바와 같이 상기 융합 단백질을 한정된 피크로 수득할 수 있다. 분석 결과를 하기 표 3에 나타낸다.
[표 3]
Figure pct00003
실시예 5(비교 실시예)
유레아 세척, 아이소프로판올 세척 및 구아니디늄 하이드로클로라이드 구배 용리에 의한 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼 상에서 서열번호 01의 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 융합 단백질의 정제
수지: Q-세파로스(등록상표) FF(GE 헬쓰케어)
로드: 281 ㎎ 폴리펩타이드
컬럼 로드: 15 ㎎/㎖
평형: 30 mM 칼륨 포스페이트 완충제 pH 8.0; 5.94 mS/㎝
유레아 세척: 6 M 유레아 용액 pH 8.0; 435 μS/㎝
2-프로판올 세척: 20%(v/v) 2-프로판올
용리액: 6 M 구아니디늄 하이드로클로라이드 pH 8.0; LF = 278 mS/㎝
세척 단계: 5 컬럼 부피 6 M 유레아 용액에 의한 세척;
5 컬럼 부피 20% 2-프로판올에 의한 세척
용리 방법: 10 컬럼 부피 중의 선형 구배 0 M에서 6 M 구아니디늄 하 이드로클로라이드
결과:
도 4로부터 알 수 있는 바와 같이 상기 융합 단백질을 상기 유레아 용액 및 2-프로판올 용액에 의한 세척 단계 동안 수득할 수 없다. 용리는 오직 구아니디늄 하이드로클로라이드 용액을 사용함으로써 수행될 수 있다.
실시예 6(비교 실시예)
유레아 세척, 구아니디늄 하이드로클로라이드 세척 및 염화 나트륨 구배 용리에 의한 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼 상에서 서열번호 01의 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 융합 단백질의 정제
수지: Q-세파로스(등록상표) FF(GE 헬쓰케어)
로드: 280 ㎎ 폴리펩타이드
컬럼 로드: 20 ㎎/㎖
평형: 30 mM 칼륨 포스페이트 완충제 pH 8.0; 5.94 mS/㎝
유레아 세척: 6 M 유레아 용액 pH 8.0; 435 μS/㎝
구아니디늄 하이드로클로라이드 용액:
0.1 M 구아니디늄 하이드로클로라이드 pH 8.0
용리액: 50 mM 칼륨 포스페이트 완충제 pH 8.0 중의 1 M 염화 나 트륨; 91.7 mS/㎝
세척 단계: 5 컬럼 부피 6 M 유레아 용액에 의한 세척;
5 컬럼 부피 0.1 M 구아니디늄 하이드로클로라이드 용액 에 의한 세척
용리 방법: 10 컬럼 부피 중의 선형 구배 0 M에서 1 M 염화 나트륨
결과:
도 5로부터 알 수 있는 바와 같이 상기 각각의 세척 단계에서 오직 작은 분획의 융합 단백질만을 수득할 수 있다. 분석 결과를 하기 표 4에 나타낸다.
[표 4]
Figure pct00004
실시예 7(비교 실시예)
유레아 세척, 구아니디늄 하이드로클로라이드 세척 및 염화 나트륨 구배 용리에 의한 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼 상에서 서열번호 02의 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 융합 단백질의 정제
수지: Q-세파로스(등록상표) FF(GE 헬쓰케어)
로드: 239 ㎎ 폴리펩타이드
컬럼 로드: 15 ㎎/㎖
평형: 30 mM 칼륨 포스페이트 완충제 pH 8.0; 5.9 mS/㎝
유레아 세척: 6 M 유레아 용액 pH 8.0
구아니디늄 하이드로클로라이드 용액:
0.1 M 구아니디늄 하이드로클로라이드 pH 8.0
용리액: 20 mM 칼륨 포스페이트 완충제 pH 8.0 중의 0.35 M 염화 나트륨
세척 단계: 4 컬럼 부피 6 M 유레아 용액에 의한 세척;
4 컬럼 부피 0.1 M 구아니디늄 하이드로클로라이드 용액 에 의한 세척
용리 방법: 7 컬럼 부피에 대해 0.35 M 염화 나트륨에 의한 단계 용 리
결과:
도 6으로부터 알 수 있는 바와 같이 상기 각각의 세척 단계에서 오직 작은 분획의 융합 단백질만을 수득할 수 있다. 3 개 실험의 분석 결과를 하기 표 5에 나타낸다.
[표 5]
Figure pct00005
실시예 8a
일정한 전도도 및 일정한 pH-값에서 유레아 구배에 의한 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼 상에서 서열번호 01의 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 융합 단백질의 정제
수지: POROS(등록상표) HS
로드: 5.58 g 폴리펩타이드
세척 1: 50 mM 나트륨 포미에이트, pH 3.0으로 조절됨
세척 2: 1 M 염화 나트륨, 30 mM 칼륨 포스페이트 완충제, pH 8.0 으로 조절됨
세척 3: 30 mM 칼륨 포스페이트 완충제, pH 8.0으로 조절됨
용리액: 10 mM 칼륨 포스페이트 완충제 pH 8.0 중의 6 M 유레아
용리 방법: 3 컬럼 부피만큼 세척 1,
20 컬럼 부피만큼 세척 2,
5 컬럼 부피만큼 세척 3,
10 컬럼 부피 중의 선형 구배 0 M에서 6 M 유레아
결과:
도 7로부터 알 수 있는 바와 같이 상기 융합 단백질을 한정된 피크로 수득할 수 있다. 분석 결과를 하기 표 6에 나타낸다.
[표 6]
Figure pct00006
실시예 8b
일정한 전도도 및 일정한 pH-값에서 유레아 구배에 의한 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 이은 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼 상에서 서열번호 01의 테트라넥틴 - 아포지방단백질 A-I 융합 단백질의 정제
수지: POROS(등록상표) HQ
로드: 실시예 8a에서 수득된 3.19 g 폴리펩타이드(상기 참조)
결과:
상기 두 번째 크로마토그래피 단계의 분석 결과를 하기 표 7에 나타낸다.
[표 7]
Figure pct00007
실시예 9
트리스 완충제 세척 및 유레아 구배 용리에 의한 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼 상에서 항-TSLP 수용체 항체의 정제
수지: POROS(등록상표) HQ
로드: 189 ㎎ 폴리펩타이드
트리스 세척: 10 mM 염화 나트륨을 갖는 5 mM 트리스 완충제 pH 8.4; 4 mS/㎝
용리액: 10 mM 염화 나트륨 및 6 M 유레아를 갖는 5 mM 트리스 완 충제 pH 8.0; 4 mS/㎝
세척 단계: 3 컬럼 부피 트리스 완충제 용액에 의한 세척
용리 방법: 30 컬럼 부피 중의 선형 구배 0 M에서 6 M 유레아
결과:
도 8로부터 알 수 있는 바와 같이 항체를 수득할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Cation and anion exchange chromatography method <130> 30584 WO <140> PCT/EP2012/066135 <141> 2012-08-17 <150> EP 11178745.3 <151> 2011-08-25 <150> EP 11183862.9 <151> 2011-10-04 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 284 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tetranectin-apolipoprotein A-I (1) <400> 1 Pro Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu 1 5 10 15 Glu Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu 20 25 30 Lys Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr Val Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro 35 40 45 Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu Lys 50 55 60 Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly 65 70 75 80 Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser 85 90 95 Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe 100 105 110 Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser 115 120 125 Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp 130 135 140 Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val 145 150 155 160 Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His 165 170 175 Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg 180 185 190 Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser 195 200 205 Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu 210 215 220 Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His 225 230 235 240 Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg 245 250 255 Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser 260 265 270 Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln 275 280 <210> 2 <211> 291 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tetranectin-apolipoprotein A-I with N-terminal His-tag <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X = any one of AP, GP, SP, PP, GSAP, GSGP, GSSP, GSPP, GGGS, GGGGS, GGGSGGGS, GGGGSGGGGS, GGGSGGGSGGGS, GGGGSGGGGSGGGGS, GGGSAP, GGGSGP, GGGSSP <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X = any one of GGGSPP, GGGGSAP, GGGGSGP, GGGGSSP, GGGGSPP, GGGSGGGSAP, GGGSGGGSGP, GGGSGGGSSP, GGGSGGGSPP, GGGSGGGSGGGSAP, GGGSGGGSGGGSGP, GGGSGGGSGGGSSP, GGGSGGGSGGGSPP <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X = any one of GGGGSAP, GGGGSGP, GGGGSSP, GGGGSPP, GGGGSGGGGSAP, GGGGSGGGGSGP, GGGGSGGGGSSP, GGGGSGGGGSPP, GGGGSGGGGSGGGGSAP, GGGGSGGGGSGGGGSGP, GGGGSGGGGSGGGGSSP, and GGGGSGGGGSGGGGSPP. <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 2 Met His His His His His His Xaa Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp Val 1 5 10 15 Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr Leu 20 25 30 Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr Val 35 40 45 Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr 50 55 60 Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln 65 70 75 80 Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp 85 90 95 Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu 100 105 110 Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu 115 120 125 Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys 130 135 140 Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met 145 150 155 160 Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu 165 170 175 Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu 180 185 190 Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg 195 200 205 Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala 210 215 220 Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr 225 230 235 240 His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys 245 250 255 Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser 260 265 270 Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu 275 280 285 Asn Thr Gln 290 <210> 3 <211> 285 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tetranectin-apolipoprotein A-I (2) <400> 3 Ala Pro Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp Val Val Asn Thr Lys Met Phe 1 5 10 15 Glu Glu Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu 20 25 30 Leu Lys Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr Val Asp Glu Pro Pro Gln Ser 35 40 45 Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu 50 55 60 Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu 65 70 75 80 Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr 85 90 95 Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu 100 105 110 Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met 115 120 125 Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp 130 135 140 Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys 145 150 155 160 Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu 165 170 175 His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp 180 185 190 Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr 195 200 205 Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys 210 215 220 Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu 225 230 235 240 His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu 245 250 255 Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu 260 265 270 Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln 275 280 285 <210> 4 <211> 285 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tetranectin-apolipoprotein A-I <220> <221> MISC_FEATURE <223> X = A or G or S or T <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 4 Xaa Pro Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp Val Val Asn Thr Lys Met Phe 1 5 10 15 Glu Glu Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu 20 25 30 Leu Lys Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr Val Asp Glu Pro Pro Gln Ser 35 40 45 Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu 50 55 60 Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu 65 70 75 80 Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr 85 90 95 Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu 100 105 110 Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met 115 120 125 Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp 130 135 140 Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys 145 150 155 160 Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu 165 170 175 His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp 180 185 190 Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr 195 200 205 Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys 210 215 220 Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu 225 230 235 240 His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu 245 250 255 Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu 260 265 270 Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln 275 280 285

Claims (14)

  1. 폴리펩타이드의 정제 방법으로,
    - 상기 폴리펩타이드를, 변성제를 포함하는 용액으로 일정한 전도도로 이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 회수하고 이에 의해 상기 폴리펩타이드를 정제하는 단계를 포함하고, 이때
    상기 이온 교환 크로마토그래피 물질이 이온성 리간드가 결합된 가교결합된 폴리(스타이렌-다이비닐벤젠)의 기질을 포함하는 방법.
  2. 폴리펩타이드의 생성 방법으로,
    - 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 원핵생물 또는 진핵생물 세포를 배양하고,
    - 상기 세포 및/또는 배양 배지로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하고,
    - 상기 폴리펩타이드를
    - 상기 폴리펩타이드를, 변성제를 포함하는 용액으로 이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 회수하고 이에 의해 상기 폴리펩타이드를 생성시키는 단계
    를 포함하는 이온 교환 크로마토그래피 방법으로 정제시키는
    단계들을 포함하고, 이때
    상기 이온 교환 크로마토그래피 물질이 이온성 리간드가 결합된 가교결합된 폴리(스타이렌-다이비닐벤젠)의 기질을 포함하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    변성제가 하나의 변성제이고 유레아, 구아니딘, 유레아-유도체 및 구아니딘-유도체를 포함하는 군 중에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이온 교환 크로마토그래피 물질이 양이온 교환 크로마토그래피 물질임을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 이온성 리간드가 설포프로필 리간드 또는 카복시메틸 리간드임을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이온 교환 크로마토그래피 물질이 음이온 교환 크로마토그래피 물질임을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 이온성 리간드가 에틸렌이민 리간드 또는 4급화된 리간드임을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 폴리펩타이드를, 변성제를 포함하는 용액을 적용함으로써 제 1 이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 회수하고,
    - 상기 회수된 폴리펩타이드를 제 2 이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하고,
    - 변성제를 포함하는 용액을 적용함으로써 상기 폴리펩타이드를 상기 제 2 이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 회수하고 이에 의해 상기 폴리펩타이드를 수득하거나 정제하는
    단계들을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 제 1 이온 교환 크로마토그래피 물질이 음이온 교환 크로마토그래피 물질이고 상기 제 2 이온 교환 크로마토그래피 물질이 양이온 교환 크로마토그래피 물질이거나, 또는
    상기 제 1 이온 교환 크로마토그래피 물질이 양이온 교환 크로마토그래피 물질이고 상기 제 2 이온 교환 크로마토그래피 물질이 음이온 교환 크로마토그래피 물질임을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서,
    상기 회수된 폴리펩타이드를 상기 제 2 이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하기 전에 리폴딩시킴을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    정제가
    - 제 1 용액을 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하고,
    - 상기 폴리펩타이드를 포함하는 제 2 용액을 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하고,
    - 상기 폴리펩타이드를, 변성제를 포함하는 제 4 용액으로 회수하고 이에 의해 생성시키거나 정제시키는
    단계들을 포함하고, 이때 상기 제 1 용액이 제 1 완충제 물질을 포함하고, 상기 제 2 용액이 제 2 완충제 물질을 포함하며, 상기 제 4 용액이 제 4 완충제 물질을 포함하고, 상기 제 4 완충제 물질이 변성제를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 제 2 용액을 적용한 후 및 상기 제 4 용액을 적용하기 전에,
    - 제 3 용액을 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계를 포함하고, 이때 상기 제 3 용액이 제 3 완충제 물질을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드가 서열번호 01, 서열번호 02, 서열번호 03 및 서열번호 04의 아미노산 서열의 군 중에서 선택된 아미노산 서열을 가짐을 특징으로 하는 방법.
  14. 가교결합된 폴리(스타이렌-다이비닐벤젠)의 기질을 포함하는 이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 폴리펩타이드를 일정한 전도도 값으로 회수함에 있어서 유레아 또는 유레아-유도체의 용도.
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