CN112662640A - 一种具有催化活性的尿酸氧化酶 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有催化活性的尿酸氧化酶，采用基因工程技术改造而获得的具有催化活性的“复活”人源尿酸氧化酶氨基酸序列以及编码该蛋白的核苷酸序列、含该核苷酸序列的载体、含该载体的宿主细胞，运用基因工程技术制备该“复活”蛋白的方法以及修饰该蛋白所获得的产物。本发明的尿酸氧化酶既具有良好的酶活性、稳定性，其编码序列又保持了与人体尿酸氧化酶假基因的高度同源性，具有制备成低免疫原性甚至无免疫原性降尿酸药物或药物组合物的良好前景。

Description

一种具有催化活性的尿酸氧化酶

技术领域

本发明涉及一种具有催化活性的尿酸氧化酶，采用基因工程技术改造而获得的具有催化活性的“复活”人源尿酸氧化酶，属于生物技术领域。

背景技术

尿酸(Uric Acid)作为人体嘌呤代谢的终产物，当其代谢紊乱或排泄减少，长期过度饱和的单钠尿酸盐(monosodium urate，MSU)晶体沉积于关节腔内或软组织，诱发局部炎症反应和组织破坏，形成痛风(gout)这一最普遍的关节炎发作，其症状包括急性发作性关节炎、痛风石形成、痛风石性慢性关节炎、尿酸盐肾病和尿酸性尿路结石，重者可造成关节残疾和肾功能不全。此外，痛风伴发高血压、高脂血症、Ⅱ型糖尿病及心血管病等临床疾病(Ragab G,Elshahaly M,Bardin T.Journal of Advanced Research.2017:495-511)。尽管世界各国痛风患病率虽然随各国经济水平及饮食习惯的不同存在一定的差异，但大多呈不断上升趋势。美国全国健康和营养调查(NHANES)发现，2015-2016年，美国成年公民中痛风患病率率为3.9％(Michael Chen-Xu,Chio Yokose,Sharan K Rai.ArthritisRheumatol.2019.71(6):991-999)。南澳大利亚South Australian Health OmnibusSurvey(SAHOS)数据显示，2015年澳大利亚国民痛风患病率已从2005年的5.8％增长至2015年多的6.8％(Huai Leng Pisaniello,Susan Lester,David Gonzalez-Chica.ArthritisRes Ther.2018.20(1):143)。与之相似，刘等人通过统计分析中国痛风及高尿酸血症的流行病学研究发现，2000-2005年中国大陆痛风患病率为0.9％，至2014年痛风患病率为1.1％，2016年已达到1.3％(Chen,Y.Z.et al.J Public Health.2017；25:521–529)。因此，寻找有效的治疗手段势在必行。

目前，痛风治疗的降尿酸疗法(urate-lowering therapy,ULT)包括三类，主要分为以黄嘌呤氧化酶为靶点的抑制尿酸生成药物(Xanthine oxidase inhibitors,XOIs)、以URAT1为靶点抑制肾尿酸重吸收的促进尿酸排泄药物(Uricosurics)以及尿酸氧化酶类药物(Uricases)(Strilchuk L,Fogacci F,Cicero AF.Expert Opinion on DrugSafety.2019:1-11)。这三类药物均存在降尿酸治疗达标率不高、禁忌症以及各自的副作用。抑制尿酸生成药物别嘌呤醇存在皮疹、史蒂文.约翰逊综合征以及别嘌呤醇过敏综合征(AHS)等副作用，而非布索坦具有腹泻、恶心等副作用。促进尿酸排泄药物除存在增加尿结石风险这一共同缺点之外，丙磺舒与多种药物存在相互作用，包括非甾体抗炎药、β-内酰胺类药物以及肝素等；而苯溴马隆则可能会导致肝功能异常，严重者甚至导致肝功能衰竭致死。而尿酸氧化酶能高效催化尿酸为溶解度更高的尿囊素，且能快速溶解已经沉积的尿酸结石，在痛风及高尿酸血症的治疗中具有无可替代的优势。

尿酸氧化酶来源非常广泛，如细菌、真菌、哺乳动物等。其中，微生物来源的尿酸氧化酶具有较高的活性及稳定性，因而这一类尿酸氧化酶最先被尝试用于治疗高尿酸血症以及痛风。然而，由于微生物来源的尿酸氧化酶具有过高的免疫原性，故1975年法国批准黄曲霉(Aspergillusflavus)来源的天然尿酸氧化酶(Uricozyme)，2001年欧洲上市的黄曲霉来源的重组尿酸氧化酶Rasburicase

以及2002年在美国上市

仅被用于肿瘤溶解综合症引起的高尿酸血症和肾衰病人(Alakel N,Middeke JM,et al.OncoTargets Ther.2017.10:597-605.)。为降低免疫原性，与人同源性更高的尿酸氧化酶蛋白成为尿酸氧化酶类药物发展的新方向。2010年，美国FDA批准了PEG修饰的猪-狒狒嵌合体尿酸氧化酶Pegloticase(Krystexxa)上市，Krystexxa被用于常规治疗无效的痛风病人。在临床Ⅲ期试验中，212位受试病人有35～42％尿酸水平恢复正常，痛风石消失，但是89％的病人产生了PEG抗体和大约一半的受试者无效(Baraf H S B,Yood R A,Ottery F D,etal.Journal of Clinical Rheumatology.2014.20(8):427)。因而，需要开发免疫原性更低的尿酸氧化酶制剂。

在动物体内，其尿酸的水平仅为人类的1/7～1/3，其原因是由于其体内存在有能够把尿酸进一步分解为极易溶解的尿囊素的尿酸氧化酶。人类遗传学研究表明，在人类进化过程中，尿酸氧化酶基因出现了多次突变，导致其不能表达有功能的蛋白质，形成了人尿酸氧化酶单一假基因。然而在研究中，Kratzer JT(James T.Kratzer,Miguel A.Lanaspa,et al.PNSA.2014,(111):3763–3768)及Lange CM等人的研究表明，作为单一假基因的一员，尿酸氧化酶假基因虽然无法表达具有活性的尿酸氧化酶蛋白，但在人体内仍能够转录生成完整的mRNA产物。Akhilesh Pande(Na C H,Sharma N,Madugundu AK,etal.Molecular&Cellular Proteomics.2019.18(7):1382-1395)则在人体汗腺组织中发现了尿酸氧化酶的两条短肽，说明尿酸氧化酶假基因转录的mRNA能够部分翻译。因而，与人尿酸氧化酶假基因推导出来的氨基酸序列同源性越高，用于治疗的尿酸氧化酶蛋白的免疫原性可能越低且体内稳定性提高。由此可见“复活”的人源尿酸氧化酶可能治疗痛风与高尿酸血症的理想药物。

发明人曾于2014年2月11日申请了申请号为201410048071.9、申请公布号为CN103834623A、名称为《具有催化活性的人源尿酸氧化酶》的中国发明专利申请，其中对人尿酸氧化酶进行具体位点氨基酸残基替换、或者进行外显子位点氨基酸残基替换，并最终获得了具有催化活性的人源尿酸氧化酶。此后，发明人将研究重点转向获得同时具有更高催化活性以及与人尿酸氧化酶假基因推到出来得氨基酸序列更高同源性的人源尿酸氧化酶。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的问题，提供一种基于人尿酸氧化酶假基因序列进行改造而获得的有活性的“复活”人源尿酸氧化酶。与发明人之前的成果相比，在保留较好的催化活性同时，进一步提高了与人体尿酸氧化酶假基因的同源性。

发明解决其技术问题的技术方案如下：

一种具有催化活性的尿酸氧化酶，具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，该酶的序列是将SEQ ID NO：2所示人尿酸氧化酶假基因序列进行若干密码子替换后翻译所得的重组尿酸氧化酶氨基酸序列；所述若干位点密码子替换由2个终止密码子以及15个氨基酸密码子定点替换组成。

所述终止密码子替换选自：

第33位及187位终止密码子TGA替换为精氨酸密码子(优选地，替换为CGA)。

所述氨基酸密码子替换选自：

第E83G、G91A、M112V、H119R、G121E、C202G、K208E、I214V、L217I、M219L、S222F、L232S、T233P、C240Y及A252E位氨基酸密码子替换。

优选地，所述若干位点氨基酸残基替换由2个终止密码子以及15个氨基酸密码子定点替换组成。

优选地，所述尿酸氧化酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：1或与SEQ ID NO：1具有95％以上的同源性。

本发明还保护编码前文所述的尿酸氧化酶的核苷酸序列。

本发明还保护含有前文所述的核苷酸序列的表达载体、表达盒或宿主细胞。

其中，所述宿主细胞含有前文的所述的表达载体。

优选的，所述载体为质粒、穿梭质粒载体、慢病毒载体以及腺病毒载体中的任一种。

优选的，所述宿主细胞选自原核生物细胞、真核生物细胞、Sf9昆虫细胞、CHO细胞中的任一种；

更优选的，所述原核生物细胞为大肠杆菌细胞，所述真核生物细胞为酵母细胞。

本发明还提供前文所述尿酸氧化酶用于制备降尿酸药物或药物组合物的用途。

本发明还提高含有前文所述尿酸氧化酶的药物组合物。

制备前文所述尿酸氧化酶的方法，包括：采用前文所述的宿主细胞表达上文所述尿酸氧化酶，然后经分离、纯化后获得尿酸氧化酶。

与现有技术相比，本发明的“复活”人源尿酸氧化酶在保留良好的催化活性同时，进一步提高了与人体尿酸氧化酶假基因的同源性；具有制备成低免疫原性甚至无免疫原性降尿酸药物或药物组合物的良好前景。

附图说明

图1为尿酸氧化酶rhUOX-17Mutant(resurrected human-source urate oxidasewith 19mutant of amino acid site，在人尿酸酶假基因基础上，通过17个氨基酸位点突变得到的具有活性的尿酸酶蛋白)氨基酸序列SEQ ID NO：1与基于人尿酸氧化酶假基因碱基序列翻译推导得到的氨基酸序列SEQ ID NO：3进行序列比对的结果。

图2为尿酸氧化酶rhUOX-17Mutant分离纯化示意图，其中，1：IPTG诱导前菌液；2：发酵液；3：超声纯化；4：盐析纯化；5：阴离子纯化；6：亲和浓缩。

图3为各尿酸氧化酶样品的温度稳定性，其中，以各尿酸氧化酶样品初始活性为100％，检测wPU(▲),PBC(×)和rhUOX-17Mutant(●)在不同温度静置6h后的残余活性。

图4为各尿酸氧化酶样品的酸碱稳定性，其中，以各尿酸氧化酶样品初始活性为100％，检测wPU(▲),PBC(×)和rhUOX-17Mutant(●)在不同pH缓冲液中静置6h后的残余活性。

具体实施方式

1.本发明的主要技术成果

发明人应用多重序列比对技术，对14种不同生物来源(人、黑猩猩、猩猩、大猩猩、长臂猿、狒狒、猕猴、食蟹猴、夜猴、家兔、小鼠、狗、牛、猪)的尿酸氧化酶氨基酸序列进行了比对，鉴别出人尿酸氧化酶假基因序列中可能导致尿酸氧化酶酶活性丧失的氨基酸残基位点，并结合现有尿酸氧化酶结构与功能研究，通过氨基酸定点突变技术替换了17个氨基酸残基位点，最终获得具有尿酸氧化酶活性的“复活”人源尿酸氧化酶，且保持了与推导出的无活性的人源尿酸氧化酶氨基酸序列高同源性，从而实现降低人体中免疫原性的目的。

发明人首先将第33位及187位终止密码子TGA替换为精氨酸密码子CGA以修复终止突变，使得人尿酸氧化酶假基因转录产物能够翻译生成完整的尿酸氧化酶。

发明人经进一步运用生物信息学技术对重组尿酸氧化酶进行了序列比对、同源模建，分析关键氨基酸残基对其结构造成的影响，进而采用重叠延伸PCR等技术对关键氨基酸残基进行定点突变，在本发明前述的修复终止突变的尿酸氧化酶氨基酸序列的基础上，经过15个氨基酸残基的定点突变，不仅提高了原蛋白的酶活性，而且改善了翻译蛋白的理化性质(提高了水溶性，增强了热稳定性等等)。该尿酸氧化酶氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

用于编码本发明前述尿酸氧化酶的多核苷酸链可采用DNA合成、PCR等各种分子生物学技术获得，但不局限于本发明实施方案中所采用的重叠延伸PCR技术以及Strantagene的quick change中描述的定点突变方法。

将上述多核苷酸有效连接到相应表达载体后，转化或转染至宿主细胞中进行表达。上述载体可以采用附加体或整合方式在宿主细胞中进行复制，在适当的启动子控制下，“复活”人尿酸氧化酶可以在哺乳动物细胞、昆虫、酵母、细菌或其它细胞中表达。

本发明的尿酸氧化酶可以从表达该蛋白的宿主细胞内部或外部(如培养基)分离纯化得到，分离纯化的方法包含但不限于柱层析法、亲和层析法、过滤法、超滤法、盐析法、等电点沉淀法、透析法等。纯化产物可采用通用的蛋白检测方法检测蛋白浓度和纯度，例如HPLC法、SDS-聚丙烯酰胺电泳法、等电点电泳法、BCA法、Lowry法、Western Blot法等。因此，本发明可提供高纯度的尿酸氧化酶蛋白。

下面结合实施例对本发明作进一步详细描述，但是本发明不限于所给出的例子。下述实施例中所采用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用试剂和材料，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

实施例一：rhUOX-N突变体的构建(resurrected human-source urate oxidasewith mutants，在人尿酸酶假基因基础上，通过氨基酸位点突变得到的具有活性的尿酸酶蛋白，rhUOX-N中N指已完成定点突变的氨基酸位点的数目)。

需要说明的是：本实验中的突变体rhUOX-N的构建过程，是以前一突变产物rhUOX-(N-1)的基因为模板，采用重叠延伸PCR技术，定点突变17个氨基酸位点中尚未突变的某一位点，并经过阳性筛选验证，进而获得突变体rhUOX-N。并且突变体rhUOX-N也是下一个突变体rhUOX-(N+1)的定点突变模板。

获得质粒模板：接种含有前一个成功突变氨基酸位点的质粒pET-22b(+)/rhUOX-(N-1)的菌株于LB液体培养基中，并加入终浓度为100μg/ml的Amp，37℃220r/min摇床过夜培养，质粒抽提试剂盒抽提质粒，1％琼脂糖凝胶电泳检测抽提质粒。

获得rhUOX-N突变体的DNA片段：

rhUOX-N上半DNA片段获得：模板序列为抽提得到的pET-22b(+)/rhUOX-(N-1)质粒，引物为HuF和引物N-U，PCR条件为：95℃预变性5min，共一个循环；95℃30s，55℃30s，72℃2min，共扩增30个循环，最后一个循环72℃延伸10min，最终获得产物rhUOX-N上半DNA片段；

rhUOX-N下半DNA片段获得：抽提得到的质粒，引物为HuR和N-D，PCR条件为：95℃预变性5min，共一个循环；95℃30s，55℃30s，72℃2min，共扩增30个循环，最后一个循环72℃延伸10min，最终获得产物rhUOX-N下半DNA片段；

rhUOX-N全长DNA片段获得：第一阶段PCR：模板为rhUOX-N上、下半DNA片段1:1的混合液，不添加引物，PCR条件为：95℃预变性5min，共一个循环；95℃30s，50℃30s，72℃2min，共扩增10个循环，最后一个循环72℃延伸10min。第二阶段PCR：上一阶段产物加入引物HuF和引物HuR，PCR条件为：95℃预变性5min，共一个循环；95℃30s，55℃30s，72℃2min，共扩增30个循环，最后一个循环72℃延伸10min，最终获得rhUOX-N全长DNA片段。各引物序列如下：

此实施案例所采用的引物序列如下：小写字母为内切酶位点；突变位点AXC，其中，A指突变前氨基酸，C为突变后氨基酸，X为突变位点所在位置，如E83G中的E为突变前氨基酸，G为突变后氨基酸，83为第83位的氨基酸。

将rhUOX-N的DNA片段和pET－22b(+)分别采用Nde I和Hind III双酶切12h，回收纯化酶切片段，T4 DNA连接酶连接两个酶切片段，采用CaCl₂转化法将连接混合物转化到表达宿主菌BL21中，含有100μg/ml的Amp的LB固体培养基平板筛选阳性克隆，测序正确后保存菌株。

实施例二：rhUOX-17Mutant(resurrected human-source urate oxidase with19mutant of amino acid site，在人尿酸酶假基因基础上，通过17个氨基酸位点突变得到的具有活性的尿酸酶蛋白)的表达及分离纯化

rhUOX-17Mutant工程菌株的诱导表达：将保存的rhUOX-17Mutant工程菌株接种至含有100μg/mL的液体LB培养基中，37℃，200rpm摇床培养11h后，转接至新鲜的发酵培养基中继续培养4h后，加入0.2mM IPTG，继续培养5h，收集发酵液。

离心收集菌体：在4℃条件下，8000g，20min离心收集发酵所得的rhUOX-17Mutant工程菌株的菌体，收集菌体用纯净水重悬后，相同条件离心，以洗涤收集的菌体。

超声破碎菌体：每1g湿菌体加入25mL，0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)重悬菌体，每50ml菌液于100mL烧杯中，冰水浴条件下，以500W功率，超声3s，间歇3s，破碎10min以裂解细胞。所得细胞裂解液于4℃条件下，静置过夜。在4℃条件下，8000g，15min离心收集沉淀。所得沉淀重悬于pH9.5 0.1M碳酸盐缓冲液中，4℃静置过夜。

上一步所得产物在4℃条件下，10000g，30min离心后，弃去沉淀，保留上清即为尿酸氧化酶的粗提取酶溶液。

盐析：将所得上清溶液，于冰水浴条件下，边搅拌边缓慢加入硫酸铵，4℃静置过夜老化。4℃条件下，15000g离心30min收集30％饱和度硫酸铵沉淀物，加入pH9.5 0.1M碳酸盐缓冲液溶解沉淀。

阴离子交换层析：层析柱尺寸：直径1.5cm，高20cm。Q sephrose fast flow填料装至18cm。缓冲液：pH9.5 0.1M碳酸盐缓冲液。上样样品的体积：5ml。分级洗脱：各50ml，0M，0.4M，0.8M，2M NaCl溶于缓冲液洗脱。缓冲液流速：1ml/min，每3min收集1管样品。收集0.8MNaCl洗脱产物，即为目的蛋白溶液。

亲和层析：层析柱尺寸：直径1.5cm，高20cm。黄嘌呤亲和层析填料装至15cm。缓冲液：pH9.5 0.1M碳酸盐缓冲液。上样样品的体积：5ml。平衡后，200μM黄嘌呤溶液洗脱。缓冲液流速：1ml/min，每3min收集1管样品。收集洗脱产物，即为目的蛋白溶液。

上述过程中，针对实施例2样品纯化时进行的SDS－PAGE电泳分析结果如图2所示。

实施例三：rhUOX-17Mutant的比活及酶学性质分析

尿酸氧化酶样品的酶活力检测

尿酸氧化酶催化尿酸降解，尿酸在293nm处具有特征吸收峰，但是尿酸降解后的产物在此波长无吸收峰，因此可以根据293nm处吸光值的减少量来确定尿酸被尿酸氧化酶降解的量，然后使用尿酸的摩尔消光系数算出尿酸浓度，根据尿酸浓度的变化可以计算出尿酸氧化酶的活性。将紫外分光光度计波长调至293nm处，预热20min，使用硼酸-硼酸钠缓冲液作为空白调零，取3ml于37℃预热1h的60μM的尿酸加入石英比色皿中，补加0.5ml的上述的酶溶液快速混匀，开始计时，每30s记一次吸光值读数，测量3min内293nm吸光度的变化值。

在37℃、pH8.5时，每分钟降解1μmol尿酸为尿囊素的酶含量定义为一个国际单位(IU)。按照如下公式计算尿酸氧化酶活性。

U＝(A0-A)*Vt/3*11.8*Ve

上式中：U＝尿酸氧化酶活力单位；A0为反应初始时的OD₂₉₃吸光值，A为反应3min后OD₂₉₃的吸光值；Vt＝反应液的总体积(ml)；11.8为尿酸在293nm波长下的微摩尔消光系数；Ve＝酶溶液的体积(ml)。

尿酸氧化酶样品的总蛋白含量测定

采用Bradford法测定总蛋白浓度，取100μL的蛋白样品与5mL的考马斯亮蓝G250溶液混匀，室温放置5min,于已用考马斯亮蓝G250溶液的分光光度计检测595nm吸光值，按照如下公式计算尿酸氧化酶样品总蛋白含量。

C＝OD595-0.0218/1.1296

上式中：C＝样品总蛋白浓度(mg/mL)；OD₅₉₅为样品与考马斯亮蓝G250溶液混匀后在595nm波长下的吸光值。

尿酸氧化酶样品的Km及Kcat测定

采用双倒数绘图法测定尿酸氧化酶样品的Km值，方法如下：将紫外分光光度计波长调至293nm处，预热20min，使用硼酸-硼酸钠缓冲液作为空白调零(pH8.5)。分别配制含不同浓度尿酸的硼砂-硼酸缓冲液(pH8.5)37℃水浴5min。取3ml底物缓冲液加入石英比色皿中，补加10μL的酶溶液并快速混匀，开始计时，每30s记一次吸光值读数，测量3min内293nm吸光度的变化值，计算不同底物浓度条件下的反应速率，采用双倒数绘图法测定尿酸氧化酶样品的Km，依据双双倒数绘图结果测定Vmax，并除以酶浓度Cenzyme，计算Kcat＝Vmax/Cenzyme。

尿酸氧化酶样品的温度稳定性

纯化后的尿酸氧化酶样品在pH 10.3 0.1M碳酸盐缓冲液中，于4℃、25℃及37℃条件下的保存6h后测定其残余酶活性，方法如下：将紫外分光光度计波长调至293nm处，使用硼酸-硼酸钠缓冲液作为空白调零，取3ml于37℃预热1h的60μM的尿酸加入石英比色皿中，补加10μL的酶溶液并快速混匀，开始计时，每30s记一次吸光值读数，测量3min内293nm吸光度的变化值，计算残余酶活性。

尿酸氧化酶样品的酸碱稳定性

在25℃条件下，于pH值分别为9.3、9.6、10、10.5、11和11.5的0.1M碳酸盐溶液中静置6h后测定其残余酶活性，方法如下：将紫外分光光度计波长调至293nm处，使用硼酸-硼酸钠缓冲液作为空白调零，取3ml于37℃预热1h的60μM的尿酸加入石英比色皿中，补加10μL的酶溶液并快速混匀，开始计时，每30s记一次吸光值读数，测量3min内293nm吸光度的变化值，计算残余酶活性。

各尿酸氧化酶蛋白按实施例3方法分离纯化后计算结果如下表所示：

注1：dHU为推定人尿酸氧化酶碱基序列(SEQ ID NO：2)于E.coli BL21宿主菌种表达产物，因其不能表达完整尿酸氧化酶蛋白，不具有降尿酸活性。

注2：wPU为猪尿酸氧化酶序列于E.coli BL21宿主菌种表达，纯化方式与实施例二中rhUOX-17Mutant尿酸氧化酶的纯化方式相同。

注3：PBC为2010年FDA批准上市药物Pegloticase(Krystexxa)中猪-狒狒嵌合体尿酸氧化酶的相同序列于E.coli BL21宿主菌种表达，纯化方式与实施案例二中rhUOX-17Mutant尿酸氧化酶的纯化方式相同。

由以上结果可知，SEQ ID NO：1所示的尿酸氧化酶(rhUOX-17Mutant尿酸氧化酶)在保留有与推定人尿酸氧化酶(dHU)高达93.75％的同源性的同时，具有比猪尿酸氧化酶(wPU)及Pegloticase尿酸氧化酶蛋白(PBC)更高的催化效率及相对活性，以及更大范围的酸碱稳定性，明显优于发明人之前申请的发明(申请号201410048071.9)中酶活最高的E24A－M112I－I115H－H119R－C141V－Q145V－Q151I－K208D－I214A－M219L－S222F－L232S－T233A－C240Y尿酸氧化酶(该尿酸氧化酶的酶活性数据是猪尿酸氧化酶的约1.1倍，而rhUOX-17Mutant尿酸氧化酶则是猪尿酸氧化酶的1.21倍)，这一优势在进行本研究之前是无法预料的。

本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

说明书相关序列

SEQ ID NO：1尿酸氧化酶rhUOX-17Mutant的氨基酸序列：

MAHYHNNYKKNDEVEFVRTGYGKEMVKVLHIQRDGKYHSIKEVATSVQLTLSSKKDYLHGDNSDIIPTDTIKNTVHVLAKFKGIKSIEAFAVNICEHFLSSFNHVIRAQVYVEEIPWKRLEKNGVKHVHAFIHTPTGTHFCEVEQLRSGPQVIHSGIKDLKVLKTTQSGFEGFIKDQFTTLPEVKDRCFATQVYCKWRYHQGRDVDFEATWDTVRDIVLEKFAGPYDKGEYSPSVQKTLYDIQVLSLSRVPEIEDMEISLPNIHYFNIDMSKMGLINKEEVLLPLDNPYGKITGTVKRKLSSRL

SEQ ID NO：2人尿酸氧化酶假基因的碱基序列：

ATGGCCCACTACCATAACAACTATAAAAAGAATGATGAGGTGGAGTTTGTCCGAACTGGCTATGGGAAGGAAATGGTAAAAGTTCTCCATATTCAGTGAGATGGAAAATATCACAGCATTAAAGAGGTGGCAACTTCAGTGCAACTTACTCTAAGTTCCAAAAAAGATTACCTGCATGGAGATAATTCAGACATCATCCCTACAGACACCATCAAGAACACAGTTCATGTCTTGGCAAAGTTTAAAGAAATCAAAAGCATAGAAGCCTTTGGTGTGAATATTTGTGAGCATTTTCTTTCTTCTTTTAACCATGTAATCCGAGCTCAAGTCTACATGGAAGAAATCCCTTGGAAGCATCTTGGAAAGAATGGAGTTAAGCATGTCCATGCATTTATTCACACTCCCACTGGAACACACTTCTGTGAAGTTGAACAGCTGAGAAGTGGACCCCAAGTCATTCATTCTGGAATCAAAGACCTCAAGGTCTTGAAAACAACACAGTCTGGATTTGAAGGTTTCATCAAGGACCAGTTCACTACCCTCCCTGAGGTGAAGGACTGATGCTTTGCCACCCAAGTGTACTGCAAGTGGCGCTACCACCAGTGCAGGGATGTGGACTTCAAGGCTACCTGGGACACCATTCGGGACCTTGTCATGGAGAAATCTGCTGGGCCCTATGACAAAGGTGAATACTTGACCTCTGTGCAGAAGACCCTCTGTGATATCCAGGTGCTCTCCCTGAGCCGAGTTCCTGGGATAGAAGATATGGAAATCAGCCTGCCAAACATTCACTACTTCAACATAGACATGTCCAAAATGGGTCTGATCAACAAGGAAGAGGTCTTGCTGCCATTAGACAATCCATATGGAAAAATTACTGGTACAGTCAAGAGGAAGTTGTCTTCAAGACTGTGA

SEQ ID NO：3基于人尿酸氧化酶假基因碱基序列翻译推导得到的氨基酸序列(dHU)：

MAHYHNNYKKNDEVEFVRTGYGKEMVKVLHIQ-DGKYHSIKEVATSVQLTLSSKKDYLHGDNSDIIPTDTIKNTVHVLAKFKEIKSIEAFGVNICEHFLSSFNHVIRAQVYMEEIPWKHLGKNGVKHVHAFIHTPTGTHFCEVEQLRSGPQVIHSGIKDLKVLKTTQSGFEGFIKDQFTTLPEVKD-CFATQVYCKWRYHQCRDVDFKATWDTIRDLVMEKSAGPYDKGEYLTSVQKTLCDIQVLSLSRVPGIEDMEISLPNIHYFNIDMSKMGLINKEEVLLPLDNPYGKITGTVKRKLSSRL

序列表

<110> 中国药科大学

<120> 一种具有催化活性的尿酸氧化酶

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 304

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala His Tyr His Asn Asn Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe

1 5 10 15

Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Glu Met Val Lys Val Leu His Ile Gln

20 25 30

Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gln

35 40 45

Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp

50 55 60

Ile Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val His Val Leu Ala Lys

65 70 75 80

Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Ala Phe Ala Val Asn Ile Cys Glu

85 90 95

His Phe Leu Ser Ser Phe Asn His Val Ile Arg Ala Gln Val Tyr Val

100 105 110

Glu Glu Ile Pro Trp Lys Arg Leu Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val

115 120 125

His Ala Phe Ile His Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu

130 135 140

Gln Leu Arg Ser Gly Pro Gln Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu

145 150 155 160

Lys Val Leu Lys Thr Thr Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp

165 170 175

Gln Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gln

180 185 190

Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gln Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu

195 200 205

Ala Thr Trp Asp Thr Val Arg Asp Ile Val Leu Glu Lys Phe Ala Gly

210 215 220

Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr

225 230 235 240

Asp Ile Gln Val Leu Ser Leu Ser Arg Val Pro Glu Ile Glu Asp Met

245 250 255

Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys

260 265 270

Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro

275 280 285

Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu

290 295 300

<210> 2

<211> 915

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

atggcccact accataacaa ctataaaaag aatgatgagg tggagtttgt ccgaactggc 60

tatgggaagg aaatggtaaa agttctccat attcagtgag atggaaaata tcacagcatt 120

aaagaggtgg caacttcagt gcaacttact ctaagttcca aaaaagatta cctgcatgga 180

gataattcag acatcatccc tacagacacc atcaagaaca cagttcatgt cttggcaaag 240

tttaaagaaa tcaaaagcat agaagccttt ggtgtgaata tttgtgagca ttttctttct 300

tcttttaacc atgtaatccg agctcaagtc tacatggaag aaatcccttg gaagcatctt 360

ggaaagaatg gagttaagca tgtccatgca tttattcaca ctcccactgg aacacacttc 420

tgtgaagttg aacagctgag aagtggaccc caagtcattc attctggaat caaagacctc 480

aaggtcttga aaacaacaca gtctggattt gaaggtttca tcaaggacca gttcactacc 540

ctccctgagg tgaaggactg atgctttgcc acccaagtgt actgcaagtg gcgctaccac 600

cagtgcaggg atgtggactt caaggctacc tgggacacca ttcgggacct tgtcatggag 660

aaatctgctg ggccctatga caaaggtgaa tacttgacct ctgtgcagaa gaccctctgt 720

gatatccagg tgctctccct gagccgagtt cctgggatag aagatatgga aatcagcctg 780

ccaaacattc actacttcaa catagacatg tccaaaatgg gtctgatcaa caaggaagag 840

gtcttgctgc cattagacaa tccatatgga aaaattactg gtacagtcaa gaggaagttg 900

tcttcaagac tgtga 915

<210> 3

<211> 302

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Met Ala His Tyr His Asn Asn Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe

1 5 10 15

Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Glu Met Val Lys Val Leu His Ile Gln

20 25 30

Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gln Leu

35 40 45

Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp Ile

50 55 60

Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val His Val Leu Ala Lys Phe

65 70 75 80

Lys Glu Ile Lys Ser Ile Glu Ala Phe Gly Val Asn Ile Cys Glu His

85 90 95

Phe Leu Ser Ser Phe Asn His Val Ile Arg Ala Gln Val Tyr Met Glu

100 105 110

Glu Ile Pro Trp Lys His Leu Gly Lys Asn Gly Val Lys His Val His

115 120 125

Ala Phe Ile His Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu Gln

130 135 140

Leu Arg Ser Gly Pro Gln Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu Lys

145 150 155 160

Val Leu Lys Thr Thr Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp Gln

165 170 175

Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Cys Phe Ala Thr Gln Val Tyr

180 185 190

Cys Lys Trp Arg Tyr His Gln Cys Arg Asp Val Asp Phe Lys Ala Thr

195 200 205

Trp Asp Thr Ile Arg Asp Leu Val Met Glu Lys Ser Ala Gly Pro Tyr

210 215 220

Asp Lys Gly Glu Tyr Leu Thr Ser Val Gln Lys Thr Leu Cys Asp Ile

225 230 235 240

Gln Val Leu Ser Leu Ser Arg Val Pro Gly Ile Glu Asp Met Glu Ile

245 250 255

Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys Met Gly

260 265 270

Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro Tyr Gly

275 280 285

Lys Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu

290 295 300

Claims (10)

1.一种具有催化活性的尿酸氧化酶，其特征在于，该酶的氨基酸序列是将SEQ ID NO:2所示的人尿酸氧化酶假基因序列进行若干密码子替换后翻译所得的重组尿酸酶氨基酸序列；所述若干密码子替换由2个终止密码子以及15个氨基酸密码子定点替换组成。

2.根据权利要求1所述的一种具有催化活性的尿酸氧化酶，其特征在于，所述终止密码子的替换为：将第33位及187位终止密码子替换为精氨酸密码子。

3.根据权利要求1或2所述的一种具有催化活性的尿酸氧化酶，其特征在于，所述氨基酸密码子的替换为：将第83位的谷氨酸替换为甘氨酸；将第91位的甘氨酸替换为丙氨酸；将第112位的甲硫氨酸替换为缬氨酸；将第119位的组氨酸替换为精氨酸；将第121位的甘氨酸替换为谷氨酸；将第202位的半胱氨酸替换为甘氨酸；将第208位的赖氨酸替换为谷氨酸；将第214位的异亮氨酸替换为缬氨酸；将第217位的亮氨酸替换为异亮氨酸；将第219位的甲硫氨酸替换为亮氨酸；将第222位的丝氨酸替换为苯丙氨酸；将第232位的亮氨酸替换为丝氨酸；将第233位的苏氨酸替换为脯氨酸；将第240位的半胱氨酸替换为酪氨酸；将第252位的丙氨酸替换为谷氨酸。

4.根据权利要求3所述的一种具有催化活性的尿酸氧化酶，其特征在于，选自（a）或（b）：

具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；

具有与SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列95％以上的同源性，且尿酸氧化酶活性未发生显著改变。

5.编码权利要求1-4任一所述的尿酸氧化酶的核苷酸序列。

6.含有权利要求5所述的核苷酸序列的载体、表达盒或宿主细胞；优选的，所述载体为质粒、穿梭质粒载体、慢病毒载体以及腺病毒载体中的任一种；所述宿主细胞选自原核生物细胞、真核生物细胞、Sf9昆虫细胞、CHO 细胞中的任一种；优选的，所述原核生物细胞为大肠杆菌细胞，所述真核生物细胞为酵母细胞。

7.权利要求1-5任一所述的尿酸氧化酶用于制备降尿酸药物或药物组合物的用途。

8.含有权利要求1-5任一项所述的尿酸氧化酶的药物组合物。

9.尿酸氧化酶蛋白修饰产物，其特征在于：它是基于权利要求1-5任一所述的尿酸氧化酶蛋白的修饰产物，优选为PEG修饰、白蛋白或Fc片段融合、脂质体、或纳米制剂包裹的尿酸氧化酶蛋白产物。

10.制备权利要求1-5任一项所述的尿酸氧化酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：采用权利要求6所述的宿主细胞表达所述的尿酸氧化酶，然后经分离、纯化后获得人源尿酸氧化酶。

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