JPS6193128A - 遺伝子工学で処理した微生物から精製成長ホルモンを回収する方法 - Google Patents
遺伝子工学で処理した微生物から精製成長ホルモンを回収する方法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
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- Health & Medical Sciences (AREA)
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- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
遺伝子工学の研究の１つのゴールは天然には高等生物内
でしか産生されないタン／Ｑり質を微生物内で産生ずる
方法の開発であった。このゴールはいくつかの真核生物
の成長ホルモンまたはそれらのアナログ（類似体）につ
いては達成されている。
でしか産生されないタン／Ｑり質を微生物内で産生ずる
方法の開発であった。このゴールはいくつかの真核生物
の成長ホルモンまたはそれらのアナログ（類似体）につ
いては達成されている。
増殖および誘導（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）によって種々の
成長ホルモンまたはアナログを産生じ得る遺伝的に変容
した細菌、たとえば大腸菌（Ｅｓｃｈａｒｉｃｈｉａ
ｃａｌｌ）の菌株が、米国メリーランド州ロックビル（
Ｒｏｃｋ−ｖＬｌｌｅ）のアメリカンタイプカルチャー
コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔ
ｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔ１ｏｎ、 ＡＴＣＣ）に寄託さ
れている。これらのホルモンは、農業分野でたとえば畜
産におけるミルクや肉の生産量を増大するために、また
医療分野でたとえば小人症に罹患している人の治療に大
きな潜在的価値を有している。
成長ホルモンまたはアナログを産生じ得る遺伝的に変容
した細菌、たとえば大腸菌（Ｅｓｃｈａｒｉｃｈｉａ
ｃａｌｌ）の菌株が、米国メリーランド州ロックビル（
Ｒｏｃｋ−ｖＬｌｌｅ）のアメリカンタイプカルチャー
コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔ
ｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔ１ｏｎ、 ＡＴＣＣ）に寄託さ
れている。これらのホルモンは、農業分野でたとえば畜
産におけるミルクや肉の生産量を増大するために、また
医療分野でたとえば小人症に罹患している人の治療に大
きな潜在的価値を有している。
微生物による成長ホルモンの産生には次の一般的なステ
ップが含まれる。
ップが含まれる。
（１）所望のホルモンの産生に関する遺伝情報をコード
している外来ＤＮＡを大腸菌（Ｅａｃｈｅｒｉｃｈｌａ
ｃｏｌｔ）のような適当な微生物中に挿入する。
している外来ＤＮＡを大腸菌（Ｅａｃｈｅｒｉｃｈｌａ
ｃｏｌｔ）のような適当な微生物中に挿入する。
（２） この微生物を適切な条件で培養し、ホルモン
を多量に産生させ蓄積させる。
を多量に産生させ蓄積させる。
（３）ホルモンを微生物から回収し、ｎ製する。
このホルモンの回収精製には一般に、細胞を破砕し、成
長ホルモンを他の細胞成分から分離し、回収したホルモ
ンをさらに精製することが含まれる。所望でない細胞構
成成分は、酵素で消化し、界面活性剤で可溶化し、遠心
によってホルモンから分離し得る。最後に、一般的なタ
ンノｔり質の精製用に開発された各種の技術によって種
々の程度まで成長ホルモンを精製することができる。そ
のような技術には次のうちの１つ以上がある。すなわち
、透析、ゾーン遠心法（ｚｏｎａｌ ｃｅｎｔｒｉｆｇ
ａｔ４ｏｎ） 。
長ホルモンを他の細胞成分から分離し、回収したホルモ
ンをさらに精製することが含まれる。所望でない細胞構
成成分は、酵素で消化し、界面活性剤で可溶化し、遠心
によってホルモンから分離し得る。最後に、一般的なタ
ンノｔり質の精製用に開発された各種の技術によって種
々の程度まで成長ホルモンを精製することができる。そ
のような技術には次のうちの１つ以上がある。すなわち
、透析、ゾーン遠心法（ｚｏｎａｌ ｃｅｎｔｒｉｆｇ
ａｔ４ｏｎ） 。
分子排除りｏマドグラフィー（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅ
ｘｃｌｕｓｉｏｎｓａｌｔｌｎｇ−ｏｕｔ）、溶媒分別
法（ｓｏｌｖｅｎｔ ｆｒａｅｔｉｏｎａｔｉｏｎ）
。
ｘｃｌｕｓｉｏｎｓａｌｔｌｎｇ−ｏｕｔ）、溶媒分別
法（ｓｏｌｖｅｎｔ ｆｒａｅｔｉｏｎａｔｉｏｎ）
。
電気泳動法、イオン交換りｐマドグラフィーおよびアフ
イニテ六クロマトグラフィーである。これらの方法の間
では、経済性と達成可能な精製度との両者に関して変動
がある。
イニテ六クロマトグラフィーである。これらの方法の間
では、経済性と達成可能な精製度との両者に関して変動
がある。
ウシ成長ホルモンの回収精製法が本発明と同じく譲渡さ
れている係属中の米国特許出願第ｂ、４，１８８号（１
９８３年７月１５日出Ｍ）に記載されている。この方法
には、混合細胞懸濁液を機械的に破砕し、沈殿をリゾチ
ームと、次にデオキシリボヌクレアーゼとインキュベー
トすることによるホルモンの回収が含まれる。次に、可
溶化したホルモンを音波処理し、溶液を遠心によって清
溌にし、ホルモンを含有する溶液をゲルクロマトグラフ
ィー、イオン交換クロマトグラフィー、透析および凍結
乾燥Ｋかけることによってホルモンを８製する。
れている係属中の米国特許出願第ｂ、４，１８８号（１
９８３年７月１５日出Ｍ）に記載されている。この方法
には、混合細胞懸濁液を機械的に破砕し、沈殿をリゾチ
ームと、次にデオキシリボヌクレアーゼとインキュベー
トすることによるホルモンの回収が含まれる。次に、可
溶化したホルモンを音波処理し、溶液を遠心によって清
溌にし、ホルモンを含有する溶液をゲルクロマトグラフ
ィー、イオン交換クロマトグラフィー、透析および凍結
乾燥Ｋかけることによってホルモンを８製する。
上記の方法にはかなシ大量のリゾチームが必要であシ、
精製ホル毛ンを得るためには時間のかかる洗浄を繰り返
す必要がちシ、しかも収率はかなり低い（発酵終了時の
細胞内ホルモンの重量に対して約１０〜１５％）。また
、この方法にはデオキシリボヌクレアーゼ消化を必要と
することに基づく別の欠点がある。デオキシリボヌクレ
アーゼはホルモン回収プロセス中に細胞ＤＮＡを消化す
るのに使用されている高価な酵素である。デオキシリボ
ヌクレアーゼ製剤は、回収中に所望の生成物を分解する
プロテアーゼを夾雑物として含んでいることが判明して
いる。したがって、上記の方法のようにデオキシリボヌ
クレアーゼを使用すると、あらゆる存在するプロテアー
ゼを阻害するための予防ステップを別に設けない限〕ホ
ルモンの回収収率は減少するであろう、しかもプロテア
ーゼの完全な阻害は不可能かもしれない。デオキシリボ
ヌクレアーゼを使用すると、生成物収率が低下すること
に加えて、夾雑するプロテアーゼのために生成物の安定
性が望ましい程度にならないであろう。
精製ホル毛ンを得るためには時間のかかる洗浄を繰り返
す必要がちシ、しかも収率はかなり低い（発酵終了時の
細胞内ホルモンの重量に対して約１０〜１５％）。また
、この方法にはデオキシリボヌクレアーゼ消化を必要と
することに基づく別の欠点がある。デオキシリボヌクレ
アーゼはホルモン回収プロセス中に細胞ＤＮＡを消化す
るのに使用されている高価な酵素である。デオキシリボ
ヌクレアーゼ製剤は、回収中に所望の生成物を分解する
プロテアーゼを夾雑物として含んでいることが判明して
いる。したがって、上記の方法のようにデオキシリボヌ
クレアーゼを使用すると、あらゆる存在するプロテアー
ゼを阻害するための予防ステップを別に設けない限〕ホ
ルモンの回収収率は減少するであろう、しかもプロテア
ーゼの完全な阻害は不可能かもしれない。デオキシリボ
ヌクレアーゼを使用すると、生成物収率が低下すること
に加えて、夾雑するプロテアーゼのために生成物の安定
性が望ましい程度にならないであろう。
本発明者らは、従来の方法より実施が容易で、ｖ４贅し
やす＜、シかも安価である、ｆ′＃製された真核生物成
長ホルモンまたはそのアナログの回収方法を開発した。
やす＜、シかも安価である、ｆ′＃製された真核生物成
長ホルモンまたはそのアナログの回収方法を開発した。
本発明の方法によると、所望の生成物が従来得ることが
できたよりも高い収率でしかも安定な形態で得られる。
できたよりも高い収率でしかも安定な形態で得られる。
この方法には従来の方法で使用されたリゾチームの量の
２．５〜５チしか必要とせず、そのため精製が容易にな
ると共に回収コストが低下する。さらにこの方法ではデ
オキシリボヌクレアーゼを使用する必要が全くない。
２．５〜５チしか必要とせず、そのため精製が容易にな
ると共に回収コストが低下する。さらにこの方法ではデ
オキシリボヌクレアーゼを使用する必要が全くない。
さらく回収コストが低下することに加えて、デオキシリ
ボヌクレアーゼを必要としなくすることで生成物の収率
が２倍以上になり、しかもずつと安定な形態の生成物が
得られる。また、この方法では必要な洗浄回数が減少す
るために、精製された成長ホルモンまたはそのアナログ
のより便利で時間効率のよいプロセスが可能となる。た
とえば従来法の時間の１０〜２０％だけとなる。限外濾
過を用いることによってこの方法ではコストが大幅に低
減すると共に生成物の純度が改良される。
ボヌクレアーゼを必要としなくすることで生成物の収率
が２倍以上になり、しかもずつと安定な形態の生成物が
得られる。また、この方法では必要な洗浄回数が減少す
るために、精製された成長ホルモンまたはそのアナログ
のより便利で時間効率のよいプロセスが可能となる。た
とえば従来法の時間の１０〜２０％だけとなる。限外濾
過を用いることによってこの方法ではコストが大幅に低
減すると共に生成物の純度が改良される。
発明の概要
本発明は、動物の成長ホルモンまたはそのアナログをコ
ービしているＤＮＡ配列の発現によってこのホルモンま
たはアナログを産生している細菌細胞か気槽製された動
物成長ホルモンまたはアナログを回収する方法に係９、
この方法は次のステップを含んでいる。
ービしているＤＮＡ配列の発現によってこのホルモンま
たはアナログを産生している細菌細胞か気槽製された動
物成長ホルモンまたはアナログを回収する方法に係９、
この方法は次のステップを含んでいる。
（ａ） 細菌細胞またはその７ラグメントの細胞壁を
破砕して溶解物（１ｙｓｉｔｅ）を生成する。
破砕して溶解物（１ｙｓｉｔｅ）を生成する。
（ｂ） 粒子と不溶物を含有する沈殿を溶解物から分
離する。
離する。
（ｃ） 分離した沈殿物の適当な緩衝溶液中懸濁液を
調製する。
調製する。
（ｄ） この懸濁液を処理して液体と固体を接触させ
る。
る。
（ｅ） 固液接触した懸濁液から沈殿物を部分的また
は完全に分離する。
は完全に分離する。
（ｆ） 分離した沈殿を充分な址の水に可溶化し、ｐ
Ｈを適切なアルカリ性ｐＨに調整して溶液を形成する。
Ｈを適切なアルカリ性ｐＨに調整して溶液を形成する。
（ｇ） 可溶化したホルモンまたはアナログを適切な
条件での限外濾過によって他の細胞成分から分離してホ
ルモンまたはアナログを含有する限外濾過−外戸液、
ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｅ ）と保留物（ｒａｔｅｎ
ｔａｔａ）とを生成する。
条件での限外濾過によって他の細胞成分から分離してホ
ルモンまたはアナログを含有する限外濾過−外戸液、
ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｅ ）と保留物（ｒａｔｅｎ
ｔａｔａ）とを生成する。
伍）ホルモンまたはアナログがさらにｎＩ製濃縮される
ように可溶化し九ホルモンまたはアナログを処理し、こ
うして、精製されたホルモンまたはアナログを回収する
。
ように可溶化し九ホルモンまたはアナログを処理し、こ
うして、精製されたホルモンまたはアナログを回収する
。
ステップ（ｄ）で、固液接触とその後の沈殿分離の前に
、溶解物から分離した沈殿のＭＱ液を処理するためにリ
ゾチームを使用することができる。この固液接触とその
後の沈殿分離との２つのステップおよび限外濾過は繰シ
返し行なうことができる。
、溶解物から分離した沈殿のＭＱ液を処理するためにリ
ゾチームを使用することができる。この固液接触とその
後の沈殿分離との２つのステップおよび限外濾過は繰シ
返し行なうことができる。
ステップ（）１）で、ホルモンまたはアナログをさらに
精製および濃縮するためにイオン交換クロマトグラフィ
ーを用いることができる。また、本発明の方法のほとん
どのステップは連続流で実施してもよいし、自動化して
もよい。
精製および濃縮するためにイオン交換クロマトグラフィ
ーを用いることができる。また、本発明の方法のほとん
どのステップは連続流で実施してもよいし、自動化して
もよい。
本発明で使用するのに適したホルモン産生細菌細胞には
大腸菌（］Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｌａ ｃｏｌｔ ） １
１株 ＡＴＣＣＮｏ、３９８０６．３９７８５ 、 ・
３９３Ｂ６，３９３８４゜３９８０４ および３９７９
２が包含される。本発明によって回収精製することがで
きる成長ホルモンの中には、ウシ、ブタ、ニワトリおよ
びヒト成長ホルモンならびにこれらのアナログがある。
大腸菌（］Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｌａ ｃｏｌｔ ） １
１株 ＡＴＣＣＮｏ、３９８０６．３９７８５ 、 ・
３９３Ｂ６，３９３８４゜３９８０４ および３９７９
２が包含される。本発明によって回収精製することがで
きる成長ホルモンの中には、ウシ、ブタ、ニワトリおよ
びヒト成長ホルモンならびにこれらのアナログがある。
発明の詳細な説明
本発明者らは、真核生物たとえば動物もしくはヒトの成
長ホルモンまたはそのアナログをコードしているＤＮＡ
配列の発現によってこのホルモンまたはアナログを産生
している細菌細胞から、精製された成長ホルモンまたは
アナログを回収するための新規な方法を開発した。
長ホルモンまたはそのアナログをコードしているＤＮＡ
配列の発現によってこのホルモンまたはアナログを産生
している細菌細胞から、精製された成長ホルモンまたは
アナログを回収するための新規な方法を開発した。
本発明で使用する遺伝的に変容した細菌細胞は公知であ
る。たとえば、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）のアナログ
を産生するように遺伝的に変容した大腸菌（Ｅｓｃｂｎ
ｒｌｃｈｌａ ｃａｌｌ ）の１つの菌株がアメリカン
タイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔ
ｙｐｅＣｕｌｔｕｒ＠Ｃｏ１１＠ｃｔｌｏｎ （以下Ａ
ＴＣＣと略）、ロックビル（ＲｏｃＩＣｖｉｌｌｅ ）
、メリーランド州）Ｋ寄託されておシＡＴＣＣＡ ３９
８０６とされている。このｂＧＨアナログは天然ｂＧＨ
のフェニルアラニン形のＮ−末端に付加されたアミノ酸
配列Ｍｅｔ −Ａｓｐ −Ｇｌｎをもっている。ＡＴＣ
Ｃに寄託されている別の遺伝的に変容した大腸ｍＣ上６
皿■）細胞系（ｃｄｌ ｔｉｎ・）（ＡＴＣＣム３９７
８５ ）は、天然ｂＧＨのフェニルアラニン形のＮ−末
端に付加されたメチオニン残基を有するｂＧＨアナログ
を産生ずる。さらにＡＴＣＣに寄託されている大腸菌（
Ｅ、 ｅｏｌｉ ）の別の菌株（ＡＴＣＣム３９３８６
）は、７オノ酸１〜１３を欠きＭｅ−で始まる天然ｂ
ＧＨのアミノ酸配列を有するヒト成長ホルモン（ｈＧＨ
）アナログを産生ずる。
る。たとえば、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）のアナログ
を産生するように遺伝的に変容した大腸菌（Ｅｓｃｂｎ
ｒｌｃｈｌａ ｃａｌｌ ）の１つの菌株がアメリカン
タイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔ
ｙｐｅＣｕｌｔｕｒ＠Ｃｏ１１＠ｃｔｌｏｎ （以下Ａ
ＴＣＣと略）、ロックビル（ＲｏｃＩＣｖｉｌｌｅ ）
、メリーランド州）Ｋ寄託されておシＡＴＣＣＡ ３９
８０６とされている。このｂＧＨアナログは天然ｂＧＨ
のフェニルアラニン形のＮ−末端に付加されたアミノ酸
配列Ｍｅｔ −Ａｓｐ −Ｇｌｎをもっている。ＡＴＣ
Ｃに寄託されている別の遺伝的に変容した大腸ｍＣ上６
皿■）細胞系（ｃｄｌ ｔｉｎ・）（ＡＴＣＣム３９７
８５ ）は、天然ｂＧＨのフェニルアラニン形のＮ−末
端に付加されたメチオニン残基を有するｂＧＨアナログ
を産生ずる。さらにＡＴＣＣに寄託されている大腸菌（
Ｅ、 ｅｏｌｉ ）の別の菌株（ＡＴＣＣム３９３８６
）は、７オノ酸１〜１３を欠きＭｅ−で始まる天然ｂ
ＧＨのアミノ酸配列を有するヒト成長ホルモン（ｈＧＨ
）アナログを産生ずる。
大ｉ薗（−４皿）細胞系（ＡＴＣＣ’扁３９３８４ ）
はＮ−末端にメチオニンがついた天然ｈＧＨの配列を有
するｈＧＨアナログを産生ずる。同様に、大腸菌（Ｅ、
ｃａｌｌ ）細胞系（ＡＴＣＣＡ ３９８０４および
３９７９２ ）はそれぞれブタ成長ホルモン（ｐＧＨ）
アナログとニワトリ成長ホルモン（ｃＧＨ）アナログを
産生じ、各アナログはそれぞれ６天然ホルモンのフェニ
ルアラニン形のＮ−末端に付加されたメチオニン残基を
有してい石。上記の各ホルモンアナログは、適当な細胞
を適切な条件で増殖誘導させると産生され、本発明の方
法によって精製形態で回収することができる。
はＮ−末端にメチオニンがついた天然ｈＧＨの配列を有
するｈＧＨアナログを産生ずる。同様に、大腸菌（Ｅ、
ｃａｌｌ ）細胞系（ＡＴＣＣＡ ３９８０４および
３９７９２ ）はそれぞれブタ成長ホルモン（ｐＧＨ）
アナログとニワトリ成長ホルモン（ｃＧＨ）アナログを
産生じ、各アナログはそれぞれ６天然ホルモンのフェニ
ルアラニン形のＮ−末端に付加されたメチオニン残基を
有してい石。上記の各ホルモンアナログは、適当な細胞
を適切な条件で増殖誘導させると産生され、本発明の方
法によって精製形態で回収することができる。
この方法は従莱法に比べて、実施がよシ容易でよシ良好
に調節でき、よシ安価であシ、所望の生成物をよシ高い
収率で、し力Ｓもよシ安定な形態で回収できる。このよ
うな生成物は、本発明によると発酵終了時のＩＩａｌ菌
中に存在するホルモンまたはアナログの重量に基づいて
２５重ｆＩｋチ、さらには３０重量％創９え」ろ収率で
回収し得る。リゾチームは、従来法で必要とされたよシ
も少ない酵素量で使用される。また本発明方法では、デ
オキシリボヌクレアーゼは一切使用する必要がなく、連
続流方式で実施してもよく、また便利なように自動化し
てもよい。
に調節でき、よシ安価であシ、所望の生成物をよシ高い
収率で、し力Ｓもよシ安定な形態で回収できる。このよ
うな生成物は、本発明によると発酵終了時のＩＩａｌ菌
中に存在するホルモンまたはアナログの重量に基づいて
２５重ｆＩｋチ、さらには３０重量％創９え」ろ収率で
回収し得る。リゾチームは、従来法で必要とされたよシ
も少ない酵素量で使用される。また本発明方法では、デ
オキシリボヌクレアーゼは一切使用する必要がなく、連
続流方式で実施してもよく、また便利なように自動化し
てもよい。
本発明方法では、適当な細菌細胞の増殖、誘導および採
取（ｈａｒｖ・ａｔ）後、上澄みをデカントした細菌細
胞、これらのフラグメントまたはセルケー空 キを中性のｐＨ（たとえば約７．４）適切な緩衝溶液に
懸濁する。この目的に適した懸濁媒体は、５０ｍＭ
Ｔｒｉｍ （ｐＨ７，４） ： ５ ０ ｍＭ
ＮａＣｊ、 ５０ ｍＭＴｒｉｍ（ｐＨ７，４）
： ５０ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝
ｔＬ（ｐＨ７，４）： ５０ｍＭＮａＣノまたは５０
ｍＭリン酸ナナトリウム緩衝液 ｐＨ７，４）： ５０
ｍＭＥＤＴＡの水溶液である。あるいは、発酵マツシュ
細胞懸濁液を中性ｐＨに調節した後直接使用してもよい
。
取（ｈａｒｖ・ａｔ）後、上澄みをデカントした細菌細
胞、これらのフラグメントまたはセルケー空 キを中性のｐＨ（たとえば約７．４）適切な緩衝溶液に
懸濁する。この目的に適した懸濁媒体は、５０ｍＭ
Ｔｒｉｍ （ｐＨ７，４） ： ５ ０ ｍＭ
ＮａＣｊ、 ５０ ｍＭＴｒｉｍ（ｐＨ７，４）
： ５０ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝
ｔＬ（ｐＨ７，４）： ５０ｍＭＮａＣノまたは５０
ｍＭリン酸ナナトリウム緩衝液 ｐＨ７，４）： ５０
ｍＭＥＤＴＡの水溶液である。あるいは、発酵マツシュ
細胞懸濁液を中性ｐＨに調節した後直接使用してもよい
。
次に、懸濁した細菌細胞またはそのフラグメントの細胞
壁を破砕して溶解物を生底する。好ましい態様では、は
ぼ３５Ｃ未満（たとえばほぼ−ｌＯＣ〜はぼ＋８Ｃ）の
温度で細胞を機械的に破砕する。ビーズミルすなわちホ
モジナイザー、たとえはダイノミル（Ｄｙｎｏｍｌｌｌ
） ＫＤ −５装ｆ（ウイリーアー、パフ ハオ７
ｘ ｙ （ＷＩ １１ｙ Ａ、 Ｂａｃｈｏｆ＠ｎ ）
＊バーゼル）がこの目的に適した市販の破砕機である
。破砕は、懸濁液をこの破砕機に適当な流速（たとえば
約８０Ｌ／時）で連続的に通すことによって実施すると
好ましい。
壁を破砕して溶解物を生底する。好ましい態様では、は
ぼ３５Ｃ未満（たとえばほぼ−ｌＯＣ〜はぼ＋８Ｃ）の
温度で細胞を機械的に破砕する。ビーズミルすなわちホ
モジナイザー、たとえはダイノミル（Ｄｙｎｏｍｌｌｌ
） ＫＤ −５装ｆ（ウイリーアー、パフ ハオ７
ｘ ｙ （ＷＩ １１ｙ Ａ、 Ｂａｃｈｏｆ＠ｎ ）
＊バーゼル）がこの目的に適した市販の破砕機である
。破砕は、懸濁液をこの破砕機に適当な流速（たとえば
約８０Ｌ／時）で連続的に通すことによって実施すると
好ましい。
次に、ホルモンやアナログとその他の水不溶性タン／ｅ
り質を含む粒子および不溶物の他に細胞膜と細胞壁断片
および凝集体（ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ ）を含有する沈
殿を、水溶性タンノｑり質、ＤＮＡおよびＲＮＡまたは
これらの断片も含有する溶解物から分離する。この分離
を実施するには、溶解物を適切な量（たとえばはぼ等容
量）の脱イオン水で希釈し、次いで所望の分離を実施す
るのに充分な流速（たとえば約６０〜８０Ｌ／時）で固
形ボール型（５ｏｌｌｄ ｂｏｗｌ ）連続流式遠心分
離機（たとえばセノ”（Ｃ＠ｐａ） １０１ ）中で遠
心すると好ましい。
り質を含む粒子および不溶物の他に細胞膜と細胞壁断片
および凝集体（ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ ）を含有する沈
殿を、水溶性タンノｑり質、ＤＮＡおよびＲＮＡまたは
これらの断片も含有する溶解物から分離する。この分離
を実施するには、溶解物を適切な量（たとえばはぼ等容
量）の脱イオン水で希釈し、次いで所望の分離を実施す
るのに充分な流速（たとえば約６０〜８０Ｌ／時）で固
形ボール型（５ｏｌｌｄ ｂｏｗｌ ）連続流式遠心分
離機（たとえばセノ”（Ｃ＠ｐａ） １０１ ）中で遠
心すると好ましい。
次に、適切な量の中性ｐＨ（たとえば約７．４）を有す
る適当な緩衝溶液に分離した沈殿を懸濁させて懸濁液を
調製する。この溶液は５０ ｍＭ Ｔｒｌｍまたはリン
酸ナトリウム（ｐＨ７，４）： ５０ｍＭＥＤＴ人を含
有するものが好ましい。懸濁用の緩衝溶液の適切な量は
最初の細菌細胞１時につき約０．５〜２．５！であり、
細胞１ｋｇ当シ約１．２４が好ましい。
る適当な緩衝溶液に分離した沈殿を懸濁させて懸濁液を
調製する。この溶液は５０ ｍＭ Ｔｒｌｍまたはリン
酸ナトリウム（ｐＨ７，４）： ５０ｍＭＥＤＴ人を含
有するものが好ましい。懸濁用の緩衝溶液の適切な量は
最初の細菌細胞１時につき約０．５〜２．５！であり、
細胞１ｋｇ当シ約１．２４が好ましい。
次に、懸濁液を、この中に存在する一すサツカライドを
消化することができる適当な酵素、たとえばリゾチーム
（シグマ（Ｓｉｇｍａ ） Ｌ −６８７６。
消化することができる適当な酵素、たとえばリゾチーム
（シグマ（Ｓｉｇｍａ ） Ｌ −６８７６。
セントルイス、ミズーリ州）と共に適切な条件下で適切
な時間インキュベートすることによって、細胞壁断片の
ような望ましくない細胞物質を消化してもよい。現在の
ところリゾチームの好ましい濃度は溶液１ｄ当た）約５
０〜１００ｈであ〕、従来法で用いていた２Ｗ／ｍよ〕
大幅に減少している。リゾチームインキュベーションの
適当な時間は約１〜２０時間である。このインキュベー
ション期間中の１ｌｉｌｌＪｆはほぼ３７Ｃに維持する
と好ましい。次に、細胞脂質のような物質を可溶化する
ために適切な量の適当な界面活性剤、たとえばトｊｌ
） ７ （Ｔｒｉｔｏｎ■）Ｘ−１００（ｏ ＋Ａア、
ドア、−ス社（Ｒｏｈｍ ＆ Ｉ（ｇａｓ Ｃｏ、 ）
ｚフィラデルフィアペンシルパニア州）を最終濃度的１
％（ｖ／マ）で懸濁液に加えてもよいつ次いで懸濁液を
適切な時間（たとえば約３０分）インキュベートする。
な時間インキュベートすることによって、細胞壁断片の
ような望ましくない細胞物質を消化してもよい。現在の
ところリゾチームの好ましい濃度は溶液１ｄ当た）約５
０〜１００ｈであ〕、従来法で用いていた２Ｗ／ｍよ〕
大幅に減少している。リゾチームインキュベーションの
適当な時間は約１〜２０時間である。このインキュベー
ション期間中の１ｌｉｌｌＪｆはほぼ３７Ｃに維持する
と好ましい。次に、細胞脂質のような物質を可溶化する
ために適切な量の適当な界面活性剤、たとえばトｊｌ
） ７ （Ｔｒｉｔｏｎ■）Ｘ−１００（ｏ ＋Ａア、
ドア、−ス社（Ｒｏｈｍ ＆ Ｉ（ｇａｓ Ｃｏ、 ）
ｚフィラデルフィアペンシルパニア州）を最終濃度的１
％（ｖ／マ）で懸濁液に加えてもよいつ次いで懸濁液を
適切な時間（たとえば約３０分）インキュベートする。
次に、Ｍ濁液に含まれている液体と固体を、たとえば、
最大動力の６５％に設定した流速が約１８Ｌ／時〜２５
Ｌ／時の３７０Ｗ連続流式音波処理装置（ヒートシステ
ムズウルトラソニック（）（ｅａｔＳｙｓｔｅｍｓ Ｕ
ｌｔｒａｓｏｎｌｅｇ ） 、プレインビューＣＰｌａ
ｉｎ−ｖｉ＊ｗ）、ニューヨーク州）のような適切な条
件での音波処理によって、固液が緊密に接触するように
処理する。次いで、固液接触した懸濁液から沈殿物を分
離する。これは固液接触した懸濁液を適西な流速（たと
えば約３０Ｌ／時）の固形ボール型連続流式遠心機（た
とえばセ’ＣＣｅｐａ）１０１ ）で遠心分離すること
によって好ま′シク行なわれる。
最大動力の６５％に設定した流速が約１８Ｌ／時〜２５
Ｌ／時の３７０Ｗ連続流式音波処理装置（ヒートシステ
ムズウルトラソニック（）（ｅａｔＳｙｓｔｅｍｓ Ｕ
ｌｔｒａｓｏｎｌｅｇ ） 、プレインビューＣＰｌａ
ｉｎ−ｖｉ＊ｗ）、ニューヨーク州）のような適切な条
件での音波処理によって、固液が緊密に接触するように
処理する。次いで、固液接触した懸濁液から沈殿物を分
離する。これは固液接触した懸濁液を適西な流速（たと
えば約３０Ｌ／時）の固形ボール型連続流式遠心機（た
とえばセ’ＣＣｅｐａ）１０１ ）で遠心分離すること
によって好ま′シク行なわれる。
別の態祥テは、このステップとその後のステップにおけ
る分離は、遠心分離の代わりに適当な膜、たとえばミリ
ポアデュラポア（ＭＨｌｉｐｏｒｅ Ｄｕｒａｐｏｒｅ
）０．４５μメンプランを用いるミクロ濾過（ｍｉｃ
ｒｏｆｌロ−ｒａｔｉｏｎ ）によって行なってもよい
。分離後、固液接触たとえば音波処理した懸濁液から分
離した沈殿物を、洗浄（５０ｍＭ Ｔｒｉｍまたはリン
酸塩（ｐＨ７、４） ： １００ ｍＭ ＮａＣｌが適
切である）し、適切な量の適当な媒体（たとえば緩衝し
たかまたはしていない水溶液）に再懸濁してもよい。こ
うして調製した懸濁液を次に１適切な条件下で音波処理
等によって固液接触せしめ、得られた沈殿物をたとえば
上述のような遠心分離または限外濾過によって固液接触
（たとえは音波処理）した懸濁液から部分的にまたは完
全に分離する。これらの再懸燭、固液接触（たとえば音
波処理）および分離は少なくとも１回線シ返して行なう
のが好ましい。
る分離は、遠心分離の代わりに適当な膜、たとえばミリ
ポアデュラポア（ＭＨｌｉｐｏｒｅ Ｄｕｒａｐｏｒｅ
）０．４５μメンプランを用いるミクロ濾過（ｍｉｃ
ｒｏｆｌロ−ｒａｔｉｏｎ ）によって行なってもよい
。分離後、固液接触たとえば音波処理した懸濁液から分
離した沈殿物を、洗浄（５０ｍＭ Ｔｒｉｍまたはリン
酸塩（ｐＨ７、４） ： １００ ｍＭ ＮａＣｌが適
切である）し、適切な量の適当な媒体（たとえば緩衝し
たかまたはしていない水溶液）に再懸濁してもよい。こ
うして調製した懸濁液を次に１適切な条件下で音波処理
等によって固液接触せしめ、得られた沈殿物をたとえば
上述のような遠心分離または限外濾過によって固液接触
（たとえは音波処理）した懸濁液から部分的にまたは完
全に分離する。これらの再懸燭、固液接触（たとえば音
波処理）および分離は少なくとも１回線シ返して行なう
のが好ましい。
特に好ましい態様ではこれらのステップを次のように４
回実施する。すなわち、まず得られた沈殿を２０ ｍＭ
Ｔｒｉｓ （ｐＨ７，４）または５０ ｍＭリン酸ナ
ナトリウム緩衝ｆｆｌ（ｐＨ７，４）に再懸濁し、この
懸濁液を上記のように固液接触させる（たとえば音波処
理する）。次に％懸濁液を上記のように遠心分離し、回
収した沈殿を５０ ｒｎＭ Ｔｒｌｍ （ｐＨ７，４）
： Ｚｏｏ ｍＭ ＮａＣｌまたは２０ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ７，４） ： １０ ｒｎＭ ＥＤ
ＴＡ ： １００ｒ１００ｒｎノに再懸濁する。次すで
、この懸濁液を音波処理等によって固液接触せしめ、上
記のように遠見は音波処理）せしめ、上記のように遠心
して所望のホルモンまたはアナログに富む沈殿を得る。
回実施する。すなわち、まず得られた沈殿を２０ ｍＭ
Ｔｒｉｓ （ｐＨ７，４）または５０ ｍＭリン酸ナ
ナトリウム緩衝ｆｆｌ（ｐＨ７，４）に再懸濁し、この
懸濁液を上記のように固液接触させる（たとえば音波処
理する）。次に％懸濁液を上記のように遠心分離し、回
収した沈殿を５０ ｒｎＭ Ｔｒｌｍ （ｐＨ７，４）
： Ｚｏｏ ｍＭ ＮａＣｌまたは２０ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ７，４） ： １０ ｒｎＭ ＥＤ
ＴＡ ： １００ｒ１００ｒｎノに再懸濁する。次すで
、この懸濁液を音波処理等によって固液接触せしめ、上
記のように遠見は音波処理）せしめ、上記のように遠心
して所望のホルモンまたはアナログに富む沈殿を得る。
その後、分離した沈殿を、たとえばこれを適当な温度（
たとえば４〜４０Ｃ）で充分な景（約２５倍容が好まし
い）の水に再懸濁するととＫよって可溶化し、 ｐＨを
適切なアルカリ性ｐＨ（たとえば約９．０〜１２．０）
にｖＩ４整してホルモンまたはアナログを含有する溶液
を形成する。溶解を容易にするために高剪断攪拌（たと
えばポリトレン（Ｐｏ１ｙ−ｔｒｏｎ ） Ｃキネマチ
力（Ｋ１ｎ＊ｍａｔ１ｃｍ ） ）ブレンダー）を用い
てもよい。最初の懸濁液のｐＨは、Ｎａ０Ｈ（たとえば
１〜１ ＯＮ Ｎａ０Ｈ）をｐＨが約９．０〜１２．０
（約１１．８〜１２．０が好ましい）Ｋなるまで懸濁液
に加えることによって適切に調整できる。
たとえば４〜４０Ｃ）で充分な景（約２５倍容が好まし
い）の水に再懸濁するととＫよって可溶化し、 ｐＨを
適切なアルカリ性ｐＨ（たとえば約９．０〜１２．０）
にｖＩ４整してホルモンまたはアナログを含有する溶液
を形成する。溶解を容易にするために高剪断攪拌（たと
えばポリトレン（Ｐｏ１ｙ−ｔｒｏｎ ） Ｃキネマチ
力（Ｋ１ｎ＊ｍａｔ１ｃｍ ） ）ブレンダー）を用い
てもよい。最初の懸濁液のｐＨは、Ｎａ０Ｈ（たとえば
１〜１ ＯＮ Ｎａ０Ｈ）をｐＨが約９．０〜１２．０
（約１１．８〜１２．０が好ましい）Ｋなるまで懸濁液
に加えることによって適切に調整できる。
Ｎａ０Ｈｌｉ溶液を撒しく攪拌しながら加えるのが好ま
しい。次にこの溶液を約１時間攪拌インキュベートする
と、ｐＨは約１０．５に低下するであろう。
しい。次にこの溶液を約１時間攪拌インキュベートする
と、ｐＨは約１０．５に低下するであろう。
次にこの溶液に、適切に濃縮した、たとえば約ＩＭ（適
当なｐＨ，たとえば１１．５〜１２．０）のホウ酸ナト
リウム水溶液を適当な量加えて、最終ホウ酸塩ａｔを好
ましい約１０ｍＭＫする。次いでタンパク質溶液を、２
〜１０倍容の１０ ｒｎＭホウ酸ナトナトリウム緩衝液
ｐＨ１０，２）で希釈するかまたは濃塩酸すなわちＩ
Ｎ ＨＣｊで滴定すふことＫよってｐＨ１０，５に滴定
する。その後この溶液を攪拌しながらさらに１〜１２時
間インキュベートする。所望によシ、こうして得られた
溶液を清僚（透明）にしてもよい。すなわち、たとえば
約１０Ｌ／時の流速で連続流式ヒートシステムソニケー
タ−（Ｈｅａｔ ５ｙｓｔ＠ｍ ５ｏｎｌｅａｔｏｒ）
モデル３７０を用いて、適当な条件下で溶液を音波処理
し、この音波処理した溶液を、たとえば約３０Ｌ／時の
流速で固形ポール型連続流式遠心機（たとえば七）ｑ（
ＣＩｐｍ） １０１ ）によって適切な条件下で遠心分
離し、上溝液を分離し、たとえばブフナー（Ｂ ｕｃｈ
ｎ＠ｒ ）真空フィルター上のワットマン（Ｗｈａｔｒ
ｎａｎ ） ４２Ｆ紙を通して液体を真空濾過して、可
溶化したホルモンまたはアナログを含有する透明溶液を
生成する。あるいはもっばら遠心分離を用いてもよい。
当なｐＨ，たとえば１１．５〜１２．０）のホウ酸ナト
リウム水溶液を適当な量加えて、最終ホウ酸塩ａｔを好
ましい約１０ｍＭＫする。次いでタンパク質溶液を、２
〜１０倍容の１０ ｒｎＭホウ酸ナトナトリウム緩衝液
ｐＨ１０，２）で希釈するかまたは濃塩酸すなわちＩ
Ｎ ＨＣｊで滴定すふことＫよってｐＨ１０，５に滴定
する。その後この溶液を攪拌しながらさらに１〜１２時
間インキュベートする。所望によシ、こうして得られた
溶液を清僚（透明）にしてもよい。すなわち、たとえば
約１０Ｌ／時の流速で連続流式ヒートシステムソニケー
タ−（Ｈｅａｔ ５ｙｓｔ＠ｍ ５ｏｎｌｅａｔｏｒ）
モデル３７０を用いて、適当な条件下で溶液を音波処理
し、この音波処理した溶液を、たとえば約３０Ｌ／時の
流速で固形ポール型連続流式遠心機（たとえば七）ｑ（
ＣＩｐｍ） １０１ ）によって適切な条件下で遠心分
離し、上溝液を分離し、たとえばブフナー（Ｂ ｕｃｈ
ｎ＠ｒ ）真空フィルター上のワットマン（Ｗｈａｔｒ
ｎａｎ ） ４２Ｆ紙を通して液体を真空濾過して、可
溶化したホルモンまたはアナログを含有する透明溶液を
生成する。あるいはもっばら遠心分離を用いてもよい。
その後、可溶化したホルモンまたはアナログをタンノ♀
り質、脂質およびその他の粒子等の他の細胞成分から分
離し、適切な条件の限外濾過によって凝集体をばらばら
にする。得られた保留物（ｒ＠ｔ＠ｎｔａｔｓ ）を再
度少なくとも１回限外ＦＡＫかける。この手順中に保留
物の容量は約９５％、たとえば約１０ノから約０，５ノ
に減少させるべきであシ、濾液を集める。カットオフが
１００ Ｋ Ｍ、Ｗ。
り質、脂質およびその他の粒子等の他の細胞成分から分
離し、適切な条件の限外濾過によって凝集体をばらばら
にする。得られた保留物（ｒ＠ｔ＠ｎｔａｔｓ ）を再
度少なくとも１回限外ＦＡＫかける。この手順中に保留
物の容量は約９５％、たとえば約１０ノから約０，５ノ
に減少させるべきであシ、濾液を集める。カットオフが
１００ Ｋ Ｍ、Ｗ。
Ｏｄ １４） 、、７ カ＊ ’）ト（Ｐｅ□１ｌｅｏ
ｎ■Ｃａ５ｓｅｔｔｏ ）またはＰＵＦ −１００螺線
（ミリポア社（Ｍ１１１１ｐｏｒ＠Ｃｏｒｐ、ａベッド
フォード（Ｂ＠ｄｆｏｒｄ ） 、 マサチューセッツ
州）が限外濾過工程での使用に適している。保留物を適
当なアルカリ性ｐＨ（たとえば約９〜１２）の適切な緩
衝液でさらに希釈し、さらに限外濾過にかけると好まし
い。現在のところ好ましい態様では１０ ｍＭホウ酸塩
緩衝液（ｐＨ１０，５〜１２．０）を使用する。再希釈
および限外濾過による再濃縮は少な（とも１回縁プ返す
のが好まし論。あるいは、保留物の容量を実質的に一定
にして限外濾過を１回以上実施してもよい。特に好まし
い態様では保留物の２８０ｍｍ吸光度が約０．１の光学
密度単位未満になるまで限外濾過を繰υ返す。
ｎ■Ｃａ５ｓｅｔｔｏ ）またはＰＵＦ −１００螺線
（ミリポア社（Ｍ１１１１ｐｏｒ＠Ｃｏｒｐ、ａベッド
フォード（Ｂ＠ｄｆｏｒｄ ） 、 マサチューセッツ
州）が限外濾過工程での使用に適している。保留物を適
当なアルカリ性ｐＨ（たとえば約９〜１２）の適切な緩
衝液でさらに希釈し、さらに限外濾過にかけると好まし
い。現在のところ好ましい態様では１０ ｍＭホウ酸塩
緩衝液（ｐＨ１０，５〜１２．０）を使用する。再希釈
および限外濾過による再濃縮は少な（とも１回縁プ返す
のが好まし論。あるいは、保留物の容量を実質的に一定
にして限外濾過を１回以上実施してもよい。特に好まし
い態様では保留物の２８０ｍｍ吸光度が約０．１の光学
密度単位未満になるまで限外濾過を繰υ返す。
ホルモンは従来ゲルクロマトグラフィーで得られたより
も高いレベルの純度と生物学的活性で限外Ｐ液から都合
よく得ることができる。
も高いレベルの純度と生物学的活性で限外Ｐ液から都合
よく得ることができる。
次に１ホルモンまたはアナログをさらに精製旋網し、精
製ホルモンまたはアナログを回収するように、たとえば
、ジメチルアミノエチルのようなアミン含有イオン交換
樹脂を用いるイオン交換クロマトグラフィー吟によって
、限外Ｐ液中に得られた精製ホルモンまたはアナログを
処理する。イオン交換クロマトグラフィーに先立って、
ＩＯＫＭ、Ｗ、メンプランを用する限外濾過で水を除去
して濃縮することは随意である。イオン交換クロマトグ
ラフィーステップ中に、残留していたＤＮＡ。
製ホルモンまたはアナログを回収するように、たとえば
、ジメチルアミノエチルのようなアミン含有イオン交換
樹脂を用いるイオン交換クロマトグラフィー吟によって
、限外Ｐ液中に得られた精製ホルモンまたはアナログを
処理する。イオン交換クロマトグラフィーに先立って、
ＩＯＫＭ、Ｗ、メンプランを用する限外濾過で水を除去
して濃縮することは随意である。イオン交換クロマトグ
ラフィーステップ中に、残留していたＤＮＡ。
（存在する場合には）リゾテーム、および多量体（ｍｕ
ｌｔ１ｍ＠ｒｓ ）がホルモンまたはアナログから分離
される。このステップで限外Ｆｉ？ＥのｐＨはまず塩酸
で滴定することによって適切なｐＨ（たとえば９．Ｏ）
に調整し、適切なイオン交換カラム、たとえばＤｇＡＥ
−セファローズ（Ｓ＠ｐｈｔｒｏｓｅ■） ＣＬ−６Ｂ
（高速”） ＫＳ −３７０区分カラム（ファルマシア
ファインケミカルズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＦＩｎ＠Ｃ
ｈｅｍｌ−ａａｌｇ）、 ピスカタウエイ（ｐｌｓｃ
ａｔａｗａｙ ） −ニューシャーシー州）に載せる。
ｌｔ１ｍ＠ｒｓ ）がホルモンまたはアナログから分離
される。このステップで限外Ｆｉ？ＥのｐＨはまず塩酸
で滴定することによって適切なｐＨ（たとえば９．Ｏ）
に調整し、適切なイオン交換カラム、たとえばＤｇＡＥ
−セファローズ（Ｓ＠ｐｈｔｒｏｓｅ■） ＣＬ−６Ｂ
（高速”） ＫＳ −３７０区分カラム（ファルマシア
ファインケミカルズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＦＩｎ＠Ｃ
ｈｅｍｌ−ａａｌｇ）、 ピスカタウエイ（ｐｌｓｃ
ａｔａｗａｙ ） −ニューシャーシー州）に載せる。
次に系を適切な緩衝液（たとえば１０ｍＭホウ酸塩緩ｇ
Ｒ液）で洗浄し、適当な溶出液、たとえば１００ ｍＭ
ＮａＣｊを含有する１ ０ ｍＭホウ酸塩緩衝液（ｐ
Ｈ９，０）、を用いて適切な速度でサンプルを溶出する
。ホルモンまたはアナログを含有する画分を、ペリコン
カセット（Ｐ＠１ｌｉｃｏｎ■Ｃａ５ｓｅｔｔｅ）すな
わちカットオフが１０Ｋ Ｍ、Ｗ、のＰＵＦ −１００
ス／Ｑイラルを用いる限外濾過によってＴｉｋ縮するこ
とができ、次いで適切な濃度の適当な塩（たとえば３ｍ
Ｍ水酸化アンモニウムまたは重炭酸アンモニウム）を含
有する溶液に対して再び１０ Ｋ Ｍ、Ｗ、のカットオ
フのペリコンカセット（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ■Ｃ・１．。
Ｒ液）で洗浄し、適当な溶出液、たとえば１００ ｍＭ
ＮａＣｊを含有する１ ０ ｍＭホウ酸塩緩衝液（ｐ
Ｈ９，０）、を用いて適切な速度でサンプルを溶出する
。ホルモンまたはアナログを含有する画分を、ペリコン
カセット（Ｐ＠１ｌｉｃｏｎ■Ｃａ５ｓｅｔｔｅ）すな
わちカットオフが１０Ｋ Ｍ、Ｗ、のＰＵＦ −１００
ス／Ｑイラルを用いる限外濾過によってＴｉｋ縮するこ
とができ、次いで適切な濃度の適当な塩（たとえば３ｍ
Ｍ水酸化アンモニウムまたは重炭酸アンモニウム）を含
有する溶液に対して再び１０ Ｋ Ｍ、Ｗ、のカットオ
フのペリコンカセット（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ■Ｃ・１．。
１１・）を用いて透析してもよい。次に、透析した物質
を適当な条件での凍結乾燥またはスプレー乾燥によって
乾燥してもよい。スプレー乾燥の方が経済的な工程であ
夛、入口温度がほぼ２００１１：’、出ロ温度が＃まぼ
５０Ｃ１流速が約２．５Ｌ／時の小さｂスプレードライ
ヤー（二四 アトマイザ−（Ｎ１ｒｏ Ａｔｏｍｙｚｅ
ｒ ） ）で便利に行なうことができる。こうして、以
上のように処理した動物成長ホルモンまたはアナログは
・白色微粉末状で得ることができる。
を適当な条件での凍結乾燥またはスプレー乾燥によって
乾燥してもよい。スプレー乾燥の方が経済的な工程であ
夛、入口温度がほぼ２００１１：’、出ロ温度が＃まぼ
５０Ｃ１流速が約２．５Ｌ／時の小さｂスプレードライ
ヤー（二四 アトマイザ−（Ｎ１ｒｏ Ａｔｏｍｙｚｅ
ｒ ） ）で便利に行なうことができる。こうして、以
上のように処理した動物成長ホルモンまたはアナログは
・白色微粉末状で得ることができる。
本発明方法によって、発酵終了時の細菌中に存在するホ
ルモンまたはアナログの重量に対して約３０％以上の収
率で精製動物成長ホルモンまたはアナログを回収するこ
とができる。このようにしテ得うれたホルモンまたはア
ナログは、低分子量のサイズマーカー（ファルマシア（
Ｐｈａｒｍａｅｌｍ））を標準として１５％ポリアクリ
ルアミド−８ＤＳゲル上で展開メすると１つのスポット
となって現われる。
ルモンまたはアナログの重量に対して約３０％以上の収
率で精製動物成長ホルモンまたはアナログを回収するこ
とができる。このようにしテ得うれたホルモンまたはア
ナログは、低分子量のサイズマーカー（ファルマシア（
Ｐｈａｒｍａｅｌｍ））を標準として１５％ポリアクリ
ルアミド−８ＤＳゲル上で展開メすると１つのスポット
となって現われる。
本発明によって限外濾過およびイオン交換クロマトグラ
フィー後に得られたペプチドは、限外濾過の代わりにゲ
ルクロマトグラフィーを用いたとき、またはイオノ交換
クロマトグラフィーの代わシに１０ＫＭ、Ｗ、限外濾過
によってペプチド濃縮をしたときよシも純度が高くしか
も安定性も高かった。
フィー後に得られたペプチドは、限外濾過の代わりにゲ
ルクロマトグラフィーを用いたとき、またはイオノ交換
クロマトグラフィーの代わシに１０ＫＭ、Ｗ、限外濾過
によってペプチド濃縮をしたときよシも純度が高くしか
も安定性も高かった。
回収されたホルモンとアナログの生物活性に関シテハ、
ラジオイムノアッセイの結果が示しているように、天然
のホルモンに対する抗体は適当な微生物によって産生さ
れ本発明に従って回収されたホルモンまたはアナログに
対してほぼ等しい親和性を有していた。同様に１ ラジ
オレセプター結合アッセイは、適当な膜の本発明によっ
て精製されたホルモンまたはアナログに対する結合活性
が天然ホルモンの真正サンプルに対する活性と同勢であ
ることを示している。さらに、このホルモンまたはアナ
ログを適当な動物に一次または二次（ブースター）注射
した後このペプチドに対する抗体は全く検出されなかっ
た。また、本発明で得られたウシ成長ホルモンアナログ
を授乳期のウシに投与すると乳汁分泌が促進されること
が判明した。
ラジオイムノアッセイの結果が示しているように、天然
のホルモンに対する抗体は適当な微生物によって産生さ
れ本発明に従って回収されたホルモンまたはアナログに
対してほぼ等しい親和性を有していた。同様に１ ラジ
オレセプター結合アッセイは、適当な膜の本発明によっ
て精製されたホルモンまたはアナログに対する結合活性
が天然ホルモンの真正サンプルに対する活性と同勢であ
ることを示している。さらに、このホルモンまたはアナ
ログを適当な動物に一次または二次（ブースター）注射
した後このペプチドに対する抗体は全く検出されなかっ
た。また、本発明で得られたウシ成長ホルモンアナログ
を授乳期のウシに投与すると乳汁分泌が促進されること
が判明した。
以下の実施例は本発明を理解する手助けをするためのも
のであシ、いかなる意味でも本発明の範囲を限定するも
のではないと理解されたい。当業者に周知の常法につい
ては詳しい説明はしない。
のであシ、いかなる意味でも本発明の範囲を限定するも
のではないと理解されたい。当業者に周知の常法につい
ては詳しい説明はしない。
（以下余白）
実施例１
大腸菌（］ｉｉ、ｃｏｊ１１）の増殖とｂＧＨアナログ
の産生増殖舖導によってｂＧ）ｒ７ナログ（Ｍｅｔ−Ａ
ｍｐ−Ｇｊｌｎ −ｂＧＨ）を産生する大腸菌（乙Ｃｏ
ｊｌｌ）株ＡＴＣＣＮｏ、３９８０６の培養株をカゼイ
ン培地（下記接種参照）上で増殖させ、凍結用培地で２
倍に希釈し、−８０℃に貯蔵した。凍結用培地には５０
（ｋｌ当ＤＫ次の成分が含まれている。
の産生増殖舖導によってｂＧ）ｒ７ナログ（Ｍｅｔ−Ａ
ｍｐ−Ｇｊｌｎ −ｂＧＨ）を産生する大腸菌（乙Ｃｏ
ｊｌｌ）株ＡＴＣＣＮｏ、３９８０６の培養株をカゼイ
ン培地（下記接種参照）上で増殖させ、凍結用培地で２
倍に希釈し、−８０℃に貯蔵した。凍結用培地には５０
（ｋｌ当ＤＫ次の成分が含まれている。
ＫＩＨＰＯ４ａ ３ Ｋ
ＫＨＩＰＯａ １８ｇクエン酸ナトリ
ウム ａ４５ｇ ＭｇＳＯａ・７Ｈ禦０ ０．０９ｇ（ＮＨ４
）ｔｓＯ４（１５）ｇ グリセロール ４４０ｇ １、接種 カゼイ／氷解物２ｏｇ／１１、酵母エキス１０ｇＡおよ
びＮａＣｊｌ ２ｇ／ｌＩ 中で接種材料を増殖した。
ウム ａ４５ｇ ＭｇＳＯａ・７Ｈ禦０ ０．０９ｇ（ＮＨ４
）ｔｓＯ４（１５）ｇ グリセロール ４４０ｇ １、接種 カゼイ／氷解物２ｏｇ／１１、酵母エキス１０ｇＡおよ
びＮａＣｊｌ ２ｇ／ｌＩ 中で接種材料を増殖した。
震盪フラスコ内の無菌培地に貯蔵培養株（ｓｔｏｃｋｅ
ｕｊｌｔｕｒ・）から接種し、３０℃、約２０Ｏｒ、
ｐ、 ｍ、のシェーカー上で１５時間インキュベートし
た。必要とされるように、接種物増殖における以後の段
階は攪拌通気発酵槽中で行なった。無菌培地に接種培養
物を２〜１０％接種し、攪拌および通気しながら３０℃
、ｐＨ７±α５で１５時間イン中ユヘートシて溶存酸素
濃度を空気飽和の約２０１のレベルに維持した。
ｕｊｌｔｕｒ・）から接種し、３０℃、約２０Ｏｒ、
ｐ、 ｍ、のシェーカー上で１５時間インキュベートし
た。必要とされるように、接種物増殖における以後の段
階は攪拌通気発酵槽中で行なった。無菌培地に接種培養
物を２〜１０％接種し、攪拌および通気しながら３０℃
、ｐＨ７±α５で１５時間イン中ユヘートシて溶存酸素
濃度を空気飽和の約２０１のレベルに維持した。
■、産生
産生培地には次の成分が含まれている。
カゼイン氷解物 ２０ｇ／ｊ。
酵母エキス １０ｇ／ＩｔＫ＠ ＨＰ
０４ １５ ｇ ／ ７１Ｍ、ＳＯ，
・７Ｈ，０１ｇ／ｌ ＮａＣｆ１ ５ｇ／１１ビオチン
αｘｍｇ７ｔｔチアミニ／
１ ｆＦｌ ｇ ／ Ａ微量元素溶液
３ ｍ Ｊ ／ Ｉｔ。
０４ １５ ｇ ／ ７１Ｍ、ＳＯ，
・７Ｈ，０１ｇ／ｌ ＮａＣｆ１ ５ｇ／１１ビオチン
αｘｍｇ７ｔｔチアミニ／
１ ｆＦｌ ｇ ／ Ａ微量元素溶液
３ ｍ Ｊ ／ Ｉｔ。
この培地にはアンピシリンも１００ ｍ ｇ ／ ＩＩ
Ｉ含まれている。アンピシリンは産生にとっては任意成
分であるが接種物の増殖に用いる培地には常に含まれて
いる。
Ｉ含まれている。アンピシリンは産生にとっては任意成
分であるが接種物の増殖に用いる培地には常に含まれて
いる。
ビオチン、チアミンおよびアンピシリンの濃縮溶液は別
にフィルター滅菌し、接種前に無菌産生培地に添加した
。無菌グルコース溶液ＦｉｌＯνすになるように一初に
添加した。誘導期にさらに１０Ｌ４のグルコースを加え
た。
にフィルター滅菌し、接種前に無菌産生培地に添加した
。無菌グルコース溶液ＦｉｌＯνすになるように一初に
添加した。誘導期にさらに１０Ｌ４のグルコースを加え
た。
微量元素溶液には次の成分が含まれている。
Ｆ＠Ｃ１ｓ ｌａｇ／４１ＺｎＣ１ｔ ・
４ＨＩ０ ２ｔ／１１ＣｏｃｆｔＢ 争６ＨｔＯ
２ｇ／ ４１Ｎａ！Ｍ６０４ ・２Ｈ！０ ２ ｇ
／ ＡＣａＣｊｌｌ 争２Ｈ１０１ｇ／１１ ＣｕＣＩｌＢ Ｉｇ／４ｋＨｓＢＯｓ
Ｏ，Ｓｇ／ｌ＃ＨＣ４１１０ｏｗ／ｌ
ｔ この培地に接種培養物をＯ，ｂ〜１０％接種し、３０℃
でインキュベートする。溶存酸素（Ｉｆが空気飽和の２
０％より高いレベルに維持されるように攪拌通気速度を
設定する。ｐＨＦｉＮＨ，で７．０〜７．５±０．２に
維持する。細胞濃度が約１５ｇ／４（ＯＤｓａ・−１０
）に達した時点で温度を４２℃に上げて鐸導を開始する
。次に温度を１〜５時間４２ＣＫ保ち、その後細胞懸濁
液から細胞を採堆し得る。
４ＨＩ０ ２ｔ／１１ＣｏｃｆｔＢ 争６ＨｔＯ
２ｇ／ ４１Ｎａ！Ｍ６０４ ・２Ｈ！０ ２ ｇ
／ ＡＣａＣｊｌｌ 争２Ｈ１０１ｇ／１１ ＣｕＣＩｌＢ Ｉｇ／４ｋＨｓＢＯｓ
Ｏ，Ｓｇ／ｌ＃ＨＣ４１１０ｏｗ／ｌ
ｔ この培地に接種培養物をＯ，ｂ〜１０％接種し、３０℃
でインキュベートする。溶存酸素（Ｉｆが空気飽和の２
０％より高いレベルに維持されるように攪拌通気速度を
設定する。ｐＨＦｉＮＨ，で７．０〜７．５±０．２に
維持する。細胞濃度が約１５ｇ／４（ＯＤｓａ・−１０
）に達した時点で温度を４２℃に上げて鐸導を開始する
。次に温度を１〜５時間４２ＣＫ保ち、その後細胞懸濁
液から細胞を採堆し得る。
実施例２
細胞採販
実施例１と同様にして得九細胞懸濁液（ａ１５ＤＣＷ／
Ｌおよび４９０ｍｇｂＧＨ／Ｌ含有）ｓｏｏｎを室温に
冷やし、保有タンク（ｈａ４ｄｌｎｇ ｔａｎｋ）Ｋ移
した。、供給速度２５ Ｇ Ｉｔ／時のＣＥＰＡ １０
１管状Ｉ−ル形（ｔｕｂ＋Ｊｉｒ ｂｏｗｌ）遠心機で
ａＮ＆ｓｙｉ液を遠心した（１４．ＯＯＯＲＰＭ、ｔ６
．ｏｏｏｘｇ）。このＣＥＰＡ １０１遠心機は、管長
７：Ｌ７ｂ、．放電ダム（ｄｉｓｃｈａｒｇ＠ｄａｍ）
ｔでの半径＆２ｂ、Ｍ、／−ル壁までの半径７．３５
０１１でア〕、加速ひれ（ａａａ＠ｊｌｓｒａｔｉｃｖ
ｆ Ｉｎ５）を備えておシ、外部ジャケット上に冷却器
がある。
Ｌおよび４９０ｍｇｂＧＨ／Ｌ含有）ｓｏｏｎを室温に
冷やし、保有タンク（ｈａ４ｄｌｎｇ ｔａｎｋ）Ｋ移
した。、供給速度２５ Ｇ Ｉｔ／時のＣＥＰＡ １０
１管状Ｉ−ル形（ｔｕｂ＋Ｊｉｒ ｂｏｗｌ）遠心機で
ａＮ＆ｓｙｉ液を遠心した（１４．ＯＯＯＲＰＭ、ｔ６
．ｏｏｏｘｇ）。このＣＥＰＡ １０１遠心機は、管長
７：Ｌ７ｂ、．放電ダム（ｄｉｓｃｈａｒｇ＠ｄａｍ）
ｔでの半径＆２ｂ、Ｍ、／−ル壁までの半径７．３５
０１１でア〕、加速ひれ（ａａａ＠ｊｌｓｒａｔｉｃｖ
ｆ Ｉｎ５）を備えておシ、外部ジャケット上に冷却器
がある。
透明な上清は密度が１．０ｇ／ｄで検出可能なりＧＨを
含んでいないので捨てた。重蓋が１１．４４（７５チ湿
洞状態）のケーキには凝集したｂＧＨが含まれておシ、
これを貯蔵した。このケーキは通常厚みが約２傷で密度
がＬ１ｇ／１１７であった。別の手順は、−晩細胞を静
置沈降させ、透明上清をサイホンで除去することである
。
含んでいないので捨てた。重蓋が１１．４４（７５チ湿
洞状態）のケーキには凝集したｂＧＨが含まれておシ、
これを貯蔵した。このケーキは通常厚みが約２傷で密度
がＬ１ｇ／１１７であった。別の手順は、−晩細胞を静
置沈降させ、透明上清をサイホンで除去することである
。
アッセイ法：ＭＡ胞８７１１３液、上清およびケーキに
対ち定黛ゲー走ｆ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｓｄ ｇａｊ
ｍｅａｎ）ステップ収率（（支）：１００チ 総合収率
：１００チステツプ歳終（ｏｕｔｐｕｔ）容量： 初期
細胞懸濁液容量の２−３チ針算アツセイ（ａａｆａｄ
ａｓｍａｙ）：ケーキ１−当ｊ）２Ｌ５ｇｂＧＨｍｕ単
（ｅｎｒｌａｈｒｎｓｎｔ ｆａｃｔｏｒ） ： ４４
（最終ｂＧＨ濃度／供給（ｉｎＰｕｔ）ｂＧＨｄ度） （（支）収率はＯＤ年単位測定して決定した。仁の単位
は２８０ｎｍでの溶液の吸光度（セル１ ｃｍ ） ｘ
溶液の容量（ｍＬ）で定義される。たとえば、ＯＤ値が
９，１で溶液容量が３２，６００ｍＬであればＯＤ年単
位値は２９７，０ＧＯＯＤである。吸光度をｐＨ９で測
定すれば、ＯＤ値に変換率０．００１５７を掛けるとｇ
ｂＧＨ心換される。す々わち１４３ｇｂＧＶＬとなる
。
対ち定黛ゲー走ｆ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｓｄ ｇａｊ
ｍｅａｎ）ステップ収率（（支）：１００チ 総合収率
：１００チステツプ歳終（ｏｕｔｐｕｔ）容量： 初期
細胞懸濁液容量の２−３チ針算アツセイ（ａａｆａｄ
ａｓｍａｙ）：ケーキ１−当ｊ）２Ｌ５ｇｂＧＨｍｕ単
（ｅｎｒｌａｈｒｎｓｎｔ ｆａｃｔｏｒ） ： ４４
（最終ｂＧＨ濃度／供給（ｉｎＰｕｔ）ｂＧＨｄ度） （（支）収率はＯＤ年単位測定して決定した。仁の単位
は２８０ｎｍでの溶液の吸光度（セル１ ｃｍ ） ｘ
溶液の容量（ｍＬ）で定義される。たとえば、ＯＤ値が
９，１で溶液容量が３２，６００ｍＬであればＯＤ年単
位値は２９７，０ＧＯＯＤである。吸光度をｐＨ９で測
定すれば、ＯＤ値に変換率０．００１５７を掛けるとｇ
ｂＧＨ心換される。す々わち１４３ｇｂＧＶＬとなる
。
実施例３
細胞破砕
細胞採取ステップ（実施例２）で得た湿潤細胞（ｉ ｔ
４Ｋｙ）ｔｍｎＮＡ胞ｔ ｒ４にツき４！（全体で４５
、６ Ａ ）の５０ｍＭ Ｔｒｌｓ：５０ ｒｎＭ Ｎ
ａＣＪＩＭ衝液（ｐＨ７，ｔ）Ｋ懸濁した。このケーキ
を分散するにはポリトロン（Ｐｏｆｙｔｒｏｎ）高剪断
ミキサー（キネマチ力、Ｋｌｎｅｍａｔｉａａ）が役に
立つ。懸濁した細胞をダイノミル（Ｄｙｎｏｍｌｌｆ）
ＫＤ−５Ｗｌｉビーズミル破砕機（）イリー アー、
ノ々ツバオフエン（ＷｉＪＩｅｙん Ｂａｃｈｏｆｅｎ
）、／’−ゼル）中に８０Ｌ／時で供給した。ビーズミ
ルは冷凍によって一１０℃〜＋８℃に維持した。この破
砕した細胞を次に等容量の脱イオン水で希釈してからＣ
ＥＰＡ １０１管状ボール形遠心機で遠心分離した。遠
心機への供給速度は３０〜６０Ｌ／時であった。供給速
度以外の遠心条件は全て細胞採取の場合と同じであった
。、供給ｂＧＨの約ｌＯチを含有する上清は捨てた。前
葉ｓ、２８Ｋｐ（７ｓチ湿潤状態）のケーキは凝集しだ
ｂＧＨを含んでおり、これを貯蔵した。
４Ｋｙ）ｔｍｎＮＡ胞ｔ ｒ４にツき４！（全体で４５
、６ Ａ ）の５０ｍＭ Ｔｒｌｓ：５０ ｒｎＭ Ｎ
ａＣＪＩＭ衝液（ｐＨ７，ｔ）Ｋ懸濁した。このケーキ
を分散するにはポリトロン（Ｐｏｆｙｔｒｏｎ）高剪断
ミキサー（キネマチ力、Ｋｌｎｅｍａｔｉａａ）が役に
立つ。懸濁した細胞をダイノミル（Ｄｙｎｏｍｌｌｆ）
ＫＤ−５Ｗｌｉビーズミル破砕機（）イリー アー、
ノ々ツバオフエン（ＷｉＪＩｅｙん Ｂａｃｈｏｆｅｎ
）、／’−ゼル）中に８０Ｌ／時で供給した。ビーズミ
ルは冷凍によって一１０℃〜＋８℃に維持した。この破
砕した細胞を次に等容量の脱イオン水で希釈してからＣ
ＥＰＡ １０１管状ボール形遠心機で遠心分離した。遠
心機への供給速度は３０〜６０Ｌ／時であった。供給速
度以外の遠心条件は全て細胞採取の場合と同じであった
。、供給ｂＧＨの約ｌＯチを含有する上清は捨てた。前
葉ｓ、２８Ｋｐ（７ｓチ湿潤状態）のケーキは凝集しだ
ｂＧＨを含んでおり、これを貯蔵した。
破砕用緩衝液（５０ｍＭＴｒｉＣ５０ｍＭ Ｎａ（Ｊ、
ｐＨ７，４） ：脱イオン水７ＳＯｍＬ中のＴｒｉｍ
６．０６ｇとＮａＣＪ！Ｌ９７ｇのｐＨをｆｌｌｌＨｃ
Ｉｌテア、４にＮｕ、脱イオン水でＩＬに希釈し、必要
ならばｐ Ｈ７，４に再調整した。
ｐＨ７，４） ：脱イオン水７ＳＯｍＬ中のＴｒｉｍ
６．０６ｇとＮａＣＪ！Ｌ９７ｇのｐＨをｆｌｌｌＨｃ
Ｉｌテア、４にＮｕ、脱イオン水でＩＬに希釈し、必要
ならばｐ Ｈ７，４に再調整した。
アッセイ法：細胞、上清およびケーキに対する定証グル
走丘 ステップ収率：９０弾 総合収率：９０％最終容ｊｋ
：初期細胞懸濁液容量のＬＯ５ｌｉｔ算アッセイ：ケー
キＩＫｇ当た＃）３７．１ ｇ ｂＧＨＩｌｌＩ縮率：
１，７ 実施例４ リゾチーム処理 破砕ステップ（実施例３）で得た湿潤ケーキ（ａｚ８Ｋ
Ｆ）を採取した最初の湿１１８ｉＩ細胞Ｉ Ｋｐにつき
ｔ、ｚＡ（全体で！１７！ンノ５Ｏｎ＋ＭＴｒ１ｇ：
５０ｍＭＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７，４）に懸濁した。こ
のケーキを分散させるＫはポリトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏ
ｎＪ高剪断ミキサーが役立つ。リゾチーム（シグマ（Ｓ
ｉｇｍａ）グレードｕ）を加え（、θ、ＱりｄｉＯ又ｉ
ツノ′÷）、このスラリーを３７℃で１時間混合した。
走丘 ステップ収率：９０弾 総合収率：９０％最終容ｊｋ
：初期細胞懸濁液容量のＬＯ５ｌｉｔ算アッセイ：ケー
キＩＫｇ当た＃）３７．１ ｇ ｂＧＨＩｌｌＩ縮率：
１，７ 実施例４ リゾチーム処理 破砕ステップ（実施例３）で得た湿潤ケーキ（ａｚ８Ｋ
Ｆ）を採取した最初の湿１１８ｉＩ細胞Ｉ Ｋｐにつき
ｔ、ｚＡ（全体で！１７！ンノ５Ｏｎ＋ＭＴｒ１ｇ：
５０ｍＭＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７，４）に懸濁した。こ
のケーキを分散させるＫはポリトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏ
ｎＪ高剪断ミキサーが役立つ。リゾチーム（シグマ（Ｓ
ｉｇｍａ）グレードｕ）を加え（、θ、ＱりｄｉＯ又ｉ
ツノ′÷）、このスラリーを３７℃で１時間混合した。
トリトン（Ｔｒｌｔｏｎ■）Ｘ−１００（ｏ−ムアンド
・・−ス社（Ｒｏｈｍ ＆ Ｈａａｓ Ｃｏ、 ）、
フイラデルフイア、ペンシルＡニア州）を加え（１２
当九Ｆ） １ｏｙ／ｖ ％緩衝溶液（ｐＨ７，４）１０
０ｍ、）リドｙ （Ｔｒｌｔｏｎ）×−１００の最終濃
度１チ）、混合物をさらに３０分間イン午ユベートした
。流れセル（ｆｆｌｏｗ ａｅ１℃）を備えた６５チ動
力（ｐｏｗ＠ｒ）のヒートシステムズ（Ｈａ ａ ｔＳ
ｙｍｔ＠ｍ５）３７０Ｗ音波処理機中でスラリーを音波
処理した。処理機中の流速は１８Ｌ／時であった。
・・−ス社（Ｒｏｈｍ ＆ Ｈａａｓ Ｃｏ、 ）、
フイラデルフイア、ペンシルＡニア州）を加え（１２
当九Ｆ） １ｏｙ／ｖ ％緩衝溶液（ｐＨ７，４）１０
０ｍ、）リドｙ （Ｔｒｌｔｏｎ）×−１００の最終濃
度１チ）、混合物をさらに３０分間イン午ユベートした
。流れセル（ｆｆｌｏｗ ａｅ１℃）を備えた６５チ動
力（ｐｏｗ＠ｒ）のヒートシステムズ（Ｈａ ａ ｔＳ
ｙｍｔ＠ｍ５）３７０Ｗ音波処理機中でスラリーを音波
処理した。処理機中の流速は１８Ｌ／時であった。
音波処理したスラリーを３０Ｌ／時のＣＥＰＡ １０１
で遠心した。供給速度以外の遠心条件は全て細胞採取時
の条件と同じであった。供給ｂＧＨの約３％を含む上清
は捨てた。１（１７ＫＦ（７５％湿潤状態）の重量のケ
ーキが凝集したｂＧＨを含有しており、これを貯蔵した
。
で遠心した。供給速度以外の遠心条件は全て細胞採取時
の条件と同じであった。供給ｂＧＨの約３％を含む上清
は捨てた。１（１７ＫＦ（７５％湿潤状態）の重量のケ
ーキが凝集したｂＧＨを含有しており、これを貯蔵した
。
丈ノフーソづＩＬ」話（５０ｒｎＭ Ｔｒｉ ｍ ＝５
０ ｍＭ ＥＤＴＡ。
０ ｍＭ ＥＤＴＡ。
ｐＨ７，４）：
脱イオン水７５０ｍＬ中のＴｒｉｍ６．０６ｇとＥＤＴ
Ａ１ｔ６ｇのｐＨを濃Ｈ，ＣＪま大は５０ ％ Ｎａ０
）ｆ’ｔ’ ７．４ ＫＭ整し、脱イオン水でＩＬＫ希
釈し、必要があれば再度ｐ Ｈ７，４にｆｆ４整した。
Ａ１ｔ６ｇのｐＨを濃Ｈ，ＣＪま大は５０ ％ Ｎａ０
）ｆ’ｔ’ ７．４ ＫＭ整し、脱イオン水でＩＬＫ希
釈し、必要があれば再度ｐ Ｈ７，４にｆｆ４整した。
アッセイ法：上清とケーキに対する定針ゲル走査ステッ
プ収率：９７チ 総合収率：８７．３％最終容ｔ：初
期細胞懸濁液容量の０６１チ計算アッセイ：ケーキ１Ｋ
ｇ当たり６１．９ ｇ ｂＧＨ績綿率：１，７ 実施例５ 第１洗浄 リゾチームステップ（実施例４）で得た湿潤ケーキ（１
（１７Ｋｇ）を最初の採取湿潤細胞Ｉ ＫＦ当たシα６
Ｊｌ（全体でｃｔ、ｓｉ）の２０ ｒｎＭ Ｔｒｉｍ
緩衝液（ｐＨ７，４）に＠濁した。このケーキを分散さ
せるのにはポリトロン（ＲｏＪｙｔｒｏｎ）高ｌＪＪ断
ミキサーが用いられる。６５チ動力のヒートシステムズ
（Ｈｅ ａ ｔＳｙｓｔｅｍｓ） ３７０ワツトモデル
中を１８Ｌ／時の流速で通してスラリーを音波処理した
。音波処理したスラリーをＣＢＰＡ １０１ （３０Ｌ
／時）で遠心分離した。供給速度以外の遠心条件は全て
細胞採取のものと同じであった。上清を捨てた。重ｆｉ
２−４６ｋ（７５チ湿潤状態）のケーキが凝集ｂＧＨを
含有しており、これを貯蔵した。
プ収率：９７チ 総合収率：８７．３％最終容ｔ：初
期細胞懸濁液容量の０６１チ計算アッセイ：ケーキ１Ｋ
ｇ当たり６１．９ ｇ ｂＧＨ績綿率：１，７ 実施例５ 第１洗浄 リゾチームステップ（実施例４）で得た湿潤ケーキ（１
（１７Ｋｇ）を最初の採取湿潤細胞Ｉ ＫＦ当たシα６
Ｊｌ（全体でｃｔ、ｓｉ）の２０ ｒｎＭ Ｔｒｉｍ
緩衝液（ｐＨ７，４）に＠濁した。このケーキを分散さ
せるのにはポリトロン（ＲｏＪｙｔｒｏｎ）高ｌＪＪ断
ミキサーが用いられる。６５チ動力のヒートシステムズ
（Ｈｅ ａ ｔＳｙｓｔｅｍｓ） ３７０ワツトモデル
中を１８Ｌ／時の流速で通してスラリーを音波処理した
。音波処理したスラリーをＣＢＰＡ １０１ （３０Ｌ
／時）で遠心分離した。供給速度以外の遠心条件は全て
細胞採取のものと同じであった。上清を捨てた。重ｆｉ
２−４６ｋ（７５チ湿潤状態）のケーキが凝集ｂＧＨを
含有しており、これを貯蔵した。
第１洗浄用緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｍ、 ｐＨ７
，４） ：脱イオン水７５０ｍＬ中のＴｒｉｍ １４２
ｇのｐＨを張ＨＣｌ２で７．４に！ｉｌｉ！Ｉ整し、
脱イオン水でＩＬに希釈し、必要に応じて再度ｐＨを７
．４に調整した。
，４） ：脱イオン水７５０ｍＬ中のＴｒｉｍ １４２
ｇのｐＨを張ＨＣｌ２で７．４に！ｉｌｉ！Ｉ整し、
脱イオン水でＩＬに希釈し、必要に応じて再度ｐＨを７
．４に調整した。
アッセイ法：上清とケーキに対する定にゲル走査ステッ
プ収率： １００優 総合収率：８７．３チＮｊ：
終容Ｍ：初期細胞懸濁液容量の０．４９計算アッセイ：
湿潤ケーキｌＫ２当たシフ７．３ｇｂＧＨ譲縮率：１．
２ 実施例６ 塩洗浄 第１洗浄ステツプ（実施例５）で得た湿潤ケーキ（２−
４６ＫＦ）を最初の湿潤採取細胞１むに対して０６Ｎ（
全体でＬ８２）の５０ｍＭ Ｔｒｌｓ：１００ｍＭ Ｎ
ａＣ４緩衝液（ＰＨ７，４１に懸濁した。このケーキを
分散させるにはポリトロン（Ｐｏｉｙｔｒｏｎ）高剪断
ミキサーが使える。スラリーを１８Ｌ／時の流速で６５
価動力のヒートシステムｉ （Ｈｅａｔ Ｓｙｓｔｅｍ
ｓ）３７０Ｗモデルに通して音波処理した。音波処理し
たスラリーを次にＣＥＰＡ １０１ （３０Ｌ／時）で
遠心した。供給速度以外の遠心条件は全て細胞採取のと
きと同じであった。上清は捨てた。２−１５に４（７５
チ湿潤状態）の重量のケーキが凝集ｂＧＨを含んでおシ
、これを貯蔵した。
プ収率： １００優 総合収率：８７．３チＮｊ：
終容Ｍ：初期細胞懸濁液容量の０．４９計算アッセイ：
湿潤ケーキｌＫ２当たシフ７．３ｇｂＧＨ譲縮率：１．
２ 実施例６ 塩洗浄 第１洗浄ステツプ（実施例５）で得た湿潤ケーキ（２−
４６ＫＦ）を最初の湿潤採取細胞１むに対して０６Ｎ（
全体でＬ８２）の５０ｍＭ Ｔｒｌｓ：１００ｍＭ Ｎ
ａＣ４緩衝液（ＰＨ７，４１に懸濁した。このケーキを
分散させるにはポリトロン（Ｐｏｉｙｔｒｏｎ）高剪断
ミキサーが使える。スラリーを１８Ｌ／時の流速で６５
価動力のヒートシステムｉ （Ｈｅａｔ Ｓｙｓｔｅｍ
ｓ）３７０Ｗモデルに通して音波処理した。音波処理し
たスラリーを次にＣＥＰＡ １０１ （３０Ｌ／時）で
遠心した。供給速度以外の遠心条件は全て細胞採取のと
きと同じであった。上清は捨てた。２−１５に４（７５
チ湿潤状態）の重量のケーキが凝集ｂＧＨを含んでおシ
、これを貯蔵した。
塩洗浄用緩衝ｉ（５０ｍＭＴｒｌａ：１００ｍＭ Ｎ
ａＣＪｌ。
ａＣＪｌ。
ｐ Ｈ７，４）
脱イオン水７５０ｍＬ中のＴｒｌｓ６．０６ｇを塩化ナ
トリウムｓ、ａｓｇ（７）ｐＨ１＠Ｈ（Ｊ で７．４に
調整し、脱イオン水でＩＬに希釈し、必要に応じてｐＨ
を７．４に再調整した。
トリウムｓ、ａｓｇ（７）ｐＨ１＠Ｈ（Ｊ で７．４に
調整し、脱イオン水でＩＬに希釈し、必要に応じてｐＨ
を７．４に再調整した。
アッセイ法：上清とケーキに対する定蓋ゲル走査ステッ
プ収−４：１０）ｏ係 総合収率：８７．３チ最終容！
＝初期細胞懸濁液容量の０．４３％計算アツセイ二ケー
キｌ Ｋｇ当たりＢ＆４ｇｂＧＨ１１１１１１４：Ｌ１
４ 実施例７ 第１水洗 塩洗浄ステップ（実施例６）で得た湿潤ケーキ（１１５
に４）を最初に採取した湿潤細胞１〜当シ１．２１ｔ（
全体で１１７１）の発熱物質を含有しない脱イオン水に
懸濁した。このケーキを分散するにはポリトロン（Ｐｏ
Ａｙｔｒｏｍ）高剪断ミキサーが使用できる。スラリー
を１８Ｌ／時の流速で６５チ動力のヒートシステムズ（
Ｈｅａｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ）３７θＷモデルに通して音
波処理した。このスラリーのｐＨは最初の水のｐＨ（約
６．２）からｐＨ約７，８〜＆０に上昇した。音波処理
したスラリーを次ＫＣＥＰＡ １０１（流速３０Ｌ／時
）で遠心分離した。供給速度以外の遠心条件は全て細胞
採取のときと同じであった。
プ収−４：１０）ｏ係 総合収率：８７．３チ最終容！
＝初期細胞懸濁液容量の０．４３％計算アツセイ二ケー
キｌ Ｋｇ当たりＢ＆４ｇｂＧＨ１１１１１１４：Ｌ１
４ 実施例７ 第１水洗 塩洗浄ステップ（実施例６）で得た湿潤ケーキ（１１５
に４）を最初に採取した湿潤細胞１〜当シ１．２１ｔ（
全体で１１７１）の発熱物質を含有しない脱イオン水に
懸濁した。このケーキを分散するにはポリトロン（Ｐｏ
Ａｙｔｒｏｍ）高剪断ミキサーが使用できる。スラリー
を１８Ｌ／時の流速で６５チ動力のヒートシステムズ（
Ｈｅａｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ）３７θＷモデルに通して音
波処理した。このスラリーのｐＨは最初の水のｐＨ（約
６．２）からｐＨ約７，８〜＆０に上昇した。音波処理
したスラリーを次ＫＣＥＰＡ １０１（流速３０Ｌ／時
）で遠心分離した。供給速度以外の遠心条件は全て細胞
採取のときと同じであった。
上清は捨てた。重Ｊｉｔ、９ｏＫｐ（７ｓ％湿潤状態）
のケーキが凝集ｂＧＨを含有しておシ、これを貯蔵した
。
のケーキが凝集ｂＧＨを含有しておシ、これを貯蔵した
。
アッセイ法二上清とケーキに対する定盤グル走査ステッ
プ収率：９９− 総合収率：８６．４チ最終容ｉｋ：
初期細胞懸濁液容量の０．３８チ計算アッセイ：ケーキ
ＩＫｇ当たり９９． Ｏｇ ｂＧＨ濃縮率（Ｌ１２ 実施例８ 第２水洗 第１水洗ステツプ（実施例７）で得た湿潤ケーキ（ｔ、
９ｏＫｆ）を最初に採取した湿潤細胞Ｉ Ｋｇ当りＬ２
Ａ（全体で１１７Ｉｔ）の発熱物質を含有しない脱イオ
ン水に懸濁した。このケーキを分散するにはボ１４）
）ロン（ＰａβｙｔｒｏｎＪ高剪断ミキサーが使用でき
る。スラリーのｐＨは約＆４であった。このスラリーを
１８Ｌ／時の流速で６５チ動力のヒートシステムイ（Ｈ
ｅａｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ）３７０Ｗ−ｖ−デル（で通し
て音波処理した。音波処理したスラリーを次にＣＥＰＡ
ｌＯｌ（流速３０Ｌ／時）で遠心分離した。供給速度以
外の遠心条件は全て細胞採取のときと同じで敷った。上
演は捨てた。重ｉ１．３１に９（７５チ湿潤状態）のケ
ーキが凝集ｂＧＨを含有しており、これを貯蔵した。
プ収率：９９− 総合収率：８６．４チ最終容ｉｋ：
初期細胞懸濁液容量の０．３８チ計算アッセイ：ケーキ
ＩＫｇ当たり９９． Ｏｇ ｂＧＨ濃縮率（Ｌ１２ 実施例８ 第２水洗 第１水洗ステツプ（実施例７）で得た湿潤ケーキ（ｔ、
９ｏＫｆ）を最初に採取した湿潤細胞Ｉ Ｋｇ当りＬ２
Ａ（全体で１１７Ｉｔ）の発熱物質を含有しない脱イオ
ン水に懸濁した。このケーキを分散するにはボ１４）
）ロン（ＰａβｙｔｒｏｎＪ高剪断ミキサーが使用でき
る。スラリーのｐＨは約＆４であった。このスラリーを
１８Ｌ／時の流速で６５チ動力のヒートシステムイ（Ｈ
ｅａｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ）３７０Ｗ−ｖ−デル（で通し
て音波処理した。音波処理したスラリーを次にＣＥＰＡ
ｌＯｌ（流速３０Ｌ／時）で遠心分離した。供給速度以
外の遠心条件は全て細胞採取のときと同じで敷った。上
演は捨てた。重ｉ１．３１に９（７５チ湿潤状態）のケ
ーキが凝集ｂＧＨを含有しており、これを貯蔵した。
アッセイ法：上清とケーキに対する定量ゲル走査ステッ
プ収率：９９チ 総合収率：８５６％最終容量：初期
細胞懸濁液容量のα２６チ計算アッセイ：ケーキＩＫ４
当たシ１６０ｇｂＧＨ濃縮率：１．６２ 実施例９ 溶解ステップ 第２水洗（実施例８）で得た湿潤ケーキ（Ｌ３１Ｋｐ）
を洗浄ケーキｉＫｆ当たシ２５ｊ１（全部で３１６ＪＩ
）の発熱物質を含有しない脱イオン水に懸濁した。この
ケーキを分散させるＫａ／リドロン（Ｐｏｊｌｙｔｒｏ
ｎ）高剪断ずキサ−が役に立つ。１ＯＮＮａＯＨを加え
てｐＨをゆつくシＩＬ８に調整した。凝集ｂＧＭ１時間
かかってゆつ〈シと溶解した。１時間インキュベートし
た後、溶液ＫＩＭホウ酸ナトリウム（＋）Ｈｌｌ、８）
を加えてホウ酸ナトリウム１０ｍＭの最終溶液にした。
プ収率：９９チ 総合収率：８５６％最終容量：初期
細胞懸濁液容量のα２６チ計算アッセイ：ケーキＩＫ４
当たシ１６０ｇｂＧＨ濃縮率：１．６２ 実施例９ 溶解ステップ 第２水洗（実施例８）で得た湿潤ケーキ（Ｌ３１Ｋｐ）
を洗浄ケーキｉＫｆ当たシ２５ｊ１（全部で３１６ＪＩ
）の発熱物質を含有しない脱イオン水に懸濁した。この
ケーキを分散させるＫａ／リドロン（Ｐｏｊｌｙｔｒｏ
ｎ）高剪断ずキサ−が役に立つ。１ＯＮＮａＯＨを加え
てｐＨをゆつくシＩＬ８に調整した。凝集ｂＧＭ１時間
かかってゆつ〈シと溶解した。１時間インキュベートし
た後、溶液ＫＩＭホウ酸ナトリウム（＋）Ｈｌｌ、８）
を加えてホウ酸ナトリウム１０ｍＭの最終溶液にした。
この溶液を３０分間保持し、その後６５チ動力でヒート
システム（Ｈｅａｔ ５ｙｓｔｕｎ） ３７０Ｗモデル
を通して音波処理した。音波処理機への供給速度は１８
Ｌ／時であった。溶液が非常に濁っている場合には、Ｃ
ＥＰＡ １０１を通して３０Ｌ／時で遠心した。
システム（Ｈｅａｔ ５ｙｓｔｕｎ） ３７０Ｗモデル
を通して音波処理した。音波処理機への供給速度は１８
Ｌ／時であった。溶液が非常に濁っている場合には、Ｃ
ＥＰＡ １０１を通して３０Ｌ／時で遠心した。
そうでない場合には単一のブ７ナー（Ｂｕｃｈｎｅｒ）
フィルター中で３枚の直径２４５Ｉのワットマン（Ｗｈ
ａ ｔｍａｎ ）Ｎｏ、 ２ペーパーを通して５−Ｌ部
に濾過した。濾過中泡立ちを防ぐために真空度を調節し
た。不溶物は微量だけだった。濾過物（３２−６Ｌ）は
溶液中にｂＧＨを含有している。
フィルター中で３枚の直径２４５Ｉのワットマン（Ｗｈ
ａ ｔｍａｎ ）Ｎｏ、 ２ペーパーを通して５−Ｌ部
に濾過した。濾過中泡立ちを防ぐために真空度を調節し
た。不溶物は微量だけだった。濾過物（３２−６Ｌ）は
溶液中にｂＧＨを含有している。
透明溶液の吸光度は２ｇｏｎｍ（セル１釧）で９．１０
、Ｄ、であった。この吸光度が全てｂＧＨＫ起因する（
そうではないが）のであれば、これは１４．３ｇｂＧＨ
／／Ｌに相当するであろう。実際のｂＧＨ含有量はこの
値の半分未満である。ＵＶを吸収する不純物がこの相違
の原因である。２８０ｎｍ（セル１０）で１．０の吸光
度はｐＨ９の純粋なりＧＨの１．５７ ｇ／ｉ溶液に相
当する。（ｂＧＨの吸光度はｐＨによって変化する。）
溶解用緩衝液（ＩＭホウ酸ナトリウム、ｐＨＩＬ８）ニ
ホウ酸６１．８ｇを脱イオン水７５０ｍに溶解し、５０
％ＮａＯＨでｐＨを１１８に調整する。脱イオン水で最
終容量１２に希釈する。
、Ｄ、であった。この吸光度が全てｂＧＨＫ起因する（
そうではないが）のであれば、これは１４．３ｇｂＧＨ
／／Ｌに相当するであろう。実際のｂＧＨ含有量はこの
値の半分未満である。ＵＶを吸収する不純物がこの相違
の原因である。２８０ｎｍ（セル１０）で１．０の吸光
度はｐＨ９の純粋なりＧＨの１．５７ ｇ／ｉ溶液に相
当する。（ｂＧＨの吸光度はｐＨによって変化する。）
溶解用緩衝液（ＩＭホウ酸ナトリウム、ｐＨＩＬ８）ニ
ホウ酸６１．８ｇを脱イオン水７５０ｍに溶解し、５０
％ＮａＯＨでｐＨを１１８に調整する。脱イオン水で最
終容量１２に希釈する。
アッセイ法：洗浄ケーキと溶解ｂＧＨに対する定量ゲル
走査 ステップ収″＄：１００チ 総合収率：８＆６チ最終
容量：初期細胞懸濁液容量の＆８チ計算アッセイ： ６
．２ ｇ ｂＧＨ／４濃縮率：０．０３９ 実施例１０ １００Ｋ 限外濾過 透明なタフ Ａり質溶液（３Ｌ６４！、２９７．０００
０Ｄ）（実施例９）を別の部分（６ｘａ４ＪＩ）に分割
した。これらは各々ｓｏ、ｏｏｏ〜６０，０ＯＯＯＤの
吸光波を有していた。面積が５ｆｔ”の１００，０００
の分子址カットオフカセット（タイプＰＴＨＫ）を３個
備えたペリコンカセット システム（Ｐｅｊｌｊｌｉｃ
ｏｎ（９Ｃａｓａ＊ｔｔ＊５ｙｓｔ＠ｍ）限外濾過器（
ミリポア（ＭｉＡｊｌｌｐｏｒｓ）、ベッドフォード（
Ｂｅｄｆｏｒｄ）、マサチューセッツ州）ｔ−通して各
部を別々に限外濾過した。第１の部分をＩＬの保留物（
すなわち濾過されずに残る残留物、ｒ＠ｔｓｎｔｍｔｅ
）容量に濃縮した。限外濾液を集め、膠でアッセイし、
貯蔵した。保留物を新たな１０ｍＭ容量にした。限外濾
液を集め、最初の限外濾液と合わせた。限外濾液中の総
流量のＯＤ吸光が限外濾過器に入れた最初の菫のＯＤ吸
光の２０％に等しくなったとき、次の濃縮の際の保留物
容閂はＩＬの代わＤＫα５Ｌにした。濃縮と１０ｍＭホ
ウ酸ナトリウム緩衝液希釈のサイクルは、０．５Ｌの保
留物容警からの限外ｆＩａＬ液の２８０ｎｍ（セルｘｃ
ｒＲ）の吸光度が０．１未満になるまで続けた。これに
は通常限外濾過と希釈が９〜１２サイクル必要である。
走査 ステップ収″＄：１００チ 総合収率：８＆６チ最終
容量：初期細胞懸濁液容量の＆８チ計算アッセイ： ６
．２ ｇ ｂＧＨ／４濃縮率：０．０３９ 実施例１０ １００Ｋ 限外濾過 透明なタフ Ａり質溶液（３Ｌ６４！、２９７．０００
０Ｄ）（実施例９）を別の部分（６ｘａ４ＪＩ）に分割
した。これらは各々ｓｏ、ｏｏｏ〜６０，０ＯＯＯＤの
吸光波を有していた。面積が５ｆｔ”の１００，０００
の分子址カットオフカセット（タイプＰＴＨＫ）を３個
備えたペリコンカセット システム（Ｐｅｊｌｊｌｉｃ
ｏｎ（９Ｃａｓａ＊ｔｔ＊５ｙｓｔ＠ｍ）限外濾過器（
ミリポア（ＭｉＡｊｌｌｐｏｒｓ）、ベッドフォード（
Ｂｅｄｆｏｒｄ）、マサチューセッツ州）ｔ−通して各
部を別々に限外濾過した。第１の部分をＩＬの保留物（
すなわち濾過されずに残る残留物、ｒ＠ｔｓｎｔｍｔｅ
）容量に濃縮した。限外濾液を集め、膠でアッセイし、
貯蔵した。保留物を新たな１０ｍＭ容量にした。限外濾
液を集め、最初の限外濾液と合わせた。限外濾液中の総
流量のＯＤ吸光が限外濾過器に入れた最初の菫のＯＤ吸
光の２０％に等しくなったとき、次の濃縮の際の保留物
容閂はＩＬの代わＤＫα５Ｌにした。濃縮と１０ｍＭホ
ウ酸ナトリウム緩衝液希釈のサイクルは、０．５Ｌの保
留物容警からの限外ｆＩａＬ液の２８０ｎｍ（セルｘｃ
ｒＲ）の吸光度が０．１未満になるまで続けた。これに
は通常限外濾過と希釈が９〜１２サイクル必要である。
最後の保留物は捨てた。限外濾過の流速は表１に示す。
その後限外濾液を全部合わせ、６Ｎ ＨＣｊｌでｐＨを
９０にｔＡ整した。別の１４−Ｌ部を同様にペリコンシ
ステム（Ｐｅｊｌｆｌｅｏｎ（９Ｓｙｓｔｅｍ ）を通
して処理し、ＰＨｔＡ！Ｉした限外＠液を全部合わせた
。典型例では、吸光度がα２ａｏＤ／ｄの限外濾液が全
部で３８０に得られ（これは１００，０００（ｐＨ１２
）の全００１１ＫＫ等しい）、完了まで１ｃ２４〜４０
時間を要した。
９０にｔＡ整した。別の１４−Ｌ部を同様にペリコンシ
ステム（Ｐｅｊｌｆｌｅｏｎ（９Ｓｙｓｔｅｍ ）を通
して処理し、ＰＨｔＡ！Ｉした限外＠液を全部合わせた
。典型例では、吸光度がα２ａｏＤ／ｄの限外濾液が全
部で３８０に得られ（これは１００，０００（ｐＨ１２
）の全００１１ＫＫ等しい）、完了まで１ｃ２４〜４０
時間を要した。
速度
（注〕入口圧力”Ｐ”ｌ［ｒｓ 背圧５ ｐｓ１ｇアッ
セイ法：入口供給物に対する定量ゲル走介と出口産物に
対する２８０Ｄｍ（セル１ｍ）吸光度菖定性ゲルクロマ
トグラフィー ステップ収率：ｙａｓｌ 総合収率：６４．６％
最終容ｉｔ：初期細胞懸濁液容量の７６チ計算アツセイ
？ ０．４ ｇ ｂＧＨ／１濃縮率？０．０６５ 供給物、保留物および限外濾液は各々、分離の程度と質
を決定するためにセファロ−１（Ｓａｐｈａｒｏｓｅ■
）ＣＬ−６Ｂ （ファルマシア ファイン ケミカルズ
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ ＣｈｅｒｎｌｃｍＡ
ｇ）、ビスカタウエイ（Ｐ ｉ ｍ ｅａ ｔａｗｎｙ
） 、 ニューシャーシー州）ゲルクロマトグラフィー
で検査した。
セイ法：入口供給物に対する定量ゲル走介と出口産物に
対する２８０Ｄｍ（セル１ｍ）吸光度菖定性ゲルクロマ
トグラフィー ステップ収率：ｙａｓｌ 総合収率：６４．６％
最終容ｉｔ：初期細胞懸濁液容量の７６チ計算アツセイ
？ ０．４ ｇ ｂＧＨ／１濃縮率？０．０６５ 供給物、保留物および限外濾液は各々、分離の程度と質
を決定するためにセファロ−１（Ｓａｐｈａｒｏｓｅ■
）ＣＬ−６Ｂ （ファルマシア ファイン ケミカルズ
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ ＣｈｅｒｎｌｃｍＡ
ｇ）、ビスカタウエイ（Ｐ ｉ ｍ ｅａ ｔａｗｎｙ
） 、 ニューシャーシー州）ゲルクロマトグラフィー
で検査した。
ゲルカラム条件は次の通シ。
直径１６ ｃｍ Ｘ長さ１００ｃｒｎ
全容量： ５００ｍＬ 空隙容ｉｉ （ｖｏｉｄ
ｖｏｌｕｍｅ） ：１５０ｍＬ流ｉ１ｉ ： ＋０〜６
０ｍＬ／時 負荷：５ｍＬ 中 ５００Ｄ 溶出液：１０ｍＭホウ酸ナトリウム、ｐＨ１２通常流出
時間：５時間 検出： ２８０ＤｍＵＶ ゲルクロマトグラフィー用緩衝液（１０ｍＭホウ酸ナト
リウム、ｐＨ１２）： 実施例９に記載のようにして調製。
ｖｏｌｕｍｅ） ：１５０ｍＬ流ｉ１ｉ ： ＋０〜６
０ｍＬ／時 負荷：５ｍＬ 中 ５００Ｄ 溶出液：１０ｍＭホウ酸ナトリウム、ｐＨ１２通常流出
時間：５時間 検出： ２８０ＤｍＵＶ ゲルクロマトグラフィー用緩衝液（１０ｍＭホウ酸ナト
リウム、ｐＨ１２）： 実施例９に記載のようにして調製。
実施例１１
イオン交換り四マドグラフィー
実施例１０の１００に限外濾過で得た限外瀘液全＃（３
８０１、吸光度Ｚｏｏ、００００Ｄ）を線流速９３備／
時（ＩＱＱＬ／時）のセファロース（Ｓｅｐｈａｒａ＋
ｌ０）ＣＬ −６Ｂ ＤＥＡＥ イオン交換カラム（
ファルマシア ファイン ケミカルズ（Ｐｈａｒｍａａ
ｌａ ＦｉｎｓＣｈｅｍｉｃａｌｇ）、ピスカタウエイ
（Ｐｌｉｅａｔａｗａｙ）、ニューシャーシー州）に載
せた。直径３７６ｎ、高さ１５ａのカラムを固定比容ｔ
（ｂＪ＋Ｉｖｏｊｌｕｍｓ）の２倍ｔ（３２Ｌ）の１０
ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ＰＨ９、Ｏ）で洗浄し、
充填（２ｏａｄｉｎｇ）ステップと洗浄ステップの溶出
液を捨てた。溶出液を１０ｔｎＭホウ酸ナトリウム：１
００ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ９）Ｋ段階的に変えてｂ
ＧＨをカラムから溶出した。溶出流速は９３倒／時であ
った。溶出の進行は溶出液の２８０Ｄｒｎ吸光度を測っ
てモニターした。ｂＧＨのピークは４〜５固定床容量で
集め（８４１、全吸光［４３，０ＯＯＯＤ）、貯蔵した
。ｂＧＨＪＨ分の平均濃度はα８ｇｂＧＨ／Ｉｔであっ
た。
８０１、吸光度Ｚｏｏ、００００Ｄ）を線流速９３備／
時（ＩＱＱＬ／時）のセファロース（Ｓｅｐｈａｒａ＋
ｌ０）ＣＬ −６Ｂ ＤＥＡＥ イオン交換カラム（
ファルマシア ファイン ケミカルズ（Ｐｈａｒｍａａ
ｌａ ＦｉｎｓＣｈｅｍｉｃａｌｇ）、ピスカタウエイ
（Ｐｌｉｅａｔａｗａｙ）、ニューシャーシー州）に載
せた。直径３７６ｎ、高さ１５ａのカラムを固定比容ｔ
（ｂＪ＋Ｉｖｏｊｌｕｍｓ）の２倍ｔ（３２Ｌ）の１０
ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ＰＨ９、Ｏ）で洗浄し、
充填（２ｏａｄｉｎｇ）ステップと洗浄ステップの溶出
液を捨てた。溶出液を１０ｔｎＭホウ酸ナトリウム：１
００ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ９）Ｋ段階的に変えてｂ
ＧＨをカラムから溶出した。溶出流速は９３倒／時であ
った。溶出の進行は溶出液の２８０Ｄｒｎ吸光度を測っ
てモニターした。ｂＧＨのピークは４〜５固定床容量で
集め（８４１、全吸光［４３，０ＯＯＯＤ）、貯蔵した
。ｂＧＨＪＨ分の平均濃度はα８ｇｂＧＨ／Ｉｔであっ
た。
固定床を９３ｃＩＩ！／時の速度で次のように洗浄して
カラムを再生した。すなわち、ＨＣｌでｐＨ＆０に調整
した１固定床容量の１Ｍ酢酸ナトリウムをカラムに流し
、次いでＬ５倍固定床容量の０．５ＮＮａＯＨを流した
。ＮａＯＨで処理した後、カラムを２時間放置し、その
後ＨＣＡでｐＨ１０に調整したＬ５５倍固定床容量１Ｍ
酢酸す）リウムでカラムを洗浄した。次にイオン交換固
定床に少なくとも３倍固定床答葉の１０ｍＭホウ酸ナト
リウム（ｐＨ９）を流して固定床を平衡化した。溶出液
の伝導度とｐＨは新来の溶液に対してチェックすべきで
ある。
カラムを再生した。すなわち、ＨＣｌでｐＨ＆０に調整
した１固定床容量の１Ｍ酢酸ナトリウムをカラムに流し
、次いでＬ５倍固定床容量の０．５ＮＮａＯＨを流した
。ＮａＯＨで処理した後、カラムを２時間放置し、その
後ＨＣＡでｐＨ１０に調整したＬ５５倍固定床容量１Ｍ
酢酸す）リウムでカラムを洗浄した。次にイオン交換固
定床に少なくとも３倍固定床答葉の１０ｍＭホウ酸ナト
リウム（ｐＨ９）を流して固定床を平衡化した。溶出液
の伝導度とｐＨは新来の溶液に対してチェックすべきで
ある。
アッセイ法７２８０ｎｍ吸収（セル１６ｎ）ステップ収
率：４３チ 総合収率：２７．７チ最終容ｔｉｔ：初
期細胞懸濁液容址の１６．８％計算アッセイ？ ０．８
ｇ ｂＧＨ／Ｌ濃縮率：２ カラム洗浄用緩衝液（１０ｍＭホウ酸ナトリウム、ｐＨ
９）； 脱イオン水７５０ｍＬ中のホウ酸０．６２ ｇのｐＨを
ｄＨｃＡで１０に調整し、脱イオン水でＩＬに希釈し、
必要に応じてｐ Ｈ９，ＯＫ再調整した。
率：４３チ 総合収率：２７．７チ最終容ｔｉｔ：初
期細胞懸濁液容址の１６．８％計算アッセイ？ ０．８
ｇ ｂＧＨ／Ｌ濃縮率：２ カラム洗浄用緩衝液（１０ｍＭホウ酸ナトリウム、ｐＨ
９）； 脱イオン水７５０ｍＬ中のホウ酸０．６２ ｇのｐＨを
ｄＨｃＡで１０に調整し、脱イオン水でＩＬに希釈し、
必要に応じてｐ Ｈ９，ＯＫ再調整した。
溶出用緩衝ｉ（１０ｍＭホウ酸ナトリウム、１００ｍＭ
塩化ナトリウム、Ｐ）（９）： 脱イオン水７５０ｍＬ中のホウ酸ナトリウム寸水和物１
８１ ｇと塩化す） Ｉ）ラム＆８５ｇのｐＨを讃ＨＣ
ＪＩで９．０に調整し、脱イオン水でＩＬに希釈し、必
要に応じてｐ Ｈ９，０に再調整した。
塩化ナトリウム、Ｐ）（９）： 脱イオン水７５０ｍＬ中のホウ酸ナトリウム寸水和物１
８１ ｇと塩化す） Ｉ）ラム＆８５ｇのｐＨを讃ＨＣ
ＪＩで９．０に調整し、脱イオン水でＩＬに希釈し、必
要に応じてｐ Ｈ９，０に再調整した。
再生用緩衝液（１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ１０）脱イオ
ン水７５０ｄ中の酢酸ナトリウム３Ｈ２０１３６，０９
ｇのｐＨを＃ＨＣＡで３．０に調整し、脱イオン水でＩ
ＬＫ希釈し、必要に応じてｐＨλＯＫ再調整した。
ン水７５０ｄ中の酢酸ナトリウム３Ｈ２０１３６，０９
ｇのｐＨを＃ＨＣＡで３．０に調整し、脱イオン水でＩ
ＬＫ希釈し、必要に応じてｐＨλＯＫ再調整した。
実施例１２
濃縮と透析
イオン交換ステップ（実施例１１）で得たｂＧＨ画分（
８４ｋ、４３，００００ Ｄ）のｐＨをＩ Ｎ ＮａＯ
Ｈで１０．ｂ、Ｃｖ！４整Ｌ７’ｃ。調整溶液ヲ、５
ｆｔ”ノ１０，０００分子菫カットオフカセット（タイ
プＰＴＧＣ’）を３ｓ有するミリポア（Ｍ１ｂ、ｐｏｒ
＠）ペリコン（Ｐ＠４ｊｌｉｃｏｎ（８１）限外濾過器
を通す限外濾過によって、保留物の２８０ａｍ（セルｌ
儒）の計算吸光度が１０になるまで濃縮した。限外濾液
はｂＧＨを含んでおらず、捨てた。保留物の＃縮率は通
常約２０であった（保留物４．２１）。流量は表２に示
す。
８４ｋ、４３，００００ Ｄ）のｐＨをＩ Ｎ ＮａＯ
Ｈで１０．ｂ、Ｃｖ！４整Ｌ７’ｃ。調整溶液ヲ、５
ｆｔ”ノ１０，０００分子菫カットオフカセット（タイ
プＰＴＧＣ’）を３ｓ有するミリポア（Ｍ１ｂ、ｐｏｒ
＠）ペリコン（Ｐ＠４ｊｌｉｃｏｎ（８１）限外濾過器
を通す限外濾過によって、保留物の２８０ａｍ（セルｌ
儒）の計算吸光度が１０になるまで濃縮した。限外濾液
はｂＧＨを含んでおらず、捨てた。保留物の＃縮率は通
常約２０であった（保留物４．２１）。流量は表２に示
す。
ｂＧＨを濃縮した後、ｌ０ＫＩＩＩＬＷ、カットオフカ
セットを有するペリコン システム（ｐ・１１ｅｏｎ■
Ｓｙｓｔｅｍ）を用いてＮＨＩＯＨに対して溶液を透析
することで脱塩した（透析濾過、ｄｌａｆ １Ａｔｒａ
ｔｉｏｎ）。
セットを有するペリコン システム（ｐ・１１ｅｏｎ■
Ｓｙｓｔｅｍ）を用いてＮＨＩＯＨに対して溶液を透析
することで脱塩した（透析濾過、ｄｌａｆ １Ａｔｒａ
ｔｉｏｎ）。
３ ｍ Ｍ ＮＨ４０Ｈ溶液（係留物容量に対して２５
倍容菫、すなわちこの場合は３ｒｎＭ ’Ｎ’ｌ’ｋＯ
Ｈ１０５ＩＩ ）を透析濾過による容量損失を償うに丁
度充分な割合で連続的に保留物に加えた。次いで透析−
過物を捨てた。とれには塩と供給ｂＧＨのｌＯチ（吸光
測定）が含まれている。脱塩したｂＧＨを含有する保留
物ヲペリコン システム（ＰａｆｊｔＩｃｏｎ” Ｓｙ
ｓｔｅｍ）から取り、限外フィルターを少量の３ ｍ
Ｍ ＮＨ４ＯＨで洗ってこれを保留物と合わせた。この
洗液を加える前の係留物容量は１＜、ｅ ｇ ｂＧＨＡ
の１度で４、２１（３９，００００Ｄ）であった。流量
を表３に示す。
倍容菫、すなわちこの場合は３ｒｎＭ ’Ｎ’ｌ’ｋＯ
Ｈ１０５ＩＩ ）を透析濾過による容量損失を償うに丁
度充分な割合で連続的に保留物に加えた。次いで透析−
過物を捨てた。とれには塩と供給ｂＧＨのｌＯチ（吸光
測定）が含まれている。脱塩したｂＧＨを含有する保留
物ヲペリコン システム（ＰａｆｊｔＩｃｏｎ” Ｓｙ
ｓｔｅｍ）から取り、限外フィルターを少量の３ ｍ
Ｍ ＮＨ４ＯＨで洗ってこれを保留物と合わせた。この
洗液を加える前の係留物容量は１＜、ｅ ｇ ｂＧＨＡ
の１度で４、２１（３９，００００Ｄ）であった。流量
を表３に示す。
速度
（注）入口圧力２０ｐｓ Ｉｇ 、 背圧１０ｐａ
１ｇ（注）入口圧力 １５ｐ＠１ｇ、 背圧 ５
ｐｓｉｇアッセイ法７２８０ｎｍ吸収（セル１−）ステ
ップ収率：９０チ 総合収率：２５チ最終容１：：初
期細胞懸濁液容量の０．８４％計算アッセイ： １４．
６ ｇ ｂＧ）ｆ／Ｌ濃縮率：１＆３ 実施例１３ 保給乾燥 透析ステップで得た保留物と洗ｉ（４，２ｘ、濃度１４
．６ ｇ ｂＧＨ／Ｌで３９．００００Ｄ）を背の高い
ガラスジャー中でシェル凍結した。とのジャーは、内容
物が凍結乾固されるまで２４〜４８時間実験室用（Ｎａ
ｂ）凍結乾燥器に連結した。ジャーの外面Ｆｉ乾燥サす
クル中室温にさらしておいた。検出できるほどのｂＧＨ
損失はなかった。ｂＧＨ（６１３ｇ）をふわふわした綿
毛状の白色粉末として得た。
１ｇ（注）入口圧力 １５ｐ＠１ｇ、 背圧 ５
ｐｓｉｇアッセイ法７２８０ｎｍ吸収（セル１−）ステ
ップ収率：９０チ 総合収率：２５チ最終容１：：初
期細胞懸濁液容量の０．８４％計算アッセイ： １４．
６ ｇ ｂＧ）ｆ／Ｌ濃縮率：１＆３ 実施例１３ 保給乾燥 透析ステップで得た保留物と洗ｉ（４，２ｘ、濃度１４
．６ ｇ ｂＧＨ／Ｌで３９．００００Ｄ）を背の高い
ガラスジャー中でシェル凍結した。とのジャーは、内容
物が凍結乾固されるまで２４〜４８時間実験室用（Ｎａ
ｂ）凍結乾燥器に連結した。ジャーの外面Ｆｉ乾燥サす
クル中室温にさらしておいた。検出できるほどのｂＧＨ
損失はなかった。ｂＧＨ（６１３ｇ）をふわふわした綿
毛状の白色粉末として得た。
アッセイ法：供給物に対する吸光度と乾燥ｂＧＨに対す
る放出アッセイ（ｒＪＩｅａａａ ■５ａｙ）ステップ
収率：１００％ 総合収率：２５チ最終容ｔ：初期細
胞懸濁液容量の０．０１２チ計算アツセイ＝１００チマ
ツ７ユ容電 ａ綿率：６８
る放出アッセイ（ｒＪＩｅａａａ ■５ａｙ）ステップ
収率：１００％ 総合収率：２５チ最終容ｔ：初期細
胞懸濁液容量の０．０１２チ計算アツセイ＝１００チマ
ツ７ユ容電 ａ綿率：６８
Claims (45)
- （１）真核生物の成長ホルモンまたはそのアナログをコ
ードしているＤＮＡ配列の発現によつてこのホルモンま
たはアナログを産生している細菌細胞から精製された真
核生物成長ホルモンまたはそのアナログを回収する方法
であつて、次のステップ： ａ、細菌細胞またはそのフラグメントの細胞壁を破砕し
て溶解物を生成する； ｂ、粒子と不溶物を含有する沈殿を溶解物から分離する
； ｃ、分離した沈殿を適当な緩衝溶液に懸濁して懸濁液を
調製する； ｄ、液体と固体の接触が起こるように懸濁液を処理する
； ｅ、固液接触した懸濁液から沈殿物を部分的または完全
に分離する； ｆ、分離した沈殿を充分な量の水溶液に可溶化し、ｐＨ
を適切なアルカリ性ｐＨに調整して溶液を形成する； ｇ、可溶化したホルモンまたはアナログを適切な条件で
の限外濾過によつて他の細胞成分から分離してホルモン
またはアナログを含有する限外濾液と保留物とを生成す
る； ｈ、ホルモンまたはアナログをさらに精製濃縮するよう
に可溶化ホルモンまたはアナログを処理し、こうして精
製されたホルモンまたはアナログを回収する； からなる方法。 - （２）ホルモンまたはアナログが動物の成長ホルモンま
たはそのアナログであることを特徴とする特許請求の範
囲第１項に記載の方法。 - （３）ホルモンまたはアナログがウシ成長ホルモンまた
はそのアナログであることを特徴とする特許請求の範囲
第２項に記載の方法。 - （４）アナログが天然のウシ成長ホルモンのフェニルア
ラニン形のＮ−末端に付加されたアミノ酸配列Ｍｅｔ−
Ａｓｐ−Ｇｌｎを含み、細菌細胞が大腸菌（￥Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ￥ ￥ｃｏｌｉ￥）菌株ＡＴＣＣ Ｎｏ
．３９８０６であることを特徴とする特許請求の範囲第
３項に記載の方法。 - （５）アナログが天然のウシ成長ホルモンのフェニルア
ラニン形のＮ−末端に付加されたメチオニン残基を含み
、細菌細胞が大腸菌（￥Ｅｓｃｈｅｉｃｈｉａ￥ ￥ｃ
ｏｌｉ￥）菌株ＡＴＣＣ Ｎｏ．３９７８５であること
を特徴とする特許請求の範囲第３項に記載の方法。 - （６）ホルモンまたはアナログがヒト成長ホルモンまた
はそのアナログであることを特徴とする特許請求の範囲
第１項に記載の方法。 - （７）アナログがＭｅｔ＾１＾４で始まる天然のヒト成
長ホルモンのアミノ酸配列からなり、細菌細胞が大腸菌
（￥Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ￥ ￥ｃｏｌｉ￥）菌株Ａ
ＴＣＣ Ｎｏ．３９３８６であることを特徴とする特許
請求の範囲第６項に記載の方法。 - （８）アナログが、Ｎ−末端にメチオニンが付いた天然
のヒト成長ホルモンのアミノ酸配列からなり、細菌細胞
が大腸菌（￥Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ￥ ￥ｃｏｌｉ￥
）菌株ＡＴＣＣ Ｎｏ．３９３８４であることを特徴と
する特許請求の範囲第６項に記載の方法。 - （９）ホルモンがブタ成長ホルモンまたはそのアナログ
であることを特徴とする特許請求の範囲第２項に記載の
方法。 - （１０）アナログが天然のブタ成長ホルモンのフェニル
アラニン形のＮ−末端に付加されたメチオニン残基を含
み、細菌細胞が大腸菌（￥Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ￥
￥ｃｏｌｉ￥）菌株ＡＴＣＣ Ｎｏ．３９８０４である
ことを特徴とする特許請求の範囲第９項に記載の方法。 - （１１）ホルモンまたはアナログがニワトリ成長ホルモ
ンまたはそのアナログであることを特徴とする特許請求
の範囲第２項に記載の方法。 - （１２）アナログが天然のニワトリ成長ホルモンのフェ
ニルアラニン形のＮ−末端に付加されたメチオニン残基
を含み、細菌細胞が大腸菌（￥Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
￥ ￥ｃｏｌｉ￥）菌株ＡＴＣＣ Ｎｏ．３９７９２で
あることを特徴とする特許請求の範囲第１１項に記載の
方法。 - （１３）ステップ（ａ）の前に細菌細胞またはそのフラ
グメントを発酵マツシユ中に懸濁維持するかまたは中性
ｐＨの適切な緩衝溶液中に懸濁することを特徴とするこ
とを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。 - （１４）中性ｐＨが約７．４であることを特徴とする特
許請求の範囲第１３項に記載の方法。 - （１５）ステップ（ａ）において細胞を機械的に破砕す
ることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法
。 - （１６）粒状物を分離する前に溶解物を適切な量の脱イ
オン水で希釈することを特徴とする特許請求の範囲第１
項に記載の方法。 - （１７）ステップ（ｂ）またはステップ（ｅ）における
分離が遠心からなることを特徴とする特許請求の範囲第
１項に記載の方法。 - （１８）ステップ（ｂ）またはステップ（ｅ）における
分離が限外濾過からなることを特徴とする特許請求の範
囲第１項に記載の方法。 - （１９）ステップ（ｄ）における処理がさらに、懸濁液
中に存在するポリサッカライドを消化し得る適当な酵素
に懸濁液を適切な時間接触させることも含むことを特徴
とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。 - （２０）適当な酵素がリゾチームであることを特徴とす
る特許請求の範囲第１９項に記載の方法。 - （２１）ステップ（ｄ）における液体と固体間の接触を
生起させる処理が音波処理からなることを特徴とする特
許請求の範囲第１項に記載の方法。 - （２２）さらに、ステップ（ｄ）の懸濁液の固液接触処
理の前に、適当な界面活性剤を適切な量で懸濁液に加え
、さらに適切な時間懸濁液をインキュベートするステッ
プをも含むことを特徴とする特許請求の範囲第１項に記
載の方法。 - （２３）ステップ（ｅ）において固液接触した懸濁液か
ら部分的または完全に分離した沈殿物を適切な量の適当
な媒体に再懸濁し、こうして調製した懸濁液を適切な条
件で固液接触させ、得られた沈殿物をステップ（ｆ）で
可溶化する前に固液接触した懸濁液から分離することを
特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。 - （２４）適当な媒体が緩衝されたかまたはされていない
水溶液であることを特徴とする特許請求の範囲第２３項
に記載の方法。 - （２５）さらに少なくとも１回得られた沈殿を再懸濁し
、固液接触させ、分離することを特徴とする特許請求の
範囲第２３項に記載の方法。 - （２６）ステップ（ｆ）において可溶化するための適切
なアルカリ性ｐＨが約９．０〜１２．０のｐＨであるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。 - （２７）約９．０〜１２．０のｐＨで沈殿を可溶化した
後にｐＨを約１０．５まで下げることを特徴とする特許
請求の範囲第２６項に記載の方法。 - （２８）ステップ（ｆ）で得られた溶液に適切に濃縮さ
れたホウ酸ナトリウム水溶液を適当な量加えることを特
徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。 - （２９）さらに、ステップ（ｆ）で得られた溶液を適当
な条件で固液接触させ、固液接触した溶液を適切な条件
で遠心し、上澄液を分離し、この液を濾過することによ
つて溶液を清澄にしてホルモンまたはアナログを含有す
る透明溶液を生成することを含むことを特徴とする特許
請求の範囲第１項に記載の方法。 - （３０）ステップ（ｇ）の限外濾過による分離を、カッ
トオフ点が約１００Ｋ Ｍ．Ｗ．の適当な膜を用いて実
施することを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の
方法。 - （３１）ステップ（ｇ）で得られた保留物をステップ（
ｈ）の処理前またはその後少なくとも１回の限外濾過に
再度付すことを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載
の方法。 - （３２）限外濾過に再度付す前に適当なアルカリ性ｐＨ
の適切な緩衝液で保留物を希釈することを特徴とする特
許請求の範囲第３１項に記載の方法。 - （３３）適当なアルカリ性ｐＨが約９．０〜１２．０で
あることを特徴とする特許請求の範囲第３２項に記載の
方法。 - （３４）希釈と限外濾過を少なくとも１回繰り返すこと
を特徴とする特許請求の範囲第３２項に記載の方法。 - （３５）保留物を限外濾過の間実質的に一定の容量に維
持することを特徴とする特許請求の範囲第３１項に記載
の方法。 - （３６）実質的に一定の保留物容量での限外濾過を少な
くとも１回繰り返すことを特徴とする特許請求の範囲第
３５項に記載の方法。 - （３７）ステップ（ｈ）における可溶化ホルモンの処理
がイオン交換クロマトグラフィーからなることを特徴と
する特許請求の範囲第１項に記載の方法。 - （３８）イオン交換クロマトグラフィーを、アミン含有
イオン交換樹脂を用いて実施することを特徴とする特許
請求の範囲第３７項に記載の方法。 - （３９）アミン含有イオン交換樹脂がジエチルアミノエ
チル−デキストランまたはセファロースであることを特
徴とする特許請求の範囲第３８項に記載の方法。 - （４０）精製されたホルモンまたはアナログを限外濾過
によつて濃縮することを特徴とする特許請求の範囲第１
項に記載の方法。 - （４１）精製されたホルモンまたはアナログを透析とそ
れに続く乾燥によつてさらに精製することを特徴とする
特許請求の範囲第１項に記載の方法。 - （４２）透析が適当な塩を適切な濃度で含有する溶液に
対するものであることを特徴とする特許請求の範囲第４
１項に記載の方法。 - （４３）適当な塩が水酸化アンモニウムまたは重炭酸ア
ンモニウムであることを特徴とする特許請求の範囲第４
２項に記載の方法。 - （４４）乾燥を凍結乾燥によつて行なうことを特徴とす
る特許請求の範囲第４１項に記載の方法。 - （４５）乾燥を適当な条件でのスプレー乾燥によつて行
なうことを特徴とする特許請求の範囲第４１項に記載の
方法。
Applications Claiming Priority (4)
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|---|---|---|---|
| US64443584A | 1984-08-27 | 1984-08-27 | |
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| US644435 | 1996-05-13 | ||
| US734450 | 2003-12-12 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| JPH0655154B2 JPH0655154B2 (ja) | 1994-07-27 |
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|---|---|---|---|
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| CA (1) | CA1267615A (ja) |
| DE (1) | DE3587391T2 (ja) |
| DK (1) | DK174889B1 (ja) |
| ES (1) | ES8606496A1 (ja) |
| GR (1) | GR852031B (ja) |
| HK (1) | HK147695A (ja) |
| HU (1) | HU201806B (ja) |
| IE (1) | IE58860B1 (ja) |
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