CN105247036B - 蛋白纯化的新颖方法 - Google Patents
蛋白纯化的新颖方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105247036B CN105247036B CN201480028322.5A CN201480028322A CN105247036B CN 105247036 B CN105247036 B CN 105247036B CN 201480028322 A CN201480028322 A CN 201480028322A CN 105247036 B CN105247036 B CN 105247036B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- addition
- culture
- das181
- cell
- edta
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 91
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 title description 12
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 18
- 108700013356 oplunofusp Proteins 0.000 claims description 77
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 59
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 claims description 41
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims description 22
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 claims description 22
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 22
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 claims description 22
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 22
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 22
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 15
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 14
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 11
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 5
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 3
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 22
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 abstract description 7
- 238000007599 discharging Methods 0.000 abstract description 4
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 69
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 27
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 26
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 24
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 24
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 23
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 22
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 22
- 239000000047 product Substances 0.000 description 19
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 18
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 18
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 17
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 16
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 16
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 16
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 15
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 14
- 229960001484 edetic acid Drugs 0.000 description 14
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 13
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 11
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 11
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 10
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 9
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 9
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 7
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 7
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 7
- 101000878457 Macrocallista nimbosa FMRFamide Proteins 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 6
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 5
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 5
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 5
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 5
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 4
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 4
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000013019 capto adhere Substances 0.000 description 4
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 2-(4-octylphenoxy)ethanol Chemical compound CCCCCCCCC1=CC=C(OCCO)C=C1 BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100037840 Dehydrogenase/reductase SDR family member 2, mitochondrial Human genes 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 101710188053 Protein D Proteins 0.000 description 3
- 101710132893 Resolvase Proteins 0.000 description 3
- -1 SDS Chemical compound 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 239000002585 base Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 3
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 3
- 230000009615 deamination Effects 0.000 description 3
- 238000006481 deamination reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 3
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 3
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 238000013060 ultrafiltration and diafiltration Methods 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 241000186044 Actinomyces viscosus Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000024720 Fabry Disease Diseases 0.000 description 2
- 208000015872 Gaucher disease Diseases 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001062009 Indigofera Species 0.000 description 2
- 208000015439 Lysosomal storage disease Diseases 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000012560 cell impurity Substances 0.000 description 2
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 2
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N dodecane Chemical compound CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N octyl beta-D-glucopyranoside Chemical compound CCCCCCCCO[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 239000012925 reference material Substances 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 102000007299 Amphiregulin Human genes 0.000 description 1
- 108010033760 Amphiregulin Proteins 0.000 description 1
- 208000010975 Dystrophic epidermolysis bullosa Diseases 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 206010053177 Epidermolysis Diseases 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 208000032007 Glycogen storage disease due to acid maltase deficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010053185 Glycogen storage disease type II Diseases 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100033448 Lysosomal alpha-glucosidase Human genes 0.000 description 1
- 208000002720 Malnutrition Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 239000004697 Polyetherimide Substances 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000005054 agglomeration Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 238000011021 bench scale process Methods 0.000 description 1
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005660 chlorination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 208000004298 epidermolysis bullosa dystrophica Diseases 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 150000004675 formic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 229930182478 glucoside Natural products 0.000 description 1
- 150000008131 glucosides Chemical class 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 201000004502 glycogen storage disease II Diseases 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000001071 malnutrition Effects 0.000 description 1
- 235000000824 malnutrition Nutrition 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 208000015380 nutritional deficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 238000000424 optical density measurement Methods 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 238000005498 polishing Methods 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000012609 strong anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 238000004879 turbidimetry Methods 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/36—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/485—Epidermal growth factor [EGF], i.e. urogastrone
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/06—Lysis of microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
- C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Mycology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本公开内容提供了用于释放细胞内蛋白的方法。该方法允许从细胞分离感兴趣的蛋白,不需机械破碎细胞、不需从培养基分离细胞且不需从培养基取出细胞。
Description
关于联邦政府资助的研究的声明
本文公开的本发明部分由政府资助做出,且政府在本发明中拥有某些权利。特别地,本文公开的本发明的部分部分地根据美国国立卫生研究院给予的合同号N01-AI-60015C得到资助。
发明领域
本发明总体上涉及从细胞培养物获取细胞内蛋白的新颖方法和试剂。
背景
围绕大规模纯化蛋白的关注对于生物技术产业是日益重要的问题。许多紊乱已是蛋白或酶替代疗法的主题,所述紊乱包括营养不良性大疱性表皮松解症(dystrophicepidermolysis bullosa)和溶酶体贮积紊乱(lysosomal storage disorders)诸如戈谢病(Gaucher disease)、法布里病(Fabry disease)和庞贝氏病(Pompe disease)。供应患者需要的大规模蛋白生产一定是成本敏感的,具有生产效率和出产高质量产品。蛋白纯化的过程是时间漫长的、繁重的和昂贵的。这些缺点大大地影响蛋白替代疗法的成本并通常对医疗保健构成巨大的挑战。
蛋白生产主要在细胞内完成,即,哺乳动物、细菌或真菌,它们通过插入包含用于该蛋白的基因的重组质粒被工程化以产生感兴趣的蛋白。在复合生长培养基中培养表达感兴趣的蛋白的细胞,该复合生长培养基包含通常由动物血清制剂提供的糖、氨基酸和生长因子。纯化需要从供给细胞的化合物和细胞碎片的混合物分离期望的蛋白以便以高质量纯化足够的量用作人类治疗剂。
用于从细胞碎片纯化蛋白的程序是漫长和复杂的。取出感兴趣的蛋白需要的多个和重复的步骤大大地降低最终蛋白的产率和质量。在许多情况下,蛋白在纯化后必须是功能性的。
在生物学表达系统的细胞内区室中表达的重组蛋白在存在细胞壁的情况下通常通过机械破碎从表达系统细胞释放。此类机械方法包括匀浆化、微流化、氮爆、超声和珠搅拌方法。其他方法包括添加酶以部分地降解细胞壁组分随后用渗透剂以诱导周质内含物的破裂和释放。结合酶消化和化学处理的这些方法主要用于在革兰氏阴性细菌中靶向周质间隙的表达的蛋白。没有细胞壁的细胞可通过渗透压而不不添加酶,或通过使用去垢剂或有机溶剂完全破碎细胞膜来破碎。为了提高效率可组合使用破碎方法。
大多数以前的方法仅适用于从周质区室释放蛋白或导致细胞区室完全破碎。当完全破碎细胞时,DNA可从亚细胞区室被释放并导致高粘性液体的形成。DNA可被剪切或酶促降解以降低粘性并使在大规模生产期间处理工艺流体流(the process fluid stream)成为可能。这些步骤成功地用于医药级蛋白的生产;然而,每个处理步骤增加了制造的复杂性,时间和成本。
发明概述
本公开内容提供了新颖方法和试剂,所述新颖方法和试剂涉及从存在于培养基中的细菌细胞特别是大肠杆菌(E.coli)纯化感兴趣的细胞内蛋白的方法,而(i)没有从培养基取出细胞,(ii)不使用细胞的机械破碎或不使用酶降解细胞壁;和(iii)没有将细胞群压实成浓缩的沉淀形式。
所公开的方法用于通过添加透化细胞用于释放重组蛋白的预定组合无机盐和去垢剂来释放细胞内的重组蛋白,而不导致细胞的全部破碎,从而减少DNA释放的量和产生的增加的粘度。
可通过在选择性沉淀后的离心步骤从可溶的重组蛋白纯化出剩余的细胞碎片。
该方法可通过一系列步骤完成,所述步骤包括在完成细胞培养(即,发酵)后将适当的化学试剂添加到生物反应器。以逐步的方式将这些化学试剂添加到培养物。还添加试剂以便实现该试剂的特定浓度。该方法需要化学试剂在溶液中的存在规定的时间量。
该方法不需要从细胞培养物分离细胞。另外,它不需要在添加试剂(“释放试剂”)前除去生长培养基。该方法不利用机械破碎裂解细胞。
这样做,该方法降低了制造的复杂性、时间和成本,同时由于减少的DNA释放而增加了稳健性。
本文件提供了用于从表达感兴趣的蛋白的细菌细胞或真菌释放感兴趣的蛋白的方法。该方法包括:(a)提供表达感兴趣的蛋白的细胞的培养物(例如,表达感兴趣的蛋白的细胞和细胞已被在其中培养的生长培养基);(b)使细胞培养物与无机盐相接触(例如,通过向培养物添加包含无机盐的组合物);(c)使包含添加的无机盐的培养物保持至少10分钟;(d)使包含添加的无机盐的培养物与螯合剂接触(例如,通过向培养物添加包含螯合剂的组合物);(e)使包含添加的无机盐和添加的螯合剂的培养物保持至少10分钟;(f)任选地将包含添加的无机盐和添加的螯合剂的培养物的pH调整至在4和9之间的pH;(g)在pH调整后使包含添加的无机盐和添加的螯合剂的培养物保持至少15分钟;(h)使包含添加的无机盐和添加的螯合剂的培养物与去垢剂接触;(i)使包含添加的无机盐、添加的螯合剂和添加的去垢剂的培养物保持至少1小时;(j)任选地使包含添加的无机盐、添加的螯合剂和添加的去垢剂的培养物的温度降低;(k)使包含添加的无机盐、添加的螯合剂和添加的去垢剂的培养物与沉淀剂接触;(l)使包含添加的无机盐、添加的螯合剂、添加的去垢剂和添加的沉淀剂的培养物保持至少1小时;和(m)使包含添加的无机盐、添加的螯合剂、添加的去垢剂和添加的沉淀剂的培养物经历除去大部分的(例如,至少90%)细胞碎片的方法。该方法不包括选自由以下组成的组的至少两个步骤:(i)机械破碎细胞,(ii)在添加前除去全部或基本上全部的培养基,和(iii)添加消化细胞壁材料的酶。在一些情况下,该方法不包括以下的任何一个:(i)机械破碎细胞,(ii)除去全部或基本上全部的培养基,和(iii)添加消化细胞壁材料的酶。以上方法还可包括除去部分或基本上全部的培养基。
在其中使用了无机盐的以上方法中,该无机盐可以是磷酸钠、硫酸铵和氯化钠。在其中使用了去垢剂的以上方法中,该去垢剂可以是Triton、SDS、CHAPS 3、Nonidet P40、n-辛基葡萄糖苷和吐温-20。以上方法还使用可选自Triton、SDS、CHAPS 3、Nonidet P40、n-辛基葡萄糖苷和吐温-20的两种去垢剂的混合物。以上方法还使用了沉淀剂,该沉淀剂可以是PEI、和铵盐、和聚乙二醇、TCA和乙醇。
在一些情况下,表达期望的蛋白的细胞是大肠杆菌。以上方法使用细菌细胞,其为革兰氏阴性菌。期望的蛋白是细胞内蛋白(即,其不是从细胞分泌的)。感兴趣的蛋白可以是DAS181。
在所有以上方法中,保持包含无机盐的培养物的步骤发生至少20分钟。在所有以上方法中,保持包含无机盐和螯合剂的培养物的步骤可以持续至少15分钟至少30分钟、45分钟或1小时或在30min和1小时之间。
在所有以上方法中,保持包含无机盐、螯合剂和去垢剂的培养物的步骤可发生至少1小时、至少30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、小时6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时或5-13小时。在所有以上方法中,保持包含无机盐、螯合剂、去垢剂和沉淀剂的培养物的步骤可发生至少1小时、至少30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时或5-13小时。
步骤可在混合物在25-35℃优选地30℃时发生。在添加沉淀剂之前,混合物的温度可被降到低于25℃,例如在25℃和20℃之间或降低到21℃和23℃之间。
附图说明
图1是新颖蛋白释放方案的实施方案的流程图。
图2是需要匀浆化裂解的蛋白释放方法相比于新颖蛋白释放方法(“去垢剂增溶”)的比较。
图3A-3E是匀浆化裂解方案和去垢剂增溶方案的SDS PAGE分析。图3A和B描述了由匀浆化方案(图3A)和去垢剂增溶方案(图3B)分离的蛋白的考马斯检测。图3C和D描述了由匀浆化方案(图3C)和去垢剂增溶方案(图3C)分离的蛋白的银检测。图3E是用银检测的SDS-PAGE比较凝胶。在图3A中,泳道1-9分别包含:分子量标志物、澄清的匀浆、SP流-通、SP洗脱物、HIC洗脱物、Post HIC TFF、RPC负载、RPC洗脱物,和DAS181 Ref Std 750-0406-002。在图3B中,泳道1-10分别包含:分子量标志物、PEI澄清的去垢剂、去垢剂SP负载、去垢剂SP流-通、去垢剂SP洗脱物、去垢剂HIC洗脱物、去垢剂Post-HIC TFF、RPC负载、RPC洗脱物和DAS181参考标准750-0406-002。在图3C中,泳道1-8分别包含:分子量标志物、澄清的匀浆、SP流-通、SP洗脱物、HIC洗脱物、Post HIC TFF、RPC洗脱物,和DAS181Ref Std 750-0406-002。
图4是去垢剂增溶的优化方法和蛋白纯化的步骤的流程图。
图5A-F是运行A和B的蛋白的分析。图A-C分别是运行A的去垢剂增溶产率的考马斯染色、蛋白印迹和银染分析。用于这些分析的泳道1-10分别为如下:MW标志物、SP洗脱物(Ferm 20110523F2)、HIC FT、UF/DF 1号池、Capto Adhere FT pH 7.7、滴定的CaptoAdhere FT pH 5.0、药物物质和DAS181Ref.Std。图D-F分别是运行B的去垢剂增溶产率的考马斯染色、蛋白印迹和银染分析。用于这些分析的泳道1-10分别为如下:MW标志物、SP洗脱物(Ferm 20110613F2)、HIC FT、UF/DF 1号池、Capto Adhere FT pH 7.7、滴定的CaptoAdhere FT pH 5.0、药物物质和DAS181参考标准Lot 46-012。
图6A和6B是DAS181纯度的SDS-PAGE分析。在图6A中显示:泳道1是MW标志物,泳道2是药物物质Ferm 20110523F2,泳道4&5是药物物质Ferm 20110613F2,且泳道6是DAS1812期参考标准Lot 46-012。在图6B中显示蛋白的不同浓度:8-20μg。
图7A-7C示出来自以下的DAS181的RP-HPLC比较:整合的运行A、整合的运行B和DAS181参考标准。
图8A-8C示出来自以下的DAS181的CEX-HPLC比较:整合的运行A、整合的运行B和DAS181参考标准。
图9是经过几周储存的DAS181稳定性的SDS-PAGE分析。
详述
本文描述的方法通常可被用于从细菌细胞特别是大肠杆菌释放细胞内蛋白。本文的实施例涉及从大肠杆菌释放DAS181(Malakhov等人,Antimicrob.Agents Chemother.,1470-1479(2006))。DAS181是融合蛋白,该融合蛋白包含来自人类双调蛋白的肝素(糖胺聚糖,或GAG)结合结构域,其通过其N-末端与粘放线菌(Actinomyces Viscosus)的催化结构域的C-末端融合(例如,在SEQ ID NO:1(无氨基末端蛋氨酸)和SEQ ID NO:2(包括氨基末端蛋氨酸)中列出的氨基酸序列)。本文描述的基因工程化细胞包含一种或更多种编码DAS181蛋白的核酸。适合体内产生DAS181或重组产生本文描述的任何多肽的细胞可以是细菌或真菌起源的。
可使用表达载体实现在细胞(例如,细菌细胞)中蛋白的过表达。表达载体可以是自主的或整合的。可以以表达载体诸如质粒的形式将重组核酸(例如,编码DAS181的重组核酸)引入到细胞中。重组核酸可以以染色体外形式维持或可将其整合入染色体DNA。表达载体可包含编码在选择条件下细胞存活所需要的蛋白的选择标志物基因以允许检测和/或选择转化了期望的核酸的那些细胞。表达载体可还包括自主复制序列(ARS)。
转化的细胞(即,细菌细胞)可通过使用适当的技术来选择,该技术包括但不限于,转化后在需要的生化产物不存在下培养营养缺陷型细胞,选择和检测新表型,或在抗生素的存在下培养,该抗生素在包含在转化子中的抗性基因不存在下对酵母是有毒的。还可通过将表达盒整合入通过例如DNA印迹或PCR分析来评估的基因组来选择和/或验证转化子。在将载体导入感兴趣的靶细胞前,载体可在如以上所述的细菌细胞诸如大肠杆菌(E.coli)中生长(例如,扩增)。可通过本领域已知的导致从细菌环境纯化载体DNA的任何方法从细菌细胞中分离载体DNA。纯化的载体DNA可大量地用苯酚、氯仿和乙醚提取以保证在质粒DNA制剂中不存在大肠杆菌蛋白,由于这些蛋白可对哺乳动物细胞是有毒的。
可用于多肽的小规模或大规模产生的表达系统包括但不限于,微生物诸如用包含核酸分子的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如,大肠杆菌),和用包含核酸分子的重组真菌表达载体转化的真菌(例如,酿酒酵母(S.cerevisiae))。
通常,对于感兴趣的蛋白通过细菌(例如,大肠杆菌)重组细胞的体内产生,细胞可在包含可同化的(assimilatable)氮源和碳源的水性营养培养基中,通常地在浸没的需氧条件下(震荡培养、浸没培养等)培养。使用培养基中的蛋白组分、掺入培养基的缓冲液或根据需要通过外部添加酸或碱,可将水性培养基维持在4.0–8.0(例如,4.5、5.0、5.5、6.0或7.5)的PH。营养培养基中的适合的碳源可包括:例如,碳水化合物、脂质和有机酸诸如葡萄糖、蔗糖、果糖、甘油、淀粉、植物油、石化衍生的油(petrochemical derived oils)、琥珀酸盐/酯、甲酸盐/酯等等。适合的氮源可包括,例如,酵母提取物、玉米浆、肉提取物、蛋白胨、蔬菜餐、酒糟可溶物(distillers solubles)、干酵母等以及无机氮源诸如硫酸铵、磷酸铵、硝酸盐、尿素、氨基酸等。
有利地组合使用的碳源和氮源,不需要以纯的形式使用,由于包含痕量的生长因子和大量矿物营养的低纯材料也适合使用。可将期望的矿物盐诸如磷酸钠或磷酸钾、氯化钠或氯化钾、镁盐、铜盐等添加到培养基。可根据需要以痕量添加消泡剂诸如液体石蜡或植物油,但通常不需要。
可在促进最佳生物量和/或酶滴度产率的条件下进行表达感兴趣的蛋白的重组细胞(例如,大肠杆菌细胞)的培养。此类条件包括,例如,分批培养、分批补料(fed-batch)培养或连续培养。另外,条件参数的改变还可促进DAS181蛋白的最佳生物量和/或酶滴度产率。此类条件包括,例如,培养基中的甘油浓度和高pO2。对于大量生物量的产生,可使用浸没的需氧培养方法,然而少量可在摇瓶中培养。对于大罐中的产生,可使用许多较小的接种罐以使接种物扩大至足以最小化生产容器中的延迟时间的高水平。用于产生生物催化剂的培养基通常在接种细胞前灭菌(例如,通过高压灭菌法)。可通过机械装置在气泡反应器中同时添加无菌空气或通过单独地添加空气实现培养物的通气和搅拌。可在培养期间在例如生物反应器中使用较高pO2(溶解氧)以促进最佳的生物量。还可用其促进生物量培养物中最佳的活性蛋白表达。实施此类发酵参数,包括较高局部氧分压和逐步地甘油消耗,可导致感兴趣的蛋白的增加的产率。
去垢剂增溶方法
原位去垢剂透化作用
在足够的培养以供期望的蛋白表达后,通过停止向反应器中的进料添加和气流,以及通过降低搅拌速度100至250rpm收获培养物。将温度设定在15℃至45℃的范围以准备透化作用步骤。在一些实施方案中,可将温度设定在30℃。这在本公开内容中还被称为预处理步骤。可将无机盐(例如,磷酸钠、硫酸铵和氯化钠)添加至在10-100mM范围的最终浓度。在一些实施方案中,无机盐的最终浓度为50mM。允许将溶液混合至少10分钟或至少20分钟。添加螯合剂诸如乙二胺四乙酸(EDTA)至在50-200mM的范围的最终浓度并混合至少10分钟或至少20分钟。在一些实施方案中,将EDTA添加至100mM的最终浓度(例如,50nM-250nM)。随后可将pH调整至5.0-6.0(例如,使用磷酸)。在一些实施方案中,将pH调整至6。边混合(例如,以400-450rpm的混合速度)边将材料孵育至少10分钟(例如,在30分钟至180分钟或更长的范围的时间量)。在该方法的一些实施方案中,将材料孵育60分钟。将去垢剂(例如,Triton、SDS、CHAPS 3、Nonidet P40、n-辛基葡糖苷和吐温-20)或去垢剂的组合例如十二烷基磺酸钠(SDS)Triton-X 100添加至混合物。Triton-X 100可在2-15%的范围与0.01-1%SDS一起组合使用。在一些实施方案中,随后将10%SDS溶液添加至0.1%的最终浓度并同时将Triton-X 100添加至7%的最终浓度。可将溶液在15-45℃的范围的温度以中等速度混合1-5小时的范围的时间量。在一些实施方案中,溶液在30℃以中等速度混合3小时。
澄清
在去垢剂组合中孵育后,将混合物温度降低至22℃。随后将百分之十(10%)PEI、pH 6.0储备溶液添加至0.5%的最终浓度。可在22℃下将溶液混合范围在6-24小时的时间量。在一些实施方案中,在22℃下将溶液混合6-12小时。在该方法的另一个实施方案中,在22℃下将溶液混合6-8小时的目标。随后通过使用Sharples AS-14(进料流速(feedflowrate):1L/min)的连续流动离心使混合物澄清。在T=0下测量混合物的浊度(OD600nm)。在开始蛋白纯化过程前,混合物可任优选地在环境温度下保持过夜。
在以上去垢剂增溶方法后,产物可经历进一步的纯化。
实施例
将在以下实施例中进一步描述本发明,该实施例不限制权利要求书中描述的本发明的范围。
本发明是无需机械破碎细胞或通过外源添加的酶酶促降解细胞壁的方法而进行的新颖蛋白纯化方案。完成它还无需从细胞培养物中分离细胞且另外不需要从培养基取出细胞。
优化本发明新颖增溶方案以出产高质量的和稳定的感兴趣的蛋白DAS181。本文定义了该新颖蛋白纯化的优化。本方案还是相比于本领域已知的蛋白纯化的普通方式即匀浆化,具有益处的方案。比较感兴趣的蛋白DAS181通过匀浆化纯化与通过新颖增溶方案纯化后的质量、稳定性和完整性。本发明蛋白纯化方案在指定的时间窗口以指定浓度利用试剂。在下面讨论这些参数的优化。
实施例1
与去垢剂增溶相比由匀浆化产生的蛋白产率和质量
进行了广泛的研究以优化用于从细胞原位释放感兴趣的蛋白DAS181的增溶,作为包括机械匀质化的方案的改进的替代。与匀浆化比较增溶将通过允许从细胞释放DAS181而没有细胞分离、细胞洗涤、重悬和匀浆化的步骤来减少处理时间。实施例1的细节描述了与匀浆化方法比较的增溶方法和关于蛋白产率与纯化的蛋白的质量的随后的结果。在图2中展示了描述增溶和匀浆化两者的方法的流程图。
方法
在诱导24小时后收获发酵物20100201 F2(F2)和20100201 F3(F3)。将发酵物混合并分成两个等分试样。每个等分试样经历增溶方法或匀质化方法进行。
通过匀浆化方法制备:将一个等分试样(A)离心以除去培养基。沉淀的细胞在包含50mM磷酸钾和200mM NaCl,pH 8的缓冲液中悬浮,并随后在冰上以15,000psi经历两次匀浆化。然后在环境温度下保持匀浆直到进一步处理。随后用聚乙烯亚胺(PEI;储备溶液10%PEI,pH 8)处理匀浆至0.5%的最终浓度并保持在环境温度下。
通过增溶方法制备:将第二个等分试样(B)原样返回至培养箱用于在30℃下去垢剂增溶。在缓慢搅拌下将七水合磷酸氢二钠与1M EDTA(在pH8.7下无酸)分别添加至50mM和100mM的最终浓度。用50%HCl将pH调整至6.0并增加搅拌。允许孵育混合物一小时,然后将SDS和Triton X-100分别添加至0.3%和5%的最终浓度。去垢剂增溶6小时后,将溶解裂解物(solubilysate)的温度降至22℃,在此后,将10%PEI,pH 6添加至0.5%的最终浓度。
下一步,等同地处理两个等分试样。边搅拌边孵育等分试样A和B过夜。随后使用50%HCl将匀浆滴定至pH 6并允许摇动大约5小时。将两个等分试样离心并使用进一步的纯化方法过滤上清液。用H2O将澄清的去垢剂溶解的DAS181 1:1稀释并经历额外的纯化方法。将匀浆纯化,而无需负载进一步纯化的产物的稀释。样品在每个步骤经历OD600nm和DTMCEX-HPLC的测量以推断产率和质量。
利用DAS181参考材料作为标准用于下面的测定。使用常规的均质蛋白纯化方法纯化Das181参考材料。纯化的DAS181以其活性形式存在。
结果
在进一步纯化之前和之后确定PEI处理后的离心的裂解物的浊度。在连续流动离心后,发现两个裂解物浊度相似,OD600nm为大约0.9。在进一步纯化后,观察到澄清的匀浆的浊度是0.1,而澄清的去垢剂材料的浊度是0.2。在匀浆材料中观察到的降低的浊度归因于与在增溶方法的去垢剂步骤中的pH 6相比较,其在pH 8进行PEI步骤。另外,由于匀浆材料需要在离心前滴定至pH 6,该材料随时间较不稳定。在RT和4℃下保持的澄清的匀浆材料24小时后浊度从0.1增加到0.2,而澄清的去垢剂材料的浊度保持不变。
对于如在表1中所示,两种裂解方法在每个过程步骤的产率是非常相似的。去垢剂增溶步骤导致83%全部细胞蛋白量被释放,然而匀浆化步骤产生了92%。然而,在预-匀浆化细胞离心步骤中观察到了损耗。因此,从发酵到匀浆化的产率是85%。PEI沉淀后与匀浆的每个柱步骤后的产率相似。匀浆化的总产率是48%,而去垢剂增溶的产率是44%。
表1:来自匀浆化和新的增溶方法的蛋白产率的比较
进行进一步纯化并在表2中显示了产物质量结果的总结。显示出匀浆化和去垢剂增溶的最终产物分别是99.9%和99.8%单体。匀浆的纯度是97.9%,而去垢剂池的纯度是98.4%。进一步纯化显示了匀浆RT FT池是6.5%峰F,12.6脱酰胺的(峰C),和81.0%主峰(峰A)。去垢剂池是7.3%峰F,8.2%脱酰胺的(峰C),和84.5%主峰(峰A)。脱氨基作用的差异可能是由于去垢剂方法在pH 6下发生,然而匀浆化在pH 8下发生。
表2:在匀浆化和新方法‘增溶’之间的DAS181质量总结比较
还对来自每种裂解方法的柱级分进行使用进一步纯化的分析,并概括于表2中。匀浆SP洗脱物包含超过去垢剂SP洗脱物几乎两倍量的HCP。进一步纯化后的匀浆包含超过40倍的HCP量。进一步外纯化后的匀浆分别包含227ng/mg HCP和≤16ng/mg(BLQ)。
SDS-PAGE分析表明从匀浆化产生的SP洗脱物表现略微不如去垢剂SP洗脱物纯(图3A-3C)。总体来说,从两种裂解方法产生的样品是相似的。来自匀浆化和去垢剂增溶的终池分别与在图3A、B和C的泳道9、10和8中所呈现的DAS181参考标准相一致。
结论是,源于去垢剂增溶方法和匀浆化的总产率和产物质量相当,不同之处是源于匀浆化方法的裂解物中宿主细胞杂质的存在。这些观察表明减少的处理时间、增强的处理稳健性和可能减少的宿主细胞杂质暗示去垢剂增溶是匀浆化蛋白纯化的可行的替代。这些结果证明了去垢剂增溶方法的进一步测试和优化是合理的。
实施例2
蛋白表达与纯化的去垢剂增溶的优化
新颖去垢剂增溶方案的优化保证DAS181药物物质纯度是足够的和可重复的。使用离液剂、胍代替NaCl做出了更高效率地SP捕获柱的清洗以保证足够的再生。另外,通过在负载琼脂糖树脂之前增加离心上清液的稀释改进SP洗脱物中的DAS181回收。用增加负载容量进一步优化利用Hexyl-650C树脂的疏水相互作用色谱。使用多通道强阴离子交换树脂的单色谱操作替代过滤和精制(polishing)步骤。
方法
诱导24小时后收获发酵样品20110523F2和20110613F2。将搅拌设定在250rpm。将七水合磷酸氢二钠与在pH 8.7下无酸的1M EDTA添加至50mM和100mM的最终浓度。将搅拌增加至350rpm并且通过添加磷酸将pH调整至6.0。将混合物孵育一小时,然后将搅拌增加至400rpm并将SDS和Triton X-100分别添加至0.1%和7%的最终浓度。在去垢剂透化作用三小时后,将透化裂解物(permeabilysate)的温度降低至22℃。将百分之十(10%)PEI,pH 6添加至0.5%的最终浓度。将材料孵育6小时然后分离。使用进一步纯化方法过滤所得的上清液。将澄清的去污剂透化裂解物以125%体积稀释至最终2M尿素浓度。
结果
最终的优化的回收和纯化过程总结于图4中。平行进行和分析新颖去垢剂方案的两个独立的运行(运行A和运行B)以推断方案的优化。通过来自运行A(图5A-5C)和运行B(图5D-5F)的纯化中间体的考马斯蓝、银染和蛋白印迹分析的SDS-PAGE显示了随着纯化进行纯度逐步地增加。从运行A和运行B纯化的最终DAS181药物物质与通过用考马斯蓝的SDS-PAGE检测的DAS181参考标准相当。然而,银染检测揭示了来自运行A和B的样品的主带下面的几条代表杂质的轻微染色的带。相反地,运行A和B比参考标准具有更低量的高分子量杂质。这些带通过考马斯染色检测均不可见。增加SDS-PAGE/考马斯蓝分析的蛋白负载(图6A)揭示了来自运行A和B的药物物质与参考标准相当。揭示了一条在50kDa附近的主DAS181带,然而对比-增强特写(close-up)揭示了紧接着每个负载的样品的主带下面的次带。这可能是过负载凝胶的伪影(artifact)。负载不同数量的参考标准(8ng至20μg)的不同的凝胶证明用胶体蓝染色的SDS PAGE可检测到低至20ng的蛋白负载(图6B)。负载20μg来自运行A和B的药物物质的泳道未显示用胶体蓝检测的其他可见带(图5)。因此,由于达到20ng水平的带可通过胶体考马斯蓝染色而可视化,使用银染在药物物质泳道中检测到的次杂质带占少于0.1%的样品负载(图5A-F)。
进一步纯化后的聚集分析揭示了来自运行A和B的药物物质分别为99.8%和99.9%单体(表3)。
表3:来自替代性的进一步纯化的产物的分析比较
通过进一步纯化的纯度分析确定了来自运行A和B的最终药物物质分别为97.1%和96.7%纯(图4)。
表4:来自替代性的进一步纯化的产物的分析比较
用于运行A和B的优化的过程参数导致来自进一步纯化杂质峰的减小的峰面积和样品量(图7A-E)。另外,来自1号至4号运行的药物物质样品的主DAS181峰的肩落(shoulderoff)不如参考标准明显。
通过进一步纯化方法获得的DAS181纯度和变体的分析显示了来自小规模(bench-scale)的整合的运行A和B的最终药物物质的色谱曲线与DAS181参考标准相当(图8),不同之处是脱酰胺作用中的差异。在来自运行A和B的药物物质中观察到了脱酰胺的DAS181(峰C)的增加(29.6±2.4%,与在13.2±0.1%的参考标准相比)。还观察到了DAS181的相应减少(峰A)。确定了来自运行A和B的峰A分别是62.3%和65.4%(表5)。
表5:CEX-HPLC分析比较
这些值比DAS181参考标准略低,其具有75.5±0.4%峰A。DAS181脱酰胺作用中的增加归因于用于进一步纯化方法特别需要的高pH环境。当pH从初始pH 5.0持续6-7小时保持在7.7时峰C的面积百分比增加了两倍。由于许多1期过程步骤在pH 8.0下进行,用于1期临床试验的药物物质为~49%(表5,图8F)。
代表错误折叠的DAS181的峰1的面积在运行A和B中比在参考标准中更少。运行A和B药物物质的峰4和峰F的面积百分比与参考标准一致。
运行A和B中产生的最终药物物质的进一步纯化的分析分别测量为15ng/mg和33ng/mg(表6)。这些值低于或接近该测定的定量限度(16ng/mg)。最终药物物质的进一步纯化的产物水平被确定为与在替代性纯化的产物中所发现的水平几乎相同。
表6:进一步纯化的产物的ELISA分析比较
唾液酸酶比活性的分析显示了在运行A和B中产生的最终药物物质分别为827U/mg和847U/mg(表7)。唾液酸酶比活性与与样品一起运行用于质量控制的DAS181参照标准(826U/mg)相当。
表7:唾液酸酶活性分析比较
小规模整合的运行A和B中产生的最终药物物质的内毒素分析分别测量为0.018EU/mg和0.043EU/mg(表8)。DAS181药物物质的内毒素规格为0.5EU/mg。从两个运行产生的药物物质的内毒素水平远低于该最大值。运行A和B分别仅为规格限度的3.5%和8.7%。
表8:LAL显色的内毒素分析比较
*3号运行显示了Capto Adhere负载调节缓冲液的内毒素测量。
以小规模整合的运行A和B获得的DAS181纯化回收产率分别为45.9%和55.0%(表89。总产率大大地受通过细胞透化作用和澄清回收的DAS181释放的性能的影响,且在色谱操作期间损失最小量的DAS181材料。预计的(projected)步骤产率不满足初级回收,但高于纯化操作所预计的。总计,初级回收后,DAS181回收率减少了3.9±1.5%。
表9:整合的运行A和B DAS181回收产率与预计步骤产率
运行A和B的进一步纯化的产物的回收率为93.1±1.5%。这是相对于1号和2号运行中使用的替代性进一步纯化的产物的产物(产生了89.9±2.4%的回收率)的改进。UF/DF1号操作的产率低于所有小规模整合的运行预期的产率~88-90%。对于全部色谱操作,预计的步骤产率都是领先的。
结论是在纯度、纯化回收产率和活性方面,用改进的参数优化的所推荐的DAS1813期纯化过程产生了与DAS181参考相当或在一些情况下好于DAS181参考的药物物质。用Capto Adhere色谱代替RP色谱校正了以前所经历的低RP-HPLC纯度问题。
实施例3
优化用于去垢剂增溶蛋白纯化的试剂的参数
测定和比较去垢剂增溶方案的不同试剂的不同参数用于基于蛋白产率的测定的优化。首先,选择评价多种Triton浓度与有限范围的SDS浓度组合用于DAS181回收产率。另外,磷酸钠与EDTA的多种组合在pH 6下预处理对通过使用7%Triton X-100和0.1%SDS的去垢剂透化作用的DAS181回收的影响。另外,确定PEI处理的持续时间是否影响在室温下保持时间延长多达5天期间的DAS181的特性。最后,评估在4℃下储存的DAS181的澄清的去垢剂透化裂解物的稳定性并用于在大规模生产的SP色谱之前确定可允许的保持时间。
方法
去垢剂浓度分析:将发酵物等分并经历去垢剂增溶纯化。
以不同浓度添加去垢剂并在30℃下搅拌6小时。使上清液经历阳离子交换HPLC。确定峰A、C和F的相对峰面积(总峰面积的%)。通过ECX总峰面积与已知浓度的标准的比较确定DAS181浓度,并将该浓度标准化为按通过唾液酸酶测定所确定的发酵收获产率以产生回收率(收获的%)。通过添加10%PEI(在50mM磷酸钾、200mM NaCl中,最终pH 6.0)澄清选择去垢剂溶解的样品至达到0.48%的最终PEI浓度。使上清液经历浊度测量和进一步的纯化。
磷酸钠和EDTA预处理分析:
诱导24小时后收获发酵物。以不同的浓度组合添加七水合磷酸氢二钠和在pH 8.7下的无酸EDTA。使样品经历去垢剂增溶方案。将上清液经历阳离子交换HPLC。确定峰A、C和F的相对峰面积(总峰面积的%)。通过总峰面积与已知浓度的标准的比较确定DAS181浓度,并将该浓度标准化为发酵收获产率以产生回收率(收获的%)。
PEI澄清的透化裂解物浓度的评价:
诱导24小时后收获发酵物。使样品经历去垢剂增溶方案。添加PEI至0.5%的最终浓度。以不同的时间间隔从发酵罐取出样品。使上清经历OD测量和进一步的纯化方法。
PEI澄清的透化裂解物储存时间的评价:在本研究中使用的起始材料是来自发酵运行的进一步纯化的透化裂解物。这些样品经历进一步的纯化方法。
结果
去垢剂浓度分析:在去垢剂增溶方案期间以不同的浓度组合添加去垢剂Triton和SDS。在表8中总结了DAS181产率的结果。
表8:用Triton和SDS的不同的浓度组合处理后的DAS181释放
随着Triton X-100浓度从1%增加到8%,不存在随SDS浓度变化的DAS181产率的明显趋势,表明尽管SDS自身是关键因素,SDS并不作为其浓度因素影响产率。在8%TritonX-100下,回收率存在明显增加,标准偏差较小,跨越所有SDS浓度的平均产量回收率为73%。因此研究了更高的浓度。注意到了来自5-9%Triton X-100的稳定的产率。在浓度大于9%Triton X-100下产率开始降低。还注意到在较高SDS浓度下DAS181产率降低的趋势。在取样中观察到包含>9%Triton X-100的去垢剂处理比具有较低Triton X-100浓度的样品更粘。
尽管在测定中存在变化,用PEI处理的样品显示了在5-9%的Triton X-100浓度下的一致产率。用10%及更高的Triton X-100观察到了产率轻微的下降。从利用增加的Triton X-100浓度的方案分离的样品中观察到了整体增加的浊度。(表10)。
表10:用于不同浓度的去垢剂组合在PEI处理后的DAS回收率
结论是最佳的Triton X-100浓度为在5-8%之间,证明过程对Triton浓度耐受。DAS181产率从5%到10%Triton X-100是一致的,而浊度从5%到8%Triton X-100是一致的。这些数据支持Triton X-100以5-8%的范围与0.05-0.2%SDS组合使用。
磷酸钠与EDTA预处理分析:
数据显示了,随着七水合磷酸氢二钠与EDTA组合浓度增加,DAS181释放总体增加(表11)。另外,在pH 6透化作用前未接受预处理的对照样品中观察到很少乃至没有的DAS181释放。在pH 5下用选择的50mM磷酸钠和100mM EDTA的预处理浓度的预处理具有与在pH 6下的相同条件下大约相同的DAS181回收百分比(表11)。
表11:不同的去垢剂透化剂对DAS181回收率的影响
结论是,磷酸钠与EDTA的预处理组合是允许释放DAS181的pDAS181大肠杆菌的有效的Triton X-100和SDS透化作用所需要的。总体上,这些观察表明了去垢剂透化作用在宽范围的磷酸钠及EDTA浓度、pH条件及孵育时间内是稳健的。选择在pH 6下50mM磷酸钠及100mM EDTA的组合作为最佳的预处理浓度。
PEI澄清的透化裂解物的评价:
在室温下保持的来自PEI处理的澄清的上清液随延长的保持时间浊度增加(表12)。在具有最短的PEI处理时间的样品中浊度的增加最大,且在具有较长的PEI处理时间的样品中浊度变化最小;确认了较长的PEI处理时间导致具有减少的沉淀形成的澄清的材料。PEI处理>7小时导致24小时内最小的浊度增加,且PEI处理>20小时导致直至为120小时的测量最长持续时间内最好的稳定性(OD600nm<2.0)。PEI处理<6小时导致在120小时浊度为OD600nm>3.0,且当与PEI处理>7小时相比时在24小时浊度轻微地增加。
在PEI处理和离心后立即确定DAS181回收率。回收率范围为从81%到95%(表4和图2)。大多数样品点具有在83%到89%之间的一致回收率。通过快速CEX-HPLC测定测量的DAS181变体的比率(峰A、C和F)在测定误差内是恒定的(表13)。对所有PEI处理,主DAS181峰(A)在79.93%和81.63%之间。峰C在10.20%和12.06%之间,且峰F范围在7.81%和8.91%之间。这些数据显示长PEI处理时间不对DAS181产物质量产生不利影响。
表12:PEI处理持续时间和澄清后保持时间对透化裂解物浊度的影响
ND=未确定
表13:PEI处理后立即得到的DAS181回收率及DAS181变体水平
结论是,在室温下24小时的保持时间后,澄清的透化裂解物浊度在所有处理时间保持低,但对于时间≥6小时是最低的。在48小时保持后,较长PEI处理的浊度增加是最少的。DAS181变体的比率不随PEI处理持续时间而变化。这些数据表明超过6小时的PEI处理时间允许至少24小时的良好的蛋白稳定性。该研究还表明PEI澄清的上清液可保持至少24小时而不影响过滤性。
PEI澄清的透化裂解物储存时间的评价:
额外纯化的澄清的去垢剂透化裂解物的浊度在4℃下储存1周后不增加(表14)。浊度从1周到2周增加了46%且从2周到3周约7%。
表14:澄清的去垢剂渗透裂解物的浊度
SP FF色谱回收率如每个运行的预期一样,在针对FT和UTSP洗涤的DAS181的损失中具有一些可变性(表15)。在进一步纯化后观察到大约5-6%的损失,而在进一步纯化后几乎没有观察到DAS181。
表15:来自进一步纯化的产物的分析比较的产率和质量平衡
通过另外的、替代性纯化方法的纯度分析显示了保持在4℃下1-3周后制备的SP洗脱物与新鲜原料制备的SP洗脱物相似(表16)。观察到了通过另进一步纯化的相对高的纯度。
表16:进一步纯化后澄清的去垢剂透化裂解物稳定性总结
进一步纯化后的结果揭示了如通过储存2周后产生的SP洗脱物中的增加的峰C百分比观察到的DAS181的脱氨基作用的轻微增加(表16)。该脱氨基作用的程度与进一步纯化的最近的小规模整合的运行样品一致,所述进一步纯化可全部被有效地认为是用于澄清的去垢剂透化裂解物储存的T=O样品。SDS-PAGE分析显示了在替代性进一步纯化的产物之间的一致的稳定性(图9)。在4℃下储存1、2和3周后进一步纯化的样品杂质带强度呈现接近相同。T=O样品杂质呈现比其他样品更强,其可能是由于样品负载轻微较重。
确定了从在4℃下保持多达3周的原料产生进一步纯化的样品的纯度没有减少。然而,CEXHPLC分析未显示储存2周后的脱酰胺作用(峰C)的轻微增加。澄清的去垢剂透化裂解物在4℃下稳定多达一周,如通过获得的进一步纯化的样品的纯度所示。
DAS181序列
DAS181(无氨基末端Met)
DAS181(具有氨基末端Met)
其他实施方案
应当理解,虽然本发明结合其详细的描述被描述,前述的描述意图是说明而非限制本发明的范围,本发明的范围由所附权利要求书的范围限定。其他方面、优势、和修改在以下权利要求书的范围内。
Claims (12)
1.一种用于从表达DAS181的大肠杆菌(Escherichia coli)细胞释放DAS181的方法,所述方法包括:
(a)提供表达DAS181的细胞的培养物;
(b1)使所述培养物与浓度在10mM至100mM范围内的磷酸钠接触;保持包含添加的磷酸钠的所述培养物至少10分钟;使所述包含添加的磷酸钠的所述培养物与浓度在75mM至200mM范围内的EDTA接触;或
(b2)使所述培养物与浓度在10mM至100mM范围内的磷酸钠和与浓度在75mM至200mM范围内的EDTA接触;
(c)使包含添加的磷酸钠和添加的EDTA的所述培养物保持至少10分钟;
(d)将所述包含添加的磷酸钠和添加的EDTA的所述培养物的pH调整至范围在5至8的pH;并使所述包含添加的磷酸钠和添加的EDTA的所述培养物保持至少15分钟;
(e)使所述包含添加的磷酸钠和添加的EDTA的所述培养物与浓度在5%至8%范围内的Triton X-100和浓度在0.05%至0.20%范围内的SDS接触;
(f)使所述包含添加的磷酸钠、添加的EDTA、添加的Triton X-100和添加的SDS的所述培养物保持至少1小时;
(g)使所述包含添加的磷酸钠、添加的EDTA、添加的Triton X-100和添加的SDS的所述培养物的温度降低;
(h)使所述包含添加的磷酸钠、添加的EDTA、添加的Triton X-100和添加的SDS的所述培养物与0.5%的聚乙烯亚胺接触;
(i)使所述包含添加的磷酸钠、添加的EDTA、添加的Triton X-100、添加的SDS和添加的聚乙烯亚胺的所述培养物保持至少1小时,以及
(j)使所述包含添加的磷酸钠、添加的EDTA、添加的Triton X-100、添加的SDS和添加的聚乙烯亚胺的所述培养物经历除去大部分的细胞碎片的方法,由此提供包含DAS181的组合物;
其中,所述方法不包括(k)机械破碎所述细胞,(l)除去基本上所有的培养基,和(m)添加降解细胞壁材料的酶。
2.如权利要求1所述的方法,其中步骤(c)是至少20分钟。
3.如权利要求1所述的方法,其中步骤(d)是至少30分钟。
4.如权利要求1所述的方法,其中步骤(d)是至少45分钟。
5.如权利要求1所述的方法,其中步骤(d)是至少1小时。
6.如权利要求1所述的方法,其中步骤(d)是在30分钟和1小时之间。
7.如权利要求1所述的方法,其中步骤(i)是2-8小时。
8.如权利要求1所述的方法,其中步骤(g)需要将所述温度降低到低于25℃。
9.如权利要求1所述的方法,其中步骤(h)在20℃-25℃发生。
10.如权利要求1所述的方法,其中步骤(h)在21℃-22℃发生。
11.如权利要求1所述的方法,其中步骤(h)在22℃发生。
12.如权利要求1所述的方法,所述方法还包括从包含感兴趣的蛋白的组合物纯化感兴趣的蛋白。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910262728.4A CN110295114A (zh) | 2013-03-15 | 2014-03-14 | 蛋白纯化的新颖方法 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201361800345P | 2013-03-15 | 2013-03-15 | |
US61/800,345 | 2013-03-15 | ||
PCT/US2014/027436 WO2014152524A2 (en) | 2013-03-15 | 2014-03-14 | Novel method of protein purification |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201910262728.4A Division CN110295114A (zh) | 2013-03-15 | 2014-03-14 | 蛋白纯化的新颖方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN105247036A CN105247036A (zh) | 2016-01-13 |
CN105247036B true CN105247036B (zh) | 2019-04-02 |
Family
ID=51581717
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201480028322.5A Active CN105247036B (zh) | 2013-03-15 | 2014-03-14 | 蛋白纯化的新颖方法 |
CN201910262728.4A Pending CN110295114A (zh) | 2013-03-15 | 2014-03-14 | 蛋白纯化的新颖方法 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201910262728.4A Pending CN110295114A (zh) | 2013-03-15 | 2014-03-14 | 蛋白纯化的新颖方法 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US10351828B2 (zh) |
EP (1) | EP2970857A4 (zh) |
JP (2) | JP6416867B2 (zh) |
KR (2) | KR102186997B1 (zh) |
CN (2) | CN105247036B (zh) |
AU (2) | AU2014239573B2 (zh) |
CA (1) | CA2906593C (zh) |
HK (1) | HK1220224A1 (zh) |
IL (2) | IL241278B (zh) |
WO (1) | WO2014152524A2 (zh) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2906593C (en) | 2013-03-15 | 2022-11-15 | Ansun Biopharma, Inc. | Method of protein purification |
IL305907A (en) | 2016-07-01 | 2023-11-01 | Univ Leland Stanford Junior | conjugates for editing cell surface area is intended |
WO2018216978A1 (en) * | 2017-05-22 | 2018-11-29 | Cj Healthcare Corporation | Cell culture method at low temperature applicable to mass production of protein |
CN112135904A (zh) | 2018-01-03 | 2020-12-25 | 帕利昂制药有限公司 | 重组人唾液酸酶、唾液酸酶融合蛋白及其使用方法 |
WO2022147481A1 (en) | 2020-12-30 | 2022-07-07 | Ansun Biopharma Inc. | Combination therapy of an oncolytic virus delivering a foreign antigen and an engineered immune cell expressing a chimeric receptor targeting the foreign antigen |
EP4426335A1 (en) * | 2021-11-02 | 2024-09-11 | Ansun Biopharma, Inc. | Das181 variant compositions |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1358196A (zh) * | 1999-06-25 | 2002-07-10 | 美国氰胺公司 | 膜内在蛋白质的抽提 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2056378T3 (es) | 1989-04-14 | 1994-10-01 | Unilever Nv | Procedimiento de extraccion. |
US20020068280A1 (en) * | 2000-12-06 | 2002-06-06 | Jeff Fairman | Compositions and methods for DNA purification from whole blood |
BR0207527A (pt) * | 2001-03-16 | 2004-02-25 | Oncolytics Biotech Inc | Método para produzir vìrus de uma cultura de células, composição, e, método para produzir reovìrus infeccioso |
JP2006507818A (ja) * | 2002-11-01 | 2006-03-09 | プロメガ コーポレイション | 細胞溶解のための組成物、使用方法、装置およびキット |
US7807174B2 (en) | 2002-11-22 | 2010-10-05 | Nexbio, Inc. | Class of therapeutic protein based molecules |
WO2014078780A2 (en) | 2012-11-19 | 2014-05-22 | Abbott Cardiovascular Systems Inc. | Multilayer balloon for a catheter |
CA2906593C (en) | 2013-03-15 | 2022-11-15 | Ansun Biopharma, Inc. | Method of protein purification |
-
2014
- 2014-03-14 CA CA2906593A patent/CA2906593C/en active Active
- 2014-03-14 CN CN201480028322.5A patent/CN105247036B/zh active Active
- 2014-03-14 WO PCT/US2014/027436 patent/WO2014152524A2/en active Application Filing
- 2014-03-14 EP EP14770943.0A patent/EP2970857A4/en active Pending
- 2014-03-14 KR KR1020157028895A patent/KR102186997B1/ko active IP Right Grant
- 2014-03-14 CN CN201910262728.4A patent/CN110295114A/zh active Pending
- 2014-03-14 AU AU2014239573A patent/AU2014239573B2/en active Active
- 2014-03-14 KR KR1020207034409A patent/KR102350205B1/ko active IP Right Grant
- 2014-03-14 JP JP2016502436A patent/JP6416867B2/ja active Active
- 2014-03-14 US US14/210,728 patent/US10351828B2/en active Active
-
2015
- 2015-09-07 IL IL241278A patent/IL241278B/en active IP Right Grant
-
2016
- 2016-07-12 HK HK16108177.0A patent/HK1220224A1/zh unknown
-
2018
- 2018-10-04 JP JP2018188899A patent/JP6728294B2/ja active Active
-
2019
- 2019-07-15 US US16/511,906 patent/US11697803B2/en active Active
- 2019-08-22 IL IL268868A patent/IL268868B/en active IP Right Grant
-
2020
- 2020-01-28 AU AU2020200572A patent/AU2020200572B2/en active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1358196A (zh) * | 1999-06-25 | 2002-07-10 | 美国氰胺公司 | 膜内在蛋白质的抽提 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Rapid and efficient extraction of soluble proteins from gram-negative microorganisms without disruption of cell walls;Danilevich, V N等;《Bioorganicheskaia khimiia》;20060331;第32卷(第6期);第579-588页 |
Sialidase fusion protein as a novel broad-spectrum inhibitor of influenza virus infection;Michael P. Malakhov等;《ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY》;20060430;第50卷(第4期);第1470-1479页 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2906593C (en) | 2022-11-15 |
AU2020200572A1 (en) | 2020-02-13 |
AU2014239573B2 (en) | 2019-11-21 |
CA2906593A1 (en) | 2014-09-25 |
AU2020200572B2 (en) | 2021-09-30 |
KR102186997B1 (ko) | 2020-12-07 |
EP2970857A2 (en) | 2016-01-20 |
JP6416867B2 (ja) | 2018-10-31 |
US10351828B2 (en) | 2019-07-16 |
IL241278A0 (en) | 2015-11-30 |
IL268868A (en) | 2019-10-31 |
US20140308729A1 (en) | 2014-10-16 |
US20200149015A1 (en) | 2020-05-14 |
CN105247036A (zh) | 2016-01-13 |
AU2014239573A1 (en) | 2015-09-24 |
JP6728294B2 (ja) | 2020-07-22 |
CN110295114A (zh) | 2019-10-01 |
JP2016512266A (ja) | 2016-04-25 |
KR20150141964A (ko) | 2015-12-21 |
KR102350205B1 (ko) | 2022-01-14 |
WO2014152524A2 (en) | 2014-09-25 |
HK1220224A1 (zh) | 2017-04-28 |
JP2019048807A (ja) | 2019-03-28 |
IL268868B (en) | 2020-09-30 |
KR20200138420A (ko) | 2020-12-09 |
IL241278B (en) | 2019-09-26 |
US11697803B2 (en) | 2023-07-11 |
WO2014152524A3 (en) | 2014-11-13 |
EP2970857A4 (en) | 2016-11-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN105247036B (zh) | 蛋白纯化的新颖方法 | |
CN105026548B (zh) | D-葡萄糖二酸生产菌及d-葡萄糖二酸的制造方法 | |
AT504347A4 (de) | Verfahren zur herstellung von glucosederivaten | |
CN103923869A (zh) | 一种产n-乙酰神经氨酸的枯草芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法和应用 | |
JPS6374493A (ja) | 酵母におけるガラクト−ス制御遺伝子発現の誘導 | |
EP2725098B1 (en) | Kluyveromyces lactis yeast strain and methods for the production of sugars, ethanol, beta-galactosidase and biomass | |
CN102776215B (zh) | 优化的乳糖酶基因及其分泌表达方法和应用 | |
JP7400468B2 (ja) | トリコデルマ属糸状菌変異株およびタンパク質の製造方法 | |
KR100401028B1 (ko) | 아르기닌존재하의원핵미생물로부터주변세포질형단백질의추출방법 | |
DE60028217T2 (de) | Zyklische depsipeptid-synthasen, deren gene und system zur massenproduktion von zyklischen depsipeptiden | |
JPWO2020045472A1 (ja) | トリコデルマ・リーセイの変異株およびそれを用いたタンパク質の製造方法 | |
CN111378635B (zh) | 一种共表达溶菌酶和木聚糖酶的方法、及制备作为替代抗生素的饲料添加剂的方法 | |
CN111349575B (zh) | 组成型表达猪胃蛋白酶原c的毕赤酵母工程菌及其应用 | |
CN106978410B (zh) | 一种具有壳聚糖水解活性的双功能葡聚糖酶、基因、载体、工程菌及其应用 | |
JP2007228937A (ja) | キラー蛋白質の精製方法 | |
JPWO2019188980A1 (ja) | トリコデルマ・リーセイ変異株およびタンパク質の製造方法 | |
JPS6279777A (ja) | ス−パ−オキシドデイスムタ−ゼの製造方法 | |
EP1196606A1 (de) | Lytisches enzym | |
JP2011217671A (ja) | 有用物質製造方法 | |
JPS61280292A (ja) | 菌体外分泌による蛋白質の製造法 | |
JP2018143100A (ja) | 有用物質の生産方法 | |
JPH03262476A (ja) | プロトプラスト製造装置 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |