CN115261349B - 一种提升活性的果糖基肽氧化酶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提升活性的果糖基肽氧化酶的制备方法，属于生物技术领域。本发明通过亲和层析和阴离子交换层析两步层析纯化得到纯度较高的果糖基肽氧化酶，并结合对果糖基肽氧化酶的热处理操作，在提高蛋白比活力的同时，减少了影响冻干效果的杂蛋白含量，可使蛋白的比活性较热处理前提升50％以上，使冻干处理后的酶粉在37℃处理7天能保持92.5％及以上的活力，冻干粉复溶后澄清透明。
Description
技术领域
本发明涉及一种提升活性的果糖基肽氧化酶的制备方法，属于生物技术领域。
背景技术
随着生活水平不断提高，营养变化和体力活动减少等因素，糖尿病在全球的发病率逐渐上升。糖尿病诊断传统的检测项目是空腹血糖或口服糖耐量实验，但这些诊断方法受较多因素的影响，导致有些糖尿病患者未能得到准确的诊断。针对糖尿病的标志物检测，对糖尿病的诊断和预防具有重要意义。
糖化血红蛋白是由红细胞中的血红蛋白和人体血液中的糖类(主要指葡萄糖)通过非酶反应相结合的产物，糖化血红蛋白可有效反映过去8～12周平均血糖水平，《中国Ⅱ型糖尿病防治指南(2020版)》将糖化血红蛋白纳入糖尿病诊断标准中，糖化血红蛋白≥6.5％可作为确诊糖尿病的依据。
糖化血红蛋白的检测方法主要有四类：色谱法、电泳法、免疫法和化学法。近年来，酶分析法以其操作简便、检测迅速及可适用于自动化分析等优点被临床上广泛使用。果糖基肽氧化酶(Fructosyl-peptide oxidase,FPOX,EC 1.5.3)是该类诊断试剂的核心酶原料，对果糖基肽氧化酶的制备方法的开发具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种提升果糖基肽氧化酶活性的方法，包括：
(a)对所述果糖基肽氧化酶进行纯化；
(b)对步骤(a)纯化后的酶进行热处理。
在一种实施方式中，所述热处理是将纯化后的果糖基肽氧化酶在35～45℃处理至少15min。
在一种实施方式中，所述热处理是将纯化后的果糖基肽氧化酶在35～40℃处理至少15min。
在一种实施方式中，所述热处理是将纯化后的果糖基肽氧化酶在35～37℃，或37～40℃处理。
在一种实施方式中，所述处理时间为15～60min，或30～60min，或35～60min，或35～45min，或35～40min。
在一种实施方式中，所述热处理是在处理温度为42～45℃处理15～30min。
在一种实施方式中，所述热处理是在35℃处理30～60min。
在一种实施方式中，所述热处理是在37℃处理30～45min。
在一种实施方式中，所述热处理是在40℃处理15～60min。
在一种实施方式中，所述热处理是在42℃处理15～30min。
在一种实施方式中，所述热处理是在45℃处理15～30min。
在一种实施方式，所述纯化依次包括亲和层析和阴离子交换层析。
在一种实施方式中，所述亲和层析是指金属离子螯合亲和层析，所述金属离子包含但不限定于Cu2+、Co2+、Ni2+、Zn2+等能够提供电子供体配位点的过渡态金属离子。
在一种实施方式中，所述金属离子螯合亲和层析选用Ni2+亲和层析。
在一种实施方式中，所述Ni2+亲和层析的填料包含但不限定于IDA、NTA、IMAC、TED等类型。
在一种实施方式，所述纯化依次包括Ni2+亲和层析和阴离子交换层析。
在一种实施方式中，所述Ni2+亲和层析填料选择Ni-NTA 6FF
在一种实施方式中，所述果糖基肽氧化酶是通过基因工程手段表达获得。
在一种实施方式中，所述果糖基肽氧化酶按如下方法制备：
(1)用包含编码果糖基肽氧化酶基因的重组表达载体转化宿主细胞，得到重组菌株；
(2)培养所述重组菌株，诱导果糖基肽氧化酶表达。
在一种实施方式中，用于表达果糖基肽氧化酶的宿主细胞包括但不限于源自于如下物种的细胞：大肠杆菌(Escherichia coli)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、枯草芽孢杆菌(Bacilllus subtilis)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、黑曲霉(Aspergillus niger)、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
在一种实施方式中，所述的宿主细胞为大肠杆菌细胞，包括但不限于大肠杆菌Origami2(DE3)、BL21(DE3)或BL21(DE3)pLysS。
在一种实施方式中，以大肠杆菌为宿主，表达果糖基肽氧化酶的融合蛋白，再收集蛋白进行纯化富集。
在一种实施方式中，所述融合蛋白的纯化富集依赖于所使用的功能片段；所述功能片段包括但不限于6×His标签蛋白。
在一种实施方式中，所述方法以培养所述细胞获得的含果糖基肽氧化酶的细胞培养液为原料。
在一种实施方式中，所述方法包含如下步骤：
(1)通过超声破碎或高压细胞破碎仪使得所述果糖基肽氧化酶与所述细胞分离；
(2)通过Ni2+亲和层析对果糖基肽氧化酶进行首次富集；
(3)超滤置换法去除一步层析洗脱液中的高浓度咪唑；
(4)通过阴离子交换层析对蛋白二次精纯；
(5)超滤置换法去除二步层析洗脱液中的盐；
(6)对蛋白液进行水浴热处理，得到高活性的果糖基肽氧化酶；
(7)将蛋白液添加适量比例的冻干保护剂后，通过冷冻干燥技术得到果糖基肽氧化酶冻干粉。
在一种实施方式中，所述超滤置换法采用截留分子量不大于30KDa的透析膜透析处理，收集留在透析膜内的组分。
在一种实施方式中，所述透析膜截留分子量选用10KDa。
在一种实施方式中，所述阴离子交换层析包含但不限定于弱阴离子层析、强阴离子层析、包含阴离子交换功能的复合层析方式。
在一种实施方式中，所述阴离子交换层析填料选择强阴离子交换介质Q FocuroseFF。
本发明还提供了应用所述方法制备的果糖基肽氧化酶酶制剂。
在一种实施方式中，所述果糖基肽氧化酶酶制剂具有良好的储藏稳定性。
在一种实施方式中，所述冻干保护剂是含海藻糖、D-甘露醇及吐温-20的混合物。
在一种实施方式中，所述冻干保护剂含有10g/L海藻糖、10g/L D-甘露醇及体积分数为0.05％的吐温20。
有益效果：
1、本发明通过两步层析纯化得到纯度较高的目的蛋白，并结合热处理操作，在提高蛋白比活力的同时，减少了影响冻干效果的杂蛋白含量，可使蛋白的比活性较热处理前提升50％以上，使冻干处理后的酶粉保持良好的稳定性。
2、本发明还提供了果糖基肽氧化酶冻干粉的制备方法，所获得的冻干粉具有酶活力高、热稳定性好、储存时间长、外观良好的特性，在37℃处理7天能保持92.5％及以上的活力，冻干粉复溶后澄清透明。
附图说明
图1为一步层析过程样品的SDS-PAGE(12％还原型SDS-PAGE)检测结果；其中，1：蛋白Maker；2：一步层析上样；3：一步层析流穿；4：一步层析平衡；5：一步层析洗杂；6、7：一步层析洗脱；8：一步层析洗柱。
图2为二步层析过程样品SDS-PAGE(12％还原型SDS-PAGE)检测结果；其中，1：二步层析上样；2：二步层析流穿；3：二步层析洗杂①；4：二步层析洗杂②；5、6：二步层析洗脱；7：二步层析洗柱；8：蛋白Maker。
具体实施方式
(一)技术术语：
果糖基肽氧化酶：本发明所提及的“果糖基肽氧化酶(Fructosyl-peptideoxidase,FPOX)是指酶命名法所定义的EC 1.5.3类中的酶。出于本发明的目的，根据具体实施方式中提及的方法确定果糖基肽氧化酶活性。
细胞培养液：本发明所提及的“细胞培养液”是指由动物细胞或微生物在培养基中生长所产生的、未经回收或经过回收和/或纯化的制剂。例如，当微生物培养物在允许蛋白质合成(例如，由宿主细胞表达酶)并且将蛋白质分泌到细胞培养基中的碳限制条件下孵育生长到饱和时，产生发酵液。所述细胞培养液可以含有细胞、目的产物、细胞破碎后释放的内容物及细胞碎片。例如，微生物细胞培养液包含被微生物利用后的培养基成分以及可通过离心去除微生物细胞后存在的细胞碎片。
纯化：本发明所提及的“纯化”是指从含目标组分的样品中去除杂质或污染物，以获得具有更高的绝对或相对浓度的目标组分。
热处理：本发明所提及的“热处理”是指将果糖基肽氧化酶或含果糖基肽氧化酶的组合物至于适当热的环境中，旨在影响果糖基肽氧化酶的活性，从而延长酶的稳定性或贮藏时间。
缓冲液：本发明所提及的“缓冲液”是指能抵御少量的酸、碱或稀释少量倍数时,使体系的pH基本不变或仅呈现出微小变化的溶液。在本申请的具体实施方式中，根据缓冲液的用途对不同成分的缓冲液做更具体的命名，例如：“平衡缓冲液”用于平衡层析柱，以便产物与柱填料的相互作用；“洗杂缓冲液”用于将杂质从填料上漂洗下来，以达到去除杂质的目的；“洗脱缓冲液”用于将目的产物从填料上洗脱下来；“洗柱缓冲液”用于在目的产物纯化过程结束后对填料柱的清洗。
柱体积：本发明在具体实施方式中提及的“柱体积”按照本领域惯常意思解释，指凝胶装柱后从柱的底板到凝胶沉积表面的体积。
干粉比活力(U/mg)：本发明所提及的“干粉比活力”是指单位质量果糖基肽氧化酶冻干粉中果糖基肽氧化酶的酶活力，其测定方法为：先测定一定重量的冻干粉中含有的实际的蛋白量，然后测定蛋白浓度及蛋白比活力，再根据蛋白比活力×蛋白浓度÷干粉重量即得到干粉比活力。干粉比活力反映干粉样品中的蛋白的酶活力，干粉比活力越接近蛋白比活力，则表明蛋白含量越高。
残余活力(％)：本发明所提及的“残余活力”是指残余酶活性的百分比，也即，将酶经过37℃的处理，再根据实施例1测得的处理后的酶活力与处理前的酶活力的比值。
纯度：本发明所提及的“纯度”是指待测样品中目的蛋白所占的质量百分比，以％表述。在本申请的一些具体实施方式中，“纯度”通常指果糖基肽氧化酶所占总蛋白的质量百分比(％)，其测定方法可选用本领域熟知的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测法结合ImageJ软件分析法。
果糖基肽氧化酶活力检测方法
本发明的蛋白具有如下性质：氧化糖化肽，生成酮醛糖、肽和过氧化氢(H2O2)。
活力检测原理：果糖基酞在果糖基肽氧化酶作用下生成葡糖酮醛、肽和H2O2，H2O2通过Trinder反应即在4-氨基安替比林(4-AAP)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOOS)和过氧化物酶(POD)作用下，生成红色醌亚胺化合物，其颜色的深浅与H2O2含量成正比，在555nm处测定终产物醌亚胺的吸光度，进而计算出H2O2生成量，从而得出果糖基肽氧化酶的活力。
酶活定义：单位酶活定义为在下述条件下，每分钟催化生成1μmol H2O2所需的酶量。
操作步骤：配制反应混合液，体系中包括50mM Tris-HCl，pH 8.0；1U/mL POD酶；0.5mM N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOOS)；0.5mM 4-氨基安替比林(4-AAP)；20mM糖化缬氨酸，将反应混合物在37℃预热5min后，加入待测酶液，混匀，37℃反应，并用分光光度计在555nm下，记录1min内的吸光度变化，从而计算果糖基肽氧化酶的活力。
实施例1果糖基肽氧化酶的表达
利用外源表达体系制备果糖基肽氧化酶，用于表达果糖基肽氧化酶的宿主细胞包括但不限于源自于如下物种的细胞：大肠杆菌(Escherichia coli)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、枯草芽孢杆菌(Bacilllus subtilis)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、黑曲霉(Aspergillus niger)、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
本实施例以大肠杆菌表达系统为例，参照公开号为CN108342370B的方法制备果糖基肽氧化酶，合成编码果糖基肽氧化酶的基因，并在基因序列N端添加6×His tag标签。将含6×His tag标签的基因连接至pET28a质粒上，再转化至大肠杆菌Escherichia coliBL21(DE3)CodonPlus RIL感受态细胞宿主细胞中。
将构建的重组工程菌株在LB培养基中，于37℃220rpm培养12h，转接至1L LB培养基摇瓶中，37℃220rpm培养约2.5～3h，使菌液OD600达到0.9左右，加入0.1mM IPTG诱导剂，25℃200rpm诱导培养12h，获得果糖基肽氧化酶≥15.0U/mL的细胞培养液。
实施例2果糖基肽氧化酶的粗提取
将实施例1制备的细胞培养液通过离心收集含目的蛋白的微生物细胞组分，获得的菌体通过机械法如高压匀浆破碎法或物理方法如超声破碎法等两种方式进行细胞破碎，使目的蛋白从菌体中释放出来，通过离心或过滤除去破碎的菌体碎片，细胞重悬缓冲液为20mM PBS pH8.0，菌体与缓冲液的比例为1g菌体/10mL缓冲液，破碎后获得酶活为10U/mL的粗提取蛋白样品。
实施例3一步层析Ni2+亲和层析
利用Ni2+亲和层析对实施例2获得的粗提取样品中的目的蛋白进行一步层析。填料选择Ni-IDA、Ni-NTA、Ni-IMAC或Ni-TED填料，在本实施例中，以Ni-NTA 6FF填料为例。
具体方法为：采用Ni-NTA 6FF亲和层析柱，使用5个柱体积平衡缓冲液进行柱料平衡，将实施例2中的粗提取样品加载到亲和层析柱上，使用5个柱体积平衡缓冲液进行再平衡，使用5个柱体积洗杂缓冲液进行洗杂，使用5个柱体积洗脱缓冲液进行洗脱，收集目的蛋白所在的洗脱组分。层析柱经过5个柱体积的洗柱缓冲液和10个柱体积的纯水依次清洗后保存于20％乙醇中。纯化过程样品的纯度检测结果见图1，经过一步亲和层析，目的蛋白完成富集，纯度提升至90％。
以上步骤所用缓冲液如下：
平衡缓冲液：10mM PBS，300mM NaCl，pH8.0；
洗杂缓冲液：10mM PBS，300mM NaCl，50mM咪唑，pH8.0；
洗脱缓冲液：10mM PBS，250mM咪唑，pH8.0；
洗柱缓冲液：500mM咪唑，pH8.0。
实施例4二步层析-阴离子交换层析
利用阴离子交换层析对实施例3中获取的一步层析样品进行精纯。可选地，选择强阴离子交换介质Q Sepharose、Source 15Q，弱阴离子交换介质DEAE Sephacel、DEAESephadex。优选地，选择强阴离子交换介质Q Sepharose FF。
具体方法为：以超滤置换液对实施例3中的洗脱组分进行buffer成分置换，除去原buffer中的高浓度咪唑，以电导率＜1.8mS/cm，pH8.0为超滤置换终点。采用Q SepharoseFF离子交换层析柱，使用5个柱体积平衡缓冲液进行柱料平衡，将超滤置换后的样品加载到Q Sepharose FF层析柱上，使用5个柱体积平衡缓冲液进行再平衡，使用5个柱体积洗杂缓冲液进行洗杂，使用5个柱体积洗脱缓冲液进行洗脱，收集目的蛋白所在的洗脱组分，对洗脱样品以超滤置换液再进行置换。层析柱经过5个柱体积的洗柱缓冲液和10个柱体积的纯水清洗后保存于20％乙醇中。纯化过程样品的纯度检测结果见图2，经过二步离子交换层析，目的蛋白纯度由90％提升至98％。
以上步骤所用缓冲液如下：
超滤置换液：10mM PBS，pH8.0；
平衡缓冲液：10mM PBS，pH8.0；
洗杂缓冲液：10mM PBS，20mM NaCl，pH8.0；
洗脱缓冲液：10mM PBS，100mM NaCl，pH8.0；
洗柱缓冲液：2M NaCl，pH8.0。
对比例1
具体实施方式同实施例3，区别在于，洗杂缓冲液替换为10mM PBS，300mM NaCl，30mM咪唑，pH8.0。
结果显示，Ni2+层析洗脱纯度为85％。
对比例2
具体实施方式同实施例4，区别在于，洗杂缓冲液替换为10mM PBS，10mM NaCl，pH8.0。
结果显示，阴离子交换层析洗脱纯度为93％。
实施例5热处理经纯化的酶
对实施例4中获取的二步层析样品进行水浴热处理，可达到提升蛋白活力的目的。可选地，水浴加热温度选择35℃、37℃、40℃，加热时间选择15min、30min、45min、60min。
样品在不同温度下热处理，随时间延长的活性变化见表1。随时间延长，样品活性呈现先升高后逐渐下降的趋势。其中，样品在37℃下热处理30min时，活性最高，较热处理前活性提升52.15％
表1热处理过程样品活性变化
| 序号 | 热处理时间 | 35℃ | 37℃ | 40℃ |
| 1 | 0min | 9.55U/mg | 9.55U/mg | 9.55U/mg |
| 2 | 15min | 12.90U/mg | 13.23U/mg | 13.90U/mg |
| 3 | 30min | 13.90U/mg | 14.53U/mg | 14.10U/mg |
| 4 | 45min | 14.05U/mg | 14.03U/mg | 13.50U/mg |
| 5 | 60min | 13.80U/mg | 13.52U/mg | 13.21U/mg |
实施例6冻干粉制备
按照实施例5相同的条件，在37℃处理30min获取样品。向所述样品中添加按终浓度计10g/L海藻糖、10g/L甘露醇及0.05％(v/v)吐温-20，使加入保护剂后的蛋白浓度为20mg/mL；置于冷冻干燥机冻干。
冷冻干燥机程序设置如下；
a.预冻阶段：设置板层温度为-45℃，时长2.5h；退火温度-25℃，时长2h；随后再降温至-45℃，时长3h；回温速率为1℃/min；
b.一次升华：设置真空值在20pa以下，由步骤a的-45℃升至-18℃，时长22h；第二阶段板层温度升至-15℃，时长12h；第三阶段板层温度升至-12℃，时长3h；第四阶段板层温度升至-10℃，时长3h；回温速率为0.5℃/min；
c.解析干燥：设置真空值在10pa以下，第一阶段板层温度升至15℃，时长1h；第二阶段板层温度升至30℃，时长1h；回温速率为1℃/min；
d.冻干程序结束，最终获得果糖基肽氧化酶冻干粉1。
实施例7
具体实施方式同实施例5，区别在于，水浴温度选择42℃，样品随热处理时间延长活性变化如表2。
随时间延长，样品活性同样呈现先升高后逐渐下降的趋势。但在42℃条件下，样品活性提高比例较实施例5更低，在42℃处理15min时活性较热处理前活性提高30.89％。
表2热处理(42℃)样品活性变化
| 处理时间 | 0min | 15min | 30min | 45min | 60min |
| 42℃ | 9.55U/mg | 12.50U/mg | 12.30U/mg | 11.50U/mg | 10.81U/mg |
实施例8
具体实施方式同实施例5，区别在于，水浴温度选择45℃，样品随热处理时间延长活性变化如表3。
随时间延长，样品活性呈现先升高后逐渐下降的趋势。但在45℃条件下，样品活性提高比例较实施例5中低，45℃、15min时活性最高，较热处理前活性提高21.05％，且在热处理45min后，样品活性低于热处理前。
表3热处理(45℃)样品活性变化
| 处理时间 | 0min | 15min | 30min | 45min | 60min |
| 45℃ | 9.55U/mg | 11.56U/mg | 11.21U/mg | 9.46U/mg | 8.99U/mg |
对比例3
具体实施方式同实施例6，区别在于，冻干样品选择实施例5中的热处理前样品，获得果糖基肽氧化酶冻干粉2。以市售的标示酶活为2.75U/mg、4.90U/mg的果糖基肽氧化酶作为对照，分别命名为竞品1、竞品2。
冻干粉各项指标检测数据见表4。
表4冻干粉关键指标检测结果
实施例6、对比例3的结果显示，合适的热处理温度能够显著提升果糖基肽氧化酶的活性，热处理温度可选择35～40℃，其中35℃、37℃、40℃处理35～45min可使酶活分别提升47.12％、52.15％、47.64％。以上结果表明，热处理能够去除样品中无活性或低活性的蛋白，达到提升比活力的目的。
在冻干粉整体性能方面，经过热处理后冻干制备的冻干粉1各项关键指标(包括蛋白比活力、干粉比活力、溶解澄清度、热加速残余活力等)都显著优于未经热处理制备的冻干粉2，溶解澄清度及热加速残余活力可达到竞品水平，蛋白比活力、干粉比活力优于竞品。由于无活性或低活性的蛋白在冷冻干燥过程中极不稳定，在获得的冻干粉2中表现出蛋白沉淀的现象，热处理能够提前去除这些不稳定的蛋白，因此冻干粉1的溶解澄清度也得以改善。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种提升果糖基肽氧化酶活性的方法，其特征在于，包括：
(a)对所述果糖基肽氧化酶进行纯化；
(b)对步骤(a)纯化后的酶进行热处理；
所述热处理是将纯化后的果糖基肽氧化酶在35～45℃处理15～60min；当处理温度为42～45℃时处理时间为15～30min。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述热处理是将纯化后的果糖基肽氧化酶在35～37℃，或37～40℃处理，或42～45℃；所述处理时间为15～60min，或30～60min，或35～60min，或35～45min，或35～40min。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述纯化依次包括亲和层析和阴离子交换层析。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述亲和层析是金属离子螯合亲和层析；所述金属离子包含但不限定于Cu2+、Co2+、Ni2+、Zn2+。
5.一种制备高活性果糖基肽氧化酶制剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)通过Ni2+亲和层析对果糖基肽氧化酶进行富集；
(2)超滤置换法去除步骤(1)层析洗脱液中的高浓度咪唑；
(3)通过阴离子交换层析对步骤(2)处理后的含酶溶液进行二次精纯；
(4)超滤置换法去除步骤(3)层析洗脱液中的盐；
(5)对步骤(4)处理后的溶液进行热处理；所述热处理是在35～40℃处理15～60min。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述阴离子交换层析包含弱阴离子层析、强阴离子层析或包含阴离子交换功能的复合层析。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，将步骤(5)处理后的蛋白与冻干保护剂混合，通过冷冻干燥技术制备果糖基肽氧化酶冻干粉。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述冻干保护剂是含海藻糖、D-甘露醇及吐温-20的混合物。
9.根据权利要求1～8任一所述的方法，其特征在于，所述果糖基肽氧化酶按如下方法制备：
(1)用包含编码果糖基肽氧化酶基因的重组表达载体转化宿主细胞，得到重组菌株；
(2)培养所述重组菌株，诱导果糖基肽氧化酶表达。
10.应用权利要求1～9任一所述方法制备的果糖基肽氧化酶酶制剂。
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2022
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