JPH05268955A - 乳酸菌由来のタンパク質 - Google Patents
乳酸菌由来のタンパク質Info
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- JPH05268955A JPH05268955A JP4148420A JP14842092A JPH05268955A JP H05268955 A JPH05268955 A JP H05268955A JP 4148420 A JP4148420 A JP 4148420A JP 14842092 A JP14842092 A JP 14842092A JP H05268955 A JPH05268955 A JP H05268955A
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- lactic acid
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- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/23—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
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- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
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- A23C19/00—Cheese; Cheese preparations; Making thereof
- A23C19/02—Making cheese curd
- A23C19/032—Making cheese curd characterised by the use of specific microorganisms, or enzymes of microbial origin
- A23C19/0328—Enzymes other than milk clotting enzymes, e.g. lipase, beta-galactosidase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
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- C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
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- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 従来知られているエクソペプチダーゼと異
なり、オリゴペプチドをよく分解して、例えばチーズ熟
成の際の苦み発生の防止やビール等の発酵飲料の清澄化
に有用なエンドペプチダーゼ活性を有する乳酸菌由来の
タンパク質提供を目的とする。 【構成】 単離されたタンパク質は、５個またはそれ
以上のアミノ酸を有するペプチド類、メトエンケファリ
ン、ブラジキニン、グルカゴン、酸化インスリンβ鎖お
よびニューロテンシンを含むが５個未満のアミノ酸を有
するペプチド類ならびにα−、β−、およびκ−カゼイ
ンを含まない基質範囲を有しており、更に７０ＫＤ±５
ＫＤの分子量、４．１±０．４の等電点、３０〜３８℃
の最適温度及び６．０〜６．５の最適ｐＨ値を有してい
る。
なり、オリゴペプチドをよく分解して、例えばチーズ熟
成の際の苦み発生の防止やビール等の発酵飲料の清澄化
に有用なエンドペプチダーゼ活性を有する乳酸菌由来の
タンパク質提供を目的とする。 【構成】 単離されたタンパク質は、５個またはそれ
以上のアミノ酸を有するペプチド類、メトエンケファリ
ン、ブラジキニン、グルカゴン、酸化インスリンβ鎖お
よびニューロテンシンを含むが５個未満のアミノ酸を有
するペプチド類ならびにα−、β−、およびκ−カゼイ
ンを含まない基質範囲を有しており、更に７０ＫＤ±５
ＫＤの分子量、４．１±０．４の等電点、３０〜３８℃
の最適温度及び６．０〜６．５の最適ｐＨ値を有してい
る。
Description
本発明は単離または精製された乳酸菌由来のタンパク
質、即ち、インビボの乳酸菌中に含まれる状態に比較し
て実質的に純粋な状態のタンパク質に関する。更に詳し
くは、本発明はペプチダーゼ活性を有する酵素である乳
酸菌由来のタンパク質に関する。また、本発明は該タン
パク質の発現能を有する（即ちタンパク質を形成するこ
とができる）遺伝子工学的に形質転換された生物、特に
微生物（バクテリアのみでなくカビ及び酵母）に関し；
該タンパク質をコードするヌクレオチド配列（特にＤＮ
Ａ）に関し；組換えポリヌクレオチド、特に該タンパク
質をコードする遺伝情報を含む組換えＤＮＡ、及び形質
転換マーカーとしての該組換えポリヌクレオチドの用途
に関し；該タンパク質が発現している生物、たとえば、
乳酸菌から単離することにより該タンパク質を製造する
方法に関し；該タンパク質を用いる該タンパク質に対す
るポリクロナールおよびモノクロナール抗体（即ち、該
タンパク質に対して親和性及び／又は特異性を有する）
の製造と、上記抗体自体及び該タンパク質の検出、除去
及び／又は単離のための上記抗体の利用に関し；ペプチ
ダーゼ酵素活性を有する該タンパク質を用いる、チーズ
その他の乳製品のような食品、肉製品、タンパク質加水
解物の製造方法及び同方法により得られる食品に関す
る。
質、即ち、インビボの乳酸菌中に含まれる状態に比較し
て実質的に純粋な状態のタンパク質に関する。更に詳し
くは、本発明はペプチダーゼ活性を有する酵素である乳
酸菌由来のタンパク質に関する。また、本発明は該タン
パク質の発現能を有する（即ちタンパク質を形成するこ
とができる）遺伝子工学的に形質転換された生物、特に
微生物（バクテリアのみでなくカビ及び酵母）に関し；
該タンパク質をコードするヌクレオチド配列（特にＤＮ
Ａ）に関し；組換えポリヌクレオチド、特に該タンパク
質をコードする遺伝情報を含む組換えＤＮＡ、及び形質
転換マーカーとしての該組換えポリヌクレオチドの用途
に関し；該タンパク質が発現している生物、たとえば、
乳酸菌から単離することにより該タンパク質を製造する
方法に関し；該タンパク質を用いる該タンパク質に対す
るポリクロナールおよびモノクロナール抗体（即ち、該
タンパク質に対して親和性及び／又は特異性を有する）
の製造と、上記抗体自体及び該タンパク質の検出、除去
及び／又は単離のための上記抗体の利用に関し；ペプチ
ダーゼ酵素活性を有する該タンパク質を用いる、チーズ
その他の乳製品のような食品、肉製品、タンパク質加水
解物の製造方法及び同方法により得られる食品に関す
る。
【０００２】
【産業上の利用分野】乳酸菌特に乳酸ラクトコッカス
（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）族、例えば、ラクトコッカ
ス ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉ
ｓ）（以下しばしば”Ｌ． ｌａｃｔｉｓ”と略す）亜
種クレモリス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ），ラクティス（ｌａ
ｃｔｉｓ）とジアセチラクティス（ｄｉａｃｅｔｙｌａ
ｃｔｉｓ）及びその他の乳酸菌たとえばルーコノストッ
ク（ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）族等は広く食品産業で、
特に、チーズなどの発酵乳酸製品を生産する乳製品産業
で利用されている。ラクトースから乳酸を産生すること
により、食品を酸性にして食品の腐敗を防ぐのである。
また、乳酸菌は食品の風味の醸成に関与する。上記に関
し重要な工程はタンパク質の分解である。
（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）族、例えば、ラクトコッカ
ス ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉ
ｓ）（以下しばしば”Ｌ． ｌａｃｔｉｓ”と略す）亜
種クレモリス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ），ラクティス（ｌａ
ｃｔｉｓ）とジアセチラクティス（ｄｉａｃｅｔｙｌａ
ｃｔｉｓ）及びその他の乳酸菌たとえばルーコノストッ
ク（ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）族等は広く食品産業で、
特に、チーズなどの発酵乳酸製品を生産する乳製品産業
で利用されている。ラクトースから乳酸を産生すること
により、食品を酸性にして食品の腐敗を防ぐのである。
また、乳酸菌は食品の風味の醸成に関与する。上記に関
し重要な工程はタンパク質の分解である。
【０００３】乳酸菌の成育と乳酸の産生のためには、ビ
タミンやアミノ酸等の必須成育因子を提供する栄養培地
が必要である。ミルクは好適な栄養培地であり、乳酸菌
の高細胞密度での成育を可能にする。しかしながら、こ
の目的のためには、ミルク中の遊離アミノ酸含量が不充
分であるため、乳酸菌のアミノ酸要求に関するかぎりで
は、乳酸菌はそのタンパク質分解系によって乳蛋白、特
にカゼインの分解を行う。乳酸菌のタンパク質分解系
は、育成停止後、例えばチーズ熟成過程でも活性を維持
し、カゼインのペプチドへの、更にはアミノ酸への分解
の結果としてチーズ風味の醸成に寄与する。
タミンやアミノ酸等の必須成育因子を提供する栄養培地
が必要である。ミルクは好適な栄養培地であり、乳酸菌
の高細胞密度での成育を可能にする。しかしながら、こ
の目的のためには、ミルク中の遊離アミノ酸含量が不充
分であるため、乳酸菌のアミノ酸要求に関するかぎりで
は、乳酸菌はそのタンパク質分解系によって乳蛋白、特
にカゼインの分解を行う。乳酸菌のタンパク質分解系
は、育成停止後、例えばチーズ熟成過程でも活性を維持
し、カゼインのペプチドへの、更にはアミノ酸への分解
の結果としてチーズ風味の醸成に寄与する。
【０００４】
【従来の技術】乳酸菌ラクトコッカスのタンパク質分解
系は、種々のプロティナーゼと種々のペプチダーゼを含
有する。ラクトコッカス ラクティス（Ｌ． Ｌａｃｔ
ｉｓ）のプロティナーゼはβ−カゼインのようなタンパ
ク質を５個以上のアミノ酸からなる数個のオリゴペプチ
ドに加水分解する。タンパク質分解酵素は菌細胞壁に局
在するのに対し、形成されたオリゴペプチドを小さなペ
プチド及びアミノ酸に更に分解するペプチダーゼは培地
中、細胞壁中、細胞内に存在する。
系は、種々のプロティナーゼと種々のペプチダーゼを含
有する。ラクトコッカス ラクティス（Ｌ． Ｌａｃｔ
ｉｓ）のプロティナーゼはβ−カゼインのようなタンパ
ク質を５個以上のアミノ酸からなる数個のオリゴペプチ
ドに加水分解する。タンパク質分解酵素は菌細胞壁に局
在するのに対し、形成されたオリゴペプチドを小さなペ
プチド及びアミノ酸に更に分解するペプチダーゼは培地
中、細胞壁中、細胞内に存在する。
【０００５】乳酸菌のいくつかのペプチダーゼが単離さ
れ、特性が明らかにされている。ティー．アール．ヤン
ら（Ｔ．Ｒ．Ｙａｎら）（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．１６３，１９８７，２５９−２６５，およびＡｐｐ
ｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５３，１９
８７，２２９６−２３０２）は大きなカゼイン片をより
小さなペプチドに加水分解し、更にその小さなペプチド
をアミノペプチダーゼによって更に分解できるストレプ
トコッカス クレモリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｃｒｅｍｏｒｉｓ）（以下しばしば”Ｓ． ｃｒｅｍｏ
ｒｉｓ”と略す）Ｈ６１から単離したエンドペプチダー
ゼ類について記述している。特異なＸ−プロリル−ジペ
プチジルアミノペプチダーゼがプロリンに富んだペプチ
ドを分解する一方でジペプチダーゼ、トリペプチダー
ゼ、プロリダーゼが遊離アミノ酸を放出し、最終的にカ
ゼインの分解を完了する。
れ、特性が明らかにされている。ティー．アール．ヤン
ら（Ｔ．Ｒ．Ｙａｎら）（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．１６３，１９８７，２５９−２６５，およびＡｐｐ
ｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５３，１９
８７，２２９６−２３０２）は大きなカゼイン片をより
小さなペプチドに加水分解し、更にその小さなペプチド
をアミノペプチダーゼによって更に分解できるストレプ
トコッカス クレモリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｃｒｅｍｏｒｉｓ）（以下しばしば”Ｓ． ｃｒｅｍｏ
ｒｉｓ”と略す）Ｈ６１から単離したエンドペプチダー
ゼ類について記述している。特異なＸ−プロリル−ジペ
プチジルアミノペプチダーゼがプロリンに富んだペプチ
ドを分解する一方でジペプチダーゼ、トリペプチダー
ゼ、プロリダーゼが遊離アミノ酸を放出し、最終的にカ
ゼインの分解を完了する。
【０００６】オランダのチーズ産業において、ラクトコ
ッカス ラクティス(Ｌ． ｌａｃｔｉｓ）亜種クレモリ
ス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）は、最も重要な乳酸菌の種であ
る。ラクトコッカス ラクティス(Ｌ． ｌａｃｔｉｓ）
亜種クレモリス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）などのラクトコッ
カスのタンパク質分解系についての優れた洞察は、スタ
ーター培養(starter culture)の改良と熟成工程の制御
の改良に寄与し、この結果、チーズ熟成期間を短縮し、
苦みの発生(苦みペプチドの形成)を防止することができ
る。上記に関する多くの基本的情報は、アール.オット
ー（Ｒ．Ｏｔｔｏ）著の論文”発酵開始ストレプトコッ
カス菌の生態生理学的研究"An ecophysiological study
of starter streptococci"(グロニンゲン州立大学、１
９８１）及びジェー．フーゲンホルツ（Ｊ．Ｈｕｇｅｎ
ｈｏｌｔｚ）著の論文”混合スターター培養における細
胞数変動”"Population dynamics of mixed starter cu
ltures"（グロニンゲン州立大学、１９８６）に記され
ている。後者の論文には、ラクトコッカス ラクティス
(Ｌ． ｌａｃｔｉｓ）亜種クレモリス（ｃｒｅｍｏｒｉ
ｓ）Ｗｇ２のプロティナーゼに関する研究が記されてお
り、また、エー．ファン ボーベン(Ａ．ｖａｎ Ｂｏｖ
ｅｎ)著、"ストレプトコッカス.クレモリス(Ｓ． Ｃｒ
ｅｍｏｒｉｓ）著の論文”ペプチドの取りこみと加水分
解”"The uptake and hydrolysis of peptides by S. c
remoris"には、ラクトコッカス ラクティス(Ｌ． ｌａ
ｃｔｉｓ）亜種クレモリス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｗｇ２
のタンパク質分解系の詳しい研究が記されている。
ッカス ラクティス(Ｌ． ｌａｃｔｉｓ）亜種クレモリ
ス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）は、最も重要な乳酸菌の種であ
る。ラクトコッカス ラクティス(Ｌ． ｌａｃｔｉｓ）
亜種クレモリス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）などのラクトコッ
カスのタンパク質分解系についての優れた洞察は、スタ
ーター培養(starter culture)の改良と熟成工程の制御
の改良に寄与し、この結果、チーズ熟成期間を短縮し、
苦みの発生(苦みペプチドの形成)を防止することができ
る。上記に関する多くの基本的情報は、アール.オット
ー（Ｒ．Ｏｔｔｏ）著の論文”発酵開始ストレプトコッ
カス菌の生態生理学的研究"An ecophysiological study
of starter streptococci"(グロニンゲン州立大学、１
９８１）及びジェー．フーゲンホルツ（Ｊ．Ｈｕｇｅｎ
ｈｏｌｔｚ）著の論文”混合スターター培養における細
胞数変動”"Population dynamics of mixed starter cu
ltures"（グロニンゲン州立大学、１９８６）に記され
ている。後者の論文には、ラクトコッカス ラクティス
(Ｌ． ｌａｃｔｉｓ）亜種クレモリス（ｃｒｅｍｏｒｉ
ｓ）Ｗｇ２のプロティナーゼに関する研究が記されてお
り、また、エー．ファン ボーベン(Ａ．ｖａｎ Ｂｏｖ
ｅｎ)著、"ストレプトコッカス.クレモリス(Ｓ． Ｃｒ
ｅｍｏｒｉｓ）著の論文”ペプチドの取りこみと加水分
解”"The uptake and hydrolysis of peptides by S. c
remoris"には、ラクトコッカス ラクティス(Ｌ． ｌａ
ｃｔｉｓ）亜種クレモリス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｗｇ２
のタンパク質分解系の詳しい研究が記されている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】今までにラクトコッカ
ス ラクティス(Ｌ． ｌａｃｔｉｓ）亜種クレモリス
（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｗｇ２から３種のペプチダーゼが
単離され生化学的に特性が調べられてきた。即ち、ジペ
プチダーゼ(Ａ．ｖａｎ Ｂｏｖｅｎら．，Ａｐｐｌ．Ｅ
ｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４，１９８８．
４３−４９），トリペプチダーゼ(Ｂ．Ｗ．Ｂｏｓｍａ
ｎら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．５６，１９９０，１８３９−１８４３），及びアミ
ノペプチダーゼ（Ｐ．Ｓ．Ｔ．Ｔａｎ 及び Ｗ．Ｎ．Ｋ
ｏｎｉｎｇｓ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．５６，１９９０，５２６−５３２）であ
る。まだ完全に特性調査が完了していないＸ−プロリル
−ジペプチジル アミノペプチダーゼに加えて、これら
３種の酵素はすべてエクソペプチダーゼであり、エンド
ペプチダーゼ様の活性を呈さない。しかしながら、エン
ドペプチダーゼ様の活性はカゼインの分解を効果的に完
全に行うには必須である。
ス ラクティス(Ｌ． ｌａｃｔｉｓ）亜種クレモリス
（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｗｇ２から３種のペプチダーゼが
単離され生化学的に特性が調べられてきた。即ち、ジペ
プチダーゼ(Ａ．ｖａｎ Ｂｏｖｅｎら．，Ａｐｐｌ．Ｅ
ｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４，１９８８．
４３−４９），トリペプチダーゼ(Ｂ．Ｗ．Ｂｏｓｍａ
ｎら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．５６，１９９０，１８３９−１８４３），及びアミ
ノペプチダーゼ（Ｐ．Ｓ．Ｔ．Ｔａｎ 及び Ｗ．Ｎ．Ｋ
ｏｎｉｎｇｓ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．５６，１９９０，５２６−５３２）であ
る。まだ完全に特性調査が完了していないＸ−プロリル
−ジペプチジル アミノペプチダーゼに加えて、これら
３種の酵素はすべてエクソペプチダーゼであり、エンド
ペプチダーゼ様の活性を呈さない。しかしながら、エン
ドペプチダーゼ様の活性はカゼインの分解を効果的に完
全に行うには必須である。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らはラクトコッ
カス ラクティス（Ｌ． ｌａｃｔｉｓ)亜種クレモリス
（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｗｇ２のペプチダーゼについて鋭
意研究を重ねた結果、Ｙａｎらによって報告された公知
のエンドペプチダーゼとは明らかに異なる新規な特定の
エンドペプチダーゼを単離し、特性を明らかにすること
に成功した。該エンドペプチダーゼはジエチルアミノエ
タン（ＤＥＡＥ）セファセル カラム クロマトグラフィ
ー、続いて、フェニル セファロース クロマトグラフィ
ー、およびヒドロキシルアパタイト クロマトグラフィ
ーと陰イオン交換カラムおよび疎水的相互作用カラムを
用いる高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）包含す
る方法を実施することによりラクトコッカス ラクティ
ス(Ｌ． ｌａｃｔｉｓ）亜種クレモリス（ｃｒｅｍｏｒ
ｉｓ）Ｗｇ２の粗細胞抽出物から精製した。ゲル濾過と
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳
動（以下しばしば“ＳＤＳ−ＰＡＧＥ”と略す）を実施
したところ７０ｋＤの精製酵素分子量を示した。多様な
テトラ−、トリ−、およびジ−ペプチドに分解される数
個のオリゴペプチドに関してはエンドペプチダーゼは加
水分解活性を示す。このエンドペプチダーゼはアミノペ
プチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、ジペプチダーゼ
又はトリペプチダーゼの活性を有さない。エンドペプチ
ダーゼが最適な活性を示すのは、ｐＨ６．０からｐＨ
６．５迄であり最適温度範囲は３０度から３８度迄であ
る。そして化学薬剤の１、１０−フェナントロリン、エ
チレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ），β−メルカプトエ
タノールおよびフェニルメチルスルフォニル フルオラ
イドによって不活化され、Ｃｕ2+及びＺｎ2+によって阻
害される。ＥＤＴＡまたは１、１０−フェナントロリン
処理の酵素はＣｏ2+により再活性化することができる。
精製したエンドペプチダーゼに対する特異抗体を用いて
免疫ブロッティングしたところ該エンドペプチダーゼは
他のラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）亜種並
びにラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｕｓ）亜
種、及びストレプトコッカス テルモフィラス（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）亜種
にも存在することを示した。
カス ラクティス（Ｌ． ｌａｃｔｉｓ)亜種クレモリス
（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｗｇ２のペプチダーゼについて鋭
意研究を重ねた結果、Ｙａｎらによって報告された公知
のエンドペプチダーゼとは明らかに異なる新規な特定の
エンドペプチダーゼを単離し、特性を明らかにすること
に成功した。該エンドペプチダーゼはジエチルアミノエ
タン（ＤＥＡＥ）セファセル カラム クロマトグラフィ
ー、続いて、フェニル セファロース クロマトグラフィ
ー、およびヒドロキシルアパタイト クロマトグラフィ
ーと陰イオン交換カラムおよび疎水的相互作用カラムを
用いる高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）包含す
る方法を実施することによりラクトコッカス ラクティ
ス(Ｌ． ｌａｃｔｉｓ）亜種クレモリス（ｃｒｅｍｏｒ
ｉｓ）Ｗｇ２の粗細胞抽出物から精製した。ゲル濾過と
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳
動（以下しばしば“ＳＤＳ−ＰＡＧＥ”と略す）を実施
したところ７０ｋＤの精製酵素分子量を示した。多様な
テトラ−、トリ−、およびジ−ペプチドに分解される数
個のオリゴペプチドに関してはエンドペプチダーゼは加
水分解活性を示す。このエンドペプチダーゼはアミノペ
プチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、ジペプチダーゼ
又はトリペプチダーゼの活性を有さない。エンドペプチ
ダーゼが最適な活性を示すのは、ｐＨ６．０からｐＨ
６．５迄であり最適温度範囲は３０度から３８度迄であ
る。そして化学薬剤の１、１０−フェナントロリン、エ
チレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ），β−メルカプトエ
タノールおよびフェニルメチルスルフォニル フルオラ
イドによって不活化され、Ｃｕ2+及びＺｎ2+によって阻
害される。ＥＤＴＡまたは１、１０−フェナントロリン
処理の酵素はＣｏ2+により再活性化することができる。
精製したエンドペプチダーゼに対する特異抗体を用いて
免疫ブロッティングしたところ該エンドペプチダーゼは
他のラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）亜種並
びにラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｕｓ）亜
種、及びストレプトコッカス テルモフィラス（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）亜種
にも存在することを示した。
【０００９】本発明による新規なエンドペプチダーゼ
は、酵素のある種の特性、たとえば、ＥＤＴＡによる不
活化、ある種のペプチドに対する作用などの点で類似し
てはいるけれども、ヤンら（Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．）に
よって報告されたエンドペプチダーゼＬＥＰ Ｉならび
にＬＥＰ ＩＩとは異なるものである。本発明のエンド
ペプチダーゼは７０ｋＤの分子量を有するモノマーであ
り、一方乳酸菌ラクトコッカス ラクティス(Ｌ． ｌａ
ｃｔｉｓ）亜種クレモリス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｈ６１
由来のＬＥＰ Iは分子量が９８ｋＤであり、ＬＥＰＩＩ
は分子量が８０ｋＤの二量体のようである。違いは又多
様な金属イオンたとえばＺｎ2+がペプチダーゼ活性に及
ぼす影響に関しても認められる。Ｚｎ2+は本発明のエン
ドペプチダーゼ活性を完全に阻害するが、ＬＥＰ Iの活
性は影響を受けない。ＬＥＰ Ｉの金属劣化活性はＭｎ2
+によって回復できるが、Ｚｎ2+のほうはＥＤＴＡで処
理されたＬＥＰ ＩＩ活性をも回復できる。又これら３
種の酵素のｐＨ最適値や等電点（ｐＩ）も相違してい
る。ＬＥＰ Ｉの最適ｐＨは７〜７．５であり等電点は
５．１であるが本エンドペプチダーゼの最適ｐＨは約
６．３、等電点は４．１である。この酵素は又それぞれ
異なった基質特異性を有している。本エンドペプチダー
ゼとは異なりＬＥＰ Ｉはグルカゴンや酸化インスリン
β鎖を加水分解することはできない。最後になるがＬＥ
Ｐ ＩＩと本エンドペプチダーゼとではアミノ酸組成と
Ｎ末端アミノ酸配列が著しく異なる。
は、酵素のある種の特性、たとえば、ＥＤＴＡによる不
活化、ある種のペプチドに対する作用などの点で類似し
てはいるけれども、ヤンら（Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．）に
よって報告されたエンドペプチダーゼＬＥＰ Ｉならび
にＬＥＰ ＩＩとは異なるものである。本発明のエンド
ペプチダーゼは７０ｋＤの分子量を有するモノマーであ
り、一方乳酸菌ラクトコッカス ラクティス(Ｌ． ｌａ
ｃｔｉｓ）亜種クレモリス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｈ６１
由来のＬＥＰ Iは分子量が９８ｋＤであり、ＬＥＰＩＩ
は分子量が８０ｋＤの二量体のようである。違いは又多
様な金属イオンたとえばＺｎ2+がペプチダーゼ活性に及
ぼす影響に関しても認められる。Ｚｎ2+は本発明のエン
ドペプチダーゼ活性を完全に阻害するが、ＬＥＰ Iの活
性は影響を受けない。ＬＥＰ Ｉの金属劣化活性はＭｎ2
+によって回復できるが、Ｚｎ2+のほうはＥＤＴＡで処
理されたＬＥＰ ＩＩ活性をも回復できる。又これら３
種の酵素のｐＨ最適値や等電点（ｐＩ）も相違してい
る。ＬＥＰ Ｉの最適ｐＨは７〜７．５であり等電点は
５．１であるが本エンドペプチダーゼの最適ｐＨは約
６．３、等電点は４．１である。この酵素は又それぞれ
異なった基質特異性を有している。本エンドペプチダー
ゼとは異なりＬＥＰ Ｉはグルカゴンや酸化インスリン
β鎖を加水分解することはできない。最後になるがＬＥ
Ｐ ＩＩと本エンドペプチダーゼとではアミノ酸組成と
Ｎ末端アミノ酸配列が著しく異なる。
【００１０】本発明の新規なエンドペプチダーゼは、チ
ーズ熟成時における望ましくない苦みの生成の防止に使
用できる。実際にある種の乳酸菌ラクトコッカス ラク
ティス（Ｌ． ｌａｃｔｉｓ）亜種クレモリス（ｃｒｅ
ｍｏｒｉｓ）菌株は、カゼイン分解後、スターター（発
酵開始バクテリア）培養液中に存在する該乳酸菌のペプ
チダーゼにより徐々に分解されていく疎水性アミノ酸含
量の高いペプチドを蓄積する結果、異なった度合の苦み
を生成することが知見されている。本トリペプチダーゼ
の利用によりこの問題点を軽減することができた。
ーズ熟成時における望ましくない苦みの生成の防止に使
用できる。実際にある種の乳酸菌ラクトコッカス ラク
ティス（Ｌ． ｌａｃｔｉｓ）亜種クレモリス（ｃｒｅ
ｍｏｒｉｓ）菌株は、カゼイン分解後、スターター（発
酵開始バクテリア）培養液中に存在する該乳酸菌のペプ
チダーゼにより徐々に分解されていく疎水性アミノ酸含
量の高いペプチドを蓄積する結果、異なった度合の苦み
を生成することが知見されている。本トリペプチダーゼ
の利用によりこの問題点を軽減することができた。
【００１１】更に、本トリペプチダーゼは他の目的例え
ばビールや飲料の清澄化のような目的にも使用可能であ
る。そして当然ながらこのものは広義のＤＮＡ技術にも
利用可能である。本発明の１つの態様によればエンドペ
プチダーゼそのものが提供される。即ち、乳酸菌由来の
単離又は精製されたタンパク質にして、Ｃｏ2+依存性エ
ンドペプチダーゼ酵素活性を有し基質範囲が５個または
それ以上のアミノ酸を有するペプチド類、メトエンケフ
ァリン、ブラジキニン、グルカゴン、酸化インスリンβ
鎖及びニューロテンシンを含むが５個未満のアミノ酸を
有するペプチド類並びにα−，β−並びにκ−カゼイン
を含まない基質範囲を有しており、更に７０ｋＤ±５ｋ
Ｄの分子量、４．１±０．４の等電点、３０℃〜３８℃
の最適温度及び６．０〜６．５の最適ｐＨ値を有するこ
とを特徴とするエンドペプチダーゼが提供される。 こ
のエンドペプチダーゼはＮ−末端のアミノ酸配列がＴｈ
ｒ−Ｘａａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ
−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ−
Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−（式中Ｘａａは未確認）であ
ることを特徴とする。
ばビールや飲料の清澄化のような目的にも使用可能であ
る。そして当然ながらこのものは広義のＤＮＡ技術にも
利用可能である。本発明の１つの態様によればエンドペ
プチダーゼそのものが提供される。即ち、乳酸菌由来の
単離又は精製されたタンパク質にして、Ｃｏ2+依存性エ
ンドペプチダーゼ酵素活性を有し基質範囲が５個または
それ以上のアミノ酸を有するペプチド類、メトエンケフ
ァリン、ブラジキニン、グルカゴン、酸化インスリンβ
鎖及びニューロテンシンを含むが５個未満のアミノ酸を
有するペプチド類並びにα−，β−並びにκ−カゼイン
を含まない基質範囲を有しており、更に７０ｋＤ±５ｋ
Ｄの分子量、４．１±０．４の等電点、３０℃〜３８℃
の最適温度及び６．０〜６．５の最適ｐＨ値を有するこ
とを特徴とするエンドペプチダーゼが提供される。 こ
のエンドペプチダーゼはＮ−末端のアミノ酸配列がＴｈ
ｒ−Ｘａａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ
−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ−
Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−（式中Ｘａａは未確認）であ
ることを特徴とする。
【００１２】後述の実施例で実際に単離し、特性を明ら
かにしたエンドペプチダーゼは１つの特定の生物即ち、
乳酸菌ラクトコッカス ラクティス(Ｌａｃｔｏｃｃｏｏ
ｕｓ ｌａｃｔｉｓ)亜種クレモリス(ｃｒｅｍｏｒｉｓ)
Ｗｇ２に由来するが、本発明は又他の乳酸菌の対応エン
ドペプチダーゼをも包含する。何故ならこれらのエンド
ペプチダーゼは対応する性質を有しており乳酸菌から同
様の方法で単離精製できるからである。"対応エンドペ
プチダーゼ”という用語は全く等しい、即ちアミノ酸配
列が同じペプチダーゼという意味ではなく、むしろこれ
らのペプチダーゼが上記のエンドペプチダーゼの特性を
満たすという意味である。
かにしたエンドペプチダーゼは１つの特定の生物即ち、
乳酸菌ラクトコッカス ラクティス(Ｌａｃｔｏｃｃｏｏ
ｕｓ ｌａｃｔｉｓ)亜種クレモリス(ｃｒｅｍｏｒｉｓ)
Ｗｇ２に由来するが、本発明は又他の乳酸菌の対応エン
ドペプチダーゼをも包含する。何故ならこれらのエンド
ペプチダーゼは対応する性質を有しており乳酸菌から同
様の方法で単離精製できるからである。"対応エンドペ
プチダーゼ”という用語は全く等しい、即ちアミノ酸配
列が同じペプチダーゼという意味ではなく、むしろこれ
らのペプチダーゼが上記のエンドペプチダーゼの特性を
満たすという意味である。
【００１３】本発明のより特定の的態様は乳酸菌ラクト
コッカス（Ｌａｃｏｔｃｏｃｃｕｓ）に由来する特に乳
酸菌ラクトコッカス ラクティス(Ｌａｃｔｏｃｃｏｏｕ
ｓ ｌａｃｔｉｓ)亜種クレモリス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）
に、最も好ましくは乳酸菌ラクトコッカス ラクティス
(Ｌａｃｔｏｃｃｏｏｕｓ ｌａｃｔｉｓ)亜種クレモリ
ス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｗｇ２に由来するエンドペプチ
ダーゼに関するものである。
コッカス（Ｌａｃｏｔｃｏｃｃｕｓ）に由来する特に乳
酸菌ラクトコッカス ラクティス(Ｌａｃｔｏｃｃｏｏｕ
ｓ ｌａｃｔｉｓ)亜種クレモリス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）
に、最も好ましくは乳酸菌ラクトコッカス ラクティス
(Ｌａｃｔｏｃｃｏｏｕｓ ｌａｃｔｉｓ)亜種クレモリ
ス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｗｇ２に由来するエンドペプチ
ダーゼに関するものである。
【００１４】“単離または精製された状態で”及び“に
由来する”という表現は、本発明をそれらの自然環境か
ら単離したエンドペプチダーゼに限定するものではな
い。事実本発明は、エンドペプチダーゼ遺伝子をトレー
スすることにより、組換えＤＮＡ技術で形質転換細胞ま
たは微生物にエンドペプチダーゼの産生を可能にする。
この目的のため、例えばエンドペプチダーゼのアミノ酸
配列が決定される（一部のアミノ酸配列はすでに決定さ
れている）。これに基づき、対応するＤＮＡ配列を遺伝
子コードより求め、その結果適切なＤＮＡプローブを合
成し、それを用いてエンドペプチダーゼメッセンジャー
ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を検出、単離できる。このｍＲＮＡ
は、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼのような酵素を用
いて常法によりコピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の調製に利用
できる。このｃＤＮＡを適当なベクター（通常はプラス
ミド類又はファージ類）を用いてクローン化し、適当な
宿主細胞内で発現する。そのものから産生したエンドペ
プチダーゼは容易に回収できる。同様にこのＤＮＡプロ
ーブは乳酸菌のゲノム中のエンドペプチダーゼ遺伝子の
探索に用いることができ、探索された遺伝子は常法によ
り適当な宿主の形質転換、形質転換細胞での該遺伝子の
発現を行なうことができる。
由来する”という表現は、本発明をそれらの自然環境か
ら単離したエンドペプチダーゼに限定するものではな
い。事実本発明は、エンドペプチダーゼ遺伝子をトレー
スすることにより、組換えＤＮＡ技術で形質転換細胞ま
たは微生物にエンドペプチダーゼの産生を可能にする。
この目的のため、例えばエンドペプチダーゼのアミノ酸
配列が決定される（一部のアミノ酸配列はすでに決定さ
れている）。これに基づき、対応するＤＮＡ配列を遺伝
子コードより求め、その結果適切なＤＮＡプローブを合
成し、それを用いてエンドペプチダーゼメッセンジャー
ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を検出、単離できる。このｍＲＮＡ
は、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼのような酵素を用
いて常法によりコピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の調製に利用
できる。このｃＤＮＡを適当なベクター（通常はプラス
ミド類又はファージ類）を用いてクローン化し、適当な
宿主細胞内で発現する。そのものから産生したエンドペ
プチダーゼは容易に回収できる。同様にこのＤＮＡプロ
ーブは乳酸菌のゲノム中のエンドペプチダーゼ遺伝子の
探索に用いることができ、探索された遺伝子は常法によ
り適当な宿主の形質転換、形質転換細胞での該遺伝子の
発現を行なうことができる。
【００１５】 このような遺伝子操作に基づ
き、マーカープラスミドを構築することもできる。この
マーカープラスミドには他の望ましい遺伝子に融合した
エンドペプチダーゼ遺伝子が含まれている。かかるプラ
スミドでエンドペプチダーゼを含まない宿主を形質転換
することで、融合産物の発現物を得ることができる。こ
の発現物は、たとえばメトエンケファリンのような特定
のエンドペプチダーゼ基質を用いるか、或いはエンドペ
プチダーゼに対するポリクローナル又はモノクローナル
抗体を用いて容易にスクリーニングすることができる。
かかるマーカープラスミドは、一般に安全と見なされて
いる細菌種（ＧＲＡＳ生物）に由来していることから食
品業界に多大の意義がある。
き、マーカープラスミドを構築することもできる。この
マーカープラスミドには他の望ましい遺伝子に融合した
エンドペプチダーゼ遺伝子が含まれている。かかるプラ
スミドでエンドペプチダーゼを含まない宿主を形質転換
することで、融合産物の発現物を得ることができる。こ
の発現物は、たとえばメトエンケファリンのような特定
のエンドペプチダーゼ基質を用いるか、或いはエンドペ
プチダーゼに対するポリクローナル又はモノクローナル
抗体を用いて容易にスクリーニングすることができる。
かかるマーカープラスミドは、一般に安全と見なされて
いる細菌種（ＧＲＡＳ生物）に由来していることから食
品業界に多大の意義がある。
【００１６】本発明のエンドペプチダーゼは、エンドペ
プチダーゼが自然に発現する乳酸菌の細胞マス、培地又
は分泌産物から、或いは遺伝子工学を用いてエンドペプ
チダーゼを発現する能力を獲得した生物の細胞マス、培
地、又は分泌産物から単離して得られる。
プチダーゼが自然に発現する乳酸菌の細胞マス、培地又
は分泌産物から、或いは遺伝子工学を用いてエンドペプ
チダーゼを発現する能力を獲得した生物の細胞マス、培
地、又は分泌産物から単離して得られる。
【００1７】本発明の別の態様によれば、遺伝子工学の
手段により本発明のエンドペプチダーゼを発現するとい
う外来の能力を獲得しているか、本来持っている能力よ
りも強いエンドペプチダーゼ発現能力を獲得した生物特
に微生物が提供される。
手段により本発明のエンドペプチダーゼを発現するとい
う外来の能力を獲得しているか、本来持っている能力よ
りも強いエンドペプチダーゼ発現能力を獲得した生物特
に微生物が提供される。
【００１８】本発明の更に別の態様によれば、本発明の
エンドペプチダーゼをコードする遺伝情報を包含する組
換えポリヌクレオチド、特に組換えＤＮＡが提供され
る。この組換えポリヌクレオチドは、エンドペプチダー
ゼをコードする遺伝子のみからなるか又はそれに加えて
適切な転写プロモーター及び／又はベクター部位のよう
な調節配列を包含している。
エンドペプチダーゼをコードする遺伝情報を包含する組
換えポリヌクレオチド、特に組換えＤＮＡが提供され
る。この組換えポリヌクレオチドは、エンドペプチダー
ゼをコードする遺伝子のみからなるか又はそれに加えて
適切な転写プロモーター及び／又はベクター部位のよう
な調節配列を包含している。
【００１９】本発明は、更に形質転換マーカーとしての
そのような組換えポリヌクレオチドの利用を包含する。
これによりエンドペプチダーゼを有さない生物がうまく
形質転換しているか否かは、エンドペプチダーゼ遺伝情
報を包含するポリヌクレオチドの発現から結論できる。
そしてその発現はエンドペプチダーゼの適切な基質を用
いるか又はエンドペプチダーゼに親和性及び／又は特異
性を有するポリクローナル又はモノクローナル抗体を用
いて検出される。本発明は、また、他の望ましい遺伝子
の導入で不活化されるエンドペプチダーゼ遺伝子を含む
プラスミドの形の形質転換マーカーの利用を包含する。
そのような組換えポリヌクレオチドの利用を包含する。
これによりエンドペプチダーゼを有さない生物がうまく
形質転換しているか否かは、エンドペプチダーゼ遺伝情
報を包含するポリヌクレオチドの発現から結論できる。
そしてその発現はエンドペプチダーゼの適切な基質を用
いるか又はエンドペプチダーゼに親和性及び／又は特異
性を有するポリクローナル又はモノクローナル抗体を用
いて検出される。本発明は、また、他の望ましい遺伝子
の導入で不活化されるエンドペプチダーゼ遺伝子を含む
プラスミドの形の形質転換マーカーの利用を包含する。
【００２０】本発明は更に本発明のエンドペプチダーゼ
を調製する方法を包含する。本調製方法はエンドペプチ
ダーゼが発現されている生物、特に微生物たとえばラク
トコッカス ラクティス（Ｌ． Ｌａｃｔｉｓ）亜種クレ
モリス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｗｇ２の粗細胞抽出物をジ
エチルアミノエタン セファセル カラム クロマトグラ
フィー、フェニル セファロース クロマトグラフィー
ヒドロキシルアパタイト クロマトグラフィーおよび陰
イオン交換カラム及び疎水的相互作用カラムを用いる高
速液体クロマトグラフィーを含む単離処理にかける。各
クロマトグラフ工程においてエンドペプチダーゼ様加水
分解活性特にメトエンケファリンに対する加水分解活性
をもつ溶出分画を選択する。
を調製する方法を包含する。本調製方法はエンドペプチ
ダーゼが発現されている生物、特に微生物たとえばラク
トコッカス ラクティス（Ｌ． Ｌａｃｔｉｓ）亜種クレ
モリス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｗｇ２の粗細胞抽出物をジ
エチルアミノエタン セファセル カラム クロマトグラ
フィー、フェニル セファロース クロマトグラフィー
ヒドロキシルアパタイト クロマトグラフィーおよび陰
イオン交換カラム及び疎水的相互作用カラムを用いる高
速液体クロマトグラフィーを含む単離処理にかける。各
クロマトグラフ工程においてエンドペプチダーゼ様加水
分解活性特にメトエンケファリンに対する加水分解活性
をもつ溶出分画を選択する。
【００２１】更に、本発明によればエンドペプチダーゼ
に対する抗体の作成が可能となり、また自然環境から又
は上記形質転換細胞や形質転換生物からのエンドペプチ
ダーゼの除去及び単離におけるそれら抗体の使用が可能
となる。
に対する抗体の作成が可能となり、また自然環境から又
は上記形質転換細胞や形質転換生物からのエンドペプチ
ダーゼの除去及び単離におけるそれら抗体の使用が可能
となる。
【００２２】それ故、本発明の更に別の態様によれば、
エンドペプチダーゼに対する親和性及び／又は特異性を
有するポリクローナル又はモノクローナル抗体を調製す
るための新規なエンドペプチダーゼの用途が提供され
る。本発明により、また、上記のポリクローナルやモノ
クローナル抗体自体、そしてそれらのエンドペプチダー
ゼ検出への利用、又はエンドペプチダーゼを含む混合物
からエンドペプチダーゼの除去・単離への利用法が提供
される。
エンドペプチダーゼに対する親和性及び／又は特異性を
有するポリクローナル又はモノクローナル抗体を調製す
るための新規なエンドペプチダーゼの用途が提供され
る。本発明により、また、上記のポリクローナルやモノ
クローナル抗体自体、そしてそれらのエンドペプチダー
ゼ検出への利用、又はエンドペプチダーゼを含む混合物
からエンドペプチダーゼの除去・単離への利用法が提供
される。
【００２３】勿論、本発明の更に別の態様によれば、本
発明のエンドペプチダーゼ及び／又は生物を用いるチー
ズのような食品、泡立ち製品及び肉製品を調製する方法
が提供される。この場合、エンドペプチダーゼの特異な
加水分解能により、チーズの苦み生成の抑制やチーズの
熟成促進が可能となる。この方法は、スターターを節約
できる等の理由から生産コストが低下できるという利点
もある。この方法で調製した食品も、（特に苦味、更に
一般には嗜好性の点で）従来の製品よりも高品質である
場合には、本発明に包含される。
発明のエンドペプチダーゼ及び／又は生物を用いるチー
ズのような食品、泡立ち製品及び肉製品を調製する方法
が提供される。この場合、エンドペプチダーゼの特異な
加水分解能により、チーズの苦み生成の抑制やチーズの
熟成促進が可能となる。この方法は、スターターを節約
できる等の理由から生産コストが低下できるという利点
もある。この方法で調製した食品も、（特に苦味、更に
一般には嗜好性の点で）従来の製品よりも高品質である
場合には、本発明に包含される。
【００２４】
【実施例】以下に本発明を実施例により説明する。材料と方法 細胞抽出物の調製 以下の実施例では菌株として乳酸菌ラクトコッカス ラ
クティス（Ｌ． Ｌａｃｔｉｓ）亜種クレモリス（ｃｒ
ｅｍｏｒｉｓ）Ｗｇ２を用いた。該乳酸菌はトリプトン
０．１％（ｗ／ｖ）を含む乾燥スキムミルクを滅菌水で
もどし１０％（ｗ／ｖ）濃度としたものの中で−２０℃
で通常貯蔵したものを用いた。ラクトコッカス ラクテ
ィス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ Ｌａｃｔｉｓ）亜種ク
レモリス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｗｇ２の培養にはＭＲＳ
培地（Ｊ．Ｃ．ｄｅ Ｍａｎ ｅｔ ａｌ,Ｊ．Ａｐｐｌ．
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、２３、１９６０、１３０−１３
５）を用い５リットル容量の発酵装置でｐＨを６．３に
調整しながら増殖させた。波長６００ｎｍのＯＤ値が
１．９，４℃で、１５分間、７０００ｘｇで遠心分離を
行ない細胞を採取し、５０ｍＭの燐酸カルシウム（以下
Ｋｐｉと略記する。ｐＨ６．０）４００ｍｌで洗い、
２０ｍＭ Ｋｐｉ（ｐＨ６．０）の５０ｍｌ中に懸濁し
た。細胞を４℃でフレンチプレス（Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｒ
ｅｓｓ）（米国メリーランド州、シルバースプリング、
アミンコ社販売）（Ａｍｉｎｃｏ，Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐ
ｒｉｎｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）で破砕した。破
砕細胞を４℃で１７，５００ｘｇ、２０分間遠心分離を
行ない無細胞抽出物を得た。
クティス（Ｌ． Ｌａｃｔｉｓ）亜種クレモリス（ｃｒ
ｅｍｏｒｉｓ）Ｗｇ２を用いた。該乳酸菌はトリプトン
０．１％（ｗ／ｖ）を含む乾燥スキムミルクを滅菌水で
もどし１０％（ｗ／ｖ）濃度としたものの中で−２０℃
で通常貯蔵したものを用いた。ラクトコッカス ラクテ
ィス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ Ｌａｃｔｉｓ）亜種ク
レモリス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｗｇ２の培養にはＭＲＳ
培地（Ｊ．Ｃ．ｄｅ Ｍａｎ ｅｔ ａｌ,Ｊ．Ａｐｐｌ．
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、２３、１９６０、１３０−１３
５）を用い５リットル容量の発酵装置でｐＨを６．３に
調整しながら増殖させた。波長６００ｎｍのＯＤ値が
１．９，４℃で、１５分間、７０００ｘｇで遠心分離を
行ない細胞を採取し、５０ｍＭの燐酸カルシウム（以下
Ｋｐｉと略記する。ｐＨ６．０）４００ｍｌで洗い、
２０ｍＭ Ｋｐｉ（ｐＨ６．０）の５０ｍｌ中に懸濁し
た。細胞を４℃でフレンチプレス（Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｒ
ｅｓｓ）（米国メリーランド州、シルバースプリング、
アミンコ社販売）（Ａｍｉｎｃｏ，Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐ
ｒｉｎｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）で破砕した。破
砕細胞を４℃で１７，５００ｘｇ、２０分間遠心分離を
行ない無細胞抽出物を得た。
【００２５】酵素活性測定 ペプチドの加水分解は薄層クロマトグラフィー（ＴＬ
Ｃ）により検出を行った。エンドペプチダーゼ活性は下
記の方法により求めた。即ち２０ｍＭ トリス塩酸（ｐ
Ｈ７．０）中に１．２５ｍＭ メトエンケファリン（チ
ロシル−グリシル−グリシル−フェニルアラニル−メチ
オニン）を含有する反応混合物を適量の酵素と共に３０
℃で１５分間インキュベートした。試料（５０μｌ）を
採取し、３０％酢酸１０μｌを加え、混合物を４℃に冷
却して反応を止めた。続いて反応混合物（１０μｌ）を
厚さ０．２５ｃｍのプレコーティングを施したシリカゲ
ル６０プレート（Ｍｅｒｃｋ社［ドイツ国 ダルムシュ
タット市 所在］製）上にスポットし、ピー．エス．テ
ィー．タンとダブリュー．エヌ．コーニングズ（Ｐ．
Ｓ．Ｔ．Ｔａｎ ａｎｄ Ｗ．Ｎ．Ｋｏｎｉｎｇｓ）に
よって述べられているような方法に準じて薄層クロマト
グラフィーを実施した。あるケースでは９９％アセトン
中に０．０５％のフルオレスアミンを含有したものを用
いてゲルの染色を行なうと、ペプチドとアミノ酸は紫外
線下で見られるようになった。エンドペプチダーゼ活性
の一単位（１Ｕ）は３０℃、ｐＨ７のタンパク質１ｍｇ
につき一分間あたり１μｍｏｌのメトエンケファリンを
加水分解する活性と定義した。メトエンケファリンはエ
ンドペプチダーゼ活性のスクリーニングに大変優れた基
質であることが分かった。
Ｃ）により検出を行った。エンドペプチダーゼ活性は下
記の方法により求めた。即ち２０ｍＭ トリス塩酸（ｐ
Ｈ７．０）中に１．２５ｍＭ メトエンケファリン（チ
ロシル−グリシル−グリシル−フェニルアラニル−メチ
オニン）を含有する反応混合物を適量の酵素と共に３０
℃で１５分間インキュベートした。試料（５０μｌ）を
採取し、３０％酢酸１０μｌを加え、混合物を４℃に冷
却して反応を止めた。続いて反応混合物（１０μｌ）を
厚さ０．２５ｃｍのプレコーティングを施したシリカゲ
ル６０プレート（Ｍｅｒｃｋ社［ドイツ国 ダルムシュ
タット市 所在］製）上にスポットし、ピー．エス．テ
ィー．タンとダブリュー．エヌ．コーニングズ（Ｐ．
Ｓ．Ｔ．Ｔａｎ ａｎｄ Ｗ．Ｎ．Ｋｏｎｉｎｇｓ）に
よって述べられているような方法に準じて薄層クロマト
グラフィーを実施した。あるケースでは９９％アセトン
中に０．０５％のフルオレスアミンを含有したものを用
いてゲルの染色を行なうと、ペプチドとアミノ酸は紫外
線下で見られるようになった。エンドペプチダーゼ活性
の一単位（１Ｕ）は３０℃、ｐＨ７のタンパク質１ｍｇ
につき一分間あたり１μｍｏｌのメトエンケファリンを
加水分解する活性と定義した。メトエンケファリンはエ
ンドペプチダーゼ活性のスクリーニングに大変優れた基
質であることが分かった。
【００２６】ＤＥＡＥ−セファセルカラム クロマトグ
ラフィー ＤＥＡＥ−セファセル カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｌ
ＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社[スウェーデン国ウ
プサラ市所在]製、１．６×２０ｃｍ）を０．１Ｍ塩化
ナトリウムを含有する２０ｍＭ Ｋｐｉ（ｐＨ６．０）
で平衡させた。ラクトコッカス ラクティス（Ｌ． ｌａ
ｃｔｉｓ）亜種クレモリス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｗｇ２
から得た細胞抽出物を２０ｍＭ Ｋｐｉを用いて稀釈
し、ＤＥＡＥ−セファセル カラムの平衡に用いた緩衝
液と同じイオン強度にした後カラムに入れた。イオン強
度はデンマーク国コペンハーゲン市で入手した放射計で
測定した。カラムを２容量分の平衡緩衝液で洗った後、
酵素の溶離を２０ｍＭ Ｋｐｉ中、塩化ナトリウムにつ
いて０．１Ｍ〜０．４Ｍまでの直線匂配を組んで５４ｍ
ｌ／ｈで行った。６ｍｌの分画を採取し、エンドペプチ
ダーゼ活性のテストを行った。最も高い酵素活性を有す
る分画を混合した。
ラフィー ＤＥＡＥ−セファセル カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｌ
ＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社[スウェーデン国ウ
プサラ市所在]製、１．６×２０ｃｍ）を０．１Ｍ塩化
ナトリウムを含有する２０ｍＭ Ｋｐｉ（ｐＨ６．０）
で平衡させた。ラクトコッカス ラクティス（Ｌ． ｌａ
ｃｔｉｓ）亜種クレモリス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｗｇ２
から得た細胞抽出物を２０ｍＭ Ｋｐｉを用いて稀釈
し、ＤＥＡＥ−セファセル カラムの平衡に用いた緩衝
液と同じイオン強度にした後カラムに入れた。イオン強
度はデンマーク国コペンハーゲン市で入手した放射計で
測定した。カラムを２容量分の平衡緩衝液で洗った後、
酵素の溶離を２０ｍＭ Ｋｐｉ中、塩化ナトリウムにつ
いて０．１Ｍ〜０．４Ｍまでの直線匂配を組んで５４ｍ
ｌ／ｈで行った。６ｍｌの分画を採取し、エンドペプチ
ダーゼ活性のテストを行った。最も高い酵素活性を有す
る分画を混合した。
【００２７】フェニル−セファロース カラム クロマト
グラフィー フェニル−セファロース（ＣＬ４Ｂ）カラム［スウェー
デン国ウプサラ(Uppsala)市所在ファーマシア ＬＫＢ
バイオテクノロジー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社販売、１．８×８．５ｃ
ｍ]を４Ｍ塩化ナトリウムを含有する２０ｍＭトリス塩
酸（ｐＨ６．０）によって平衡させた。塩化ナトリウム
をプールした酵素分画で稀釈して平衡緩衝液と同じオス
モル濃度にした後その酵素溶液をカラムに入れた。その
カラムを２容量分の平衡緩衝液で洗った後、酵素を２０
ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ６．０）で塩化ナトリウムにつ
いて４Ｍ〜０Ｍまでの直線匂配を組んで３０ｍｌ／ｈで
溶出した。７．５ｍｌの分画を採取し、エンドペプチダ
ーゼ活性のテストを行った。最も高い酵素活性を有する
分画を混合した。
グラフィー フェニル−セファロース（ＣＬ４Ｂ）カラム［スウェー
デン国ウプサラ(Uppsala)市所在ファーマシア ＬＫＢ
バイオテクノロジー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社販売、１．８×８．５ｃ
ｍ]を４Ｍ塩化ナトリウムを含有する２０ｍＭトリス塩
酸（ｐＨ６．０）によって平衡させた。塩化ナトリウム
をプールした酵素分画で稀釈して平衡緩衝液と同じオス
モル濃度にした後その酵素溶液をカラムに入れた。その
カラムを２容量分の平衡緩衝液で洗った後、酵素を２０
ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ６．０）で塩化ナトリウムにつ
いて４Ｍ〜０Ｍまでの直線匂配を組んで３０ｍｌ／ｈで
溶出した。７．５ｍｌの分画を採取し、エンドペプチダ
ーゼ活性のテストを行った。最も高い酵素活性を有する
分画を混合した。
【００２８】ヒドロキシル アパタイトを用いる クロマ
トグラフィー フェニル−セファロース クロマトグラフィーによって
得られた酵素分画を０．０１Ｍのリン酸ナトリウム（以
下Ｎａｐｉと略す）（ｐＨ６．０）であらかじめ平衡さ
せておいたヒドロキシルアパタイト カラム（１．５×
６．３ｃｍ）に挿入した。このカラムを２容量分の平衡
緩衝液で洗った。酵素溶出をｐＨ６．０でＮａｐｉにつ
いて０．０１Ｍ〜０．４Ｍの直線匂配を組んで４０ｍｌ
／ｈで行った。分画のエンドペプチダーゼ活性のテスト
を行い最も高い活性の分画をプールした。
トグラフィー フェニル−セファロース クロマトグラフィーによって
得られた酵素分画を０．０１Ｍのリン酸ナトリウム（以
下Ｎａｐｉと略す）（ｐＨ６．０）であらかじめ平衡さ
せておいたヒドロキシルアパタイト カラム（１．５×
６．３ｃｍ）に挿入した。このカラムを２容量分の平衡
緩衝液で洗った。酵素溶出をｐＨ６．０でＮａｐｉにつ
いて０．０１Ｍ〜０．４Ｍの直線匂配を組んで４０ｍｌ
／ｈで行った。分画のエンドペプチダーゼ活性のテスト
を行い最も高い活性の分画をプールした。
【００２９】第二陰イオン交換クロマトグラフィー 高速タンパク質液体クロマトグラフィーを行うためモノ
Ｑ ＨＲ５／５カラム（スウェーデン国ウプサラ市フ
ァーマシア社販売）を用いた。そのカラムは０．１Ｍ塩
化ナトリウムを含有する２０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ
６．０）であらかじめ平衡させておいた。そのあとヒド
ロキシル アパタイト クロマトグラフィーの混合分画を
カラムに入れた。１ｍｌ／ｍｉｎの流量で２０ｍＭトリ
ス塩酸（ｐＨ６．０）で塩化ナトリウムについて０．１
Ｍ〜０．３Ｍの直線匂配を組んで酵素を溶出した。分画
のエンドペプチダーゼ活性のテストを行って最も活性の
高い分画を混合した。
Ｑ ＨＲ５／５カラム（スウェーデン国ウプサラ市フ
ァーマシア社販売）を用いた。そのカラムは０．１Ｍ塩
化ナトリウムを含有する２０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ
６．０）であらかじめ平衡させておいた。そのあとヒド
ロキシル アパタイト クロマトグラフィーの混合分画を
カラムに入れた。１ｍｌ／ｍｉｎの流量で２０ｍＭトリ
ス塩酸（ｐＨ６．０）で塩化ナトリウムについて０．１
Ｍ〜０．３Ｍの直線匂配を組んで酵素を溶出した。分画
のエンドペプチダーゼ活性のテストを行って最も活性の
高い分画を混合した。
【００３０】第二疎水的相互作用クロマトグラフィー 塩化ナトリウム４Ｍ含有の２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ
６．０）でフェニル−スーパーロースＨＲ５／５カラム
[スウェーデン国ウプサラ(Uppsala)市ファーマシア社販
売］をあらかじめ平衡させておいたのち同じカラムで高
速タンパク質液体クロマトグラフィーを行った。カラム
に入れる前に活性モノＱ分画に同じ重量モル濃度の塩化
ナトリウムを添加した。０．５ｍｌ／ｍｉｎの流量で２
０ｍＭトリス塩酸ｐＨ６．０中に塩化ナトリウムについ
て４Ｍ〜０Ｍの直線匂配を組んで酵素を溶出した。分画
のエンドペプチダーゼ活性のテストを行い最も活性の高
い分画をプールした。
６．０）でフェニル−スーパーロースＨＲ５／５カラム
[スウェーデン国ウプサラ(Uppsala)市ファーマシア社販
売］をあらかじめ平衡させておいたのち同じカラムで高
速タンパク質液体クロマトグラフィーを行った。カラム
に入れる前に活性モノＱ分画に同じ重量モル濃度の塩化
ナトリウムを添加した。０．５ｍｌ／ｍｉｎの流量で２
０ｍＭトリス塩酸ｐＨ６．０中に塩化ナトリウムについ
て４Ｍ〜０Ｍの直線匂配を組んで酵素を溶出した。分画
のエンドペプチダーゼ活性のテストを行い最も活性の高
い分画をプールした。
【００３１】高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ） Ｂ．Ｗ．ボスマン（Ｂｏｓｍａｎ）ら記載の方法と同様
な方法により高速液体クロマトグラフィーを実施した。
ウルトラパック（Ｕｌｔａｒａｐａｃ）ＴＳＫＧ３００
０ＳＷゲル濾過カラム（７．５×６００ｍｍ）（ファー
マシアＬＫＢバイオテクノロジー社販売）に精製エンド
ペプチダーゼ（２５μｇのタンパク質を含有する１００
μｌ）を注入した。タンパク質の分子量を低範囲タンパ
ク質基準（ファーマシアＬＫＢバイオテクノロジー社販
売）を用いて見積もった。メトエンケファリン加水分解
のためにピーク分画を一つテストした。
な方法により高速液体クロマトグラフィーを実施した。
ウルトラパック（Ｕｌｔａｒａｐａｃ）ＴＳＫＧ３００
０ＳＷゲル濾過カラム（７．５×６００ｍｍ）（ファー
マシアＬＫＢバイオテクノロジー社販売）に精製エンド
ペプチダーゼ（２５μｇのタンパク質を含有する１００
μｌ）を注入した。タンパク質の分子量を低範囲タンパ
ク質基準（ファーマシアＬＫＢバイオテクノロジー社販
売）を用いて見積もった。メトエンケファリン加水分解
のためにピーク分画を一つテストした。
【００３２】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミド
電気泳動（ＰＡＧＥ）をユー．ケー．ラーメリ（Ｕ．
Ｋ．Ｌａｅｍｍｌｉ）、ケイ．フォーレ（Ｋ．Ｆａｕｒ
ｅ）、ジェイ．モル．バイオロ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ）８０，１９７３，５７５−５９９記載と同様な方法
により実施した。タンパク質サンプルをサンプル緩衝液
（０．０５Ｍトリス塩酸ｐＨ６．８，１０％ＳＤＳ，２
２％グリセリン、１０％β−メルカプトエタノール、
０．１８％ブロムフェノールブルー）で４：１に混合し
たゲルにおいた。タンパク質バンドの分子量を低範囲Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ基準（カリフォルニア州リッチノンド市
バイオーランド研究所販売）を用いて見積もった。ゲル
をダブリュー．レイ ら アナル、バイオケム（Ｗ．Ｗｒ
ａｙ ｅｔ ａｌ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ）１１８，
１９８１，１９７−２０３の方法に準じてクーマシー
ブリリアント ブルーか又は銀色に染色した。
電気泳動（ＰＡＧＥ）をユー．ケー．ラーメリ（Ｕ．
Ｋ．Ｌａｅｍｍｌｉ）、ケイ．フォーレ（Ｋ．Ｆａｕｒ
ｅ）、ジェイ．モル．バイオロ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ）８０，１９７３，５７５−５９９記載と同様な方法
により実施した。タンパク質サンプルをサンプル緩衝液
（０．０５Ｍトリス塩酸ｐＨ６．８，１０％ＳＤＳ，２
２％グリセリン、１０％β−メルカプトエタノール、
０．１８％ブロムフェノールブルー）で４：１に混合し
たゲルにおいた。タンパク質バンドの分子量を低範囲Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ基準（カリフォルニア州リッチノンド市
バイオーランド研究所販売）を用いて見積もった。ゲル
をダブリュー．レイ ら アナル、バイオケム（Ｗ．Ｗｒ
ａｙ ｅｔ ａｌ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ）１１８，
１９８１，１９７−２０３の方法に準じてクーマシー
ブリリアント ブルーか又は銀色に染色した。
【００３３】等電点電気泳動 ファルマシア ファースト システム（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ Ｐｈａｓｔ Ｓｙｓｔｅｍ）とファーマライト（Ｐｈ
ａｒｍａｌｙｔｅ）３−９含有の既製の５％ポリアクリ
ルアミドゲル（Ｐｈａｓｔｇｅｌ，Ｐｈａｍａｃｉａ
社）を用いてスラブゲルで等電点電気泳動を行った。等
電点は広範囲の等電点測定キット（スウェーデン国ウプ
サラ（Ｕｐｐｓａｌａ）市ファルマシア社販売）からの
参照タンパク質を用いて測定した。ゲルの染色はクーマ
シー ブリリアントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉ
ｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ）を用いるファースト システム
によって自動的に行われた。
ａ Ｐｈａｓｔ Ｓｙｓｔｅｍ）とファーマライト（Ｐｈ
ａｒｍａｌｙｔｅ）３−９含有の既製の５％ポリアクリ
ルアミドゲル（Ｐｈａｓｔｇｅｌ，Ｐｈａｍａｃｉａ
社）を用いてスラブゲルで等電点電気泳動を行った。等
電点は広範囲の等電点測定キット（スウェーデン国ウプ
サラ（Ｕｐｐｓａｌａ）市ファルマシア社販売）からの
参照タンパク質を用いて測定した。ゲルの染色はクーマ
シー ブリリアントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉ
ｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ）を用いるファースト システム
によって自動的に行われた。
【００３４】二価陽イオンと化学薬品の酵素活性に及ぼ
す影響 精製した酵素（９９μｇ）をトリス塩酸ｐＨ６．０中Ｅ
ＤＴＡ（１ｍＭ）と共に４℃にて３０分間あらかじめイ
ンキュベートした。同じ緩衝液に対して２４時間透析し
たのち酵素溶液を二価陽イオンの濃度をいくつかに変え
て４℃で３０分間インキュベートしてからメトエンケフ
ァリンを添加して反応を開始した。反応を止めてから反
応生成物を上記記載のごとく分析した。適当量の酵素を
化学薬品（１ｍＭ）で３０分間４℃でインキュベート
し、酵素活性に及ぼす影響を調べた。
す影響 精製した酵素（９９μｇ）をトリス塩酸ｐＨ６．０中Ｅ
ＤＴＡ（１ｍＭ）と共に４℃にて３０分間あらかじめイ
ンキュベートした。同じ緩衝液に対して２４時間透析し
たのち酵素溶液を二価陽イオンの濃度をいくつかに変え
て４℃で３０分間インキュベートしてからメトエンケフ
ァリンを添加して反応を開始した。反応を止めてから反
応生成物を上記記載のごとく分析した。適当量の酵素を
化学薬品（１ｍＭ）で３０分間４℃でインキュベート
し、酵素活性に及ぼす影響を調べた。
【００３５】抗エンドペプチダーゼ血清 次の実験手順に基づいて、免疫したウサギを使用して酵
素に対する抗血清を培養した。精製した酵素のサンプル
（１００μｌ、０．５ｍｇタンパク質／ｍ／ｌ）を完全
なフロイントアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ ａｄｊｕｖ
ａｎｔ）と共に注射した。１ケ月後５０μｇの精製酵素
のブースター注射（追加抗原注射）を施した。それぞれ
のウサギにブースター注射をしてから７日及び１４日後
に採血し、１０分間１０,０００ × ｇで遠心分離にか
けて血清を作った。
素に対する抗血清を培養した。精製した酵素のサンプル
（１００μｌ、０．５ｍｇタンパク質／ｍ／ｌ）を完全
なフロイントアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ ａｄｊｕｖ
ａｎｔ）と共に注射した。１ケ月後５０μｇの精製酵素
のブースター注射（追加抗原注射）を施した。それぞれ
のウサギにブースター注射をしてから７日及び１４日後
に採血し、１０分間１０,０００ × ｇで遠心分離にか
けて血清を作った。
【００３６】免疫ブロット ラクトコッカス ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｌａｃｔｉs)亜種、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃ
ｃｉｌｌｕｓ）の亜種ブルガリクス（ｂｕｌｇａｒｉｃ
ｕｓ）変種ジアセチラクティス（ｄｉａｃｅｔｙｌａｃ
ｔｉｓ）およびストレプトコッカス テルモフィラス
（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ
ｕｓ）菌株の粗抽出物又は精製エンドペプチダーゼを含
有するサンプルを電気泳動（ＰＡＧＥ）にかけたあとゲ
ル上に分離したタンパク質をジェイ．カイゼ −アンデ
ルセン，ジェイ．バイオケム．バイオフィス．メス
（Ｊ．Ｋｙｈｓｅ−Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈ．）１０，１９８４，
２０３−２０９の技法により半乾式エレクトロブロッタ
ー（デンマーク国、アンコス社販売）を使用してポリビ
ニリデン ジフッ化物（ＰＶＤＦ）シート上に移した。
ＰＶＤＦ膜を１％スキムミルクで飽和させてのち７００
０分の１に希釈したウサギの坑エンドペプチダーゼ血清
でインキュベートした。続いて１０００分の１に希釈し
たアルカリ フォスファターゼで処理した山羊−ウサギ
免疫グロブリン血清（米国ミズーリ州 セントルイス
市、シグマ社販売）でその飽和ＰＶＤＦ膜をインキュベ
ートした。
ｌａｃｔｉs)亜種、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃ
ｃｉｌｌｕｓ）の亜種ブルガリクス（ｂｕｌｇａｒｉｃ
ｕｓ）変種ジアセチラクティス（ｄｉａｃｅｔｙｌａｃ
ｔｉｓ）およびストレプトコッカス テルモフィラス
（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ
ｕｓ）菌株の粗抽出物又は精製エンドペプチダーゼを含
有するサンプルを電気泳動（ＰＡＧＥ）にかけたあとゲ
ル上に分離したタンパク質をジェイ．カイゼ −アンデ
ルセン，ジェイ．バイオケム．バイオフィス．メス
（Ｊ．Ｋｙｈｓｅ−Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈ．）１０，１９８４，
２０３−２０９の技法により半乾式エレクトロブロッタ
ー（デンマーク国、アンコス社販売）を使用してポリビ
ニリデン ジフッ化物（ＰＶＤＦ）シート上に移した。
ＰＶＤＦ膜を１％スキムミルクで飽和させてのち７００
０分の１に希釈したウサギの坑エンドペプチダーゼ血清
でインキュベートした。続いて１０００分の１に希釈し
たアルカリ フォスファターゼで処理した山羊−ウサギ
免疫グロブリン血清（米国ミズーリ州 セントルイス
市、シグマ社販売）でその飽和ＰＶＤＦ膜をインキュベ
ートした。
【００３７】１５０ｍＭ塩化ナトリウムと０．０５％ツ
ィーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０を含有する１０ｍＭトリス
塩酸（ｐＨ８．０）（ＴＢＳＴ）でその酵素抗体錯体を
洗浄ののち、７０％ジメチルフォルムアミド中１％（ｖ
／ｖ）のニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ、３０ｍ
ｇ／ｍｌ）と１００％ジメチルフォルムアミド中１％
（ｖ／ｖ）５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル燐
酸塩（ＢＣＩＰ，１５ｍｇ／ｍｌ）を含有するｐＨ９．
８のアルカリ炭酸塩緩衝液の中で膜をインキュベートし
て酵素抗体錯体を目に見えるようにした。
ィーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０を含有する１０ｍＭトリス
塩酸（ｐＨ８．０）（ＴＢＳＴ）でその酵素抗体錯体を
洗浄ののち、７０％ジメチルフォルムアミド中１％（ｖ
／ｖ）のニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ、３０ｍ
ｇ／ｍｌ）と１００％ジメチルフォルムアミド中１％
（ｖ／ｖ）５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル燐
酸塩（ＢＣＩＰ，１５ｍｇ／ｍｌ）を含有するｐＨ９．
８のアルカリ炭酸塩緩衝液の中で膜をインキュベートし
て酵素抗体錯体を目に見えるようにした。
【００３８】交差免疫電気泳動（ＣＩＥ） ジェイ．ファン．デル．プラス ら、ジェイ．バクテリ
オ（Ｊ．Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｌａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ），１５３，１９８３，１０２７−１
０３７によって記載されている方法に準じて交差免疫電
気泳動を実施した。１次元方向ではゲルを９０分間３０
Ｖ／ｃｍで泳動させた。２次元方向では１８時間から２
４時間にわたって４０Ｖ／ｃｍで泳動させた。ジェイ．
フーゲンホルツ ら アプラ、エンベ、マイクロバイオ
（Ｊ．Ｈｕｇｅｎｈｏｌｔｚｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．
Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）４８，１９８４，１１
０５−１１１０によって記載されているラクトコッカス
ラクティス（Ｌ． ｌａｃｔｉｓ）亜種クレモリス（ｃ
ｒｅｍｏｒｉｓ）Ｗｇ２の細胞抽出物抗体（０．５ｍｇ
タンパク質／ｍｌ）に対する精製した酵素（８０μｇタ
ンパク質／ｍｌ）について交差免疫電気泳動を実施し
た。更に精製したエンドペプチダーゼ抗体（１７．８ｍ
ｇタンパク質／ｍｌ）に対してラクトコッカス ラクテ
ィス（Ｌ． ｌａｃｔｉｃ）亜種クレモリス（ｃｒｅｍ
ｏｒｉｓ）Ｗｇ２からの無細胞抽出物（０．３２ｍｇタ
ンパク質／ｍｌ）についても同様に電気泳動を行った。
沈澱物を示すためクーマシーブリリアントブルーでゲル
を染色した。
オ（Ｊ．Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｌａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ），１５３，１９８３，１０２７−１
０３７によって記載されている方法に準じて交差免疫電
気泳動を実施した。１次元方向ではゲルを９０分間３０
Ｖ／ｃｍで泳動させた。２次元方向では１８時間から２
４時間にわたって４０Ｖ／ｃｍで泳動させた。ジェイ．
フーゲンホルツ ら アプラ、エンベ、マイクロバイオ
（Ｊ．Ｈｕｇｅｎｈｏｌｔｚｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．
Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）４８，１９８４，１１
０５−１１１０によって記載されているラクトコッカス
ラクティス（Ｌ． ｌａｃｔｉｓ）亜種クレモリス（ｃ
ｒｅｍｏｒｉｓ）Ｗｇ２の細胞抽出物抗体（０．５ｍｇ
タンパク質／ｍｌ）に対する精製した酵素（８０μｇタ
ンパク質／ｍｌ）について交差免疫電気泳動を実施し
た。更に精製したエンドペプチダーゼ抗体（１７．８ｍ
ｇタンパク質／ｍｌ）に対してラクトコッカス ラクテ
ィス（Ｌ． ｌａｃｔｉｃ）亜種クレモリス（ｃｒｅｍ
ｏｒｉｓ）Ｗｇ２からの無細胞抽出物（０．３２ｍｇタ
ンパク質／ｍｌ）についても同様に電気泳動を行った。
沈澱物を示すためクーマシーブリリアントブルーでゲル
を染色した。
【００３９】カゼイン加水分解 トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７）の中のα−，β−、κ−カ
ゼイン（１．５ｍｇ／ｍｌ）の混合物に適量の精製酵素
を添加した。３０℃で一晩インキュベートしたあとサン
プルを上記記載のごとくサンプル緩衝液中で５分間煮沸
した。１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＡゲルで電気泳動を行
ってタンパク質を分離した。
ゼイン（１．５ｍｇ／ｍｌ）の混合物に適量の精製酵素
を添加した。３０℃で一晩インキュベートしたあとサン
プルを上記記載のごとくサンプル緩衝液中で５分間煮沸
した。１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＡゲルで電気泳動を行
ってタンパク質を分離した。
【００４０】タンパク質の測定 オー．アール．ローリー ら、ジェイ バイオ ケミ
（Ｏ．Ｒ．Ｌｏｗｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃ
ｈｅｍ．１９３，１９５１，２６５−２７５）の方法と
同様の方法によって牛血清アルブミンを標準としてタン
パク質濃度を測定した。
（Ｏ．Ｒ．Ｌｏｗｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃ
ｈｅｍ．１９３，１９５１，２６５−２７５）の方法と
同様の方法によって牛血清アルブミンを標準としてタン
パク質濃度を測定した。
【００４１】アミノ酸とＮ−末端配列の分析 アミノ酸分析とＮ−末端アミノ酸配列の分析はピー．エ
ス．ティ．タンとダブリュー．エヌ．コーニングズ
（Ｐ．Ｓ．Ｔ．Ｔａｎ ａｎｄ Ｗ．Ｎ．Ｋｏｎｉｎｇ
ｓ）が述べている方法に準じて行った。
ス．ティ．タンとダブリュー．エヌ．コーニングズ
（Ｐ．Ｓ．Ｔ．Ｔａｎ ａｎｄ Ｗ．Ｎ．Ｋｏｎｉｎｇ
ｓ）が述べている方法に準じて行った。
【００４２】化学薬品 使用した全ての化学薬品は市販の試薬グレードのもので
ある。 結果酵素の精製 工程（ａ）：ラクトコッカス ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔ
ｉｓ）亜種クレモリス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｗｇ２から
抽出した粗細胞抽出物（４００ｍｌ）をＤＥＡＥセファ
セル カラム クロマトグラフィーにかけた後、メトエン
ケファリン加水分解活性の最高値は塩化ナトリウム匂配
溶出分画番号９０から１２０において塩化ナトリウム
０．１８Ｍ〜０．２４Ｍの範囲で検出された。これらの
分画を混合し、塩化ナトリウムを最終濃度４Ｍで添加し
た。 工程（ｂ）：これらの混合した分画（１８６ｍｌ）をフ
ェニル セファロースカラムに入れた。４Ｍ〜０Ｍまで
の塩化ナトリウムでの溶出のあと、塩化ナトリウムが
０．９〜０．６Ｍのところでメトエンケファリン加水分
解分画が検出された。 工程（ｃ）：プールした分画（９０ｍｌ）をヒドロキシ
ル アパタイト カラムに入れた。０．１Ｍ〜０．４Ｍの
燐酸ナトリウム（Ｎａｐｉ）匂配を組んで溶出したあ
と、メトエンケファリン加水分解活性は０．２１〜０．
２５Ｍ燐酸ナトリウム(Ｎａｐｉ)での分画で検出され
た。
ある。 結果酵素の精製 工程（ａ）：ラクトコッカス ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔ
ｉｓ）亜種クレモリス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｗｇ２から
抽出した粗細胞抽出物（４００ｍｌ）をＤＥＡＥセファ
セル カラム クロマトグラフィーにかけた後、メトエン
ケファリン加水分解活性の最高値は塩化ナトリウム匂配
溶出分画番号９０から１２０において塩化ナトリウム
０．１８Ｍ〜０．２４Ｍの範囲で検出された。これらの
分画を混合し、塩化ナトリウムを最終濃度４Ｍで添加し
た。 工程（ｂ）：これらの混合した分画（１８６ｍｌ）をフ
ェニル セファロースカラムに入れた。４Ｍ〜０Ｍまで
の塩化ナトリウムでの溶出のあと、塩化ナトリウムが
０．９〜０．６Ｍのところでメトエンケファリン加水分
解分画が検出された。 工程（ｃ）：プールした分画（９０ｍｌ）をヒドロキシ
ル アパタイト カラムに入れた。０．１Ｍ〜０．４Ｍの
燐酸ナトリウム（Ｎａｐｉ）匂配を組んで溶出したあ
と、メトエンケファリン加水分解活性は０．２１〜０．
２５Ｍ燐酸ナトリウム(Ｎａｐｉ)での分画で検出され
た。
【００４３】工程（ｄ）：混合した分画（３×２５ｍ
ｌ）をモノ キュー カラム（ｍｏｎｏ Ｑ ｃｏｌｕｍ
ｎ）に入れた。０．１〜０．３Ｍの塩化ナトリウムの匂
配を組んでのカラムからの溶出の結果０．２３〜０．２
７Ｍの塩化ナトリウムでの分画中でメトエンケファリン
の加水分解活性が示された。分画をプールして４Ｍ塩化
ナトリウムの最終濃度が得られるまで塩化ナトリウムを
添加した。 工程（ｅ）：最終工程では混合したエンドペプチダーゼ
分画２ｍｌをフェニルスペロース カラムに挿入した。
１６分から２４分の保持時間の後１．６ＭのＮａＣｌで
精製酵素を溶出分離した。酵素の精製を表１にまとめ
た。精製処理後の全収率は１７．４％、精製率は６７８
倍と見積もられた。最終の精製工程のあとには、単一の
ピーク分画が溶出された。メトエンケファリンのアミノ
酸への完全な加水分解に於いては数種のペプチダーゼ活
性が関与している。第三の精製工程のあと、トリペプチ
ドのＴｙｒｏｓｙｌ−ｇｌｙｃｙｌ−ｇｌｙｃｉｎｅは
これ以上加水分解されなかった。これはトリペプチダー
ゼ活性とアミノペプチダーゼ活性が消失したことを示
す。しかしながらＰｈｅ−Ｍｅｔの加水分解で示された
ようにジペプチダーゼ活性は依然存在している。モノ
キュー（Ｍｏｎｏ Ｑ）カラムから得た分画はメトエン
ケファリンをＴｙｒ−ＧＬｙ−ＧＬｙとＰｈｅ−Ｍｅｔ
だけに加水分解した。これはエンドペプチダーゼ活性だ
けが保持されていることを示している。しかしＳＤＳ−
ＰＡＧＥの結果は分画にはいぜん他のタンパク質が混入
していることを示した。これらの混入タンパク質は最後
の精製工程で除去された。精製の各工程が終わる毎に比
活性が増加した（表１参照）。
ｌ）をモノ キュー カラム（ｍｏｎｏ Ｑ ｃｏｌｕｍ
ｎ）に入れた。０．１〜０．３Ｍの塩化ナトリウムの匂
配を組んでのカラムからの溶出の結果０．２３〜０．２
７Ｍの塩化ナトリウムでの分画中でメトエンケファリン
の加水分解活性が示された。分画をプールして４Ｍ塩化
ナトリウムの最終濃度が得られるまで塩化ナトリウムを
添加した。 工程（ｅ）：最終工程では混合したエンドペプチダーゼ
分画２ｍｌをフェニルスペロース カラムに挿入した。
１６分から２４分の保持時間の後１．６ＭのＮａＣｌで
精製酵素を溶出分離した。酵素の精製を表１にまとめ
た。精製処理後の全収率は１７．４％、精製率は６７８
倍と見積もられた。最終の精製工程のあとには、単一の
ピーク分画が溶出された。メトエンケファリンのアミノ
酸への完全な加水分解に於いては数種のペプチダーゼ活
性が関与している。第三の精製工程のあと、トリペプチ
ドのＴｙｒｏｓｙｌ−ｇｌｙｃｙｌ−ｇｌｙｃｉｎｅは
これ以上加水分解されなかった。これはトリペプチダー
ゼ活性とアミノペプチダーゼ活性が消失したことを示
す。しかしながらＰｈｅ−Ｍｅｔの加水分解で示された
ようにジペプチダーゼ活性は依然存在している。モノ
キュー（Ｍｏｎｏ Ｑ）カラムから得た分画はメトエン
ケファリンをＴｙｒ−ＧＬｙ−ＧＬｙとＰｈｅ−Ｍｅｔ
だけに加水分解した。これはエンドペプチダーゼ活性だ
けが保持されていることを示している。しかしＳＤＳ−
ＰＡＧＥの結果は分画にはいぜん他のタンパク質が混入
していることを示した。これらの混入タンパク質は最後
の精製工程で除去された。精製の各工程が終わる毎に比
活性が増加した（表１参照）。
【００４４】分子量と等電点 エンドペプチダーゼの分子量はＴＳＫ Ｇ３０００ ＳＷ
カラムでのＨＰＬＣならびに１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
により７０ｋＤと見積もられた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは
精製酵素は銀染色でもまたクーマシー ブリリアント ブ
ルーの染色でも１つのバンドを示した。精製酵素を５分
間煮沸したあとβ−メルカプトエタノールで処理して
も、また、そのままの状態でβ−メルカプトエタノール
で処理しても結果は同じであり、酵素は単一のポリペプ
チドで構成されていることを示した。 酵素の等電点は
等電点電気泳動により４．３と見積もられた。
カラムでのＨＰＬＣならびに１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
により７０ｋＤと見積もられた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは
精製酵素は銀染色でもまたクーマシー ブリリアント ブ
ルーの染色でも１つのバンドを示した。精製酵素を５分
間煮沸したあとβ−メルカプトエタノールで処理して
も、また、そのままの状態でβ−メルカプトエタノール
で処理しても結果は同じであり、酵素は単一のポリペプ
チドで構成されていることを示した。 酵素の等電点は
等電点電気泳動により４．３と見積もられた。
【００４５】免疫ブロット 精製タンパク質に対するポリクロナール抗体を得た。精
製酵素と菌株Ｗｇ２からの無細胞抽出物で免疫ブロット
を行ない、酵素の純度を確認した。また、抗血清と粗抽
出物の中の他のタンパク質との間には交差反応は認めら
れなかった。又エル ラクチス、（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）
亜種クレモリス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｈ６１，Ｐ８−２
−４７，Ｅ８，ＡＭ２，ＳＫｌ１、ＨＰ、及びエル ラ
クチス（Ｌ． ｌａｃｔｉｓ）亜種ラクチス（ｌａｃｔ
ｉｓ）ＭＬ１とＭＬ３、並びに、ストレプトコッカス
テルモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉｌｕｓ） Ａ１４７とラクトバチルス ブル
ガリクス （Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒ
ｉｃｕｓ）Ｂ１３１の細胞抽出物で免疫ブロットでは、
エンドペプチターゼに対して培養した抗血清でインキュ
ベートしたときに、７０ｋＤのバンドを示した。
製酵素と菌株Ｗｇ２からの無細胞抽出物で免疫ブロット
を行ない、酵素の純度を確認した。また、抗血清と粗抽
出物の中の他のタンパク質との間には交差反応は認めら
れなかった。又エル ラクチス、（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）
亜種クレモリス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｈ６１，Ｐ８−２
−４７，Ｅ８，ＡＭ２，ＳＫｌ１、ＨＰ、及びエル ラ
クチス（Ｌ． ｌａｃｔｉｓ）亜種ラクチス（ｌａｃｔ
ｉｓ）ＭＬ１とＭＬ３、並びに、ストレプトコッカス
テルモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉｌｕｓ） Ａ１４７とラクトバチルス ブル
ガリクス （Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒ
ｉｃｕｓ）Ｂ１３１の細胞抽出物で免疫ブロットでは、
エンドペプチターゼに対して培養した抗血清でインキュ
ベートしたときに、７０ｋＤのバンドを示した。
【００４６】交差免疫電気泳動（ＣＩＥ） 最後の精製段階のあと得られたタンパク質での交差免疫
電気泳動（最高純度精製タンパク質１０μｌを使用）を
１％アガロースゲルの中で行った。この際２次元方向に
はエル ラクチス（Ｌ． ｌａｃｔｉｓ）亜種のクレモリ
ス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｗｇ２の完全細胞に対して培養
した抗体を０．５ｍｇタンパク質／ｍｌを含有させた。
またエル ラクチス（Ｌ． ｌａｃｔｉｓ）亜種クレモ
リス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｗｇ２の４μｌの無細胞抽出
物（０．３２ｍｇタンパク質／ｍｌ）で交差免疫電気泳
動を行った。この際２次元方向には精製エンドペプチダ
ーゼに対して培養された抗体１７．８ｍｇ／ｍｌを含有
させた。ゲルをクーマシーブリリアント ブルーで染色
した後、無細胞抽出物ならびに精製サンプルは1つの沈
澱線だけを示したが、これは精製された分画はたった１
つのタンパク質だけを含有しており、またエンドペプチ
ダーゼに対するの抗体は特異的なものだったことを示し
ている。これらの結果は明らかに、エンドペプチダーゼ
が完全に精製されていることを示している。精製エンド
ペプチダーゼの特性をさらに調べた。
電気泳動（最高純度精製タンパク質１０μｌを使用）を
１％アガロースゲルの中で行った。この際２次元方向に
はエル ラクチス（Ｌ． ｌａｃｔｉｓ）亜種のクレモリ
ス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｗｇ２の完全細胞に対して培養
した抗体を０．５ｍｇタンパク質／ｍｌを含有させた。
またエル ラクチス（Ｌ． ｌａｃｔｉｓ）亜種クレモ
リス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｗｇ２の４μｌの無細胞抽出
物（０．３２ｍｇタンパク質／ｍｌ）で交差免疫電気泳
動を行った。この際２次元方向には精製エンドペプチダ
ーゼに対して培養された抗体１７．８ｍｇ／ｍｌを含有
させた。ゲルをクーマシーブリリアント ブルーで染色
した後、無細胞抽出物ならびに精製サンプルは1つの沈
澱線だけを示したが、これは精製された分画はたった１
つのタンパク質だけを含有しており、またエンドペプチ
ダーゼに対するの抗体は特異的なものだったことを示し
ている。これらの結果は明らかに、エンドペプチダーゼ
が完全に精製されていることを示している。精製エンド
ペプチダーゼの特性をさらに調べた。
【００４７】エンドペプチダーゼ活性の温度とｐＨへの
依存性 エンドペプチダーゼ活性に及ぼす温度の影響を４度から
６０度Ｃの範囲で測定した。酵素の混合物はメトエンケ
ファリンを添加する前に試験温度で５分間平衡させた。
メトエンケファリンの加水分解活性の最適温度は３０度
から３８度Ｃの間であることがわかった（図１）。ｐＨ
の酵素活性に及ぼす影響をリンゴ酸、２−（Ｎ−モルフ
ォリノ）エタンスルフォン酸（ＭＥＳ）、４−（２−ヒ
ドロキシエチル）−１−ピペラジン−エタン スルフォ
ン酸（ＨＥＰＥＳ）及びホウ酸をそれぞれ２０ｍＭ含有
し適正ｐＨに調節された緩衝液を用いてｐＨ ４からｐ
Ｈ １０の範囲で調べた。メトエンケファリンを加水分
解するための最適ｐＨは６．０から６．５の間であるこ
とが判明した。４．５未満及び１０．０を超えるｐＨ値
ではメトケファリンの加水分解は検出されなかった（図
２）。
依存性 エンドペプチダーゼ活性に及ぼす温度の影響を４度から
６０度Ｃの範囲で測定した。酵素の混合物はメトエンケ
ファリンを添加する前に試験温度で５分間平衡させた。
メトエンケファリンの加水分解活性の最適温度は３０度
から３８度Ｃの間であることがわかった（図１）。ｐＨ
の酵素活性に及ぼす影響をリンゴ酸、２−（Ｎ−モルフ
ォリノ）エタンスルフォン酸（ＭＥＳ）、４−（２−ヒ
ドロキシエチル）−１−ピペラジン−エタン スルフォ
ン酸（ＨＥＰＥＳ）及びホウ酸をそれぞれ２０ｍＭ含有
し適正ｐＨに調節された緩衝液を用いてｐＨ ４からｐ
Ｈ １０の範囲で調べた。メトエンケファリンを加水分
解するための最適ｐＨは６．０から６．５の間であるこ
とが判明した。４．５未満及び１０．０を超えるｐＨ値
ではメトケファリンの加水分解は検出されなかった（図
２）。
【００４８】基質特異性 数種のペプチドに及ぼす酵素の加水分解効果を表２にま
とめた。加水分解生成物は薄層クロマトグラフィー（Ｔ
ＬＣ）により分析した。精製されたエンドペプチダーゼ
は幅広い基質特異性を示した。５個未満のアミノ酸残基
のペプチドは加水分解されなかった。エンドペプチダー
ゼによって加水分解された最も大きなペプチドは酸化イ
ンスリンβ鎖であった。精製酵素と一晩インキュベート
した後でさえα、β、又はκ−カゼインの加水分解は検
出されなかった。
とめた。加水分解生成物は薄層クロマトグラフィー（Ｔ
ＬＣ）により分析した。精製されたエンドペプチダーゼ
は幅広い基質特異性を示した。５個未満のアミノ酸残基
のペプチドは加水分解されなかった。エンドペプチダー
ゼによって加水分解された最も大きなペプチドは酸化イ
ンスリンβ鎖であった。精製酵素と一晩インキュベート
した後でさえα、β、又はκ−カゼインの加水分解は検
出されなかった。
【００４９】種々の化学薬品の影響 表３はエンドペプチダーゼ活性がキレート化剤ＥＤＴＡ
および１，１０−フェナンスロリン（１．０ｍＭ）によ
って阻害されたことを示している。この酵素はまたセリ
ン プロテイナーゼ阻害剤であるフェニルメチルスルフ
ォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）及び二硫化物還元剤の
β−メルカプトエタノール（１％）によって阻害された
が、ジチオスレイトール （ＤＴＴ）によっては阻止さ
れなかった。スルホヒドリルの試薬であるｐ−クロロメ
ルキュリベンゾエイト（ｐＣＭＢ）、ｐ−クロロメルキ
ュリベンゼンスルフォン酸塩（ｐＣＭＢＳ）及びο−
（３−ヒドロキシメルキュリ−２−メトキシプロピル）
−カルバミルフェノキシアセテイト（メルサリル）は活
性に影響を示さなかった。β−メルカプトエタノールに
よる酵素の阻害は不可逆的であるようにみえた。フェリ
シアン化物、プルンバギン、および酸化グルタチオン
（５ｍＭまで）のような各種酸化試薬で酵素の活性を回
復させることはできなかった。
および１，１０−フェナンスロリン（１．０ｍＭ）によ
って阻害されたことを示している。この酵素はまたセリ
ン プロテイナーゼ阻害剤であるフェニルメチルスルフ
ォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）及び二硫化物還元剤の
β−メルカプトエタノール（１％）によって阻害された
が、ジチオスレイトール （ＤＴＴ）によっては阻止さ
れなかった。スルホヒドリルの試薬であるｐ−クロロメ
ルキュリベンゾエイト（ｐＣＭＢ）、ｐ−クロロメルキ
ュリベンゼンスルフォン酸塩（ｐＣＭＢＳ）及びο−
（３−ヒドロキシメルキュリ−２−メトキシプロピル）
−カルバミルフェノキシアセテイト（メルサリル）は活
性に影響を示さなかった。β−メルカプトエタノールに
よる酵素の阻害は不可逆的であるようにみえた。フェリ
シアン化物、プルンバギン、および酸化グルタチオン
（５ｍＭまで）のような各種酸化試薬で酵素の活性を回
復させることはできなかった。
【００５０】金属イオンの酵素活性に及ぼす影響 酵素（４μｇタンパク質）を１ｍＭのＣｕ2+又はＺｎ2+
で処理したところ酵素活性は完全に阻害された。他の陽
イオン、例えばＣｏ2+やＭｎ2+（１ｍＭ）のようなもの
は酵素活性に影響を与えなかった(表４)。ＥＤＴＡまた
は１、１０−フェナンスロリンによって阻害された酵素
活性は５０μＭから３００μＭのＣｏ2+によって回復さ
せることが出来たが、その他の２価の陽イオンによって
は回復させることはできなかった（表５）。これはこの
酵素がＣｏ2+に依存する金属ペプチダーゼであることを
示している。
で処理したところ酵素活性は完全に阻害された。他の陽
イオン、例えばＣｏ2+やＭｎ2+（１ｍＭ）のようなもの
は酵素活性に影響を与えなかった(表４)。ＥＤＴＡまた
は１、１０−フェナンスロリンによって阻害された酵素
活性は５０μＭから３００μＭのＣｏ2+によって回復さ
せることが出来たが、その他の２価の陽イオンによって
は回復させることはできなかった（表５）。これはこの
酵素がＣｏ2+に依存する金属ペプチダーゼであることを
示している。
【００５１】アミノ酸組成とＮ末端配列 精製したエンドペプチダーゼのアミノ酸組成（表６）は
セリンおよびグリシン残基含有量が高いことを示してい
る。システインやメチオニンのように硫黄を含んでいる
アミノ酸は低濃度である。アミノ酸の近似個数から計算
した分子量は６６ｋＤであった。エンドペプチダーゼの
アミノ末端の部分配列は以下のように１６番目まで決定
した：Ｔｈｒ−Ｘａａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ａｓ
ｐ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ
−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−． 表１ エル ラクティス（Ｌ． ｌａｃｔｉｓ）亜種
クレモリス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｗｇ２由来のエンドペ
プチダーゼの精製 ａ ｂ 精製工程 総タンパク質 総活性 収率 比活性 精製度 （ｍｇ） （％） （倍率） 細胞抽出物 6.640 278.9 100 0.042 1 DEAE-セファセル 902.1 387.9 139 0.430 10フェニル -セファロース 102.6 112.4 40.3 1.096 26ヒト゛ロキシル アハ゜タイト 38.5 96.3 34.5 2.500 60 モノ キュー 2.4 48.5 17.4 20.208 481フェニル スヘ゜ロース 1.7 48.4 17.4 28.470 678 ａ．総活性は１分間当り加水分解されたメトエンケファ
リンのマイクロモル数で表わす。 ｂ．比活性は１分間当たりタンパク質１ｍｇ当り加水分
解されたメトエンケファリンのマイクロモル数で表わ
す。 表２ エル ラクティス（Ｌ． ｌａｃｔｉｓ）亜種
クレモリス（ｃｒｅｍｏ ｒｉｓ）Ｗｇ２由来のエンドペ
プチダーゼの基質特異性。ペプチドの加水分解は薄層ク
ロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって分析した。又、発
色体基質ａ）の加水分解はＡ４１０で測定した。カゼイ
ンｂ）の加水分解はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出し
た。 基質 活性 ａ） Ｌｙｓ−ｐＮＡ − ａ） Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ − ａ） Ａｌａ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ − Ｂｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ − Ｂｚ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ − Ｚ−Ｐｒｏ−Ａｌａ − Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｌａ − Ｇｌｙ−Ｇｌｙ − Ｌｅｕ−Ｌｅｕ − Ｐｈｅ−Ｍｅｔ − Ｐｈｅ−Ｖａｌ − Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ − Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ − Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ − Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ − Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ − Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ − Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ − ａ） Ｎｓｕｃｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ｐＮＡ − ａ） Ｎｓｕｃｃ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ − ａ） Ｎｓｕｃｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ｐＮＡ − Ｚ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｐＮＡ − Ａｌａ5 − Ａｌａ6 − メトエンケファリン ＋ β−カソモルフィン − ブラジキニン ＋ サブスタンス Ｐ ＋ グルカゴン ＋ 酸化インスリン β鎖 ＋ ニューロテンシン ＋ ｂ） α−カゼイン − ｂ） β−カゼイン − ｂ） κ−カゼイン − β−カゼイン（３３−４８） − β−カゼイン（１８４−２０２） ＋ β−カゼイン（２０３−２０９） ＋ ＋： 加水分解 −： 加水分解検出されず 表３ 潜在的阻害剤のエンドペプチダーゼ活性に及ぼ
す影響。精製酵素（４μｇタンパク質）を２０℃で１０
分間１ｍＭの化学薬品であらかじめインキュベートし
た。メトエンケファリンの添加後、分画を３０℃で１５
分間インキュベートした。酵素の活性を薄層クロマトグ
ラフィーでテストした。 表４ 金属イオンのエンドペプチダーゼ活性に及ぼす
影響。活性測定は薄層クロマトグラフィーで実施した。 金属イオン（１ｍＭ） 阻害 無 − ＋＋ Ｃａ − ＋＋ Ｃｏ − ＋＋ Ｃｕ ＋ ＋＋ Ｍｇ − ＋＋ Ｍｎ − ＋＋ Ｚｎ ＋ ＋＋ Ｆｅ − ＋： 加水分解検出されず −： 加水分解表５ ＥＤＴＡと１、１０−フェナン
スロリンで処理したエンドペプチダーゼでの再活性化実
験。基質の加水分解の検出は薄層クロマトグラフィーに
よる。 濃度 金属イオン ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ （μＭ） Ｍｎ Ｃｏ Ｃｕ Ｃａ Ｆｅ Ｍｇ Ｚｎ ０ − − − − − − − ５０ − ＋ − − − − − １００ − ＋ − − − − − １５０ − ＋ − − − − − ２００ − ＋ − − − − − ３００ − ＋ ｎ.ｄ． ｎ.ｄ． ｎ．ｄ． ｎ．ｄ． − １０００ − − − − − − − ＋： 加水分解 −： 加水分解検出されず ｎ.ｄ．： 決定されず 表６ エンドペプチダーゼのアミノ酸組成エンドペプ
チダーゼのＡｒｇ及びＴｒｐ残基は決定されなかった。
近似個数から６６ｋＤａの分子量を算出した。 アミノ酸 酵素中のアミノ酸 近似個数 残基の％ Ａｓｘ ８．７８ ５８ Ｇｌｘ ７．９７ ５２ Ｓｅｒ １０．２５ ６８ Ｈｉｓ ２．００ １３ Ｇｌｙ １３．４６ ８９ Ｔｈｒ ５．５４ ３７ Ａｌａ ９．３６ ６２ Ａｒｇ ｎ．ｄ． ｎ．ｄ． Ｔｙｒ ２．４４ １６ Ｃｙｓ ２．９４ １９ Ｖａｌ ４．５４ ３０ Ｍｅｔ １．７７ １２ Ｐｈｅ ５．５４ ３７ Ｉｌｅ ５．２４ ３５ Ｌｅｕ ９．１２ ６０ Ｌｙｓ ５．９８ ４０ Ｐｒｏ ２．３０ １５ Ｔｒｐ ｎ．ｄ． ｎ．ｄ． ｎ．ｄ．： 決定されず
セリンおよびグリシン残基含有量が高いことを示してい
る。システインやメチオニンのように硫黄を含んでいる
アミノ酸は低濃度である。アミノ酸の近似個数から計算
した分子量は６６ｋＤであった。エンドペプチダーゼの
アミノ末端の部分配列は以下のように１６番目まで決定
した：Ｔｈｒ−Ｘａａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ａｓ
ｐ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ
−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−． 表１ エル ラクティス（Ｌ． ｌａｃｔｉｓ）亜種
クレモリス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｗｇ２由来のエンドペ
プチダーゼの精製 ａ ｂ 精製工程 総タンパク質 総活性 収率 比活性 精製度 （ｍｇ） （％） （倍率） 細胞抽出物 6.640 278.9 100 0.042 1 DEAE-セファセル 902.1 387.9 139 0.430 10フェニル -セファロース 102.6 112.4 40.3 1.096 26ヒト゛ロキシル アハ゜タイト 38.5 96.3 34.5 2.500 60 モノ キュー 2.4 48.5 17.4 20.208 481フェニル スヘ゜ロース 1.7 48.4 17.4 28.470 678 ａ．総活性は１分間当り加水分解されたメトエンケファ
リンのマイクロモル数で表わす。 ｂ．比活性は１分間当たりタンパク質１ｍｇ当り加水分
解されたメトエンケファリンのマイクロモル数で表わ
す。 表２ エル ラクティス（Ｌ． ｌａｃｔｉｓ）亜種
クレモリス（ｃｒｅｍｏ ｒｉｓ）Ｗｇ２由来のエンドペ
プチダーゼの基質特異性。ペプチドの加水分解は薄層ク
ロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって分析した。又、発
色体基質ａ）の加水分解はＡ４１０で測定した。カゼイ
ンｂ）の加水分解はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出し
た。 基質 活性 ａ） Ｌｙｓ−ｐＮＡ − ａ） Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ − ａ） Ａｌａ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ − Ｂｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ − Ｂｚ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ − Ｚ−Ｐｒｏ−Ａｌａ − Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｌａ − Ｇｌｙ−Ｇｌｙ − Ｌｅｕ−Ｌｅｕ − Ｐｈｅ−Ｍｅｔ − Ｐｈｅ−Ｖａｌ − Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ − Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ − Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ − Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ − Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ − Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ − Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ − ａ） Ｎｓｕｃｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ｐＮＡ − ａ） Ｎｓｕｃｃ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ − ａ） Ｎｓｕｃｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ｐＮＡ − Ｚ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｐＮＡ − Ａｌａ5 − Ａｌａ6 − メトエンケファリン ＋ β−カソモルフィン − ブラジキニン ＋ サブスタンス Ｐ ＋ グルカゴン ＋ 酸化インスリン β鎖 ＋ ニューロテンシン ＋ ｂ） α−カゼイン − ｂ） β−カゼイン − ｂ） κ−カゼイン − β−カゼイン（３３−４８） − β−カゼイン（１８４−２０２） ＋ β−カゼイン（２０３−２０９） ＋ ＋： 加水分解 −： 加水分解検出されず 表３ 潜在的阻害剤のエンドペプチダーゼ活性に及ぼ
す影響。精製酵素（４μｇタンパク質）を２０℃で１０
分間１ｍＭの化学薬品であらかじめインキュベートし
た。メトエンケファリンの添加後、分画を３０℃で１５
分間インキュベートした。酵素の活性を薄層クロマトグ
ラフィーでテストした。 表４ 金属イオンのエンドペプチダーゼ活性に及ぼす
影響。活性測定は薄層クロマトグラフィーで実施した。 金属イオン（１ｍＭ） 阻害 無 − ＋＋ Ｃａ − ＋＋ Ｃｏ − ＋＋ Ｃｕ ＋ ＋＋ Ｍｇ − ＋＋ Ｍｎ − ＋＋ Ｚｎ ＋ ＋＋ Ｆｅ − ＋： 加水分解検出されず −： 加水分解表５ ＥＤＴＡと１、１０−フェナン
スロリンで処理したエンドペプチダーゼでの再活性化実
験。基質の加水分解の検出は薄層クロマトグラフィーに
よる。 濃度 金属イオン ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ （μＭ） Ｍｎ Ｃｏ Ｃｕ Ｃａ Ｆｅ Ｍｇ Ｚｎ ０ − − − − − − − ５０ − ＋ − − − − − １００ − ＋ − − − − − １５０ − ＋ − − − − − ２００ − ＋ − − − − − ３００ − ＋ ｎ.ｄ． ｎ.ｄ． ｎ．ｄ． ｎ．ｄ． − １０００ − − − − − − − ＋： 加水分解 −： 加水分解検出されず ｎ.ｄ．： 決定されず 表６ エンドペプチダーゼのアミノ酸組成エンドペプ
チダーゼのＡｒｇ及びＴｒｐ残基は決定されなかった。
近似個数から６６ｋＤａの分子量を算出した。 アミノ酸 酵素中のアミノ酸 近似個数 残基の％ Ａｓｘ ８．７８ ５８ Ｇｌｘ ７．９７ ５２ Ｓｅｒ １０．２５ ６８ Ｈｉｓ ２．００ １３ Ｇｌｙ １３．４６ ８９ Ｔｈｒ ５．５４ ３７ Ａｌａ ９．３６ ６２ Ａｒｇ ｎ．ｄ． ｎ．ｄ． Ｔｙｒ ２．４４ １６ Ｃｙｓ ２．９４ １９ Ｖａｌ ４．５４ ３０ Ｍｅｔ １．７７ １２ Ｐｈｅ ５．５４ ３７ Ｉｌｅ ５．２４ ３５ Ｌｅｕ ９．１２ ６０ Ｌｙｓ ５．９８ ４０ Ｐｒｏ ２．３０ １５ Ｔｒｐ ｎ．ｄ． ｎ．ｄ． ｎ．ｄ．： 決定されず
【００５２】
【発明の作用と効果】本発明の乳酸菌由来のタンパク質
はエンドペプチダーゼ活性を有し、従来知られているエ
クソペプチダーゼと異なり、オリゴペプチドをよく分解
して、例えばチーズ熟成の際の苦み発生の防止やビール
等の発酵飲料の清澄化に有用である。
はエンドペプチダーゼ活性を有し、従来知られているエ
クソペプチダーゼと異なり、オリゴペプチドをよく分解
して、例えばチーズ熟成の際の苦み発生の防止やビール
等の発酵飲料の清澄化に有用である。
【００５３】
【図面の簡単な説明】 図１は２０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７）中での精製ペプ
チダーゼの活性に及ぼす温度の影響を示す。上記の如く
エンドペプチダーゼの相対活性を測定した。 図２は２０ｍＭのリンゴ酸、２０ｍＭのＭＥＳ，２０ｍ
ＭのＨＥＰＥＳ，２０ｍＭのホウ酸においてＫＯＨでｐ
Ｈ値を変えて測定した、エンドペプチダーゼ活性に及ぼ
すｐＨの影響を示す。エンドペプチダーゼの相対活性を
上述の如く測定した。
チダーゼの活性に及ぼす温度の影響を示す。上記の如く
エンドペプチダーゼの相対活性を測定した。 図２は２０ｍＭのリンゴ酸、２０ｍＭのＭＥＳ，２０ｍ
ＭのＨＥＰＥＳ，２０ｍＭのホウ酸においてＫＯＨでｐ
Ｈ値を変えて測定した、エンドペプチダーゼ活性に及ぼ
すｐＨの影響を示す。エンドペプチダーゼの相対活性を
上述の如く測定した。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年７月２２日
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１３】本発明のより特定の態様は乳酸菌ラクトコ
ッカス（Ｌａｃｏｔｃｏｃｃｕｓ）に由来する特に乳酸
菌ラクトコッカス ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｃｏｏｕ
ｓｌａｃｔｉｓ）亜種クレモリス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）
に、最も好ましくは乳酸菌ラクトコッカス ラクティス
（Ｌａｃｔｏｃｃｏｏｕｓ ｌａｃｔｉｓ）亜種クレモ
リス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｗｇ２に由来するエンドペプ
チダーゼに関するものである。
ッカス（Ｌａｃｏｔｃｏｃｃｕｓ）に由来する特に乳酸
菌ラクトコッカス ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｃｏｏｕ
ｓｌａｃｔｉｓ）亜種クレモリス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）
に、最も好ましくは乳酸菌ラクトコッカス ラクティス
（Ｌａｃｔｏｃｃｏｏｕｓ ｌａｃｔｉｓ）亜種クレモ
リス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｗｇ２に由来するエンドペプ
チダーゼに関するものである。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 15/04 8619−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 1/21 7236−4Ｂ 15/57 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/08 8214−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/573 Ａ 9015−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ //(Ｃ１２Ｎ 9/52 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01）
Claims (16)
- 【請求項１】 乳酸菌由来の単離または精製されたタン
パク質にして、Ｃｏ2+ 依存性エンドペプチダーゼ酵素
活性を有し、５個またはそれ以上のアミノ酸を有するペ
プチド類、メトエンケファリン、ブラジキニン、グルカ
ゴン、酸化インスリンβ鎖およびニューロテンシンを含
むが５個未満のアミノ酸を有するペプチド類ならびにα
−、β−及びκ−カゼインを含まない基質範囲を有して
おり、更に７０ｋＤ±５ｋＤの分子量、４．１±０．４
の等電点、３０〜３８℃の最適温度及び６．０〜６．５
の最適ｐＨ値を有することを特徴とするタンパク質。 - 【請求項２】 乳酸菌ラクトコッカスに由来する請求項
１に記載のタンパク質。 - 【請求項３】 乳酸菌ラクトコッカスのラクトコッカス
ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ Ｌａｃｔｉｓ）
に由来する請求項２に記載のタンパク質。 - 【請求項４】 乳酸菌ラクトコッカスのラクトコッカス
ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ Ｌａｃｔｉｓ）
亜種クレモリス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）に由来する請求項
２に記載のタンパク質。 - 【請求項５】 乳酸菌ラクトコッカスのラクトコッカス
ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ Ｌａｃｔｉｓ）
亜種クレモリス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｗｇ２に由来する
請求項２に記載のタンパク質。 - 【請求項６】 Ｎ−末端のアミノ酸配列がＴｈｒ−Ｘａ
ａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ
−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−
Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−（式中、Ｘａａは未確認）であること
を特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のタンパク
質。 - 【請求項７】 該タンパク質が自然に発現されている乳
酸菌の細胞マス、培地または分泌産物から得られるか、
或いは、遺伝子工学によって該タンパク質を発現する能
力を獲得した細胞マス、培地または生物の分泌産物から
得られ請求項１〜５のいずれかに記載のタンパク質。 - 【請求項８】 遺伝子工学により、請求項１〜７のいず
れかに記載のタンパク質を発現する自分では有さない能
力を獲得したか、或いは、請求項１〜７のいずれかに記
載のタンパク質の発現に関して自分が自然に有するより
も強く発現する能力を獲得した生物、特に微生物。 - 【請求項９】 請求項１〜７のいずれかに記載のタンパ
ク質をコードする遺伝情報を含有する組換えポリヌクレ
オチド、特に組換えＤＮＡ。 - 【請求項１０】 請求項１〜７のいずれかに記載のタン
パク質の製造方法にして、該タンパク質が発現されてい
る生物、特に微生物、例えばラクトコッカスラクティス
（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ Ｌａｃｔｉｓ）亜種クレモ
リス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｗｇ２、の粗細胞抽出物を、
ジエチルアミノエタン セファセル カラム クロマトグ
ラフィー、フェニル セファロース クロマトグラフィ
ー、ヒドロキシアパタイト クロマトグラフィー、なら
びに陰イオン交換カラムおよび疎水性相互作用カラムで
の高速液体クロマトグラフィーを含む単離処理にかけ、
各クロマトグラフィー処理工程において、エンドペプチ
ダーゼ様の加水分解能、特にメトエンケファリンに対す
る加水分解能を有する溶出液分画を選択することを特徴
とする製造方法。 - 【請求項１１】 請求項１〜７のいずれかに記載のタン
パク質を用いて、該タンパク質に対して親和性及び／ま
たは特異性を有するポリクローナルまたはモノクローナ
ル抗体を製造する方法。 - 【請求項１２】 請求項１〜７のいずれかに記載のタン
パク質に対して親和性および／または特異性を有するポ
リクローナルまたはモノクローナル抗体。 - 【請求項１３】 請求項１２に記載のポリクローナルま
たはモノクローナル抗体を用いて、請求項１〜７のいず
れかに記載のタンパク質を検知、除去および／または単
離する方法。 - 【請求項１４】 請求項９に記載の組換えポリヌクレオ
チドを形質転換マーカーとして用いる方法にして、該ポ
リヌクレオチドが遺伝情報を有するエンドペプチダーゼ
の発現を、該エンドペプチダーゼの適当な基質によるか
または該エンドペプチダーゼに対して親和性および／ま
たは特異性を有するポリクローナルまたはモノクローナ
ル抗体によって検知する方法。 - 【請求項１５】 請求項１〜７のいずれかに記載のタン
パク質および／または請求項８に記載の生物を用いるこ
とを特徴とするチーズのような食品、泡立ち製品および
肉製品を製造する方法。 - 【請求項１６】 請求項１〜７のいずれかに記載のタン
パク質および／または請求項８に記載の生物を用いて得
られたチーズのような食品、泡立ち製品および肉製品。 【０００１】
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP91201185A EP0522203A1 (en) | 1991-05-16 | 1991-05-16 | Protein from lactic acid bacteria |
| NL91201185.5 | 1991-05-16 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05268955A true JPH05268955A (ja) | 1993-10-19 |
Family
ID=8207656
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4148420A Pending JPH05268955A (ja) | 1991-05-16 | 1992-05-15 | 乳酸菌由来のタンパク質 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0522203A1 (ja) |
| JP (1) | JPH05268955A (ja) |
| CA (1) | CA2068811A1 (ja) |
| IE (1) | IE921553A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0733703A3 (en) * | 1995-03-07 | 1996-10-16 | Snow Brand Milk Products Co., Ltd. | Endopeptidase from Lactobacillus helveticus |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9313586D0 (en) * | 1993-07-01 | 1993-08-18 | Europ Economic Community | Lys-aminopeptidase pepn from lactobacillus delbrukii ssp.lactis,nucleic acids coding for it,and its use in fermentation processes |
| NL1005037C2 (nl) * | 1997-01-17 | 1998-07-20 | Nl Zuivelonderzoek Inst | Werkwijze voor het selectief afbreken van melkeiwit, in het bijzonder voor het selectief hydrolyseren van caseïne/caseïnaat in aanwezigheid van andere melkeiwitten, in het bijzonder wei-eiwitten. |
| CA2706364A1 (en) | 2000-12-07 | 2002-06-13 | Dsm Ip Assets B.V. | Method for the prevention or reduction of haze in beverages |
| CA2490020C (en) | 2002-06-07 | 2011-01-04 | Dsm Ip Assets B.V. | Improved method for the prevention or reduction of haze in beverages |
| CN116218711B (zh) * | 2022-12-21 | 2024-02-06 | 陕西省微生物研究所 | 一株乳酸乳球菌pz1及其在制备富硒低聚肽中的应用 |
-
1991
- 1991-05-16 EP EP91201185A patent/EP0522203A1/en not_active Withdrawn
-
1992
- 1992-05-15 CA CA002068811A patent/CA2068811A1/en not_active Abandoned
- 1992-05-15 JP JP4148420A patent/JPH05268955A/ja active Pending
- 1992-07-01 IE IE155392A patent/IE921553A1/en not_active Application Discontinuation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0733703A3 (en) * | 1995-03-07 | 1996-10-16 | Snow Brand Milk Products Co., Ltd. | Endopeptidase from Lactobacillus helveticus |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2068811A1 (en) | 1992-11-17 |
| EP0522203A1 (en) | 1993-01-13 |
| IE921553A1 (en) | 1992-11-18 |
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