CN107267491A - 一种重组人pcsk9蛋白在cho‑k1细胞中的表达纯化方法 - Google Patents

一种重组人pcsk9蛋白在cho‑k1细胞中的表达纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术构建领域，具体公开了一种重组人PCSK9蛋白在CHO‑K1细胞中的表达纯化方法，包括真核表达载体pCMV‑pcsk9‑His的构建，CHO‑K1细胞的转染，细胞培养，重组人PCSK9蛋白的纯化等步骤，其中重组人PCSK9蛋白的纯化采用亲和层析、尺寸排阻层析、阴离子交换层析三步，获得的重组蛋白纯度更高，更加利于研究其功能和性质，减少PCSK9蛋白抑制剂筛选过程中的干扰。

Description

一种重组人PCSK9蛋白在CHO-K1细胞中的表达纯化方法
技术领域
本发明属于生物技术构建领域，具体涉及一种重组人PCSK9蛋白在CHO-K1细胞中的表达纯化方法。
背景技术
人类的PCSK9基因在染色体1p32.3定位，全长为29kb，含有12个外显子，cDNA全长有3617个碱基，它的编码含有692个氨基酸残基的蛋白质，并且其编码的蛋白质被称为神经细胞凋亡调节转化酶1(NARC-1)，它是一个独特的前蛋白转化酶，而且是属于丝氨酸蛋白酶K亚类，它能切割非碱性氨基酸，其底物特异性是不同于其它前蛋白转化酶的，它的特定已知底物为前体PCSK9。人类的PCSK9氨基酸序列可以分为前结构域(31～152)、催化结构域(153～451)、信号肽(1～30)、富含半胱氨酸和组氨酸的C末端区域(452～692)。PCSK9的前体蛋白可以在内质网中合成一种可溶性酶原，即PCSK9酶原(apo-PCSK9)，在内质网或高尔基体中apo-PCSK9(151～152)的残基处能够发生自动催化分裂，并且能释放前肽形成成熟的蛋白酶分泌入血。PCSK9主要是在肝脏和小肠中表达，但是PCSK9只在肝脏表达才可分泌入血。
血清低密度脂蛋白(low density lipoprotein cholesterol，LDL)水平是衡量血脂水平的主要指标，动脉粥样硬化性心脏病的主要危险因素是LDL升高，它可以诱发和促进动脉粥样硬化的发生和发展。PCSK9是除LDLR、载脂蛋白B-100(apolipoproteinB-100，apoB-100)和Niemann-PickC1 Like 1(NPC1L1))外，又1个与ADH相关基因，它可以在不影响LDLR mRNA水平的情况下，可以在蛋白质水平降解LDLR，从而影响LDL的代谢。流行病学研究已经发现在PCSK9基因的不同部位碱基突变能够导致2种大不相同的生物学效应。分别是功能获得型突变和功能确实型突变，功能获得型突变能够增强降解肝细胞LDLR的能力，从而能使LDL在血液中的清除减少，最终能够导致高胆固醇血症的发生，并且增加冠心病的易感性。功能缺失型突变能够使PCSK9的正常功能损坏，从而导致肝细胞LDLR的增多，并且血液中摄取LDL的降解增加，进一步引起低胆固醇血症，由于在肝脂质代谢调节中PCSK9起重要作用，所以PCSK9目前已经成为研发降脂药物的热门靶点。
目前主要采用在体外建立稳定的表达细胞系和杆状病毒表达系统来表达PCSK9，但是没有出现系统的纯化方法的报道，没有进行纯化方法的优化，所获得的PCSK9纯度不高，活性较差。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组人PCSK9蛋白在CHO-K1细胞中的表达纯化方法，首次采用三步层析对重组PCSK9进行纯化，获得的重组蛋白纯度更高，更加利于研究其功能和性质，减少PCSK9抑制剂筛选过程中的干扰。
本发明还提供了一种重组人PCSK9蛋白在CHO-K1细胞中的表达纯化方法，包括以下步骤：
S1，真核表达载体pCMV-pcsk9-His的构建
根据人pcsk9基因的cDNA序列合成pcsk9基因，然后将pcsk9基因整合入真核表达载体pCMV-C-His，得到真核表达载体pCMV-pcsk9-His；
S2，CHO-K1细胞的转染
培养CHO-K1细胞汇合度达到80％时，用真核表达载体pCMV-pcsk9-His转染CHO-K1细胞；
S3，细胞培养、表达
CHO-K1细胞转染后传代培养，在CHO-K1细胞表达出重组人PCSK9蛋白，得到CHO-K1细胞培养液；
S4，重组人PCSK9蛋白的纯化
S41，亲和层析
S411，取Ni Sepharose excel树脂，装配成亲和层析柱，用BufferⅠ平衡NiSepharose excel树脂；
S412，取CHO-K1细胞培养液，流经平衡好的Ni Sepharose excel树脂；
S413，用BufferⅠ继续平衡Ni Sepharose excel树脂；
S414，用BufferⅡ洗脱Ni Sepharose excel树脂，收集亲和层析洗脱液；
S415，用截留分子量30KD超滤管将亲和层析洗脱液浓缩，得到浓缩液；
S42，尺寸排阻层析
S421，取Superdex 200prep grade树脂，装配成尺寸排阻层析柱，用BufferⅢ平衡Superdex 200prep grade树脂；
S422，用所述浓缩液流经Superdex 200prep grade树脂，收集流出液；
S423，用截留分子量30KD超滤管对15mL流出液进行溶液过滤，直至溶液的电导率值小于5mS/cm，弃去滤出液，收集截留液；
S43，阴离子交换层析
S431，取Q sepharose Fast flow树脂，装配成阴离子交换层析柱，BufferⅣ平衡Qsepharose Fast flow树脂；
S432，将所述截留液流经Q sepharose Fast flow树脂；
S433，用BufferⅣ继续平衡Q sepharose Fast flow树脂；
S434，用BufferⅤ清洗Q sepharose Fast flow树脂；
S435，用BufferⅥ洗脱Q sepharose Fast flow树脂，收集阴离子交换层析洗脱液；
S436，用截留分子量30KD超滤管对阴离子交换层析洗脱液进行浓缩脱盐，得到纯化的重组人PCSK9蛋白；
其中，BufferⅠ、BufferⅡ均由NaH2PO4、咪唑、NaCl、双蒸水配制而成，pH均为7.4；BufferⅢ、BufferⅣ、BufferⅤ、BufferⅥ均由NaH2PO4、NaCl、双蒸水配制而成，pH均为7.4。
优选的，上述重组人PCSK9蛋白在CHO-K1细胞中的表达纯化方法，S411中，用BufferⅠ平衡Ni Sepharose excel树脂的流速为2mL/min；
S412中，取CHO-K1细胞培养液，以2mL/min的流速流经平衡好的Ni Sepharoseexcel树脂；
S413中，用BufferⅠ继续平衡Ni Sepharose excel树脂的流速为2mL/min。
优选的，上述重组人PCSK9蛋白在CHO-K1细胞中的表达纯化方法，S421中，取120mL的Superdex 200prep grade树脂，装配成尺寸排阻层析柱，柱高60cm，柱直径是16mm，用BufferⅢ平衡Superdex 200prep grade树脂的流速为1mL/min；
S422中，用所述浓缩液流经层析柱的流速为1mL/min。
优选的，上述重组人PCSK9蛋白在CHO-K1细胞中的表达纯化方法，S431，取5mL的Qsepharose Fast flow树脂，装配成阴离子交换层析柱，柱高7cm，柱直径10mm，BufferⅣ平衡Q sepharose Fast flow树脂，流速为1mL/min；
S432，将所述截留液以1mL/min的流速流经衡Q sepharose Fast flow树脂；
S433，用BufferⅣ继续平衡Q sepharose Fast flow树脂，流速是2mL/min；
S434，用BufferⅤ清洗Q sepharose Fast flow树脂，流速为1mL/min。
优选的，上述重组人PCSK9蛋白在CHO-K1细胞中的表达纯化方法，每升BufferⅠ中含有50mmol NaH2PO4、20mmol咪唑、300mmol NaCl，溶剂为双蒸水，2M NaOH调pH至7.4；
每升BufferⅡ中含有50mmol NaH2PO4、500mmol咪唑、300mmol NaCl，溶剂为双蒸水，用2M HCl调pH至7.4；
每升BufferⅢ中含有50mmol NaH2PO4，150mmol NaCl，溶剂为双蒸水，用2M NaOH调pH至7.4；
每升BufferⅣ中含有50mmol NaH2PO4，50mmol NaCl，溶剂为双蒸水，用2M NaOH调pH至7.4；
每升BufferⅤ中含有50mmol NaH2PO4，100mmol NaCl，溶剂为双蒸水，用2M NaOH调pH至7.4；
每升BufferⅥ中含有50mmol NaH2PO4，500mmol NaCl，溶剂为双蒸水，用2M NaOH调pH至7.4。
与现有技术相比，本发明提供的一种重组人PCSK9蛋白在CHO-K1细胞中的表达纯化方法，具有以下有益效果：
1、可以在两个月内获高纯度有生物学活性的重组人PCSK9蛋白，该蛋白的表达量和纯度完全可以支撑PCSK9蛋白抑制剂的前期筛选工作。CHO-K1是表达重组蛋白的常用细胞系，选用该细胞系是因为CHO-K1便于后续蛋白质生产的放大，CHO-K1可以经过驯化培养成悬浮细胞，可以用于工业生产。另外本方法首次采用三步层析对重组PCSK9蛋白进行纯化，获得的重组蛋白纯度更高，更加利于研究其功能和性质，减少PCSK9蛋白抑制剂筛选过程中的干扰。
2、本发明的方法简化纯化操作程序，固定各纯化步骤的详细参数，易于普通技术人员的操作。
附图说明
图1是真核表达载体pCMV-pcsk9-His的双酶切电泳图谱；
其中，M泳道为DNA分子量Marker；1号泳道为HindⅢ/EcoRⅠ对质粒的酶切产物；2号泳道为BamHⅠ/EcoRⅠ酶切产物；
图2是三个阳性克隆细胞的Western blot分析图谱；
其中，M泳道为蛋白质分子量Marker；1号泳道为1号克隆细胞株培养液；2号泳道为2号克隆细胞株培养液；3号泳道是3号克隆细胞株培养液；
图3是重组人PCSK9蛋白纯化电泳鉴定图；
其中，M泳道是蛋白质分子量Marker；1号泳道是Ni Sepharose excel纯化产物；2号泳道是Superdex 200prep grade纯化产物；3号泳道是Q sepharose Fast flow纯化产物；
图4是流式细胞仪检测细胞表面FITC的荧光值。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，未注明的实验材料来源均为市售，由于不涉及发明点，故不对其步骤进行详细描述。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。
下述实施例中真核表达载体pCMV-C-His由黄河科技学院生物研究中心保存；感受态细胞DH5α购自天根生化科技有限公司；CHO-K1细胞、HepG2细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司。质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒均购自QIAGEN；各个限制性内切酶HindⅢ、XbaⅠ、BamHⅠ、EcoRⅠ、EcoRⅠ均购自NEB；F12K、胎牛血清、FITC标记的LDLR抗体、双抗、G418等细胞培养用试剂均购自Invitrogen；PCSK9抗体和二抗均购自Abcam；Ni Sepharose excel树脂、Q sepharose Fast flow树脂、Superdex 200prep grade树脂均购自GE。
本发明提供了一种重组人PCSK9蛋白在CHO-K1细胞中的表达纯化方法，具体包括以下步骤：
S1，真核表达载体pCMV-pcsk9-His的构建
根据人pcsk9基因的cDNA序列合成pcsk9基因，然后将pcsk9基因整合入真核表达载体pCMV-C-His，得到真核表达载体pCMV-pcsk9-His，具体为：
由Genebank中查出人pcsk9基因的cDNA序列(NM_174936.3)，送至南京金斯瑞生物科技有限公司合成获得pcsk9基因，合成的pcsk9基因和真核表达载体pCMV-C-His分别用限制性内切酶HindⅢ和XbaⅠ进行双酶切，酶切产物用胶回收试剂盒进行分别回收纯化。回收获得的pcsk9基因和表达载体片段，将pcsk9基因和表达载体片段用T4连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌DH 5α，经氨苄青霉素抗性筛选获得阳性克隆，送Invitrogen测序。挑选测序正确的质粒进行后续的细胞转染，并命名为真核表达载体pCMV-pcsk9-His。分别用HindⅢ/EcoRⅠ和BamHⅠ/EcoRⅠ对真核表达载体pCMV-pcsk9-His进行双酶切，酶切图谱见图1；琼脂糖凝胶电泳显示条带与预期条带一样，说明真核表达载体pCMV-pcsk9-His完整，可以进行后续瞬时转染。
S2，CHO-K1细胞的转染
将浓度为104个/ml的CHO-K1细胞传代培养到6孔板中，待细胞汇合度达到80％时，按照Lipofectamine3000转染试剂的说明书进行真核表达载体pCMV-pcsk9-His转染CHO-K1细胞的操作。
S3，细胞培养
CHO-K1细胞转染后传代培养，在CHO-K1细胞表达出重组人PCSK9蛋白，得到CHO-K1细胞培养液：
在CHO-K1细胞转染24h后，细胞以1：20密度传代，待细胞贴壁以后，更换为含800μg/mL G418的F12K细胞培养液进行培养，每隔三天进行一次换液，连续培养14天，利用克隆环挑出单克隆进行扩大培养，待细胞扩大培养至6孔板时，收集细胞培养液进行Westernblot检测，挑选出阳性克隆进行放大培养，在CHO-K1细胞充分表达出重组人PCSK9蛋白，收集三天的CHO-K1细胞培养液300mL用于后续纯化。三个阳性克隆细胞的Western blot分析如图2所示，均可见清晰的蛋白质条带。
S4，重组人PCSK9蛋白的纯化
本方法首次采用三步层析对重组PCSK9进行纯化，步骤如下：
S41，亲和层析
S411，取10mL的Ni Sepharose excel树脂，装配成亲和层析柱，柱高5cm，柱直径16mm，用100mL BufferⅠ平衡Ni Sepharose excel树脂，流速为2mL/min；
S412，取300mL的CHO-K1细胞培养液，以2mL/min的流速流经平衡好的NiSepharose excel树脂；
S413，用100mL BufferⅠ继续平衡Ni Sepharose excel树脂，流速为2mL/min；
S414，用150mL BufferⅡ洗脱Ni Sepharose excel树脂，流速为1mL/min，收集亲和层析洗脱液；
S415，用截留分子量30KD超滤管将亲和层析洗脱液浓缩至500μL(超滤管内截留的液体)，得到浓缩液；
S42，尺寸排阻层析
S421，取120mL的Superdex 200prep grade树脂，装配成尺寸排阻层析柱，柱高60cm，柱直径是16mm，用600mL BufferⅢ平衡Superdex 200prep grade树脂，流速为1mL/min；
S422，用500μL所述浓缩液流经Superdex 200prep grade树脂，流速为1mL/min，70min后，收集流出液15mL；
S423，用截留分子量30KD超滤管对15mL流出液进行溶液过滤，直至溶液的电导率值小于5mS/cm，弃去滤出液，收集截留液；
S43，阴离子交换层析
S431，取5mL的Q sepharose Fast flow树脂装配成阴离子交换层析柱，柱高7cm，柱直径10mm，50mL BufferⅣ平衡Q sepharose Fast flow树脂，流速为1mL/min；
S432，将所述截留液以1mL/min的流速流经Q sepharose Fast flow树脂；
S433，用50mL BufferⅣ继续平衡Q sepharose Fast flow树脂，流速是2mL/min；
S434，用50mL BufferⅤ清洗Q sepharose Fast flow树脂，流速为1mL/min；
S435，用50mL BufferⅥ洗脱Q sepharose Fast flow树脂，流速是1mL/min收集阴离子交换层析洗脱液；
S436，用截留分子量30KD超滤管对阴离子交换层析洗脱液进行浓缩脱盐，浓缩至500μL，得到纯化的含有重组人PCSK9蛋白的浓缩液(超滤管内截留的液体)；
含有重组人PCSK9蛋白的浓缩液干燥后，最终获得95％纯度(SDS-PAGE检测)以上的重组人PCSK9蛋白，每升CHO-K1细胞培养液可获得为1.2mg的重组人PCSK9蛋白。
Buffer溶液配制：
BufferⅠ：每升BufferⅠ中含有50mmol NaH2PO4、20mmol咪唑、300mmol NaCl，溶剂为双蒸水，2M NaOH调pH至7.4；
BufferⅡ：每升BufferⅡ中含有50mmol NaH2PO4、500mmol咪唑、300mmol NaCl，溶剂为双蒸水，用2M HCl调pH至7.4；
BufferⅢ：每升BufferⅢ中含有50mmol NaH2PO4，150mmol NaCl，溶剂为双蒸水，用2M NaOH调pH至7.4；
BufferⅣ：每升BufferⅣ中含有50mmol NaH2PO4，50mmol NaCl，溶剂为双蒸水，用2M NaOH调pH至7.4；
BufferⅤ：每升BufferⅤ中含有50mmol NaH2PO4，100mmol NaCl，溶剂为双蒸水，用2M NaOH调pH至7.4；
BufferⅥ：每升BufferⅥ中含有50mmol NaH2PO4，500mmol NaCl，溶剂为双蒸水，用2M NaOH调pH至7.4。
图3是重组人PCSK9蛋白纯化电泳鉴定图，M:蛋白质分子量Marker；1是NiSepharose excel纯化产物；2是Superdex 200prep grade纯化产物；3是Q sepharose Fastflow纯化产物。条带越少，纯度越高，经三步纯化后，在55-72KD之间可见一明显条带，基本无杂带，纯化效果良好。
S5，重组人PCSK9蛋白的活性分析
将HepG2细胞以104个/mL的密度传代到6孔板中，培养24h后，将培养液中的胎牛血清更换为人无脂血清，继续培养24h，加入纯化的重组人PCSK9蛋白，使其浓度达到50μg/mL，放入培养箱中继续培养6h，培养条件：37℃，5％CO2，饱和湿度收集细胞，0.1M、pH8.0PBS洗2次，加入FITC标记的LDLR抗体，冰上孵育20min，PBS洗2次，300μL PBS悬浮细胞，过70μm细胞筛网过滤，经流式细胞仪检测细胞表面FITC的荧光值。
设置实验组(加入重组人PCSK9蛋白并使浓度为50μg/mL、加入FITC标记的LDLR抗体)对应图4中1号、空白组(以ddH2O替代重组人PCSK9蛋白和FITC标记的LDLR抗体)对应图4中3号、FITC标记组(以ddH2O替代重组人PCSK9蛋白，加入FITC标记的LDLR抗体)对应图4中2号，经流式细胞仪检测后发现，实验组的FITC荧光值极显著减少(P<0.01)(见图4)，说明PCSK9明显降低了细胞表面LDLR的水平，从而证明我们纯化的PCSK9具有生物学学活性。
本发明的表达纯化方法与现有技术的重组人PCSK9蛋白的表达纯化方法相比，可以在两个月内获高纯度有生物学活性的重组人PCSK9蛋白，该蛋白的表达量和纯度完全可以支撑PCSK9蛋白抑制剂的前期筛选工作。CHO-K1是表达重组蛋白的常用细胞系，选用该细胞系是因为CHO-K1便于后续蛋白质生产的放大，CHO-K1可以经过驯化培养成悬浮细胞，可以用于工业生产。另外本方法首次采用三步层析对人重组PCSK9蛋白进行纯化，获得的重组蛋白纯度更高，更加利于研究其功能和性质，减少PCSK9蛋白抑制剂筛选过程中的干扰。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (5)

1.一种重组人PCSK9蛋白在CHO-K1细胞中的表达纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，真核表达载体pCMV-pcsk9-His的构建
根据人pcsk9基因的cDNA序列合成pcsk9基因，然后将pcsk9基因整合入真核表达载体pCMV-C-His，得到真核表达载体pCMV-pcsk9-His；
S2，CHO-K1细胞的转染
培养CHO-K1细胞汇合度达到80％时，用真核表达载体pCMV-pcsk9-His转染CHO-K1细胞；
S3，细胞培养、表达
CHO-K1细胞转染后传代培养，在CHO-K1细胞表达出重组人PCSK9蛋白，得到CHO-K1细胞培养液；
S4，重组人PCSK9蛋白的纯化
S41，亲和层析
S411，取Ni Sepharose excel树脂，装配成亲和层析柱，用BufferⅠ平衡Ni Sepharoseexcel树脂；
S412，取CHO-K1细胞培养液，流经平衡好的Ni Sepharose excel树脂；
S413，用BufferⅠ继续平衡Ni Sepharose excel树脂；
S414，用BufferⅡ洗脱Ni Sepharose excel树脂，收集亲和层析洗脱液；
S415，用截留分子量30KD超滤管将亲和层析洗脱液浓缩，得到浓缩液；
S42，尺寸排阻层析
S421，取Superdex 200 prep grade树脂，装配成尺寸排阻层析柱，用Buffer Ⅲ平衡Superdex 200 prep grade树脂；
S422，用所述浓缩液流经Superdex 200 prep grade树脂，收集流出液；
S423，用截留分子量30KD超滤管对15mL流出液进行溶液过滤，直至溶液的电导率值小于5mS/cm，弃去滤出液，收集截留液；
S43，阴离子交换层析
S431，取Q sepharose Fast flow树脂，装配成阴离子交换层析柱，BufferⅣ平衡Qsepharose Fast flow树脂；
S432，将所述截留液流经Q sepharose Fast flow树脂；
S433，用BufferⅣ继续平衡Q sepharose Fast flow树脂；
S434，用BufferⅤ清洗Q sepharose Fast flow树脂；
S435，用BufferⅥ洗脱Q sepharose Fast flow树脂，收集阴离子交换层析洗脱液；
S436，用截留分子量30KD超滤管对阴离子交换层析洗脱液进行浓缩脱盐，得到纯化的重组人PCSK9蛋白；
其中，BufferⅠ、BufferⅡ均由NaH2PO4、咪唑、NaCl、双蒸水配制而成，pH均为7.4；BufferⅢ、BufferⅣ、BufferⅤ、BufferⅥ均由NaH2PO4、NaCl、双蒸水配制而成，pH均为7.4。
2.根据权利要求1所述的重组人PCSK9蛋白在CHO-K1细胞中的表达纯化方法，其特征在于，
S411中，用Buffer Ⅰ平衡Ni Sepharose excel树脂的流速为2mL/min；
S412中，取CHO-K1细胞培养液，以2mL/min的流速流经平衡好的Ni Sepharose excel树脂；
S413中，用BufferⅠ继续平衡Ni Sepharose excel树脂的流速为2mL/min。
3.根据权利要求1所述的重组人PCSK9蛋白在CHO-K1细胞中的表达纯化方法，其特征在于，
S421中，取120mL的Superdex 200 prep grade树脂，装配成尺寸排阻层析柱，柱高60cm，柱直径是16mm，用BufferⅢ平衡Superdex 200 prep grade树脂的流速为1mL/min；
S422中，用所述浓缩液流经层析柱的流速为1mL/min。
4.根据权利要求1所述的重组人PCSK9蛋白在CHO-K1细胞中的表达纯化方法，其特征在于，
S431，取5mL的Q sepharose Fast flow树脂，装配成阴离子交换层析柱，柱高7cm，柱直径10mm，BufferⅣ平衡Q sepharose Fast flow树脂，流速为1mL/min；
S432，将所述截留液以1mL/min的流速流经衡Q sepharose Fast flow树脂；
S433，用BufferⅣ继续平衡Q sepharose Fast flow树脂，流速是2mL/min；
S434，用BufferⅤ清洗Q sepharose Fast flow树脂，流速为1mL/min。
5.根据权利要求1所述的重组人PCSK9蛋白在CHO-K1细胞中的表达纯化方法，其特征在于，
每升BufferⅠ中含有50mmol NaH2PO4、20mmol咪唑、300mmol NaCl，溶剂为双蒸水，2MNaOH调pH至7.4；
每升BufferⅡ中含有50mmol NaH2PO4、500mmol咪唑、300mmol NaCl，溶剂为双蒸水，用2M HCl调pH至7.4；
每升BufferⅢ中含有50mmol NaH2PO4，150mmol NaCl，溶剂为双蒸水，用2M NaOH调pH至7.4；
每升BufferⅣ中含有50mmol NaH2PO4，50mmol NaCl，溶剂为双蒸水，用2M NaOH调pH至7.4；
每升BufferⅤ中含有50mmol NaH2PO4，100mmol NaCl，溶剂为双蒸水，用2M NaOH调pH至7.4；
每升BufferⅥ中含有50mmol NaH2PO4，500mmol NaCl，溶剂为双蒸水，用2M NaOH调pH至7.4。
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CN108753821A (zh) * 2018-06-13 2018-11-06 黄河科技学院 一种基于细胞的pcsk9抑制剂筛选方法
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