CN104987370A - 一种细菌素及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种细菌素及其制备方法和应用。所述细菌素属于广谱性细菌素，抑菌谱包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，如恶臭假单胞菌、枯草芽孢杆菌、单增李斯特氏菌、福氏志贺氏菌、柠檬色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌等。

Description

一种细菌素及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一株清酒乳杆菌LZ217(Lactobacillus sakei LZ217)所产的细菌素，及利用该微生物生产细菌素的应用。

背景技术

细菌素是由乳杆菌产生的一种耐高温、耐酸、在人体中可降解、安全无毒，且具有较强抑菌活性的抗菌短肽。细菌素是由微生物通过核糖体合成机制产生的一类具有抗菌活性的蛋白质或低分子量多肽物质，抑菌范围不仅仅局限于同源的细菌，产生菌对其细菌素具有自身免疫性。

细菌素作为一种特殊的抗菌抑菌蛋白质，具有抑菌活性强、生物相容性好、性能稳定、可生物降解、可消化吸收、生物安全性高的特点，在预防及治疗畜禽疾病、生产绿色生物饲料添加剂和生物兽药领域具有广阔的开发应用前景。

目前已发现多株产细菌素的清酒乳杆菌，这些清酒乳杆菌素的分子量从几千到几万道尔顿不等，如lactocin 27分子量为12400Da，lactacin B分子量为6300Da，plantaricin AMA-K分子量为2900Da等，这些细菌素的共同点是，细菌素是一种小分子多肽，具有蛋白质的一些基本特性。所以蛋白质的分离纯化方法同样适用于乳酸菌细菌素的分离纯化，但是根据不同的细菌素的特点，细菌素的纯化方法也存在差异，且目前公开的纯化效果和收率不是很理想。

发明内容

本发明为了克服现有技术不足，提供清酒乳杆菌LZ217(Lactobacillus sakei LZ217)所产的细菌素，该菌株发酵生产的细菌素为广谱抗菌素，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有抑菌效果；并提供该细菌素的分离提纯方法，得到的细菌素纯度高，收率高。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种细菌素，其特征在于，所述细菌素由清酒乳杆菌LZ217(Lactobacillus sakei LZ217)产生，其中清酒乳杆菌LZ217(Lactobacillus sakei LZ217)保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO.10259，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间2014年12月29日。

前述细菌素的制备方法，清酒乳杆菌LZ217接种于MRS液体培养基中，37℃静置培养12h，制得种子液；按5％的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃静置培养24h，离心去除菌体，4℃保存备用。

优选的，离心条件为转速12000rpm，时间20min，温度4℃。

进一步，离心获得的发酵上清液，首先通过大孔树脂进行粗提，然后先后通过阳离子交换层析和凝胶过滤层析进行中度纯化；最后通过HPLC高效液相色谱层析进行精细纯化，得到纯化后的细菌素，冻干保存。

优选的，大孔树脂纯化的具体步骤如下：

称取30g大孔树脂XAD-1180，用无水乙醇浸泡24h使其充分溶胀激活，然后再用去离子水充分的漂洗，最后再用抽滤瓶抽滤干净备用；

将处理过的大孔树脂采用湿法装柱，装入2.5×30cm的玻璃层析柱中，尽量避免气泡进入；

将1L发酵上清过柱，流速控制在10mL/min。持续时间大概100min；

用500mL的去超纯水清洗层析柱，去除附着在树脂表面的残留培养液；

用200mL20％甲醇溶液洗脱层析柱，流速控制在10mL/min，再用200mL50％的甲醇溶液洗脱层析柱，流速控制在10mL/min，，最后再用200mL 70％的甲醇溶液洗脱层析柱，大部分有活性的细菌素在70％的甲醇洗脱液；

通过旋转蒸发去除甲醇，得到的浓缩液，-20℃保存备用。 

优选的，阳离子交换层析的具体步骤为：(1)用超纯水清洗AKTApurifier蛋白纯化系统和层析柱直至基线平衡；

(2)用10倍柱体积的50mmol/L醋酸缓冲液平衡阳离子交换层析柱；

(3)将经XAD-1180提取的粗提液细菌素样品通过系统泵进入阳离子交换柱；

(4)先用5倍柱体积50mmol/L醋酸缓冲液洗脱未结合杂蛋白，洗脱至基线水平；

(5)接着用含1mol/L NaCl的50mmol/L醋酸缓冲液梯度洗脱结合的目标蛋白，流速为l ml/min，每管3mL收集洗脱液，215nm紫外波长检测蛋白峰，分别检测蛋白质含量和抑菌活性；

(6)用10倍柱体积含1mol/L NaCl的50mmol/L醋酸缓冲液清洗层析柱，也可用2mol/L NaOH溶液对层析柱进行再生处理，直至基线平衡；

(7)再用超纯水清洗AKTA-purifier蛋白质纯化系统和层析柱直至基线平衡；

(8)将AKTA系统和离子柱保存在20％的乙醇溶液中；

(9)收集所需组分，真空浓缩保存，以便后续实验。

优选的，所述凝胶过滤层析包括以下步骤：

(1)将经阳离子交换层析后的细菌素样品通过系统泵进入凝胶柱中；

(2)用1倍柱体积50mmol/L醋酸缓冲液洗脱目标蛋白，洗脱至基线水平。速度为l ml/min，每管1mL收集洗脱液，215nm紫外检测收集蛋白峰，分别检测蛋白质含量和抗菌活性；

(3)将AKTA系统和离子柱保存在20％的乙醇溶液中；

(4)收集所需组分，真空浓缩保存。

优选的，所述高效液相色谱层析包括以下步骤：

(1)制样：取一定量的经凝胶层析后的细菌素溶解于溶解液中，用0.45um微孔滤膜过滤后，备用；

(2)上样：C18色谱柱用甲醇冲洗30min，65％乙腈+35％水溶液洗脱30min，流动相A洗脱平衡30min，微量进样针吸取20μl进样；

(3)梯度洗脱：洗脱时间为40min，洗脱梯度为0％B-100％B，流速为1ml/min，检测紫外波长为215nm,收集各个洗脱峰，分别测定蛋白质含量和抑菌活性；

(4)色谱柱再生：甲醇冲洗C18色谱柱30min，超纯水清洗30min，保存液清洗20min。

前述细菌素在制备食品和饲料防腐剂或绿色生物兽药的应用。

前述细菌素在制备细菌抑制剂中的应用，所述细菌为柠檬色葡萄球菌、单增李斯特氏，藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、恶臭假单胞菌。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供一种细菌素，所述细菌素由一株产细菌素清酒乳杆菌LZ217产生,命名为细菌素LZ217。

本发明的清酒乳杆菌LZ217菌株产生的细菌素能够有效抑制多种食品腐败和致病革兰氏阳性细菌。其抑菌谱很广，其中对柠檬色葡萄球菌、单增李斯特氏的抑制作用非常明显，对藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、恶臭假单胞菌等致病菌也有较强的抑制作用，抑菌谱包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，属于广谱性细菌素。

采用本发明提供的细菌素的分离提纯方法，步骤相对来说操作简单且快速，过程较短，可以很好的分离纯化本发明的细菌素LZ217，并可避免细菌素在长时间的处理下变性失活，收率高，纯度高。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

清酒乳杆菌LZ217的分离

取生鲜牛乳用0.9％的生理盐水以10倍梯度稀释，将每个稀释梯度分别吸取0.3ml涂布于含清酒乳杆菌LZ217筛选培养基的平板上，37℃倒置无氧培养36～48h。选择长势良好形态不同且钙溶圈大的菌落进行编号，并通过平板划线分离法反复分离纯化，挑取平板上的清酒乳杆菌LZ217单菌落，接种到MRS液体培养基中，37℃恒温培养24h，然后编号保种，－80℃保藏菌株。

产抑菌活性代谢产物的清酒乳杆菌LZ217筛选

分别挑取分离出来的产酸菌株各3环接种至MRS液体培养基中，37℃培养 24h。在4℃、10000rpm离心15min，用pH酸度计测量发酵上清液pH值，样品待用。

以柠檬色葡萄球菌为指示菌，将柠檬色葡萄球菌液体培养24h，稀释成108CFU/mL的菌液，取此菌液300μL与10mL融化后保持在45℃的LB上层半固体培养基混匀后立即倒入素琼脂平板上，待平板凝固后均匀地放上灭过菌的牛津杯，取发酵上清液200μL注入牛津杯，37℃培养16h后检测是否有抑菌圈。

将实验分离所得的清酒乳杆菌LZ217菌株接种到MRS液体培养基中，37℃恒温培养24h，然后编号保种，－80℃保藏菌株。 

(2)鉴定

菌落形态：37℃在MRS固体培养基平板培养24h，菌落呈圆形，直径1～3mm，隆起或微隆起，乳白色，边缘整齐，光滑有光泽，不透光，质地易挑起。

细胞形态：24h培养物的细胞呈短杆状。

生理特征： 

1)氧气利用试验 

清酒乳杆菌LZ217在好氧和厌氧条件下都能生长，在厌氧条件下菌体生长情况的更好些，属于兼性厌氧菌。

2)温度生长试验 

清酒乳杆菌LZ217经过24h的培养观察发现在4℃，15℃，30℃，37℃，45℃条件下都能生长，在60℃的条件下不能生长。最适生长温度为37℃。

3)pH耐受性试验 

清酒乳杆菌LZ217在pH值为4.0的MRS液体培养基中生长旺盛，而在pH值为10.0的MRS液体培养基中几乎不生长。

4)耐盐性试验 

清酒乳杆菌LZ217在含1％-10％NaCl梯度的MRS液体培养基中均能生长，最适NaCl浓度为2％。

生化特征： 

根据过氧化氢酶试验、精氨酸产氨试验、葡萄糖及葡萄糖酸盐产酸产气试验、七叶苷(灵)水解试验、乙酰甲基甲醇(V-P)试验、H2S产生试验、淀粉水解试验、精氨酸水解试验、葡聚糖产生试验等实验，对清酒乳杆菌LZ217进行了生化特性分析。

过氧化氢酶阴性，精氨酸产氨为阳性，葡萄糖产酸产气和葡萄糖酸钠产酸产气试验均为阳性，可水解七叶苷，不能水解淀粉乙酰甲基甲醇(V-P)试验，硫化氢产生试验，可水解精氨酸，可产生葡聚糖。

16S rDNA测序结果： 

本发明的清酒乳杆菌LZ217总DNA在0.7％琼脂糖凝胶下电泳结果,可见其总DNA条带的大小在20kb左右，符合清酒乳杆菌LZ217总DNA的大小。以清酒乳杆菌LZ217的总DNA为模板，用16S rDNA引物进行PCR扩增,得到的1481bp特异性扩增产物。

菌株LZ217的基因组DNA,以该基因为模板扩增出一条约为1500bp长的DNA条带，割胶纯化经上海生工生物工程有限公司测得有效序列为1468bp，基因序列(SEQ ID NO：1)如下所示：

TCCTTGCCGGCATGCTATACATGCAAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGTTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCT TCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAACCAGCCGCCTAATGTGACAT 

将此序列在NCBI进行BLAST比对，与之相似度达99％的菌株均为清酒杆菌；选取相似度达99％的部分序列和其它乳杆菌的16S rDNA序列，经多重序列比对，用软件MAGE 4.1按Neighbor-Joining法构建系统发育树。结果是该菌与清酒乳杆菌同源性最高。综合以上结果，认为LZ217为清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)。

实施例2：细菌素的制备

清酒乳杆菌LZ217接种于MRS液体培养基中，37℃静置培养12h，制得种子液；按5％的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃静置培养24h，离心去除菌体，4℃保存备用。离心条件为转速12000rpm，时间20min，温度4℃。

离心得到细菌素粗提液，将该细菌素命名为清酒乳杆菌素LZ217。

实施例3：

细菌素的分离纯化(一)

发酵上清液经过大孔树脂粗提，具体实验步骤如下

(1)称取30g大孔树脂XAD-1180，用无水乙醇浸泡24h使其充分溶胀激活，然后再用去离子水充分的漂洗，最后再用抽滤瓶抽滤干净备用。

(2)将处理过的大孔树脂采用湿法装柱，装入2.5×30cm的玻璃层析柱中，尽量避免气泡进入。

(3)将1L发酵上清过柱，流速控制在10mL/min。持续时间大概100min。

(4)用500mL的去超纯水清洗层析柱，去除附着在树脂表面的残留培养液。

(5)用200mL20％甲醇溶液洗脱层析柱，流速控制在10mL/min，再用200mL50％的甲醇溶液洗脱层析柱，流速控制在10mL/min，，最后再用200mL 70％的甲醇溶液(含0.1％三氟乙酸)洗脱层析柱，大部分有活性的细菌素在70％的甲醇洗脱液。

(6)通过旋转蒸发去除甲醇，得到的浓缩液，-20℃保存备用。同时测定细菌素溶液的抑菌活性和蛋白质含量。

实施例4：

细菌素的分离纯化(二)

通过大孔树脂粗提后的粗提液再次通过阳离子交换层析进一步纯化。

(1)用超纯水清洗AKTApurifier蛋白纯化系统和层析柱直至基线平衡；

(2)用10倍柱体积(10CV)的50mmol/L醋酸缓冲液(pH 4.5)平衡阳离子交换层析柱(SP-sepharose Fast Flow)；

(3)将经XAD-1180提取的粗提液细菌素样品通过系统泵进入阳离子交换柱；

(4)先用5倍柱体积(5CV)50mmol/L醋酸缓冲液洗脱未结合杂蛋白，洗脱至基线水平；

(5)接着用含1mol/L NaCl的50mmol/L醋酸缓冲液(pH4.5)梯度洗脱结合的目标蛋白，流速为l ml/min，每管3mL收集洗脱液，215nm紫外波长检测蛋白峰，分别检测蛋白质含量和抑菌活性；

(6)用10倍柱体积(10CV)含1mol/L NaCl的50mmol/L醋酸缓冲液(pH4.5)清洗层析柱，也可用2mol/L NaOH溶液对层析柱进行再生处理，直至基线平衡；

(7)再用超纯水清洗AKTA-purifier蛋白质纯化系统和层析柱直至基线平衡；

(8)将AKTA系统和离子柱保存在20％的乙醇溶液中；

(9)收集所需组分，真空浓缩保存，以便后续实验。

实施例5

细菌素的分离纯化(三)

通过阳离子交换层析后的细菌素再次通过凝胶层析。

采用AKTA-purifier蛋白纯化系统和Superdex Peptide 10/300GL预装柱进行分离。

具体步骤如下：

(1)用超纯水清洗AKTA-purifier蛋白质纯化系统和Superdex PP层析柱直至基线平衡；

(2)将经阳离子交换层析后的细菌素样品通过系统泵进入凝胶柱中；

(3)用1倍柱体积(1CV)50mmol/L醋酸缓冲液(pH4.5)洗脱目标蛋白，洗脱至基线水平。速度为l ml/min，每管1mL收集洗脱液，215nm紫外检测收集蛋白峰，分别检测蛋白质含量和抗菌活性；

(4)将AKTA系统和离子柱保存在20％的乙醇溶液中；

(5)收集所需组分，真空浓缩保存，以便后续实验。

实施例6

细菌素的分离纯化(四)

通过凝胶层析后的细菌素最后通过高效液相色谱层析。

选择C18柱进行细菌素LZ217分离。

具体操作步骤：

(1)制样：取一定量的经凝胶过来后的细菌素LZ217样品溶解于溶解液中，用0.45um微孔滤膜过滤后，备用；

(2)上样：C18色谱柱(waters,UK)用甲醇冲洗30min，65％乙腈+35％水溶液洗脱30min，流动相A洗脱平衡30min，微量进样针吸取20μl进样；

(3)梯度洗脱：洗脱时间为40min，洗脱梯度为0％B-100％B，流速为1ml/min，检测紫外波长为215nm,收集各个洗脱峰，分别测定蛋白质含量和抑菌活性；

(4)色谱柱再生：甲醇冲洗C18色谱柱30min，超纯水清洗30min，保存液清洗20min。

实施例6

本发明清酒乳杆菌细菌素LZ217的分离纯化分为5个步骤(如表1所示)：第一步收集发酵上清液，总效价为65988AU，比活力为4.23AU/mg；第二步进行XAD-1180大孔树脂处理，得到粗蛋白样品，得率为23.49％，比活力提高到30.05AU/mg；第三步进行阳离子交换层析，收集活性峰并浓缩，得率为16.18％，但比活提高到53.13AU/mg，第四步进行凝胶层析，收集活性峰并浓缩，得率为5.45％，但比活提高到386.77AU/mg，第五步进行HPLC层析，收集活性峰并浓缩，得率为1.76％，但比活提高到1274.735AU/mg，说明LZ217经过上述五步处理后，纯化倍数提高了301倍，达到了很好的纯化效果。

表1 清酒乳杆菌LZ217产细菌素的纯化结果

实施例7

细菌素的鉴定 

将实施例6得到的细菌素进行试验鉴定。

选择食品中9种常见的革兰氏阳性细菌、6种革兰氏阴性细菌和1种酵母菌作为指示菌，观察细菌素的抑菌情况，如表2所示。

表2 清酒乳杆菌素LZ217的抑菌谱

抑菌圈直径(mm)：+++，15-20；++，10-15；+，5-10；-，无抑菌效果

采用牛津杯双层平板法检测清酒乳杆菌LZ217菌株产生的抗菌物质对各种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的抑制活性。结果发现细菌素粗提液能够有效抑制多种食品腐败和致病革兰氏阳性细菌。其抑菌谱很广，其中对柠檬色葡萄球菌、单增李斯特氏的抑制作用非常明显，对藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、恶臭假单胞菌等致病菌也有较强的抑制作用，抑菌谱包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，属于广谱性细菌素。

虽然本发明已由较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟知此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，可作些许的更动与润饰，因此本发明的保护范围当视权利要求书所要求保护的范围为准。

Claims (10)

1.一种细菌素，其特征在于，所述细菌素由清酒乳杆菌LZ217（Lactobacillus sakeiLZ217）产生，其中清酒乳杆菌LZ217（Lactobacillus sakei LZ217）保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO.10259。

2.如权利要求1所述的细菌素的制备方法，其特征在于，清酒乳杆菌LZ217 接种于MRS 液体培养基中，37℃静置培养12 h，制得种子液；按5%的接种量接种于MRS 液体培养基中，37℃静置培养24 h，离心去除菌体，4℃保存备用。

3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，离心条件为转速12000 rpm，时间20 min，温度4℃。

4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，离心获得的发酵上清液，首先通过大孔树脂进行粗提，然后先后通过阳离子交换层析和凝胶过滤层析进行中度纯化；最后通过HPLC高效液相色谱层析进行精细纯化，得到纯化后的细菌素，冻干保存。

5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，大孔树脂纯化的具体步骤如下：

称取30 g大孔树脂XAD-1180，用无水乙醇浸泡24 h使其充分溶胀激活，然后再用去离子水充分的漂洗，最后再用抽滤瓶抽滤干净备用；

将处理过的大孔树脂采用湿法装柱，装入2.5×30 cm 的玻璃层析柱中，尽量避免气泡进入；

将1 L发酵上清过柱，流速控制在10 mL/min；

 持续时间大概100 min；

用500 mL的去超纯水清洗层析柱，去除附着在树脂表面的残留培养液；

用200 mL 20 %甲醇溶液洗脱层析柱，流速控制在10 mL/min，再用200 mL 50 %的甲醇溶液洗脱层析柱，流速控制在10 mL/min，，最后再用200 mL 70 %的甲醇溶液洗脱层析柱，大部分有活性的细菌素在70 %的甲醇洗脱液；

通过旋转蒸发去除甲醇，得到的浓缩液，-20 ℃保存备用。

6.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，阳离子交换层析的具体步骤为：（1）用超纯水清洗 AKTApurifier 蛋白纯化系统和层析柱直至基线平衡；

（2）用10倍柱体积的 50 mmol/L 醋酸缓冲液平衡阳离子交换层析柱；

（3）将经XAD-1180提取的粗提液细菌素样品通过系统泵进入阳离子交换柱；

（4）先用5倍柱体积50 mmol/L醋酸缓冲液洗脱未结合杂蛋白，洗脱至基线水平；

（5）接着用含1 mol/L NaCl的50 mmol/L 醋酸缓冲液梯度洗脱结合的目标蛋白，流速为 l ml/min，每管3 mL收集洗脱液，215 nm 紫外波长检测蛋白峰，分别检测蛋白质含量和抑菌活性；

（6）用10倍柱体积含1 mol/L NaCl的50 mmol/L 醋酸缓冲液清洗层析柱，也可用 2 mol/L NaOH 溶液对层析柱进行再生处理，直至基线平衡；

（7）再用超纯水清洗 AKTA- purifier 蛋白质纯化系统和层析柱直至基线平衡；

（8）将AKTA系统和离子柱保存在20%的乙醇溶液中；

（9）收集所需组分，真空浓缩保存，以便后续实验。

7.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述凝胶过滤层析包括以下步骤：

（1）将经阳离子交换层析后的细菌素样品通过系统泵进入凝胶柱中；

（2）用1倍柱体积50 mmol/L 醋酸缓冲液洗脱目标蛋白，洗脱至基线水平；

速度为 l ml/min，每管1 mL收集洗脱液，215 nm 紫外检测收集蛋白峰，分别检测蛋白质含量和抗菌活性；

（3）将AKTA系统和离子柱保存在20%的乙醇溶液中；

（4）收集所需组分，真空浓缩保存。

8.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述高效液相色谱层析包括以下步骤：

（1）制样：取一定量的经凝胶层析后的细菌素溶解于溶解液中，用0.45um 微孔滤膜过滤后，备用；

（2）上样：C18色谱柱用甲醇冲洗30 min，65%乙腈+35%水溶液洗脱 30 min，流动相A洗脱平衡30 min，微量进样针吸取20 μl进样；

（3）梯度洗脱：洗脱时间为40 min，洗脱梯度为0%B-100%B，流速为1 ml/min，检测紫外波长为215 nm,收集各个洗脱峰，分别测定蛋白质含量和抑菌活性；

（4）色谱柱再生：甲醇冲洗C18色谱柱30 min，超纯水清洗30 min，保存液清洗20 min。

9.如权利要求1所述的细菌素在制备食品和饲料防腐剂或绿色生物兽药的应用。

10.如权利要求1所述的细菌素在制备细菌抑制剂中的应用，所述细菌为柠檬色葡萄球菌、单增李斯特氏，藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、恶臭假单胞菌。