JP2018143100A - 有用物質の生産方法 - Google Patents
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Abstract
Description
HO−(A1O)m1−(A2O)m2−(A3O)m3−H (1)
[一般式(1)中、A1O、A2O及びA3Oはそれぞれ独立に炭素数2〜4のオキシアルキレン基を表し、A1OとA2Oは構造式が異なっており、A2OとA3Oは構造式が異なっており、m1、m2及びm3は、A1O、A2O及びA3Oの平均付加モル数を表し、それぞれ独立に1〜600の数である。]
HO−(A1O)m1−(A2O)m2−(A3O)m3−H (1)
[一般式(1)中、A1O、A2O及びA3Oはそれぞれ独立に炭素数2〜4のオキシアルキレン基を表し、A1OとA2Oは構造式が異なっており、A2OとA3Oは構造式が異なっており、m1、m2及びm3は、A1O、A2O及びA3Oの平均付加モル数を表し、それぞれ独立に1〜600の数である。]
Saccaromyces株としては、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces bayanus、Saccharomyces kudriavzevii、Saccharomyces mikatae、Saccharomyces paradoxus及びSaccharomyces pastorianus等を用いることが好ましい。
遺伝子組み換えをする方法としては、例えば以下のように、細菌(大腸菌及び酵母等)を用いて酵母に組み込むためのプラスミドを作製し、作製したプラスミドを酵母に組み込んで形質転換する方法が挙げられる。
酵母に組み込むためのプラスミドの作製は、以下の方法等を用いることができる。
目的タンパク質を発現している細胞(動物細胞及び植物細胞等)からメッセンジャーRNA(mRNA)を分離し、該mRNAから単鎖のcDNAを作製し、次に二本鎖DNAを合成する。その後、合成した二本鎖DNAを、細菌に組み込むためのファージDNA又はプラスミドに組み込み、得られた組み換えファージ又はプラスミドを宿主となる細菌に形質転換しcDNAライブラリーを作製する。
次に、形質転換した細菌から得たcDNAライブラリーの中から、目的とするDNAを含有するプラスミドをスクリーニングする。スクリーニングの方法としては、プラスミドと、目的タンパク質遺伝子又は相補配列の一部をコードするDNAプローブとのハイブリダイゼーション法が挙げられる。
スクリーニング後、細菌中の目的とするクローン化DNAを有するプラスミドから、該クローン化DNA又はその一部を切りだし、該クローン化DNA又はその一部をプロモーターの下流に連結することによって、目的遺伝子を有する酵母に組み込むためのプラスミドを作製することができる。
また、該クローン化DNA又はその一部を酵母に組み込むためのプラスミドに導入する際に、内膜を移行させるシグナル配列(ペリプラズムに目的物質を発現させるシグナル配列)をコードするDNAを連結することもできる。
このような酵母に組み込むためのプラスミドの作製方法としては、例えばバイオ実験イラストレイティッド7(水野貴之著、2003年10月30日発行)の47〜69項に記載の方法を用いることができる。
上記1)で作製した酵母に組み込むためのプラスミドを用いて酵母を形質転換する方法としては、リチウム塩で処理して自然にDNAを取込みやすい状態にしてプラスミドを取り込ませる方法や、あるいは電気的にDNAを細胞内に導入する方法を採用できる(Becker and Guarente,Methods Enzymol.,194,182−187(1991))。
一般式(1)中、A1O、A2O及びA3Oはそれぞれ独立に炭素数2〜4のオキシアルキレン基を表す。
また、A1OとA2Oは構造式が異なっており、A2OとA3Oは構造式が異なっている。
炭素数2〜4のオキシアルキレン基としては、オキシエチレン基(以下EOと略記)、1,2−又は1,3−オキシプロピレン基(以下POと略記)及び1,2−、1,3−、1,4−又は2,3−オキシブチレン基(以下BOと略記)が挙げられる。
このうち、A1O、A2O及びA3Oは、有用物質の生産量の観点から、それぞれ独立にEO又はPOであることが好ましく、更に好ましい組み合わせは、A1O及びA3Oが、EOであって、A2Oが、POである組み合わせである。
また、上記の組み合わせにおけるPOは、有用物質の生産量の観点から、1,2−オキシプロピレン基であることが好ましい。
このうち、m1、m2及びm3は、有用物質の生産量の観点から、m1及びm3が1〜200の数であり、かつ、m2が10〜70の数であることが好ましい。
一般式(1)で表される化合物(A)のHLB値は親水系と親油性のバランスを示す指標であって、例えば「界面活性剤入門」〔2007年三洋化成工業株式会社発行、藤本武彦著〕142頁に記載されているグリフィン法によって、一般式(1)で表される化合物(A)の分子量の値と一般式(1)で表される化合物の親水基部分の分子量の値との比率から以下の式で計算することができる。
HLB値=20×化合物(A)の親水基部分の分子量/化合物(A)の分子量
本発明の方法において、一般式(1)で表される化合物(A)の数平均分子量は下記の方法により算出することができる。
数平均分子量は、テトラヒドロフラン(以下、THFと略記)への可溶分に対し、GPC(Gel Permeation Chromatography)を用いて以下の条件で測定することができる。
測定装置:東ソー株式会社製の「HLC−8120」
カラム:東ソー株式会社製の「TSKgelGMHXL」(2本)と東ソー(株)製の「T SKgelMultiporeHXL−M」(1本)
試料溶液:0.25質量%のTHF溶液
カラムへの試料溶液の注入量:100μl
流速:1ml/分
測定温度:40℃
検出装置:屈折率検出器
基準物質:東ソー株式会社製の標準ポリスチレン(TSK standard POLYSTYRENE)12点(数平均分子量:500、1050、2800、5970、9100、18100、37900、96400、190000、355000、1090000、2890000)。
例えば、培養開始時点において、あらかじめ培養液に一般式(1)で表される化合物(A)が加えられていてもよく、培養途中で培養液に一般式(1)で表される化合物(A)を加えてもよい。
有用物質の生産効率等の観点から、培養開始時点の培養液は一般式(1)で表される化合物(A)を含んでいないことが好ましい。この場合、一般式(1)で表される化合物(A)を酵母の対数増殖期に加えることが好ましい。
また、溶解性の観点から、一般式(1)で表される化合物(A)は、水溶液の状態で培養液に加えることが好ましい。
なお、培養液の重量は、培養開始時点の培養液の重量を基準とする。
酵母の培養の温度は、好ましくは15〜32℃であり、更に好ましくは25〜30℃である。
培地のpHは、4〜7であることが好ましい。
本培養開始から6〜800時間後に培養温度を維持したまま一般式(1)で表される化合物(A)の水溶液を添加し、本培養開始から20〜1000時間培養を継続する等で培養工程を実施することが好ましい。
培養中の培養液は公知の撹拌装置(撹拌羽根及びマグネティックスターラー等)を用いて撹拌することが好ましい。培養工程に用いる装置としては、公知の培養装置を用いることができるが、試験管、ディープウェルプレート(ビーエム機器株式会社製品等)及び微生物培養装置(エイブル社製等)等が挙げられる。
溶剤による沈殿処理としては、エタノール沈殿、硫酸アンモニウム沈殿及びポリエチレングリコール沈殿等の沈殿処理が挙げられる。
また、製造した化合物(A−1)〜(A−11)の数平均分子量及びHLB値を表1に示す。
ステンレス製加圧反応装置に1,2−プロパンジオール19部と水酸化ナトリウム0.05部を仕込み、窒素置換後に110〜130℃で1,2−プロピレンオキサイド420部を4時間かけてオートクレーブ内圧が0.3MPa以上にならないようにして、徐々に滴下した。同温度でさらに10時間反応させた。
その後、同温度でエチレンオキサイド66部を4時間かけてオートクレーブ内圧が0.3MPa以上にならないようにして、徐々に滴下した後、同温度でさらに10時間反応させ、化合物(A−1)を得た。
製造例1において、1,2−プロパンジオールの仕込み量を19部から15.8部に変更し、1,2−プロピレンオキサイドの滴下量を420部から350部に変更し、エチレンオキサイドの滴下量を66部から138部に変更した以外は同様の操作を行い、化合物(A−2)を得た。
製造例1において、1,2−プロパンジオールの仕込み量を19部から12.2部に変更し、1,2−プロピレンオキサイドの滴下量を420部から270部に変更し、エチレンオキサイドの滴下量を66部から220部に変更した以外は同様の操作を行い、化合物(A−3)を得た。
製造例1において、1,2−プロパンジオールの仕込み量を19部から4.8部に変更し、1,2−プロピレンオキサイドの滴下量を420部から106部に変更し、エチレンオキサイドの滴下量を66部から394部に変更した以外は同様の操作を行い、化合物(A−4)を得た。
ステンレス製加圧反応装置にサンニックスPP−2000[三洋化成工業(株)製;1,2−オキシプロピレン基を構成単位とするポリオキシプロピレングリコール(数平均分子量:2000)]450部と水酸化ナトリウム0.05部を仕込み、窒素置換後に110〜130℃でエチレンオキサイド50部を4時間かけてオートクレーブ内圧が0.3MPa以上にならないようにして、徐々に滴下した後、同温度でさらに10時間反応させ、化合物(A−5)を得た。
製造例5において、サンニックスPP−2000の仕込み量を450部から323部に変更し、エチレンオキサイドの滴下量を50部から178部に変更した以外は同様の操作を行い、化合物(A−6)を得た。
製造例5において、サンニックスPP−2000の仕込み量を450部から106部に変更し、エチレンオキサイドの滴下量を50部から392部に変更した以外が同様の操作を行い、化合物(A−7)を得た。
製造例5において、サンニックスPP−2000 450部に代えてサンニックスPP−3000[三洋化成工業(株)製;1,2−オキシプロピレン基を構成単位とするポリオキシプロピレングリコール(数平均分子量:3200)]を101部使用し、エチレンオキサイドの滴下量を50部から402部に変更した以外は同様の操作を行い、化合物(A−8)を得た。
製造例1において、1,2−プロピレンオキサイドの滴下量を420部から290部に変更し、エチレンオキサイドの滴下量を66部から250部に変更した以外は同様の操作を行い、化合物(A−9)を得た。
ステンレス製加圧反応装置にエチレングリコール10部と水酸化ナトリウム0.05部を仕込み、窒素置換後に110〜130℃でエチレンオキサイド35部を4時間かけてオートクレーブ内圧が0.3MPa以上にならないようにして、徐々に滴下した。同温度でさらに10時間反応させた。
その後、同温度で1,2−プロピレンオキサイド402部を4時間かけてオートクレーブ内圧が0.3MPa以上にならないようにして、徐々に滴下した。同温度でさらに10時間反応させて、化合物(A−10)を得た。
製造例10において、エチレンオキサイドの滴下量を35部から92部に変更した以外は同様の操作を行い、化合物(A−11)を得た。
数平均分子量は、テトラヒドロフラン(以下、THFと略記)への可溶分に対し、GPC(Gel Permeation Chromatography)を用いて以下の条件で測定した。
測定装置:東ソー株式会社製の「HLC−8120」
カラム:東ソー株式会社製の「TSKgelGMHXL」(2本)と東ソー(株)製の「T SKgelMultiporeHXL−M」(1本)
試料溶液:0.25質量%のTHF溶液
カラムへの試料溶液の注入量:100μl
流速:1ml/分
測定温度:40℃
検出装置:屈折率検出器
基準物質:東ソー株式会社製の標準ポリスチレン(TSK standard POLYSTYRENE)12点(数平均分子量:500、1050、2800、5970、9100、18100、37900、96400、190000、355000、1090000、2890000)。
Gaussia princeps由来のルシフェラーゼ(GLuc)のアミノ酸配列については、UniprotにおけるAAG54095で開示されている。
このアミノ酸配列を基に、出芽酵母のコドン使用に合わせた遺伝子配列を設計し、Gaussia princeps由来のルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子(下記配列番号1)の合成を行なった。
得られた合成遺伝子は市販のEcoRIとSalIで切断、YEp352GAPIIベクターは市販のEcoRIとSalIで切断後、それぞれアガロースゲル電気泳動を行い、それぞれの断片に相当するバンドをゲルから切り出した。切り出したゲルからプロメガ社のWizard SV DNA and PCR Clean−Up Systemを用いてDNA断片を抽出、精製した。NanoDrop Lite(Thermo Fisher Scientific社)でDNA濃度を測定後、それぞれの断片50ngずつを混合しH2Oで7.5μLとし、3.75μLのLigatio High Ver.2(TOYOBO社)を加え、16℃、30分間反応した。うち2μLを用いて、大腸菌ECOSTM Competent E. coli. DH5α(ニッポンジーン社)を形質転換した。50μg/mLのアンピシリンを含むLB寒天培地で37℃、16時間培養し、形質転換体を得た。
得られたコロニーを、50ug/mLのアンピシリンを含むLB液体培地で37℃、16時間培養を行った。菌体よりプロメガ社のWizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systemを用いてYEp352GAPII−GLucベクターを精製した。シークエンス解析を行い、塩基配列に間違いがないことを確認し、YEp352GAPII−GLucベクターとした。
得られたYEp352GAPII−GLucベクターからBamHIを用いてGAPDHプロモーターとターミネーターを含む領域を上記と同様に回収し、酵母インテグレーション型プラスミドpRS305のBamHI部位に同様に挿入し、形質転換を行なった。得られたコロニーを培養後、プラスミドを回収することで図1に示すベクター(pRS305−GLuc)を作製した。このベクター(pRS305−GLuc)をEcoRVで切断して線状化した後、常法に従い出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)W303−1B株の形質転換を行なった。
形質転換後の菌液をSD−Leu寒天培地(2.67% Minimal SD Base Medium、0.069% DO Supplement −Leu (TaKaRa Bio社)、2% Agar)に塗布し、30℃で2日間培養することで形質転換体のコロニーを得た。コロニーをプレートから掻きとり、PCR反応液に懸濁する簡易PCR法にて染色体上への組み込みを確認し、このSaccaromyces株である酵母をGLuc発現出芽酵母とした。
製造例12で製造したGLuc発現出芽酵母をカザミノ酸培地5ml〔0.5重量%カザミノ酸[Casamino Acid,technical DifcoTM、Becton,Dickinson and Company社(以下BD社)製]、0.67重量%イーストナイトロジェンベース(Yeast Extract DifcoTM、BD社製)、2重量%グルコース[D(+)−Glucose、和光純薬工業社製]〕に白金耳を用いて植菌して30℃で6時間、200rpmで振とう培養して作製した培養液15μlを、2mlYPAD培地〔2重量%ペプトン(Bacto Peptone DifcoTM、BD社製)、1重量%酵母エキス(Yeast Extract DifcoTM、BD社製)、2重量%グルコース[D(+)−Glucose、和光純薬工業社製]、アデニン(Adenine Sulfate、和光純薬工業社製)(40mg/l)〕に再懸濁した。
再懸濁して得られた培養液を30℃で2時間、1100rpmで振とう培養を続けた後に、表2に記載する化合物(A)を、培養液の重量を基準として0.3重量%になるように添加した。
その後、更に、30℃で24時間、1100rpmで振とう培養を続けた。
その後、培養液のサンプリングを行い、遠心分離機によって、酵母を含む培養液から菌体と培養上清を分離した後、培養上清を回収した。
化合物(A)を添加しなかったこと以外は実施例1と同様にして、実施し、培養上清を得た。
実施例8において、添加する化合物(A−8)の添加量を、培養液の重量を基準として、表3に記載の重量%になるように加えたこと以外は実施例8と同様にして、培養上清を得た。
各培養上清を、1ml(光路長:10mm)の石英セルに加え、濁度計[UV−1700、(株)島津製作所製]を用いて、濁度の測定を行った。
なお、培養上清は、適切な吸光度になるように生理食塩水で希釈して測定を行った。
また、実施例1〜14で得た培養上清に対しては、YPAD培地2mlをブランクとして用いた。培養液の濁度は下記数式(1)によって算出した。
培養液の濁度=[(希釈した培養液の濁度の測定値)−(ブランクの濁度の測定値)]×培養液の希釈倍率 [数式(1)]
実施例1〜14及び比較例1の場合、実施例1〜14及び比較例1毎の「培養液の濁度」を、比較例1の培養液の濁度で除し、この値を実施例1〜14及び比較例1毎の培養液の濁度比とした。評価結果を表2及び表3に示す。
培養液の濁度比が高いほど、酵母濃度が高いことを意味している。
また、酵母濃度あたりのタンパク質の活性値が高いほど活性を維持したタンパク質を効率的に生産できていることを意味する。
ルシフェラーゼ活性評価は、ルシフェラーゼ発現酵母の培養上清20μlに、ルシフェリン溶液60μl添加した混合液に対し、ルミノメーターを用いて以下の条件で測定することができる。
ルミノメーター:アトー株式会社製の「アトー(株)製 AB−2350 PHELIOS」
ルシフェリン溶液:ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社製品またはアトー株式会社製品
試料溶液:製造例に記載の通り、ルシフェラーゼ発現酵母を所定時間培養した培養上清
測定温度:25℃
検出装置:発光検出器
検出波長:460nm
実施例1〜14及び比較例1の場合、実施例1〜14及び比較例1毎の測定した発光強度を、比較例1の発光強度で除し、この値を実施例1〜14及び比較例1毎のルシフェラーゼ活性値比とした。評価結果を表2及び表3に示す。
ルシフェラーゼ活性値比が高いほど、培養液上清の単位体積あたりのタンパク質の活性値が高いことを意味している。
また、各実施例又は各比較例のルシフェラーゼ活性比を、各実施例及び各比較例の培養液の濁度比で除すことで、酵母濃度あたりのルシフェラーゼ活性値比を求めることができる。
この酵母濃度あたりのルシフェラーゼ活性値比が高いほど、ルシフェラーゼ活性を維持したタンパク質を効率的に生産できていることを意味する。
ルシフェラーゼ発現量の評価は、以下に詳述するウェスタンブロッティング(電気泳動、転写及び発色を含む)により評価した。
(1)電気泳動
電気泳動は、組み換え酵母の培養上清10μlに、サンプルバッファー溶液10μl添加した混合液を用いて以下の条件で実施した。
試料溶液:各実施例又は各比較例で得た培養上清
ポリアクリルアミドゲル:E−R15L e・パジェル[アトー(株)製]
電気泳動槽:WSE−1100P パジェラン−R[アトー(株)製]
電気泳動時間:90分
サンプルバッファー溶液:4X Laemmli サンプルバッファー[バイオ・ラッド(株)製品]900μlと2−メルカプトエタノール100μlの混合液
(2)転写
転写は、上記条件で電気泳動後、転写メンブレンを用いて以下の条件で実施することができる。
転写メンブレン:Amersham Hybond P0.45 PVDF[GEヘルスケア(株)製]
転写液:AE−1465EzFastBlot [アトー(株)製]を蒸留水で10倍に希釈した液
電圧/電流:12V/400mA
転写時間:30分
(3)発色
上記条件で転写後、その転写メンブレンをブロッキング、次いで一次抗体及び二次抗体で抗原抗体反応を行った。本試験においては、一次抗体としてAnti−Gluc Antibody(BioLabs社製)を使用し、二次抗体として、horseradish peroxidase HRP標識二次抗体を用い、ImageQuant LAS4000を用いて以下の条件で発色させた。
検出器:ImageQuant LAS4000(富士フィルム株式会社製品)
ブロッキング時間:45分
一次抗体反応時間:120分
二次抗体反応時間:60分
(4)発現量の解析方法
(1)〜(3)の操作の後、転写メンブレンにルシフェラーゼのバンドが検出された後、そのバンドの濃さをイメージJ(National Institutes of Health,USA)によって、定量した。
実施例1〜14及び比較例1の場合、実施例1〜14及び比較例1毎の定量したバンドの濃さを、比較例1のバンドの濃さで除し、この値を実施例1〜14及び比較例1毎のルシフェラーゼの発現量比とした。評価結果を表2及び表3に示す。
ルシフェラーゼ発現量比が高いほど、培養液上清の単位体積あたりのルシフェラーゼの発現量が高いことを意味している。
また、各実施例又は各比較例のルシフェラーゼの発現量比を、各実施例及び各比較例の培養液の濁度比で除すことで、酵母濃度あたりのルシフェラーゼの発現量比を求めることができる。
この酵母濃度あたりのルシフェラーゼの発現量比が高いほど、ルシフェラーゼ活性を維持したタンパク質を効率的に生産できていることを意味する。
LEU2:ロイシン合成酵素
GAPp:GAPプロモーター
GAPt:GAPターミネーター
GLuc:Gaussia princeps由来のルシフェラーゼ
Claims (5)
- 培養液に含まれる酵母により有用物質を培養液中に分泌生産する有用物質の生産方法であって、前記酵母が、Saccaromyces株であり、前記培養液が、一般式(1)で表される化合物(A)を含有し、前記化合物(A)のHLB値が0.1〜16であって、かつ数平均分子量が200〜30000であり、前記化合物(A)の重量割合が、前記培養液の重量を基準として0.0001〜10重量%である有用物質の生産方法。
HO−(A1O)m1−(A2O)m2−(A3O)m3−H (1)
[一般式(1)中、A1O、A2O及びA3Oはそれぞれ独立に炭素数2〜4のオキシアルキレン基を表し、A1OとA2Oは構造式が異なっており、A2OとA3Oは構造式が異なっており、m1、m2及びm3は、A1O、A2O及びA3Oの平均付加モル数を表し、それぞれ独立に1〜600の数である。] - 前記有用物質が、タンパク質である請求項1に記載の有用物質の生産方法。
- 前記一般式(1)で表される化合物(A)におけるA1O、A2O及びA3Oが、それぞれ独立にオキシエチレン基又は1,2−オキシプロピレン基である請求項1又は2に記載の有用物質の生産方法。
- 前記一般式(1)で表される化合物(A)におけるA1O及びA3Oが、オキシエチレン基であって、A2Oが、1,2−オキシプロピレン基である請求項1〜3のいずれか1項に記載の有用物質の生産方法。
- 前記一般式(1)で表される化合物(A)の数平均分子量が1000〜20000であり、A2Oが、1,2−オキシプロピレン基であり、m2が10〜70の数である請求項1〜4のいずれか1項に記載の有用物質の生産方法。
Priority Applications (5)
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