CN110295152A

CN110295152A - 一种重组产朊假丝酵母尿酸酶的纯化方法

Info

Publication number: CN110295152A
Application number: CN201910689377.5A
Authority: CN
Inventors: 孙昌荣; 李利华; 李慎涛; 王志
Original assignee: Beijing Grace Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Beijing Grace Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-07-29
Filing date: 2019-07-29
Publication date: 2019-10-01

Abstract

本发明公开了一种重组产朊假丝酵母尿酸酶的纯化方法，属于生物技术领域。具体涉及一种重组产朊假丝酵母尿酸酶的纯化方法，即将表达重组蛋白的细胞上清依次经过聚乙烯亚胺絮凝、硫酸铵盐析、阴离子交换层析、阳离子交换层析、层析脱盐、冷冻干燥得到高纯度重组产朊假丝酵母尿酸酶。本发明具有生产周期短、目的产物纯度高、部分产品质量指标得到了有效改进，整个工艺过程具有易于控制和规模化放大生产等特点。

Description

一种重组产朊假丝酵母尿酸酶的纯化方法

技术领域

本发明涉及利用重组DNA技术生产基因工程药物，具体涉及一种来源于产朊假丝酵母的尿酸酶重组蛋白的纯化方法，属于生物技术领域。

背景技术

随着社会经济的发展，人们的生活水平、生活方式、饮食结构都出现了变化，我国高尿酸血症发病率逐年上升。据估计，目前我们国家大概有高尿酸血症患者1.2亿，并逐渐呈年轻化趋势，仅次于糖尿病，成为第二大代谢性疾病，并且加入了“四高”的行列（高血糖、高血脂、高血压、高尿酸），已引起了人们广泛的重视。

据研究资料报道，在哺乳类动物体内，尿酸会首先代谢转换为尿酸氧化中间产物，再经尿酸氧化酶进一步作用转化为尿囊素和CO2，然后排出体外，这样就不会造成尿酸蓄积。但是人和大多数的灵长类动物( 如大猩猩、猿等) 在进化过程中受到相关基因的自然突变，编码尿酸酶的基因发生了变化，不能合成有生物活性的尿酸酶，从而导致代谢能力减弱，只能将少量尿酸经肾脏排出体外，同时由于现代人的生活方式和饮食结构发生变化，尿酸代谢量又明显增加，从而产生了大量的高尿酸血症患者。

近年来，国外已上市了基因工程尿酸酶(Rasburicase)，其cDNA来源于黄曲霉，在酿酒酵母中表达，降解尿酸的效果良好，但存在用量大(0.2mg/kg 体重)的弊端，而且过程中伴有许多不良反应，如发热、恶心、呕吐、皮疹、头痛和过敏等缺点，到目前为止，只有法国Sanofi-Synthelabo公司的产品获准上市，但仍未进入中国市场。针对此现象，国内一些研究机构和企业也开展了相关研究，如：在专利《一种重组尿酸酶的制备方法》（申请号：201410535887.4）中就公开了一种适合大肠杆菌分泌表达重组产朊假丝酵母尿酸酶(Uricase,EC1.7.3.3) 核苷酸序列及从该工程细胞纯化重组产朊假丝酵母尿酸酶的方法，但由于在该技术方案中采用了凝胶过滤层析步骤，此凝胶过滤步骤存在上样量限制（一般为柱体积的2～5%左右），存在单位处理量小、生产成本高的缺点及同时伴有宿主细胞残留DNA超标的工艺缺点，方案急需改善。

发明内容

有鉴于此，本发明根据工业化生产要求，提供一种重组产朊假丝酵母尿酸酶制备的生产方法：该方法在菌体破碎后，首先采用聚乙烯亚胺（Polyethyleneimine，PEI）絮凝，去除宿主核酸，降低溶液粘度、宿主DNA残留和后续层析的操作负荷，然后利用重组产朊假丝酵母尿酸酶与杂蛋白的理化性质差异，直接采用阴离子交换穿透，即可获得纯度比较高的重组蛋白，但为了进一步保证产品质量，我们又通过阳离子交换层析有效避免了产品中聚合体存在的风险，解决了原有工艺存在单位批次处理量小，生产周期长，部分产品质量指标不合格的缺点。本发明采用的技术方案，具体由以下步骤组成：

（1）菌体破碎：按质量体积比1∶5-50重悬于破菌缓冲液（ 1×PBS，pH为7-8）中破碎，高速离心，得上清备用;所述步骤(1)，菌体破碎可采取超声、均质以及溶菌酶等多种破菌方式;

（2）PEI絮凝去除核酸：在（1）破菌离心上清中，加入终浓度为 0.2-0.5%(V/V)的聚乙烯亚胺（MW70000），搅拌絮凝后，离心收集上清备用;

（3）硫酸铵盐析浓缩：按照终浓度60-70% 饱和硫酸铵要求，在（2）制备的上清中加入相应克重硫酸铵粉末，充分搅拌絮凝，待盐析结束后，离心得到蛋白沉淀并采用（4）缓冲液A复溶备用;

（4）阴离子交换层析；

缓冲液A的制备：25 mmol Tris-HCl，pH为8.0；

缓冲液B的制备：25 mmol Tris-HCl、1mol/L氯化钠，pH为8.0；

通过调整和控制平衡缓冲液及样品液的电导≥3.2ms/cm，采用缓冲液A进行填料平衡后，采取柱上直接流穿方式，收集流穿目的峰;

所述步骤（4）阴离子交换层析所用填料，可选择采用DEAE sephrose, Q sepharose ，DEAE-Cellulose，DEAE-Sephacel，Q-Cellulose，Q-Sephacel填料;

（5）阳离子交换层析；

填料平衡后，调整阴离子收集液的PH和电导后，直接上样，待冲洗至基线后，可进行线性或梯度洗脱;

所述步骤（5）阳离子交换层析填料，可采用CM sephrose, SP sepharose ，CM -Cellulose，CM -Sephacel，SP -Cellulose，SP—Sephacel;

（6）置换缓冲液

采用sephadex G25脱盐柱进行缓冲液置换;

(7）制剂冻干；

根据成品配方，进行冻干前原液调配并分装，置于-80℃预冻2小时以上后，采用冷冻干燥备用。

优选的，步骤(4)中所述，阴离子交换层析优选Q-Sepharose FF。

优选的，步骤(4)中所述缓冲液A配方和样品液通过添加氯化钠控制电导在 3.2-3.5ms/cm，这样即可能保证蛋白纯度又可避免内毒素和核酸被洗脱。

优选的，步骤(5)中所述，阳离子交换层析优选SP阳离子交换。

优选的，步骤(5)中所述，采用0-6%B线性洗脱，收集目的洗脱峰。

优选的，步骤(7）成品配方采用每毫升缓冲液（2.6-14.3克磷酸氢二钠/100ml纯化水）中含1.5mg重组尿酸氧化酶（Uricase）、10.6mg 甘露醇，15.9mg L-丙氨酸;

综上所述，本发明方案达到初步纯化的目的，层析处理量不再受5%的上样量限制。相比，整个生产周期缩短了30%，单支成本降低了40%，同样获得了高质量的产品，经检测，本发明制备的重组产朊假丝酵母尿酸酶电泳可以达到95%以上，外源性DNA残留量也大大减小，指标也符合了药典要求。与原发明相比，本发明处理量大、生产周期短、目的产物纯度高、部分产品质量指标得到了明显改进，整个工艺方案具有易于控制和规模化放大等特点。

附图说明

图1是重组蛋白表达图

1：重组蛋白诱导前全菌蛋白；2：重组蛋白诱导3小时全菌蛋白；3：重组蛋白诱导7小时全菌蛋白；

图2是阴离子层析色谱图；

图3是阳离子层析色谱图；

图4 是阴阳离子层析目的峰SDS-PAGE（15%分离胶）分析图；

1：预染蛋白Marker；2：阴离子层析蛋白峰1（流穿）；3：阳离子层析蛋白峰2（洗脱）；

图5是成品冻干粉复溶SDS-PAGE（12%分离胶）纯度分析图

1：预染蛋白Marker；2：冻干粉复溶样品。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

参照专利CN104342415 A提供方法发酵结束后，离心收集菌体，进行SDS-PAGE蛋白表达分析，见图1，由泳3可以看出重组蛋白在有明显诱导表达，并采用1×PBS缓冲液重悬清洗菌体一遍后，离心菌泥冻存备用或直接处理。

实施实例1

（1）菌体破碎：

按菌体质量体积比1∶10（g（湿重）/ml）加入破碎缓冲液(1×PBS+1 mmol DTT+1mmolPMSF+pH8.0), 高压均质机（AH2010, ATS）700-1000bar条件下破碎两遍，离心收集上清备用，注意整体过程低温控制。

（2）PEI絮凝去除核酸

5%聚乙烯亚胺（Mw=70000）母液的配制：取10 mL PEI(50%), 用双蒸水或超纯水H₂O 稀释至70 mL，并以浓盐酸调节pH至7.9。最后以双蒸水或超纯水H₂O 定容至终体积为100mL。

在离心上清中，按照终浓度为 0.2%(V/V)的加入量，加入5%聚乙烯亚胺母液，搅拌器搅拌10-30分钟，离心8000转30分钟，收集上清备用，下方大量絮状沉淀去掉。

（3）硫酸盐析浓缩

根据终浓度70% 饱和硫酸铵浓度，上清中加入相应克重硫酸铵（按47克/100ml上清加），少量多次溶解后静置过夜，8000转30分钟离心后，去除上清，沉淀采用（4）阴离子交换缓冲液A液溶解，控制溶解液电导处于3.2-3.5ms/cml，然后高速离心处理并经0.45um微孔滤膜过滤，滤液备用。

（4）阴离子交换层析；

缓冲液A的制备：25 mmol Tris-HCl，pH为8.0

缓冲液B的制备：25 mmol Tris-HCl、1mol/L氯化钠，pH为8.0

先采用作为缓冲液B冲洗Q-Sepharose FF(GE Healthcare)柱10个柱体积，然后再采用缓冲液A进行预平衡，直至电导和UV值基线稳定为止。然后进行盐析复溶后调配液上样，收集流穿液峰1，SDS-PAGE纯度见图4泳道2,然后再分别采用100%B和0.5mol/L氢氧化钠清洗柱子，得到峰2及峰3。

（4）阳离子交换层析；

缓冲液A的制备：20 mmol T磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液，pH为6.0；

缓冲液B的制备：20 mmol 磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、1mol/L氯化钠，pH为6.0

先采用作为缓冲液B冲洗TOSOH SP-650M (TOYOPEARL)柱10个柱体积，然后再采用缓冲液A进行预平衡，直至电导和UV值基线稳定为止。对（3）收集的穿透液的pH调整为6.0，然后采用缓冲液A稀释1倍，进行上样，层析过程见图3，峰1为流穿峰；峰2为采用0-6%B线性洗脱，经检验为目的峰，SDS-PAGE纯度见图4泳道3；峰3为100%B洗脱峰，峰4为0.5mol/L 氢氧化钠洗脱峰。

（7）置换缓冲液；

缓冲液配制：称量14.0克磷酸氢二钠，采用纯水定容至100ml。

采用sephadex G25 (GE Healthcare)脱盐柱进行缓冲液置换。

（8）制剂冻干；

根据终浓度：每毫升中含1.5mg重组尿酸氧化酶（Uricase）、10.6mg 甘露醇，15.9mg L-丙氨酸，进行冻干前原液调配，分装后，置于-80℃预冻2小时以上，然后采用冷冻干燥机冻干后保存备用，取1支采用纯化水溶解后，进行产品蛋白纯度SDS-PAGE分析，纯度可达95%以上，见图5泳道2。

实施例2重组尿酸酶的活性测定

活性分析：酶活定义：在30℃、pH8.9的条件下，每1umol尿酸分解所需要的酶量，定义为一个活性单位。样品管：加入2ml 0.2umol/ml尿酸贮存液，2.5ml 三乙醇胺缓冲液( 7.5g三乙醇胺，0.38g EDTA，定容至1L，pH8.9)，30℃预热5min，加入1ml待测样品，30℃反应5min，加入0.5ml 3.5mol/L硫酸终止反应，292nm测定吸光度。试剂空白：样品管中加入2ml尿酸贮存液，2.5mlTEA，30℃预热5min，加入与样品同体积的TEA缓冲液，30℃反应5min，加入0.5ml3.5mol/L硫酸终止反应，292nm测定吸光度。根据标准曲线及下面公式计算酶的活性：

样品比活性（U/mg） =

(注：体积单位为ml，时间单位为min，浓度单位为mg/ml。)，根据实验结果，冻干产品样品比活为29.82U/mg。

实施例3外源性DNA残留量测定

根据专利提供技术方案分别制备尿酸酶冻干粉，然后按照《中国药典2015》通则3407检测外源性DNA残留量，试剂盒采用E.coli宿主细胞DNA残留检测试剂盒（SK030202e100，中检院生产），由斑点杂点试验检测结果可知，本发明方案产品的残留明显低于指示阳性斑点10ng/1.5mg，整体好于对照专利制备的产品（处于20～50ng/1.5mg），产品外源性DNA残留量检测，指标合格。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims

1.一种重组产朊假丝酵母尿酸酶的纯化方法，其特征在于：其具体步骤为：

（1）菌体破碎：按质量体积比1∶5-50重悬于pH为7-8， 1×PBS缓冲液中破碎，高速离心，得上清备用;

所述步骤(1)，菌体破碎可采取超声、均质以及溶菌酶等破菌方式;

（2）PEI絮凝去除核酸

在破菌离心上清中，加入终浓度为 0.2-0.5%(w/v)的聚乙烯亚胺（MW70000），搅拌絮凝后，离心收集上清备用;

（3）硫酸铵盐析浓缩

按照终浓度为60-70% 饱和硫酸铵浓度，在（2）制备的上清中加入相应克重硫酸铵粉末，搅拌絮凝，待盐析结束后，离心得到沉淀采用25 mmol Tris-HCl，pH为8.0缓冲液复溶备用;

（4）阴离子交换层析；

缓冲液A的制备：25 mmol Tris-HCl，pH为8.0

缓冲液B的制备：25 mmol Tris-HCl、1mol/L氯化钠，pH为8.0

采用缓冲液A进行填料平衡后，通过调整和控制平衡缓冲液及样品液的电导值，采取柱上直接流穿方式，收集相应目的峰;

（5）阳离子交换层析；

缓冲液A的制备：20 mmol 磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液，pH为6.0；

缓冲液B的制备：20 mmol 磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、1mol/L氯化钠，pH为6.0；

先采用作为缓冲液B冲洗 CM Sepharose Fast Flow (GE Healthcare)柱10个柱体积，然后再采用缓冲液A进行预平衡，直至电导和UV值基线稳定为止；对（4）收集的穿透液的pH调整为6.0，然后采用缓冲液A稀释1倍，进行上样，待冲洗至基线后，进行线性或梯度洗脱;

所述步骤（5）阳离子交换层析填料，可采用CM sephrose, SP sepharose ，CM-Cellulose，CM-Sephacel，SP-Cellulose，SP-Sephacel;

（6）置换缓冲液

采用sephadex G25脱盐柱进行缓冲液（2.6-14.3克磷酸氢二钠/100ml纯化水）置换;

（7）制剂冻干；

根据成品配方，调配并分装，置于-80℃预冻2小时以上后，采用冷冻干燥备用。

2. 根据权利要求2所述的一种重组产朊假丝酵母尿酸酶的纯化方法，其特征在于：步骤(4)中所述，阴离子交换层析优选Q-Sepharose FF。

3.根据权利要求2所述的一种重组产朊假丝酵母尿酸酶的纯化方法，其特征在于：通过调整和控制（4）阴离子交换层析平衡缓冲液及样品液的电导值处于3.2-3.5ms/cm之间。

4.根据权利要求3所述的一种重组产朊假丝酵母尿酸酶的纯化方法，其特征在于：步骤(5)中所述，阳离子交换层析优选SP阳离子交换。

5.根据权利要求4所述的一种重组产朊假丝酵母尿酸酶的纯化方法，其特征在于：采用0-6%B线性洗脱，收集目的洗脱峰。

6.根据权利要求5所述的一种重组产朊假丝酵母尿酸酶的纯化方法，其特征在于：步骤（7）成品配方采用每毫升缓冲液（2.6-14.3克磷酸氢二钠/100ml纯化水）中含1.5mg重组尿酸氧化酶（Uricase）、10.6mg 甘露醇，15.9mg L-丙氨酸。