CN110923149B - 一种层出镰刀菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种层出镰刀菌及其应用，所述层出镰刀菌为层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)EF003，保藏编号为CCTCC NO:M2018776，保藏时间为2018年11月12日。本发明提供的技术方案中，通过培养、筛选以及纯化等步骤，从新鲜湖北麦冬植物块根中分离筛选出产生湖北麦冬多糖的菌株层出镰刀菌EF003，将该层出镰刀菌发酵可以制备湖北麦冬多糖，能够有效解决现有湖北麦冬多糖生产受湖北麦冬生长影响的问题，可以根据湖北麦冬多糖的具体需求量，改变相应参数，制备湖北麦冬多糖，条件可控、稳定性强。

Description

一种层出镰刀菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种层出镰刀菌及其应用。
背景技术
湖北麦冬多糖，是国家地理标志产品、湖北道地中药材植物——湖北麦冬Liriopespicata var.prolifera Y.T.Ma块根的主要活性成分之一，研究表明：湖北麦冬多糖具有抗心肌缺血、抗血栓、耐缺氧、抗衰老、降血糖等多方面的药理作用，此外，它对改善机体免疫系统、增进胃肠运动机能等方面都有着积极的影响，最新的研究表明它还具有抗肿瘤作用。
现有的湖北麦冬多糖生产，主要是通过直接分离块根提取物获得。但是，在湖北麦冬多糖实际生产中，存在着诸如受连作障碍导致种植面积相对较小、受气候条件影响较大、块根生产周期长、麦冬多糖提取成本高等问题，导致湖北麦冬多糖的市场受到限制。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种层出镰刀菌及其应用，旨在提供一种层出镰刀菌，解决现有湖北麦冬多糖生产受湖北麦冬生长影响的技术问题。
为实现上述目的，本发明提出一种层出镰刀菌，所述层出镰刀菌已被送至中国典型培养物保藏中心保藏，地址：中国.武汉.武汉大学，分类名为Fusarium proliferatumstrain EF003，其保藏编号为CCTCC NO:M2018776，保藏时间为2018年11月12日。
上述的层出镰刀菌通过以下步骤筛选得到：
将新鲜湖北麦冬植物块根清洗干净，依次分别用体积分数为75％乙醇、有效氯含量为4％～6％次氯酸钠溶液浸泡后，除去表面水分得干净湖北麦冬块根，所述浸泡时间为1～3min；
将所述干净湖北麦冬块根除去褐变部分后切成薄片，将所述薄片置于PDA培养基上，于25～30℃下密封培养5～7天，所述PDA培养基还包含终浓度为50ug/mL的氨苄青霉素；
挑取所述PDA培养基上的块根薄片周边长出的白色圆形的菌落顶端菌丝，转移到新的PDA培养基上进行多次纯化培养直至仅长出单一纯菌落，即得所述层出镰刀菌。
可选地，所述层出镰刀菌的18S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提出一种利用如上所述的层出镰刀菌在的制备湖北麦冬多糖中的应用，采用所述层出镰刀菌通过发酵制备得到湖北麦冬多糖。
上述发酵制备湖北麦冬多糖具体包括以下步骤：
在无菌条件下将上述层出镰刀菌EF003接种至PDA培养基，在28℃下活化培养72h，得活化菌种；
将所述活化菌种接种至液体马铃薯种子培养基，在28℃、180rpm下震荡培养72h，得种子；
按照10％的接种量，将种子接入事先配制的液体发酵培养基中，在28℃、180rpm下震荡培养7天，得发酵固液混合物；
将所述发酵固液混合物冷冻干燥，之后研成粉末，用95％的乙醇洗涤、烘干，得烘干物；
向所述烘干物中加水，80℃下水浴加热2h后过滤，得滤液；
将所述滤液离心，取上清液透析48h，取截留液浓缩，得浓缩液；
将所述浓缩液进行醇沉处理，将醇沉产物依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，最后干燥，得到湖北麦冬多糖。
本发明提供的层出镰刀菌，通过培养、筛选以及纯化等步骤，从新鲜湖北麦冬植物块根中分离筛选出层出镰刀菌，层出镰刀菌EF003，用分离筛选出层出镰刀菌发酵制备湖北麦冬多糖，能够有效解决现有湖北麦冬多糖生产受湖北麦冬生长影响的问题，可以根据湖北麦冬多糖的具体需求量，改变相应参数，制备湖北麦冬多糖，条件可控、稳定性强。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1中层出镰刀菌EF003在PDA培养基上的形态图；
图2湖北麦冬多糖的酸解单糖的HPLC检测图；
图3为本发明实施例2中菌产多糖的酸解单糖的HPLC检测图；
图4为本发明实施例2中菌产多糖对OH、O2 -、DPPH、ABTS自由基的清除活性图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
湖北麦冬多糖生产，主要是通过直接分离块根提取物获得。但是，在湖北麦冬多糖实际生产中，存在着诸如受连作障碍导致种植面积相对较小、受气候条件影响较大、块根生产周期长、麦冬多糖提取成本高等问题，导致湖北麦冬多糖的市场受到限制。
鉴于此，本发明提出一种层出镰刀菌，所述层出镰刀菌已被送至中国典型培养物保藏中心保藏，地址：中国.武汉.武汉大学，分类名为Fusarium proliferatum strainEF003，其保藏编号为CCTCC NO:M2018776，保藏时间为2018年11月12日。
如图1所示，由本发明实施例中层出镰刀菌EF003在PDA培养基上的形态图可看出，所述层出镰刀菌EF003为白色圆形菌落。
所述层出镰刀菌EF003的18S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示，将所述层出镰刀菌EF003的18S rRNA基因序列在NCBI网站进行序列比对，可得出，所述层出镰刀菌EF003同Fusarium proliferatum partial，LT841264.1，同源性99％。
本发明提供的层出镰刀菌，通过培养、筛选以及纯化等步骤，从新鲜湖北麦冬植物块根中分离筛选出层出镰刀菌，层出镰刀菌EF003，用分离筛选出层出镰刀菌发酵制备湖北麦冬多糖，能够有效解决现有湖北麦冬多糖生产受湖北麦冬生长影响的问题，可以根据湖北麦冬多糖的具体需求量，改变相应参数，制备湖北麦冬多糖，条件可控、稳定性强。
在发明提供的层出镰刀菌的筛选方法中，所述层出镰刀菌的筛选方法包括如下步骤：
步骤S10、将新鲜湖北麦冬植物块根清洗干净，依次分别用体积分数为75％乙醇、有效氯含量为4％～6％次氯酸钠溶液浸泡后，除去表面水分得干净湖北麦冬块根，所述浸泡时间为1～3min。
以下给出步骤S10的一具体实施例：
使用大量自来水充分清洗新鲜湖北麦冬植物块根表面泥土，然后装入干净的烧杯中，加入去离子水，置于超声波清洗器中反复清洗，直至清洗后的水变得极为清澈；用无菌滤纸蘸干湖北麦冬块根表面的水分后，先用75％(V/V)乙醇浸泡块根2min，用无菌水漂洗3次；再用有效氯含量4％-6％的次氯酸钠溶液浸泡2min，后用大量无菌水连续漂洗4次，再用无菌滤纸蘸干水分，得到干净湖北麦冬块根。
步骤S20、将所述干净湖北麦冬块根除去褐变部分后切成薄片，将所述薄片置于PDA培养基上，于25～30℃下密封培养5～7天，所述PDA培养基还包含终浓度为50ug/mL的氨苄青霉素。
以下给出步骤S20的一具体实施例：
取上述干净湖北麦冬块根，无菌条件下剪去块根两头褐变部分，剩余部分用解剖刀片切割成0.5cm×0.5cm组织小片(横向切片或纵向切片)，尽可能切割薄一些以便其能与培养基表面充分接触，有利于真菌从培养基中吸收养分，置于PDA培养基(含氨卞青霉素，终浓度为50ug/mL)上，用镊子均匀的在组织小片上轻轻压一压，使其紧紧贴服于平板上，每皿植入2片，并设五个重复，最后用parafilm封口膜将培养皿密封后置于28℃恒温培养5～7天。
步骤S30、挑取所述PDA培养基上的块根薄片周边长出的白色圆形菌落顶端菌丝，转移到新的PDA培养基上进行多次纯化培养直至仅长出单一纯菌落，即得所述层出镰刀菌。
以下给出步骤S30的一具体实施例：
每天观察PDA培养基上块根薄片周边真菌生长的情况，5-7天后有菌丝长出，挑取菌丝尖端转移到新的PDA培养基上纯化培养，最终得到所述层出镰刀菌。
本发明进一步提出一种利用如上所述的层出镰刀菌在的制备湖北麦冬多糖中的应用，采用所述层出镰刀菌通过发酵制备得到湖北麦冬多糖。
上述发酵制备湖北麦冬多糖具体包括以下步骤：
在无菌条件下将上述层出镰刀菌EF003接种至PDA培养基，在28℃下活化培养72h，得活化菌种；
将所述活化菌种接种至液体马铃薯种子培养基，在28℃、180rpm下震荡培养72h，得种子；
按照10％的接种量，将种子接入事先配制的液体发酵培养基中，在28℃、180rpm下震荡培养7天，得发酵固液混合物；
将所述发酵固液混合物冷冻干燥，之后研成粉末，用95％的乙醇洗涤、烘干，得烘干物；
向所述烘干物中加水，80℃下水浴加热2h后过滤，得滤液；
将所述滤液离心，取上清液透析48h，取截留液浓缩，得浓缩液；
将所述浓缩液进行醇沉处理，将醇沉产物依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，最后干燥，得到湖北麦冬多糖。
以下给出发酵制备湖北麦冬多糖的一具体实施例：
取上述层出镰刀菌EF003菌种，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的PDA培养基试管，于28℃活化培养72小时；取活化培养后的菌种，在无菌条件下，转接入已灭菌的液体马铃薯种子培养基中，28℃下180rpm振荡培养72小时，得种子；将配制好的液体发酵培养基分别装入250mL的三角瓶中，每瓶约100mL，灭菌处理，冷却备用；之后在无菌条件下按照10％的接种量接入种子，28℃下180rpm振荡培养7天；发酵完毕，将发酵固液混合物置于超低温冰箱中快速冷冻成固态后，使用小型冷冻干燥机进行低温冷冻干燥处理，得到干燥的发酵产物；将低温冷冻干燥的菌株发酵产物研成粉末，分别重复三次加入100mL95％乙醇，对粉碎物进行洗涤，烘干；将烘干样品按1∶10(g/mL)加蒸馏水，80℃水浴2h后过滤，对滤渣再重复上述操1次；合并提取液，离心，取上清液透析48h；透析后将截留液减压浓缩得浸膏，再用100mL 95％乙醇对其进行醇沉；醇沉产物依次经无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，干燥，获得湖北麦冬多糖，4℃下保存。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1层出镰刀菌的筛选
(1)使用大量自来水充分清洗新鲜湖北麦冬植物块根表面泥土，然后装入干净的烧杯中，加入去离子水，置于超声波清洗器中反复清洗，直至清洗后的水变得极为清澈；用无菌滤纸蘸干湖北麦冬块根表面的水分后，先用75％(V/V)乙醇浸泡块根2min，用无菌水漂洗3次；再用有效氯含量4％-6％的次氯酸钠溶液浸泡2min，后用大量无菌水连续漂洗4次，再用无菌滤纸蘸干水分，得到干净湖北麦冬块根。
(2)取上述干净湖北麦冬块根，无菌条件下剪去块根两头褐变部分，剩余部分用解剖刀片切割成0.5cm×0.5cm组织小片(横向切片或纵向切片)，尽可能切割薄一些以便其能与培养基表面充分接触，有利于真菌从培养基中吸收养分，置于PDA培养基(含氨卞青霉素，终浓度为50ug/mL)上，用镊子均匀的在组织小片上轻轻压一压，使其紧紧贴服于平板上，每皿植入2片，并设五个重复，最后用parafilm封口膜将培养皿密封后置于28℃恒温培养5～7天。
(3)每天观察PDA培养基上块根薄片周边真菌生长的情况，5-7天后有菌丝长出，挑取菌丝尖端转移到新的PDA培养基上纯化培养，最终得到所述层出镰刀菌。
实施例2菌产多糖提取物的制备
取上述层出镰刀菌EF003，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的PDA培养基试管，于28℃活化培养72小时；取活化培养后的菌种，在无菌条件下，转接入已灭菌的液体马铃薯种子培养基中，28℃下180rpm振荡培养72小时，得种子；将配制好的液体发酵培养基分别装入250mL的三角瓶中，每瓶约100mL，灭菌处理，冷却备用；之后在无菌条件下按照10％的接种量接入种子，28℃下180rpm振荡培养7天；发酵完毕，将发酵固液混合物置于超低温冰箱中快速冷冻成固态后，使用小型冷冻干燥机进行低温冷冻干燥处理，得到干燥的发酵产物；将低温冷冻干燥的菌株发酵产物研成粉末，分别重复三次加入100mL95％乙醇，对粉碎物进行洗涤，烘干；将烘干样品按1∶10(g/mL)加蒸馏水，80℃水浴2h后过滤，对滤渣再重复上述操1次；合并提取液，离心，取上清液透析48h；透析后将截留液减压浓缩得浸膏，再用100mL 95％乙醇对其进行醇沉；醇沉产物依次经无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，干燥，获得菌产多糖提取物，4℃下保存。
实施例3菌株鉴定
(1)菌种培养基形态特征鉴定
将实施例1获得的层出镰刀菌EF003划线于PDA培养基平板，于28℃培养24h，观察菌落形状、大小、颜色等特征。其中，PDA培养基还包含终浓度为50ug/mL的氨苄青霉素。
观察结果如图1所示，层出镰刀菌EF003的菌落呈杆状较湿润、较光滑、较粘稠、易挑起、质地均匀、菌落正反面及中央部位的颜色一致，菌落呈白色，形状为圆形。
(2)层出镰刀菌EF003的18S rRNA基因测序
如SEQ ID NO.1所示为层出镰刀菌EF003的18S rRNA基因序列，将测序结果于NCBI网站进行序列比对(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)得出，层出镰刀菌EF003同Fusarium proliferatum partial，LT841264.1，同源性99％。
(3)菌产多糖提取物的颜色反应
采用以下两种颜色反应方法进行检测：
(a)萘酚-浓硫酸反应方法：200uL发酵产物溶液样品溶于400uL 15％的1-萘酚中，加浓硫酸100uL，呈蓝紫色为阳性。
(b)蒽酮-浓硫酸反应方法：400uL发酵产物溶液样品，加入300uL蒽酮硫酸溶液，呈蓝绿色为阳性。
层出镰刀菌EF003菌产多糖提取物的两种反应结果，均呈阳性。即表明层出镰刀菌EF003发酵能够产生多糖。
(4)薄层色谱检测(TLC)
取20mg上述制备的层出镰刀菌EF003菌产多糖提取物，加入5mL纯水进行溶解，再加入0.25mL的12mol/L的HCl，将其置于120-126℃环境中反应4h。中和、透析后稀释至10mL，得酸解产物。
以湖北麦冬块根提取的多糖的酸解产物为阳性对照，对层出镰刀菌EF003发酵产物的酸解液进行薄层层析。展开剂为正丁醇：无水乙醇：冰醋酸：纯水＝2:3:1:1(V/V/V/V)；显色剂为称取4g二苯胺、量取4mL苯胺及20mL 85％磷酸溶于200mL丙酮。显色条件：将薄层板置于105℃烘箱中加热3min，直至显出清晰红色斑点为止。
层出镰刀菌EF003菌产多糖提取物的酸解单糖与阳性对照酸解单糖有相似的Rf值。即表明层出镰刀菌EF003发酵能够产生湖北麦冬多糖。
(5)高效液相色谱检测(HPLC)
取20mg上述制备的层出镰刀菌EF003菌产多糖提取物，加入5mL纯水进行溶解，再加入0.25mL的12mol/L的HCl，将其置于120-126℃环境中反应4h。中和、透析后稀释至10mL，得酸解产物。
取上述制备的层出镰刀菌EF003菌产多糖提取物的酸解产物1mL置于离心管中，加1mL0.5mol/mL PMP-甲醇溶液及0.3mol/L NaOH溶液，涡旋1min，70℃水浴60min冷却至室温，取1mL 0.3mol/L HCl溶液中和，氯仿2mL萃取3次，合并水层，水系滤膜过滤，使用前超声0.5h。同时，取湖北麦冬块根提取的多糖的酸解产物，重复上述操作步骤，制备阳性对照样品。
HPLC色谱条件：色谱仪岛津LC-20高效液相色谱仪(检测器：SPD-M20A，柱温箱：CTO-20A并配真空脱气机DGU-20A3，色谱柱Inert Sustain C18)；利用乙腈：磷酸盐缓冲溶液(pH＝5.0)＝20:80进行等度洗脱，流速1mL/min；光谱数据采集通道：ch1(250nm)；进样量10μL；记录30min数据；信号强度单位为mAU。
图2湖北麦冬多糖的酸解单糖的HPLC检测图；图3为本发明实施例2中菌产多糖的酸解单糖的HPLC检测图，由图2和图3对比表明层出镰刀菌EF003发酵能够产生湖北麦冬多糖。
(6)菌产多糖提取物的抗氧化性测定
采用α-脱氧核糖法、邻苯三酚自氧化法、DPPH法和ABTS法，分别测试层出镰刀菌EF003菌产多糖提取物对OH、O2 -、DPPH、ABTS自由基的清除活性。
图4是层出镰刀菌EF003菌产多糖提取物对OH、O2 -、DPPH、ABTS自由基的清除活性图。由图4可知，层出镰刀菌EF003菌产多糖提取物对四种自由基(DPPH、O- 2、OH、ABTS)均具有一定的体外清除活性，抗氧化能力与浓度呈正相关。
综上所述，本发明提出的层出镰刀菌EF003菌落呈白色圆形，同Fusariumproliferatum partial，LT841264.1，同源性99％；两种颜色反应结果，均呈阳性，菌产多糖提取物酸解单糖与阳性对照酸解单糖有相似的Rf值，HPLC比对图谱均表明层出镰刀菌EF003发酵能够产生湖北麦冬多糖；其菌产多糖提取物具有一定的体外清除活性，表明层出镰刀菌EF003性能良好，能够广泛应用于生产中。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之类，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 湖北文理学院
<120> 一种层出镰刀菌及其应用
<130> 2019.12.13
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1556
<212> DNA
<213> Fusarium proliferatum
<400> 1
tgtctagtat aagcattata cagcgaaact gcgaatggct cattatataa gttatcgttt 60
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tagagggact atcggctcaa gccgatggaa gtttgaggca ataacaggtc tgtgatgccc 1380
ttagatgttc tgggccgcac gcgcgctaca ctgacggagc cagcgagtac ttccttgtcc 1440
gaaaggtccg ggtaatcttg ttaaactccg tcgtgctggg gatagagcat tgcaattatt 1500
gctcttcaac gaggaatccc tagtaagcgc aagtcatcag cttgcgttga ttacgt 1556

Claims (2)

1.一种层出镰刀菌，其特征在于，所述层出镰刀菌为层出镰刀菌(Fusariumproliferatum)EF003，保藏编号为CCTCC NO:M2018776，保藏时间为2018年11月12日。
2.一种如权利要求1所述的层出镰刀菌在制备湖北麦冬多糖中的应用，其特征在于，采用所述层出镰刀菌通过发酵制备得到湖北麦冬多糖。
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