CN107428817A - 纯化白蛋白融合蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及纯化白蛋白融合蛋白以降低敏感的氨基酸残基的氧化水平的方法。该方法包括亲和基质层析步骤和阴离子交换层析步骤。这些经纯化的白蛋白融合蛋白具有低水平的氧化并且保留其增强的体内半衰期及其生物活性。在一些实施例中，该白蛋白融合蛋白包含支架，如人类肌腱蛋白C支架。进一步披露了包含该白蛋白融合蛋白的组合物。

Description

纯化白蛋白融合蛋白的方法
序列表的引用
本申请通过引用结合以文本文件通过EFS-Web与本申请一起提交的序列表，该序列表名称为“CD40L-300P1_SL.TXT”，创建于2015年3月12日并且具有228千字节的大小。
发明背景
技术领域
本发明总体上涉及纯化白蛋白融合蛋白的方法，该蛋白质具有低的色氨酸和/或甲硫氨酸残基氧化水平。这些残基的低氧化水平允许经纯化的白蛋白融合蛋白保留其相对效力和生物活性。该白蛋白融合蛋白可以包括支架，例如像衍生自有用的人类肌腱蛋白C的第三纤连蛋白III型结构域的那些。本发明涉及纯化白蛋白融合蛋白的方法，获得自该方法的经纯化的蛋白质以及包含该经纯化的白蛋白融合蛋白的组合物。
背景技术
使用蛋白质作为潜在的治疗性药物近年来越来越受到关注。蛋白质药物的一个缺点是它们在体内往往具有短的半衰期。为了克服这个挑战，蛋白质和肽可以与其他分子缀合或融合。延长半衰期的一个选择是通过PEG化，一种通过多种可用化学反应使聚(乙二醇)或PEG共价附接至蛋白质的过程。除了半衰期延长之外，PEG化还可以降低免疫原性，这可能是由于蛋白质表面被一条或多条PEG链屏护起来。PEG化的缺点在于它需要缀合反应步骤并且通常需要另外的纯化步骤来除去未反应的PEG链。尽管存在这些挑战，PEG化技术仍已经成功应用于几种商业生物药物。
延长半衰期的第二个选择是融合蛋白技术。在这种情况下，治疗性蛋白与被设计成延长体内半衰期的第二蛋白质遗传地融合。这种选择提供了类似于PEG化的半衰期延长；然而，它不需要另外的制造步骤(缀合反应和相关纯化)，因为融合蛋白被表达和纯化为单个实体。融合蛋白的实例包括Fc融合物、转铁蛋白融合物和白蛋白融合物。所有蛋白质都以高水平在人类血浆中被发现，减轻了由于药物引起的增加的水平的影响。
除了半衰期延长和易于制造的益处之外，融合蛋白还可以能够利用平台方法进行纯化。这是因为在许多情况下，载体蛋白构成融合蛋白的大部分，并且因此在各种融合蛋白之间存在类似的生理化学特征。为了使得平台方法成功，纯化操作必须对载体蛋白具有选择性。
本发明涉及纯化白蛋白融合蛋白的方法。
本文中对参考文献的引用或讨论不应被解释为承认这些是本发明的现有技术。
发明内容
在某些方面中，本文的披露涉及在纯化期间减少白蛋白融合蛋白中色氨酸和/或甲硫氨酸氧化的方法，该方法包括使包含该白蛋白融合蛋白的组合物经受以下纯化过程：(a)亲和基质；(b)阴离子交换基质，其中通过应用包含辛酸盐的洗脱缓冲液将该白蛋白融合蛋白从该亲和基质上洗脱。
在另外的方面中，本文的披露涉及在纯化期间减少白蛋白融合蛋白中色氨酸和/或甲硫氨酸氧化的方法，该方法包括使包含该白蛋白融合蛋白的组合物经受以下纯化过程：(a)亲和基质；(b)阴离子交换基质，其中用洗涤缓冲液洗涤该亲和基质，该洗涤缓冲液包含：(1)约2％至约20％的多元醇，其中该多元醇选自下组，该组由以下各项组成：1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,2-丁二醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇、1,6-己二醇和2-甲基-2,4-戊二醇；(2)0.05M至2.0M的盐，其中该盐选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化锂、溴化钠、溴化钾和溴化锂；(3)约0.02M至约0.2M的硫酸钠；(4)约0.01％至约1％的非离子型表面活性剂；(5)约0.05M至约1.0M的尿素；或(6)约0.02M至约0.5M的烟酰胺。
在另外的方面中，本文的披露涉及获得包含基本上不含经氧化的色氨酸残基的白蛋白融合蛋白的组合物的方法，该方法包括使包含经氧化的色氨酸白蛋白融合蛋白和未经氧化的色氨酸白蛋白融合蛋白的组合物经受疏水相互作用基质，其中在不同时间将经氧化的色氨酸白蛋白融合蛋白和未经氧化的色氨酸白蛋白融合蛋白从该疏水相互作用基质上洗脱，从而将该经氧化的色氨酸白蛋白融合蛋白与该未经氧化的色氨酸白蛋白融合蛋白分离。
在某些方面中，本文的披露涉及基本上免于氧化色氨酸/甲硫氨酸残基而分离白蛋白融合蛋白的方法，该方法包括使包含白蛋白融合蛋白的组合物经受以下纯化过程：(a)亲和基质层析过程；(b)阴离子交换层析过程；和(c)疏水相互作用基质层析过程，其中将包含辛酸盐的洗脱缓冲液应用至该亲和基质，并且其中在不同时间将经氧化的色氨酸白蛋白融合蛋白和未经氧化的色氨酸白蛋白融合蛋白从该疏水相互作用基质上洗脱，从而将该经氧化的色氨酸白蛋白融合蛋白与该未经氧化的色氨酸白蛋白融合蛋白分离。
在另外的方面中，本文的披露涉及纯化白蛋白融合蛋白的方法，该方法包括使包含白蛋白融合蛋白的组合物经受疏水相互作用基质以及以下纯化过程中的一个或多个：(a)亲和基质，其中将包含辛酸盐的洗脱缓冲液应用至该亲和基质；和/或(b)阴离子交换基质；其中用洗涤缓冲液洗涤亲和基质，该洗涤缓冲液包含：(1)约2％至约20％的多元醇，其中该多元醇选自下组，该组由以下各项组成：1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,2-丁二醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇、1,6己二醇和2-甲基-2,4-戊二醇；(2)0.05M至2.0M的盐，其中该盐选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化锂、溴化钠、溴化钾和溴化锂；(3)约0.02M至约0.2M的硫酸钠；(4)约0.01％至约1％的非离子型表面活性剂；(5)约0.05M至约1.0M的尿素；或(6)约0.02M至约0.5M的烟酰胺，其中该所得经纯化的白蛋白融合蛋白基本上不含经氧化的色氨酸残基。
在另外的方面中，本文的披露涉及纯化白蛋白融合蛋白的方法，该方法包括：(a)将包含该白蛋白融合蛋白的组合物应用至亲和基质；(b)将该白蛋白融合蛋白从(a)的亲和基质上洗脱以获得第一洗脱液；(c)将该第一洗脱液应用至阴离子交换基质；(d)将该白蛋白融合蛋白从该阴离子交换基质上洗脱以获得第二洗脱液；(e)将该第二洗脱液应用至阴离子交换膜；
使该白蛋白融合蛋白通过阴离子交换膜以获得流通物(flow through)；(f)将该流通物应用至疏水相互作用基质；
将该白蛋白融合蛋白从该疏水相互作用基质上洗脱以获得第三洗脱液，其中该第三洗脱液包含该经纯化的白蛋白融合蛋白。
本文的披露还涉及通过本文披露的任何方法获得的白蛋白融合蛋白组合物。
本文的披露进一步涉及包含白蛋白融合蛋白的组合物，其中该组合物具有少于20ng/mg的宿主细胞蛋白，并且其中少于15％的色氨酸残基被氧化。
本文的披露另外涉及包含白蛋白融合蛋白的组合物，其中该组合物具有少于5x10-3ng/mg的DNA，并且其中少于15％的色氨酸残基被氧化。
本文的披露进一步涉及包含白蛋白融合蛋白的组合物，其中该组合物具有少于20ng/mg的宿主细胞蛋白，并且其中该白蛋白融合蛋白具有>90％的相对活性。
本文的披露还涉及包含白蛋白融合蛋白的组合物，其中该组合物具有少于5x10-3ng/mg的DNA，并且其中该白蛋白融合蛋白具有>90％的相对活性。
本文的披露进一步涉及包含SEQ ID NO:134、135、201、202、203、204、205、206、207或208的白蛋白融合蛋白的组合物，其中该组合物具有少于20ng/mg的宿主细胞蛋白，并且其中位置46、151或两个位置处的色氨酸不被氧化。
本文的披露还涉及药学上可接受的配制品，该配制品包含：(a)本文披露的任何组合物；(b)缓冲液；(c)糖；和(d)乳化剂。
附图说明
出于说明本发明的目的，在附图中描绘了本发明的某些实施例。然而，本发明不限于附图中所描绘的实施例的精确安排和手段。
图1描绘了rHSA纯化过程的一个实施例的流程图。
图2描绘了rHSA的在300cm/h下操作的汽巴蓝(Cibacron blue)染料层析的代表性层析图。
图3描绘了白蛋白融合物纯化过程的一个实施例的流程图。
图4描绘了白蛋白融合蛋白#1(AFP-1)的在300cm/h下操作的汽巴蓝染料层析的代表性层析图。
图5描绘了AFP-1的在300cm/hr下操作的代表性Capto Q层析图。
图6描绘了在10MV/hr下操作的代表性Mustang Q膜层析图。
图7描绘了在130cm/hr下以结合和洗脱模式操作的代表性Toyopearl PPG-600M层析图。
图8A-8B描绘了用(A)25mM辛酸盐和(B)2M NaCl洗脱缓冲液进行的白蛋白融合蛋白的汽巴蓝染料层析。
图9A-9B描绘了Mustang Q膜层析的随pH和NaCl浓度变化的步骤产率(图7A)和DNA对数减少值(LRV)(图7B)。
图10描绘了白蛋白融合蛋白的随氧化变化的相对效力。□表示AFP-1的甲硫氨酸M498；○表示AFP-1的色氨酸W46/W151；◇表示AFP-1的甲硫氨酸残基M74/M179；并且Δ表示AFP-1的甲硫氨酸M529。
图 11描绘了如通过SEC-HPLC测量的针对来自Capto Blue(“Blue”)和Capto Q(“Q”)过程的过程中间体的色氨酸氧化随时间(天)的综述。
图12示出了AFP-1的代表性HIC层析图，包括Capto MMC、Butyl-S Fast Flow、Toyopearl PPG-600M和Toyopearl Phenyl-650M。
图14示出了经纯化的白蛋白融合蛋白的随在Butyl-S Fast Flow(●)或PPG-600M(○)层析运行期间取的HIC级分中HIC-HPLC早期种类含量变化的相对效力。
具体实施方式
定义
在详细描述本发明之前，应理解的是本发明不限于特定的组合物或方法步骤，因为这些组合物或方法步骤可以变化。必须注意的是，如在本说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数指代物，除非上下文另外明确地指示。术语“一个”(或“一种”)以及术语“一个或多个/一种或多种”和“至少一个/一种”在本文可以互换地使用。
此外，当在本文使用时，“和/或”应被理解为这两个指定的特征或组分每一者与或不与另一者的特定披露。因此，术语“和/或”如在本文在词组如“A和/或B”中使用时，旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)以及“B”(单独)。同样地，术语“和/或”如在本文在词组如“A、B和/或C”中使用时，旨在涵盖以下实施例中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。
除非另外定义，否则在本文使用的所有技术和科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。例如，以下字典为技术人员提供了本发明中所使用的许多术语的通用词典：the Concise Dictionary of Biomedicine and MolecularBiology,Juo,Pei-Show,2nd ed.,2002,CRC Press[生物医学和分子生物学简明词典，Juo,Pei-Show，第2版，2002，CRC出版社]；The Dictionary ofCell and Molecular Biology,3rd ed.,1999,Academic Press[细胞和分子生物学词典，第3版，1999，学术出版社]；以及the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology,Revised,2000,Oxford University Press[牛津生物化学和分子生物学词典，修订版，2000，牛津大学出版社]。
单位、前缀和符号均以它们的国际单位系统(SI)接受形式表示。数值范围包括定义该范围的数字。除非另外说明，否则氨基酸序列以氨基至羧基取向从左向右书写。在本文提供的小标题不是本发明的不同方面或实施例的限制，可以通过作为一个整体参考本说明书来获得这些方面。因此，紧接着在下文中定义的术语通过参考整个说明书来更全面地定义。
应当理解的是，无论在什么情况下在本文用语言“包含”描述实施例时，也提供了用“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的其他类似实施例。
氨基酸在本文中通过其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样地，核苷酸通过它们的普遍公认的单字母代码来提及。
如在本文使用的术语“表位”是指能够结合本发明支架的蛋白质决定子。表位通常由如氨基酸或糖侧链分子的化学活性表面基团组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象表位和非构象表位的区别在于：在变性溶剂存在下，与前者的结合丧失但与后者的结合不丧失。
术语“纤连蛋白III型(FnIII)结构域”、“FnIII结构域”和“FnIII支架”是指与人类纤连蛋白III型结构域同源的多肽，该结构域具有至少7条分布于两个β片层之间的β链并且进一步含有溶剂暴露环，这些β片层自身互相抵靠包装以形成蛋白质的核心，这些环将β链彼此连接。在β片层夹心的每个边缘处存在至少三个这样的环，其中边缘是垂直于β链的方向的蛋白质的边界。在某些实施例中，FnIII结构域包含7条连接至六个被指定为AB、BC、CD、DE、EF和FG的环区的被指定为A、B、C、D、E、F和G的β链，其中环区与每条β链都连接。
在本文使用的术语“Tn3支架”是指包含至少一个FnIII支架的分子，其中Aβ链包含SEQ ID NO:11，Bβ链包含SEQ ID NO:12，Cβ链包含SEQ ID NO:13或14，Dβ链包含SEQ ID NO:15，Eβ链包含SEQ ID NO:16，Fβ链包含SEQ ID NO:17，并且β链G包含SEQ ID NO:18，其中至少一个环是“亲本Tn3支架”中的环的非天然存在的变体。在某些实施例中，Tn3模块的一条或多条β链包含至少一个氨基酸取代，除了Cβ链中的半胱氨酸残基(例如，SEQ ID NO:13或14中的半胱氨酸)和Fβ链(SEQ ID NO:17)不被取代以外。
如在本文使用的术语“亲本Tn3”是指包含SEQ ID NO:3的FnIII支架，即衍生自人类肌腱蛋白C的第三FnIII结构域的热稳定化的半胱氨酸工程化的FnIII支架。
术语“多聚体”或““”多聚支架”是指包含至少两个关联的FnIII支架的分子。形成多聚支架的支架可以通过接头连接，该接头允许每个支架独立地发挥作用。
术语“单体”、“单体亚单位”或“单体支架”是指只包含一个FnIII支架的分子。
如在本文使用的术语“CD40L特异性单体亚单位”是指衍生自“亲本Tn3”的Tn3单体，其中该Tn3单体与CD40L或其片段(例如，CD40L的可溶态)特异性地结合。
术语“DNA”是指两个或更多个共价键合的天然存在的或经修饰的脱氧核糖核苷酸的序列。
术语“融合蛋白”是指包括(i)一种或多种连接至(ii)第二不同蛋白质(即，“异源”蛋白质)的治疗性蛋白或片段的蛋白质。在本发明的范围内，白蛋白(HSA、变体HSA或片段HSA)与治疗性蛋白或片段连接。
表1：“亲本Tn3”的组分的序列和SEQ ID NO
在本文使用术语“异源部分”来指示向本发明的Tn3支架添加组合物，其中该组合物正常地不是FnIII结构域的部分。示例性异源部分包括蛋白质、肽、蛋白质结构域、接头、药物、毒素、显像剂、放射性化合物、有机和无机聚合物、以及任何其他可以提供不是该FnIII结构域自身固有的活性的组合物，这些其他组分包括但不限于聚乙二醇(PEG)、细胞毒剂、放射性核素、显像剂、生物素、二聚化结构域(例如亮氨酸拉链结构域)、人血清白蛋白(HSA)或其FcRn结合部分、抗体的结构域或片段(例如，抗体可变结构域、CH1结构域、Cκ结构域、Cλ结构域、CH2或CH3结构域)、单链抗体、结构域抗体、白蛋白结合结构域、IgG分子、酶、配体、受体、结合肽、非FnIII支架、表位标签、重组多肽聚合物、细胞因子等。
如在本文使用的术语“接头”是指任何连接(join)或连接(connect)两个或更多个支架的分子组件。接头可以是其功能是在支架中的模块之间充当“间隔子”的分子，或者它还可以是具有另外的功能的分子(即，“功能部分”)。包括在“异源部分”的定义中的分子也可以作为接头而发挥作用。
术语“连接”、“缀合”和“融合”可互换地使用。这些术语是指通过包括化学缀合或重组手段的任何手段将两个或更多个支架、异源部分或接头连接在一起。
术语“结构域”或“蛋白质结构域”是指可以被折叠为稳定的三维结构(通常独立于蛋白质的剩余部分)并且可以被赋予具体功能的蛋白质的区域。这种结构维持与原始蛋白质内的结构域的功能相关的特定功能，例如酶活性、用于另一个分子的识别基序的创建或用来为蛋白质提供必需的结构组分，以在蛋白质的具体环境中存在。在蛋白质家族内以及在相关蛋白质超家族内，蛋白质结构域可以是进化上保守的区域。当描述多聚支架的组分时，术语“结构域”、“单体支架”、“单体亚单位”和“模块”可以可互换地使用。“天然FnIII结构域”意指由活有机体编码的任何非重组FnIII结构域。
“蛋白质序列”或“氨基酸序列”意指多肽中氨基末端至羧基末端方向上的氨基酸成分的线性表示，其中在表示中彼此相邻的残基在多肽的一级结构中是连续的。
术语“核酸”是指任何两个或更多个共价键合的核苷酸或核苷酸类似物或衍生物。如在本文使用的，这个术语包括但不限于DNA、RNA和PNA。“核酸”和“多核苷酸”在本文可互换地使用。
术语“多核苷酸”旨在涵盖单数核酸以及复数核酸，并且是指分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。术语“分离的”核酸或多核苷酸是指已经从其天然环境中去除的核酸分子、DNA或RNA。例如，出于本发明的目的，载体中所含的编码例如本发明支架的重组多核苷酸被认为是分离的。分离的多核苷酸的另外的实例包括维持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或溶液中的纯化(部分地或基本上)多核苷酸。分离的RNA分子包括本发明的多核苷酸的体内或体外RNA转录物。根据本发明的分离的多核苷酸或核酸进一步包括合成产生的这类分子。另外，多核苷酸或核酸可以是或可以包括调控元件如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
术语“药学上可接受的”是指可以给予至动物(例如，哺乳动物)而没有显著不利的医疗后果的化合物或蛋白质。
术语“生理学上可接受的载体”是指对所治疗的宿主不具有显著有害影响并且保留给予的化合物的治疗特性的载体。一种示例性的生理学上可接受的载体是生理盐水。其他生理学上可接受的载体及其配制品是本领域技术人员已知的，并且描述于例如Remington's Pharmaceutical Sciences,(18th edition),ed.A.Gennaro,1990,MackPublishing Company,Easton,Pa.[雷明顿药物科学，(第18版)，A.Gennaro编辑，1990，麦克出版公司，伊斯顿，宾夕法尼亚州]，通过引用并入本文。
“多肽”意指通过酰胺键(肽键)线性连接的两个或更多个氨基酸的任何序列，而不管长度、翻译后修饰或功能。“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换地使用。因此，肽、二肽、三肽或寡肽被包括在“多肽”的定义内，并且术语“多肽”可以用于替代这些术语中的任何一个或与这些术语可互换地使用。术语“多肽”还旨在指多肽在表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/阻断基团来进行的衍生、蛋白水解裂解或通过非天然存在的氨基酸来进行的修饰。多肽可以来源于天然生物来源或通过重组技术来产生，但不是必然从指定的核酸序列翻译而来。多肽可以按任何方式(包括通过化学合成)来产生。
本发明的多肽还包括前述多肽的片段、衍生物、类似物或变体，及其任何组合。变体可以天然地存在或是非天然存在的。非天然存在的变体可以使用本领域已知的诱变技术来产生。变体多肽可以包含保守或非保守氨基酸取代、缺失或添加。含有二十种标准氨基酸的一种或多种天然存在的氨基酸衍生物的那些肽也作为“衍生物”被包括在内。
“随机化的”或“突变的”意指相对于模板序列包括一个或多个氨基酸改变，包括缺失、取代或添加。“随机化”或“突变”意指将这种氨基酸改变引入序列中的过程。随机化或突变可以通过(通常是核酸编码序列的)有意的、盲目的或自发的序列变化来完成，并且可以通过任何技术(例如PCR、易错PCR或化学DNA合成)发生。术语“随机化”、“随机化的”、“突变”、“突变的”等在本文可互换地使用。
“同源的”或“同源的未突变的蛋白质”意指除了引入变体蛋白质的氨基酸突变之外，序列上与变体蛋白质相同的蛋白质，其中变体蛋白质是随机化的或突变的。
“RNA”意指两个或更多个共价键合的天然存在的或经修饰的核糖核苷酸的序列。这个术语中所包括的经修饰的RNA的一个实例是硫代磷酸酯RNA。
如在本文使用的，术语“本发明的支架”或“本发明的多个支架”是指多聚Tn3支架以及单体Tn3支架。术语“靶标”是指被本发明的特定支架识别的化合物。术语“靶标”和“抗原”在本文可互换地使用。如在本文使用的术语“特异性”，例如在术语“特异性结合”(specifically binds或specific binding)中，是指本发明的Tn3支架经由一个或多个抗原结合结构域结合一个或多个抗原并且结合需要一个或多个抗原结合结构域与一个或多个抗原之间的一些互补性的相对亲和力。根据这个定义，当与本发明的Tn3支架将结合至随机的不相关表位相比，该Tn3支架更容易地结合至表位时，该Tn3支架被认为是“特异性地结合”至该表位。
“亲和力成熟的”支架是通常在环中具有一个或多个改变的支架，这导致与不具有那一个或多个改变的亲本Tn3支架相比，该Tn3支架对表位的亲和力的改善。
如在本文使用的术语“亲和力”是指本发明的某一Tn3支架与单独表位结合的强度的量度。
如在本文使用的术语“亲合力”是指在本发明的Tn3支架群体与某一表位之间的复合物的总体稳定性，即多个Tn3支架与该抗原结合的功能上地复合强度。亲合力与单独抗原结合结构域与特定表位的亲和力相关，并且还与本发明的支架的效价相关。
术语“对靶标的作用”是指本发明的Tn3支架与一个或多个靶标的结合以及由这种结合产生的生物效应。在这个方面中，在Tn3支架支架中的多个抗原结合单位可以与多种靶标和/或表位相互作用，并且例如使两个靶标物理地离得更近、通过与不同的靶标相互作用触发代谢级联等。关于CD40L，“对靶标的作用”是指例如通过CD40L的一种或多种生物活性的增强、刺激或激活实现的作用。
如在本文使用的术语“效价”是指潜在的抗原结合模块的数目，例如在本发明的支架中的FnIII模块的数目。当本发明的Tn3支架包含多于一个抗原结合模块时，每个结合模块都可以与同一靶标或不同靶标中的同一表位或不同表位特异性地结合。
如在本文使用的术语“二硫键”包括在两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包含可以与第二硫醇基形成二硫键或二硫桥的硫醇基。
术语“免疫球蛋白”和“抗体”包含可以通过生物化学方法区分的多种多样的多肽。本领域普通技术人员将理解的是，重链被分为γ、μ、α、δ或ε。这种链的性质决定了抗体的“类别”分别为IgG、IgM、IgA IgG或IgE。技术人员可以容易地辨别这些类别中的每个的修饰版本。如在本文使用的，术语“抗体”包括但不限于完整抗体、修饰抗体、抗体VL或VL结构域、CH1结构域、Cκ结构域、Cλ结构域、Fc结构域(见下文)、CH2或CH3结构域。
如在本文使用的，术语“Fc结构域”结构域是指抗体恒定区的一部分。传统地，术语Fc结构域是指涵盖抗体的配对CH2、CH3和铰链区的蛋白酶(例如，木瓜蛋白酶)裂解产物。在本披露的上下文中，术语Fc结构域或Fc是指不管产生手段的任何多肽(或编码这样一种多肽的核酸)，其包括免疫球蛋白多肽的CH2、CH3和铰链区的全部或一部分。
如在本文使用的，术语“修饰抗体”包括被改变这样使得它们不是天然存在的抗体的合成形式，例如包含至少两个重链部分但是不是两个完整的重链的抗体(作为例如结构域缺失的抗体或迷你抗体(minibody))；被改变以与两个或更多个抗原结合或与单一抗原的不同表位结合的抗体的多特异性(例如，双特异性、三特异性等)形式。另外，术语“修饰抗体”包括抗体的多价形式(例如，与同一抗原的三个或更多个拷贝结合的三价、四价等抗体)。(参见例如，Antibody Engineering,Kontermann&Dubel,eds.,2010,SpringerProtocols,Springer[抗体工程，Kontermann和Dubel编著，2010，斯普林格试验指南，斯普林格出版社])。
以其正常含义使用术语“体内半衰期”，即多肽的50％的生物活性仍存在于身体/靶器官中的时间，或该多肽的活性是其初始值的50％的时间。作为确定功能性体内半衰期的替代方案，可以确定“血清半衰期”，即在被清除之前50％的多肽分子在血浆或血流中循环的时间。血清半衰期的确定通常比确定功能性体内半衰期更简单并且血清半衰期的量级通常是功能性体内半衰期的量级的好指征。血清半衰期的替代术语包括“血浆半衰期”、循环半衰期(circulating half-life)、循环半衰期(circulatory half-life)、血清清除率、血浆清除率以及清除半衰期。有待保留的功能性正常地选自促凝血活性、蛋白水解活性、辅因子结合活性、受体结合活性或与具体蛋白质相关的其他类型的生物活性。
使用相对于功能性体内半衰期或血浆半衰期的术语“增加的”来指示如在可比较的条件下所确定的，相对于参考分子(例如未修饰的多肽)的相关半衰期，该多肽的相关半衰期是统计学上显著增加的。
使用相对于功能性体内半衰期或血浆半衰期的术语“减少的”来指示如在可比较的条件下所确定的，相对于参考分子(例如未修饰的多肽)的相关半衰期，该多肽的相关半衰期是统计学上显著减少的。
如在本文使用的术语“表达”是指基因产生生物化学物质例如本发明的支架或其片段的过程。该过程包括基因在细胞内的功能性存在的任何表现，包括但不限于基因敲除以及瞬态表达和稳定表达两者。它包括但不限于将基因转录成一个或多个mRNA，和将这样的mRNA翻译成一个或多个多肽。如果最终所希望的产物是生物化学物质，那么表达包括所述生物化学物质和任何前体的产生。
“表达产物”可以是核酸(例如，通过基因转录而产生的信使RNA)或多肽。本文所述的表达产物进一步包括具有转录后修饰(例如，多聚腺苷酸化)的核酸，或具有翻译后修饰(例如，甲基化、糖基化、添加脂质、与其他蛋白质亚单位相关联、蛋白水解裂解等)的多肽。
术语“载体”或“表达载体”在本文用于意指根据本发明用作在宿主细胞中引入并表达所希望的表达产物的媒介物的载体。如本领域普通技术人员已知的，这类载体可以容易地选自下组，该组由以下各项组成：质粒、噬菌体、病毒和逆转录病毒。通常，与本发明相容的载体将包含选择标记物、促进所希望的核酸的克隆和进入和/或在真核或原核细胞中复制的能力的适当限制位点。
术语“宿主细胞”是指具有使用重组DNA技术构建并编码至少一种表达产物的载体的细胞。在从重组宿主分离表达产物的过程的描述中，除非另有明确说明，否则术语“细胞”和“细胞培养物”可互换地使用以表示表达产物的来源，即从“细胞”回收表达产物意指从离心的全细胞回收，或从含有培养基和悬浮细胞的细胞培养物中回收。
如在本文使用的术语“治疗”(treat或treatment)是指治疗性治疗和预防性(prophylactic)或预防性(preventative)措施，其中目的是预防或减缓(减轻)受试者中不希望的生理变化或障碍，如炎性疾病或病症的进展。有益的或所希望的临床结果包括但不限于症状缓解、疾病程度减轻、疾病状态稳定化(即，未恶化)、疾病进展延迟或减缓、疾病状态改善或缓和以及减轻(无论是部分减轻还是全部减轻)，无论是可检测的还是不可检测的。
术语“治疗”(treatment)还意指与不接受治疗的预期存活相比延长存活。需要治疗的那些包括已患有病症或障碍的那些以及易于患上病症或障碍的那些或打算预防病症或障碍的那些。
术语“受试者”、“个体”、“动物”、“患者”或“哺乳动物”是指任何希望诊断、预后或治疗的个体、患者或动物，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人、家畜、农畜以及动物园动物、体育动物或宠物动物，如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、乳牛等。
如在本文使用的术语“CD40L”是指但不限于在T细胞表面表达的CD40L、重组表达的CD40L、由大肠杆菌或其他适合的重组蛋白表达系统表达并纯化的CD40L、未糖基化的CD40L以及CD40L的可溶性片段。如在本文使用的，“CD40L”还指MegaCD40L。MegaCD40LTM是一种高活性的构建体，其中两个三聚CD40配体经由ACRP30/脂连蛋白的胶原结构域被人工连接。这个构建体在体内非常有效地模拟CD40L的天然膜辅助聚集。它为[CD40L+增强子]组合(亚力克西斯生化制品公司(Alexis biochemicals))提供了一种简单且同样有效的替代物。术语“CD40L”是指CD40L的单体形式以及低聚形式，例如三聚CD40L。
术语“CD40L”是指全长CD40L和可溶性片段两者，例如由蛋白水解生成的CD40L的细胞外结构域形式。在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中分别示出了人类CD40L(Swissprot：P29965)的膜结合和可溶形式的氨基酸序列。
以最广泛的意义使用术语“CD40L拮抗剂”或“拮抗剂”，并且包括在体内、在原位或在体外部分地或完全地抑制、减少或钝化CD40L及其生物活性变体的一种或多种生物活性的任何分子。例如，由于与CD40L结合，CD40L拮抗剂可以发挥作用以在体内、在体外或在原位部分地或完全地抑制、减少或钝化一个或多个CD40L分子或一个或多个与CD40或其他靶标结合的CD40L分子的一种或多种生物活性。
以最广泛的意义使用术语“CD40L激动剂”或“激动剂”，并且包括在体内、在原位或在体外部分地或完全地增强、刺激或激活CD40L及其生物活性变体的一种或多种生物活性的任何分子。例如，由于与CD40L结合，CD40L激动剂可以发挥作用以在体内、在体外或在原位部分地或完全地增强、刺激或激活一个或多个CD40L分子或一个或多个与CD40R或其他靶标结合的CD40L分子的一种或多种生物活性。
如在本文使用的，术语“晶体”是指物质的固态的一种形式，其中原子被安排为三维地周期性重复的模式，典型地形成晶格。
如在本文使用的，术语“空间群对称性”是指将晶格的平移对称性与点群对称性合并的晶体的整体对称性。由标识晶格群的大写字母(P、A、F等)、随后是点群符号来指定“空间群”，其中将旋转和反射元件延伸以包括螺旋轴和滑移面。要注意的是，可以通过移除空间群的胞心符号(cell centering symbol)并且将所有的螺旋轴用类似的旋转轴替换并将所有的滑移面用镜平面替换来确定给定的空间群的点群对称性。空间群的点群对称性描述了其倒易晶格的真实对称性。
如在本文使用的，术语“晶胞”意指在晶体中以规则重复模式安排的原子，其中最小的重复单位被叫做晶胞。可以由晶胞的知识重建整个结构，晶胞由三个长度(a、b、和c)以及三个角度(α、β和γ)来表征。数量a和b是晶胞的底部的侧面的长度并且γ是这两个侧面之间的角度。数量c是晶胞的高度。角度α和β描述了晶胞的底部与垂直侧面之间的角度。
如在本文使用的，术语“机器可读的数据存储介质”意指用机器可读的数据编码的数据存储材料，其中用使用这样的数据的指令将机器程序化并且该机器能够以所希望的格式展示数据，例如分子或分子复合物的图形化的三维表示。
术语“X射线衍射图”意指从晶体中的分子或原子的周期性组件的X射线散射获得的图案。X射线结晶学是一种利用了X射线被晶体折射的事实的技术。X射线具有有待被可比较的大小的原子的电子云散射的适当的波长(在埃范围内，大约10-8cm)。基于从晶体中的分子或原子的周期性组件的X射线散射获得的衍射图，可以重建电子密度。可以从衍射数据或从补充衍射实验中提取到另外的相位信息以完成重建(在结晶学中的相位问题)。一种模型是渐进地建成实验的电子密度，针对数据进行精制，以产生精确的分子结构。X射线结构坐标定义空间中的点的独特构型。本领域的普通技术人员理解的是，针对蛋白质或蛋白质-配体复合物或其部分的一组结构坐标定义相对的点集，这个点集反过来定义三维构型。可以通过一组完全不同的坐标定义相似的或相同的构型，其条件是坐标之间的距离和角度保持基本相同。另外，可以通过标量因子增加或减小坐标之间的距离同时保持角度基本相同来确定点的构型。
如在本文使用的，术语“晶体结构”是指结晶材料中的重复原子单位或分子单位的三维排列或晶格间距排列。可以通过X射线结晶学方法确定结晶材料的晶体结构，参见例如Jan Drenth的“Principles of Protein X-Ray Crystallography”,Springer AdvancedTexts in Chemistry,Springer Verlag,2nd ed.,February 199,ISBN:0387985875[蛋白质X射线结晶学原理，施普林格高等化学教科书，施普林格出版社，第2版，二月199，ISBN：0387985875]，和Alexander McPherson的“Introduction to MacromolecularCrystallography”,Wiley-Liss,Oct.18,2002,ISBN:0471251224[大分子结晶学入门，威利-利斯出版社，2002年10月18日，ISBN：0471251224]。
术语“效应子功能”是指由抗体的Fc区(天然Fc区或氨基酸序列变体Fc区)引起的抗体或抗体片段的那些生物活性，并且随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调；以及B细胞激活。
术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指一种细胞毒性形式，其中结合至存在于某些细胞毒性细胞(例如，天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上的Fc受体(FcR)上的分泌的Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性地结合至带有抗原的靶细胞并且随后用细胞毒素杀伤这些靶细胞。
术语“Fc受体”或“FcR”描述了与抗体的Fc区结合的受体。FcR可以是天然序列人类FcR。FcR可以与IgG抗体(γ受体)结合并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII子类的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。该术语还包括新生儿受体FcRn。
术语“共有序列”是指在比对多个序列之后在具体位置处显示最常见的氨基酸的蛋白质序列。共有序列是一种表示多重序列比对的结果的方式，其中相关的序列被彼此比较。共有序列显示在比对中的每个位置处哪些残基是最丰富的，以及在每个位置处的变异性程度。
术语“基本上不含”是指相对于蛋白质中的氨基酸残基的总数组合物具有少于10％经氧化的色氨酸残基、相对于蛋白质中的氨基酸残基的总数组合物具有少于8％经氧化的色氨酸残基、相对于蛋白质中的氨基酸残基的总数组合物具有少于5％经氧化的色氨酸残基、相对于蛋白质中的氨基酸残基的总数组合物具有少于4％经氧化的色氨酸残基、相对于蛋白质中的氨基酸残基的总数组合物具有少于3％经氧化的色氨酸残基、相对于蛋白质中的氨基酸残基的总数组合物具有少于2％经氧化的色氨酸残基、相对于蛋白质中的氨基酸残基的总数组合物具有少于1％经氧化的色氨酸残基。在一些实施例中，术语“基本上不含”是指相对于蛋白质中的氨基酸残基的总数组合物具有少于5％经氧化的色氨酸残基。
术语“生物活性”或“活性”是指治疗性蛋白(例如，TN3支架)的生物活性，以及它以其预期方式(例如，与CD40L结合)在体内发挥作用的能力。在一些实施例中，活性是指“相对活性”，即经纯化的治疗性蛋白相对于未经氧化的治疗性蛋白的活性。在一些实施例中，经纯化的治疗性蛋白的相对活性大于80％、大于85％、大于90％、大于92％、大于94％、大于95％、大于98％或大于99％。
已经发现白蛋白与治疗性蛋白融合可增加或延长经融合治疗性蛋白的体内或血清半衰期。然而，已经发现在这样的白蛋白融合蛋白的纯化期间，某些氨基酸残基可能对氧化敏感，从而降低或限制白蛋白融合蛋白的生物活性。本发明针对减少白蛋白融合蛋白中敏感的氨基酸残基的氧化和纯化这样的白蛋白融合蛋白的方法。在一个实施例中，白蛋白融合蛋白包括支架。在另一个实施例中，该支架包含Fn3结构域。在又另一个实施例中，该支架包含能够与CD40L结合的人类肌腱蛋白C(Tn3)支架。
减少白蛋白融合蛋白氧化的过程
在白蛋白融合蛋白的纯化过程期间，某些氨基酸残基可能变得对氧化敏感，这可以抑制白蛋白融合蛋白的生物活性和相对效力。例如，一个或多个色氨酸和/或甲硫氨酸残基可能变得对氧化敏感。根据本发明，通过使包含白蛋白融合蛋白的溶液在适当条件下经受亲和层析基质和阴离子交换层析基质来降低白蛋白融合蛋白的敏感的氨基酸残基的氧化。
亲和基质层析
亲和层析步骤利用优先地结合白蛋白的亲和基质。例如，适合的基质包括汽巴蓝染料、Reactive Blue 2、Procion Blue HB、Capto Blue、Capto Blue(高取代(high sub))、Toyopearl、AF-Blue HC-650M、Blue Sepharose、Blue Trisacryl、Mimetic Blue 1、Mimetic Blue SA、Mimetic Blue SA HL以及其他蒽醌型化合物、硝化纤维素基质、基于抗体的基质(如来自生命技术公司(Life Technologies)的Capture Select)、基于脂肪酸的基质。在一个实施例中，由于其对白蛋白的亲和力，汽巴蓝染料层析是用于从细胞培养基中纯化白蛋白融合蛋白的理想选择。尽管许多汽巴蓝染料层析树脂是可商购的，它们中的许多对于大规模纯化白蛋白融合蛋白而言不够理想。用于大规模纯化，树脂应当由最小化与宿主相关杂质的非特异性相互作用的材料制成，具有良好的压力流动特征并且在极端pH下是稳定的以达到消毒目的(在腐蚀性条件下优选地稳定)。考虑到这些特性，几种可商购的汽巴蓝染料层析树脂作为临床和商业规模纯化的潜在树脂脱颖而出：来自通用医疗集团(GE Healthcare)的Capto Blue和Capto blue(高取代)以及来自东曹生物科学公司(TosohBiosciences)的Toyopearl AF-Blue HC-650M。在两种Capto Blue选择中，在一些实施例中，高取代版本因其较高的配体密度和因此较高的结合能力是优选的。
在典型的纯化过程中，将汽巴蓝染料柱在中性pH附近或微酸性pH下用缓冲液(如磷酸盐、tris、bis-tris等)平衡，并且然后加载含有白蛋白融合蛋白的澄清的细胞培养液或过程中间体(如果汽巴蓝染料柱不是初始纯化步骤的话)。
可以将不同量的蛋白质加载到柱上。在一些实施例中，可以将约5g蛋白质/L树脂至约100g蛋白质/L树脂、约10g蛋白质/L至约50g蛋白质/L树脂或约25g蛋白质/L树脂加载到亲和柱上。
在加载样品之后，任选地将含有结合的白蛋白融合蛋白的亲和层析柱再平衡并且然后可以用更具侵蚀性的缓冲液进一步洗涤以进一步去除与柱结合的(通过非特异性相互作用)或与白蛋白融合蛋白结合的(通过蛋白质-蛋白质相互作用)宿主细胞杂质。可以将洗涤缓冲液优化以去除这些杂质。在一个实施例中，该洗涤缓冲液含有多元醇；盐；硫酸钠；非离子型表面活性剂；尿素；和/或烟酰胺。
在一个实施例中，该洗涤缓冲液包含约2％至约20％的多元醇。该多元醇可以选自下组，该组由以下各项组成：1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,2-丁二醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇、1,6-己二醇和2-甲基-2,4-戊二醇。
不同浓度的盐可以存在于洗涤缓冲液中。在一些实施例中，该盐以适合的量存在，例如约0.05M至约2.0M的盐、约0.1M至约1.8M的盐、约0.2M至约1.5M的盐、约0.3M至约1.0M的盐、约0.4M至约0.8M的盐或约0.5M的盐。该盐可以选自本领域常用的那些，例如氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化锂、溴化钠、溴化钾和溴化锂。
可以使用不同浓度的硫酸钠。硫酸钠能以约0.01M至约0.5M、0.02M至约0.3M、约0.04M至约0.2M或约0.05M至约0.1M的量存在。
可以使用各种非离子型表面活性剂。例如，在一些实施例中，该非离子型表面活性剂可以选自下组，该组由以下各项组成：曲通X-100、吐温80、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、壬苯醇醚-9、泊洛沙姆、硬脂醇或脱水山梨醇单硬脂酸酯。可以使用不同浓度的非离子型表面活性剂。例如，在一些实施例中，这些非离子型表面活性剂以约0.01％至约1％、约0.02％、约0.4％、约0.05％至约0.2％或约0.08％至约0.01％的浓度存在于洗涤缓冲液中。
本领域已知各种离液剂。在本发明中，尿素是有待在洗涤缓冲液中使用的离液剂。尿素能以约0.02M至约1.5M、约0.05M至约1.0M或约0.08M至约1.0M的洗涤缓冲液的量存在。
在一些实施例中，将烟酰胺用于洗涤缓冲液中。烟酰胺能以约0.01M至约1.0M、约0.02M至约0.5M、约0.04M至约0.3M、约0.06M至约0.2M或约0.1M的洗涤缓冲液的量存在。
该洗涤缓冲液可以具有各种pH水平。在一些实施例中，该洗涤缓冲液的pH大于约5.0、大于约5.5或大于约6.0。在一些实施例中，该洗涤缓冲液的pH小于约8.0、小于约7.5、小于约7.0或小于约6.5。在一些实施例中，该洗涤缓冲液的pH是约5.0至约8.0、约5.5至约7.5、约5.5至约7.0、约6.0至约7.0或约6.5至约7.0。
在本发明的另一个实施例中，该洗涤缓冲液包含约5％至约15％的多元醇、约0.2M至约0.8M的盐、约0.2M至约0.8M的硫酸钠、约0.02％至约0.2％的非离子型表面活性剂和/或约0.2M至约1.0M的尿素。在本发明的一个方面中，该洗涤缓冲液包含多元醇1,2-丙二醇、盐氯化钠和非离子型表面活性剂曲通X-100。在本发明的另一个方面中，该洗涤缓冲液包含约0.5M的氯化钠；约0.5M的硫酸钠；或约10％的1,3-丙二醇。根据本发明的一个方面，该洗涤缓冲液具有约5.5至约7.0的pH。
在一些实施例中，该洗涤缓冲液适于将DNA浓度降至小于约5x102ng/mg DNA、小于约2x102ng/mg DNA或小于约50ng/mg DNA。在一些实施例中，该洗涤缓冲液适于将宿主细胞蛋白(HCP)减至小于50,000ng/mg、小于20,000ng/mg或小于10,000ng/mg。
在一些实施例中，通过将高pH缓冲液应用至柱或者添加高浓度的盐、温和的有机溶剂或组合以破坏产物的结合而将经纯化的产物从亲和基质柱上洗脱。在一个实施例中，该洗脱缓冲液包含碱，如bis-tris、tris或磷酸盐碱。在本发明的另一个方面中，该洗脱缓冲液的碱是50mM的bis-tris。在另一个实施例中，该洗脱缓冲液包含洗脱盐，如辛酸盐、NaCl、或者辛酸、庚酸、己酸或壬酸的钠盐和/或钾盐。在一些实施例中，该洗脱缓冲液包含辛酸钠。该盐能以约5mM至约500mM、约20mM至约250mM、约50mM至约200mM或约75mM至约150mM的量存在于洗脱缓冲液中。在另一个实施例中，该洗脱缓冲液包含EDTA或其他螯合剂。在一个实施例中，该亲和基质洗脱缓冲液包含适合量(如约2mM至约20mM EDTA)的EDTA。在另外的实施例中，该亲和基质洗脱缓冲液包含辛酸盐。
根据本发明，亲和层析具有低水平的经氧化的产物。在一个实施例中，相对于全蛋白，在亲和层析后含有白蛋白融合蛋白的中间产物具有少于约100％、少于约90％、少于约80％、少于约70％、少于约60％、少于约50％、少于约40％、少于约30％、少于约20％、少于约10％、少于约9％、少于约8％、少于约7％、少于约6％、少于约5％或少于约4％的经氧化的产物。在另一个实施例中，相对于色氨酸残基的总数，在亲和层析后含有白蛋白融合蛋白的中间产物具有少于约50％、少于约40％、少于约30％、少于约20％、少于约10％、少于约9％、少于约8％、少于约7％、少于约6％、少于约5％或少于约4％的经氧化的色氨酸残基。在另一个实施例中，亲和基质步骤从原始样品中去除至少1、2、3、1-2或2-3个数量级的宿主细胞蛋白。在本发明的实施例中，亲和基质步骤从原始样品中去除至少1、2、3、4、1-2、2-3、3-4个数量级的DNA杂质。
病毒灭活
在本发明的一个实施例中，可以处理含有白蛋白融合蛋白的级分或样品以灭活可能存在的病毒。以此方式，可以用病毒灭活剂(例如，曲通X-100、吐温80、吐温20、三正丁基磷酸酯或尿素)处理该级分/样品。在一个实施例中，病毒灭活步骤出现在亲和层析与阴离子交换层析步骤之间。以此方式，能以约0.05％至约3％、约0.01％至约1％或约0.1％至约0.5％的量添加病毒灭活剂(例如，曲通X-100)持续约1秒钟至约10小时、约30秒钟至约5小时、约30分钟至约3小时或约2小时的时间。在一个实施例中，病毒灭活剂是0.5％曲通X-100(w/w)，保持约30至约240分钟(例如，130分钟)。
阴离子交换层析
在本发明的另一个方面中，使含有白蛋白融合蛋白的级分或样品经受阴离子交换层析。阴离子交换可以经由结合和洗脱系统或流通系统或两者进行。可以使用任何适合的阴离子交换基质。在一个实施例中，阴离子交换基质可以是树脂，如琼脂糖或琼脂糖凝胶，例如或合成微孔或大孔膜。适合的结合和洗脱阴离子交换基质包括例如Q-树脂、季胺、DEAE。可商购的基质包括例如Capto Q、Toyopearl SuperQ、ANX、DEAE、Q-Sepharose、Q-Sepharose FF、Q-Sepharose HP和Q-Sepharose XL、Q-Hyper D、DEAE-纤维素、QAE-纤维素、TMAE、DMAE或DEAE Fractogel、Mustang Q、Sartobind Q或Sartobind STIC PA。这样的基质可以包含高度交联的琼脂糖或是聚合的，具有例如聚醚砜聚丙烯、甲基丙烯酸酯或聚丙烯酸酯基。柱加载量(challenge)在约0.1至约50g/L、约0.5至约40g/L、约1至约30g/L或约5至约25g/L的范围内。膜加载量在约0.1至约10g/mL、约0.2至约5.0g/mL、约0.5至约2.5g/mL或约1.0至约2.0g/mL的范围内。
在另一个实施例中，基质被修饰成增强白蛋白融合蛋白的纯化。例如，在一个实施例中，该基质是具有葡聚糖表面增充剂的高度交联的琼脂糖。在另一个实施例中，用季胺修饰聚醚砜基基质。在另一个实施例中，用季胺修饰聚丙烯基基质。
当使用结合和洗脱系统时，阴离子交换层析步骤可以涉及在中性或微酸性pH下用缓冲液(如磷酸盐、tris和bis-tris)进行的平衡步骤。加载样品并且将基质任选地再平衡。如本领域已知的，基于所使用的pH和树脂优化加载缓冲液，并且以优化靶白蛋白融合蛋白的分离。适合的加载缓冲液包括约5mM至约200mM、约10mM至约150mM、约20mM至约100mM、约30mM至约80mM或约50mM范围内的碱(如tris或bis-tris)以及约5mM至约100mM、约10mM至约50mM或约20mM的量的盐(如NaCl或辛酸盐)。在一个实施例中，用于阴离子交换的适合的加载缓冲液包含pH 7.0的50mM bis-tris、20mM NaCl。
在结合和洗脱系统中，在平衡阴离子交换基质之后，加载含有白蛋白融合蛋白的样品并且使所希望的蛋白质结合至阴离子交换基质。用洗涤缓冲液洗涤含有结合的白蛋白融合蛋白的亲和层析柱以去除存在于溶液中除白蛋白融合蛋白以外的材料。在一些实施例中，洗涤缓冲液与加载缓冲液相同。在一些实施例中，洗涤缓冲液包含pH 7.0的50mM bis-tris、20mM NaCl。
将结合的白蛋白融合蛋白通过步骤洗脱或梯度洗脱而从阴离子交换基质上洗脱。在一个实施例中，该阴离子交换基质洗脱缓冲液利用盐，如NaCl、CaCl2或KCl。该缓冲液的盐浓度的范围是从大于约10mM、约10mM至约150mM、约20mM至约400mM、约50mM至约300mM、约20mM至约140mM、约30mM至约130M、约40mM至约120mM或约50mM至约110mM。用于洗脱的pH范围在小于约9、约6至约8、约6至约7.5、约6至约7或约6.5至约7的pH之间变化。在一些实施例中，使用约10mM至约600mM的盐(例如，NaCl)或约20mM至约400mM的盐(例如，NaCl)的线性梯度将结合的白蛋白融合蛋白从基质上洗脱。
根据本发明，阴离子交换结合和洗脱系统通过减少聚集产物而导致单体含量增加并且去除负责白蛋白融合蛋白的氧化且具有低水平的经氧化的产物的杂质。在一个实施例中，相对于全蛋白，来自这个步骤的含有白蛋白融合蛋白的中间产物具有少于约100％、少于约90％、少于约80％、少于约70％、少于约60％、少于约50％、少于约40％、少于约30％、少于约20％、少于约10％、少于约9％、少于约8％、少于约7％、少于约6％、少于约5％、少于约4％、少于约3％或少于约2％的经氧化的产物。在一个实施例中，相对于色氨酸残基的总数，来自这个步骤的含有白蛋白融合蛋白的中间产物具有少于约50％、少于约40％、少于约30％、少于约20％、少于约10％、少于约9％、少于约8％、少于约7％、少于约6％、少于约5％、少于约4％、少于约3％或少于约2％的经氧化的色氨酸残基。在另一个实施例中，结合和洗脱阴离子交换步骤从原始样品中去除大于5、10、15、20或30个或者至少5-30、10-30、10-40、15-30、15-40、20-30或20-40个数量级的宿主细胞蛋白。在本发明的实施例中，结合和洗脱阴离子交换步骤从原始样品中去除至少3、4、5或6个或者1-2、2-3、3-4个之间的数量级的DNA杂质。
在一些实施例中，该阴离子交换层析基质是利用膜的流通模式。在一些实施例中使白蛋白融合蛋白经受阴离子交换层析基质和阴离子交换膜两者。可以在加载之前对膜进行预调节和平衡。此外，可以调整加载缓冲液的pH，这样使得靶白蛋白融合蛋白不结合至阴离子交换基质。以此方式，任何污染材料(包括DNA、宿主细胞蛋白(HCP)、病毒和小分子杂质)可以与靶白蛋白融合蛋白分离。
根据本发明，在一个实施例中，在小于约9、约6至约8、约6.5至约7.5、约6至约7.5或约7至约7.5范围内的pH或者约6、7、8或9的pH下操作该膜。在另一个实施例中，该缓冲液的盐浓度将大于10mM或在约10mM至约200mM、约40mM至约180mM、约50mM至约150mM、约60mM至约120mM、约60mM至约80mM的范围内。在一些实施例中，该缓冲液的盐浓度是约50mM、约60mM或约70mM。在其他实施例中，该流通缓冲液具有10mM至150mM的盐浓度和6至8的pH。在另一个实施例中，该流通缓冲液具有大于10mM的盐浓度和小于8的pH。值得注意地，观察到在低pH(例如，约7至约7.5)和较高盐浓度(例如，大于60mM的盐)下白蛋白融合蛋白的产率和DNA清除率都是最优的。
根据本发明，阴离子交换流通系统使得具有低水平的经氧化的产物的单体含量增加并且去除杂质(包括HCP和DNA)。在一个实施例中，相对于全蛋白，来自这个步骤的含有白蛋白融合蛋白的产物具有少于约10％、少于约9％、少于约8％、少于约7％、少于约6％、少于约5％、少于约4％、少于约3％或少于约2％的经氧化的产物。在另一个实施例中，相对于色氨酸残基的总数，来自这个步骤的含有白蛋白融合蛋白的产物具有少于约10％、少于约9％、少于约8％、少于约7％、少于约6％、少于约5％、少于约4％、少于约3％或少于约2％的经氧化的色氨酸残基。在另一个实施例中，流通阴离子交换步骤从原始样品中去除大于1或大于2个数量级的宿主细胞蛋白。在本发明的实施例中，流通阴离子交换步骤从原始样品中去除至少3、4、5或68、9或10个或者在3-6、4-6或5-6、8-10或9-10个之间的数量级的DNA杂质。
根据本发明，阴离子交换的结合结合到洗脱模式可以与阴离子交换的流通模式组合进行。可以在该一个或多个阴离子交换步骤之前、之间或之后进行另外的任选的纯化步骤。例如，可以用曲通X-100处理包含白蛋白融合蛋白的样品以灭活包膜病毒。可替代地，该样品可以经历渗滤或超滤。可以添加适合浓度的盐。在一个实施例中，用pH 7.0的50mMbis-tris、20mM NaCl渗滤含有白蛋白融合蛋白的洗脱液。
另外的纯化步骤
另外的纯化步骤可以包括使包含白蛋白融合蛋白的洗脱液/级分经受疏水相互作用或多模式基质。该疏水相互作用基质可以是任何适合的基质。在一些情况下，疏水相互作用基质包含苯基、辛基或丁基疏水基团。疏水相互作用基质是可商购的并且是本领域技术人员已知的，例如Capto Butyl、Capto Phenyl、Capto Butyl、Butyl-S Fast Flow(通用医疗生命科学公司(GE Healthcase Life Sciences)，皮斯卡塔韦，新泽西州)、ToyopearlHexyl、Toyopearl Butyl、Toyopearl Phenyl、Toyopearl PPG、Toyopearl Ether、Toyopearl PPG-600M以及Toyopearl Phenyl-650M、Toyopearl PPG-600M、TSKgel Phenyl、TSKgel Ether(东曹公司(TOSOH Corporations)，东京，日本)、Macro-Prep Methyl(伯乐实验室公司(Bio-Rad Labboratories)，赫拉克勒斯，加州)。该多模式基质可以是任何适合的基质。在一些情况下，多模式基质包含苯基、辛基或丁基疏水基团连同阳离子或阴离子交换基团。多模式基质是可商购的并且是本领域技术人员已知的，例如Capto MMC、EshmunoHCX、Nuvia cPrime或Toyopearl MX-Trp-650M。已经发现任选地用缓冲液平衡白蛋白融合蛋白，该缓冲液含有盐，如铵盐、锂盐、钾盐、镁盐、钙盐、铝盐或胍盐作为阳离子，和/或硫酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐或氯酸盐作为阴离子。例如，在一些实施例中，该盐是适合量(例如，约100mM至约2M、约200mM至约1.5M、约300mM至约1M、约400mM至约800mM的盐，例如柠檬酸盐)的氯化钠、硫酸钠、柠檬酸钠或硫酸铵。在平衡之后，将含有白蛋白融合蛋白的样品/级分加载到柱上。在一个实施例中，将该柱再平衡并且然后步骤或梯度洗脱至具有降低的盐浓度的缓冲液。
在另一个实施例中，可以通过使包含白蛋白融合蛋白的洗脱液/级分经受纳滤而将这些级分进一步纯化。在一些实施例中，纳滤可以用于去除潜在的病毒颗粒并且能以本领域普通技术人员的标准方法进行。
在其他实施例中，可以使这些级分经受大小排阻层析以进一步纯化白蛋白融合蛋白。
在本发明的另一个实施例中，提供了获得包含基本上不含经氧化的色氨酸残基的白蛋白融合蛋白的组合物的方法。根据这个实施例，该方法包括使包含经氧化的色氨酸白蛋白融合蛋白和未经氧化的色氨酸白蛋白融合蛋白的组合物经受疏水相互作用基质，其中在不同时间将该经氧化的色氨酸白蛋白融合蛋白和未经氧化的色氨酸白蛋白融合蛋白从该疏水相互作用基质上洗脱，从而将该经氧化的色氨酸白蛋白融合蛋白与该未经氧化的色氨酸白蛋白融合蛋白分离。
本发明的另一个实施例针对基本上免于氧化色氨酸和/或甲硫氨酸残基而分离白蛋白融合蛋白的方法。根据这个实施例，使包含白蛋白融合蛋白的该组合物经受以下纯化过程：(a)亲和基质层析过程；(b)阴离子交换层析过程；和(c)疏水相互作用基质层析过程。用于亲和基质层析过程的洗脱缓冲液包含辛酸盐(caprylate/octanoate)，并且在一些实施例中，另外将EDTA应用至亲和基质。此外，在不同时间将该经氧化的色氨酸白蛋白融合蛋白和未经氧化的色氨酸白蛋白融合蛋白从该疏水相互作用基质上洗脱，从而将该经氧化的色氨酸白蛋白融合蛋白与该未经氧化的色氨酸白蛋白融合蛋白分离。
本发明的另一个方面是纯化白蛋白融合蛋白的方法，该方法包括使包含白蛋白融合蛋白的组合物经受疏水相互作用基质以及以下纯化过程中的一个或多个：(a)亲和基质，其中将包含辛酸盐(caprylate/octanoate)的洗脱缓冲液应用至该亲和基质，并且在一些实施例中，另外将EDTA应用至该亲和基质；和/或(b)阴离子交换基质。根据这个实施例，可以用洗涤缓冲液洗涤该亲和基质，该洗涤缓冲液包含：(1)约2％至约20％的多元醇，其中该多元醇选自下组，该组由以下各项组成：1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,2-丁二醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇、1,6-己二醇和2-甲基-2,4-戊二醇；(2)0.05M至2.0M的盐，其中该盐选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化锂、溴化钠、溴化钾和溴化锂；(3)约0.02M至约1M的硫酸钠；(4)约0.01％至约1％的非离子型表面活性剂；(5)约0.05M至约1.0M的尿素；和/或(6)约0.02M至约0.5M的烟酰胺。所得经纯化的白蛋白融合蛋白基本上不含经氧化的色氨酸残基。
一种纯化白蛋白融合蛋白的方法，该方法包括：将包含该白蛋白融合蛋白的组合物应用至亲和基质；将该白蛋白融合蛋白从该亲和基上洗脱以获得第一洗脱液；将该第一洗脱液应用至阴离子交换基质；将该白蛋白融合蛋白从该阴离子交换基质上洗脱以获得第二洗脱液；将该第二洗脱液应用至阴离子交换膜；使该白蛋白融合蛋白通过阴离子交换膜以获得流通物；将该流通物应用至疏水相互作用基质；将该白蛋白融合蛋白从该疏水相互作用基质上洗脱以获得第三洗脱液，其中该第三洗脱液包含该经纯化的白蛋白融合蛋白。根据这个实施例，所得经纯化的白蛋白融合蛋白具有5％或更少的经氧化的色氨酸残基。
经纯化的白蛋白融合蛋白的组合物
包含经纯化的白蛋白融合蛋白的组合物在本发明的范围内。这些组合物具有低水平的宿主细胞蛋白、DNA和病毒活性。另外地，这些包含经纯化的白蛋白融合蛋白的组合物具有低水平的氧化并保留生物活性。
包含根据本发明纯化的白蛋白融合蛋白的组合物或级分具有少于约1000ng/mg、200ng/mg、100ng/mg、50ng/mg、40ng/mg、30ng/mg、20ng/mg或10ng/mg的宿主细胞蛋白。在一个实施例中，含有白蛋白融合蛋白的组合物具有少于20ng/mg的宿主细胞蛋白。在一些实施例中，该白蛋白融合蛋白组合物具有政府机构(例如，美国食品和药物管理局)可接受的用于给予人类受试者的宿主细胞蛋白水平。
此外，包含根据本发明纯化的白蛋白融合蛋白的组合物或级分具有少于约5x10-2、1x10-2、5x10-3、1x10-3、5x10-4或1x10-4ng/mg。在一个实施例中，根据本发明纯化的白蛋白融合蛋白具有少于5x10-3ng/mg的DNA。在一些实施例中，该白蛋白融合蛋白组合物具有政府机构(例如，美国食品和药物管理局)可接受的用于给予人类受试者的DNA。
已经发现白蛋白融合蛋白上的色氨酸/甲硫氨酸残基的氧化可以影响该蛋白质的生物活性和相对效力。根据本发明的方法纯化和获得的白蛋白融合蛋白具有低水平的氧化。在本发明的实施例中，该白蛋白融合蛋白的相对效力是至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％。在另一个实施例中，相对于该蛋白质中色氨酸残基的总量，该白蛋白融合蛋白具有少于25％、少于20％、少于15％、少于10％或少于5％的经氧化的色氨酸残基。在一个实施例中，相对于该蛋白质的总量，该白蛋白融合蛋白具有少于约20％的经氧化的色氨酸残基。在另一个实施例中，相对于该蛋白质中总色氨酸残基的数目，该白蛋白融合蛋白具有少于10％、少于9％、少于8％、少于7％、少于6％或少于5％的经氧化的色氨酸残基。在本发明的实施例中，相对于该蛋白质中色氨酸残基的总数，该白蛋白融合蛋白具有少于约5％的经氧化的色氨酸残基。
在本发明范围内的组合物包含白蛋白融合蛋白，其中该组合物具有少于5x10-3ng/mg的DNA，并且其中少于15％的色氨酸残基被氧化。在一个实施例中，该组合物具有少于5x10-3ng/mg的DNA并且具有其中的少于5％的色氨酸残基被氧化的白蛋白融合蛋白。
本发明的另一种组合物包含白蛋白融合蛋白，其中该组合物具有少于20ng/mg的宿主细胞蛋白，并且其中该白蛋白融合蛋白具有>90％的相对活性。
本发明的一个实施例是包含白蛋白融合蛋白的组合物，其中该组合物具有少于5x10-3ng/mg的DNA，并且其中该白蛋白融合蛋白具有>90％的相对活性。
白蛋白融合蛋白
白蛋白(如人血清白蛋白(HSA))或其片段或变体可以与治疗性蛋白任何或缀合以增加或延长该蛋白质在血流中的半衰期和/或其组织渗透。在一些实施例中，通过与HSA变体缀合改善的特性是血浆半衰期。该白蛋白融合蛋白的血浆半衰期的改善可以是该特性的改变，如血浆半衰期的增加或减少，或其他药代动力学参数的变化。
延长或增加治疗性蛋白的体内或血清半衰期的白蛋白或HSA的片段或变体在本发明的范围内。先前已经披露了HSA变体，即衍生自全长HSA(SEQ ID NO:139)的至少包含氨基酸取代、缺失或序列截短的分子。例如，以下公开描述了可以使用的HSA变体：WO 2011/103076、WO 2011/051489和WO 2012/112188。在一个实施例中，该白蛋白是HSA。在另一个实施例中，该白蛋白是变体HSA。
在一些实施例中，该HSA变体是衍生自全长HSA(SEQ ID NO:138)的突变体。在具体实施例中，该HSA变体在位置34处包含丝氨酸对半胱氨酸的取代(SEQ ID NO:133)。可以用于改变Tn3支架的血浆半衰期的HSA变体例如描述于例如国际公开WO 2011/103076和WO2011/051489中，将两者通过引用以其整体而并入。在一些实施例中，本发明的治疗性蛋白的血浆半衰期通过将它与在HSA的结构域III中包含至少一个氨基酸取代的HSA变体融合来增加。另一个实施例包括变体HSA的氨基酸序列是SEQ ID NO:133。
在一些实施例中，本发明的白蛋白融合蛋白包含HSA变体，该HSA变体包含全长成熟HSA(SEQ ID NO:138)或其片段的序列，除了在选自下组的位置处的至少一个氨基酸取代以外，相对于全长成熟HSA中的位置编号，该组由以下各项组成：407、415、463、500、506、508、509、511、512、515、516、521、523、524、526、535、550、557、573、574和580；其中该至少一个氨基酸取代不包含在位置573处的谷氨酸(E)对赖氨酸(K)的取代，并且其中该治疗性蛋白具有比不与该HSA变体缀合的相同治疗性蛋白的血浆半衰期长的血浆半衰期。
在一些其他实施例中，至少一个氨基酸取代，相对于全长成熟HSA中的位置编号，在选自下组的位置处该组由以下各项组成：463、508、523和524，其中该治疗性蛋白具有比不与该HSA变体缀合的治疗性蛋白的血浆半衰期长的血浆半衰期。
在其他实施例中，本发明的白蛋白融合蛋白包含HSA变体，该HSA变体包含全长成熟HSA(SEQ ID NO:133或138)或其片段的序列，除了选自下组的至少一个氨基酸取代以外，相对于全长成熟HSA中的位置编号，该组由以下各项组成：
(a)在位置407处天冬酰胺(N)或酪氨酸(Y)对亮氨酸(L)的取代；
(b)在位置415处苏氨酸(T)对缬氨酸(V)的取代；
(c)在位置463处天冬酰胺(N)对亮氨酸(L)的取代；
(d)在位置500处精氨酸(R)对赖氨酸(K)的取代；
(e)在位置506处酪氨酸(Y)对苏氨酸(T)的取代；
(f)在位置508处精氨酸(R)对苏氨酸(T)的取代；
(g)在位置509处甲硫氨酸(M)或色氨酸(W)对苯丙氨酸(F)的取代；
(h)在位置511处苯丙氨酸(F)对丙氨酸(A)的取代；
(i)在位置512处酪氨酸(Y)对天冬氨酸(D)的取代；
(j)在位置515处谷氨酰胺(Q)对苏氨酸(T)的取代；
(k)在位置516处苏氨酸(T)或色氨酸(W)对亮氨酸(L)的取代；
(l)在位置521处色氨酸(W)对精氨酸(R)的取代；
(m)在位置523处天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、甘氨酸(G)、赖氨酸(K)或精氨酸(R)对异亮氨酸(I)的取代；
(n)在位置524处亮氨酸(L)对赖氨酸(K)的取代；
(o)在位置526处甲硫氨酸(M)对谷氨酰胺(Q)的取代；
(p)在位置535处脯氨酸(P)对组氨酸(H)的取代；
(q)在位置550处谷氨酸(E)对天冬氨酸(D)的取代；
(r)在位置557处甘氨酸(G)对赖氨酸(K)的取代；
(s)在位置573处苯丙氨酸(F)、组氨酸(H)、脯氨酸(P)、色氨酸(W)或酪氨酸(Y)对赖氨酸(K)的取代；
(t)在位置574处天冬酰胺(N)对赖氨酸(K)的取代；
(u)在位置580处赖氨酸(K)对谷氨酰胺(Q)的取代；以及，
(v)所述取代中两个或更多个的组合，
其中该治疗性蛋白具有比不与所述HSA变体缀合的相同治疗性蛋白的血浆半衰期长的血浆半衰期。
在一些实施例中，该白蛋白融合蛋白包含HSA变体，该HSA变体包含全长成熟HSA(SEQ ID NO:133或138)或其片段的序列，除了选自下组的至少一个氨基酸取代以外，相对于全长成熟HSA中的位置编号，该组由以下各项组成：
(a)在位置463处天冬酰胺(N)对亮氨酸(L)的取代；
(b)在位置508处精氨酸(R)对苏氨酸(T)的取代；
(c)在位置523处天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、甘氨酸(G)、赖氨酸(K)或精氨酸(R)对异亮氨酸(I)的取代；
(d)在位置524处亮氨酸(L)对赖氨酸(K)的取代；以及，
(e)所述取代中两个或更多个的组合，
其中所述治疗性蛋白具有比不与所述HSA变体缀合的相同治疗性蛋白的血浆半衰期长的血浆半衰期。
白蛋白融合蛋白可以通过标准技术产生，例如从使用公众可得的基因序列构建的重组融合基因表达该融合蛋白。
该治疗性蛋白可以是可以与白蛋白融合或缀合以增加或延长其半衰期的任何蛋白质。在一个实施例中，该治疗性蛋白包含支架部分，该支架部分包含色氨酸残基，其中该色氨酸的氧化降低该白蛋白融合蛋白的生物活性。在另一个实施例中，该蛋白质能够与CD40L结合。在另一个实施例中，该治疗性蛋白是能够与CD40L结合的支架部分。另一个实施例提供了该支架部分包含第三纤连蛋白III型(FnIII)结构域。包含FnIII结构域的支架先前已经描述于例如WO 98/56915、WO 2009/023184、WO 2009/05379、WO 2010/051274中。WO2010/093627)。在一些实施例中，该FnIII结构域可以衍生自人类肌腱蛋白C(Tn3支架)。这样的Tn3支架已经描述于例如WO 2009/05379、WO 2010/051274和WO 2013/055745中。
与支架融合的白蛋白
在本发明的实施例中，该白蛋白融合蛋白包含支架。例如，这些支架可以包含衍生自人类肌腱蛋白C(Tn3)的第三FnIII结构域的CD40L特异性单体亚单位，其中至少一个非天然存在的分子内二硫键已经被工程化。组成本发明的Tn3支架的单体亚单位彼此独立地正确折叠，保留其结合特异性和亲和力，并且每个单体支架保留其功能特性。当单体亚单位被组装为高效价的多聚Tn3支架时，这些单体亚单位彼此独立地正确折叠，保留其结合特异性和亲和力，并且每个单体保留其功能特性。
本发明的包含多于一个单体亚单位的支架可以与多个表位结合，例如(i)与单一靶标中的多个表位结合，(ii)与多个靶标中的单一表位结合，(iii)与位于一个靶标的不同亚单位上的多个表位结合，或(iv)与多个靶标上的多个表位结合，由此增加亲合力。
另外，由于经由接头的多个单体之间的距离变化的可能性，多聚Tn3支架能够与表面上的多个靶分子结合(在同一细胞/表面上或在不同细胞/表面里)。由于其与多于一个靶标同时结合的能力，本发明的Tn3多聚支架可以用来调节多个通路，使细胞表面上的受体交联，结合单独的细胞上的细胞表面受体，和/或将靶分子或细胞与底物结合。
另外，本发明提供了亲和力成熟的支架，其中经由突变调节支架对特定靶标的亲和力。而且，本发明提供了用于生产本发明的支架的方法以及用于工程化具有令人希望的物理化学特性、药理学特性或免疫学特性的支架的方法。此外，本发明提供了这样的支架的用途以及用于治疗、预防或诊断用途的方法。
在一个实施例中，该白蛋白融合蛋白具有Tn3支架，如描述于2012年10月10日提交的且通过引用并入本文的PCT申请公开号WO2013/055745中的Tn3支架。当纯化白蛋白-Tn3支架融合蛋白时，已经发现色氨酸和甲硫氨酸残基对氧化敏感。例如，在该Tn3支架选自SEQID NO:134、135、201、202、203、204、205、206、207或208的白蛋白融合蛋白的情况下，已经发现在纯化过程期间氧化可以出现在Tn3的结合环上的色氨酸氨基酸残基W46/151处以及Tn3和人血清白蛋白上的甲硫氨酸氨基酸残基M74/179、M498、M529处。影响研究揭示到，白蛋白-Tn3支架蛋白质的W46/151、M74/179、M498和M529处的氧化可以影响生物活性。具体而言，发现Tn3的结合环上的W46/151处的氧化负面地影响MEDI4920的生物活性和相对效力。然而，M74/179、M498和M529处的氧化对该融合蛋白的生物活性具有较少的影响。尽管如此，但是本发明的目标是通过旨在控制白蛋白融合蛋白的敏感氨基酸的氧化的纯化过程来减少白蛋白融合蛋白的氧化种类。
FnIII结构基序
本发明的适合的支架包括基于III型纤连蛋白模块(FnIII)的结构的那些，III型纤连蛋白模块是一种广泛发现于生命体和病毒的所有三个结构域之间并且发现于众多蛋白质种类中的结构域。在具体实施例中，本发明的支架衍生自人类肌腱蛋白C的第三FnIII结构域(参见被公开为WO 2009/058379的国际申请号PCT/US2008/012398；被公开为WO2011/130324的国际申请号PCT/US2011/032184；以及被公开为WO 2011130328的国际申请号PCT/US2011/032188)。
在一个具体实施例中，本发明的Tn3支架包含衍生自亲本Tn3支架的CD40L特异性单体亚单位。单体的总体三维折叠与最小的功能性抗体片段(重链的可变区(VH))的三维折叠密切相关，在骆驼和骆驼科动物(例如，美洲驼)的单域抗体中的重链的可变区包含完整的抗原识别单位。
本发明的Tn3单体亚单位以及来自肌腱蛋白C的天然FnIII结构域由相同的三维结构表征，即由六个环区连接的在一侧具有三条β链(A、B和Ε)并且在另一侧具有四条β链(C、D、F和G)的β夹心结构。根据连接至每个环的N端和C端的β链来指定这些环区。因此，AB环位于β链A和B之间，BC环位于链B和C之间，CD环位于β链C和D之间，DE环位于β链D和E之间，EF环位于β链E和F之间，并且FG环位于β链F和G之间。FnIII结构域具有耐受随机化的溶剂暴露环，这些环协助能够以高亲和力与特定靶标结合的蛋白质支架的不同池的产生。
在本发明的一个方面中，使Tn3单体亚单位经受被设计成随机化与抗体可变区的互补决定区(CDR)类似的一个或多个环的定向进化。这样一种定向进化途径导致对感兴趣的靶标(例如，CD40L)具有高亲和力的抗体样分子的产生。
另外，在一些实施例中，可以使用在本文描述的Tn3支架来展示限定的暴露环(例如，先前被随机化的并且在靶标结合的基础上选择的环)以便指导与这样的引入的环结合的分子的进化。可以进行这种类型的选择以鉴定任何单独的CDR样环的识别分子，或可替代地用于被合并进非线性表位结合部分中的两个或全部三个CDR样环的识别。可以赋予特异性靶标结合的一组三个环(被指定为BC、DE和FG)分别在B和C链；D和E链，以及F和GP链之间运行。人类肌腱蛋白C的第三FnIII结构域的BC、DE和FG环分别为9个、6个和10个氨基酸残基长。这些环的长度落入发现于抗体重链中的同源抗原识别环的窄范围内，也就是说长度分别为7-10个、4-8个和4-28个氨基酸。类似地，第二组环(即AB、CD和EF环(长度分别为7个、7个和8个氨基酸))分别在A和Bβ链；C和Dβ链；以及E和Fβ链之间运行。
一旦针对与靶标的高亲和力结合而被随机化并被选择，Tn3单体支架中的这些环可以与靶标接触，相当于抗体中的同源CDR环的接触。因此，在一些实施例中，针对与一个或多个靶标(例如，CD40L)的高亲和力结合将AB、CD和EF环随机化并对其进行选择。在一些实施例中，可以与BC、DE和FG环的随机化平行地进行这个随机化和选择过程，而在其他实施例中，连续地进行这个随机化和选择过程。
CD40L特异性单体亚单位
本发明提供了CD40L特异性重组的非天然存在的Tn3支架，这些Tn3支架包含被连接至多个环区的多个β链结构域，其中一个或多个所述环区与野生型Tn3(SEQ ID NO:3)中的同源环的不同之处在于至少一个氨基酸的缺失、取代或添加(参见表1)。
为了产生改进的具有新颖的结合特征的CD40L特异性Tn3单体亚单位，使亲本Tn3经受氨基酸添加、缺失或取代。应理解的是，当比较CD40L特异性Tn3单体亚单位的序列与亲本Tn3的序列时，利用β链和环的相同的定义。在一些实施例中，本发明的CD40L特异性Tn3单体亚单位包含以下氨基酸序列：
IEV(XAB)nALITW(XBC)nCELX1YGI(XCD)nTTIDL(XDE)nYSI(XEF)nYEVSLIC(XFG)nKETFTT
其中：
(a)XAB、XBC、XCD、XDE、XEF和XFG分别表示存在于AB、BC、CD、DE、EF和FG环的序列中的氨基酸残基；
(b)X1表示氨基酸残基丙氨酸(A)或苏氨酸(T)；并且，
(c)环的长度n是在2与26之间的整数。
表2：在这些研究中使用的Tn3克隆的环序列
包含具有序列CELAYGI(SEQ ID NO:14)的Cβ链的克隆，所有其他克隆包含具有序列CELTYGI(SEQ ID NO:13)的Cβ链。
*在309家族的一些变体(例如，342)中，FG环可以被SEQ ID NO:139替代。
**在311家族的一些变体中，可以将BC环工程化以替代在位置21处的酪氨酸。特别考虑了置换氨基酸残基以具有小侧链。
在一些实施例中，本发明的CD40L特异性Tn3单体亚单位由以下氨基酸序列组成：
IEV(XAB)nALITW(XBC)nCELX1YGI(XCD)nTTIDL(XDE)nYSI(XEF)nYEVSLIC(XFG)nKETFTT
其中：
(a)XAB、XBC、XCD、XDE、XEF和XFG分别表示存在于AB、BC、CD、DE、EF和FG环的序列中的氨基酸残基；
(b)X1表示氨基酸残基丙氨酸(A)或苏氨酸(T)；并且，
(c)环的长度n是在2与26之间的整数。
在一个实施例中，CD40L特异性Tn3单体支架的β链与亲本Tn3支架(SEQ ID NO:3)的β链具有至少90％序列一致性。为了计算这样的序列一致性百分比，应用本领域已知的方法比对氨基酸序列。将序列一致性百分比定义为(a)位于在序列比对中相同的β链中的氨基酸的数目与(b)位于β链中的氨基酸的总数之间的比率。
在一个实施例中，AB环的序列包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:136。在另一个实施例中，CD环的序列包含SEQ ID NO:6。在另一个实施例中，EF环的序列包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:137。在一个实施例中，AB环的序列由SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:136组成。在另一个实施例中，CD环的序列由SEQ ID NO:6组成。在另一个实施例中，EF环的序列由SEQ IDNO:8或SEQ ID NO:137组成。
在一个实施例中，BC环的序列包含选自下组的序列，该组由以下各项组成：SEQ IDNO:83、84、85、86、87、88、89、90、91、92和93。在另一个实施例中，BC环的序列由选自下组的序列组成，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:83、84、85、86、87、88、89、90、91、92和93。
在一个实施例中，DE环的序列包含选自下组的序列，该组由以下各项组成：SEQ IDNO:94、95、96、97和98。在另一个实施例中，DE环的序列由选自下组的序列组成，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:94、95、96、97和98。
在一个实施例中，FG环的序列包含选自下组的序列，该组由以下各项组成：SEQ IDNO:9、99和139。在另一个实施例中，FG环的序列由选自下组的序列组成，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:9、99和139。
在一个实施例中，BC环的序列包含选自下组的序列，该组由以下各项组成：SEQ IDNO:100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116和117。在另一个实施例中，BC环的序列由选自下组的序列组成，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116和117。
在一些实施例中，DE环的序列包含选自下组的序列，该组由以下各项组成：SEQ IDNO:118、119、120、121、122、123、124、125、126、127和128。在其他实施例中，DE环的序列由选自下组的序列组成，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:118、119、120、121、122、123、124、125、126、127和128。
在一些实施例中，FG环的序列包含选自下组的序列，该组由以下各项组成：SEQ IDNO:129和130。在其他实施例中，FG环的序列由选自下组的序列组成，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:129和130。
在一些实施例中，BC环的序列包含SEQ ID NO:83，DE环的序列包含SEQ ID NO:94，并且FG环的序列包含SEQ ID NO:9或139。在一些实施例中，BC环的序列由SEQ ID NO:83组成，DE环的序列由SEQ ID NO:94组成，并且FG环的序列由SEQ ID NO:9或139组成。
在一些实施例中，BC环的序列包含SEQ ID NO:83，DE环的序列包含SEQ ID NO:94，并且FG环的序列包含SEQ ID NO:99。在其他实施例中，BC环的序列由SEQ ID NO:83组成，DE环的序列由SEQ ID NO:94组成，并且FG环的序列由SEQ ID NO:99组成。
在一些实施例中，BC环的序列包含SEQ ID NO:84，DE环的序列包含SEQ ID NO:95，并且FG环的序列包含SEQ ID NO:9或139。在其他实施例中，BC环的序列由SEQ ID NO:84组成，DE环的序列由SEQ ID NO:95组成，并且FG环的序列由SEQ ID NO:9或139组成。
在一些实施例中，BC环的序列包含SEQ ID NO:85，DE环的序列包含SEQ ID NO:94，并且FG环的序列包含SEQ ID NO:9或139。在其他实施例中，BC环的序列由SEQ ID NO:85组成，DE环的序列由SEQ ID NO:94组成，并且FG环的序列由SEQ ID NO:9或139组成。
在一些实施例中，BC环的序列包含SEQ ID NO:86，DE环的序列包含SEQ ID NO:96，并且FG环的序列包含SEQ ID NO:9或139。在其他实施例中，BC环的序列由SEQ ID NO:86组成，DE环的序列由SEQ ID NO:96组成，并且FG环的序列由SEQ ID NO:9或139组成。
在一些实施例中，BC环的序列包含SEQ ID NO:87，DE环的序列包含SEQ ID NO:97，并且FG环的序列包含SEQ ID NO:9或139。在其他实施例中，BC环的序列由SEQ ID NO:87组成，DE环的序列由SEQ ID NO:97组成，并且FG环的序列由SEQ ID NO:9或139组成。
在一些实施例中，BC环的序列包含SEQ ID NO:88，DE环的序列包含SEQ ID NO:95，并且FG环的序列包含SEQ ID NO:9或139。在其他实施例中，BC环的序列由SEQ ID NO:88组成，DE环的序列由SEQ ID NO:95组成，并且FG环的序列由SEQ ID NO:9或139组成。
在一些实施例中，BC环的序列包含SEQ ID NO:89，DE环的序列包含SEQ ID NO:94，并且FG环的序列包含SEQ ID NO:9或139。在其他实施例中，BC环的序列由SEQ ID NO:89组成，DE环的序列由SEQ ID NO:94组成，并且FG环的序列由SEQ ID NO:9或139组成。
在一些实施例中，BC环的序列包含SEQ ID NO:90，DE环的序列包含SEQ ID NO:94，并且FG环的序列包含SEQ ID NO:9或139。在其他实施例中，BC环的序列由SEQ ID NO:90组成，DE环的序列由SEQ ID NO:94组成，并且FG环的序列由SEQ ID NO:9或139组成。
在一些实施例中，BC环的序列包含SEQ ID NO:91，DE环的序列包含SEQ ID NO:95，并且FG环的序列包含SEQ ID NO:9或139。在其他实施例中，BC环的序列由SEQ ID NO:91组成，DE环的序列由SEQ ID NO:95组成，并且FG环的序列由SEQ ID NO:9或139组成。
在一些实施例中，BC环的序列包含SEQ ID NO:92，DE环的序列包含SEQ ID NO:98，并且FG环的序列包含SEQ ID NO:9或139。在其他实施例中，BC环的序列由SEQ ID NO:92组成，DE环的序列由SEQ ID NO:98组成，并且FG环的序列由SEQ ID NO:9或139组成。
在一些实施例中，BC环的序列包含SEQ ID NO:93，DE环的序列包含SEQ ID NO:94，并且FG环的序列包含SEQ ID NO:9或139。在其他实施例中，BC环的序列由SEQ ID NO:93组成，DE环的序列由SEQ ID NO:94组成，并且FG环的序列由SEQ ID NO:9或139组成。
在一些实施例中，BC环的序列包含SEQ ID NO:168，DE环的序列包含SEQ ID NO:169，并且FG环的序列包含SEQ ID NO:170。在其他实施例中，BC环的序列由SEQ ID NO:168组成，DE环的序列由SEQ ID NO:169组成，并且FG环的序列由SEQ ID NO:170组成。
在一些实施例中，BC环的序列包含SEQ ID NO:100，DE环的序列包含SEQ ID NO:118，并且FG环的序列包含SEQ ID NO:129。在其他实施例中，BC环的序列由SEQ ID NO:100组成，DE环的序列由SEQ ID NO:118组成，并且FG环的序列由SEQ ID NO:129组成。
在一些实施例中，AB环的序列包含SEQ ID NO:136，BC环的序列包含SEQ ID NO:101，DE环的序列包含SEQ ID NO:119，并且FG环的序列包含SEQ ID NO:129。在其他实施例中，AB环的序列由SEQ ID NO:136组成，BC环的序列由SEQ ID NO:101组成，DE环的序列由SEQ ID NO:119组成，并且FG环的序列由SEQ ID NO:129组成。
在一些实施例中，AB环的序列包含SEQ ID NO:136，BC环的序列包含SEQ ID NO:102，DE环的序列包含SEQ ID NO:120，并且FG环的序列包含SEQ ID NO:129。在其他实施例中，AB环的序列由SEQ ID NO:136组成，BC环的序列由SEQ ID NO:102组成，DE环的序列由SEQ ID NO:120组成，并且FG环的序列由SEQ ID NO:129组成。
在一些实施例中，AB环的序列包含SEQ ID NO:136，BC环的序列包含SEQ ID NO:103，DE环的序列包含SEQ ID NO:121，并且FG环的序列包含SEQ ID NO:129。在其他实施例中，AB环的序列由SEQ ID NO:136组成，BC环的序列由SEQ ID NO:103组成，DE环的序列由SEQ ID NO:121组成，并且FG环的序列由SEQ ID NO:129组成。
在一些实施例中，AB环的序列包含SEQ ID NO:136，BC环的序列包含SEQ ID NO:104，DE环的序列包含SEQ ID NO:122，并且FG环的序列包含SEQ ID NO:129。在其他实施例中，AB环的序列由SEQ ID NO:136组成，BC环的序列由SEQ ID NO:104组成，DE环的序列由SEQ ID NO:122组成，并且FG环的序列由SEQ ID NO:129组成。
在一些实施例中，AB环的序列包含SEQ ID NO:136，BC环的序列包含SEQ ID NO:105，DE环的序列包含SEQ ID NO:121，并且FG环的序列包含SEQ ID NO:129。在其他实施例中，AB环的序列由SEQ ID NO:136组成，BC环的序列由SEQ ID NO:105组成，DE环的序列由SEQ ID NO:121组成，并且FG环的序列由SEQ ID NO:129组成。
在一些实施例中，AB环的序列包含SEQ ID NO:136，BC环的序列包含SEQ ID NO:106，DE环的序列包含SEQ ID NO:123，并且FG环的序列包含SEQ ID NO:129。在其他实施例中，AB环的序列由SEQ ID NO:136组成，BC环的序列由SEQ ID NO:106组成，DE环的序列由SEQ ID NO:123组成，并且FG环的序列由SEQ ID NO:129组成。
在一些实施例中，AB环的序列包含SEQ ID NO:136，BC环的序列包含SEQ ID NO:107，DE环的序列包含SEQ ID NO:123，并且FG环的序列包含SEQ ID NO:129。在其他实施例中，AB环的序列由SEQ ID NO:136组成，BC环的序列由SEQ ID NO:107组成，DE环的序列由SEQ ID NO:123组成，并且FG环的序列由SEQ ID NO:129组成。
在一些实施例中，AB环的序列包含SEQ ID NO:136，BC环的序列包含SEQ ID NO:108，DE环的序列包含SEQ ID NO:118，并且FG环的序列包含SEQ ID NO:129。在其他实施例中，AB环的序列由SEQ ID NO:136组成，BC环的序列由SEQ ID NO:108组成，DE环的序列由SEQ ID NO:118组成，并且FG环的序列由SEQ ID NO:129组成。
在一些实施例中，AB环的序列包含SEQ ID NO:136，BC环的序列包含SEQ ID NO:109，DE环的序列包含SEQ ID NO:123，并且FG环的序列包含SEQ ID NO:129。在其他实施例中，AB环的序列由SEQ ID NO:136组成，BC环的序列由SEQ ID NO:109组成，DE环的序列由SEQ ID NO:123组成，并且FG环的序列由SEQ ID NO:129组成。
在一些实施例中，AB环的序列包含SEQ ID NO:136，BC环的序列包含SEQ ID NO:110，DE环的序列包含SEQ ID NO:121，并且FG环的序列包含SEQ ID NO:129。在其他实施例中，AB环的序列由SEQ ID NO:136组成，BC环的序列由SEQ ID NO:110组成，DE环的序列由SEQ ID NO:121组成，并且FG环的序列由SEQ ID NO:129组成。
在一些实施例中，AB环的序列包含SEQ ID NO:136，BC环的序列包含SEQ ID NO:111，DE环的序列包含SEQ ID NO:123，并且FG环的序列包含SEQ ID NO:130。在其他实施例中，AB环的序列由SEQ ID NO:136组成，BC环的序列由SEQ ID NO:111组成，DE环的序列由SEQ ID NO:123组成，并且FG环的序列由SEQ ID NO:130组成。
在一些实施例中，AB环的序列包含SEQ ID NO:136，BC环的序列包含SEQ ID NO:108，DE环的序列包含SEQ ID NO:121，并且FG环的序列包含SEQ ID NO:129。在其他实施例中，AB环的序列由SEQ ID NO:136组成，BC环的序列由SEQ ID NO:108组成，DE环的序列由SEQ ID NO:121组成，并且FG环的序列由SEQ ID NO:129组成。
在一些实施例中，AB环的序列包含SEQ ID NO:136，BC环的序列包含SEQ ID NO:112，DE环的序列包含SEQ ID NO:124，并且FG环的序列包含SEQ ID NO:129。在其他实施例中，AB环的序列由SEQ ID NO:136组成，BC环的序列由SEQ ID NO:112组成，DE环的序列由SEQ ID NO:124组成，并且FG环的序列由SEQ ID NO:129组成。
在一些实施例中，AB环的序列包含SEQ ID NO:136，BC环的序列包含SEQ ID NO:113，DE环的序列包含SEQ ID NO:125，并且FG环的序列包含SEQ ID NO:129。在其他实施例中，AB环的序列由SEQ ID NO:136组成，BC环的序列由SEQ ID NO:113组成，DE环的序列由SEQ ID NO:125组成，并且FG环的序列由SEQ ID NO:129组成。
在一些实施例中，AB环的序列包含SEQ ID NO:136，BC环的序列包含SEQ ID NO:114，DE环的序列包含SEQ ID NO:118，并且FG环的序列包含SEQ ID NO:129。在其他实施例中，AB环的序列由SEQ ID NO:136组成，BC环的序列由SEQ ID NO:114组成，DE环的序列由SEQ ID NO:118组成，并且FG环的序列由SEQ ID NO:129组成。
在一些实施例中，AB环的序列包含SEQ ID NO:136，BC环的序列包含SEQ ID NO:115，DE环的序列包含SEQ ID NO:126，并且FG环的序列包含SEQ ID NO:129。在其他实施例中，AB环的序列由SEQ ID NO:136组成，BC环的序列由SEQ ID NO:115组成，DE环的序列由SEQ ID NO:126组成，并且FG环的序列由SEQ ID NO:129组成。
在一些实施例中，AB环的序列包含SEQ ID NO:136，BC环的序列包含SEQ ID NO:116，DE环的序列包含SEQ ID NO:127，并且FG环的序列包含SEQ ID NO:129。在其他实施例中，AB环的序列由SEQ ID NO:136组成，BC环的序列由SEQ ID NO:116组成，DE环的序列由SEQ ID NO:127组成，并且FG环的序列由SEQ ID NO:129组成。
在一些实施例中，AB环的序列包含SEQ ID NO:136，BC环的序列包含SEQ ID NO:117，DE环的序列包含SEQ ID NO:128，并且FG环的序列包含SEQ ID NO:129。在其他实施例中，AB环的序列由SEQ ID NO:136组成，BC环的序列由SEQ ID NO:117组成，DE环的序列由SEQ ID NO:128组成，并且FG环的序列由SEQ ID NO:129组成。
在一些实施例中，BC环的序列包含SEQ ID NO:174，DE环的序列包含SEQ ID NO:175，并且FG环的序列包含SEQ ID NO:177。在其他实施例中，BC环的序列由SEQ ID NO:174组成，DE环的序列由SEQ ID NO:175组成，并且FG环的序列由SEQ ID NO:177组成。
在一些实施例中，CD40L特异性单体亚单位包含选自下组的序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42和146。在其他实施例中，CD40L特异性单体亚单位由选自下组的序列组成，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42和146。
在一些实施例中，CD40L特异性单体亚单位包含SEQ ID NO:28或146。在其他实施例中，CD40L特异性单体亚单位由SEQ ID NO:28或146组成。
在一些实施例中，本发明的CD40L特异性Tn3单体亚单位包含以下氨基酸序列：
IEVKDVTDTTALITWX1DX2X3X4X5X6X7X8CELTYGIKDVPGDRTTIDLWX9HX10AX11YSIGNLKPDTEYEVSLICRX12GDMSSNPAKETFTT(SEQ ID NO:167)
其中：
(a)X1表示氨基酸残基丝氨酸(S)或亮氨酸(L)；
(b)X2表示氨基酸残基天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)；
(c)X3表示氨基酸残基组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、苯丙氨酸(F)或色氨酸(W)；
(d)X4表示氨基酸残基丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)；
(e)X5表示氨基酸残基谷氨酸(E)、亮氨酸(L)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、天冬氨酸(D)或天冬酰胺(N)；
(f)X6表示氨基酸残基苯丙氨酸(F)或酪氨酸(Y)；
(g)X7表示氨基酸残基异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、组氨酸(H)、谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)；
(h)X8表示氨基酸残基甘氨酸(G)、色氨酸(W)或缬氨酸(V)；
(i)X9表示氨基酸残基色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)或酪氨酸(Y)；
(j)X10表示氨基酸残基丝氨酸(S)、谷氨酰胺(Q)、甲硫氨酸(M)或组氨酸(H)；
(k)X11表示氨基酸残基色氨酸(W)或组氨酸(H)；并且，
(l)X12表示氨基酸残基精氨酸(R)或丝氨酸(S)。
在一些实施例中，本发明的CD40L特异性Tn3单体亚单位由以下氨基酸序列组成：
IEVKDVTDTTALITWX1DX2X3X4X5X6X7X8CELTYGIKDVPGDRTTIDLWX9HX10AX11YSIGNLKPDTEYEVSLICRX12GDMSSNPAKETFTT(SEQ ID NO:167)
其中：
(a)X1表示氨基酸残基丝氨酸(S)或亮氨酸(L)；
(b)X2表示氨基酸残基天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)；
(c)X3表示氨基酸残基组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、苯丙氨酸(F)或色氨酸(W)；
(d)X4表示氨基酸残基丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)；
(e)X5表示氨基酸残基谷氨酸(E)、亮氨酸(L)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、天冬氨酸(D)或天冬酰胺(N)；
(f)X6表示氨基酸残基苯丙氨酸(F)或酪氨酸(Y)；
(g)X7表示氨基酸残基异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、组氨酸(H)、谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)；
(h)X8表示氨基酸残基甘氨酸(G)、色氨酸(W)或缬氨酸(V)；
(i)X9表示氨基酸残基色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)或酪氨酸(Y)；
(j)X10表示氨基酸残基丝氨酸(S)、谷氨酰胺(Q)、甲硫氨酸(M)或组氨酸(H)；
(k)X11表示氨基酸残基色氨酸(W)或组氨酸(H)；并且，
(l)X12表示氨基酸残基精氨酸(R)或丝氨酸(S)。
在一些实施例中，CD40L特异性单体亚单位包含选自下组的序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80和82。在一些实施例中，CD40L特异性单体亚单位由选自下组的序列组成，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80和82。
在一些实施例中，本发明的CD40L特异性Tn3单体亚单位包含以下氨基酸序列：
IEVX1DVTDTTALITWX2X3RSX4X5X6X7X8X9X10CELX11YGIKDVPGDRTTIDLX12X13X14X15YVHYSIGNLKPDTX16YEVSLICLTTDGTYX17NPAKETFTT
(SEQ ID NO:171)
其中：
(a)X1表示氨基酸残基赖氨酸(K)或谷氨酸(E)；
(b)X2表示氨基酸残基苏氨酸(T)或异亮氨酸(I)；
(c)X3表示氨基酸残基天冬酰胺(N)或丙氨酸(A)；
(d)X4表示氨基酸残基丝氨酸(S)、亮氨酸(L)、丙氨酸(A)、苯丙氨酸(F)或酪氨酸(Y)；
(e)X5表示氨基酸残基酪氨酸(Y)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)或丝氨酸(S)；
(f)X6表示氨基酸残基酪氨酸(Y)、丝氨酸(S)、丙氨酸(A)或组氨酸(H)；
(g)X7表示氨基酸残基天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、组氨酸(H)或酪氨酸(Y)；
(h)X8表示氨基酸残基亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)、组氨酸(H)或酪氨酸(Y)；
(i)X9表示氨基酸残基组氨酸(H)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)、亮氨酸(L)或天冬氨酸(D)；
(j)X10表示氨基酸残基甘氨酸(G)、苯丙氨酸(F)、组氨酸(H)或酪氨酸(Y)；
(k)X11表示氨基酸残基丙氨酸(A)或苏氨酸(T)；
(l)X12表示氨基酸残基丝氨酸(S)、天冬酰胺(N)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(R)或天冬氨酸(D)；
(m)X13表示氨基酸残基丝氨酸(S)、谷氨酰胺(Q)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)或丙氨酸(A)；
(n)X14表示氨基酸残基脯氨酸(P)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)或丙氨酸(A)或无氨基酸；
(o)X15表示氨基酸残基异亮氨酸(I)或无氨基酸；
(p)X16表示氨基酸残基谷氨酸(E)或赖氨酸(K)；并且，
(q)X17表示氨基酸残基丝氨酸(S)或天冬酰胺(N)。
在一些实施例中，本发明的CD40L特异性Tn3单体亚单位由以下氨基酸序列组成：
IEVX1DVTDTTALITWX2X3RSX4X5X6X7X8X9X10CELX11YGIKDVPGDRTTIDLX12X13X14X15YVHYSIGNLKPDTX16YEVSLICLTTDGTYX17NPAKETFTT
(SEQ ID NO:171)
其中：
(a)X1表示氨基酸残基赖氨酸(K)或谷氨酸(E)；
(b)X2表示氨基酸残基苏氨酸(T)或异亮氨酸(I)；
(c)X3表示氨基酸残基天冬酰胺(N)或丙氨酸(A)；
(d)X4表示氨基酸残基丝氨酸(S)、亮氨酸(L)、丙氨酸(A)、苯丙氨酸(F)或酪氨酸(Y)；
(e)X5表示氨基酸残基酪氨酸(Y)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)或丝氨酸(S)；
(f)X6表示氨基酸残基酪氨酸(Y)、丝氨酸(S)、丙氨酸(A)或组氨酸(H)；
(g)X7表示氨基酸残基天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、组氨酸(H)或酪氨酸(Y)；
(h)X8表示氨基酸残基亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)、组氨酸(H)或酪氨酸(Y)；
(i)X9表示氨基酸残基组氨酸(H)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)、亮氨酸(L)或天冬氨酸(D)；
(j)X10表示氨基酸残基甘氨酸(G)、苯丙氨酸(F)、组氨酸(H)或酪氨酸(Y)；
(k)X11表示氨基酸残基丙氨酸(A)或苏氨酸(T)；
(l)X12表示氨基酸残基丝氨酸(S)、天冬酰胺(N)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(R)或天冬氨酸(D)；
(m)X13表示氨基酸残基丝氨酸(S)、谷氨酰胺(Q)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)或丙氨酸(A)；
(n)X14表示氨基酸残基脯氨酸(P)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)或丙氨酸(A)或无氨基酸；
(o)X15表示氨基酸残基异亮氨酸(I)或无氨基酸；
(p)X16表示氨基酸残基谷氨酸(E)或赖氨酸(K)；并且，
(q)X17表示氨基酸残基丝氨酸(S)或天冬酰胺(N)。
在一些实施例中，CD40L特异性单体支架包含Tn3模块，其中一条或多条β链包含至少一个氨基酸取代，除了C和Fβ链(分别是SEQ ID NO:13或14；和SEQ ID NO:17)中的半胱氨酸残基可以不被取代以外。
可以针对长度和/或序列多样性将连接CD40L特异性单体亚单位的不同β链的环随机化。在一个实施例中，CD40L特异性单体亚单位具有至少一个针对长度和/或序列多样性随机化的环。在一个实施例中，针对长度和/或序列多样性将CD40L特异性单体亚单位的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个环随机化。在一个实施例中，CD40L特异性单体亚单位的至少一个环保持不变，同时针对长度和/或序列多样性将至少一个另外的环随机化。在另一个实施例中，环AB、CD和EF中的至少一个、至少两个或全部三个保持不变，同时针对长度或序列多样性将环BC、DE和FG中的至少一个、至少两个或全部三个随机化。在另一个实施例中，将环AB、CD和EF中的至少一个、至少两个或至少全部三个随机化，同时针对长度和/或序列多样性将环BC、DE和FG中的至少一个、至少两个或全部三个随机化。在仍另一个实施例中，针对长度或序列多样性将环AB、CD、EF、BC、DE和FG中的至少一个、至少两个、至少三个环、至少4个、至少五个或全部六个随机化。
在一些实施例中，在环内的一个或多个残基保持不变，同时针对长度和/或序列多样性将其他残基随机化。在一些实施例中，在环内的一个或多个残基保持为预先确定的并且有限数目的不同氨基酸，同时针对长度和/或序列多样性将其他残基随机化。因此，本发明的CD40L特异性单体亚单位可以包含一个或多个具有简并的共有序列的环和/或一个或多个不变的氨基酸残基。
在一个实施例中，本发明的CD40L特异性单体亚单位包含被随机化的AB环。在另一个实施例中，本发明的CD40L特异性单体亚单位包含被随机化的BC环。在一个实施例中，本发明的CD40L特异性单体亚单位包含被随机化的CD环。在一个实施例中，本发明的CD40L特异性单体亚单位包含被随机化的DE环。在一个实施例中，本发明的CD40L特异性单体亚单位包含被随机化的EF环。
在某些实施例中，本发明的CD40L特异性单体亚单位包含被保持为比人类肌腱蛋白C的第三FnIII结构域的同源FG环短至少一个氨基酸残基并且在一个或多个位置处被进一步随机化的FG环。
在具体实施例中，将环BC、DE和FG中的至少一个随机化，其中Aβ链包含SEQ ID NO:10或11，Bβ链包含SEQ ID NO:12，Cβ链包含SEQ ID NO:13或14，Dβ链包含SEQ ID NO:15，Eβ链包含SEQ ID NO:16，Fβ链包含SEQ ID NO:17，并且Gβ链包含SEQ ID NO:18，AB环包含SEQID NO:4或136，CD环包含SEQ ID NO:6并且EF环包含SEQ ID NO:8或137。
在其他具体实施例中，将环AB、CD和EF中的至少一个随机化，其中Aβ链包含SEQ IDNO:10或11，Bβ链包含SEQ ID NO:12，Cβ链包含SEQ ID NO:13或14，Dβ链包含SEQ ID NO:15，Eβ链包含SEQ ID NO:16，Fβ链包含SEQ ID NO:17，并且Gβ链包含SEQ ID NO:18，BC环包含SEQ ID NO:5，DE环包含SEQ ID NO:7并且FG环包含SEQ ID NO:9或139。
可以通过许多不同的途径增加本发明的Tn3支架的稳定性。在一些实施例中，可以通过延伸N端和/或C端区来稳定本发明的Tn3支架。可以将N端和/或C端区延伸1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或多于10个氨基酸。在其他实施例中，可以通过引入增加血清半衰期的改变来稳定本发明的Tn3支架，如本文所述的。在又另一个实施例中，本发明的Tn3支架包含至少一个氨基酸残基的添加、缺失或取代，以稳定该支架的疏水核。
如在国际专利申请号PCT/US2011/032184中披露的，可以通过工程化非天然的二硫键来有效地稳定本发明的Tn3支架。在一些实施例中，本发明的支架包含非天然存在的二硫键，如在PCT申请号WO 2009/058379中所述的。可以利用生物信息学途径来鉴定适于工程化二硫键的候选位置。
在一个实施例中，本发明的Tn3单体亚单位包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个或至少五个非天然存在的分子内二硫键。在一个实施例中，本发明的Tn3单体亚单位包含至少一个非天然存在的分子内二硫键，其中所述至少一个非天然存在的二硫键稳定该单体。在又另一个实施例中，本发明的Tn3支架包含至少一个非天然存在的二硫键，其中该键位于两个不同的单体或多聚体Tn3支架支架之间，即该二硫键是分子间二硫键。例如，二硫键可以连接不同的支架(例如，两个CD40L特异性单体支架)、Tn3支架和接头、Tn3支架和Fc结构域或者Tn3支架和抗体或其片段。
在一些实施例中，本发明的Tn3支架包含至少一个非天然存在的分子间二硫键，该分子间二硫键连接Tn3单体亚单位和分离的异源部分、Tn3单体亚单位和与同一Tn3支架融合或缀合的异源部分或Tn3单体亚单位和与不同Tn3支架融合或缀合的异源部分。
在一些实施例中，本发明的Tn3支架包含形成具有至少2个、至少3个、至少4个或更多个单体亚单位的Tn3多聚支架的二硫键。
在另一个实施例中，本发明的Tn3支架可以包含N端和/或C端区的延伸。在一个实施例中，本发明的Tn3支架包含用于增加血清半衰期的改变，如本文所述的。在又另一个实施例中，本发明的支架包含至少一个氨基酸残基的添加、缺失或取代，以稳定该支架的疏水核。
多聚Tn3支架
本发明的一个方面提供了多聚Tn3支架，这些多聚Tn3支架包含至少两个串联的本发明的Tn3单体亚单位，并且其中至少一个单体是CD40L特异性单体亚单位。可以将这样的多聚Tn3支架组装为多种形式。在具体方面中，本发明提供了多聚Tn3支架，其中至少两个CD40L特异性单体亚单位经由肽接头被串联地连接。在一些实施例中，这些多聚Tn3支架展示出靶标结合的效价和/或亲合力或该一种或多种靶标的其他作用的增加。在一些实施例中，当多个单体亚单位与同一靶标结合时，靶标结合的效价的和/或亲合力的增加得以实现。在一些实施例中，效价的增加改善对靶标的特定作用，如增加靶蛋白的二聚化。
在具体实施例中，本发明的多聚Tn3支架包含至少两个串联连接的CD40L特异性单体亚单位，其中每个CD40L特异性单体亚单位结合至少一个靶标，并且其中每个CD40L特异性单体亚单位包含多条被连接至多个环区的β链，其中至少一个环是亲本Tn3支架(SEQ IDNO:3)中的同源环的非天然存在的变体。
在一个实施例中，例如通过直接连接CD40L特异性单体亚单位或通过包含接头(例如，肽接头)经由CD40L特异性单体亚单位之间的共价结合产生多聚Tn3支架。在具体实例中，通过构建编码CD40L特异性单体亚单位的融合基因，或可替代地通过将半胱氨酸残基的密码子工程化进入CD40L特异性单体亚单位并且允许在表达产物之间形成二硫键来产生共价键合的Tn3支架。
在一个实施例中，本发明的多聚Tn3支架包含至少两个被直接彼此连接而没有任何另外的介入氨基酸的CD40L特异性单体亚单位。在另一个实施例中，本发明的多聚Tn3支架包含至少两个经由接头(例如，肽接头)而被串联连接的CD40L特异性单体亚单位。
在具体实施例中，本发明的多聚Tn3支架包含至少两个经由肽接头被串联连接的CD40L特异性单体亚单位，其中该肽接头包含1至约1000、或1至约500、或1至约250、或1至约100、或1至约50、或1至约25个氨基酸。在具体实施例中，该多聚Tn3支架包含至少两个经由肽接头被串联连接的CD40L特异性单体亚单位，其中该肽接头包含1至约20、或1至约15、或1至约10、或1至约5个氨基酸。
在具体实施例中，该多聚Tn3支架包含至少两个经由接头(例如，肽接头)被串联连接的CD40L特异性单体亚单位，其中该接头是功能部分。将基于该多聚Tn3支架的所希望的功能和/或特征来选择该功能部分。例如，可以将对于纯化有用的功能部分(例如，组氨酸标签)用作接头。作为接头有用的功能部分包括但不限于聚乙二醇(PEG)、细胞毒剂、放射性核素、显像剂、生物素、二聚化结构域、人血清白蛋白(HSA)或其FcRn结合部分、抗体的结构域或片段、单链抗体、结构域抗体、白蛋白结合结构域、IgG分子、酶、配体、受体、结合肽、非Tn3支架、表位标签、重组多肽聚合物、细胞因子等。在下文披露了可以用作接头的特定的肽接头和功能部分。
在具体实施例中，该功能部分是免疫球蛋白或其片段。在一些实施例中，该免疫球蛋白或其片段包含Fc结构域。在一些实施例中，该Fc结构域不能诱导至少一种FcγR介导的效应子功能，如ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)。在本领域已知可以改变Fc结构域以减少或消除至少一种FcγR介导的效应子功能，参见例如美国专利号5,624,821和6,737,056。
在一些实施例中，该多聚Tn3支架包含至少两个经由一个或多个接头连接的CD40L特异性单体亚单位，其中在每个CD40L特异性单体亚单位之间插入的接头可以是相同的接头或不同的接头。在一些实施例中，接头可以包含多个接头，这多个接头可以是相同的接头或不同的接头。在一些实施例中，当多个接头被串联时，这些接头中的一些或全部可以是功能部分。
支架结合化学计算
在一些实施例中，单体或多聚Tn3支架可以包含对不同表位具有特异性的CD40L特异性单体亚单位，这些不同的表位可以是在单一CD40L分子上或在不同CD40L靶分子上。在一些实施例中，多聚Tn3支架可以包含以下CD40L特异性单体亚单位，其中每个亚单位靶向一个或多个CD40L分子上的一个或多个不同的表位。
在其他实施例中，单体或多聚Tn3支架可以结合同一CD40L分子上的两个或更多个不同的表位。在一些实施例中，这些不同的表位是不重叠的表位。在其他实施例中，这些不同的表位是重叠的表位。
在又另一个具体实施例中，单体或多聚Tn3支架可以结合CD40L分子上的一个或多个表位并且另外结合第二CD40L分子上的一个或多个表位。在一些实施例中，这些不同的靶分子是低聚复合物(例如，三聚CD40L复合物)的一部分。
在仍另一个具体实施例中，单体或多聚Tn3支架可以与CD40L三聚体上的单一表位结合。在又另一个实施例中，单体或多聚Tn3支架可以与至少两个CD40L三聚体上的同一表位结合。
在某些实施例中，单体或多聚Tn3支架可以结合相邻细胞表面上的CD40L分子的两个或更多个拷贝的同一表位。在某些实施例中，单体或多聚Tn3支架可以结合溶液中的CD40L分子的两个或更多个拷贝的同一表位。在一些实施例中，单体或多聚Tn3支架能以相同或不同结合亲和力和/或亲合力与CD40L上的同一表位或不同表位结合。
在另一个实施例中，单体或多聚Tn3支架可以与CD40L的一个或多个拷贝上的表位结合并且实现或增强(例如，协同地)对靶标的所希望的作用，例如阻止与受体结合或阻止低聚化。
另外，当本发明的单体或多聚Tn3支架包含多个CD40L特异性单体亚单位(例如，不同单体)，其中的每个单体靶向CD40L上的不同表位时，可以根据某种模式或特殊的方向排列这样的单体亚单位以实现或增强某一生物效应。可以使用本领域已知的方法组装单体亚单位的这样的组合并且随后对其进行评估。
此外，可以将本发明的Tn3支架与标记序列(如肽)融合以便于纯化。在一些实施例中，标记氨基酸序列是多组氨酸肽(His-标签)，例如八组氨酸标签(His-8-标签)或六组氨酸标签(His-6-标签)，如提供于pQE表达载体(凯杰公司(QIAGEN,Inc.)，9259伊顿大道，查茨沃思，加州，91311)等其他载体中的标签，这些标签中的许多是可商购的。如Gentz etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:821-824,1989[Gentz等人，美国国家科学院院刊，86：821-824，1989]中所述的，例如，多组氨酸为融合蛋白纯化提供了方便。对于纯化有用的其他肽标签包括但不限于对应于衍生自流感血球凝集素蛋白的表位的血球凝集素(“HA”)标签(参见例如，Wilson et al.,Cell37:767,1984[Wilson等人，细胞，37：767，1984])、FLAG标签、Strep-标签、myc-标签、V5标签、GFP-标签、AU1-标签、AU5-标签、ECS-标签、GST-标签或OLLAS标签。
可以通过基因改组、基序改组、外显子改组和/或密码子改组(统称为“DNA改组”)技术产生另外的包含本发明的Tn3支架的融合蛋白。
可以采用DNA改组来改变Tn3支架对靶标的作用(例如，产生具有较高亲和力和较低解离速率的支架)。可以在重组之前通过随机诱变通过易错PCR、随机核苷酸插入或其他方法改变Tn3支架。可以将编码与特定靶标结合的支架的多核苷酸的一个或多个部分与一种或多种异源分子的一个或多个组分、基序、区段、部分、结构域、片段等重组。
抗体和Fc结构域融合物
在一些实施例中，本发明的Tn3支架包含与抗体(例如，IgG)的结构域或片段(包括但不限于Fc结构域)融合的CD40L特异性单体亚单位。
在一些实施例中，仅有一个CD40L特异性单体亚单位与抗体的结构域或片段缀合或融合。例如，单一CD40L特异性单体亚单位可以与抗体的结构域或片段(例如，抗体的重链或轻链)的多肽的N端融合。在其他实施例中，通过将一个或多个CD40L特异性单体亚单位与抗体的结构域或片段(例如，抗体的重链和/或轻链、或Fc结构域)的多肽的N端和/或C端融合或缀合来产生Tn3支架。
在一些实施例中，与抗体的结构域或片段融合的一些或全部CD40L特异性单体亚单位是相同的。在一些其他实施例中，与抗体的结构域或片段融合的一些或全部CD40L特异性单体亚单位是不同的。
在具体实施例中，本发明的Tn3支架包含一个与Fc结构域融合的CD40L特异性单体亚单位。在其他实施例中，本发明的Tn3支架包含至少两个与Fc结构域融合的CD40L特异性单体亚单位。在一个具体实施例中，与Fc结构域融合的CD40L特异性单体亚单位中的两个是相同的。在一个具体实施例中，与Fc结构域融合的CD40L特异性单体亚单位中的两个是不同的。在一个具体实施例中，与Fc结构域融合的两个CD40L特异性单体亚单位彼此串联连接，并且CD40L特异性单体亚单位之一与Fc结构域融合。
在一些实施例中，本发明的不同Tn3支架可以通过使用有利于形成异源二聚体的Fc结构域突变来二聚化。在本领域已知的是，Fc区的变体(例如，氨基酸取代和/或添加和/或缺失)增强或降低抗体的效应子功能并且可以改变该抗体的药代动力学特性(例如半衰期)。因此，在某些实施例中，本发明的Tn3支架包含一个或多个含有被改变的Fc区的Fc结构域，其中在Fc区中已经做出了一个或多个改变，以改变该Tn3支架的功能特性和/或药代动力学特性。在某些实施例中，本发明的Tn3支架包含一个或多个含有被改变的Fc区的Fc结构域，其中在Fc区中已经做出了一个或多个改变，以减少或消除至少一种Fc□R介导的效应子功能。
还已知的是，可以修饰Fc区的糖基化，以增加或减少效应子功能和/或抗炎性活性。因此，在一个实施例中，本发明的Tn3支架包含具有改变的氨基酸残基的糖基化的Fc区，以便改变Tn3支架的细胞毒特性和/或抗炎性特性。
Tn3支架拓扑结构
本发明的Tn3支架能以任何适合的空间排布与Fc结构域、抗体轻链和抗体重链的C端融合。关于预期的支架拓扑结构的详细说明，参加例如国际公开PCT/US2011/032184。
支架的产生
可以将本文所述的Tn3支架在任何用于演化出新的或改善的靶标结合蛋白的技术中使用。在一个具体实例中，将靶标固定在固相支持体(如柱树脂或微量滴定板孔)上，并且使靶标与基于候选支架的结合蛋白的文库接触。这样一个文库可以由通过CDR样环的序列和/或长度的随机化由Tn3支架构建的克隆组成。
在此方面中，细菌噬菌体(噬菌体)展示是一种熟知的允许人们筛选大的寡肽文库以鉴定那些文库中能够与靶标特异性结合的一个或多个成员的技术。噬菌体展示是一种将变体多肽展示为在细菌噬菌体颗粒的表面上的外壳蛋白的融合蛋白的技术(Scott,J.K.and Smith,G.P.(1990)Science 249:386[Scott,J.K.和Smith,G.P.(1990)科学，249：386])。可以采用生物信息学途径确定天然存在的FnIII结构域的环长和多样性偏好。使用这种分析，可以采用环长和序列多样性的偏好研发“受限随机化”途径。在这种受限随机化中，将相对环长和序列偏好合并进文库策略的研发中。将环长和序列多样性分析整合进文库研发中导致受限随机化(即随机化的环内的某些位置受限于可以在那一位置存在哪种氨基酸)。
本发明还提供了包含非天然存在的Tn3支架的多样群体的重组文库。在一个实施例中，这些文库包含非天然存在的Tn3支架，这些Tn3支架包含多条被连接至多个环区的β链结构域，其中一个或多个所述环随至少一个氨基酸的缺失、取代或添加而变化。在具体实施例中，这些文库包含衍生自野生型Tn3支架的Tn3支架。
如上文详细说明的，可以针对长度和/或序列多样性将连接支架的不同β链的环随机化。在一个实施例中，本发明的文库包含具有至少一个针对长度和/或序列多样性被随机化的环的Tn3支架。在一个实施例中，针对长度和/或序列多样性将Tn3支架的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个环随机化。在一个实施例中，至少一个环保持不变，同时针对长度和/或序列多样性将至少一个另外的环随机化。在另一个实施例中，环AB、CD和EF中的至少一个、至少两个或全部三个保持不变，同时针对长度或序列多样性将环BC、DE和FG中的至少一个、至少两个或全部三个随机化。在另一个实施例中，将环AB、CD和EF中的至少一个、至少两个或至少全部三个随机化，同时针对长度和/或序列多样性将环BC、DE和FG中的至少一个、至少两个或全部三个随机化。
在具体实施例中，本发明的文库包含FnIII支架，其中Aβ链包含SEQ ID NO:10或11，Bβ链包含SEQ ID NO:12，Cβ链包含SEQ ID NO:13或14，Dβ链包含SEQ ID NO:15，Eβ链包含SEQ ID NO:16，Fβ链包含SEQ ID NO:17，并且Gβ链包含SEQ ID NO:18。
在具体实施例中，本发明的文库包含FnIII支架，其中Aβ链由SEQ ID NO:10或11组成，Bβ链由SEQ ID NO:12组成，Cβ链由SEQ ID NO:13或14组成，Dβ链由SEQ ID NO:15组成，Eβ链由SEQ ID NO:16组成，Fβ链由SEQ ID NO:17组成，并且Gβ链由SEQ ID NO:18组成。
在具体实施例中，本发明的文库包含FnIII支架，其中Aβ链基本上由SEQ ID NO:10或11组成，Bβ链基本上由SEQ ID NO:12组成，Cβ链基本上由SEQ ID NO:13或14组成，Dβ链基本上由SEQ ID NO:15组成，Eβ链基本上由SEQ ID NO:16组成，Fβ链基本上由SEQ ID NO:17组成，并且Gβ链基本上由SEQ ID NO:18组成。
如上文详细说明的，在环内的一个或多个残基可以保持不变，同时针对长度和/或序列多样性将其他残基随机化。任选地或可替代地，在环内的一个或多个残基可以保持为预先确定的并且有限数目的不同氨基酸，同时针对长度和/或序列多样性将其他残基随机化。因此，本发明的文库包含以下Tn3支架，这些Tn3支架可以包含一个或多个具有简并的共有序列的环和/或一个或多个不变的氨基酸残基。在另一个实施例中，本发明的文库包含具有被随机化的BC环的Tn3支架。在另一个实施例中，本发明的文库包含具有被随机化的BC环的Tn3支架。在仍另一个实施例中，本发明的文库包含具有被随机化的BC环的Tn3支架。
在一个实施例中，本发明的文库包含具有被随机化的DE环的Tn3支架。在一个实施例中，本发明的文库包含具有被随机化的FG环的Tn3支架。在另一个实施例中，本发明的文库包含具有被随机化的FG环的FnIII支架。
在具体实施例中，本发明的文库包含支架，其中这些支架包含以下氨基酸序列：
IEV(XAB)nALITW(XBC)nCELX1YGI(XCD)nTTIDL(XDE)nYSI(XEF)nYEVSLIC(XFG)nKETFTT
其中：
(a)XAB、XBC、XCD、XDE、XEF和XFG分别表示存在于AB、BC、CD、DE、EF和FG环的序列中的氨基酸残基；
(b)X1表示氨基酸残基A或T；并且，
(c)环的长度n是在2与26之间的整数。
在一些实施例中，本发明的文库包含本发明的CD40L特异性Tn3单体亚单位，这些Tn3单体亚单位包含以下氨基酸序列：
IEVKDVTDTTALITWX1DX2X3X4X5X6X7X8CELTYGIKDVPGDRTTIDLWX9HX10AX11YSIGNLKPDTEYEVSLICRX12GDMSSNPAKETFTT(SEQ ID NO:167)
其中：
(a)X1表示氨基酸残基丝氨酸(S)或亮氨酸(L)；
(b)X2表示氨基酸残基天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)；
(c)X3表示氨基酸残基组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、苯丙氨酸(F)或色氨酸(W)；
(d)X4表示氨基酸残基丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)；
(e)X5表示氨基酸残基谷氨酸(E)、亮氨酸(L)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、天冬氨酸(D)或天冬酰胺(N)；
(f)X6表示氨基酸残基苯丙氨酸(F)或酪氨酸(Y)；
(g)X7表示氨基酸残基异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、组氨酸(H)、谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)；
(h)X8表示氨基酸残基甘氨酸(G)、色氨酸(W)或缬氨酸(V)；
(i)X9表示氨基酸残基色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)或酪氨酸(Y)；
(j)X10表示氨基酸残基丝氨酸(S)、谷氨酰胺(Q)、甲硫氨酸(M)或组氨酸(H)；
(k)X11表示氨基酸残基色氨酸(W)或组氨酸(H)；并且，
(l)X12表示氨基酸残基精氨酸(R)或丝氨酸(S)。
在一些实施例中，本发明的文库包含本发明的CD40L特异性Tn3单体亚单位，这些Tn3单体亚单位包含以下氨基酸序列：
IEVX1DVTDTTALITWX2X3RSX4X5X6X7X8X9X10CELX11YGIKDVPGDRTTIDLX12X13X14X15YVHYSIGNLKPDTX16YEVSLICLTTDGTYX17NPAKETFTT
(SEQ ID NO:171)
其中：
(a)X1表示氨基酸残基赖氨酸(K)或谷氨酸(E)；
(b)X2表示氨基酸残基苏氨酸(T)或异亮氨酸(I)；
(c)X3表示氨基酸残基天冬酰胺(N)或丙氨酸(A)；
(d)X4表示氨基酸残基丝氨酸(S)、亮氨酸(L)、丙氨酸(A)、苯丙氨酸(F)或酪氨酸(Y)；
(e)X5表示氨基酸残基酪氨酸(Y)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)或丝氨酸(S)；
(f)X6表示氨基酸残基酪氨酸(Y)、丝氨酸(S)、丙氨酸(A)或组氨酸(H)；
(g)X7表示氨基酸残基天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、组氨酸(H)或酪氨酸(Y)；
(h)X8表示氨基酸残基亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)、组氨酸(H)或酪氨酸(Y)；
(i)X9表示氨基酸残基组氨酸(H)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)、亮氨酸(L)或天冬氨酸(D)；
(j)X10表示氨基酸残基甘氨酸(G)、苯丙氨酸(F)、组氨酸(H)或酪氨酸(Y)；
(k)X11表示氨基酸残基丙氨酸(A)或苏氨酸(T)；
(l)X12表示氨基酸残基丝氨酸(S)、天冬酰胺(N)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(R)或天冬氨酸(D)；
(m)X13表示氨基酸残基丝氨酸(S)、谷氨酰胺(Q)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)或丙氨酸(A)；
(n)X14表示氨基酸残基脯氨酸(P)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)或丙氨酸(A)或无氨基酸；
(o)X15表示氨基酸残基异亮氨酸(I)或无氨基酸；
(p)X16表示氨基酸残基谷氨酸(E)或赖氨酸(K)；并且，
(q)X17表示氨基酸残基丝氨酸(S)或天冬酰胺(N)。
本发明进一步提供了用于通过筛选本发明的文库来鉴定结合靶标(例如，CD40L)并且与亲本Tn3支架相比对该靶标(例如，CD40L)具有增加的稳定性或改善的作用的重组Tn3支架的方法。
在某些实施例中，用于鉴定与亲本Tn3支架相比具有增加的蛋白质稳定性并且特异性结合靶标的重组Tn3支架的方法包括：
在适于形成支架:靶标配体复合物的条件下，使该靶标配体与本发明的文库接触；
从该复合物获得结合该靶标配体的支架；
确定在步骤(b)中获得的支架的稳定性是否大于野生型Tn3支架的稳定性。
可以使用同一方法鉴定对该靶标具有改善的结合亲和力、亲合力等的重组Tn3支架。在一个实施例中，在步骤(a)中，将本发明的支架文库与固定的靶标一起孵育。在一个实施例中，在步骤(b)中，洗涤该支架:靶标配体复合物以去除非特异性粘合剂，并且在非常严格条件下洗脱最紧的粘合剂并且使其经受PCR以回收序列信息。确切考虑了可以使用本文披露的方法或本领域普通技术人员已知的方法，将在步骤(b)中获得的粘合剂和/或序列信息用来创建新的文库，在需要或无需进一步突变该序列的情况下，可以使用该文库来重复选择过程。在一些实施例中，可以继续多轮选择，直到获得对该抗原具有足够亲和力的粘合剂。
本发明的另外的实施例是一批编码包含本发明的支架并且如上所述的文库的分离的核酸分子。
可以使本发明的支架经受亲和力成熟。在这个领域接受的过程中，使特定的结合蛋白经受以下方案，该方案针对增加的亲和力选择特定的靶标(参见Wu et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.95(11):6037-42[Wu等人，美国国家科学院院刊，95(11)：6037-42])。本发明形成的支架可以展示出至少与这些支架在亲和力成熟之前一样高的结合特征。
本发明还提供了鉴定能够与靶标结合以便形成支架:靶标复合物的蛋白质支架的氨基酸序列的方法。在一个实施例中，该方法包括：(a)使本发明的文库与固定的或可分离的靶标接触；(b)将该支架:靶标复合物与游离的支架分离；(c)使(b)的分离的支架复制，以便生成以具有降低的多样性并且以富含能够结合该靶标的显示的支架而与(a)中的文库区分开的新的多肽展示文库；d)任选地用(c)的新的文库重复步骤(a)和(b)；并且e)确定编码来自(d)的种类的显示的支架的区域的核酸序列并且因此推导出能够与该靶标结合的肽序列。
在另一个实施例中，在由文库筛选鉴定之后，可以将本发明的Tn3支架进一步随机化。在一个实施例中，本发明的方法包括进一步随机化使用本文所述的方法从文库中鉴定的支架的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个环。在另一个实施例中，使被进一步随机化的支架经受鉴定能够结合靶标的支架的后续方法。这种方法包括(a)使所述被进一步随机化的支架与固定的或可分离的靶标接触，(b)将被进一步随机化的支架:靶标复合物与游离的支架分离，(c)使(b)的分离的支架复制，任选地重复步骤(a)-(c)，并且(d)确定编码所述被进一步随机化的支架的区域的核酸序列并且因此，推导出能够与该靶标结合的肽序列。
在另外的实施例中，被进一步随机化的支架包含先前在第一文库中被随机化的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个被随机化的环。在替代的另外的实施例中，被进一步随机化的支架包含先前在第一文库中未被随机化的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个被随机化的环。
本发明还提供了用于获得至少两个与至少一个或多个靶标结合的Tn3支架的方法。这种方法允许筛选合作地发挥作用以引起具体应答的试剂。当需要多于一个支架的合作的激动活性时，使用这样一种筛选可以是有利的。这种方法允许筛选协同试剂而无需重定文库的格式，以形成多聚复合物。在一个实施例中，本发明的方法包括使靶标配体与本发明的文库在允许形成支架:靶标配体复合物的条件下接触，使所述支架与交联剂(被定义为使至少两个相同的或不同的支架离得很近的试剂)结合，其中这些支架的交联引起可检测的应答，并且从该复合物获得结合该靶标的所述支架。在另外的实施例中，该交联剂是支架特异性抗体或其片段、表位标签特异性抗体或其片段、二聚化结构域(如Fc区)、卷曲螺旋基序(例如但不限于亮氨酸拉链)、化学交联剂或本领域已知的另一种二聚化结构域。
亲和力成熟
本发明的Tn3支架的研发可以涉及一个或多个体外或体内亲和力成熟步骤。在一些实施例中，Tn3单体亚单位可以经历单步的亲和力成熟。在其他实施例中，Tn3单体亚单位可以经历两步或更多步的亲和力成熟。可以采用通常导致亲本Tn3支架中的氨基酸改变，或确切地亲本Tn3支架的环中的氨基酸改变的任何亲和力成熟途径，这些改变改善亲和力成熟的Tn3支架与所希望的抗原的结合。
可以例如经由随机诱变、“漫步(walk though)”诱变和“浏览(look through)诱变”实现这些氨基酸改变。可以通过使用例如易错PCR、酵母菌或细菌的“增变基因”菌株、在基于FnIII的结合分子的全部或部分的从头合成期间掺入随机的或限定的核酸改变来实现这样的诱变。用于进行亲和力成熟和/或诱变的方法描述于例如美国专利号7,195,880；6,951,725；7,078,197；7,022,479；5,922,545；5,830,721；5,605,793，5,830,650；6,194,550；6,699,658；7,063,943；5,866,344以及PCT公开WO 06023144中。
这样的亲和力成熟方法可能进一步需要增加抗原结合筛选测定的严谨度，以选择对抗原具有改善的亲和力的Tn3支架。可以在这里使用用于增加蛋白质-蛋白质相互作用测定的严谨度的领域公认的方法。在一个实施例中，可以改变一个或多个测定条件(例如，测定缓冲液的盐浓度)，以减小Tn3支架对所希望的抗原的亲和力。在另一个实施例中，Tn3支架与所希望的抗原结合所允许的时间的长度被减少。
在另一个实施例中，可以向蛋白质-蛋白质相互作用测定中添加竞争性结合步骤。例如，首先可以允许该Tn3支架与所希望的固定抗原结合。然后添加特定浓度的非固定抗原，用来与固定抗原竞争结合，这样使得对抗原具有最低亲和力的Tn3支架被从固定抗原上洗脱，导致选择出具有改善的抗原结合亲和力的Tn3支架。可以通过增加向该测定中添加的非固定抗原的浓度来进一步增加测定条件的严谨度。
筛选方法可能也需要多轮选择，以富集一个或多个具有改善的抗原结合的Tn3支架。在一个实施例中，在每一轮选择中，向该Tn3支架中引入另外的氨基酸突变。在另一个实施例中，在每一轮选择中，增加与所希望的抗原的结合的严谨度，以选择出对抗原具有增加的亲和力的Tn3支架。
在一些实施例中，通过Tn3的BC、DE和FG环的部分的饱和诱变进行亲和力成熟。在一些实施例中，使用孔克尔诱变(Kunkel mutagenesis)进行饱和诱变。在其他实施例中，通过使用PCR进行饱和诱变。
在一些实施例中，应用至少一轮、至少两轮、至少三轮、至少四轮、至少五轮或多于五轮的亲和力成熟。在一些实施例中，仅对一个环应用饱和诱变，而在一些其他实施例中，在一轮亲和力成熟期间，仅对一个环或环的一部分进行突变。在一些实施例中，在同一轮的亲和力成熟期间，对多于一个环或一个或多于一个环的部分进行突变。
在其他实施例中，在同一轮的亲和力成熟期间，同时突变BC、DE和FG环。
在将单体组装为与同一靶标的不同表位结合的多聚Tn3支架的情况下，可以独立地筛选每个结合特异性。
在一些实施例中，使用噬菌体展示文库随机化这些环。在一些实施例中，可以使用本领域公认的方法确定Tn3支架与所希望的靶标的结合。而且，可以使用领域公认的方法确定在筛选中鉴定的Tn3支架的氨基酸序列。
在一些实施例中，与亲和力成熟之前的同一Tn3支架相比，本发明的单体亲和力成熟的支架展示出对CD40L的至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少40倍、至少60倍、至少80倍或至少100倍或更多倍的亲和力的增加，如通过表面等离振子共振或通过本领域已知的其他测定测量的。在一些实施例中，本发明的单体亲和力成熟的支架具有小于5μM、小于1μM、小于500μM、小于250μM、小于100μM或小于50μM的解离常数(Kd)，如通过表面等离振子共振或通过本领域已知的其他测定测量的。
可以将这些亲和力成熟方法应用于研发具有令人希望的改善的结合特性(如增加的亲和力或其他令人希望的特征，如有利的药代动力学特性、高效力、低免疫原性、增加的或减少的交叉反应性等)的Tn3支架。
串联重复序列的产生
可以通过使用本领域已知的限制性内切酶(包括但不限于II型和IIS型限制性内切酶)在限制位点处连接寡核苷酸来产生串联构建体(即通过将两个CD40L特异性单体亚单位连接而形成的二聚体)的连接。
本发明的多聚Tn3支架在C端和/或N端和/或在如本文所述的结构域之间可以包含接头。另外，包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少8个多肽支架的本发明的支架可以与二聚化结构域融合或缀合，包括但不限于选自以下项的抗体部分：
(i)Fab片段，具有VL、CL、VH和CH1结构域；
(ii)Fab'片段，其是在CH1结构域的C端具有一个或多个半胱氨酸残基的Fab片段；
(iii)具有VH和CH1结构域的Fd片段；
(iv)具有VH和CH1结构域并且在CH1结构域的C端具有一个或多个半胱氨酸残基的Fd'片段；
(v)具有抗体的单臂的VL和VH结构域的Fv片段；
(vi)由VH结构域组成的dAb片段；
(vii)分离的CDR区；
(viii)F(ab')2片段，即包括两个由绞链区的二硫桥键连接的Fab'片段的二价片段；
(ix)单链抗体分子(例如，单链Fv；scFv)；
(x)具有两个抗原结合位点的“双抗体”，包含被连接至同一多肽链中的轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)；
(xi)包含一对串联Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)的“线性抗体”，这对串联Fd区段与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区；
(xii)全长抗体；以及
(xiii)包含CH2-CH3的Fc区，该Fc区可以进一步包含全部或部分的绞链区和/或CHl区。
Tn3支架生产
本发明的Tn3支架的重组表达需要构建含有编码该Tn3支架的多核苷酸的表达载体。一旦已经获得了编码Tn3支架的多核苷酸，便可以使用本领域熟知的技术通过重组DNA技术生产用于产生该Tn3支架的载体。因此，在本文描述了用于通过表达含有编码Tn3支架的核苷酸序列的多核苷酸来制备蛋白质的方法。可以使用本领域普通技术人员熟知的方法构建含有编码支架多肽的序列以及适当的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术以及体内基因重组。因此，本发明提供了包含编码本发明的Tn3支架的被可操作地连接至启动子的核苷酸序列的可复制载体。
通过常规技术将表达载体转移至宿主细胞中，并且然后通过常规技术培养经转染的细胞，以产生本发明的Tn3支架。因此，本发明提供了含有编码本发明的支架的被可操作地连接至异源性启动子的多核苷酸的宿主细胞。适合的宿主细胞包括但不限于微生物，如细菌(例如，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)。
可以利用多种宿主表达载体系统表达本发明的Tn3支架。这样的宿主表达系统代表通过其可以产生并随后纯化感兴趣的编码序列的媒介物，但还代表当用适当的核苷酸编码序列转化或转染时，可以原位表达本发明的支架的细胞。这些包括但不限于用含有支架编码序列的重组细菌噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的微生物，如细菌(例如，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)，或哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、BHK、293、NSO和3T3细胞)。
有用于生产本发明的Tn3支架的方法披露于例如国际专利申请公开号WO 2009/058379中。一旦已经通过重组表达产生本发明的支架，便可以通过本领域已知的用于蛋白质纯化的任何方法纯化该支架。
在一些实施例中，可以通过在重组表达期间替代可以被糖基化的氨基酸残基来以糖基化形式生产本发明的支架。在一个具体实施例中，在甘氨酸-丝氨酸接头(例如，SEQ IDNO:131或SEQ ID NO:132)中的丝氨酸氨基酸可以被其他氨基酸残基替代，如丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸(参见例如，SEQ ID NO:140、141、142和143)，以便在重组表达期间阻止糖基化作用。在一些具体实施例中，将N-糖基化位点从本发明的Tn3支架中去除。在其他实施例中，在重组表达之后，可以将本发明的支架去糖基化。使用例如酶混合物在重组表达之后体外去糖基化的方法在本领域是已知的(例如，PFGase F、Enodo F Multi、Orela O-linked Glycan Release、Enzymatic CarboRelease以及由加州棕榈沙漠的QA-bio销售的Enzymatic DeGlycoMx去糖基化试剂盒)。
可以将在研究实验室中的本发明的Tn3支架的生产按比例放大用于在分析规模的反应器或生产规模的反应器中生产支架，如在美国专利公开号US 2010-0298541 A1中所述的。
分泌型Tn3支架的可扩大生产
可以将本发明的Tn3支架细胞内地生产或作为分泌形式来生产。在一些实施例中，这些分泌型支架是适当折叠并完全功能化的。本发明的Tn3支架能以可扩大过程来生产。在一些实施例中，在研究实验室中能以可扩大过程生产本发明的支架，可以将其按比例放大以在分析规模的生物反应器(例如但不限于5L、10L、15L、30L或50L生物反应器)中生产本发明的支架。在其他实施例中，在研究实验室中能以可扩大过程生产本发明的Tn3支架，可以将其按比例放大以在生产规模的生物反应器(例如但不限于75L、100L、150L、300L或500L)中生产本发明的Tn3支架。在一些实施例中，与在研究实验室中进行的生产过程相比，本发明的可扩大过程导致在生产效率上很少的降低或没有降低。
接头
在多聚Tn3支架中的单体亚单位可以由蛋白质和/或非蛋白质接头连接，其中每个接头与至少两个单体亚单位融合。适合的接头可以由蛋白质接头、非蛋白质接头及其组合组成。接头的组合可以是同数的或异数的。在一些实施例中，本发明的多聚Tn3支架包含多个单体亚单位，其中所有的接头都是相同的。在其他实施例中，多聚Tn3支架包含多个单体亚单位，其中至少一个接头与剩余的接头在功能上或结构上是不同的。在一些实施例中，接头可以本身通过直接或间接参与与靶标的结合而有助于多聚Tn3支架的活性。
在一些实施例中，该蛋白质接头是多肽。接头多肽应该具有适合以这样一种方式连接两个或更多个单体亚单位的长度，在该方式中它们相对于彼此采取正确的构象，这样使得它们保留所希望的活性。
在一个实施例中，该多肽接头包含1至约1000个氨基酸残基、1至约50个氨基酸残基、1-25个氨基酸残基、1-20个氨基酸残基、1-15个氨基酸残基、1-10个氨基酸残基、1-5个氨基酸残基、1-3个氨基酸残基。本发明进一步提供了编码该多肽接头序列的核酸，如DNA、RNA或两者的组合。选择被包含在该多肽接头中的氨基酸残基应该展示出不显著地干扰本发明的多聚Tn3支架的活性或功能的特性。因此，多肽接头应该大体上不展示出将与本发明的Tn3多聚支架的活性或功能不一致的职责(charge)，或干扰内部折叠，或与一个或多个单体亚单位中的氨基酸残基形成键或其他相互作用，这将严重地妨碍本发明的多聚Tn3支架与CD40L的结合。
将天然存在的以及人工的肽接头用于将多肽连接进新颖的连接的融合多肽中在文献中是熟知的。因此，融合两个或更多个单体亚单位的接头是天然接头、人工接头或其组合。在一些实施例中，存在于本发明的Tn3多聚支架中的所有肽接头的氨基酸序列都是相同的。在其他实施例中，存在于本发明的多聚Tn3支架中的至少两个肽接头的氨基酸序列是不同的。
在一些实施例中，多肽接头具有构象柔性。在一些实施例中，多肽接头序列包含(G-G-G-G-X)m氨基酸序列，其中X是丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、甘氨酸(G)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)或缬氨酸(V)并且m是正整数(参见例如，SEQ ID NO:209)。在具体实施例中，多肽接头序列包含(G-G-G-G-S)m氨基酸序列，其中m是正整数(参见例如，SEQ ID NO:147)。在另一个具体实施例中，多肽接头序列包含(G-G-G-G-G)m氨基酸序列，其中m是正整数(参见例如，SEQ ID NO:148)。在仍另一个具体实施例中，多肽接头序列包含(G-G-G-G-A)m氨基酸序列，其中m是正整数(参见例如，SEQ ID NO:149)。在一些实施例中，多肽接头是固有非结构化的天然的或人工的多肽(参见例如，Schellenberger et al.,Nature Biotechnol.27:1186-1190,2009[Schellenberger等人，自然生物技术，27：1186-1190，2009]；还参见，Sickmeieret al.,Nucleic Acids Res.35:D786-93,2007[Sickmeier等人，核酸研究，35：D786-93，2007])。
能以引入包含非多肽部分的附接基团的氨基酸残基的这样一种方式修饰该肽接头。这样的氨基酸残基的实例可以是半胱氨酸残基(然后非多肽部分随后附接至其上)或该氨基酸残基可以包括体内N-糖基化位点(从而将糖部分(体内)附接至该肽接头)。
在一些实施例中，存在于该多肽多聚体中的所有肽接头的氨基酸序列都是相同的。可替代地，存在于该多肽多聚体中的所有肽接头的氨基酸序列可以是不同的。
本发明进一步涵盖与治疗性部分缀合的Tn3支架的用途。Tn3支架可以与治疗性部分(如细胞毒素例如细胞抑制剂或杀细胞剂、治疗剂或放射性金属离子例如α-发射体)缀合。细胞毒素或细胞毒剂包括对细胞有害的任何试剂。
CD40L特异性Tn3支架
本发明提供了与CD40L特异性结合的Tn3支架。在具体实施例中，本发明的支架与人类CD40L特异性结合。在其他具体实施例中，本发明的Tn3支架与来自小鼠、鸡、恒河猴、猕猴、大鼠或兔的CD40L同系物结合。在一些实施例中，本发明的Tn3支架与CD40L的暴露表位结合。这样的实施例包括在细胞和/或被转染以异位表达该受体的细胞上内源表达的CD40L。
在一些实施例中，本发明的Tn3支架识别展示在单体CD40L上的表位。在其他实施例中，本发明的Tn3支架识别展示在CD40L的三聚体形式上的表位。在其他实施例中，本发明的Tn3支架识别展示在膜结合的CD40L上的表位。在其他实施例中，本发明的Tn3支架识别展示在可溶性CD40L上的表位。
在又其他实施例中，本发明的Tn3支架结合单体CD40L并且阻止或干扰CD40L分子的低聚化。在又其他实施例中，本发明的支架减少或抑制CD40L与CD40的相互作用。在其他实施例中，本发明的Tn3支架激动由CD40L介导的细胞信号传导。在又其他实施例中，本发明的Tn3支架拮抗由CD40L介导的细胞信号传导。
本发明还提供了使用本文所述的Tn3支架调节CD40L活性的方法。在一些实施例中，本发明的方法包括使CD40L与CD40L特异性支架接触并且阻断CD40与CD40L之间的相互作用。在其他实施例中，本发明的方法包括使表达CD40L的细胞与CD40L特异性Tn3支架接触并且阻止CD40L从细胞表面蛋白水解裂解。在其他实施例中，本发明的方法包括使CD40L单体与CD40L特异性Tn3支架并且阻止CD40L低聚化。在其他实施例中，可以通过使用多聚Tn3支架实现CD40L的二聚化或低聚化。
在一些实施例中，本发明的方法包括给予减少CD40介导的免疫应答(参见例如，Elqueta et al.229:152-172,2009[Elqueta等人，229：152-172，2009])或由CD40与CD40L的结合引发的下游信号传导通路(如通过本领域已知的常规测定测量的)的CD40L特异性支架。
不希望被任何具体理论所束缚，本发明的CD40L支架可以通过以下方式发挥作用：通过阻止CD40L与CD40的结合，通过结合并螯合可溶性CD40L，通过改变CD40L与CD40的相互作用而非阻止结合，通过阻止或增强金属蛋白酶介导的CD40L从细胞表面的酶法裂解以产生可溶性CD40L，通过阻止或增强细胞表面CD40L胞吞作用等。
特异性CD40L结合序列
在一些实施例中，本发明的Tn3支架包含CD40L特异性单体亚单位，这些单体亚单位包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个与CD40L结合的环序列。
在一些实施例中，CD40L特异性单体亚单位包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个选自以下项的CD40L结合单体克隆的环序列：309(分离自天然Tn3文库的亲本309家族克隆；SEQ ID NO:20)，309FGwt(具有人源化的FG环的亲本309克隆；SEQ ID NO:22)，340(亲和力成熟的309克隆；SEQ ID NO:24)，341(亲和力成熟的309克隆；SEQ ID NO:26)，342(亲和力成熟的309克隆；SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:146)，343(亲和力成熟的309克隆；SEQ ID NO:30)，344(亲和力成熟的309克隆；SEQ ID NO:32)，345(亲和力成熟的309克隆；SEQ ID NO:34)，346(亲和力成熟的309克隆；SEQ ID NO:36)，347(亲和力成熟的309克隆；SEQ ID NO:38)，348(亲和力成熟的309克隆；SEQ ID NO:40)，349(亲和力成熟的309克隆；SEQ ID NO:42)，311(分离自天然Tn3文库的亲本311家族克隆；SEQ ID NO:44)，311K4E(来自第一轮的亲和力成熟的变体311家族克隆；SEQ ID NO:46)；311K4E_1(来自第二轮的亲和力成熟的变体311家族克隆；SEQ ID NO:48)，311K4E_2(来自第二轮的亲和力成熟的变体311家族克隆；SEQ ID NO:50)，311K4E_3(来自第二轮的亲和力成熟的变体311家族克隆；SEQ ID NO:52)，311K4E_4(来自第二轮的亲和力成熟的变体311家族克隆；SEQ ID NO:54)，311K4E_5(来自第二轮的亲和力成熟的变体311家族克隆；SEQ ID NO:56)，311K4E_7(来自第二轮的亲和力成熟的变体311家族克隆；SEQ ID NO:58)，311K4E_8(来自第二轮的亲和力成熟的变体311家族克隆；SEQ ID NO:60)，311K4E_9(来自第二轮的亲和力成熟的变体311家族克隆；SEQ ID NO:62)，311K4E_10(来自第二轮的亲和力成熟的变体311家族克隆；SEQ ID NO:64)，311K4E_11(来自第二轮的亲和力成熟的变体311家族克隆；SEQID NO:66)，311K4E_12(来自第二轮的亲和力成熟的变体311家族克隆；SEQ ID NO:68)，311K4E_13(来自第二轮的亲和力成熟的变体311家族克隆；SEQ ID NO:70)，311K4E_14(来自第二轮的亲和力成熟的变体311家族克隆；SEQ ID NO:72)，311K4E_15(来自第二轮的亲和力成熟的变体311家族克隆；SEQ ID NO:74)，311K4E_16(来自第二轮的亲和力成熟的变体311家族克隆；SEQ ID NO:76)，311K4E_19(来自第二轮的亲和力成熟的变体311家族克隆；SEQ ID NO:78)，311K4E_20(来自第二轮的亲和力成熟的变体311家族克隆；SEQ ID NO:80)以及311K4E_21(来自第二轮的亲和力成熟的变体311家族克隆；SEQ ID NO:82)。
在一些实施例中，CD40L特异性单体亚单位包含至少一个选自列于表2中的环序列的环序列。在其他实施例中，CD40L特异性单体亚单位包含至少一个选自列于表2中的BC环序列的BC环序列。在其他实施例中，CD40L特异性单体亚单位包含至少一个选自列于表2中的DE环序列的DE环序列。在其他实施例中，CD40L特异性单体亚单位包含至少一个选自列于表2中的FG环序列的FG环序列。
在一些实施例中，CD40L特异性单体亚单位包含选自列于表2中的BC环序列的BC环序列；和选自列于表2中的DE环序列的DE环序列。在其他实施例中，CD40L特异性单体亚单位包含选自列于表2中的BC环序列的BC环序列；和选自列于表2中的FG环序列的FG环序列。在其他实施例中，CD40L特异性单体亚单位包含选自列于表2中的DE环序列的DE环序列；和选自列于表2中的FG环序列的FG环序列。在一些实施例中，CD40L特异性单体亚单位包含对应于来自一个、两个或三个不同的Tn3克隆的环序列的环序列。
在某些实施例中，在CD40L特异性单体支架序列在该序列的C端含有接头和/或组氨酸标签(例如，His-8标签)或另外的N端氨基酸的情况下，可以去除这些C端接头和/或组氨酸标签以及另外的N端氨基酸，因此对应的氨基酸序列含有C端接头和His标签序列以及N端另外的一个或多个氨基酸的缺失。
在一些实施例中，CD40L特异性Tn3支架包含单一的单体亚单位，例如342克隆序列(亲和力成熟的309克隆；SEQ ID NO:28和/或SEQ ID NO:146)。在其他实施例中，CD40L特异性支架包含多于一个单体亚单位，例如两个串联的342克隆单体亚单位(SEQ ID NO:28和/或SEQ ID NO:146)(参见例如，SEQ ID NO:135)。在具体实施例中，本发明的Tn3支架与变体HSA缀合(参见例如，SEQ ID NO:134和SEQ ID NO:135)。在另外的实施例中，可以在多聚Tn3支架的N端或C端缀合该HSA。
在具体实施例中，CD40L特异性Tn3支架包含单一的311K4E_12单体亚单位、GS接头和C34S HSA变体(参见例如，SEQ ID NO:201)。在另一个具体实施例中，CD40L特异性Tn3支架包含具有β链C CELTYG变体的单一的311K4E_12单体亚单位、全是甘氨酸的接头和C34SHSA变体(参见例如，SEQ ID NO:202)。在另一个具体实施例中，CD40L特异性Tn3支架包含两个串联的311K4E_12亚单位和两个GS接头，其中一个GS接头将亚单位彼此连接并且第二GS接头将一个亚单位与C34S HSA变体连接(参见例如，SEQ ID NO:203)。在又另一个具体实施例中，CD40L特异性Tn3支架包含两个串联的311K4E_12亚单位和两个全是甘氨酸的接头，其中一个全是甘氨酸的接头将亚单位彼此连接并且第二全是甘氨酸的接头将一个亚单位与C34S HSA变体连接(参见例如，SEQ ID NO:204)。
在一个具体实施例中，CD40L特异性Tn3支架包含两个经由GS接头连接的309亚单位(参见例如，SEQ ID NO:205)。在另一个具体实施例中，CD40L特异性Tn3支架包含单一的被连接至C34S HSA变体的309亚单位(参见例如，SEQ ID NO:206)。在另一个具体实施例中，CD40L特异性Tn3支架包含两个串联的309亚单位和两个GS接头，其中一个GS接头将亚单位彼此连接并且第二GS接头将一个亚单位与C34S HSA变体连接(参见例如，SEQ ID NO:207)。
在具体实施例中，CD40L特异性Tn3支架包含单一的342单体亚单位、GS接头和C34SHSA变体(参见例如，SEQ ID NO:134)。在另一个具体实施例中，CD40L特异性Tn3支架包含单一的342单体亚单位、全是甘氨酸的接头和C34S HSA变体(参见例如，SEQ ID NO:144)。在另一个具体实施例中，CD40L特异性Tn3支架包含两个串联的342亚单位和两个GS接头，其中一个GS接头将亚单位彼此连接并且第二GS接头将一个亚单位与C34S HSA变体连接(参见例如，SEQ ID NO:135)。在又另一个具体实施例中，CD40L特异性Tn3支架包含两个串联的342亚单位和两个全是甘氨酸的接头，其中一个全是甘氨酸的接头将亚单位彼此连接并且第二全是甘氨酸的接头将一个亚单位与C34S HSA变体连接(参见例如，SEQ ID NO:145)。在又另一个具体实施例中，CD40L特异性Tn3支架包含两个通过GS接头连接的342亚单位(参见例如，SEQ ID NO:208)。
在具体实施例中，CD40L特异性Tn3支架包含在另一个具体实施例中，CD40L特异性Tn3支架包含串联的311亚单位或衍生自311的亚单位(例如，311K4E_12)和309亚单位或衍生自309的亚单位(例如，342)以及两个GS接头，其中一个GS接头将亚单位彼此连接并且第二GS接头将一个亚单位与C34S HSA变体连接(参见例如，SEQ ID NO:135)。在又另一个具体实施例中，CD40L特异性Tn3支架包含串联的311亚单位或衍生自311的亚单位(例如，311K4E_12)和309亚单位或衍生自309的亚单位(例如，342)以及两个全是甘氨酸的接头，其中一个全是甘氨酸的接头将亚单位彼此连接并且第二全是甘氨酸的接头将一个亚单位与C34S HSA变体连接(参见例如，SEQ ID NO:145)。
CD40L特异性串联二价Tn3支架和血清白蛋白(SA)融合物的实例示于图2A中(还参见图9A)。尽管在图2A中提供了特定的接头，但是考虑了如本文提供的其他接头。尽管可以使用野生型成熟SA(例如鼠血清白蛋白(MSA)或人血清白蛋白(HSA))，但是考虑了在成熟SA中的一个或多个半胱氨酸(C)氨基酸残基可以被例如丝氨酸(S)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)等取代。
下面示出了代表性构建体。SA的序列带下划线。接头被加框。应理解的是，许多改变在本发明的范围内。例如，接头可以被改变(在本文提供了若干非限制性实例)，第一个或前两个N端氨基酸残基(SQ)可以不存在和/或被替代性氨基酸残基取代，可以掺入标签(例如，6xHis标签)，可以在类似构建体中使用替代性CD40L特异性支架(例如，基于纤连蛋白的第10个Fn3结构域的那些)等。
342单价HSA构建体1(SEQ ID NO:134)
[342单体]-(G4S)2接头-HSAC34S
SQIEVKDVTDTTALITWSDDFGEYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHHAHYSIGNLKPDTEYEVSLICRSGDMSSNPAKETFTT DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFA KTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAF HDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQ KFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEK PLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLE KCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGS KCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHAD ICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
342单价HSA构建体2(SEQ ID NO:144)
[342单体]-G10接头-HSAC34S：
SQIEVKDVTDTTALITWSDDFGEYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHHAHYSIGNLKPDTEYEVSLICRSGDMSSNPAKETFTT DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEF AKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTA FHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASL QKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCE KPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTL EKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVG SKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHA DICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
342二价HSA构建体1(SEQ ID NO:135)
[342单体]-(G4S)3接头-[342单体]-(G4S)2接头-HSAC34S：
SQIEVKDVTDTTALITWSDDFGEYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHHAHYSIGNLKPDTEYEVSLICRSGDMSSNPAKETFTTRLDAPSQIEVKDVTDTTALITWSDDFGEYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHHAHYSIGNLKPDTEYEVSLICRSGDMSSNPAKETFTT DAHKSEVAHRFKDL GEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCC AKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTEC CQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTEC CHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEA KDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLG EYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKC CTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAA FVEKCCKDDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
342二价HSA构建体2(SEQ ID NO:145)
[342单体]-G15接头-[342单体]-G10接头-HSAC34S：
SQIEVKDVTDTTALITWSDDFGEYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHHAHYSIGNLKPDTEYEVSLICRSGDMSSNPAKETFTTRLDAPSQIEVKDVTDTTALITWSDDFGEYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHHAHYSIGNLKPDTEYEVSLICRSGDMSSNPAKETFTT DAHKSEVAHRFK DLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMAD CCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFT ECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHT ECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYA EAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQ LGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVT KCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDF AAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
311K4E_12单价HSA构建体1(SEQ ID NO:201)
[311K4E_12单体]-(G4S)2接头-HSAC34S：
SQIEVEDVTDTTALITWTNRSSYSNLHGCELAYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLKPDTEYEVSLICLTTDGTYNNPAKETFTT DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEV TEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVM CTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKC ASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKE CCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYE TTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLG KVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFT FHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
311K4E_12单价HSA构建体2(SEQ ID NO:202)
[311K4E_12单体]-G10接头-HSAC34S：
SQIEVEDVTDTTALITWTNRSSYSNLHGCELTYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLKPDTEYEVSLICLTTDGTYNNPAKETFTT DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNE VTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDV MCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLK CASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLK ECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTY ETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNL GKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETF TFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
311K4E_12二价HSA构建体1(SEQ ID NO:203)
[311K4E_12单体]-G4S3接头-[311K4E_12单体]-(G4S)2接头-HSAC34S：
SQIEVEDVTDTTALITWTNRSSYSNLHGCELAYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLKPDTEYEVSLICLTTDGTYNNPAKETFTTRLDAPSQIEVEDVTDTTALITWTNRSSYSNLHGCELAYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLKPDTEYEVSLICLTTDGTYNNPAKETFTTGGGGSGGGGSDAHKSEVAHRFKD LGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADC CAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTE CCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTE CCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAE AKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQL GEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTK CCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFA AFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
311K4E_12二价HSA构建体2(SEQ ID NO:204)
[311K4E_12单体]-G15接头-[311K4E_12单体]-G10接头-HSAC34S：
SQIEVEDVTDTTALITWTNRSSYSNLHGCELTYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLKPDTEYEVSLICLTTDGTYNNPAKETFTT RLDAPSQIEVEDVTDTTALITWTNRSSYSNLHGCELAYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLKPDTEYEVSLICLTTDGTYNNPAKETFTT DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTV ATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPEL LFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEV SKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAAD FVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQ NLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCV LHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKA TKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
药物组合物
在另一个方面中，本发明提供了组合物(例如但不限于药物组合物)，该组合物含有与药学上可接受的载体一起配制的一个本发明的Tn3支架或其组合。在一些实施例中，该药物组合物包含具有支架(如Tn3支架)的白蛋白融合蛋白。在另一个实施例中，该药物组合物包含SEQ ID NO:134、135、201、202、203、204、205、206、207或208的白蛋白融合蛋白的组合物，其中该组合物具有少于20ng/mg的宿主细胞蛋白，并且其中位置46、151或两个位置处的色氨酸不被氧化。其他实施例涉及包含根据本发明纯化的白蛋白融合蛋白的药学上可接受的配制品。该配制品可以适合地包括缓冲液、糖和乳化剂。在一个实施例中，该缓冲液是磷酸钠缓冲液，该糖是蔗糖，并且该乳化剂是聚山梨醇酯80。如权利要求100或权利要求101所述的药物配制品，其中该配制品被冻干。
等效物
本领域普通技术人员应认识到，或使用不超出常规实验能够确定本文所述的本发明的特定实施例的很多等效物。这样的等效物旨在被以下权利要求书所涵盖。
在本说明书提到的所有公开、专利和专利申请均通过引用并入本文，引用程度就如同每个单独公开、专利或专利申请特定地并且单独地指示通过引用并入本文一般。
实例
现在参考以下实例来描述本发明。这些实例仅是说明性的，并且本发明决不应被解释为局限于这些实例，而是应当被解释为涵盖作为本文提供的教导的结果变得明显的任何以及所有变体。
实例1
化学品
丙二醇获得自阿尔法阿萨尔公司(Alfa Aesar)(沃德山(Ward Hill)，马萨诸塞州，美国)。蔗糖获得自Pfanstiehl公司(沃基根，伊利诺伊州，美国)。曲通X-100和硫酸钠获得自EMD密理博公司(EMD Millipore)(比尔里卡，马萨诸塞州，美国)。Bis-tris、bis-trisHCl和烟酰胺获得自西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)(圣路易斯，密苏里州，美国)。冰醋酸、精氨酸、甘氨酸、乙酸钠、辛酸钠、氯化钠、柠檬酸钠、氢氧化钠、磷酸钠、tris和尿素获得自杰帝贝柯公司(JT Baker)(中心谷(Center Valley)，宾夕法尼亚州，美国)。
蛋白质
在这项工作中使用的蛋白质白蛋白融合蛋白#1(AFP-1)(SEQ ID NO:145)是一种由两个相同的衍生自人类纤连蛋白III型蛋白质结构域的与人血清白蛋白融合的肌腱蛋白C(TnC)结构域组成的CD40L拮抗剂。每个Tn3(衍生自人类TnC的第三纤连蛋白III型蛋白质结构域)结构域与人类CD40L结合并且抑制其与人类CD40的相互作用。人血清白蛋白融合确保该分子的适合的药代动力学特性。使用在本领域中受过训练的技术人员熟悉的技术在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达该蛋白质。重组人类白蛋白(rHSA；表达于水稻中)作为冻干粉购自西格玛奥德里奇公司(目录号：A9731)表3综述了rHSA和AFP-1的特性。
表3.蛋白质特性综述
a制造商的数据
a如通过cIEF测量的。
总蛋白浓度测量
使用行业常用的标准分光光度法通过280nm下的吸光度测量所有过程中间体(除了澄清的培养基并且在一些情况下汽巴蓝染料层析池以外)中的蛋白质浓度。将0.98(mg/mL)-1cm-1的消光系数用于AFP-1，并且将0.531(mg/mL)-1cm-1的消光系数用于rHSA。
HSA亲和力高效液相层析
使用具有安捷伦(Agilent)1200HPLC系统(帕洛阿尔托，加州，美国)的获得自生命技术公司(格兰岛，纽约州，美国)的Poros CaptureSelect HSA柱进行分析型高效HSA亲和层析(HSA-HPLC)。平衡缓冲液相是3.5mL/min的pH 7.2的10-50mM磷酸钠，并且将产物用100mM甘氨酸(pH 2.0)缓冲液洗脱。注射10-100ug的纯样品并且使用分光光度计在280nm下监测洗脱谱。使用来自安捷伦公司(Agilent)的ChemStation软件收集并分析数据，并且从用经纯化的蛋白质产生的标准曲线确定产物特异性浓度。
染料亲和层析
在典型的结合和洗脱条件下在具有20cm床高的小规模层析柱中进行汽巴蓝染料亲和层析。使用来自通用医疗集团(皮斯卡塔韦，新泽西州，美国)的AKTA Explorer液相层析系统进行所有运行，并且在300cm/h下操作柱。在基线条件下，用50mM bis-tris(或磷酸盐)、50mM NaCl(pH6.0)平衡柱，并且然后加载直到25g的蛋白质/L的树脂(基于澄清细胞培养液中的HSA-HPLC滴度)。在加载之后，将柱再平衡，用50mM bis-tris(或磷酸盐)(pH 7.0)洗涤，并且然后用50mM bis-tris(或磷酸盐)、25mM辛酸钠、10mM EDTA(pH 7.0)洗脱。基于在产物峰前部和尾部的100mAU处的吸光度标准来收集产物峰。在优化期间(参见实例2)，在再平衡与50mM磷酸盐(pH 7)洗涤之间将另外的洗涤物应用至柱。Capto Blue(高取代)树脂获得自通用医疗集团(皮斯卡塔韦，新泽西州，美国)。Toyopearl AF-Blue HC-650M树脂获得自东曹生物科学公司(Tosho Biosciences)(普鲁士王，宾夕法尼亚州，美国)。
阴离子交换层析
在典型的结合和洗脱条件下在包装至20cm床高的小层析柱中进行阴离子交换层析(AEX)。使用来自通用医疗集团的AKTA Explorer液相层析系统进行所有运行，并且在300cm/h下操作柱。在基线条件下，将柱用50mM bis-tris、20mM氯化钠(pH 7.0)平衡，加载蛋白质，并且然后用平衡缓冲液洗涤。将柱使用逐步或10柱体积(CV)线性梯度的20-400mM氯化钠在pH 7.0的bis-tris缓冲液中洗脱。基于在产物峰前部和尾部的100mAU处的吸光度标准来收集产物峰。Capto Q树脂获得自通用医疗集团(皮斯卡塔韦，新泽西州，美国)。
阴离子交换膜层析
在典型的流通条件下进行阴离子交换膜层析(AEMC)。使用来自通用医疗集团的AKTA Explorer液相层析系统进行所有运行，并且在10MV/min下操作柱。在基线条件下，将膜用50mM bis-tris、50mM氯化钠(pH 7.0)平衡并且然后使加载材料通过该膜。基于在产物峰前部和尾部的100mAU处的吸光度标准来收集流通产物峰。在优化期间(参见实例2)，使用在10-220mM NaCl与pH 6至8之间的缓冲液条件。Mustang Q膜获得自颇尔生命科学公司(华盛顿港，纽约州，美国)。
疏水相互作用层析
在典型的结合和洗脱条件下在具有20cm台阶高度的小规模层析柱中进行疏水相互作用层析(HIC)。使用来自通用医疗集团(皮斯卡塔韦，新泽西州，美国)的AKTA Explorer液相层析系统进行所有运行，并且在130-300cm/h下操作柱。在基线条件下，将柱用50mMbis-tris、1M柠檬酸钠(pH 7.0)平衡。通过使用2份50mM bis-tris、2M柠檬酸钠(pH 7.0)稀释1份(按重量计)蛋白质溶液来制备加载液，并且然后将柱加载直到25g的蛋白质/L的树脂。在加载之后，将柱用平衡缓冲液再平衡，并且然后用从1M至0mM柠檬酸钠的线性梯度经过20个柱体积洗脱。将产物峰收集在级分中，其中早期洗脱材料富含经氧化的产物。Toyopearl PPG 600M和Toyopearl Phenyl 650M树脂来自东曹生物科学公司(TosohBioscience)(普鲁士王，宾夕法尼亚州，美国)；Capto MMC和Butyl-S Fast Flow树脂来自通用医疗集团(皮斯卡塔韦，新泽西州，美国)。
分析型尺寸排阻层析
使用具有安捷伦1200HPLC系统(帕洛阿尔托，加州，美国)的获得自东曹生物科学公司(Tosoh Biosciences)(普鲁士王，宾夕法尼亚州，美国)的TSK-GEL G3000SWXL柱(7.8mm×30cm)进行分析型高效尺寸排阻层析(SEC-HPLC)。流动相是0.8mL/min的0.1M磷酸钠、0.1M硫酸钠、10％异丙醇(pH 6.8)，在30℃下持续22分钟。注射250ug的纯样品并且使用来自伯乐公司(Bio-Rad)(赫拉克勒斯，加州，美国)的分子量标准品来对柱进行校准。使用分光光度计在280nm下监测洗脱谱，并且使用来自安捷伦公司的ChemStation软件收集并分析数据。将结果报告为与在大约12分钟观察到的所有其他峰(不包括缓冲液相关峰)相比的产物单体峰的面积百分比。当在流动相中没有10％异丙醇的情况下运行SEC-HPLC方法时，在单体峰上观察到被鉴定为色氨酸经氧化的单体的前肩(没有完全分辨出)。因此，取决于如何操作SEC-HPLC测定，它可以用于测量单体和聚集体，或估计色氨酸氧化。
实例2
白蛋白融合蛋白的纯化(500L规模)
用以下过程纯化重组人类白蛋白(rHSA)，该过程包括三个结合和洗脱层析柱、流通层析膜、曲通病毒灭活步骤和超滤/渗滤步骤。为了制备用于rHSA过程的起始材料，通过在蛋白质A层析运行期间收集未结合的材料将来自单克隆抗体(mAb)过程的细胞培养上清液耗尽抗体，并且然后将冻干rHSA粉溶解于无抗体的上清液中。这种起始材料包括将典型地存在于在CHO细胞培养物中表达的白蛋白融合蛋白的细胞培养上清液中的宿主细胞蛋白、DNA以及小分子杂质。
将示于图1中的rHSA纯化过程用于纯化约700mL的上清液。表4示出了来自1L规模纯化的性能参数。从该表可以看出，层析单元操作的步骤产率通常较高，Capto Blue(高取代)除外。图2示出了rHSA的汽巴蓝(高取代)染料亲和层析图。从该图可以看出，在加载期间以及在0.5M NaCl洗涤期间观察到大的吸光度峰。从这个单独的运行不知道低产率是由于过载柱(即该柱被rHSA饱和并且并不是所有的rHSA被从上清液中捕获)还是因为0.5M NaCl洗涤。在任一情况下，可能的是通过优化柱加载和洗涤步骤条件可以使产率损失最小化。
表4.rHSA纯化性能参数综述
aCV＝柱体积；MV＝膜体积。
b基于加载液中的HSA-HPLC产物浓度以及池中的A280吸光度浓度计算Capto Blue步骤产率。使用加载物和池两者的A280吸光度浓度计算所有其他步骤产率。
rHSA过程中间体的产品质量属性的综述示于表5中。从该表可以看出，HCP和DNA随着纯化过程被良好控制到低水平，其中在经完全纯化的材料中在<10ng/mg下测量HCP并且在1.7x10-4ng/mg下测量DNA。HCP经Capto Blue柱被减少2个对数，并且从CaptoQ和PPG-600M柱再被减少1个对数(或更多)。大于5个对数的DNA被CaptoQ柱去除，并且另外的1个对数(或更大)被Capto Blue和MustangQ步骤去除。另外，在纯化过程中，经多个步骤观察到聚集体去除。总体而言，该过程在纯化rHSA上非常成功并且可以被用作纯化白蛋白融合蛋白的起点。
表5.rHSA的产品质量综述
aLRV＝对数减少值。计算为Log10(ng的加载液中的杂质/ng的池中的杂质)
实例3
白蛋白融合蛋白的纯化(500L规模)
在CHO细胞中表达AFP-1(一种重组人血清白蛋白融合蛋白(HSA融合物或白蛋白融合物))并用以下过程纯化，该过程包括三个结合和洗脱层析柱、流通层析膜、曲通病毒灭活步骤、纳米过滤器以及两个中间超滤/渗滤步骤。
白蛋白融合物纯化过程示于图3中。将示于图3中的纯化过程按比例放大以纯化两个500L生物反应器。表6示出了来自两个500L生物反应器规模纯化的性能参数。从该表可以看出，层析单元操作的步骤产率和池体积在批次之间是一致的。第1批和第2批的总过程产率(包括UF/DF和纳滤)分别是48％和53％。过程中间体的产品质量属性的综述示于表7中。总性能(即过程产率)和产品质量(绝对水平和LRV)与用于纯化rHSA的纯化过程是非常可比的。这对于负责大部分HCP去除(Capto Blue(高取代)和Capto Q)和DNA清除(Capto Q和Mustang Q)的步骤尤其如此。
表6.AFP-1纯化性能参数综述。
aCV＝柱体积；MV＝膜体积。
b基于加载液中的HSA-HPLC产物浓度以及池中的A280吸光度浓度计算Capto Blue步骤产率。使用加载物和池两者的A280吸光度浓度计算所有其他步骤产率。
表7.AFP-1的产品质量综述。
aLRV＝对数减少值。计算为Log10(ng的加载液中的杂质/ng的池中的杂质)。b给出的值是多个产物收集袋的加权平均。
c给出的值是多个柱循环的加权平均。
汽巴蓝染料亲和层析，将Capto Blue(高取代)树脂用作AFP-1纯化过程的捕获柱。图4示出了AFP-1的在300cm/h下操作的汽巴蓝染料层析的代表性层析图。从图4可以看出，在加载期间看到大的流通峰，如通过在6个柱体积(CV)左右开始的大的OD信号所指示的。这个流通峰含有大部分的存在于条件培养基中的过程相关杂质，包括宿主细胞蛋白(HCP)和DNA。在加载之后，将柱再平衡并且然后用不同缓冲液洗涤；第一缓冲液含有pH 6.0的0.5MNaCl，随后再平衡并且然后用pH 7.0的10％丙二醇洗涤。洗涤物通过将这些杂质与汽巴蓝染料配体和/或白蛋白融合蛋白分离而降低HCP和DNA水平。然后将柱用含有辛酸钠和EDTA的缓冲液洗脱。从表7可以看出，在Capto Blue(高取代)层析之后，产物中间体具有与条件培养基相比更低的DNA(0.6-0.7个对数的清除率)和更低的HCP(2.7-2.9个对数的清除率)。此外，Capto Blue(高取代)产物具有高单体(≥98.0％)和低水平的经氧化的产物。
在通过汽巴蓝染料层析初始捕获之后，将产物用曲通X-100处理以灭活潜在的包膜病毒。在这个实例中，将Capto Blue(高取代)池用10％曲通X-100掺至0.5％曲通X-100(w/w)的终浓度并在室温下保持130分钟。在这些条件下，实现了有效的病毒灭活(关于细节，参见实例5)。
在曲通X-100处理之后，将白蛋白融合蛋白使用Capto Q柱以结合和洗脱模式通过阴离子交换层析纯化。图5示出了AFP-1的在300cm/h下操作的代表性Capto Q层析图。从图5可以看出，在加载期间看到大的流通峰，如通过在7个CV左右开始的大的OD信号所指示的。这个流通峰含有来自先前步骤的曲通X-100。在加载之后，将柱再平衡并且然后经10个CV(pH7.0)用线性NaCl梯度洗脱至0.4M NaCl。从表7可以看出，与Capto Blue(高取代)池相比，Capto Q中间体具有更低的HCP(1.3-1.5个对数的清除率)和低得多的DNA(6-6.7个对数的清除率)。还可以看出，Capto Q具有增加单体含量的能力(通过减少聚集的产物)并且还去除负责氧化AFP-1的杂质(关于细节，参见实例7)。
用50mM bis-tris、50mM NaCl(pH 7.0)渗滤Capto Q产物以备使用Mustang Q膜层析步骤的纯化。图6示出了在10MV/hr下操作的代表性Mustang Q膜层析图。在调节和平衡膜之后，将产物应用至膜并且收集在流通物中，而杂质结合至该膜。当用2M NaCl汽提时，观察到含有杂质和一些产物两者的大峰(汽提峰未被包括在图6的层析图中)。从表7可以看出，DNA被Mustang Q膜进一步减少(0.6-1个对数的清除率)。
最终层析步骤是使用Toyopearl PPG-600M的疏水相互作用柱。图7示出了AFP-1的在130cm/h下操作的代表性Toyopearl PPG-600M层析图。在含有1M柠檬酸盐的缓冲液中平衡之后，将产物加载到柱上。由于产物在纯化过程中通过这个阶段如此纯，没有观察到流通峰。在加载之后，将柱再平衡并且然后梯度洗脱至不含柠檬酸盐的缓冲液。将产物在锐峰中洗脱，该锐峰被收集在级分中，通过HIC-HPLC测定这些级分的经氧化的产物含量。将通过HIC-HPLC测得的含有少于15％经氧化的种类的所有级分聚池并接后纳滤。
使用蛋白质纯化领域的普通技术人员的标准技术进行使用Viresolve Vpro+的纳滤。纳滤的目标在于去除潜在的病毒颗粒。在纳滤之后，将产物浓缩，渗滤并且在10mM磷酸盐、250mM蔗糖、0.02％聚山梨醇酯80中配制。在完成纳滤(或配制)之后，针对在纯化过程期间引入产物中的另外的杂质对产物池进行测试。表8综述了过程相关杂质测试。如表8中所见，在早期过程步骤(蓝色染料层析和病毒灭活步骤)中引入过程中的缓冲液组分和汽巴蓝染料配体通过后续纯化步骤降至非常低的水平。
表8.过程相关杂质综述
实例4
汽巴蓝染料亲和层析
在结合能力和从澄清细胞培养液中去除杂质方面对Capto Blue(高取代)和Toyopearl AF-Blue HC-650M进行比较。表9综述了澄清细胞培养液中AFP-1的动态结合容量。对于Capto Blue(高取代)，动态结合容量显示出与pH直接相关，其中pH 5具有最高的结合容量(37.4g AFP-1/L树脂)并且pH 8具有最低的结合容量(12.3g/L)。虽然高结合能力是令人希望的，但是在pH 5下操作不太令人希望，这是由于在pH 6和以下分子的聚集率增加(数据未示出)。因此，pH 6被选择为平衡高结合能力和产物稳定性的最适pH。Capto Blue(高取代)和Toyopearl AF-Blue HC-650M的动态结合容量的比较揭示了在pH 6下CaptoBlue(高取代)的动态结合容量几乎加倍。
表9.在汽巴蓝染料树脂上动态结合容量的比较。
为了比较这两种树脂从澄清细胞培养液中清除杂质，在基线条件下操作每个柱，其中将柱加载至75％-80％的其动态结合容量(对于是Capto Blue(高取代)是17.5g/L并且对于Toyopearl AF-Blue HC-650M是10.0g/L)，并且使用25mM辛酸钠从柱中洗脱。表10示出了用于从澄清细胞培养液中捕获和纯化AFP-1的两种汽巴蓝染料树脂的比较。从表10可以看出，两种树脂的产率类似(对于用25mM辛酸盐洗脱而言)，其中典型的产率>90％。此外，两种树脂有效地降低来自澄清细胞培养液的HCP和DNA水平；然而，与Capto Blue(高取代)相比，Toyopearl AF-Blue HC-650M层析显示出稍好的HCP和DNA清除。
表10.使用汽巴蓝染料层析优化白蛋白融合物纯化。
a产率是基于加载液和池中的HSA-HPLC浓度测量值。
对于AFP-1，由于其较高的结合能力，将Capto Blue(高取代)树脂选择用于制造过程。为了优化用Capto Blue(高取代)进行的捕获步骤，考虑了若干因素，包括柱加载和洗涤以及洗脱缓冲液组成。从表10可以看出，柱加载对DNA没有影响，但是对HCP清除显示出轻微影响。在测试的极端柱加载下(10g/L或25g/L加载)，HCP清除比在中间加载(17.5g/L加载)下更有效。因此，有益的是在动态结合容量下或附近操作柱，以便增加吞吐量并且还增加HCP去除。
针对汽巴蓝染料层析捕获步骤对洗脱缓冲液组成进行优化。图8示出了用于汽巴蓝染料层析的洗脱缓冲液的比较。从图8和表10可以看出，与2M NaCl相比，对于从汽巴蓝染料柱下洗脱而言，辛酸盐是有效地多得多的选择。对于这个实例，基于60％产率和在层析图中所见的宽洗脱谱，2M NaCl给出从柱上的不完全的AFP-1洗脱。2M NaCl运行的产品质量显示与使用25mM辛酸盐的洗脱相比，HCP水平要高得多并且单体水平要低得多。此外，使用2MNaCl(单独地或与溶剂组合)从制造的角度来看不太令人希望，因为这些洗脱缓冲液昂贵并且该过程可能需要缓冲液更换步骤以协助在该过程中与下一层析柱结合。
在汽巴蓝染料捕获步骤的研发中，最终步骤是洗涤优化。熟知的是，白蛋白可以结合许多类型的分子，并且白蛋白融合蛋白也如此。因此，期望的是杂质(如HCP和DNA)可以与白蛋白融合蛋白相互作用并且与所希望的产物共纯化。利用白蛋白融合蛋白强烈地结合在汽巴蓝染料层析树脂上，在通过破坏杂质和汽巴蓝染料配体之间的或杂质与结合至配体的白蛋白融合蛋白之间的相互作用以改善杂质清除的尝试中测试了若干洗涤物。使用了不同类型的洗涤物，包括离子的、离液的、亲液的表面活性剂和温和溶剂。此外，在pH 6和pH 7下对每种洗涤物进行了测试以确定pH的影响(如果存在的话)。
表11综述了在汽巴蓝染料层析上测试的洗涤物。从表11可以看出，洗涤物的pH对于HCP去除而言是非常重要的。在pH 7下，与pH 6下的相同洗涤物相比，所有测试的洗涤物在减少HCP方面更有效，其中最有效的洗涤物将HCP降低两倍或更高。在测试的洗涤物中，pH7的0.5M NaCl在减少HCP方面是最有效的，与对照运行相比显示出大于七倍的HCP降低。与HCP清除不同，DNA清除不受pH 6与7之间的pH的影响。在所有测试的洗涤物中，与对照运行相比，仅有离子的洗涤物(NaCl和Na2SO4)显示出改善的DNA清除。在这些情况下，与对照运行相比，观察到DNA减少4-5倍。还应该指出的是，在含有10％丙二醇的运行的情况下观察到较高的单体水平；然而，在测试的许多洗涤物的情况下观察到单体水平的边际增加。在单体纯度中观察到pH没有影响。
基于表11的数据，在HCP和DNA清除方面0.5M NaCl是非常有效的洗涤物，并且对于增加单体纯度而言10％丙二醇是有效的洗涤物。这里应该指出的是，10％丙二醇洗涤物在降低Capto Blue池中产物的氧化可能性方面也是有效的(关于另外的细节，参见实例7)。产率最受0.5M NaCl洗涤物的负面影响，其中pH 6和7下的产率损失分别是5％和14％。有趣的是，在测试的其他洗涤物的情况下没有观察到产率损失。基于这些结果，将含有pH 6的0.5MNaCl的洗涤物和含有pH 7的10％丙二醇的洗涤物掺入实例3的制造过程中。
表9.汽巴蓝染料层析洗涤优化综述。
a产率是基于加载液和池中的HSA-HPLC浓度测量值。
实例5
曲通X-100病毒灭活
对于AFP-1(即一种具有5.4-5.5范围内的等电点的白蛋白融合分子)，低pH处理被确定为对该分子的产品质量是有害的(观察到聚集和沉淀)。因此，曲通X-100处理被选择用于病毒灭活。类似于低pH处理，添加曲通X-100将破坏病毒周围的包膜，使得它失活。与低pH处理不同，曲通X-100对AFP-1的产品质量没有可测量的影响。
使用异嗜性鼠白血病病毒(XMuLV)作为模型包膜病毒对用曲通X-100灭活病毒进行测试。简言之，将通过汽巴蓝染料层析纯化的材料用10％(w/w)曲通X-100掺至0.5％(w/w)曲通X-100的终浓度，孵育给定时间，并且然后使用本领域普通技术人员常用的板基方法测试感染性。在曲通X-100处理之前和之后，基于来自样品上运行的感染性测定的XMuLV滴度计算对数减少值(LRV)。
表12综述了针对XMuLV病毒灭活获得的LRV。从该表可以看出，用0.5％(w/w)曲通X-100处理是用于XMuLV灭活的有效方法。对于在曲通X-100处理之后立即测量的样品，针对重复实验获得了4.73和>5.15的LRV值。到120分钟孵育结束时，两项研究都显示出>5.15个对数的XMuLV灭活。这些LRV与针对单克隆抗体的通过低pH处理获得的值在相同的范围内。
表10.白蛋白融合蛋白的曲通X-100处理的XMuLV LRV综述
在曲通X-100处理之后，将产物通过阴离子交换层析纯化(关于纯化过程，参见图3)。在阴离子交换层析期间，白蛋白融合物强烈结合至固定相，同时一些杂质流过柱。曲通X-100不被阴离子交换柱保留并且由于其在280nm下的吸光度可以在阴离子交换柱的流通物中看到。图5示出了代表性阴离子交换层析图，其中在柱加载期间具有强的280nm吸光度信号。可以在疏水相互作用层析期间实现另外的曲通X-100清除；然而，预期曲通X-100可与疏水柱连同产物结合。因此，从产物中去除曲通X-100不太强劲并且依赖于在曲通X-100与白蛋白融合蛋白之间的选择性。在通过示于图3中的过程纯化之后，测量到曲通X-100水平低于0.1μg/mL(参见表5)。
实例6
阴离子交换膜层析
以流通模式操作的阴离子交换(AEX)膜可以提供优异的宿主细胞杂质如宿主细胞蛋白(HCP)、DNA和病毒的去除。对于pI典型地在7.5至9.5范围的单克隆抗体(mAb)，当在中性pH附近操作流通AEX膜时产物结合受到最低关注，并且产率通常>95％(不管盐浓度或导电率)。因为操作pH接近mAb的pI，结合可以出现并且产率可能丢失。对于mAb，在高pH和低盐(或导电率)条件下实现宿主细胞杂质清除。因此，对于典型的mAb，对操作条件进行优化，这样使得导电率被最小化并且pH尽可能地高同时保持低于pI。
对于具有低pI的白蛋白融合蛋白，流通AEX膜层析步骤的研发和优化更复杂并且无法先验预测。与典型的mAb不同，在中性附近的所有pH值下靶分子与AEX膜可能都有一些结合，并且在更低的pH(由于更低的蛋白质电荷)和更高的盐浓度(这将掩蔽白蛋白融合蛋白与层析配体之间的相互作用)下预期更少的结合。因此，在更低的pH和更高的盐浓度下将预期更高的产率。另一方面，预期相对于盐和pH的杂质清除趋势可反映在mAb情况下观察到的趋势，其中较高的pH和较低的盐浓度导致较大的杂质清除率。因此，必须在高产率(低pH和高盐)与高纯度(高pH和低盐)之间达到平衡，并且必须针对给定产物对pH、盐浓度和膜加载进行优化。
为了针对AFP-1优化AEX膜层析步骤，在多变量实验设计(DoE)中研究了pH(pH 6.0至8.0)、NaCl浓度(10-220mM)和膜加载量(0.5-2.5g/mL的膜)。对于这项研究，使用筛选设计，在该筛选设计中对设计空间的角落进行了测试，并且沿着边缘对两个中心点条件和两个附加点进行了测试，以便确定对步骤产率和杂质清除率的影响。表13综述了针对AFP-1的AEX膜优化实验。从表13可以看出，产率受全部三个因素的影响，并且通常遵循在低pH、低盐和较高加载下获得的较高产率的情况下预期的趋势。另一方面，DNA清除率不遵循在较高pH和较低盐下预期的较好清除的趋势。相反，在10mM NaCl下，在pH 8下，观察到DNA清除最差。有趣的是，该效果不是由单一因素引起的。例如，当与强结合条件(pH 8.0，10mM NaCl)相比时，在弱(pH 6，220mM NaCl)和中间(pH 6，10mM NaCl或pH 8，110mM NaCl)结合条件下观察到增加的杂质清除。仅在测试的最强结合条件下，杂质清除受到负面影响。这种结果的一个解释可能是白蛋白融合蛋白与杂质之间的竞争性结合。在强结合条件下，白蛋白融合蛋白可能会争夺结合位点，这将导致DNA的结合容量更低并且产物的产率更低。还应该指出的是，对于测试的所有条件，没有观察到HCP清除，并且聚集体水平保持相对不变。
在完成针对Mustang Q步骤的以上优化研究之前，预期需要在产率与杂质清除率之间达到平衡。但是实际上，在该研究中观察到相反的情况。图9示出了随pH和NaCl浓度变化的步骤产率和DNA对数减少值(LRV)。从该图可以看出，在低pH和较高NaCl浓度下产率和DNA清除率都显示是最适的(由红色等高线示出)。这对于DNA而言是出乎意外的发现，并且在病毒清除率情况下可以观察到类似的效果。
表11.针对Mustang Q膜层析的过程和分析数据综述。
实例7
使用疏水相互作用层析控制氧化变体
在这项工作中使用的蛋白质是含有两个被连接至重组人血清白蛋白的Tn3支架的白蛋白融合蛋白。每个Tn3支架含有能够与CD40L配体结合的活性位点。该白蛋白融合蛋白含有八个甲硫氨酸残基(六个在该分子的白蛋白部分上，并且每个Tn3支架上一个)和七个色氨酸残基(五个在该分子的白蛋白部分上，并且每个Tn3支架上一个)。接近表面积的甲硫氨酸和色氨酸残基在细胞培养和/或纯化过程期间可以被氧化。图10示出了通过肽作图质谱法确定的随氧化变化的相对效力。如可以看出的，该分子的白蛋白(M498和M529)或Tn3(M74和M17)部分上的甲硫氨酸氧化不会促成效力损失。另一方面，出现在该分子的活性位点(在BC环上)附近的Tn3支架上的色氨酸氧化(W46和W151)导致该分子的效力损失。因此，必须在整个制造过程中良好地控制色氨酸氧化。
为了在AFP-1的研发和制造期间监测色氨酸氧化，在研发的不同阶段利用肽作图质谱法、SEC-HPLC和HIC-HPLC。虽然质谱法可以用于相当精确地确定甲硫氨酸水平和色氨酸水平，但是它是低通量的并且涉及更多的时间和资源，所以它典型地用于表征重要的样品。另一方面，更快的HPLC方法可以用于过程中测试；然而，两种HPLC测定都有缺点。例如，SEC-HPLC可以测量色氨酸氧化，但是仅是估计值，因为色氨酸肩不能与天然分子完全分辨开，同时HIC-HPLC可以准确地测量氧化水平，但是无法区分甲硫氨酸与色氨酸氧化。在研发和制造期间应用所有三种方法，以便更好地了解AFP-1氧化。为了改善AFP-氧化量化的特异性，将RP-HPLC方法研发成聚焦于检测含有TN3色氨酸(W46和W151)氧化的肽。该方法可以用于AFP-1的未来过程中测试和质量控制。
成功的氧化控制策略包括氧化抑制以及在制造过程期间形成的经氧化的种类的去除两者。图11示出了针对Capto Blue和Capto Q池的随时间变化的色氨酸氧化。对于这些运行，池标称上是pH 7至pH 8，这是纯化过程的典型操作pH。从图11可以看出，Capto Blue池中的色氨酸氧化(通过SEC-HPLC测量的)随生物反应器变化并且当应用10％丙二醇洗涤物时是减少的并且当在较低温度下储存池时也是减少的。此外，向Capto Blue池中添加10mM EDTA也显示出色氨酸氧化(数据未示出)。从图9可以看出，Capto Q池中的色氨酸氧化似乎是可忽略的，并且Capto Q池即使在室温下也相当稳定。
为了进一步研究AFP-1色氨酸氧化的根本原因，进行实验以揭示Cibcron Blue染料的存在和/或高盐浓度不会造成氧化。观察到AFP-1色氨酸氧化需要在早期过程样品(条件培养基或Capto Blue池)中发现的组分的独特组合和曝光。色氨酸氧化的一种潜在来源是酶，如色氨酸2,3-双加氧酶(TDO2)或色氨酸羟化酶(TPH)，这两种酶都可以特异性地氧化色氨酸。应该指出的是，已经使用抗TDO2蛋白质印迹在CM中明确地鉴定出TDO2(参见图12)并且其可以引起AFP-1的色氨酸氧化。
一旦氧化发生在早期过程步骤期间，可能在下游过程中稍后需要控制经氧化的变体的水平。对于AFP-1，利用疏水相互作用层析步骤去除过量的氧化，包括色氨酸氧化。图13示出了AFP-1的代表性HIC层析图。从该图可以看出，针对AFP-1的纯化研究了多种HIC树脂和多模式(阳离子交换/HIC)树脂。对于所有测试的树脂，将AFP-1在梯度中心附近洗脱，并且其适于去除色氨酸氧化。当在AFP-1的梯度洗脱中应用HIC时，经氧化的产物(包括甲硫氨酸和色氨酸氧化)比天然产物洗脱地早并且集中在峰的前部。在制备型规模条件下，经氧化的种类集中在峰的前部；然而，分辨率不足以看到经氧化的产物特征峰。
在研发期间，将Butyl-S Fast Flow(Butyl-S)和Toyopearl PPG-600M(PPG-600M)按比例放大并且以线性梯度模式操作，以查看是否每个柱都可以用于去除经氧化的产物。在每种情况下，将洗脱池以0.5柱体积级分进行分级直到最高峰值，并且然后将剩余的产物峰收集在单一的最终级分中。在两种运行中，针对经氧化的内容物(通过HIC-HPLC)和效力对级分进行测试。图14示出了针对在Butyl-S或PPG-600M层析运行期间取的级分相对效力与HIC-HPLC早期种类含量。在两种情况下，早期洗脱级分(从该图的右侧开始)含有更多的经氧化的产物(如通过HIC-HPLC测量的)并且具有比后来的洗脱级分(该图的左侧)更低的效力。在这些条件下，制备型HIC可以用于控制氧化水平，并且因此控制产物的效力。
结论
以上描述概述了使用可以适于临床或商业制造的可扩大技术纯化重组人白蛋白(rHSA)和白蛋白融合蛋白的各种方法。对该过程的初始步骤进行优化以减少宿主相关杂质，如HCP、DNA和病毒。汽巴蓝染料层析捕获步骤包括用以减少HCP的侵蚀性洗涤并且利用用辛酸盐进行的选择性洗脱。显示曲通X-100病毒灭活是一种用于灭活包膜病毒而不影响产品质量的强劲方法。对AEX柱和膜层析步骤进行优化，以将DNA降至非常低的水平。有趣的是，显示膜层析步骤在低pH和高盐下是最适的，这在此项工作之前是未预期到的。最后，该纯化过程被设计成控制经氧化的变体的水平，其显示是不太有效力的。控制策略包括在Cibacron blue层析步骤期间的丙二醇洗涤物以及向洗脱缓冲液中添加EDTA以在帮助限制色氨酸氧化。另外，疏水相互作用层析被用作去除经氧化的产物的有效选择。将该纯化过程按比例放大以纯化500L生物反应器并且显示就批次之间的产率和产品质量而言是一致的。
上文所示的实例说明了本发明的各个方面和本发明方法的实践。这些实例不旨在提供本发明的许多不同实施例的详尽描述。因此，尽管出于清晰理解的目的已经借助于说明和实例相当详细地描述了本发明，但本领域的普通技术人员应容易地意识到可以在不偏离所附权利要求的精神或范围的情况下进行许多变化和修改。
在本说明书提到的所有公开、专利和专利申请均通过引用并入本文，引用程度就如同每个单独公开、专利或专利申请特定地并且单独地指示通过引用并入本文一般。
<110> 米迪缪尼公司（MedImmune LLC）
<120> 纯化白蛋白融合蛋白的方法
<130> CD40L-300P1
<160> 210
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 261
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu
20 25 30
Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg
35 40 45
Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val
50 55 60
Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser
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Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys
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Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly
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Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln
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165 170 175
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225 230 235 240
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260
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<213> 智人
<400> 2
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1 5 10 15
Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly
20 25 30
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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1 5 10 15
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20 25 30
Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Trp Trp His Ser Ala
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50 55 60
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50 55 60
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<223> 合成构建体
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Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp Leu
1 5 10 15
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20 25 30
Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Trp Tyr His Gln Ala
35 40 45
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50 55 60
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1 5 10 15
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20 25 30
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Ala Trp Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr Glu Val
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Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Thr Leu Gly His His His His His His
85 90 95
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<213> 人工序列
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<223> 合成构建体
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1 5 10 15
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20 25 30
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<211> 98
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 33
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1 5 10 15
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Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Thr Leu Gly His His His His His His
85 90 95
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 34
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1 5 10 15
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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<220>
<223> 合成构建体
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Ala Trp Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr Glu Val
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<223> 合成构建体
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Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp Ser
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Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Thr Leu Gly His His His His His His
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His His
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Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp Ser
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Asp Asp Ile Gly Leu Tyr Val Trp Cys Glu Leu Thr Tyr Gly Ile Lys
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Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Trp Phe His Gln Ala
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His His
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Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Trp Trp His Ser Ala
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Trp Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr Glu Val Ser
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Leu Ile Cys Arg Arg Gly Asp Met Ser Ser Asn Pro Ala Lys Glu Thr
65 70 75 80
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<220>
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<220>
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<220>
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Gly Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Ser Ser
35 40 45
Pro Tyr Val His Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr
50 55 60
Glu Val Ser Leu Ile Cys Leu Thr Thr Asp Gly Thr Tyr Ser Asn Pro
65 70 75 80
Ala Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Thr Leu Gly His His His
85 90 95
His His His His His
100
<210> 76
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 76
Ile Glu Val Glu Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp Thr
1 5 10 15
Asn Arg Ser Ser Tyr Ser Asp Leu Pro Gly Cys Glu Leu Thr Tyr Gly
20 25 30
Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Ser Ser Pro
35 40 45
Tyr Val His Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr Glu
50 55 60
Val Ser Leu Ile Cys Leu Thr Thr Asp Gly Thr Tyr Ser Asn Pro Ala
65 70 75 80
Lys Glu Thr Phe Thr Thr
85
<210> 77
<211> 101
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 77
Ala Ile Glu Val Glu Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp
1 5 10 15
Thr His Arg Ser Ala Tyr Ser Asn His Ser Phe Cys Glu Leu Thr Tyr
20 25 30
Gly Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Asn Thr
35 40 45
Pro Tyr Val His Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr
50 55 60
Glu Val Ser Leu Ile Cys Leu Thr Thr Asp Gly Thr Tyr Ser Asn Pro
65 70 75 80
Ala Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Thr Leu Gly His His His
85 90 95
His His His His His
100
<210> 78
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 78
Ile Glu Val Glu Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp Thr
1 5 10 15
His Arg Ser Ala Tyr Ser Asn His Ser Phe Cys Glu Leu Thr Tyr Gly
20 25 30
Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Asn Thr Pro
35 40 45
Tyr Val His Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr Glu
50 55 60
Val Ser Leu Ile Cys Leu Thr Thr Asp Gly Thr Tyr Ser Asn Pro Ala
65 70 75 80
Lys Glu Thr Phe Thr Thr
85
<210> 79
<211> 101
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 79
Ala Ile Glu Val Glu Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp
1 5 10 15
Thr Asn Arg Ser Leu Tyr Ala Asn Phe His Gly Cys Glu Leu Thr Tyr
20 25 30
Gly Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Glu Gln
35 40 45
Val Tyr Val His Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr
50 55 60
Glu Val Ser Leu Ile Cys Leu Thr Thr Asp Gly Thr Tyr Ser Asn Pro
65 70 75 80
Ala Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Thr Leu Gly His His His
85 90 95
His His His His His
100
<210> 80
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 80
Ile Glu Val Glu Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp Thr
1 5 10 15
Asn Arg Ser Leu Tyr Ala Asn Phe His Gly Cys Glu Leu Thr Tyr Gly
20 25 30
Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Glu Gln Val
35 40 45
Tyr Val His Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr Glu
50 55 60
Val Ser Leu Ile Cys Leu Thr Thr Asp Gly Thr Tyr Ser Asn Pro Ala
65 70 75 80
Lys Glu Thr Phe Thr Thr
85
<210> 81
<211> 101
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 81
Ala Ile Glu Val Glu Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp
1 5 10 15
Thr Asn Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Leu Pro Gly Cys Glu Leu Thr Tyr
20 25 30
Gly Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Asn Gln
35 40 45
Val Tyr Val His Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr
50 55 60
Glu Val Ser Leu Ile Cys Leu Thr Thr Asp Gly Thr Tyr Ser Asn Pro
65 70 75 80
Ala Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Thr Leu Gly His His His
85 90 95
His His His His His
100
<210> 82
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 82
Ile Glu Val Glu Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp Thr
1 5 10 15
Asn Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Leu Pro Gly Cys Glu Leu Thr Tyr Gly
20 25 30
Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Asn Gln Val
35 40 45
Tyr Val His Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr Glu
50 55 60
Val Ser Leu Ile Cys Leu Thr Thr Asp Gly Thr Tyr Ser Asn Pro Ala
65 70 75 80
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<220>
<223> 合成构建体
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 84
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1 5
<210> 85
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 85
Ser Asp Asp Phe Ala Asp Tyr Val Trp
1 5
<210> 86
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 86
Ser Asp Asp Phe Gly Glu Tyr Val Trp
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 87
Leu Asp Asp Trp Gly Ser Tyr His Val
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 88
Ser Asp Glu Val Gly Asp Tyr Val Val
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 89
Ser Asp Asp Phe Ala Glu Tyr Val Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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Ser Asp Asp Phe Glu Glu Tyr Val Val
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 92
Ser Asp Asp Ile Gly Leu Tyr Val Trp
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 93
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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Trp Trp His Ser Ala Trp
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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Trp Tyr His Met Ala Trp
1 5
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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Trp Tyr His His Ala His
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成构建体
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Trp Phe His Gln Ala Trp
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 99
Tyr Thr Asp Gln Glu Ala Gly Asn Pro Ala
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 100
Thr Asn Arg Ser Ser Tyr Tyr Asn Leu His Gly
1 5 10
<210> 101
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 101
Ile Asn Arg Ser Tyr Tyr Ala Asp Leu His Gly
1 5 10
<210> 102
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 102
Thr Asn Arg Ser Ser Tyr Ser His Leu Asp Gly
1 5 10
<210> 103
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 103
Ile Asn Arg Ser Ser Tyr His Asn Phe Pro His
1 5 10
<210> 104
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 104
Thr Asn Arg Ser Ser Tyr Ser Asn His Leu Gly
1 5 10
<210> 105
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 105
Thr Asn Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Phe His Gly
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 106
Thr Asn Arg Ser Phe Tyr Ser Asn Leu His Gly
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 107
Thr Asn Arg Ser Ser Tyr Ala Tyr Leu His Gly
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 108
Ile Asn Arg Ser Ser Tyr Ala Asn Leu His Gly
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 109
Thr Asn Arg Ser Ser Tyr Ala Asn Tyr His Gly
1 5 10
<210> 110
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 110
Thr Asn Arg Ser Ser Tyr Ala Asn Leu Pro Gly
1 5 10
<210> 111
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 111
Thr Asn Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Leu His Gly
1 5 10
<210> 112
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 112
Thr Ala Arg Ser Ala Tyr Ser His His His Tyr
1 5 10
<210> 113
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 113
Thr Asn Arg Ser Ser Tyr Ala Asn Tyr His His
1 5 10
<210> 114
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 114
Thr Asn Arg Ser Ser Tyr Ser Asp Leu Pro Gly
1 5 10
<210> 115
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 115
Thr His Arg Ser Ala Tyr Ser Asn His Ser Phe
1 5 10
<210> 116
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 116
Thr Asn Arg Ser Leu Tyr Ala Asn Phe His Gly
1 5 10
<210> 117
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 117
Thr Asn Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Leu Pro Gly
1 5 10
<210> 118
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 118
Ser Ser Pro Tyr Val His
1 5
<210> 119
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 119
Asp Gln Ile Tyr Val His
1 5
<210> 120
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 120
Ser Ala Ala Ile Tyr Val His
1 5
<210> 121
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 121
Asn Ser Pro Tyr Val His
1 5
<210> 122
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 122
Asn Asn Ile Tyr Val His
1 5
<210> 123
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 123
Asn Gln Pro Tyr Val His
1 5
<210> 124
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 124
Arg Gln Pro Tyr Val His
1 5
<210> 125
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 125
Glu Leu Tyr Val His
1 5
<210> 126
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 126
Asn Thr Pro Tyr Val His
1 5
<210> 127
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 127
Glu Gln Val Tyr Val His
1 5
<210> 128
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 128
Asn Gln Val Tyr Val His
1 5
<210> 129
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 129
Leu Thr Thr Asp Gly Thr Tyr Ser Asn Pro Ala
1 5 10
<210> 130
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 130
Leu Thr Thr Asp Gly Thr Tyr Asn Asn Pro Ala
1 5 10
<210> 131
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 131
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 132
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 132
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 133
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 133
Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu
1 5 10 15
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln
20 25 30
Gln Ser Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu
35 40 45
Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys
50 55 60
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu
65 70 75 80
Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro
85 90 95
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu
100 105 110
Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His
115 120 125
Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg
130 135 140
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala
165 170 175
Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser
180 185 190
Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu
195 200 205
Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro
210 215 220
Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys
225 230 235 240
Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
245 250 255
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser
260 265 270
Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His
275 280 285
Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser
290 295 300
Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala
305 310 315 320
Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg
325 330 335
Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr
340 345 350
Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu
355 360 365
Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro
370 375 380
Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu
385 390 395 400
Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro
405 410 415
Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys
420 425 430
Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys
435 440 445
Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His
450 455 460
Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser
465 470 475 480
Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp
500 505 510
Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala
515 520 525
Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu
530 535 540
Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys
545 550 555 560
Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val
565 570 575
Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
580 585
<210> 134
<211> 680
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 134
Ser Gln Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr
1 5 10 15
Trp Ser Asp Asp Phe Gly Glu Tyr Val Trp Cys Glu Leu Thr Tyr Gly
20 25 30
Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Trp Tyr His
35 40 45
His Ala His Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr Glu
50 55 60
Val Ser Leu Ile Cys Arg Ser Gly Asp Met Ser Ser Asn Pro Ala Lys
65 70 75 80
Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
85 90 95
Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu
100 105 110
Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln
115 120 125
Ser Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe
130 135 140
Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser
145 150 155 160
Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg
165 170 175
Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu
180 185 190
Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro
195 200 205
Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp
210 215 220
Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg
225 230 235 240
His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr
245 250 255
Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys
260 265 270
Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser
275 280 285
Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg
290 295 300
Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys
305 310 315 320
Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val
325 330 335
His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg
340 345 350
Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser
355 360 365
Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys
370 375 380
Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu
385 390 395 400
Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu
405 410 415
Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg
420 425 430
His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr
435 440 445
Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys
450 455 460
Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln
465 470 475 480
Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr
485 490 495
Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln
500 505 510
Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val
515 520 525
Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala
530 535 540
Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu
545 550 555 560
Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu
565 570 575
Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr
580 585 590
Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile
595 600 605
Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu
610 615 620
Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys
625 630 635 640
Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala
645 650 655
Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala
660 665 670
Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
675 680
<210> 135
<211> 785
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 135
Ser Gln Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr
1 5 10 15
Trp Ser Asp Asp Phe Gly Glu Tyr Val Trp Cys Glu Leu Thr Tyr Gly
20 25 30
Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Trp Tyr His
35 40 45
His Ala His Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr Glu
50 55 60
Val Ser Leu Ile Cys Arg Ser Gly Asp Met Ser Ser Asn Pro Ala Lys
65 70 75 80
Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Ser Arg Leu Asp Ala Pro Ser Gln Ile Glu Val Lys Asp
100 105 110
Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp Ser Asp Asp Phe Gly Glu
115 120 125
Tyr Val Trp Cys Glu Leu Thr Tyr Gly Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp
130 135 140
Arg Thr Thr Ile Asp Leu Trp Tyr His His Ala His Tyr Ser Ile Gly
145 150 155 160
Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Arg Ser
165 170 175
Gly Asp Met Ser Ser Asn Pro Ala Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly
180 185 190
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala
195 200 205
His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu
210 215 220
Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Ser Pro Phe Glu Asp His Val
225 230 235 240
Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp
245 250 255
Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp
260 265 270
Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala
275 280 285
Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln
290 295 300
His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val
305 310 315 320
Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys
325 330 335
Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro
340 345 350
Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys
355 360 365
Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu
370 375 380
Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys
385 390 395 400
Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val
405 410 415
Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser
420 425 430
Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly
435 440 445
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile
450 455 460
Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu
465 470 475 480
Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp
485 490 495
Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser
500 505 510
Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly
515 520 525
Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val
530 535 540
Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys
545 550 555 560
Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu
565 570 575
Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys
580 585 590
Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu
595 600 605
Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val
610 615 620
Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His
625 630 635 640
Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val
645 650 655
Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg
660 665 670
Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe
675 680 685
Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala
690 695 700
Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu
705 710 715 720
Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys
725 730 735
Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala
740 745 750
Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe
755 760 765
Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly
770 775 780
Leu
785
<210> 136
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 136
Glu Asp Val Thr Asp Thr Thr
1 5
<210> 137
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 137
Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Lys
1 5
<210> 138
<211> 585
<212> PRT
<213> 智人
<400> 138
Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu
1 5 10 15
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln
20 25 30
Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu
35 40 45
Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys
50 55 60
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu
65 70 75 80
Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro
85 90 95
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu
100 105 110
Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His
115 120 125
Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg
130 135 140
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala
165 170 175
Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser
180 185 190
Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu
195 200 205
Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro
210 215 220
Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys
225 230 235 240
Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
245 250 255
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser
260 265 270
Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His
275 280 285
Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser
290 295 300
Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala
305 310 315 320
Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg
325 330 335
Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr
340 345 350
Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu
355 360 365
Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro
370 375 380
Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu
385 390 395 400
Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro
405 410 415
Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys
420 425 430
Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys
435 440 445
Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His
450 455 460
Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser
465 470 475 480
Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp
500 505 510
Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala
515 520 525
Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu
530 535 540
Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys
545 550 555 560
Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val
565 570 575
Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
580 585
<210> 139
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 139
Arg Ser Gly Asp Met Ser Ser Asn Pro Ala
1 5 10
<210> 140
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是Ala、Gly、Leu、Ile和Val中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (10)..(10)
<223> Xaa是Ala、Gly、Leu、Ile和Val中的任何项
<400> 140
Gly Gly Gly Gly Xaa Gly Gly Gly Gly Xaa
1 5 10
<210> 141
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是Ala、Gly、Leu、Ile和Val中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (10)..(10)
<223> Xaa是Ala、Gly、Leu、Ile和Val中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (15)..(15)
<223> Xaa是Ala、Gly、Leu、Ile和Val中的任何项
<400> 141
Gly Gly Gly Gly Xaa Gly Gly Gly Gly Xaa Gly Gly Gly Gly Xaa
1 5 10 15
<210> 142
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 142
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 143
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 143
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
<210> 144
<211> 680
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 144
Ser Gln Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr
1 5 10 15
Trp Ser Asp Asp Phe Gly Glu Tyr Val Trp Cys Glu Leu Thr Tyr Gly
20 25 30
Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Trp Tyr His
35 40 45
His Ala His Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr Glu
50 55 60
Val Ser Leu Ile Cys Arg Ser Gly Asp Met Ser Ser Asn Pro Ala Lys
65 70 75 80
Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asp
85 90 95
Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu
100 105 110
Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln
115 120 125
Ser Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe
130 135 140
Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser
145 150 155 160
Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg
165 170 175
Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu
180 185 190
Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro
195 200 205
Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp
210 215 220
Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg
225 230 235 240
His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr
245 250 255
Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys
260 265 270
Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser
275 280 285
Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg
290 295 300
Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys
305 310 315 320
Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val
325 330 335
His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg
340 345 350
Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser
355 360 365
Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys
370 375 380
Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu
385 390 395 400
Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu
405 410 415
Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg
420 425 430
His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr
435 440 445
Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys
450 455 460
Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln
465 470 475 480
Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr
485 490 495
Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln
500 505 510
Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val
515 520 525
Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala
530 535 540
Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu
545 550 555 560
Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu
565 570 575
Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr
580 585 590
Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile
595 600 605
Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu
610 615 620
Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys
625 630 635 640
Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala
645 650 655
Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala
660 665 670
Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
675 680
<210> 145
<211> 785
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 145
Ser Gln Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr
1 5 10 15
Trp Ser Asp Asp Phe Gly Glu Tyr Val Trp Cys Glu Leu Thr Tyr Gly
20 25 30
Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Trp Tyr His
35 40 45
His Ala His Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr Glu
50 55 60
Val Ser Leu Ile Cys Arg Ser Gly Asp Met Ser Ser Asn Pro Ala Lys
65 70 75 80
Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Gly Arg Leu Asp Ala Pro Ser Gln Ile Glu Val Lys Asp
100 105 110
Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp Ser Asp Asp Phe Gly Glu
115 120 125
Tyr Val Trp Cys Glu Leu Thr Tyr Gly Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp
130 135 140
Arg Thr Thr Ile Asp Leu Trp Tyr His His Ala His Tyr Ser Ile Gly
145 150 155 160
Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Arg Ser
165 170 175
Gly Asp Met Ser Ser Asn Pro Ala Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly
180 185 190
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala
195 200 205
His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu
210 215 220
Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Ser Pro Phe Glu Asp His Val
225 230 235 240
Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp
245 250 255
Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp
260 265 270
Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala
275 280 285
Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln
290 295 300
His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val
305 310 315 320
Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys
325 330 335
Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro
340 345 350
Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys
355 360 365
Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu
370 375 380
Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys
385 390 395 400
Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val
405 410 415
Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser
420 425 430
Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly
435 440 445
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile
450 455 460
Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu
465 470 475 480
Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp
485 490 495
Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser
500 505 510
Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly
515 520 525
Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val
530 535 540
Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys
545 550 555 560
Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu
565 570 575
Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys
580 585 590
Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu
595 600 605
Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val
610 615 620
Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His
625 630 635 640
Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val
645 650 655
Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg
660 665 670
Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe
675 680 685
Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala
690 695 700
Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu
705 710 715 720
Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys
725 730 735
Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala
740 745 750
Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe
755 760 765
Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly
770 775 780
Leu
785
<210> 146
<211> 83
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 146
Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp Ser
1 5 10 15
Asp Asp Phe Gly Glu Tyr Val Trp Cys Glu Leu Thr Tyr Gly Ile Lys
20 25 30
Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Trp Tyr His His Ala
35 40 45
His Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr Glu Val Ser
50 55 60
Leu Ile Cys Arg Ser Gly Asp Met Ser Ser Asn Pro Ala Lys Glu Thr
65 70 75 80
Phe Thr Thr
<210> 147
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是Ser、Ala、Gly、Leu、Ile和Val中的任何项
<400> 147
Gly Gly Gly Gly Xaa
1 5
<210> 148
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 148
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 149
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 149
Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 150
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 150
Gly Gly Gly Gly Ala
1 5
<210> 151
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 151
His His His His His His His His
1 5
<210> 152
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 152
Gly Gly Gly Gly Ser His His His His His His His His
1 5 10
<210> 153
<211> 584
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 153
Glu Ala His Lys Ser Glu Ile Ala His Arg Tyr Asn Asp Leu Gly Glu
1 5 10 15
Gln His Phe Lys Gly Leu Val Leu Ile Ala Phe Ser Gln Tyr Leu Gln
20 25 30
Lys Cys Ser Tyr Asp Glu His Ala Lys Leu Val Gln Glu Val Thr Asp
35 40 45
Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Ala Asn Cys Asp Lys
50 55 60
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Ala Ile Pro Asn Leu
65 70 75 80
Arg Glu Asn Tyr Gly Glu Leu Ala Asp Cys Cys Thr Lys Gln Glu Pro
85 90 95
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Ser Leu
100 105 110
Pro Pro Phe Glu Arg Pro Glu Ala Glu Ala Met Cys Thr Ser Phe Lys
115 120 125
Glu Asn Pro Thr Thr Phe Met Gly His Tyr Leu His Glu Val Ala Arg
130 135 140
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Tyr Tyr Ala Glu Gln
145 150 155 160
Tyr Asn Glu Ile Leu Thr Gln Cys Cys Ala Glu Ala Asp Lys Glu Ser
165 170 175
Cys Leu Thr Pro Lys Leu Asp Gly Val Lys Glu Lys Ala Leu Val Ser
180 185 190
Ser Val Arg Gln Arg Met Lys Cys Ser Ser Met Gln Lys Phe Gly Glu
195 200 205
Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Thr Phe Pro
210 215 220
Asn Ala Asp Phe Ala Glu Ile Thr Lys Leu Ala Thr Asp Leu Thr Lys
225 230 235 240
Val Asn Lys Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
245 250 255
Arg Ala Glu Leu Ala Lys Tyr Met Cys Glu Asn Gln Ala Thr Ile Ser
260 265 270
Ser Lys Leu Gln Thr Cys Cys Asp Lys Pro Leu Leu Lys Lys Ala His
275 280 285
Cys Leu Ser Glu Val Glu His Asp Thr Met Pro Ala Asp Leu Pro Ala
290 295 300
Ile Ala Ala Asp Phe Val Glu Asp Gln Glu Val Cys Lys Asn Tyr Ala
305 310 315 320
Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Thr Phe Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg
325 330 335
Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Ser Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Lys
340 345 350
Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Glu Ala Asn Pro Pro Ala
355 360 365
Cys Tyr Gly Thr Val Leu Ala Glu Phe Gln Pro Leu Val Glu Glu Pro
370 375 380
Lys Asn Leu Val Lys Thr Asn Cys Asp Leu Tyr Glu Lys Leu Gly Glu
385 390 395 400
Tyr Gly Phe Gln Asn Ala Ile Leu Val Arg Tyr Thr Gln Lys Ala Pro
405 410 415
Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Ala Ala Arg Asn Leu Gly Arg
420 425 430
Val Gly Thr Lys Cys Cys Thr Leu Pro Glu Asp Gln Arg Leu Pro Cys
435 440 445
Val Glu Asp Tyr Leu Ser Ala Ile Leu Asn Arg Val Cys Leu Leu His
450 455 460
Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu His Val Thr Lys Cys Cys Ser Gly Ser
465 470 475 480
Leu Val Glu Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Thr Val Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Lys Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ser Asp
500 505 510
Ile Cys Thr Leu Pro Glu Lys Glu Lys Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala
515 520 525
Leu Ala Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Ala Glu Gln Leu
530 535 540
Lys Thr Val Met Asp Asp Phe Ala Gln Phe Leu Asp Thr Cys Cys Lys
545 550 555 560
Ala Ala Asp Lys Asp Thr Cys Phe Ser Thr Glu Gly Pro Asn Leu Val
565 570 575
Thr Arg Cys Lys Asp Ala Leu Ala
580
<210> 154
<211> 584
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 154
Glu Ala His Lys Ser Glu Ile Ala His Arg Tyr Asn Asp Leu Gly Glu
1 5 10 15
Gln His Phe Lys Gly Leu Val Leu Ile Ala Phe Ser Gln Tyr Leu Gln
20 25 30
Lys Ser Ser Tyr Asp Glu His Ala Lys Leu Val Gln Glu Val Thr Asp
35 40 45
Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Ala Asn Cys Asp Lys
50 55 60
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Ala Ile Pro Asn Leu
65 70 75 80
Arg Glu Asn Tyr Gly Glu Leu Ala Asp Cys Cys Thr Lys Gln Glu Pro
85 90 95
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Ser Leu
100 105 110
Pro Pro Phe Glu Arg Pro Glu Ala Glu Ala Met Cys Thr Ser Phe Lys
115 120 125
Glu Asn Pro Thr Thr Phe Met Gly His Tyr Leu His Glu Val Ala Arg
130 135 140
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Tyr Tyr Ala Glu Gln
145 150 155 160
Tyr Asn Glu Ile Leu Thr Gln Cys Cys Ala Glu Ala Asp Lys Glu Ser
165 170 175
Cys Leu Thr Pro Lys Leu Asp Gly Val Lys Glu Lys Ala Leu Val Ser
180 185 190
Ser Val Arg Gln Arg Met Lys Cys Ser Ser Met Gln Lys Phe Gly Glu
195 200 205
Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Thr Phe Pro
210 215 220
Asn Ala Asp Phe Ala Glu Ile Thr Lys Leu Ala Thr Asp Leu Thr Lys
225 230 235 240
Val Asn Lys Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
245 250 255
Arg Ala Glu Leu Ala Lys Tyr Met Cys Glu Asn Gln Ala Thr Ile Ser
260 265 270
Ser Lys Leu Gln Thr Cys Cys Asp Lys Pro Leu Leu Lys Lys Ala His
275 280 285
Cys Leu Ser Glu Val Glu His Asp Thr Met Pro Ala Asp Leu Pro Ala
290 295 300
Ile Ala Ala Asp Phe Val Glu Asp Gln Glu Val Cys Lys Asn Tyr Ala
305 310 315 320
Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Thr Phe Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg
325 330 335
Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Ser Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Lys
340 345 350
Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Glu Ala Asn Pro Pro Ala
355 360 365
Cys Tyr Gly Thr Val Leu Ala Glu Phe Gln Pro Leu Val Glu Glu Pro
370 375 380
Lys Asn Leu Val Lys Thr Asn Cys Asp Leu Tyr Glu Lys Leu Gly Glu
385 390 395 400
Tyr Gly Phe Gln Asn Ala Ile Leu Val Arg Tyr Thr Gln Lys Ala Pro
405 410 415
Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Ala Ala Arg Asn Leu Gly Arg
420 425 430
Val Gly Thr Lys Cys Cys Thr Leu Pro Glu Asp Gln Arg Leu Pro Cys
435 440 445
Val Glu Asp Tyr Leu Ser Ala Ile Leu Asn Arg Val Cys Leu Leu His
450 455 460
Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu His Val Thr Lys Cys Cys Ser Gly Ser
465 470 475 480
Leu Val Glu Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Thr Val Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Lys Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ser Asp
500 505 510
Ile Cys Thr Leu Pro Glu Lys Glu Lys Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala
515 520 525
Leu Ala Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Ala Glu Gln Leu
530 535 540
Lys Thr Val Met Asp Asp Phe Ala Gln Phe Leu Asp Thr Cys Cys Lys
545 550 555 560
Ala Ala Asp Lys Asp Thr Cys Phe Ser Thr Glu Gly Pro Asn Leu Val
565 570 575
Thr Arg Ser Lys Asp Ala Leu Ala
580
<210> 155
<211> 84
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 155
Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp His
1 5 10 15
Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly Cys Glu Leu Thr Tyr Gly Ile Lys
20 25 30
Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Pro Asp His Phe His
35 40 45
Asn Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr Glu Val Ser
50 55 60
Leu Ile Cys Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala Lys Glu
65 70 75 80
Thr Phe Thr Thr
<210> 156
<211> 84
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 156
Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp His
1 5 10 15
Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly Cys Glu Leu Thr Tyr Gly Ile Lys
20 25 30
Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Pro Asp His Phe His
35 40 45
Gln Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr Glu Val Ser
50 55 60
Leu Ile Cys Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala Lys Glu
65 70 75 80
Thr Phe Thr Thr
<210> 157
<211> 183
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 157
Ser Gln Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr
1 5 10 15
Trp His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly Cys Glu Leu Thr Tyr Gly
20 25 30
Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Pro Asp His
35 40 45
Phe His Gln Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr Glu
50 55 60
Val Ser Leu Ile Cys Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala
65 70 75 80
Lys Glu Thr Phe Thr Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ser Arg Leu Asp Ala
85 90 95
Pro Ser Gln Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile
100 105 110
Thr Trp His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly Cys Glu Leu Thr Tyr
115 120 125
Gly Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Pro Asp
130 135 140
His Phe His Gln Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr
145 150 155 160
Glu Val Ser Leu Ile Cys Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro
165 170 175
Ala Lys Glu Thr Phe Thr Thr
180
<210> 158
<211> 685
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 158
Ser Gln Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr
1 5 10 15
Trp His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly Cys Glu Leu Thr Tyr Gly
20 25 30
Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Pro Asp His
35 40 45
Phe His Gln Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr Glu
50 55 60
Val Ser Leu Ile Cys Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala
65 70 75 80
Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
85 90 95
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ala His Lys Ser Glu Ile Ala His Arg Tyr
100 105 110
Asn Asp Leu Gly Glu Gln His Phe Lys Gly Leu Val Leu Ile Ala Phe
115 120 125
Ser Gln Tyr Leu Gln Lys Ser Ser Tyr Asp Glu His Ala Lys Leu Val
130 135 140
Gln Glu Val Thr Asp Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala
145 150 155 160
Ala Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys
165 170 175
Ala Ile Pro Asn Leu Arg Glu Asn Tyr Gly Glu Leu Ala Asp Cys Cys
180 185 190
Thr Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp
195 200 205
Asp Asn Pro Ser Leu Pro Pro Phe Glu Arg Pro Glu Ala Glu Ala Met
210 215 220
Cys Thr Ser Phe Lys Glu Asn Pro Thr Thr Phe Met Gly His Tyr Leu
225 230 235 240
His Glu Val Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu
245 250 255
Tyr Tyr Ala Glu Gln Tyr Asn Glu Ile Leu Thr Gln Cys Cys Ala Glu
260 265 270
Ala Asp Lys Glu Ser Cys Leu Thr Pro Lys Leu Asp Gly Val Lys Glu
275 280 285
Lys Ala Leu Val Ser Ser Val Arg Gln Arg Met Lys Cys Ser Ser Met
290 295 300
Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu
305 310 315 320
Ser Gln Thr Phe Pro Asn Ala Asp Phe Ala Glu Ile Thr Lys Leu Ala
325 330 335
Thr Asp Leu Thr Lys Val Asn Lys Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu
340 345 350
Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Glu Leu Ala Lys Tyr Met Cys Glu Asn
355 360 365
Gln Ala Thr Ile Ser Ser Lys Leu Gln Thr Cys Cys Asp Lys Pro Leu
370 375 380
Leu Lys Lys Ala His Cys Leu Ser Glu Val Glu His Asp Thr Met Pro
385 390 395 400
Ala Asp Leu Pro Ala Ile Ala Ala Asp Phe Val Glu Asp Gln Glu Val
405 410 415
Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Thr Phe Leu
420 425 430
Tyr Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Ser Leu Leu Leu
435 440 445
Arg Leu Ala Lys Lys Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Glu
450 455 460
Ala Asn Pro Pro Ala Cys Tyr Gly Thr Val Leu Ala Glu Phe Gln Pro
465 470 475 480
Leu Val Glu Glu Pro Lys Asn Leu Val Lys Thr Asn Cys Asp Leu Tyr
485 490 495
Glu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Phe Gln Asn Ala Ile Leu Val Arg Tyr
500 505 510
Thr Gln Lys Ala Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Ala Ala
515 520 525
Arg Asn Leu Gly Arg Val Gly Thr Lys Cys Cys Thr Leu Pro Glu Asp
530 535 540
Gln Arg Leu Pro Cys Val Glu Asp Tyr Leu Ser Ala Ile Leu Asn Arg
545 550 555 560
Val Cys Leu Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu His Val Thr Lys
565 570 575
Cys Cys Ser Gly Ser Leu Val Glu Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu
580 585 590
Thr Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Lys Ala Glu Thr Phe
595 600 605
Thr Phe His Ser Asp Ile Cys Thr Leu Pro Glu Lys Glu Lys Gln Ile
610 615 620
Lys Lys Gln Thr Ala Leu Ala Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala
625 630 635 640
Thr Ala Glu Gln Leu Lys Thr Val Met Asp Asp Phe Ala Gln Phe Leu
645 650 655
Asp Thr Cys Cys Lys Ala Ala Asp Lys Asp Thr Cys Phe Ser Thr Glu
660 665 670
Gly Pro Asn Leu Val Thr Arg Ser Lys Asp Ala Leu Ala
675 680 685
<210> 159
<211> 782
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 159
Ser Gln Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr
1 5 10 15
Trp His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly Cys Glu Leu Thr Tyr Gly
20 25 30
Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Pro Asp His
35 40 45
Phe His Gln Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr Glu
50 55 60
Val Ser Leu Ile Cys Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro Ala
65 70 75 80
Lys Glu Thr Phe Thr Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ser Arg Leu Asp Ala
85 90 95
Pro Ser Gln Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile
100 105 110
Thr Trp His Asp Ala Phe Gly Tyr Asp Phe Gly Cys Glu Leu Thr Tyr
115 120 125
Gly Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Pro Asp
130 135 140
His Phe His Gln Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr
145 150 155 160
Glu Val Ser Leu Ile Cys Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Asn Pro
165 170 175
Ala Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
180 185 190
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ala His Lys Ser Glu Ile Ala His Arg
195 200 205
Tyr Asn Asp Leu Gly Glu Gln His Phe Lys Gly Leu Val Leu Ile Ala
210 215 220
Phe Ser Gln Tyr Leu Gln Lys Ser Ser Tyr Asp Glu His Ala Lys Leu
225 230 235 240
Val Gln Glu Val Thr Asp Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser
245 250 255
Ala Ala Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu
260 265 270
Cys Ala Ile Pro Asn Leu Arg Glu Asn Tyr Gly Glu Leu Ala Asp Cys
275 280 285
Cys Thr Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys
290 295 300
Asp Asp Asn Pro Ser Leu Pro Pro Phe Glu Arg Pro Glu Ala Glu Ala
305 310 315 320
Met Cys Thr Ser Phe Lys Glu Asn Pro Thr Thr Phe Met Gly His Tyr
325 330 335
Leu His Glu Val Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu
340 345 350
Leu Tyr Tyr Ala Glu Gln Tyr Asn Glu Ile Leu Thr Gln Cys Cys Ala
355 360 365
Glu Ala Asp Lys Glu Ser Cys Leu Thr Pro Lys Leu Asp Gly Val Lys
370 375 380
Glu Lys Ala Leu Val Ser Ser Val Arg Gln Arg Met Lys Cys Ser Ser
385 390 395 400
Met Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg
405 410 415
Leu Ser Gln Thr Phe Pro Asn Ala Asp Phe Ala Glu Ile Thr Lys Leu
420 425 430
Ala Thr Asp Leu Thr Lys Val Asn Lys Glu Cys Cys His Gly Asp Leu
435 440 445
Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Glu Leu Ala Lys Tyr Met Cys Glu
450 455 460
Asn Gln Ala Thr Ile Ser Ser Lys Leu Gln Thr Cys Cys Asp Lys Pro
465 470 475 480
Leu Leu Lys Lys Ala His Cys Leu Ser Glu Val Glu His Asp Thr Met
485 490 495
Pro Ala Asp Leu Pro Ala Ile Ala Ala Asp Phe Val Glu Asp Gln Glu
500 505 510
Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Thr Phe
515 520 525
Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Ser Leu Leu
530 535 540
Leu Arg Leu Ala Lys Lys Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala
545 550 555 560
Glu Ala Asn Pro Pro Ala Cys Tyr Gly Thr Val Leu Ala Glu Phe Gln
565 570 575
Pro Leu Val Glu Glu Pro Lys Asn Leu Val Lys Thr Asn Cys Asp Leu
580 585 590
Tyr Glu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Phe Gln Asn Ala Ile Leu Val Arg
595 600 605
Tyr Thr Gln Lys Ala Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Ala
610 615 620
Ala Arg Asn Leu Gly Arg Val Gly Thr Lys Cys Cys Thr Leu Pro Glu
625 630 635 640
Asp Gln Arg Leu Pro Cys Val Glu Asp Tyr Leu Ser Ala Ile Leu Asn
645 650 655
Arg Val Cys Leu Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu His Val Thr
660 665 670
Lys Cys Cys Ser Gly Ser Leu Val Glu Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala
675 680 685
Leu Thr Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Lys Ala Glu Thr
690 695 700
Phe Thr Phe His Ser Asp Ile Cys Thr Leu Pro Glu Lys Glu Lys Gln
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Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Ala Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys
725 730 735
Ala Thr Ala Glu Gln Leu Lys Thr Val Met Asp Asp Phe Ala Gln Phe
740 745 750
Leu Asp Thr Cys Cys Lys Ala Ala Asp Lys Asp Thr Cys Phe Ser Thr
755 760 765
Glu Gly Pro Asn Leu Val Thr Arg Ser Lys Asp Ala Leu Ala
770 775 780
<210> 160
<211> 84
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 160
Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp His
1 5 10 15
Asp Pro Ser Gly Tyr Asp Phe Trp Cys Glu Leu Thr Tyr Gly Ile Lys
20 25 30
Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Pro Asp His Phe His
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50 55 60
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65 70 75 80
Thr Phe Thr Thr
<210> 161
<211> 84
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 161
Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp His
1 5 10 15
Asp Pro Ser Gly Tyr Asp Phe Trp Cys Glu Leu Thr Tyr Gly Ile Lys
20 25 30
Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Pro Asp His Phe His
35 40 45
Gln Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr Glu Val Ser
50 55 60
Leu Ile Cys Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Tyr Pro Ala Lys Glu
65 70 75 80
Thr Phe Thr Thr
<210> 162
<211> 183
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 162
Ser Gln Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr
1 5 10 15
Trp His Asp Pro Ser Gly Tyr Asp Phe Trp Cys Glu Leu Thr Tyr Gly
20 25 30
Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Pro Asp His
35 40 45
Phe His Gln Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr Glu
50 55 60
Val Ser Leu Ile Cys Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Tyr Pro Ala
65 70 75 80
Lys Glu Thr Phe Thr Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ser Arg Leu Asp Ala
85 90 95
Pro Ser Gln Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile
100 105 110
Thr Trp His Asp Pro Ser Gly Tyr Asp Phe Trp Cys Glu Leu Thr Tyr
115 120 125
Gly Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Pro Asp
130 135 140
His Phe His Gln Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr
145 150 155 160
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165 170 175
Ala Lys Glu Thr Phe Thr Thr
180
<210> 163
<211> 685
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 163
Ser Gln Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr
1 5 10 15
Trp His Asp Pro Ser Gly Tyr Asp Phe Trp Cys Glu Leu Thr Tyr Gly
20 25 30
Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Pro Asp His
35 40 45
Phe His Gln Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr Glu
50 55 60
Val Ser Leu Ile Cys Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Tyr Pro Ala
65 70 75 80
Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
85 90 95
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ala His Lys Ser Glu Ile Ala His Arg Tyr
100 105 110
Asn Asp Leu Gly Glu Gln His Phe Lys Gly Leu Val Leu Ile Ala Phe
115 120 125
Ser Gln Tyr Leu Gln Lys Ser Ser Tyr Asp Glu His Ala Lys Leu Val
130 135 140
Gln Glu Val Thr Asp Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala
145 150 155 160
Ala Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys
165 170 175
Ala Ile Pro Asn Leu Arg Glu Asn Tyr Gly Glu Leu Ala Asp Cys Cys
180 185 190
Thr Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp
195 200 205
Asp Asn Pro Ser Leu Pro Pro Phe Glu Arg Pro Glu Ala Glu Ala Met
210 215 220
Cys Thr Ser Phe Lys Glu Asn Pro Thr Thr Phe Met Gly His Tyr Leu
225 230 235 240
His Glu Val Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu
245 250 255
Tyr Tyr Ala Glu Gln Tyr Asn Glu Ile Leu Thr Gln Cys Cys Ala Glu
260 265 270
Ala Asp Lys Glu Ser Cys Leu Thr Pro Lys Leu Asp Gly Val Lys Glu
275 280 285
Lys Ala Leu Val Ser Ser Val Arg Gln Arg Met Lys Cys Ser Ser Met
290 295 300
Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu
305 310 315 320
Ser Gln Thr Phe Pro Asn Ala Asp Phe Ala Glu Ile Thr Lys Leu Ala
325 330 335
Thr Asp Leu Thr Lys Val Asn Lys Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu
340 345 350
Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Glu Leu Ala Lys Tyr Met Cys Glu Asn
355 360 365
Gln Ala Thr Ile Ser Ser Lys Leu Gln Thr Cys Cys Asp Lys Pro Leu
370 375 380
Leu Lys Lys Ala His Cys Leu Ser Glu Val Glu His Asp Thr Met Pro
385 390 395 400
Ala Asp Leu Pro Ala Ile Ala Ala Asp Phe Val Glu Asp Gln Glu Val
405 410 415
Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Thr Phe Leu
420 425 430
Tyr Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Ser Leu Leu Leu
435 440 445
Arg Leu Ala Lys Lys Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Glu
450 455 460
Ala Asn Pro Pro Ala Cys Tyr Gly Thr Val Leu Ala Glu Phe Gln Pro
465 470 475 480
Leu Val Glu Glu Pro Lys Asn Leu Val Lys Thr Asn Cys Asp Leu Tyr
485 490 495
Glu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Phe Gln Asn Ala Ile Leu Val Arg Tyr
500 505 510
Thr Gln Lys Ala Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Ala Ala
515 520 525
Arg Asn Leu Gly Arg Val Gly Thr Lys Cys Cys Thr Leu Pro Glu Asp
530 535 540
Gln Arg Leu Pro Cys Val Glu Asp Tyr Leu Ser Ala Ile Leu Asn Arg
545 550 555 560
Val Cys Leu Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu His Val Thr Lys
565 570 575
Cys Cys Ser Gly Ser Leu Val Glu Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu
580 585 590
Thr Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Lys Ala Glu Thr Phe
595 600 605
Thr Phe His Ser Asp Ile Cys Thr Leu Pro Glu Lys Glu Lys Gln Ile
610 615 620
Lys Lys Gln Thr Ala Leu Ala Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala
625 630 635 640
Thr Ala Glu Gln Leu Lys Thr Val Met Asp Asp Phe Ala Gln Phe Leu
645 650 655
Asp Thr Cys Cys Lys Ala Ala Asp Lys Asp Thr Cys Phe Ser Thr Glu
660 665 670
Gly Pro Asn Leu Val Thr Arg Ser Lys Asp Ala Leu Ala
675 680 685
<210> 164
<211> 782
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 164
Ser Gln Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr
1 5 10 15
Trp His Asp Pro Ser Gly Tyr Asp Phe Trp Cys Glu Leu Thr Tyr Gly
20 25 30
Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Pro Asp His
35 40 45
Phe His Gln Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr Glu
50 55 60
Val Ser Leu Ile Cys Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Tyr Pro Ala
65 70 75 80
Lys Glu Thr Phe Thr Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ser Arg Leu Asp Ala
85 90 95
Pro Ser Gln Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile
100 105 110
Thr Trp His Asp Pro Ser Gly Tyr Asp Phe Trp Cys Glu Leu Thr Tyr
115 120 125
Gly Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Pro Asp
130 135 140
His Phe His Gln Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr
145 150 155 160
Glu Val Ser Leu Ile Cys Ala Asn Asp His Gly Phe Asp Ser Tyr Pro
165 170 175
Ala Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
180 185 190
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ala His Lys Ser Glu Ile Ala His Arg
195 200 205
Tyr Asn Asp Leu Gly Glu Gln His Phe Lys Gly Leu Val Leu Ile Ala
210 215 220
Phe Ser Gln Tyr Leu Gln Lys Ser Ser Tyr Asp Glu His Ala Lys Leu
225 230 235 240
Val Gln Glu Val Thr Asp Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser
245 250 255
Ala Ala Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu
260 265 270
Cys Ala Ile Pro Asn Leu Arg Glu Asn Tyr Gly Glu Leu Ala Asp Cys
275 280 285
Cys Thr Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys
290 295 300
Asp Asp Asn Pro Ser Leu Pro Pro Phe Glu Arg Pro Glu Ala Glu Ala
305 310 315 320
Met Cys Thr Ser Phe Lys Glu Asn Pro Thr Thr Phe Met Gly His Tyr
325 330 335
Leu His Glu Val Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu
340 345 350
Leu Tyr Tyr Ala Glu Gln Tyr Asn Glu Ile Leu Thr Gln Cys Cys Ala
355 360 365
Glu Ala Asp Lys Glu Ser Cys Leu Thr Pro Lys Leu Asp Gly Val Lys
370 375 380
Glu Lys Ala Leu Val Ser Ser Val Arg Gln Arg Met Lys Cys Ser Ser
385 390 395 400
Met Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg
405 410 415
Leu Ser Gln Thr Phe Pro Asn Ala Asp Phe Ala Glu Ile Thr Lys Leu
420 425 430
Ala Thr Asp Leu Thr Lys Val Asn Lys Glu Cys Cys His Gly Asp Leu
435 440 445
Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Glu Leu Ala Lys Tyr Met Cys Glu
450 455 460
Asn Gln Ala Thr Ile Ser Ser Lys Leu Gln Thr Cys Cys Asp Lys Pro
465 470 475 480
Leu Leu Lys Lys Ala His Cys Leu Ser Glu Val Glu His Asp Thr Met
485 490 495
Pro Ala Asp Leu Pro Ala Ile Ala Ala Asp Phe Val Glu Asp Gln Glu
500 505 510
Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Thr Phe
515 520 525
Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Ser Leu Leu
530 535 540
Leu Arg Leu Ala Lys Lys Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala
545 550 555 560
Glu Ala Asn Pro Pro Ala Cys Tyr Gly Thr Val Leu Ala Glu Phe Gln
565 570 575
Pro Leu Val Glu Glu Pro Lys Asn Leu Val Lys Thr Asn Cys Asp Leu
580 585 590
Tyr Glu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Phe Gln Asn Ala Ile Leu Val Arg
595 600 605
Tyr Thr Gln Lys Ala Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Ala
610 615 620
Ala Arg Asn Leu Gly Arg Val Gly Thr Lys Cys Cys Thr Leu Pro Glu
625 630 635 640
Asp Gln Arg Leu Pro Cys Val Glu Asp Tyr Leu Ser Ala Ile Leu Asn
645 650 655
Arg Val Cys Leu Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu His Val Thr
660 665 670
Lys Cys Cys Ser Gly Ser Leu Val Glu Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala
675 680 685
Leu Thr Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Lys Ala Glu Thr
690 695 700
Phe Thr Phe His Ser Asp Ile Cys Thr Leu Pro Glu Lys Glu Lys Gln
705 710 715 720
Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Ala Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys
725 730 735
Ala Thr Ala Glu Gln Leu Lys Thr Val Met Asp Asp Phe Ala Gln Phe
740 745 750
Leu Asp Thr Cys Cys Lys Ala Ala Asp Lys Asp Thr Cys Phe Ser Thr
755 760 765
Glu Gly Pro Asn Leu Val Thr Arg Ser Lys Asp Ala Leu Ala
770 775 780
<210> 165
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 165
Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp Ser
1 5 10 15
Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly Cys Glu Leu Thr Tyr Gly
20 25 30
Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Thr Glu Asp
35 40 45
Glu Asn Gln Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr Glu
50 55 60
Val Ser Leu Ile Cys Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro Ala Lys
65 70 75 80
Glu Thr Phe Thr Thr Thr
85
<210> 166
<211> 784
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 166
Ser Gln Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr
1 5 10 15
Trp Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly Cys Glu Leu Thr
20 25 30
Tyr Gly Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Thr
35 40 45
Glu Asp Glu Asn Gln Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu
50 55 60
Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser Asn Pro
65 70 75 80
Ala Lys Glu Thr Phe Thr Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ser Arg Leu Asp
85 90 95
Ala Pro Ser Gln Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu
100 105 110
Ile Thr Trp Ser Pro Gly Glu Arg Ile Trp Met Phe Thr Gly Cys Glu
115 120 125
Leu Thr Tyr Gly Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp
130 135 140
Leu Thr Glu Asp Glu Asn Gln Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp
145 150 155 160
Thr Glu Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Pro Asn Tyr Glu Arg Ile Ser
165 170 175
Asn Pro Ala Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
180 185 190
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ala His Lys Ser Glu Ile Ala
195 200 205
His Arg Tyr Asn Asp Leu Gly Glu Gln His Phe Lys Gly Leu Val Leu
210 215 220
Ile Ala Phe Ser Gln Tyr Leu Gln Lys Ser Ser Tyr Asp Glu His Ala
225 230 235 240
Lys Leu Val Gln Glu Val Thr Asp Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp
245 250 255
Glu Ser Ala Ala Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp
260 265 270
Lys Leu Cys Ala Ile Pro Asn Leu Arg Glu Asn Tyr Gly Glu Leu Ala
275 280 285
Asp Cys Cys Thr Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln
290 295 300
His Lys Asp Asp Asn Pro Ser Leu Pro Pro Phe Glu Arg Pro Glu Ala
305 310 315 320
Glu Ala Met Cys Thr Ser Phe Lys Glu Asn Pro Thr Thr Phe Met Gly
325 330 335
His Tyr Leu His Glu Val Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro
340 345 350
Glu Leu Leu Tyr Tyr Ala Glu Gln Tyr Asn Glu Ile Leu Thr Gln Cys
355 360 365
Cys Ala Glu Ala Asp Lys Glu Ser Cys Leu Thr Pro Lys Leu Asp Gly
370 375 380
Val Lys Glu Lys Ala Leu Val Ser Ser Val Arg Gln Arg Met Lys Cys
385 390 395 400
Ser Ser Met Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val
405 410 415
Ala Arg Leu Ser Gln Thr Phe Pro Asn Ala Asp Phe Ala Glu Ile Thr
420 425 430
Lys Leu Ala Thr Asp Leu Thr Lys Val Asn Lys Glu Cys Cys His Gly
435 440 445
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Glu Leu Ala Lys Tyr Met
450 455 460
Cys Glu Asn Gln Ala Thr Ile Ser Ser Lys Leu Gln Thr Cys Cys Asp
465 470 475 480
Lys Pro Leu Leu Lys Lys Ala His Cys Leu Ser Glu Val Glu His Asp
485 490 495
Thr Met Pro Ala Asp Leu Pro Ala Ile Ala Ala Asp Phe Val Glu Asp
500 505 510
Gln Glu Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly
515 520 525
Thr Phe Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Ser
530 535 540
Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Lys Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Lys Cys
545 550 555 560
Cys Ala Glu Ala Asn Pro Pro Ala Cys Tyr Gly Thr Val Leu Ala Glu
565 570 575
Phe Gln Pro Leu Val Glu Glu Pro Lys Asn Leu Val Lys Thr Asn Cys
580 585 590
Asp Leu Tyr Glu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Phe Gln Asn Ala Ile Leu
595 600 605
Val Arg Tyr Thr Gln Lys Ala Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val
610 615 620
Glu Ala Ala Arg Asn Leu Gly Arg Val Gly Thr Lys Cys Cys Thr Leu
625 630 635 640
Pro Glu Asp Gln Arg Leu Pro Cys Val Glu Asp Tyr Leu Ser Ala Ile
645 650 655
Leu Asn Arg Val Cys Leu Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu His
660 665 670
Val Thr Lys Cys Cys Ser Gly Ser Leu Val Glu Arg Arg Pro Cys Phe
675 680 685
Ser Ala Leu Thr Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Lys Ala
690 695 700
Glu Thr Phe Thr Phe His Ser Asp Ile Cys Thr Leu Pro Glu Lys Glu
705 710 715 720
Lys Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Ala Glu Leu Val Lys His Lys
725 730 735
Pro Lys Ala Thr Ala Glu Gln Leu Lys Thr Val Met Asp Asp Phe Ala
740 745 750
Gln Phe Leu Asp Thr Cys Cys Lys Ala Ala Asp Lys Asp Thr Cys Phe
755 760 765
Ser Thr Glu Gly Pro Asn Leu Val Thr Arg Ser Lys Asp Ala Leu Ala
770 775 780
<210> 167
<211> 83
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 167
Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp Ser
1 5 10 15
Asp Asp Phe Gly Glu Tyr Val Trp Cys Glu Leu Thr Tyr Gly Ile Lys
20 25 30
Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Trp Tyr His His Ala
35 40 45
His Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr Glu Val Ser
50 55 60
Leu Ile Cys Arg Ser Gly Asp Met Ser Ser Asn Pro Ala Lys Glu Thr
65 70 75 80
Phe Thr Thr
<210> 168
<211> 83
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (16)..(16)
<223> Xaa是Ser或Leu
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (18)..(18)
<223> Xaa是Asp或Glu
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (19)..(19)
<223> Xaa是His、Ile、Val、Phe或Trp中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (20)..(20)
<223> Xaa是Ala、Gly、Glu或Asp中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (21)..(21)
<223> Xaa是Glu、Leu、Gln、Ser、Asp或Asn中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (22)..(22)
<223> Xaa是Phe或Tyr中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (23)..(23)
<223> Xaa是Ile、Val、His、Glu或Asp中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (24)..(24)
<223> Xaa是Gly、Trp或Val中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (45)..(45)
<223> Xaa是Trp、Phe或Tyr中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (47)..(47)
<223> Xaa是Ser、Gln、Met或His中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (49)..(49)
<223> Xaa是任何Trp或His
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (69)..(69)
<223> Xaa是Arg或Ser中的任何项
<400> 168
Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp Xaa
1 5 10 15
Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Glu Leu Thr Tyr Gly Ile Lys
20 25 30
Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Trp Xaa His Xaa Ala
35 40 45
Xaa Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr Glu Val Ser
50 55 60
Leu Ile Cys Arg Xaa Gly Asp Met Ser Ser Asn Pro Ala Lys Glu Thr
65 70 75 80
Phe Thr Thr
<210> 169
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是Ser或Leu中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是Asp或Glu中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是His、Ile、Val、Phe或Trp中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是Ala、Gly、Glu或Asp中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是Glu、Leu、Gln、Ser、Asp或Asn中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是Phe或Tyr中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是Ile、Val、His、Glu或Asp中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (9)..(9)
<223> Xaa是Gly、Trp或Val中的任何项
<400> 169
Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 170
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是Trp、Phe或Tyr中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是Ser、Gln、Met或His中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是Trp或His中的任何项
<400> 170
Trp Xaa His Xaa Ala Xaa
1 5
<210> 171
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是Arg或Ser
<400> 171
Arg Xaa Gly Asp Met Ser Ser Asn Pro Ala
1 5 10
<210> 172
<211> 87
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是Lys或Glu
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (16)..(16)
<223> Xaa是Thr或Ile
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (17)..(17)
<223> Xaa是Asn或Ala
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (20)..(20)
<223> Xaa是Ser、Leu、Ala、Phe和Tyr中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (21)..(21)
<223> Xaa是Tyr、Ala、Gly、Val、Ile和Ser中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (22)..(22)
<223> Xaa是Tyr、Ser、Ala和His中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (23)..(23)
<223> Xaa是Asn、Asp、His和Tyr中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (24)..(24)
<223> Xaa是Leu、Phe、His和Tyr中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (25)..(25)
<223> Xaa是His、Pro、Ser、Leu和Asp中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (26)..(26)
<223> Xaa是Gly、Phe、His和Tyr中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (30)..(30)
<223> Xaa是Ala或Thr
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (46)..(46)
<223> Xaa是Ser、Asn、Glu、Arg和Asp中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (47)..(47)
<223> Xaa是Ser、Gln、Thr、Asn和Ala中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (48)..(48)
<223> Xaa不存在或是Pro、Val、Ile和Ala中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (49)..(49)
<223> Xaa不存在或是Ile
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (63)..(63)
<223> Xaa是Glu或Lys
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (78)..(78)
<223> Xaa是中的任何项
<400> 172
Ile Glu Val Xaa Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp Xaa
1 5 10 15
Xaa Arg Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Glu Leu Xaa Tyr Gly
20 25 30
Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Xaa Xaa Xaa
35 40 45
Xaa Tyr Val His Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Xaa Tyr
50 55 60
Glu Val Ser Leu Ile Cys Leu Thr Thr Asp Gly Thr Tyr Xaa Asn Pro
65 70 75 80
Ala Lys Glu Thr Phe Thr Thr
85
<210> 173
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是Ala或Thr
<400> 173
Cys Glu Leu Xaa Tyr Gly Ile
1 5
<210> 174
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是Lys或Glu
<400> 174
Xaa Asp Val Thr Asp Thr Thr
1 5
<210> 175
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是Thr或Ile
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是Asn或Ala
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是Ser、Leu、Ala、Phe和Tyr中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是Tyr、Ala、Gly、Val、Ile和Ser中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是Tyr、Ser、Ala和His中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是Asn、Asp、His和Tyr中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (9)..(9)
<223> Xaa是Leu、Phe、His和Tyr中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (10)..(10)
<223> Xaa是His、Pro、Ser、Leu和Asp中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (11)..(11)
<223> Xaa是Gly、Phe、His和Tyr中的任何项
<400> 175
Xaa Xaa Arg Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10
<210> 176
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是Ser、Asn、Glu、Arg和Asp中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是Ser、Gln、Thr、Asn和Ala中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (3)..(3)
<223> Xaa不存在或是Pro、Val、 Ile和Ala中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (4)..(4)
<223> Xaa不存在或是Ile
<400> 176
Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Val His
1 5
<210> 177
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (8)..()
<223> Xaa是Glu或Lys
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (8)..(8)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 177
Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Xaa
1 5
<210> 178
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是Ser或Asn
<400> 178
Leu Thr Thr Asp Gly Thr Tyr Xaa Asn Pro Ala
1 5 10
<210> 179
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (19)..(19)
<223> N是G、A、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (22)..(22)
<223> N是G、A、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (28)..(28)
<223> N是G、A、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (34)..(34)
<223> N是G、A、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (37)..(37)
<223> N是G、A、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (40)..(40)
<223> N是G、A、T和C中的任何项
<400> 179
accgcgctga ttacctggnh tnhtscgnht gstnhtnhtn htggctgtga actgacctat 60
ggcattaaa 69
<210> 180
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (19)..(19)
<223> N是G、A、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (22)..(22)
<223> N是G、A、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (28)..(28)
<223> N是G、A、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (31)..(31)
<223> N是G、A、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (34)..(34)
<223> N是G、A、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (37)..(37)
<223> N是G、A、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (40)..(40)
<223> N是G、A、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (43)..(43)
<223> N是G、A、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (46)..(46)
<223> N是G、A、T和C中的任何项
<400> 180
accgcgctga ttacctggnh tnhtbstnht nhtnhtnhtn htnhtnhtgg ctgtgaactg 60
acctatggca ttaaa 75
<210> 181
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (19)..(19)
<223> N是A、G、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (28)..(28)
<223> N是A、G、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (31)..(31)
<223> N是A、G、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (34)..(34)
<223> N是A、G、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (43)..(43)
<223> N是A、G、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (49)..(49)
<223> N是A、G、T和C中的任何项
<400> 181
accgcgctga ttacctggnh tvmaccgnht nhtnhtrrcr gcnhtvttnh tggctgtgaa 60
ctgacctatg gcattaaa 78
<210> 182
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (23)..(23)
<223> N是A、G、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (26)..(26)
<223> N是A、G、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (29)..(29)
<223> N是A、G、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (32)..(32)
<223> N是A、G、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (35)..(35)
<223> N是A、G、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (38)..(38)
<223> N是A、G、T和C中的任何项
<400> 182
cgatcgcacc accatagatc tgnhtnhtnh tnhtnhtnht tatagcattg gtaacctgaa 60
accg 64
<210> 183
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (25)..(25)
<223> N是A、G、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (31)..(31)
<223> N是A、G、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (34)..(34)
<223> N是A、G、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (40)..(40)
<223> N是A、G、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (43)..(43)
<223> N是A、G、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (46)..(46)
<223> N是A、G、T和C中的任何项
<400> 183
gaatatgaag tgagcctgat ttgcnhtams nhtnhtggtn htnhtnhtkc gaaagaaacc 60
tttaccaccg gtg 73
<210> 184
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (25)..(25)
<223> N是A、G、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (31)..(31)
<223> N是A、G、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (34)..(34)
<223> N是A、G、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (37)..(37)
<223> N是A、G、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (40)..(40)
<223> N是A、G、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (46)..(46)
<223> N是A、G、T和C中的任何项
<400> 184
gaatatgaag tgagcctgat ttgcnhtams nhtnhtnhtn htrgcnhtcc ggcgaaagaa 60
acctttacca ccggtg 76
<210> 185
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (25)..(25)
<223> N是A、G、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (31)..(31)
<223> N是A、G、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (34)..(34)
<223> N是A、G、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (40)..(40)
<223> N是A、G、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (43)..(43)
<223> N是A、G、T和C中的任何项
<400> 185
gaatatgaag tgagcctgat ttgcnhtams nhtnhtggtn htnhtagcaa cccggcgaaa 60
gaaaccttta ccaccggtg 79
<210> 186
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 186
cagatctatg gtggtgcgat cgcccggcac atctttaatg ccataggtca gttcaca 57
<210> 187
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 187
gcaaatcagg ctcacttcat attcggtatc cggtttcagg ttaccaatgc tat 53
<210> 188
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 188
cgggtcggtt ggggtaccgc caccggtggt aaaggtttct tt 42
<210> 189
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 189
cgggtcggtt ggggta 16
<210> 190
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 190
ggcccagccg gccatggccg ccattgaagt gaaagatgtg accgatacca ccgcgctgat 60
tacctgg 67
<210> 191
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (22)..(24)
<223> NNN编码所有氨基酸，除了Cys
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (25)..(27)
<223> NNN编码Ala或Pro
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (28)..(30)
<223> NNN编码所有氨基酸，除了Cys
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (31)..(33)
<223> NNN编码Ala或Gly
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (34)..(36)
<223> NNN编码所有氨基酸，除了Cys
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (37)..(39)
<223> NNN编码所有氨基酸，除了Cys
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (40)..(42)
<223> NNN编码所有氨基酸，除了Cys
<400> 191
accgcgctga ttacctggtc tnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnggctgtga actgacctat 60
ggcattaaag atg 73
<210> 192
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (19)..(20)
<223> 每个N是A、G、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (22)..(23)
<223> 每个N是A、G、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (28)..(29)
<223> 每个N是A、G、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (34)..(35)
<223> 每个N是A、G、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (37)..(38)
<223> 每个N是A、G、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (40)..(41)
<223> 每个N是A、G、T和C中的任何项
<400> 192
accgcgctga ttacctggnn knnksmgnnk gstnnknnkn nkggctgtga actgacctat 60
ggcattaaa 69
<210> 193
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (19)..(20)
<223> 每个N是A、T、C或T中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (22)..(23)
<223> 每个N是G、A、C和T中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (25)..(26)
<223> 每个N是G、A、C和T中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (28)..(29)
<223> 每个N是G、A、C和T中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (31)..(32)
<223> 每个N是G、A、C和T中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (34)..(35)
<223> 每个N是G、A、C和T中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (37)..(37)
<223> N是G、A、C和T中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (40)..(41)
<223> 每个N是G、A、C和T中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (43)..(44)
<223> 每个N是G、A、C和T中的任何项
<400> 193
accgcgctga ttacctggnn knnknnknnk nnknnknhtn nknnktgtga actgacctat 60
ggcattaaa 69
<210> 194
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (34)..(36)
<223> NNN编码所有氨基酸，除了Cys
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (37)..(39)
<223> NNN编码所有氨基酸，除了Cys
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (40)..(42)
<223> NNN编码所有氨基酸，除了Cys
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (43)..(45)
<223> NNN编码所有氨基酸，除了Cys
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (46)..(49)
<223> NNN编码所有氨基酸，除了Cys
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (50)..(51)
<223> NNN编码所有氨基酸，除了Cys
<400> 194
gatgtgccgg gcgatcgcac caccatagat ctgnnnnnnn nnnnnnnnnn ntatagcatt 60
ggtaacctga aaccgg 76
<210> 195
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 195
ccaggtaatc agcgcggtgg tat 23
<210> 196
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 196
cagatctatg gtggtgcgat cgc 23
<210> 197
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 197
tgtgaactga cctatggcat taaagatgt 29
<210> 198
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (19)..(19)
<223> N是G、A、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (22)..(22)
<223> N是G、A、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (26)..(26)
<223> N是G、A、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (28)..(28)
<223> N是G、A、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (31)..(31)
<223> N是G、A、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (34)..(34)
<223> N是G、A、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (37)..(37)
<223> n是 a、c、g或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (38)..(38)
<223> N是G、A、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (40)..(40)
<223> N是G、A、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (43)..(43)
<223> N是G、A、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (46)..(46)
<223> N是G、A、T和C中的任何项
<400> 198
accgcgctga ttacctggnh tnhtvntnht nhtnhtnhtn htnhtnhtgg ctgtgaactg 60
acctatggca ttaaa 75
<210> 199
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (19)..(19)
<223> N是G、A、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (22)..(22)
<223> N是G、A、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (26)..(26)
<223> N是G、A、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (28)..(28)
<223> N是G、A、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (31)..(31)
<223> N是G、A、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (34)..(34)
<223> N是G、A、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (37)..(37)
<223> N是G、A、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (40)..(40)
<223> N是G、A、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (43)..(43)
<223> N是G、A、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (46)..(46)
<223> N是G、A、T和C中的任何项
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (49)..(49)
<223> N是G、A、T和C中的任何项
<400> 199
accgcgctga ttacctggnh tnhtvntnht nhtnhtnhtn htnhtnhtnh ttgtgaactg 60
acctatggca ttaaa 75
<210> 200
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 200
ggcccagccg gccatggccg ccattgaagt ggaagatgtg accgatacca ccgcgctgat 60
tacctgg 67
<210> 201
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 201
Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu
1 5 10 15
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln
20 25 30
Gln Ser Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu
35 40 45
Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys
50 55 60
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu
65 70 75 80
Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro
85 90 95
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu
100 105 110
Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His
115 120 125
Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg
130 135 140
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala
165 170 175
Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser
180 185 190
Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu
195 200 205
Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro
210 215 220
Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys
225 230 235 240
Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
245 250 255
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser
260 265 270
Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His
275 280 285
Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser
290 295 300
Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala
305 310 315 320
Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg
325 330 335
Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr
340 345 350
Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu
355 360 365
Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro
370 375 380
Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu
385 390 395 400
Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro
405 410 415
Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys
420 425 430
Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys
435 440 445
Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Asn His
450 455 460
Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser
465 470 475 480
Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp
500 505 510
Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Leu Lys Gln Thr Ala
515 520 525
Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu
530 535 540
Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys
545 550 555 560
Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val
565 570 575
Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
580 585
<210> 202
<211> 683
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 202
Ser Gln Ile Glu Val Glu Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr
1 5 10 15
Trp Thr Asn Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Leu His Gly Cys Glu Leu Ala
20 25 30
Tyr Gly Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Asn
35 40 45
Gln Pro Tyr Val His Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu
50 55 60
Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Leu Thr Thr Asp Gly Thr Tyr Asn Asn
65 70 75 80
Pro Ala Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
85 90 95
Gly Ser Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu
100 105 110
Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr
115 120 125
Leu Gln Gln Ser Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val
130 135 140
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145 150 155 160
Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala
165 170 175
Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln
180 185 190
Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro
195 200 205
Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala
210 215 220
Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile
225 230 235 240
Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala
245 250 255
Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys
260 265 270
Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys
275 280 285
Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe
290 295 300
Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg
305 310 315 320
Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu
325 330 335
Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala
340 345 350
Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser
355 360 365
Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys
370 375 380
Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu
385 390 395 400
Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn
405 410 415
Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr
420 425 430
Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala
435 440 445
Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro
450 455 460
His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu
465 470 475 480
Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu
485 490 495
Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys
500 505 510
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515 520 525
Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met
530 535 540
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545 550 555 560
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595 600 605
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Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
675 680
<210> 203
<211> 683
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 203
Ser Gln Ile Glu Val Glu Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr
1 5 10 15
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Gly Gly Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu
100 105 110
Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr
115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
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195 200 205
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg
305 310 315 320
Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu
325 330 335
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355 360 365
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370 375 380
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Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn
405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met
530 535 540
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545 550 555 560
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Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp
580 585 590
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595 600 605
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645 650 655
Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys
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Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
675 680
<210> 204
<211> 791
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 204
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1 5 10 15
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275 280 285
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305 310 315 320
Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn
325 330 335
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340 345 350
Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys
355 360 365
Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu
370 375 380
Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala
385 390 395 400
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405 410 415
Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala
420 425 430
Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His
435 440 445
Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala
450 455 460
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465 470 475 480
Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile
485 490 495
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500 505 510
Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala
515 520 525
Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His
530 535 540
Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu
545 550 555 560
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565 570 575
Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn
580 585 590
Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys
595 600 605
Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val
610 615 620
Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly
625 630 635 640
Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu
645 650 655
Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys
660 665 670
Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val
675 680 685
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Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala
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Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
785 790
<210> 205
<211> 791
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 205
Ser Gln Ile Glu Val Glu Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr
1 5 10 15
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Tyr Gly Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Asn
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg Leu Asp Ala Pro Ser Gln Ile Glu
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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195 200 205
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210 215 220
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245 250 255
Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu
260 265 270
His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu
275 280 285
Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg
290 295 300
Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg
305 310 315 320
Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala
385 390 395 400
Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala
405 410 415
Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala
420 425 430
Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His
435 440 445
Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala
450 455 460
Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys
465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala
515 520 525
Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His
530 535 540
Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu
545 550 555 560
Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr
565 570 575
Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn
580 585 590
Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys
595 600 605
Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val
610 615 620
Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly
625 630 635 640
Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu
645 650 655
Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys
660 665 670
Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val
675 680 685
Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val
690 695 700
Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys
705 710 715 720
Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val
725 730 735
Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala
740 745 750
Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp
755 760 765
Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala
770 775 780
Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
785 790
<210> 206
<211> 190
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 206
Ser Gln Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr
1 5 10 15
Trp Ser Asp Glu Phe Gly His Tyr Asp Gly Cys Glu Leu Thr Tyr Gly
20 25 30
Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Trp Trp His
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Gly Gly Gly Ser Arg Leu Asp Ala Pro Ser Gln Ile Glu Val Lys Asp
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
<210> 207
<211> 680
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 207
Ser Gln Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr
1 5 10 15
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20 25 30
Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Trp Trp His
35 40 45
Ser Ala Trp Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr Glu
50 55 60
Val Ser Leu Ile Cys Tyr Thr Asp Gln Glu Ala Gly Asn Pro Ala Lys
65 70 75 80
Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
85 90 95
Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu
100 105 110
Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln
115 120 125
Ser Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe
130 135 140
Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser
145 150 155 160
Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg
165 170 175
Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu
180 185 190
Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro
195 200 205
Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp
210 215 220
Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg
225 230 235 240
His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr
245 250 255
Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys
260 265 270
Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser
275 280 285
Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg
290 295 300
Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys
305 310 315 320
Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val
325 330 335
His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg
340 345 350
Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser
355 360 365
Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys
370 375 380
Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu
385 390 395 400
Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu
405 410 415
Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg
420 425 430
His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr
435 440 445
Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys
450 455 460
Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln
465 470 475 480
Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr
485 490 495
Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln
500 505 510
Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val
515 520 525
Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala
530 535 540
Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu
545 550 555 560
Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu
565 570 575
Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr
580 585 590
Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile
595 600 605
Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu
610 615 620
Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys
625 630 635 640
Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala
645 650 655
Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala
660 665 670
Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
675 680
<210> 208
<211> 785
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 208
Ser Gln Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr
1 5 10 15
Trp Ser Asp Glu Phe Gly His Tyr Asp Gly Cys Glu Leu Thr Tyr Gly
20 25 30
Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Trp Trp His
35 40 45
Ser Ala Trp Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr Glu
50 55 60
Val Ser Leu Ile Cys Tyr Thr Asp Gln Glu Ala Gly Asn Pro Ala Lys
65 70 75 80
Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Ser Arg Leu Asp Ala Pro Ser Gln Ile Glu Val Lys Asp
100 105 110
Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp Ser Asp Glu Phe Gly His
115 120 125
Tyr Asp Gly Cys Glu Leu Thr Tyr Gly Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp
130 135 140
Arg Thr Thr Ile Asp Leu Trp Trp His Ser Ala Trp Tyr Ser Ile Gly
145 150 155 160
Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Tyr Thr
165 170 175
Asp Gln Glu Ala Gly Asn Pro Ala Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly
180 185 190
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala
195 200 205
His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu
210 215 220
Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Ser Pro Phe Glu Asp His Val
225 230 235 240
Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp
245 250 255
Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp
260 265 270
Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala
275 280 285
Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln
290 295 300
His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val
305 310 315 320
Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys
325 330 335
Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro
340 345 350
Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys
355 360 365
Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu
370 375 380
Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys
385 390 395 400
Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val
405 410 415
Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser
420 425 430
Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly
435 440 445
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile
450 455 460
Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu
465 470 475 480
Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp
485 490 495
Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser
500 505 510
Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly
515 520 525
Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val
530 535 540
Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys
545 550 555 560
Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu
565 570 575
Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys
580 585 590
Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu
595 600 605
Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val
610 615 620
Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His
625 630 635 640
Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val
645 650 655
Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg
660 665 670
Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe
675 680 685
Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala
690 695 700
Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu
705 710 715 720
Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys
725 730 735
Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala
740 745 750
Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe
755 760 765
Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly
770 775 780
Leu
785
<210> 209
<211> 190
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 209
Ser Gln Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr
1 5 10 15
Trp Ser Asp Asp Phe Gly Glu Tyr Val Trp Cys Glu Leu Thr Tyr Gly
20 25 30
Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu Trp Tyr His
35 40 45
His Ala His Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr Glu
50 55 60
Val Ser Leu Ile Cys Arg Ser Gly Asp Met Ser Ser Asn Pro Ala Lys
65 70 75 80
Glu Thr Phe Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Ser Arg Leu Asp Ala Pro Ser Gln Ile Glu Val Lys Asp
100 105 110
Val Thr Asp Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp Ser Asp Asp Phe Gly Glu
115 120 125
Tyr Val Trp Cys Glu Leu Thr Tyr Gly Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp
130 135 140
Arg Thr Thr Ile Asp Leu Trp Tyr His His Ala His Tyr Ser Ile Gly
145 150 155 160
Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr Glu Val Ser Leu Ile Cys Arg Ser
165 170 175
Gly Asp Met Ser Ser Asn Pro Ala Lys Glu Thr Phe Thr Thr
180 185 190
<210> 210
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 210
Met Thr Asn Ile Thr Lys Arg Ser Leu Val Ala Ala Gly Val Leu Ala
1 5 10 15
Ala Leu Met Ala Gly Asn Val Ala Met Ala
20 25

Claims (104)

1.一种在纯化期间减少白蛋白融合蛋白中色氨酸和/或甲硫氨酸氧化的方法，该方法包括使包含该白蛋白融合蛋白的组合物经受以下纯化过程：
(a)亲和基质；
(b)阴离子交换基质，
其中通过应用包含辛酸盐的洗脱缓冲液将该白蛋白融合蛋白从该亲和基质上洗脱。
2.如权利要求1所述的方法，其中该洗脱缓冲液包含约2mM至约100mM的辛酸盐。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中用包含以下项的洗涤缓冲液洗涤亲和基质：
(1)约2％至约20％的多元醇，其中该多元醇选自下组，该组由以下各项组成：1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,2-丁二醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇、1,6-己二醇和2-甲基-2,4-戊二醇；
(2)0.05M至2.0M的盐，其中该盐选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化锂、溴化钠、溴化钾和溴化锂；
(3)约0.02M至约0.2M的硫酸钠；
(4)约0.01％至约1％的非离子型表面活性剂；
(5)约0.05M至约1.0M的尿素；或
(6)约0.02M至约0.5M的烟酰胺。
4.一种在纯化期间减少白蛋白融合蛋白中色氨酸和/或甲硫氨酸氧化的方法，该方法包括使包含该白蛋白融合蛋白的组合物经受以下纯化过程：
(a)亲和基质；
(b)阴离子交换基质，
其中用包含以下项的洗涤缓冲液洗涤该亲和基质：
(1)约2％至约20％的多元醇，其中该多元醇选自下组，该组由以下各项组成：1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,2-丁二醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇、1,6-己二醇和2-甲基-2,4-戊二醇；
(2)0.05M至2.0M的盐，其中该盐选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化锂、溴化钠、溴化钾和溴化锂；
(3)约0.02M至约0.2M的硫酸钠；
(4)约0.01％至约1％的非离子型表面活性剂；
(5)约0.05M至约1.0M的尿素；或
(6)约0.02M至约0.5M的烟酰胺。
5.如权利要求3或权利要求4所述的方法，其中该洗涤缓冲液包含约5％至约15％的多元醇、约0.2M至约0.8M的盐、约0.2M至约0.8M的硫酸钠、约0.02％至约0.4％的非离子型表面活性剂或约0.2M至约1.0M的尿素。
6.如权利要求3、4或5所述的方法，其中该多元醇是1,2-丙二醇，该盐是氯化钠，并且该非离子型表面活性剂是曲通X-100。
7.如权利要求3或权利要求4所述的方法，其中该洗涤缓冲液包含：(1)约0.5M的氯化钠；(2)约0.5M的硫酸钠；或(3)约10％的1,3-丙二醇。
8.如权利要求1、2、3、5、6或7所述的方法，其中该洗脱缓冲液包含bis-Tris、Tris、磷酸盐、盐、螯合剂或其组合。
9.如权利要求8所述的方法，其中该洗脱缓冲液是50mM bis-Tris。
10.如权利要求3或权利要求4所述的方法，其中该洗涤缓冲液处于5.5至7.0的pH。
11.如权利要求3或权利要求4所述的方法，其中用加载缓冲液平衡该亲和基质。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中该亲和基质是染料亲和基质。
13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中该阴离子交换基质包含具有葡聚糖表面增充剂的高度交联的琼脂糖。
14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中使用步骤洗脱将该白蛋白融合蛋白从该阴离子交换基质上洗脱。
15.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中使用梯度洗脱将该白蛋白融合蛋白从该阴离子交换中洗脱。
16.如权利要求1中任一项所述的方法，其中该阴离子交换基质洗脱缓冲液包含选自下组的盐，该组由以下各项组成：NaCl、KCl、CaCl2、HCl、LiCl、NaBr、KBr和LiBr。
17.如权利要求14所述的方法，其中该盐是NaCl并且以20-400mM的量存在。
18.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中用pH 7.0的包含50mM bis-Tris和20mM NaCl的加载缓冲液平衡该阴离子交换基质。
19.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括使该组合物通过阴离子交换膜。
20.如权利要求17所述的方法，其中该阴离子交换膜是用季胺改性的聚醚砜基膜。
21.如权利要求17所述的方法，其中使该组合物在具有大于10mM的盐浓度和小于8的pH的流通缓冲液中通过该阴离子交换膜。
22.如权利要求19所述的方法，其中该流通缓冲液具有10mM至220mM的盐浓度和6至8的pH。
23.如权利要求20所述的方法，其中6至7.5的pH的该流通缓冲液具有50mM至220mM的盐浓度。
24.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中使该阴离子交换基质洗脱液经受渗滤。
25.如权利要求22所述的方法，其中用于渗滤的pH 7.0的该缓冲液包含50mM bis-tris和50mM NaCl。
26.如权利要求17至22中任一项所述的方法，其中预调节该膜。
27.如权利要求17至22中任一项所述的方法，其中平衡该膜。
28.如权利要求1至25中任一项所述的方法，该方法进一步包括使该组合物经受疏水相互作用基质。
29.如权利要求26所述的方法，其中该疏水相互作用基质或多模式基质选自下组，该组由以下各项组成：Capto Butyl、Capto Phenyl、Capto Butyl、Butyl-S Fast Flow、Toyopearl Hexyl、Toyopearl Butyl、Toyopearl Phenyl、Toyopearl PPG、ToyopearlEther、Toyopearl PPG-600M以及Toyopearl Phenyl-650M、Toyopearl PPG-600M、TSKgelPhenyl、TSKgel Ether、Macro-Prep Methyl、Capto MMC、Eshmuno HCX、Nuvia cPrime或Toyopearl MX-Trp-650M。
30.如权利要求26所述的方法，其中该疏水相互作用基质加载包含柠檬酸盐、硫酸钠或硫酸铵的缓冲液。
31.如权利要求26所述的方法，其中用包含低水平的柠檬酸盐、[硫酸？]钠或硫酸铵的洗脱缓冲液洗脱该疏水相互作用基质。
32.如权利要求1至29中任一项所述的方法，该方法进一步包括使该组合物经受超滤。
33.如权利要求1至30中任一项所述的方法，该方法进一步包括使该组合物经受渗滤。
34.如权利要求1至31中任一项所述的方法，该方法进一步包括使该组合物经受纳滤。
35.如权利要求1至32中任一项所述的方法，该方法进一步包括使该组合物经受尺寸排阻层析。
36.如权利要求1至33中任一项所述的方法，该方法进一步包括病毒灭活过程。
37.如权利要求34所述的方法，其中该病毒灭活过程包括用曲通X-100、吐温80、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、壬苯醇醚-9、泊洛沙姆、硬脂醇或脱水山梨醇单硬脂酸酯处理包含白蛋白融合蛋白的该组合物。
38.如权利要求34所述的方法，其中在步骤(a)的过程之后且在步骤(b)的过程之前进行该病毒灭活过程。
39.如权利要求38所述的方法，其中将曲通X-100添加至约0.01％至约1％的曲通X-100(w/w)的终浓度，保持约30至约240分钟。
40.一种获得包含基本上不含经氧化的色氨酸残基的白蛋白融合蛋白的组合物的方法，该方法包括使包含经氧化的色氨酸白蛋白融合蛋白和未经氧化的色氨酸白蛋白融合蛋白的组合物经受疏水相互作用基质，其中在不同时间将经氧化的色氨酸白蛋白融合蛋白和未经氧化的色氨酸白蛋白融合蛋白从该疏水相互作用基质上洗脱，从而将该经氧化的色氨酸白蛋白融合蛋白与该未经氧化的色氨酸白蛋白融合蛋白分离。
41.一种基本上免于氧化色氨酸/甲硫氨酸残基而分离白蛋白融合蛋白的方法，该方法包括使包含白蛋白融合蛋白的组合物经受以下纯化过程：
(a)亲和基质层析过程；
(b)阴离子交换层析过程；以及
(c)疏水相互作用基质层析过程，
其中将包含辛酸盐的洗脱缓冲液应用至该亲和基质，并且其中在不同时间将经氧化的色氨酸白蛋白融合蛋白和未经氧化的色氨酸白蛋白融合蛋白从该疏水相互作用基质上洗脱，从而将该经氧化的色氨酸白蛋白融合蛋白与该未经氧化的色氨酸白蛋白融合蛋白分离。
42.一种纯化白蛋白融合蛋白的方法，该方法包括使包含白蛋白融合蛋白的组合物经受疏水相互作用基质以及以下纯化过程中的一个或多个：
(a)亲和基质，其中将包含辛酸盐的洗脱缓冲液应用至该亲和基质；和/或
(b)阴离子交换基质；其中用洗涤缓冲液洗涤亲和基质，该洗涤缓冲液包含：(1)约2％至约20％的多元醇，其中该多元醇选自下组，该组由以下各项组成：1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,2-丁二醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇、1,6己二醇和2-甲基-2,4-戊二醇；(2)0.05M至2.0M的盐，其中该盐选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化锂、溴化钠、溴化钾和溴化锂；(3)约0.02M至约0.2M的硫酸钠；(4)约0.01％至约1％的非离子型表面活性剂；(5)约0.05M至约1.0M的尿素；或(6)约0.02M至约0.5M的烟酰胺，
其中该所得经纯化的白蛋白融合蛋白基本上不含经氧化的色氨酸残基。
43.一种纯化白蛋白融合蛋白的方法，该方法包括：
(a)将包含该白蛋白融合蛋白的组合物应用至亲和基质；
(b)将该白蛋白融合蛋白从(a)的亲和基质上洗脱以获得第一洗脱液；
(c)将该第一洗脱液应用至阴离子交换基质；
(d)将该白蛋白融合蛋白从该阴离子交换基质上洗脱以获得第二洗脱液；
(e)将该第二洗脱液应用至阴离子交换膜；
(f)使该白蛋白融合蛋白通过阴离子交换膜以获得流通物；
(g)将该流通物应用至疏水相互作用基质；
(h)将该白蛋白融合蛋白从该疏水相互作用基质上洗脱以获得第三洗脱液，
其中该第三洗脱液包含该经纯化的白蛋白融合蛋白。
44.如权利要求1至41中任一项所述的方法，其中该白蛋白融合蛋白中的白蛋白是人血清白蛋白(HSA)。
45.如权利要求42所述的方法，其中该HSA是变体HSA。
46.如权利要求43所述的方法，其中该变体HSA的氨基酸序列是SEQ ID NO:133。
47.如权利要求1至44中任一项所述的方法，其中该白蛋白融合蛋白包含支架部分，该支架部分包含第三纤连蛋白III型(FnIII)结构域。
48.如权利要求45所述的方法，其中该FnIII结构域衍生自人类肌腱蛋白C(Tn3支架)。
49.如权利要求1至46中任一项所述的方法，其中该白蛋白融合蛋白包含支架。
50.如权利要求47所述的方法，其中该支架包含色氨酸残基。
51.如权利要求48所述的方法，其中该色氨酸残基的氧化降低该白蛋白融合蛋白的活性。
52.如权利要求47-49中任一项所述的方法，其中该支架与CD40L特异性结合。
53.如权利要求50所述的方法，其中该Tn3支架包含单一的CD40L特异性单体亚单位。
54.如权利要求51所述的方法，其中该Tn3支架包含两个串联的CD40L特异性单体亚单位。
55.如权利要求52所述的方法，其中该两个CD40L特异性单体亚单位是直接连接的。
56.如权利要求52所述的方法，其中该两个CD40L特异性单体亚单位通过接头连接。
57.如权利要求54所述的方法，其中该接头包含肽接头。
58.如权利要求55所述的方法，其中该肽接头包含(GmX)n序列，其中：
(a)X是丝氨酸(S)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、Leu(L)、异亮氨酸(I)或缬氨酸(V)；
(b)m和n是整数；
(c)m是1、2、3或4；并且
(d)n是1、2、3、4、5、6或7。
59.如权利要求56所述的方法，其中该肽接头包含SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQID NO:142或SEQ ID NO:143。
60.如权利要求45所述的方法，其中该Tn3支架包含β链，并且其中至少一个CD40L特异性单体亚单位的β链与SEQ ID NO:3的β链具有至少90％序列一致性。
61.如权利要求45所述的方法，其中该Tn3支架包含Aβ链，其中该Aβ链包含SEQ ID NO:11，除了至少一个突变以外。
62.如权利要求45所述的方法，其中该Tn3支架包含Bβ链，其中该Bβ链包含SEQ ID NO:12，除了至少一个突变以外。
63.如权利要求45所述的方法，其中该Tn3支架包含Cβ链，其中该Cβ链包含SEQ ID NO:13或14，除了至少一个突变以外，并且其中SEQ ID NO:13或14中的半胱氨酸不被取代。
64.如权利要求45所述的方法，其中该Tn3支架包含Dβ链，其中该Dβ链包含SEQ ID NO:15，除了至少一个突变以外。
65.如权利要求45所述的方法，其中该Tn3支架包含Eβ，其中该Eβ链包含SEQ ID NO:16，除了至少一个突变以外。
66.如权利要求45所述的方法，其中该Tn3支架包含Fβ，其中该Dβ链包含SEQ ID NO:17，除了至少一个突变以外，并且其中SEQ ID NO:17中的半胱氨酸不被取代。
67.如权利要求45所述的方法，其中该Tn3支架包含Gβ链，其中该Gβ链包含SEQ ID NO:18，除了至少一个突变以外。
68.如权利要求50至54中任一项所述的方法，其中该CD40L特异性单体亚单位包含以下氨基酸序列：
IEV(XAB)nALITW(XBC)nCELX1YGI(XCD)nTTIDL(XDE)nYSI(XEF)nYEVSLIC(XFG)nKETFTT
其中：
(a)XAB、XBC、XCD、XDE、XEF和XFG分别表示存在于AB、BC、CD、DE、EF和FG环的序列中的氨基酸残基；
(b)X1表示氨基酸残基A或T；并且，
(c)环的长度n是在2与26之间的整数。
69.如权利要求66所述的方法，其中该AB环的序列包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:136，该CD环的序列包含SEQ ID NO:6，并且该EF环的序列包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:137。
70.如权利要求67所述的方法，其中该BC环的序列包含选自下组的序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93和168。
71.如权利要求67所述的方法，其中该DE环的序列包含选自下组的序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:94、95、96、97、98和169。
72.如权利要求67所述的方法，其中该FG环的序列包含选自下组的序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:9、99、139和170。
73.如权利要求67所述的方法，其中该BC环的序列包含选自下组的序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117和174。
74.如权利要求67所述的方法，其中该DE环的序列包含选自下组的序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128和175。
75.如权利要求67所述的方法，其中该FG环的序列包含选自下组的序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:129、130和177。
76.如权利要求67所述的方法，其中：
(a)该BC环的序列包含SEQ ID NO:83，该DE环的序列包含SEQ ID NO:94，并且该FG环的序列包含SEQ ID NO:9或139；
(b)该BC环的序列包含SEQ ID NO:83，该DE环的序列包含SEQ ID NO:94，并且该FG环的序列包含SEQ ID NO:99；
(c)该BC环的序列包含SEQ ID NO:84，该DE环的序列包含SEQ ID NO:95，并且该FG环的序列包含SEQ ID NO:9或139；
(d)该BC环的序列包含SEQ ID NO:85，该DE环的序列包含SEQ ID NO:94，并且该FG环的序列包含SEQ ID NO:9或139；
(e)该BC环的序列包含SEQ ID NO:86，该DE环的序列包含SEQ ID NO:96，并且该FG环的序列包含SEQ ID NO:9或139；
(f)该BC环的序列包含SEQ ID NO:87，该DE环的序列包含SEQ ID NO:97，并且该FG环的序列包含SEQ ID NO:9或139；
(g)该BC环的序列包含SEQ ID NO:88，该DE环的序列包含SEQ ID NO:95，并且该FG环的序列包含SEQ ID NO:9或139；
(h)该BC环的序列包含SEQ ID NO:89，该DE环的序列包含SEQ ID NO:94，并且该FG环的序列包含SEQ ID NO:9或139；
(i)该BC环的序列包含SEQ ID NO:90，该DE环的序列包含SEQ ID NO:94，并且该FG环的序列包含SEQ ID NO:9或139；
(j)该BC环的序列包含SEQ ID NO:91，该DE环的序列包含SEQ ID NO:95，并且该FG环的序列包含SEQ ID NO:9或139；
(k)该BC环的序列包含SEQ ID NO:92，该DE环的序列包含SEQ ID NO:98，并且该FG环的序列包含SEQ ID NO:9或139；或
(l)该BC环的序列包含SEQ ID NO:93，该DE环的序列包含SEQ ID NO:94，并且该FG环的序列包含SEQ ID NO:9或139。
77.如权利要求67所述的方法，其中：
(a)该BC环的序列包含SEQ ID NO:100，该DE环的序列包含SEQ ID NO:118，并且该FG环的序列包含SEQ ID NO:129；
(b)该BC环的序列包含SEQ ID NO:101，该DE环的序列包含SEQ ID NO:119，并且该FG环的序列包含SEQ ID NO:129；
(c)该BC环的序列包含SEQ ID NO:102，该DE环的序列包含SEQ ID NO:120，并且该FG环的序列包含SEQ ID NO:129；
(d)该BC环的序列包含SEQ ID NO:103，该DE环的序列包含SEQ ID NO:121，并且该FG环的序列包含SEQ ID NO:129；
(e)该BC环的序列包含SEQ ID NO:104，该DE环的序列包含SEQ ID NO:122，并且该FG环的序列包含SEQ ID NO:129；
(f)该BC环的序列包含SEQ ID NO:105，该DE环的序列包含SEQ ID NO:121，并且该FG环的序列包含SEQ ID NO:129；
(g)该BC环的序列包含SEQ ID NO:106，该DE环的序列包含SEQ ID NO:123，并且该FG环的序列包含SEQ ID NO:129；
(h)该BC环的序列包含SEQ ID NO:107，该DE环的序列包含SEQ ID NO:123，并且该FG环的序列包含SEQ ID NO:129；
(i)该BC环的序列包含SEQ ID NO:108，该DE环的序列包含SEQ ID NO:118，并且该FG环的序列包含SEQ ID NO:129；
(j)该BC环的序列包含SEQ ID NO:109，该DE环的序列包含SEQ ID NO:123，并且该FG环的序列包含SEQ ID NO:129；
(k)该BC环的序列包含SEQ ID NO:110，该DE环的序列包含SEQ ID NO:121，并且该FG环的序列包含SEQ ID NO:129；
(l)该BC环的序列包含SEQ ID NO:111，该DE环的序列包含SEQ ID NO:123，并且该FG环的序列包含SEQ ID NO:130；
(m)该BC环的序列包含SEQ ID NO:108，该DE环的序列包含SEQ ID NO:121，并且该FG环的序列包含SEQ ID NO:129；
(n)该BC环的序列包含SEQ ID NO:112，该DE环的序列包含SEQ ID NO:124，并且该FG环的序列包含SEQ ID NO:129；
(o)该BC环的序列包含SEQ ID NO:113，该DE环的序列包含SEQ ID NO:125，并且该FG环的序列包含SEQ ID NO:129；
(p)该BC环的序列包含SEQ ID NO:114，该DE环的序列包含SEQ ID NO:118，并且该FG环的序列包含SEQ ID NO:129；
(q)该BC环的序列包含SEQ ID NO:115，该DE环的序列包含SEQ ID NO:126，并且该FG环的序列包含SEQ ID NO:129；
(r)该BC环的序列包含SEQ ID NO:116，该DE环的序列包含SEQ ID NO:127，并且该FG环的序列包含SEQ ID NO:129；或
(s)该BC环的序列包含SEQ ID NO:117，该DE环的序列包含SEQ ID NO:128，并且该FG环的序列包含SEQ ID NO:129。
78.如权利要求75所述的方法，其中该AB环包含SEQ ID NO:136。
79.如权利要求75所述的方法，其中该CD40L特异性单体亚单位包含选自下组的序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42和146。
80.如权利要求50至54中任一项所述的方法，其中该CD40L特异性单体亚单位包含以下氨基酸序列：
IEVKDVTDTTALITWX1DX2X3X4X5X6X7X8CELTYGIKDVPGDRTTIDLWX9HX10AX11YSIGNLKPDTEYEVSLICRX12GDMSSNPAKETFTT(SEQ ID NO:167)
其中：
(a)X1表示氨基酸残基丝氨酸(S)或亮氨酸(L)；
(b)X2表示氨基酸残基天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)；
(c)X3表示氨基酸残基组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、苯丙氨酸(F)或色氨酸(W)；
(d)X4表示氨基酸残基丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)；
(e)X5表示氨基酸残基谷氨酸(E)、亮氨酸(L)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、天冬氨酸(D)或天冬酰胺(N)；
(f)X6表示氨基酸残基苯丙氨酸(F)或酪氨酸(Y)；
(g)X7表示氨基酸残基异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、组氨酸(H)、谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)；
(h)X8表示氨基酸残基甘氨酸(G)、色氨酸(W)或缬氨酸(V)；
(i)X9表示氨基酸残基色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)或酪氨酸(Y)；
(j)X10表示氨基酸残基丝氨酸(S)、谷氨酰胺(Q)、甲硫氨酸(M)或组氨酸(H)；
(k)X11表示氨基酸残基色氨酸(W)或组氨酸(H)；并且，
(l)X12表示氨基酸残基精氨酸(R)或丝氨酸(S)。
81.如权利要求78所述的方法，其中该CD40L特异性单体亚单位包含选自下组的序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80和82。
82.如权利要求78所述的方法，其中该CD40L特异性单体亚单位包含以下氨基酸序列：
IEVX1DVTDTTALITWX2X3RSX4X5X6X7X8X9X10CELX11YGIKDVPGDRTTIDLX12X13X14X15YVHYSIGNLKPDTX16YEVSLICLTTDGTYX17NPAKETFTT
(SEQ ID NO:171)
其中：
(a)X1表示氨基酸残基赖氨酸(K)或谷氨酸(E)；
(b)X2表示氨基酸残基苏氨酸(T)或异亮氨酸(I)；
(c)X3表示氨基酸残基天冬酰胺(N)或丙氨酸(A)；
(d)X4表示氨基酸残基丝氨酸(S)、亮氨酸(L)、丙氨酸(A)、苯丙氨酸(F)或酪氨酸(Y)；
(e)X5表示氨基酸残基酪氨酸(Y)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)或丝氨酸(S)；
(f)X6表示氨基酸残基酪氨酸(Y)、丝氨酸(S)、丙氨酸(A)或组氨酸(H)；
(g)X7表示氨基酸残基天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、组氨酸(H)或酪氨酸(Y)；
(h)X8表示氨基酸残基亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)、组氨酸(H)或酪氨酸(Y)；
(i)X9表示氨基酸残基组氨酸(H)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)、亮氨酸(L)或天冬氨酸(D)；
(j)X10表示氨基酸残基甘氨酸(G)、苯丙氨酸(F)、组氨酸(H)
(k)或酪氨酸(Y)；
(l)X11表示氨基酸残基丙氨酸(A)或苏氨酸(T)；
(m)X12表示氨基酸残基丝氨酸(S)、天冬酰胺(N)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(R)或天冬氨酸(D)；
(n)X13表示氨基酸残基丝氨酸(S)、谷氨酰胺(Q)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)或丙氨酸(A)；
(o)X14表示氨基酸残基脯氨酸(P)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)或丙氨酸(A)或无氨基酸；
(p)X15表示氨基酸残基异亮氨酸(I)或无氨基酸；
(q)X16表示氨基酸残基谷氨酸(E)或赖氨酸(K)；并且，
(r)X17表示氨基酸残基丝氨酸(S)或天冬酰胺(N)。
83.如权利要求46所述的方法，其中该Tn3支架包含选自下组的序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:134、135、205、206、207和208。
84.如权利要求46所述的方法，其中该Tn3支架包含选自下组的序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:201、202、203和204。
85.如权利要求50所述的方法，其中该CD40L是人类CD40L。
86.如权利要求83所述的方法，其中该CD40L是膜结合CD40L(SEQ ID NO:1)、可溶性CD40L(SEQ ID NO:2)或其片段。
87.如权利要求50至84中任一项所述的方法，其中该支架结合CD40L并且阻止CD40L与CD40结合。
88.如权利要求50至85中任一项所述的方法，其中该支架结合CD40L并且破坏介导信号传导的CD40。
89.如权利要求50至86中任一项所述的方法，其中该支架以约1μM或更小、或约500nM或更小、或约100nM或更小、或约50nM或更小、或约25nM或更小、或约10nM或更小、或约5nM或更小或约2nM或更小的亲和力(Kd)与CD40L结合。
90.如权利要求50至87中任一项所述的方法，其中CD40L特异性单体亚单位与CD40L表位特异性结合，该CD40L表位包含位于SEQ ID NO:2的位置142至155、200至230或247至251处的氨基酸。
91.一种通过如权利要求1至88中任一项所述的方法获得的白蛋白融合蛋白组合物。
92.如权利要求89所述的组合物，其中该经纯化的白蛋白融合蛋白的相对效力>90％。
93.一种包含白蛋白融合蛋白的组合物，其中该组合物具有少于20ng/mg的宿主细胞蛋白，并且其中少于15％的色氨酸残基被氧化。
94.如权利要求91所述的组合物，其中少于5％的色氨酸残基被氧化。
95.如权利要求94所述的组合物，其中相对于整个蛋白质少于5％的氨基酸残基被氧化。
96.一种包含白蛋白融合蛋白的组合物，其中该组合物具有少于5x10-3ng/mg的DNA，并且其中少于15％的色氨酸残基被氧化。
97.如权利要求94所述的组合物，其中少于5％的色氨酸残基被氧化。
98.如权利要求95所述的组合物，其中相对于整个蛋白质少于20％的氨基酸残基被氧化。
99.一种包含白蛋白融合蛋白的组合物，其中该组合物具有少于20ng/mg的宿主细胞蛋白，并且其中该白蛋白融合蛋白具有>90％的相对活性。
100.一种包含白蛋白融合蛋白的组合物，其中该组合物具有少于5x10-3ng/mg的DNA，并且其中该白蛋白融合蛋白具有>90％的相对活性。
101.一种包含SEQ ID NO:134、135、201、202、203、204、205、206、207或208的白蛋白融合蛋白的组合物，其中该组合物具有少于20ng/mg的宿主细胞蛋白，并且其中位置46、151或两个位置处的色氨酸不被氧化。
102.一种药学上可接受的配制品，该配制品包含：
(a)如权利要求90至99中任一项所述的组合物；
(b)缓冲液；
(c)糖；以及
(d)乳化剂。
103.如权利要求100所述的配制品，其中该缓冲液是磷酸钠缓冲液，该糖是蔗糖，并且该乳化剂是聚山梨醇酯80。
104.如权利要求100或权利要求101所述的配制品，其中该配制品被冻干。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110295152A (zh) * 2019-07-29 2019-10-01 北京泓恩生物科技有限公司 一种重组产朊假丝酵母尿酸酶的纯化方法
CN112062833A (zh) * 2020-10-09 2020-12-11 国药集团武汉血液制品有限公司 一种从血浆组分ⅳ沉淀中提取人血白蛋白的方法
CN113286806A (zh) * 2018-11-09 2021-08-20 尼欧派普制药有限两合公司 治疗压力、免疫反应和中风综合征的多肽
CN114401994A (zh) * 2019-12-06 2022-04-26 瑞泽恩制药公司 抗vegf蛋白组合物及其制备方法
CN115677848A (zh) * 2022-10-24 2023-02-03 通化安睿特生物制药股份有限公司 一种制备高纯度高稳定性蛋白质的方法
US12103960B2 (en) 2020-05-08 2024-10-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. VEGF traps and mini-traps and methods for treating ocular disorders and cancer

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013055745A2 (en) 2011-10-11 2013-04-18 Medimmune, Llc Cd40l-specific tn3-derived scaffolds and methods of use thereof
KR20210010890A (ko) 2018-05-16 2021-01-28 립 테라퓨틱스, 엘엘씨 Pcsk9 결합 분자를 포함하는 조성물 및 사용 방법
CN115996940A (zh) * 2020-07-01 2023-04-21 免疫医疗有限责任公司 用于纯化生物治疗剂的洗涤剂和方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0570916A2 (en) * 1992-05-20 1993-11-24 The Green Cross Corporation Recombinant human serum albumin, process for producing the same and pharmaceutical preparation containing the same
CN1902224A (zh) * 2003-12-04 2007-01-24 Cj株式会社 纯化β－干扰素的方法
CN102549012A (zh) * 2009-05-07 2012-07-04 诺维信生物制药丹麦公司 纯化白蛋白的方法

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
EP0527809B1 (en) 1990-04-05 1995-08-16 CREA, Roberto Walk-through mutagenesis
US7063943B1 (en) 1990-07-10 2006-06-20 Cambridge Antibody Technology Methods for producing members of specific binding pairs
US5843701A (en) 1990-08-02 1998-12-01 Nexstar Pharmaceticals, Inc. Systematic polypeptide evolution by reverse translation
US5866344A (en) 1991-11-15 1999-02-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Antibody selection methods using cell surface expressed libraries
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
US5922545A (en) 1993-10-29 1999-07-13 Affymax Technologies N.V. In vitro peptide and antibody display libraries
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US6699658B1 (en) 1996-05-31 2004-03-02 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
EP0985039B1 (en) 1997-06-12 2008-02-20 Novartis International Pharmaceutical Ltd. Artificial antibody polypeptides
WO2000032823A1 (en) 1998-12-02 2000-06-08 Phylos, Inc. Dna-protein fusions and uses thereof
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US6429300B1 (en) 1999-07-27 2002-08-06 Phylos, Inc. Peptide acceptor ligation methods
US7022479B2 (en) 2000-01-24 2006-04-04 Compound Therapeutics, Inc. Sensitive, multiplexed diagnostic assays for protein analysis
WO2003000856A2 (en) 2001-06-21 2003-01-03 Phylos, Inc. In vitro protein interaction detection systems
BRPI0513155B1 (pt) 2004-07-06 2021-07-20 Bioren, Inc. Método de distinguir um ou mais resíduos de aminoácido funcionais dos resíduos de aminoácido não-funcionais em uma região definida dentro de um polipeptídeo, método de gerar uma biblioteca de análogos de polipeptídeo e método de identificar um subconjunto de análogos de polipeptídeo tendo uma propriedade desejada
EP1976876A4 (en) 2005-12-22 2010-01-13 Conjuchem Biotechnologies Inc PROCESS FOR PRODUCING PREFORMED ALBUMIN CONJUGATES AND THERAPEUTIC AGENT
CN102014888A (zh) 2007-07-03 2011-04-13 达努塔·克鲁谢夫斯卡 α-酮戊二酸的新医药用途
JP5781762B2 (ja) 2007-08-10 2015-09-24 プロテリックス、インク ユニバーサルｉｉｉ型フィブロネクチン結合ドメインのライブラリ
RU2010121967A (ru) 2007-10-31 2011-12-10 Медиммун, Ллк (Us) Белковые каркасные структуры
US8278419B2 (en) 2008-10-31 2012-10-02 Centocor Ortho Biotech Inc. Fibronectin type III domain based scaffold compositions, methods and uses
WO2010093627A2 (en) 2009-02-12 2010-08-19 Centocor Ortho Biotech Inc. Fibronectin type iii domain based scaffold compositions, methods and uses
AU2010311332B2 (en) 2009-10-30 2015-04-23 Albumedix Ltd. Albumin variants
KR20130020765A (ko) 2010-02-16 2013-02-28 메디뮨 엘엘씨 Ｈｓａ-관련 조성물 및 사용방법
US20130079280A1 (en) 2010-04-13 2013-03-28 Medlmmune, Llc Fibronectin type iii domain-based multimeric scaffolds
EP2675471A4 (en) 2011-02-15 2015-01-28 Medimmune Llc HSA-RELATED COMPOSITIONS AND USE PROCESSES
WO2013055745A2 (en) * 2011-10-11 2013-04-18 Medimmune, Llc Cd40l-specific tn3-derived scaffolds and methods of use thereof
MX2015005363A (es) * 2012-11-08 2015-11-06 Novozymes Biopharma Dk As Variantes de albumina.

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0570916A2 (en) * 1992-05-20 1993-11-24 The Green Cross Corporation Recombinant human serum albumin, process for producing the same and pharmaceutical preparation containing the same
CN1902224A (zh) * 2003-12-04 2007-01-24 Cj株式会社 纯化β－干扰素的方法
CN102549012A (zh) * 2009-05-07 2012-07-04 诺维信生物制药丹麦公司 纯化白蛋白的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DANIELBOYD ET AL.: "HIC resolution of an IgG1 with an oxidized Trp in a complementarity determining region", 《JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY B》 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113286806A (zh) * 2018-11-09 2021-08-20 尼欧派普制药有限两合公司 治疗压力、免疫反应和中风综合征的多肽
CN110295152A (zh) * 2019-07-29 2019-10-01 北京泓恩生物科技有限公司 一种重组产朊假丝酵母尿酸酶的纯化方法
US11732025B2 (en) 2019-12-06 2023-08-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-VEGF protein compositions and methods for producing the same
CN114401994A (zh) * 2019-12-06 2022-04-26 瑞泽恩制药公司 抗vegf蛋白组合物及其制备方法
US11649273B2 (en) 2019-12-06 2023-05-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-VEGF protein compositions and methods for producing the same
US11753459B2 (en) 2019-12-06 2023-09-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-VEGF protein compositions and methods for producing the same
US12012444B2 (en) 2019-12-06 2024-06-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-VEGF protein compositions and methods for producing the same
US12054533B2 (en) 2019-12-06 2024-08-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-VEGF protein compositions and methods for producing the same
US12054532B2 (en) 2019-12-06 2024-08-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-VEGF protein compositions and methods for producing the same
US12077570B2 (en) 2019-12-06 2024-09-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-VEGF protein compositions and methods for producing the same
US12103960B2 (en) 2020-05-08 2024-10-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. VEGF traps and mini-traps and methods for treating ocular disorders and cancer
CN112062833A (zh) * 2020-10-09 2020-12-11 国药集团武汉血液制品有限公司 一种从血浆组分ⅳ沉淀中提取人血白蛋白的方法
CN115677848A (zh) * 2022-10-24 2023-02-03 通化安睿特生物制药股份有限公司 一种制备高纯度高稳定性蛋白质的方法

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