CN111285925A - 副干酪乳杆菌zfm54细菌素的分离纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种副干酪乳杆菌ZMF54细菌素的分离纯化方法，其包括步骤：(A)获取副干酪乳杆菌ZFM54；(B)细菌素效价的测定；(C)副干酪乳杆菌ZFM54产抑菌物质最适发酵条件的确定；(D)发酵上清液的制备；(E)大孔树脂吸附层析；(F)离子交换色谱；(G)凝胶过滤层析；以及(H)制备型HPLC纯化，通过多步分离纯化方法得到副干酪乳杆菌ZMF54细菌素。

Description

副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法

技术领域

本发明涉及菌种培养领域，更进一步，涉及一副干酪乳杆菌ZMF54细菌素的分离纯化方法。

背景技术

目前商业化的乳酸菌素Nisin由于对热不稳定，抑菌谱较窄，能有效抑制革兰氏阳性菌但对大多数革兰氏阴性菌和霉菌等的生长没有抑制作用等原因，在食品工业中的应用受到限制。因此，开发广谱、高效的乳酸菌细菌素作为天然防腐剂已成为研究热点而备受关注。

副干酪乳杆菌常被用作牛奶、酸奶、奶油和干酪等乳制品的发酵剂及辅助发酵剂。细菌素一般定义为某些细菌在代谢过程中由核糖体合成的一类小分子蛋白质或多肽，这些物质在一定浓度下对其他微生物具有显著抑菌或杀菌活性。

揭示乳酸菌细菌素的生化特性、结构及作用机制对开发乳酸菌素资源与应用具有重要意义，这些都必须建立在获得乳酸菌纯品的基础上。迄今科研学者通过大量的产细菌素乳酸菌的筛选与研究已经发现了百余种乳酸菌素，但除了乳酸链球菌素Nisin第一个作为食品防腐剂应用于食品中外，真正商业化应用的乳酸菌素却很少，这是因为乳酸菌素的分离纯化难度较大，限制了乳酸菌素纯品的获得，使其难以深入研究和推广应用。因此，建立一个高效、快速的纯化流程是推动乳酸菌素研究及其在食品工业中应用的关键所在。由于乳酸菌细菌素是一类蛋白质或小分子多肽类物质，具有蛋白质的基本特性，所以一般蛋白质的纯化方法也可以为纯化乳酸菌素借鉴。而细菌素本身也有独特的理化特性如大多数带正电荷、疏水性较强等，因此需要结合其特异性选择合适的纯化方法。乳酸菌细菌素属于胞外分泌型代谢产物，但是由于发酵上清液中细菌素的浓度较低，直接分离纯化的难度较大，在检测阶段可能无法准确检出，因此一般先对发酵上清液进行粗提使其浓缩，再进行后续分离纯化。目前乳酸菌素的纯化流程已经比较成熟，主要分为粗提、中度纯化和精细纯化三个阶段。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法，其通过多步分离纯化方法，结合形态学鉴定、生理生化鉴定和16S rDNA同源性分析，鉴定筛选副干酪乳杆菌ZMF54。

本发明的一个目的在于提供一副干酪乳杆菌ZMF54细菌素的分离纯化方法，其经过初筛获得了一株具有较广泛抑菌谱的乳酸菌菌株ZFM54，为了避免乳酸菌代谢产生的一些有机酸、过氧化氢等物质对抑菌效果产生的干扰，确定是细菌素类物质发挥的抑菌作用，并且进一步复筛对这些干扰因素做了逐一排除。

本发明的一个目的在于提供一副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法，其包括步骤：

(A)获取副干酪乳杆菌ZFM54；

(B)细菌素效价的测定；

(C)副干酪乳杆菌ZFM54产抑菌物质最适发酵条件的确定；

(D)发酵上清液的制备；

(E)大孔树脂吸附层析；

(F)离子交换色谱；

(G)凝胶过滤层析；以及

(H)制备型HPLC纯化。

根据一个实施例所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法，其进一步包括步骤：反相HPLC分析。

根据一个实施例所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法，其进一步包括步骤：Tricine-SDS-PAGE方法检测细菌素的分子量。

根据一个实施例所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法，其进一步包括步骤：BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。

根据一个实施例所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法，其中所述步骤(C)包括：确定发酵时间对对ZFM54产抑菌物质的影响。

根据一个实施例所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法，其中所述步骤(C)包括：确定发酵温度对ZFM54产抑菌物质的影响。

根据一个实施例所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法，其中所述步骤(C)包括：确定接种量对ZFM54产抑菌物质的影响

根据一个实施例所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法，其中所述步骤(F)中：选择pH范围广的HiPrep XL SP阳离子柱进行分离。

根据一个实施例所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法，其中所述步骤(G)中：选择分辨率是1000～5000Da的Sephadex G-25凝胶柱对阳离子交换得到的活性组分进一步分离纯化。

根据一个实施例所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法，其中所述步骤(H)中：将经Sephadex G-25凝胶柱层析分离纯化得到的活性成分在 37℃旋转蒸发浓缩，用制备型C18反相高效液相色谱进一步分离纯化。

根据一个实施例所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法，其中所述步骤(A)中，通过钙溶圈、菌落形态学观察和革兰氏染色实验从初生婴儿粪便中分离到乳酸菌，利用牛津杯琼脂扩散法分别测试抑菌活性对乳酸菌进行了初筛，从中筛选到一株对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑菌效果且抑菌活性最强的优势菌株ZFM54。

附图说明

图1是根据本发明的一个优选实施例的菌种ZFM54的获取方法框图。

图2是根据本发明的实施例的乳酸菌分离培养基菌株生长状态。

图3是根据本发明的实施例的抑菌活性测试图，排除有机酸对抑菌活性的影响。

图4A示意菌株ZFM54的菌落形态。

图4B示意革兰氏染色检验结果。

图5示意ZFM54的16S rDNA扩增产物电泳图。

图6示意菌株ZFM54的16S rDNA基因序列系统进化树。

图7示意细菌素效价标准曲线。

图8示意副干酪乳杆菌ZFM54生长曲线与抑菌活性曲线。

图9示意培养温度对副干酪乳杆菌ZFM54抑菌活性的影响。

图10示意不同接种量对副干酪乳杆菌ZFM54抑菌活性的影响。

图11示XAD-16大孔树脂洗脱组分对指示菌的抑菌活性。

图12示意SP-Sepharose纯化色谱图。

图13示意阳离子交换色谱组分抑菌活性。

图14示意凝胶过滤层析出峰图。

图15示意凝胶过滤层析洗脱组分抑菌活性。

图16示意制备型HPLC纯化色谱图。

图17示意HPLC梯度洗脱组分的抑菌活性。

图18示意分析型高效液相色谱图。

图19示意ZFM54副干酪乳杆菌素的Tricine-SDS-PAGE图谱。

图20示意BCA法测蛋白浓度标准曲线。

菌种副干酪乳杆菌ZFM54保藏信息：

保藏日期：2016年11月23日

保藏单位：中国典型培养物保藏中心

地址：中国武汉武汉大学

保藏编号：CCTCC NO:M2016667

具体实施方式

以下描述用于揭露本发明以使本领域技术人员能够实现本发明。以下描述中的优选实施例只作为举例，本领域技术人员可以想到其他显而易见的变型。在以下描述中界定的本发明的基本原理可以应用于其他实施方案、变形方案、改进方案、等同方案以及没有背离本发明的精神和范围的其他技术方案。

本领域技术人员应理解的是，在本发明的揭露中，术语“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系是基于附图所示的方位或位置关系，其仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此上述术语不能理解为对本发明的限制。

可以理解的是，术语“一”应理解为“至少一”或“一个或多个”，即在一个实施例中，一个元件的数量可以为一个，而在另外的实施例中，该元件的数量可以为多个，术语“一”不能理解为对数量的限制。

对“一个实施例”、“实施例”、“示例实施例”、“各种实施例”、“一些实施例”等的引用指示这样的描述本发明的实施例可包括特定特征、结构或特性，但是不是每个实施例必须包括该特征、结构或特性。此外，一些实施例可具有对其它实施例的描述的特征中的一些、全部或没有这样的特征。

本发明提供一副干酪乳杆菌ZMF54细菌素的分离纯化方法，其用于分离纯化副干酪乳杆菌ZMF54细菌素，以获得副干酪乳杆菌ZMF54细菌素的纯品。

进一步，本发明的副干酪乳杆菌ZMF54通过以下方法获取。

参考图1，是根据本发明的实施例的副干酪乳杆菌ZMF54的获取及分离纯化方法的框图示意图。本发明提供一副干酪乳杆菌ZMF54的获取方法，所述菌种ZFM54是保藏菌种，分类命名：副干酪乳杆菌ZFM54(Lactobacillus casei ZFM54)。

保藏信息：

保藏日期：2016年11月23日

保藏单位：中国典型培养物保藏中心CCTCC

地址：中国湖北省武汉市武昌区珞珈山街16号武汉大学

保藏编号：CCTCC NO:M2016667分类命名：副干酪乳杆菌ZFM54(Lactobacilluscasei ZFM54)。

所述菌种ZFM54的获取方法包括以下步骤：

(S0)：原材料准备；主要包括以下几个方面：

(a)确定菌种来源

本实施例中所筛菌种来源于浙江大学医学院附属妇产科医院初生婴儿粪便。抑菌实验所用指示菌为本实验室保藏的藤黄微球菌10209(Micrococcus luteus 10209)、金黄色葡萄球菌D48(Staphylococcus aureus D48)、单增李斯特氏菌LM1(Listeriamonocytogenes LM1)、大肠杆菌DH5α(Escherichia coli DH5α)、鼠伤寒沙门氏菌CMCC50015(Salmonella typhimurium CMCC 50015)。

(b)培养基

(1)MRS培养基：牛肉膏10g，葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，柠檬酸三铵3g，磷酸氢二钾2g，无水乙酸钠5g，七水硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05 g，吐温80 1mL，溶于超纯水并定容至1L。调节培养基pH为6.5，121℃高压灭菌15min。固体培养基在此基础上加入1.5％～2％(W/V)琼脂。筛选乳酸菌所用的培养基在此基础上额外添加2％的碳酸钙。

(2)LB培养基：氯化钠10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，超纯水溶解并定容至1L，调节培养基pH为7，121℃高压灭菌15min。固体培养基在此基础上加入1.5％～2％(W/V)琼脂，半固体培养基在此基础上加入1％～1.2％(W/V) 琼脂。

(c)主要试剂

细菌微量生化鉴定管购于青岛海博生物技术有限公司；草酸铵结晶紫、加路哥式碘液、碳酸钙、琼脂糖、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、无水乙醇、盐酸、氢氧化钠、过氧化氢酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、细菌基因组提取试剂盒购于生工生物工程(上海)股份有限公司。

(d)主要仪器

表1实验主要仪器设备

进一步，所述菌种ZMF54的获取方法包括步骤：

(S11):婴儿粪便中乳酸菌的分离

在无菌条件下，取初生婴儿粪便用1mL灭菌生理盐水稀释，振荡使其充分混匀后静置，取100μL上清涂布到添加有2％碳酸钙的MRS固体培养基平板上，倒置于37℃培养箱中厌氧培养36～48h。选取长势良好且有明显钙溶圈的单菌落分别接种于MRS液体培养基中培养并编号。菌液经过反复几次平板划线分离，挑取单菌落，进行革兰氏染色及过氧化氢酶测试，革兰氏染色阳性，过氧化氢酶阴性的菌落初步判定为乳酸菌。

(S12)：菌种的活化及保藏

初步判定为乳酸菌的单菌落，接种到10mL MRS液体培养基中于37℃条件下培养24h，再以1％(v/v)的接种量进行两次传代培养。活化后编号保种，取 700μL菌液加上300μL灭菌甘油于-80℃保藏菌株。

(S13)：指示菌的培养

将保藏在-80℃甘油管中的各指示菌菌种，分别划线于LB固体培养基平板上，在各自的最适温度下培养至出现明显单菌落，挑取单菌落接种于LB液体培养基中摇床振荡培养至对数期(约12h)。用无菌生理盐水调整菌体浓度至OD600＝0.6， 4℃保存备用。

(S14)：乳酸菌初筛

将活化好的乳酸菌菌株按照1％(v/v)比例分别接种于10mL MRS液体培养基中，在37℃条件下静置培养24h后，4℃下8000r/min离心20min获得上清液，发酵上清液采用牛津杯琼脂扩散法测试抑菌活性。选择抑菌效果最好的菌株，进行分类鉴定作后续研究。牛津杯法抑菌试验具体方法如下：

(1)将灭过菌的LB半固体培养基加热使其充分融化，轻轻振荡混匀，并置于55℃水浴锅中恒温防止琼脂凝固；

(2)将灭过菌的牛津杯间隔均匀地放置在一次性培养皿上；

(3)将指示菌在漩涡振荡器中振荡混匀，待LB半固体培养基冷却到45℃左右后按1％(v/v)的接种量将指示菌菌悬液加入到15mL半固体培养基中，充分混匀后倒入培养皿中，轻轻旋转平皿使其均匀覆盖平皿表面，注意不要将培养基倒入牛津杯中；

(4)待半固体培养基完全冷却凝固后，用灭菌的镊子将牛津杯小心拔出，制成带圆柱形孔洞的含菌平板；

(5)在每个孔洞中加入100μL待测样品后，将平板置于4℃冰箱使样品充分扩散4h，然后按照不同指示菌各自的最适培养条件培养12h；

(6)用游标卡尺测量抑菌圈的直径并记录。抑菌试验均做三组平行。

(S15)：产细菌素乳酸菌复筛

除了细菌素外，乳酸菌代谢产生的抗菌活性物质还包括一些有机酸和过氧化氢等物质，牛津杯法初筛只能筛选出能产生抑菌物质的乳酸菌，无法确定发挥抑菌作用的是哪种物质，因此需要排除有机酸、过氧化氢对指示菌的抑菌干扰作用。

其具体包括：

(S151):排除有机酸的干扰

首先测定ZFM54发酵上清液的pH，然后用1M氢氧化钠溶液将发酵上清液调至pH5.0，以用乳酸和醋酸调至相同pH的无菌MRS培养基为对照，对藤黄微球菌10209进行牛津杯琼脂扩散法抑菌试验，测量抑菌圈直径大小，比较抑菌活性区别。

(S152)：排除过氧化氢的干扰

将发酵上清液浓缩两倍后调节pH值到原来的发酵上清pH值，配制浓度为 5mg/mL的过氧化氢酶工作液(溶剂为pH7.0的PBS缓冲液)。按发酵上清浓缩液与过氧化氢酶工作液体积比为1∶1进行混合，在37℃水浴处理2h后采用牛津杯法测试其抑菌活性；同时用以1∶1混合的发酵上清浓缩液和pH7.0的PBS 缓冲液作为空白对照，分别测量抑菌圈直径大小并比较区别。

(S153)：细菌素类物质(多肽)的确定

配制胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K的酶溶液5mg/mL，将发酵上清液分别调到各蛋白酶的最适pH值(胃蛋白酶pH2.0、胰蛋白酶pH5.4、蛋白酶K pH7.6)，然后加入对应酶溶液使其终浓度为1mg/mL，在37℃水浴锅中处理2h，再调回发酵上清液初始pH值。以未经蛋白酶处理的发酵上清液为空白对照，采用牛津杯法进行抑菌试验，测量抑菌圈直径大小并比较区别。

所述副干酪乳杆菌ZMF54的获取方法进一步包括步骤：

(S16)：菌种鉴定

根据《乳酸菌细菌分类鉴定及实验方法》和《伯杰氏系统细菌学手册》，对筛选得到的抗菌活性最优的菌株进行菌落菌体形态学鉴定和生理生化鉴定。同时基于16S rDNA基因进行分子生物学鉴定。

(S161)：形态学鉴定

在MRS固体平板上划线分离乳酸菌，根据平板上长出的单菌落的菌落形状、颜色、透明度、边缘是否整齐、表面是否光滑等特征来初步判断该菌株类型，然后挑取符合乳酸菌菌落形态且有抑菌活性的菌落进行革兰氏染色，再用显微镜观察菌体的形态特征，并从颜色判断属于革兰氏阳性菌还是阴性菌。

革兰氏染色及镜检步骤：

(1)制片：在干净的载玻片上滴一滴生理盐水，用接种环挑取单菌落与生理盐水混合均匀后进行涂片，涂抹成直径约为1cm的薄层；

(2)固定：将载玻片在酒精灯火焰上方快速来回通过一至两次进行加热固定；

(3)染色：在涂片区域上滴一滴草酸铵结晶紫，染色1min后用无菌水小心冲洗；

(4)媒染：加路哥式碘液一滴，作用1min后用无菌水冲洗，用擦镜纸吸干；

(5)脱色：倾斜载玻片，用滴管流加95％乙醇进行脱色，直至无紫色脱落，再用无菌水冲洗；

(6)复染：滴加0.5％的番红染色一滴，染色30s后，水洗；

(7)镜检：用擦镜纸吸干水，用油镜观察。

(S62)：生理生化鉴定

(1)七叶苷水解实验

有些细菌可以分解利用七叶苷产生七叶素，七叶素能够与培养基中的二价铁离子反应形成黑色的化合物。用细菌微量生化反应管来进行本实验，用接种环从平板上挑取已纯化培养的同一菌落接种于七叶苷试验的生化管。接种后静置于 37℃恒温箱中培养24h(用封口膜封口，封口膜用75％酒精擦拭灭菌)，若出现黑色说明七叶苷被水解，为阳性反应，否则为阴性反应。

(2)淀粉分解实验

将菌株从-80℃取出并在MRS固体培养基平板上划线活化，用接种环挑取单菌落接种于含有0.5％淀粉的MRS液体培养基中，静置于37℃恒温箱中培养24h。然后向培养液中加入几滴碘液摇匀，观察是否变色。若不变色表示淀粉完全水解，为阳性反应，如变成蓝色或蓝紫色则表明淀粉未完全水解，为阴性反应。

(3)糖醇发酵实验

该实验用各种糖的微量生化反应管来进行。用接种环从平板上挑取单菌落接种于葡萄糖微量生化反应管、果糖微量生化反应管、纤维二糖微量生化反应管、麦芽糖微量生化反应管、蔗糖微量生化反应管、蜜二糖微量生化反应管、棉籽糖微量生化反应管、乳糖微量生化反应管、甘露醇微量生化反应管和山梨醇微量生化反应管中，静置于37℃恒温箱中培养24h(用封口膜封口，封口膜用75％酒精擦拭灭菌)后观察结果。若反应管显色为黄色则说明产酸，为阳性反应，否则为阴性反应。

(4)过氧化氢酶实验

将菌株从-80℃取出并在MRS固体培养基平板上划线活化，置于37℃静置培养24h。然后挑取单菌落涂抹在载玻片上，在涂片区域上滴加几滴5％的过氧化氢溶液。若细菌可以产生过氧化氢酶，则过氧化氢被酶分解产生气泡，为阳性反应，否则为阴性反应。

(5)硫化氢实验

有些细菌能分解含硫的氨基酸如胱氨酸、半胱氨酸等并产生硫化氢。硫化氢能与培养基中的铁盐反应，生成黑色的硫化铁沉淀。用接种环从平板上挑取单菌落接种于硫化氢试验的微量生化反应管中，静置于37℃恒温箱中培养24h(用封口膜封口，封口膜用75％酒精擦拭灭菌)后观察结果，若显出黑色为阳性反应，否则为阴性反应。

(6)明胶水解实验

该实验用于检测细菌是否可以产生明胶酶将明胶水解成多肽。用微量生化反应管来进行本实验。用接种环从平板上挑取单菌落接种于明胶水解试验的微量生化反应管中，静置于37℃恒温箱中培养24h(用封口膜封口，封口膜用75％酒精擦拭灭菌)，观察明胶水解情况。

(7)细菌V-P实验

该实验用于检测细菌产生乙酰甲基甲醇的能力。某些细菌能够分解葡萄糖最终产生乙酰甲基甲醇。在碱性条件下，乙酰甲基甲醇被氧化成二乙酰，进而与培养基中的精氨酸等含胍基的物质结合形成红色化合物，即V-P试验阳性。用微量生化反应管来进行本实验，用接种环从平板上挑取单菌落接种于微量生化反应管。接种后静置于37℃恒温箱中培养24h(用封口膜封口，封口膜用75％酒精擦拭灭菌)，然后滴加VP甲液和乙液，显出红色为阳性反应，否则为阴性反应。

(S163)：基于16S rDNA的分子生物学鉴定

(1)乳酸菌基因组DNA的提取

用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒进行细菌全基因组的提取。实验开始前，按要求在PW Solution中加入相应量的异丙醇混合均匀，Wash Solution 中加入相应量的无水乙醇混合均匀，并在瓶身上做好标签，在室温下密封保存。使用前检查Buffer Digestion是否出现沉淀，如有则在56℃下溶解后使用。

1)将保存在-80℃中的菌株取出于MRS固体培养基平板上划线活化，待长出菌落后挑取单菌落接种至10mL MRS液体培养基中并置于37℃恒温培养箱中培养24h；

2)将培养后的菌液于漩涡振荡器上震荡使细菌充分混匀，吸取1mL菌液于1.5mLEP管中，在8000r/min离心1min，弃上清。加入180μL溶菌酶溶液 (使用前将相应的溶解酶加入到Enzymatic lysis buffer中，配置成20mg/mL的溶解酶溶液)重悬菌液，并在37℃下水浴一小时。加入20μL Proteinase K溶液，震荡混匀。56℃水浴30min直至细胞完全裂解；

3)加入200μL Buffer BD，充分颠倒混匀；

4)加入200μL无水乙醇，充分颠倒混匀；

5)先将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液全部吸取到吸附柱中，并静置2min，12000r/min离心1min，倒掉收集管中废液；

6)将吸附柱放回收集管中，加入500μL PW Solution，10000r/min离心30s，倒掉收集管中的滤液；

7)将吸附柱放回收集管中，加入500μL Wash Solution，10000r/min离心 30s，倒掉收集管中的滤液。

8)将吸附柱放回收集管中，于12000r/min中离心2min，离去残留的WashSolution。打开吸附柱的盖子在室温下放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的WashSolution，以免影响基因组DNA的产量和后续实验；

9)取出吸附柱放入新的1.5mL EP管中，加入100μL CE Buffer静置3min， 12000r/min离心2min，收集DNA溶液，并于-20℃保存以备进一步实验。

(2)琼脂糖凝胶电泳

1)制胶：称取0.2g琼脂糖，加入40mL 1×TAE溶液混合，并加热40s至琼脂糖完全溶解，室温下冷却至60℃左右加入1uL溴化乙锭充分混匀，倒入制胶槽中插入梳子，待其完全冷却凝固，小心将梳子拔出。

2)上样：将制好的胶放入电泳槽内，使得槽中的1×TAE溶液没过整块胶。取1uL 10×Loading buffer在塑料薄膜上，再取5uL提取好的DNA样品与 10×Loading buffer混合均匀，将样品小心打入凝胶孔中，再在边上的槽孔中加入 3uL 10000bp的DNA Marker。上样时小心枪头将胶戳破，注意不要有气泡。

3)电泳、成像：在80V恒压下电泳45min左右，待蓝色条带跑至整块凝胶的三分之二处即可结束电泳。取出凝胶并在凝胶成像仪中拍照查看结果。

(3)PCR扩增

PCR扩增采用乳酸菌16S rDNA的通用引物[101]，由生工生物工程(上海) 有限公司合成。

27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)

1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)

PCR扩增反应体系如下表2所示：

表2PCR扩增反应体系

表3PCR循环条件

PCR扩增后的产物使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行回收，乳酸菌16S rDNA通用引物的合成以及PCR产物序列的测序都由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

(4)16S rDNA同源性分析及系统发育树的构建

测序得到的序列提交到NCBI的GenBank数据库进行BLAST分析，筛选与所测菌株16S rDNA序列同源性最高的菌株，提取它们的序列并用生物信息学软件MEGA 6.0构建系统发育树，进行系统发育分析从而确定分离到的乳酸菌菌株的种属关系。

(S17)：结果分析

产细菌素乳酸菌的分离及初筛

以浙江省杭州市省妇幼保健医院初生婴儿的粪便为样品，筛选得到能产生钙溶圈的乳酸菌，如图2所示。挑选4株钙溶圈明显、菌落形态单一的单菌落接种于MRS液体培养基中，分别编号为S1、S2、S3、S4。

通过牛津杯琼脂扩散法检测这4株乳酸菌对大肠杆菌DH5、藤黄微球菌 10209等指示菌的抑菌活性，结果如表4所示。经试验发现菌株S4的发酵上清液抑菌活性最强，因此选定其作为后续实验的优势菌株，命名为ZFM54。

表4乳酸菌发酵液对指示菌的抑菌作用

注：牛津杯直径为8.0mm；“-”表示无抑菌圈

产细菌素乳酸菌的复筛

经过初筛获得了一株具有较广泛抑菌谱的乳酸菌菌株ZFM54，为了避免乳酸菌代谢产生的一些有机酸、过氧化氢等物质对抑菌效果产生的干扰，确定是细菌素类物质发挥的抑菌作用，复筛实验对这些干扰因素做了逐一排除。

排除有机酸对抑菌活性的干扰

用1M氢氧化钠溶液将乳酸菌ZFM54发酵上清液的pH调至5.0，用乳酸、醋酸将未接种的MRS液体培养基调节成pH5.0，以未调pH的发酵上清液(pH3.78) 为对照进行抑菌活性测试，指示菌为藤黄微球菌10209，结果如图3，图3中的 1是ZFM54发酵上清液；2是pH5.0的发酵上清液；3是pH5.0的乳酸MRS；4 是pH5.0的醋酸MRS。抑菌实验结果发现发酵上清液pH调为5.0后抑菌圈比发酵原液抑菌圈透明度低，抑菌圈稍小，但仍然具有良好的抑菌活性。而pH调为 5.0的乳酸MRS和醋酸MRS无抑菌圈出现，该实验结果说明发酵上清液中存在其他非酸性物质发挥抑菌作用。

图3中1是ZFM54发酵上清液；2是pH5.0的发酵上清液；3是pH5.0的乳酸MRS；4是pH5.0的醋酸MRS。

排除H₂O₂对乳酸菌抑菌活性的干扰

用过氧化氢酶处理菌株ZFM54的发酵上清液，以发酵原液作对照，两者对藤黄微球菌的抑菌效果未见显著变化，抑菌圈大小和透明度几乎一样，由此排除 H₂O₂所起的抑菌作用，进一步说明发酵上清液中存在其他抑菌活性物质。

蛋白酶处理对发酵上清抑菌活性的影响

菌株ZFM54发酵上清液经胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K处理后的抑菌活性如表5所示。经观察发现，菌株ZFM54的抑菌物质对不同的蛋白酶呈现出不同的敏感性，在经过胰蛋白酶和蛋白酶K处理之后，其抑菌圈直径明显的减小，丧失大部分抑菌活性；在经过胃蛋白酶的处理后其抑菌圈直径略有减小，且透明度降低，丧失小部分抑菌活性。由上述结果初步判断菌株ZFM54发酵上清液中的主要抑菌物质是一种蛋白质、多肽类物质或者不是单一的物质。

表5不同蛋白酶处理对菌株ZFM54抑菌活性的影响

注：牛津杯直径为8.00mm；同列相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，同列不同字母表示差异显著(P＜0.05)。

(S18):产细菌素乳酸菌的菌种鉴定

(S181):菌落菌体形态学鉴定

通过平板划线分离可以看到菌株ZFM54在MRS固体培养基平板上生长情况良好，菌落为圆形凸起状且边缘整齐，大小0.5～2.0mm，呈乳白色，表面光滑不透明，具有乳酸菌典型的生长特征(如图4A，菌株ZFM54菌落形态)；革兰氏染色结果呈阳性；在光学显微镜下观察菌体形态发现呈杆状形态，无鞭毛，无芽孢(如图4B，革兰氏染色结果)，菌落形态与革兰氏染色镜检结果与乳杆菌的特征符合。

(S82):细菌的生理生化鉴定

细菌在生长繁殖的过程中会进行各种复杂的代谢反应，反应过程中都必须要有酶的催化。不同种类细菌代谢途径不同，会产生不同的酶来催化反应的进行，因而其代谢类型和产物都不同，所以可以用生物化学方法进行检测来鉴定细菌的种类。菌株ZFM54的生理生化试验结果见表6。

表6菌株ZFM54生理生化特征

注：“+”代表阳性；“－”代表阴性

菌株ZFM54经H₂O₂酶试验、淀粉水解试验、硫化氢产生试验、明胶液化试验后结果均为阴性，说明该菌在生长代谢过程中不能分泌产生淀粉酶来降解大分子物质，也不能产硫化氢和过氧化氢。多种糖类分解实验中，ZFM54可以发酵多种糖醇类如葡萄糖、果糖、麦芽糖、甘露醇、山梨醇等，结果呈阳性；但不可发酵蜜二糖、棉籽糖和阿拉伯糖等产酸，结果呈阴性。此外细菌可以分解七叶苷且V-P反应呈阴性，此结果和乳酸菌群的特征基本对应。综合以上形态学及生理生化特性，参考《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》和《常见细菌系统鉴定手册》，初步认定菌株为ZFM54为副干酪乳杆菌。但由于副干酪乳杆菌与干酪乳杆菌中的某些亚种以及鼠李糖乳杆菌亲缘关系十分接近，很难利用传统的发酵特性做出区分，因此需要进一步结合16S rDNA方法进行鉴定。

(S183)：乳酸菌的分子生物学鉴定

(1)乳酸菌ZFM54基因组提取及16S rDNA的PCR扩增

使用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取乳酸菌ZFM54的总DNA，以乳酸菌ZFM54的总DNA为模板，用乳酸菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，扩增产物在1％琼脂糖凝胶下电泳得到一条约为1500bp的条带，电泳结果见图5。乳酸菌ZFM54的16S rDNA由生工生物工程(上海)有限公司进行测序。

(2)BLAST同源性比较及系统发育树的构建

将测序得到的乳酸菌ZFM54的16S rDNA序列提交至NCBI的GenBank数据库中进行BLAST比对，选择了10个菌株的16S rDNA基因序列，应用MEGA6.0 软件进行多重序列比对并构建系统发育树，见图6。在系统发育树中，菌株ZFM54 与副干酪乳杆菌在同一分支，结合细菌形态学和生理生化鉴定，该菌被鉴定为副干酪乳杆菌，并命名为Lactobacillus caseiZFM54，简称ZFM54。

乳酸菌是人体肠道中重要的益生菌，其数量和组成对维持宿主的微生态平衡和提高免疫系统功能起着至关重要的作用。由于外源益生菌的生长环境与人体胃肠道的环境相差甚远，因而许多学者认为理想的益生菌最好来自于人体自身的胃肠道。研究发现婴儿粪便中含有益生菌，这些益生菌可以有效调节肠道菌群，并能增加小鼠肠道和人体粪便中短链脂肪酸的含量。

本发明的实施例通过钙溶圈、菌落形态学观察和革兰氏染色实验从初生婴儿粪便中分离到4株乳酸菌，利用牛津杯琼脂扩散法分别测试抑菌活性对4株乳酸菌进行了初筛，从中筛选到一株对藤黄微球菌10209、单增李斯特氏菌LM1等革兰氏阳性菌和大肠杆菌DH5α、鼠伤寒沙门氏菌CMCC 50015等革兰氏阴性菌均有抑菌效果且抑菌活性最强的优势菌株ZFM54。由于乳酸菌发酵上清液中的抑菌物质除了细菌素外，还包括一些有机酸和H₂O₂等物质，仅通过牛津杯法抑菌试验不能说明是细菌素类物质发挥的抑菌作用，因此需要设计复筛实验来排除有机酸和H₂O₂的干扰。通过排除试验发现，菌株ZFM54的抑菌效果并不是由有机酸和H₂O₂引起而是另有其它抑菌物质在起作用。通过胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K处理菌株ZFM54发酵上清液发现：ZFM54发酵上清液中的抑菌物质对胰蛋白酶和蛋白酶K非常敏感，胃蛋白酶也可使其失去部分活性，因此初步鉴定ZFM54中产生抑菌效果的物质应该是一类蛋白质或者是多肽。

不同的微生物在分解、利用糖类、脂肪类和蛋白类物质的能力不同，因此，细菌的生理生化反应是菌株鉴定的重要依据。本发明的实施例中，结合形态学鉴定、生理生化鉴定和16S rDNA同源性分析，鉴定筛选出的ZFM54菌株为副干酪乳杆菌，命名为副干酪乳杆菌ZFM54(Lactobacillus casei ZFM54)。

以下对上述方法获取的副干酪乳杆菌ZMF54进行分离纯化

(S2.1)实验菌种准备

发酵菌种为副干酪乳杆菌ZFM54；指示菌为藤黄微球菌10209、单增李斯特氏菌LM1、金黄色葡萄球菌D48和鼠伤寒沙门氏菌CMCC50015。实验菌种及其培养条件见表2-1。

表2-1实验主要菌种

(S2.2)培养基的配置

(1)MRS培养基：牛肉膏10g，葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，柠檬酸三铵3g，磷酸氢二钾2g，无水乙酸钠5g，七水硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05 g，吐温80 1mL，溶于超纯水并定容至1L。调节培养基pH为6.5，121℃高压灭菌15min。固体培养基在此基础上加入1.5％～2％(W/V)琼脂。筛选乳酸菌所用的培养基在此基础上额外添加2％的碳酸钙；

(2)LB培养基：氯化钠10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，超纯水溶解并定容至1L，调节培养基pH为7，121℃高压灭菌15min。固体培养基在此基础上加入1.5％～2％(W/V)琼脂，半固体培养基在此基础上加入1％～1.2％(W/V) 琼脂。

(S2.3)主要试剂与耗材

丙烯酰胺粉末、甲叉丙烯酰胺粉末、过硫酸铵(APS)、甲醇、甘油、四甲基乙二胺(TEMED)、十二烷基磺酸钠(SDS)、购自生工生物工程(上海) 股份有限公司；

异丙醇、乙醇、色谱级乙腈、三氟乙酸(TFA)、一次性使用无菌注射器(带针)、0.22μm水系/有机微孔过滤膜等购自浙江常青化工有限公司；

XAD-16大孔树脂、HiPrep^TMSP XL 16/10层析柱、Sephadex G-25交联葡聚糖凝胶柱填料购自北京慧得易公司；

BCA蛋白定量试剂盒购自江苏凯基生物技术股份公司。

(S2.4)主要仪器

表2-2主要仪器

(S2.5)相关溶液配制

(S2.5.1)FPLC所用溶液

(1)缓冲液：20mM醋酸钠溶液，HCl调pH至4.0。使用前用0.22μm的滤膜抽滤并在超声清洗器中超声脱气20min；

(2)洗脱液：20mM醋酸钠+1M氯化钠，HCl调pH至4.0。使用前用0.22 μm的滤膜抽滤并在超声清洗器中超声脱气20min。

(S 2.5.2)HPLC所用溶液

(1)水相流动相A：100％水+0.05％TFA。使用前用0.22μm的滤膜抽滤并在超声清洗器中超声脱气20min；

(2)有机相流动相B：100％乙睛+0.05％TFA。使用前用0.22μm的滤膜抽滤并在超声清洗器中超声脱气20min。

(S 2.5.3)Tricine-SDS-PAGE所用溶液

(1)AB-3母液(49.5％T，3％C mixture)：称取48g丙烯酰胺和1.5g甲叉丙烯酰胺溶解于100mL蒸馏水中，4℃避光保存；

(2)AB-6母液(49.5％T，6％C mixture)：称取46.5g丙烯酰胺和3g甲叉丙烯酰胺溶解于100mL蒸馏水中，4℃避光保存；

(3)凝胶缓冲液：称取36.3g Tris和0.3g SDS溶于100mL超纯水中，用 HCl调pH值至8.45；

(4)样品缓冲液：12％SDS，6％巯基乙醇，30％甘油，0.05％溴酚蓝，0.15M Tris-HCL(pH＝7.0)；

(5)10％APS：称取过硫酸铵1g用蒸馏水定容至10mL并置于棕色瓶中， 4℃保存半个月；

(6)10×阴极缓冲液：称取121.14g Tris，179.2g Tricine和10g SDS用蒸馏水溶解并定容至1L，用HCl调节pH至8.25；

(7)10×阳极缓冲液：称取121g Tris用蒸馏水溶解并定容至1L，HCl调节pH至8.9；

(8)固定液：量取50mL甲醇，10mL冰醋酸，称取0.7708g醋酸铵，加蒸馏水定容至100mL；

(9)染色液：称取0.25g考马斯亮蓝G-250，溶于100mL强脱中(乙醇 45mL，冰乙酸10mL，蒸馏水45mL)，用滤纸过滤；

(10)强脱色液：量取乙醇45mL，冰乙酸10mL，蒸馏水定容至100mL；

(11)弱脱色液：量取乙醇25mL，冰乙酸8mL，蒸馏水定容至100mL。

(S3)细菌素的分离纯化

(S 3.1)细菌素效价的测定

(1)配制Nisin标准品溶液：准确称取Nisin标准品(10⁶IU/g)0.2g溶解于20mL0.02M的稀盐酸溶液中，得到浓度为1×10⁴IU/mL的Nisin标准样品溶液；

(2)用0.02M的稀盐酸溶液对1×10⁴IU/mL的标准样品溶液进行梯度稀释，获得终浓度分别为2000、1000、800、600、500、250、100和50IU/mL的标准品溶液；

(3)用牛津杯法对不同浓度的Nisin标准样品和细菌素进行抑菌实验，以藤黄微球菌10209为指示菌，设置三组平行实验；

(4)测量抑菌圈的直径大小，以Nisin标准溶液的不同效价的对数值为横坐标，以测得的抑菌圈的直径大小为纵坐标，绘制标准曲线，根据公式计算细菌素的效价。

(S 3.2)副干酪乳杆菌ZFM54产抑菌物质最适发酵条件的确定

(S 3.2.1)发酵时间对ZFM54产抑菌物质的影响

(1)用接种环将保藏在-80℃甘油管中的副干酪乳杆菌ZFM54在MRS固体培养基平板上进行划线活化，待平板上长出菌落后，挑取单菌落接种于10mL MRS液体培养基中，37℃静置培养24h后，按照1％(v/v)的接种量接种于800 mL的MRS液体培养基中，在37℃静置培养；

(2)在培养时间为0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、 36、40、48、60h的时间点时依次取样，每次取出5mL发酵液，分别测试发酵液的OD₆₀₀。注意取样前摇匀发酵液，并以同批灭菌的MRS液体培养基作空白对照。将每次测完余下的样品在8000r/min下离心15min，取上清测试其pH和抑菌活性，抑菌活性检测采用牛津杯琼脂扩散法，以藤黄微球菌为抑菌检测的指示菌；

(3)做三组平行实验，数据取平均值，绘制副干酪乳杆菌ZFM54的生长曲线及抑菌物质产生曲线。

(S 3.2.2)发酵温度对ZFM54产抑菌物质的影响

将副干酪乳杆菌ZFM54以1％(V/V)的接种量接种于MRS液体培养基中，分别以30℃、34℃、37℃、40℃恒温静置培养24h后，测定其OD₆₀₀值和抑菌活性大小(以抑菌圈直径大小表示)，确定最适发酵温度。做三组平行实验。

(S 3.2.3)接种量对ZFM54产抑菌物质的影响

将副干酪乳杆菌ZFM54分别以1％、1.5％、2％、2.5％(V/V)的接种量接种到MRS液体培养基中，37℃恒温静置培养24h后，测定其OD₆₀₀值和抑菌活性大小(以抑菌圈直径大小表示)，确定最适的接种量。

(S 3.3)发酵上清液的制备

(1)用接种环蘸取保藏在-80℃甘油管中的L.casei ZFM54菌液后在MRS 固体培养基平板上采用三区划线法划线，37℃培养箱中倒置培养，待长出单菌落；

(2)用接种环挑取单菌落接种到10mL MRS液体培养基中，在37℃下静置培养12～16h至对数生长期；

(3)以2％的接种量将已活化的L.casei ZFM54接种到5L MRS液体培养基中，在37℃培养箱中静置培养36h，得到发酵液；

(4)将发酵液在8000r/min，4℃条件下离心20min获得L.casei ZFM54的发酵上清液，测定发酵上清液的pH值，并将其在4℃保存备用。

(S 3.4)大孔树脂吸附层析

大孔树脂是一类有机高聚物吸附剂，普遍应用于天然产物的分离纯化。大孔树脂吸附作用是依靠它和被吸附的分子之间的范德华引力，通过它巨大的比表面进行物理吸附而工作，同时由于大孔吸附树脂的多孔结构使其对分子量大小不同的物质具有筛选作用，经过一定溶剂洗脱分开而达到分离、纯化、除杂、浓缩等不同目的。具体实验操作步骤如下：

(1)预处理：称取XAD-16大孔树脂50g左右，用纯乙醇浸泡过夜，使之充分膨胀，去除其中的致孔剂和漂浮的树脂小颗粒等杂志。并用超纯水反复冲洗至没有乙醇气味。

(2)湿法装柱：关闭玻璃柱下端开关，加入少量棉花堵住阀口以免树脂泄露，加入少量超纯水(5cm左右高度)。稍打开下端阀门，使液体保持缓慢流动，上端缓慢倒入已预处理的XAD-16大孔树脂，同时用细玻棒不断搅拌，排出填柱时产生的气泡。大孔树脂填充至柱体积2/3即可，确保树脂全部浸没在液体中，树脂上端用脱脂棉轻轻封住，防止颗粒漂浮。

(3)平衡层析柱：用超纯水以5mL/min流速冲洗大孔树脂柱至流出液在试管中用水稀释不浑浊或无明显乙醇气味时为止。切勿将柱子中的液体流干，树脂层面上保持2～3cm液体。

(4)发酵上清液过柱：将ZFM54发酵上清液以3～5mL/min的流速通过大孔树脂柱，树脂层中不能有气泡。待所有发酵上清液流完，用3倍柱体积的超纯水冲洗掉未吸附上的原液。接收所有流出液。

(5)梯度洗脱：依次用3倍柱体积的30％、50％、70％、100％异丙醇溶液以3mL/min的流速洗脱大孔树脂上吸附的物质，并收集各梯度的洗脱液。

(6)树脂的强化再生及保存：用超纯水淋洗树脂层直至无醇味，然后分别用4％HCl溶液和4％NaOH溶液浸泡2h再以5mL/min的流速淋洗树脂层，用超纯水洗至中性后用20％乙醇保存大孔树脂备用。

(7)活性检测：以上接收的各梯度洗脱液用旋转蒸发仪进行浓缩。由于纯化过程中制得的样品较少，因此选用具有代表性的致病菌藤黄微球菌10209、单增李斯特氏菌LM1(G⁺)和鼠伤寒沙门氏菌CMCC 50015(G^-)作为抑菌指示菌，检测分离得到的物质的抑菌活性。

(S 3.5)离子交换色谱

由于大多数细菌素的等电点大于7，在酸性环境中带正电荷，因此我们选择 pH范围广的HiPrep XL SP阳离子柱进行分离。通过调节pH、盐浓度、流速和上样量，选择合适的条件。

具体实验操作如下：

(1)开机：依次打开电脑和仪器的主电源，待仪器自检完毕(CU950上面的3个指示灯完全点亮且不闪烁)，双击桌面上的UNICORN图标，进入操作界面；

(2)准备工作溶液和样品：所有的工作溶液和样品必须经过0.22μm的滤膜过滤，并在使用前用低频超声脱气10min；

(3)清洗及管道准备：首先将A1和B1管道放入超纯水中，用注射器将泵 A和泵B中的空气抽出，在system control窗口点击工具栏内的manual，选择pump wash purifier，选中A1，B1管道为ON，点击execute，将自动进行泵清洗；

(4)安装层析柱：安装柱子之前先设置high alarm为0.15Mpa，以免流速过大超过填料的耐受压力而冲坏柱子。在flow rate里输入流速1ml/min，待 Injection Valve的1号位管道流出水后接入柱子的柱头，稍微拧紧后将柱下端的堵头卸掉接入管道连上紫外流动池。用超纯水将层析柱内的保存液冲洗干净，直到基线平衡；

(5)平衡层析柱：暂停流速，将A1管道放入缓冲液(20mM醋酸钠，pH4.0) 中，B1管道放入洗脱液(20mM醋酸钠+1M NaCl，pH4.0)后，继续冲大约3-5 个柱体积缓冲液来平衡层析柱，待基线走平准备上样，上样前将紫外调零；

(6)用样品环上样：样品是XAD-16大孔树脂洗脱下来的活性部分，将样品吸进注射器，推掉气泡，将进样阀转换为载样状态，从Inject Valve的3号位将样品打入进样环(进样量不得低于进样环体积的2倍)，推好后不要取下注射器。点击inject，执行操作；

(7)洗脱：上样后用缓冲液洗掉未结合杂蛋白，尽量将穿透峰洗回基线，大约3-5个柱体积。设置线性梯度target B为100％，洗脱时间为50min；

(8)设定收集：自动收集器设置每管收集体积为5mL，UV215 nm和UV280 nm检测收集洗脱峰，旋蒸浓缩并采用打孔法检测抑菌活性；

(9)泵清洗及层析柱的保存：缓冲液平衡层析柱3-5个柱体积后，将A1 和B1管道放入超纯水中，冲洗泵和整个管路，然后再将A1和B1管道放入20％乙醇中，同样操作将乙醇冲满整个管路和层析柱保存；

(10)关闭电源：退出UNICORN操作软件，关闭AKTA主机电源和电脑电源。

(S 3.6)凝胶过滤层析

凝胶过滤层析法又称为排阻层析或分子筛方法，是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离的一种方法。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，当多组分样品上柱时，大于凝胶孔径的分子无法进入凝胶孔内，直接从凝胶颗粒间的缝隙穿过而先流出柱子，小分子物质能进入凝胶孔内在其中绕行而后流出柱子，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。由于乳酸菌细菌素的分子量较小，因此我们选择分辨率是1000～5000Da 的Sephadex G-25凝胶柱对阳离子交换得到的活性组分进一步分离纯化，这样不仅实现了按分子量筛分不同组分，而且也达到了对上一步阳离子交换得到的高盐组分的脱盐目的。具体实验步骤如下：

(1)Sephadex G-25的预处理：称取适量的Sephadex G-25干粉于烧杯中，加入超纯水搅拌，于室温下浸泡过夜使其充分吸水溶胀，或沸水浴溶胀2h。倾倒除去凝胶上层水及细小颗粒，用超纯反复洗涤几次；

(2)装柱：层析柱规格为1.6cm×80cm，使用前用超纯水冲洗干净，垂直固定在铁架台上，将下口接上乳胶管并将螺旋盖旋紧。层析柱中倒入少量超纯水测试乳胶管出水是否正常，如果水能顺利从下口流出，保留约5cm高度的超纯水。将凝胶轻轻搅动均匀，用玻璃棒沿层析柱内壁引流缓慢倒入处理好的 Sephadex G-25。注意装柱要尽可能一次性将填料全部注入层析柱内，避免出现分层。同时注意避免产生气泡，如果有气泡则用玻璃棒轻轻搅拌赶走气泡。待 Sephadex G-25凝胶全部沉降后，用超纯水平衡2个以上柱体积，使松散的凝胶压紧密，注意凝胶层上方要始终保持有3～4cm高的超纯水，避免柱子流干；

(3)上样：样品是阳离子交换层析洗脱下来的活性组分旋蒸浓缩至2mL。使柱面上的超纯水流出，直至液面的最低点与凝胶柱面相切时，用一次性滴管吸取样品从层析柱上口沿着内壁转圈缓慢滴入，打开下端出口，使样品溶液进入凝胶内，待样品溶液凹液面与凝胶层相切时，用少量超纯水以同样方法清洗柱层析加样区，共洗涤三次，每次超纯水应完全进入凝胶柱内后，再进行下一次洗涤。最后在凝胶表面上加入超纯水，保持高度为3～4cm。

(4)洗脱与收集：连接好凝胶柱层析系统，打开恒流泵，调节洗脱液(超纯水)流速为1mL/min，进行洗脱。仔细观察样品在层析柱内的分离现象，最初的80mL流出液可以弃去，之后利用自动收集器收集洗脱液，设置每3min收集一管馏分；

(5)检测：将各收集管中的洗脱液分别用分光光度计在波长280nm处测定吸光度，根据数据绘制吸光度随管数的变化曲线。根据曲线合并同一峰型的洗脱液并旋蒸浓缩，以藤黄微球菌和李斯特菌为指示菌，采用牛津杯琼脂扩散法检测其抑菌活性；

(6)凝胶的再生：将样品完全洗脱下来后，继续用3倍柱体积的超纯水冲洗凝胶柱。凝胶反复使用多次后需要再生，用0.1mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl 溶液浸泡，然后用蒸馏水洗至中性备用。

(S 3.7)制备型HPLC纯化

高效液相色谱的原理是根据流动相中的样品各组分与固定相发生分配、吸附和解析等作用强弱不同，因此在固定相中的滞留时间不同，而使不同组分发生分离的。将经Sephadex G-25凝胶柱层析分离纯化得到的活性成分在37℃旋转蒸发浓缩，用制备型C18反相高效液相色谱进一步分离纯化，具体实验步骤如下：

(1)样品准备：将从凝胶柱层析洗脱液中得到的有抑菌活性的样品过0.22 μm滤膜，并用超纯水稀释成合适的浓度；

(2)仪器准备：流动相A、B在使用前均需经过抽滤并超声除气，换上流动相后开机，等待仪器自检完毕后，灌注溶剂使溶剂充满整个管路。上样前先用流动相A(95％水+0.05％TFA)、流动相B(5％乙睛+0.05％TFA)平衡C18 反相色谱柱40分钟，再将A相和B相设置成方法的起始比例走基线，流速1 mL/min，紫外检测波长设置为280nm；

(3)上样：用注射器向进样环中注射300μL样品，注意注射器中的样品不能出现气泡；

(4)梯度洗脱：流动相B从5％～95％梯度洗脱，具体方法见表3-3；

(5)进样结束后，用高比例的超纯水和高比例的纯乙腈先后冲洗，将系统和色谱柱中残留的样品杂质去除，最后用超纯水:纯乙腈＝40％:60％的比例保存色谱柱，方便下次使用。关闭仪器。

(6)检测活性：收集每个峰的组分，旋蒸将乙腈挥发完全后真空冷冻干燥，使用打孔法进行抑菌活性检测。

表3-3流动相洗脱梯度

(S3.8)反相HPLC分析

与制备型高效液相色谱相比较，分析型高效液相色谱与之原理相同、使用方法相同，但选用的是不同型号的C₁₈反向色谱柱(色谱柱型号：YMC-Pack ODS-AQ， 150×4.6mmL.D.)。该色谱柱具有更高的灵敏度和准确度，能更好的分离样品，检验样品的纯度。

(1)样品预处理：将分离纯化后经旋蒸、冻干的样品重溶，0.22μm滤膜过滤，取1mL样品放入液相专用样品进样瓶中，拧上进样瓶瓶盖，置于4℃待用。

(2)仪器准备：按照电脑、仪器、软件的开启顺序启动液相色谱，待仪器自检结束。设定流速为0.8mL/min，紫外检测波长为280nm。用95％流动相A 平衡C₁₈反相色谱柱1小时，使基线走平。

(3)上样：将进样瓶放入进样盘中，设定每次向进样环中进样30μL预处理样品，每一个样品连续进样3次。

(4)梯度洗脱：按照表3-3的方法进行洗脱。

(5)色谱柱冲洗方法与制备型液相相同相同。关闭仪器。

(S3.9)Tricine-SDS-PAGE

聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)是一种最常用的蛋白表达分析技术。在一般蛋白电泳中，蛋白质会受到电荷等其他因素的影响，但是在SDS-PAGE中加入阴离子表面活性剂(SDS)，SDS会和蛋白质结合成蛋白-SDS复合物并破坏蛋白质的二级结构和三级结构，同时使整个蛋白带上负电荷，因此蛋白质中所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，使得蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子量，根据分子量的不同，达到在电泳胶中分离的效果，是常用于分析蛋白质和多肽分子的一种手段。但是常规的SDS-PAGE电泳对于相对分子量小的，尤其是10kDa 以下的蛋白分辨率极低，而Tricne-SDS-PAGE可以很好的分离分子量在1-10kDa的蛋白及多肽。由于细菌素分子量大多小于10kDa，因此我们采用分离小分子肽的Tricine-SDS-PAGE三层胶方法来检测细菌素的分子量。具体实验操作如下：

(1)准备工作：准备制胶所需的长短玻璃板、制胶器、架子、胶条、梳子和制胶所用溶液。长短玻璃板要注意用清水冲洗，用75％酒精擦洗吹干板上的水珠；

(2)制胶：将凝胶模具安装好后，按照表3-4的配方配制分离胶、夹层胶和浓缩胶。向凝胶模具中迅速灌入适量18％分离胶(约4mL)，然后在分离胶液面上轻轻覆盖一层1～3cm的水层，使凝胶表面保持平整。静置，待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面表示凝胶已聚合。去除覆盖在分离胶上的水层，用滤纸将残留的水尽量吸去。之后以同样的方法灌注10％夹层胶(约1mL)和4％浓缩胶。浓缩胶灌注至与玻璃短板齐平后，将梳子插入凝胶，避免产生气泡。待凝胶聚合后，小心地拔出梳子，注意不要破坏加样孔；

表3-4Tricine-SDS-PAGE胶配方

(3)样品变性：用0.5M碳酸钠溶液调节细菌素提取样品的pH至中性后取 20μL与20μL上样缓冲液混匀，于99℃金属浴10min进行变性，之后迅速置于冰上冷却，并于5000r/min离心5min；

(4)上样：将制好的胶板安装到电泳槽上，在内槽中加入1×阴极缓冲液，在外槽中加入1×阳极缓冲液。在泳道中分别加入5μL Marker和15μL样品；

(5)电泳：加样完成后，先30V电泳1h，待样品进入夹层胶之后，以40mA 恒流电泳至溴酚蓝条带到达分离胶底部1cm处，停止电泳；

(6)电泳结束后，把胶取出置于固定液中固定30min，防止小分子多肽逸出，再用超纯水清洗三次；

(7)加入100mL考马斯亮蓝染色液于摇床上染色30min，回收染色液，加入强脱色液100mL洗脱20min，后换弱脱色液洗脱至蛋白条带清晰；

(8)取出胶块，在凝胶成像仪中拍照观察。

S3.10 BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度

BCA法测定蛋白浓度具有快速灵敏、稳定可靠、节省样品且对不同种类蛋白质变异系数小的优点。BCA法测定蛋白浓度的原理是：在碱性条件下，Cu²⁺被蛋白质的肽键还原成Cu⁺，两分子的bicinchoninic acid(BCA)螯合一个Cu⁺形成一种在562nm处有强吸收的紫色络合物，测定蛋白样品在562nm出的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算出待测蛋白的浓度。

BCA试剂盒测定蛋白浓度的实验操作如下：

(1)按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50∶1)配制5mL BCA 工作液，充分混匀；

(2)取一块酶标板，按照表3-5在相应的孔内加入试剂得到系列稀释的蛋白标准品溶液，每个浓度做三组平行；

表3-5BCA标准蛋白贮液配制表

(3)各孔加入200μL BCA工作液，把酶标板放在振荡器上振荡30sec，37℃放置30min，然后在562nm下比色测定。以蛋白含量(μg)为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；

(4)稀释待测样品至合适浓度，使样品稀释液总体积为20μL，加入BCA 工作液200μL，充分混匀，37℃放置30min后，以标准曲线0号管做参比，在 562nm波长下比色，记录吸光值；

(5)根据所测样品的吸光值，对比标准曲线即可计算出相应的蛋白含量(μg)，除以样品稀释液总体积(20μL)，乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度(单位：μg/μL)。

S4结果分析

(S4.1)细菌素效价的标准曲线

以Nisin标准溶液效价的对数值为横坐标，抑菌圈直径为纵坐标，绘制细菌素效价标准曲线，如图7所示。Nisin效价的标准曲线方程为：y＝6.8527x+0.2516， R²＝0.9908表明该标准曲线的线性程度较好，可用于乳酸菌细菌素效价的测定。 (S4.2)副干酪乳杆菌ZFM54产抑菌物质的最适发酵条件的确定 (S4.2.1)发酵时间对ZFM54产抑菌物质的影响

将活化好的副干酪乳杆菌ZFM54以1％接种量接种在MRS液体培养基中，在37℃下培养60h，以时间为横坐标，OD₆₀₀值、pH值和抑菌圈直径为纵坐标绘制生长曲线和抑菌活性变化曲线，结果如图8所示。由图可知，ZFM54在0-6 h时OD₆₀₀值变化较小，说明菌体生长缓慢，处于延滞期。6h后，ZFM54进入对数生长期，菌体生长旺盛，菌体密度快速上升，与此同时发酵液的pH迅速下降，12h后开始产生抑菌活性物质，到对数生长末期的20h，开始大量产生抑菌活性物质。20h后菌体生长变缓，逐渐进入稳定期，pH值小幅度下降，随后基本稳定在3.75左右，抑菌活性在36-48h达到最大值。副干酪乳杆菌ZFM54的生长曲线未见明显的衰亡期出现。

(S4.2.2)发酵温度对ZFM54产抑菌物质的影响

将副干酪乳杆菌ZFM54以1％(V/V)的接种量接种于MRS液体培养基，在不同的温度(30、34、37、40℃)下培养时，其生长和抑菌活性的变化情况如图9所示。

从图9中可以看出，副干酪乳杆菌ZFM54在30～37℃生长良好，40℃时菌体密度显著下降。而37℃培养时，OD₆₀₀值最高，且抑菌活性也明显优于其他培养温度，因此后续实验选择37℃作为副干酪乳杆菌ZFM54产细菌素的最佳发酵培养温度。

(S4.2.3)接种量对ZFM54产抑菌物质的影响

将副干酪乳杆菌ZFM54分别按1％、1.5％、2％、2.5％(V/V)的接种量接种于MRS液体培养基，于37℃培养时其生长和抑菌活性的变化情况如图10所示。

如图10所示，随着接种量的增加，菌体密度呈现下降趋势，推测可能是由于接种量的增大，培养基的营养不足，使副干酪乳杆菌之间产生生长的竞争，然而在接种量为2％时抑菌活性最高。有文献报道，细菌素在不利生长条件下反而有更高的细菌素产量，所以推测出现这种情况可能是因为细菌素的产生是一种应激调节，对不适于其最佳生长环境的一种应激反应^[109-110]。但总的来说，细菌素的产生是一个复杂的代谢过程，可能受多种因素的影响。根据不同接种量发酵的试验结果，我们选择2％的接种量作为副干酪乳杆菌ZFM54产细菌素的最佳发酵接种量。

(S4.3)XAD-16大孔树脂吸附层析

本实验将5L发酵上清液(pH为3.78)全部流经XAD-16大孔树脂吸附柱，经过超纯水平衡后，分别用30％、50％、70％、100％异丙醇洗脱，收集上清流出液及各梯度洗脱液，用旋转蒸发仪在37℃，80r/min条件下除去有机溶剂，浓缩洗脱液。用牛津杯琼脂扩散法检测各梯度洗脱液的抑菌活性。如图11A-11C所示，仅上清流出液和30％异丙醇洗脱液对藤黄微球菌10209、鼠伤寒沙门氏菌 CMCC 50015和单增李斯特氏菌LM1有较好的抑菌活性，50％、70％、100％异丙醇洗脱液均未检测到抑菌活性。图11A中，a对应经过XAD-16处理的大孔树脂流出液对藤黄微球菌10209的抑菌结果，b1、b2、b3、b4分别是30％异丙醇洗脱液、50％异丙醇洗脱液、70％异丙醇洗脱液、100％异丙醇洗脱液的对藤黄微球菌10209抑菌结果，图11B中，a对应经过XAD-16处理的大孔树脂流出液对单增李斯特氏菌LM1的抑菌结果，b1、b2、b3、b4分别是30％异丙醇洗脱液、 50％异丙醇洗脱液、70％异丙醇洗脱液、100％异丙醇洗脱液的对单增李斯特氏菌 LM1的抑菌结果。图11C中，a对应经过XAD-16处理的大孔树脂流出液对鼠伤寒沙门氏菌CMCC 50015的抑菌结果，b1、b2、b3、b4分别是30％异丙醇洗脱液、50％异丙醇洗脱液、70％异丙醇洗脱液、100％异丙醇洗脱液的对鼠伤寒沙门氏菌CMCC50015的抑菌结果。

(S4.4)离子交换色谱分离纯化

由于大多数细菌素的等电点在碱性范围，在酸性环境中性质稳定，带正电荷，因此我们采用Hiprep SP XL强阳离子交换色谱，选择pH4.0的缓冲液作为离子交换层析的流动相。本实验采用XAD-16大孔树脂30％异丙醇洗脱液浓缩样品200mL上样，每针上样样品用2mL浓缩粗提液加上4mL超纯水稀释，流速为1mL/min，每进5针样品后用含1M NaCl的醋酸钠缓冲液进行梯度洗脱，吸附洗脱曲线如图12所示。从图中可以看出，当洗脱液中盐浓度达到60％时，有一个单独的蛋白峰开始被洗脱下来。将收集到的各管洗脱液分别旋蒸浓缩后采用点样法检测抑菌活性(见图13A，f-穿透峰，t1-1管，t2-2管，t3-3管，t4-4管， t5-5管，t6-6管，t7-7管，t8-8管，t9-9管，t10-10管，a-XAD-16大孔树脂30％异丙醇洗脱液)，可以看到以藤黄微球菌10209为指示菌，具有抑菌活性的物质集中在7、8、9管，正好与离子交换色谱图上的洗脱峰对应。将有抑菌活性的几管合并浓缩成2mL，以牛津杯法检测对藤黄微球菌10209的抑菌活性(见图13B， f1-穿透峰1，f2-穿透峰2，f3-洗脱峰前，f4-洗脱峰，f5-洗脱峰后)。

(S4.5)凝胶过滤层析分离纯化

将阳离子交换层析洗脱下来的活性成分浓缩后利用Sephadex G-25凝胶柱进行筛分及脱盐，一次上样2mL，用超纯水洗脱，每3mL馏分收集1管，共收集60管的馏分，在280nm检测波长下测定每管馏分的吸光度并绘制变化曲线，结果如图14所示。共出现4个组分(Z1-组分1，Z2-组分2，Z3-组分3，Z4-组分4)，将4个组分对应管数的洗脱液合并，旋蒸浓缩，用牛津杯琼脂扩散法对藤黄微球菌10209进行抑菌活性检测，结果如图15，发现仅组分2具有抑菌活性。

(S4.6)制备型HPLC纯化

将经凝胶过滤层析后的抗菌活性样品进一步利用制备型C18反相高效液相色谱进行纯化，得到的色谱图如图16所示。可以看到HPLC色谱图上出现两个洗脱峰(D1，D2)，分别接收两个洗脱峰，旋蒸冻干后检测抑菌活性，发现只有在19min左右出峰(D2)的样品对藤黄微球菌10209具有抑菌效果(见图17， y1-D1对应的HPLC梯度洗脱组分的抑菌活性，y2-D2对应的HPLC梯度洗脱组分的抑菌活性)。

(S4.7)分析型HPLC鉴定

将经过制备型液相反复制备并收集的活性峰成分进行浓缩，再次使用分析型高效液相色谱进行分析，色谱图中仅出现单一峰，保留时间为15.64min(见图18)。

(S4.8)Tricine-SDS-PAGE测定分子量

将经过HPLC纯化后的ZFM54副干酪乳杆菌素进行Tricine-SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，经过考马斯亮蓝染色后得到条带见图19，ZFM54副干酪乳杆菌素的分子量约为5kDa，属于一种小肽类细菌素。

(S4.9)细菌素分离纯化得率分析

ZFM54副干酪乳杆菌素分离纯化得率如表3-6所示，从表中可以看出，经过四步纯化后，ZFM54副干酪乳杆菌素的最终纯化倍数为5.03倍，但最终得率仅为0.51％，纯化过程中抑菌活性物质的损失较大，尤其是在凝胶过滤层析这一步。分析其原因，可能是有一部分细菌素在柱内保留时间稍长，导致洗脱液收集不完全，另外由于凝胶过滤层析所用洗脱液为水，旋转蒸发耗时较长导致细菌素活性受损。HPLC纯化阶段细菌素的损失则主要是因为HPLC进样量需始终大于进样环的容量。

表3-6ZFM54副干酪乳杆菌纯化得率

(S4.10)蛋白质含量标准曲线

本研究中的蛋白质含量采用BCA蛋白定量试剂盒测定，根据试剂盒制作的蛋白质标准曲线如图20所示，标准曲线方程为y＝0.0506x+0.111，R²＝0.9985表明本标准曲线的线性程度较高，可用作测定乳酸菌细菌素浓度的标准曲线。将分离纯化所得的ZFM54副干酪乳杆菌素稀释40倍后在562nm处的紫外吸收值为0.326，根据蛋白质标准曲线计算得出稀释40倍后的细菌素的浓度为0.21245 μg/μL，ZFM54副干酪乳杆菌素的最终浓度为8.498μg/μL，最终得到ZFM54副干酪乳杆菌素约42.49mg，将其真空冷冻干燥，并置于-20℃备用。

由于细菌素是胞外代谢产物，在发酵液中的含量比较低，因此在本章研究中我们首先通过单因素试验确定了副干酪乳杆菌ZFM54产抑菌活性物质的最佳发酵条件。对副干酪乳杆菌ZFM54的生长曲线进行了测定，发现L.casei ZFM54 在对数期中期开始产生抑菌活性物质，至稳定期后期(约36-48h)产量达到最大并基本稳定；研究不同培养温度对抑菌活性的影响，结果显示37℃培养时抑菌活性最好；研究不同接种量对抑菌活性的影响，发现以2％的接种量接种时抑菌活性最好。因此确定L.casei ZFM54产细菌素的最佳发酵条件为：2％(V/V) 接种量，于37℃培养36h。

根据细菌素多带正电荷，具有疏水性及分子量较小的性质，设计了XAD-16 大孔树脂吸附、阳离子交换层析、Sephadex G-25凝胶过滤层析和RP-HPLC的四步纯化法，对发酵上清液中的ZFM54副干酪乳杆菌素进行了分离纯化。经 Tricine-SDS-PAGE蛋白电泳进行表观分子量分析，ZFM54副干酪乳杆菌素分子量为5kDa左右。用BCA试剂盒测得蛋白浓度，根据蛋白标准曲线计算细菌素的含量为42.49mg。对细菌素纯化效果进行评估，得到最终纯化倍数为5.03倍，回收率仅为0.51％，说明纯化过程中细菌素的损失较大，今后应继续对其分离纯化的方法或条件进行优化。

本领域的技术人员应理解，上述描述及附图中所示的本发明的实施例只作为举例而并不限制本发明。本发明的目的已经完整并有效地实现。本发明的功能及结构原理已在实施例中展示和说明，在没有背离所述原理下，本发明的实施方式可以有任何变形或修改。

Claims (22)

1.一副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法，其特征在于，包括步骤：

(A)获取副干酪乳杆菌ZFM54；

(B)细菌素效价的测定；

(C)副干酪乳杆菌ZFM54产抑菌物质最适发酵条件的确定；

(D)发酵上清液的制备；

(E)大孔树脂吸附层析；

(F)离子交换色谱；

(G)凝胶过滤层析；以及

(H)制备型HPLC纯化。

2.根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法，其进一步包括步骤：反相HPLC分析。

3.根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法，其进一步包括步骤：Tricine-SDS-PAGE方法检测细菌素的分子量。

4.根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法，其进一步包括步骤：BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。

5.根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法，其中所述步骤(C)包括：确定发酵时间对对ZFM54产抑菌物质的影响。

6.根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法，其中所述步骤(C)包括：确定发酵温度对ZFM54产抑菌物质的影响。

7.根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法，其中所述步骤(C)包括：确定接种量对ZFM54产抑菌物质的影响。

8.根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法，其中所述步骤(F)中：选择pH范围广的HiPrep XL SP阳离子柱进行分离。

9.根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法，其中所述步骤(G)中：选择分辨率是1000～5000Da的Sephadex G-25凝胶柱对阳离子交换得到的活性组分进一步分离纯化。

10.根据权利要求9所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法，其中所述步骤(H)中：将经Sephadex G-25凝胶柱层析分离纯化得到的活性成分在37℃旋转蒸发浓缩，用制备型C18反相高效液相色谱进一步分离纯化。

11.根据权利要求1-10任一所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法，其中所述步骤(A)中，通过钙溶圈、菌落形态学观察和革兰氏染色实验从初生婴儿粪便中分离到乳酸菌，利用牛津杯琼脂扩散法分别测试抑菌活性对乳酸菌进行了初筛，从中筛选到一株对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑菌效果且抑菌活性最强的优势菌株ZFM54。

12.根据权利要求1-10任一所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法，其中所述步骤(A)副干酪乳杆菌ZFM54的获取方法为：从婴儿粪便中分离乳酸菌；菌种的活化和保藏；指示菌的培养；乳酸菌初筛；产细菌素乳酸菌复筛。

13.根据权利要求12所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法，从婴儿粪便中分离乳酸菌的方法为：在无菌条件下，取初生婴儿粪便用1mL灭菌生理盐水稀释，振荡使其充分混匀后静置，取100μL上清涂布到添加有2％碳酸钙的MRS固体培养基平板上，倒置于37℃培养箱中厌氧培养36～48h。

14.根据权利要求12所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法，所述步骤(A)菌种的活化和保藏方法为：初步判定为乳酸菌的单菌落，接种到10mL MRS液体培养基中于37℃条件下培养24h，再以1％(v/v)的接种量进行两次传代培养，活化后编号保种，取700μL菌液加上300μL灭菌甘油于-80℃保藏菌株。

15.根据权利要求14所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法，指示菌的培养方法为：将保藏在-80℃甘油管中的各指示菌菌种，分别划线于LB固体培养基平板上，在各自的最适温度下培养至出现明显单菌落，挑取单菌落接种于LB液体培养基中摇床振荡培养至对数期。

16.根据权利要求12所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法，其中乳酸菌初筛方法为：将活化好的乳酸菌菌株按照1％比例分别接种于10mL MRS液体培养基中，在37℃条件下静置培养24h后，4℃下8000r/min离心20min获得上清液，发酵上清液采用牛津杯琼脂扩散法测试抑菌活性。

17.根据权利要求12所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法，其中产细菌素乳酸菌复筛方法为：排除有机酸的干扰，首先测定ZFM54发酵上清液的pH，然后用1M氢氧化钠溶液将发酵上清液调至pH5.0，以用乳酸和醋酸调至相同pH的无菌MRS培养基为对照，对藤黄微球菌10209进行牛津杯琼脂扩散法抑菌试验，测量抑菌圈直径大小，比较抑菌活性区别。

18.根据权利要求17所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法，其中产细菌素乳酸菌复筛方法为：排除过氧化氢的干扰，将发酵上清液浓缩两倍后调节pH值到原来的发酵上清pH值，配制浓度为5mg/mL的过氧化氢酶工作液，按发酵上清浓缩液与过氧化氢酶工作液体积比为1:1进行混合，在37℃水浴处理2h后采用牛津杯法测试其抑菌活性；同时用以1:1混合的发酵上清浓缩液和pH7.0的PBS缓冲液作为空白对照，分别测量抑菌圈直径大小并比较区别。

19.根据权利要求17所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法，其中包括步骤菌种鉴定：细菌素类物质的确定，配制胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K的酶溶液5mg/mL，将发酵上清液分别调到各蛋白酶的最适pH值，然后加入对应酶溶液使其终浓度为1mg/mL，在37℃水浴锅中处理2h，再调回发酵上清液初始pH值，以未经蛋白酶处理的发酵上清液为空白对照，采用牛津杯法进行抑菌试验，测量抑菌圈直径大小并比较区别。

20.根据权利要求19所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法，其中菌种鉴定包括：形态学鉴定，在MRS固体平板上划线分离乳酸菌，根据平板上长出的单菌落的菌落形状、颜色、透明度、边缘是否整齐、表面是否光滑等特征来初步判断该菌株类型，然后挑取符合乳酸菌菌落形态且有抑菌活性的菌落进行革兰氏染色，再用显微镜观察菌体的形态特征，并从颜色判断属于革兰氏阳性菌还是阴性菌。

21.根据权利要求19所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法，其中菌种鉴定包括：生理生化鉴定，分别进行七叶苷水解实验，淀粉分解实验，糖醇发酵实验，过氧化氢酶实验，硫化氢实验，明胶水解实验，细菌V-P实验。

22.根据权利要求19所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法，其中菌种鉴定包括：基于16S rDNA的分子生物学鉴定。

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