CN110337496A

CN110337496A - 有用物质的生产方法

Info

Publication number: CN110337496A
Application number: CN201880014455.5A
Authority: CN
Inventors: 上田真澄; 中西睦; 千叶靖典; 横尾岳彦
Original assignee: Sanyo Chemical Industries Ltd
Current assignee: Sanyo Chemical Industries Ltd
Priority date: 2017-03-01
Filing date: 2018-02-28
Publication date: 2019-10-15
Also published as: JP6909591B2; JP2018143100A; EP3591061A1; EP3591061A4; US20190376104A1; WO2018159652A1

Abstract

一种有用物质的生产方法，其为利用培养液中含有的酵母将有用物质分泌生产到培养液中的有用物质的生产方法，上述酵母为酵母属株，上述培养液含有通式(1)所表示的化合物(A)，上述化合物(A)的HLB值为0.1～16且数均分子量为200～30000，以上述培养液的重量为基准，上述化合物(A)的重量比例为0.0001～10重量％。HO‑(A¹O)m¹‑(A²O)m²‑(A³O)m³‑H(1)[通式(1)中，A¹O、A²O和A³O各自独立地表示碳原子数为2～4的氧化亚烷基，A¹O与A²O的结构式不同，A²O与A³O的结构式不同，m¹、m²和m³表示A¹O、A²O和A³O的平均加成摩尔数，各自独立地为1～600的数]。

Description

有用物质的生产方法

技术领域

本发明涉及有用物质的生产方法。

背景技术

酵母被广泛用于生产氨基酸、蛋白质等有用物质。特别是，近年来，已知一种使用通过将医药上/工业上有用的蛋白质的基因导入至酵母中而进行了转化的酵母来有效地生产蛋白质的技术。

在使用大肠杆菌作为用于有用物质生产的细菌的情况下，由于大肠杆菌体内不存在糖链合成酶，因此其限于不带有糖的蛋白质的生产。另一方面，若在有用物质生产中使用酵母，则酵母所表达的蛋白质通过糖链合成酶受到糖链附加等翻译后修饰后被分泌到菌体外，因此能够生产带有糖的蛋白质(非专利文献1)。

但是，在利用酵母的蛋白质生产方法中，与大肠杆菌相比，存在蛋白质生产量低的课题(非专利文献2)。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：马场忠、“構造生物(结构生物)”Vol.5、No.1(1998)、35～39页

非专利文献2：江崎信芳等著、“生化学基礎の基礎(生物化学基础的基础)”、化学同人、2002年3月、288-289页

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的目的在于提供一种使用酵母的有用物质的生产量优异的生产方法。

用于解决课题的手段

本发明人为了解决这些课题，进行了深入研究，结果完成了本发明。即，本发明为一种有用物质的生产方法，其为利用培养液中含有的酵母将有用物质分泌生产到培养液中的有用物质的生产方法，上述酵母为酵母属株，上述培养液含有通式(1)所表示的化合物(A)，上述化合物(A)的HLB值为0.1～16且数均分子量为200～30000，以上述培养液的重量为基准，上述化合物(A)的重量比例为0.0001～10重量％。

HO-(A¹O)m¹-(A²O)m²-(A³O)m³-H (1)

[通式(1)中，A¹O、A²O和A³O各自独立地表示碳原子数为2～4的氧化亚烷基，A¹O与A²O的结构式不同，A²O与A³O的结构式不同，m¹、m²和m³表示A¹O、A²O和A³O的平均加成摩尔数，各自独立地为1～600的数。]

发明的效果

通过使用本发明的有用物质的生产方法，能够利用酵母大量地生产有用物质。

附图说明

图1是示出制造例12中使用的载体的图。

具体实施方式

本发明的有用物质的生产方法为利用培养液中含有的酵母将有用物质分泌生产到培养液中的有用物质的生产方法，其特征在于，培养液含有下述通式(1)所表示的化合物(A)，下述通式(1)所表示的化合物(A)的HLB值为0.1～16且数均分子量为200～30000，以培养液的重量为基准，在培养液中含有0.0001～10重量％的下述通式(1)所表示的化合物(A)。

HO-(A¹O)m¹-(A²O)m²-(A³O)m³-H (1)

作为本发明的生产方法中使用的进行培养的培养基，只要是该技术领域中通常使用的细胞培养用培养基就可以没有特别限制地使用，可以使用包含碳源、氮源和其他必要营养素的天然培养基、合成培养基中的任一种。

作为碳源，可以举出葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉等碳水化合物；乙酸、丙酸等有机酸；乙醇和丙醇等醇类。

作为氮源，可以举出无机酸或有机酸的铵盐(氯化铵、硫酸铵、乙酸铵、磷酸铵等)、氨、蛋白胨、肉提取物和玉米浆等。

作为其他必要营养素，可以举出无机盐类，作为无机盐类，使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜和碳酸钙等。

从能够进行基因操作、工业利用容易的方面出发，使用酵母属株。

作为酵母属株，优选使用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)、库德里阿兹威酵母(Saccharomyces kudriavzevii)、粟酒裂殖酵母(Saccharomyces mikatae)、奇异酵母(Saccharomyces paradoxus)和巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)等。

作为本发明的生产方法中使用的酵母，可以使用根据目标有用物质的种类进行了基因重组的酵母。

作为进行基因重组的方法，例如可以举出如下所述使用细菌(大肠杆菌和酵母等)制作用于导入至酵母中的质粒、将所制作的质粒导入至酵母中而进行转化的方法。

1)用于导入至酵母中的质粒的制作

用于导入至酵母中的质粒的制作可以使用下述方法等。

从表达目标蛋白质的细胞(动物细胞和植物细胞等)分离信使RNA(mRNA)，由该mRNA制作单链的cDNA，接着合成双链DNA。之后，将合成的双链DNA导入到用于导入至细菌中的噬菌体DNA或质粒中，将所得到的重组噬菌体或质粒转化到作为宿主的细菌中，制作cDNA文库。

接着，从由转化的细菌得到的cDNA文库中筛选含有目标DNA的质粒。作为筛选的方法，可以举出质粒与编码目标蛋白质基因或互补序列的一部分的DNA探针的杂交法。

筛选后，从细菌中的具有目标克隆化DNA的质粒中切割出该克隆化DNA或其一部分，将该克隆化DNA或其一部分连接到启动子的下游，由此可以制作出具有目标基因的用于导入至酵母中的质粒。

另外，将该克隆化DNA或其一部分导入到用于导入至酵母中的质粒中时，也可以连接编码在内膜中移动的信号肽序列(使目标物质表达在周质中的信号肽序列)的DNA。

作为这种用于导入至酵母中的质粒的制作方法，例如可以使用生物实验说明7(水野贵之著、2003年10月30日发行)的47～69项中记载的方法。

2)酵母的转化

作为使用上述1)中制作的用于导入至酵母中的质粒对酵母进行转化的方法，可以采用：用锂盐进行处理，成为易于自然地导入DNA的状态后导入质粒的方法；或者以电方式将DNA导入到细胞内的方法(Becker and Guarente,Methods Enzymol.,194,182-187(1991))。

本发明的生产方法中使用的培养液含有通式(1)所表示的化合物(A)。化合物(A)可以单独使用1种，也可以合用2种以上。

通式(1)中，A¹O、A²O和A³O各自独立地表示碳原子数为2～4的氧化亚烷基。

另外，A¹O与A²O的结构式不同，A²O与A³O的结构式不同。

作为碳原子数为2～4的氧化亚烷基，可以举出氧化亚乙基(以下简记为EO)、1,2-或1,3-氧化亚丙基(以下简记为PO)以及1,2-、1,3-、1,4-或2,3-氧化亚丁基(以下简记为BO)。

其中，从有用物质的生产量的方面出发，A¹O、A²O和A³O各自独立地优选为EO或PO，进一步优选的组合是A¹O和A³O为EO、A²O为PO的组合。

另外，从有用物质的生产量的方面出发，上述组合中的PO优选为1,2-氧化亚丙基。

通式(1)中，m¹、m²和m³各自独立地表示A¹O、A²O和A³O的平均加成摩尔数，为1～600的数。

其中，关于m¹、m²和m³，从有用物质的生产量的方面出发，优选m¹和m³为1～200的数、且m²为10～70的数。

本发明的方法中使用的通式(1)所表示的化合物(A)的HLB值为0.1～16、优选为9～16。HLB值为0.1～16的范围外的情况下，有用物质的生产量变差。

通式(1)所表示的化合物(A)的HLB值是表示亲水性与亲油性的平衡的指标，可以利用例如“表面活性剂入门”[2007年三洋化成工业株式会社发行、藤本武彦著]142页中记载的格里芬法，按照下式由通式(1)所表示的化合物(A)的分子量的值与通式(1)所表示的化合物的亲水基部分的分子量的值的比例进行计算。

HLB值＝20×化合物(A)的亲水基部分的分子量/化合物(A)的分子量

本发明的方法中，通式(1)所表示的化合物(A)的数均分子量为200～30000，从有用物质的生产量的方面出发，优选为1000～20000。

本发明的方法中，通式(1)所表示的化合物(A)的数均分子量可以利用下述方法算出。

数均分子量可以利用GPC(凝胶渗透色谱法)在下述条件下对四氢呋喃(以下简记为THF)中的可溶成分进行测定。

测定装置：东曹株式会社制造的“HLC-8120”

柱：东曹株式会社制造的“TSK gel GMHXL”(2根)和东曹株式会社制造的“TSK gelMultipore HXL-M”(1根)

试样溶液：0.25质量％的THF溶液

柱中的试样溶液的注入量：100μl

流速：1ml/分钟

测定温度：40℃

检测装置：折射率检测器

基准物质：东曹株式会社制造的标准聚苯乙烯(TSK standard POLYSTYRENE)12种(数均分子量：500、1050、2800、5970、9100、18100、37900、96400、190000、355000、1090000、2890000)。

本发明的生产方法中，通式(1)所表示的化合物(A)在酵母培养的任一时期含有在培养液中即可。

例如，可以在培养开始时刻预先在培养液中加入有通式(1)所表示的化合物(A)，也可以在培养中途向培养液中加入通式(1)所表示的化合物(A)。

从有用物质的生产效率等方面出发，培养开始时刻的培养液优选不含有通式(1)所表示的化合物(A)。该情况下，优选在酵母的对数生长期加入通式(1)所表示的化合物(A)。

另外，从溶解性的方面出发，通式(1)所表示的化合物(A)优选以水溶液的状态加入到培养液中。

本发明的方法中，所使用的通式(1)所表示的化合物(A)的总用量(重量％)根据作为对象的微生物、所生产的有用物质的种类和提取方法的种类而适当选择，基于培养液的重量，为0.0001～10重量％，从抑制所生产的蛋白质的变性的方面出发，优选为0.005～10重量％。

需要说明的是，培养液的重量以培养开始时刻的培养液的重量为基准。

作为利用本发明的有用物质的制造方法所制造的有用物质，可以举出蛋白质(酶、激素蛋白、抗体和肽等)、多糖、寡糖和核酸等。

作为蛋白质，可以举出酶{氧化还原酶(胆固醇氧化酶、葡萄糖氧化酶、抗坏血酸氧化酶和过氧化物酶等)、水解酶(溶菌酶、蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶和葡糖淀粉酶等)、异构酶(葡萄糖异构酶等)、转移酶(酰基转移酶和磺基转移酶等)、合成酶(脂肪酸合成酶、磷酸合成酶和柠檬酸合成酶等)和裂解酶(果胶裂解酶等)等}、激素蛋白{骨形态生成蛋白(BMP)、干扰素α、干扰素β、白细胞介素1～12、生长激素、促红细胞生成素、胰岛素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、组织纤溶酶原激活物(TPA)、利钠肽、凝血因子VIII、生长调节素、胰高血糖素、生长激素释放因子、血清白蛋白和降钙素等}、抗体、抗原蛋白{乙型肝炎表面抗原等}、功能性蛋白{ProNectin(注册商标)、抗冻肽、抗菌肽等}、荧光蛋白(GFP等)、发光蛋白(荧光素酶等)和肽(氨基酸组成没有特别限定，寡肽、二肽和三肽等)等。

作为多糖，可以举出透明质酸、软骨素、黄原胶和纤维素等。

作为寡糖，可以举出蔗糖、乳糖、海藻糖、麦芽糖、棉子糖、潘糖、环糊精、低聚半乳糖和低聚果糖等。

作为核酸，可以举出肌苷一磷酸、腺苷一磷酸和鸟苷一磷酸等。

这些之中，从有用物质的生产效率等方面出发，优选蛋白质。

本发明的有用物质的生产方法优选具有培养工序和纯化工序。

培养工序中，优选对下述有用物质的生产中使用的培养液进行高压釜灭菌(优选为120℃、20分钟)，并在其中对进行了预培养的酵母进行主培养。

酵母的培养温度优选为15～32℃、进一步优选为25～30℃。

培养基的pH优选为4～7。

优选在主培养开始后6～800小时后，在维持培养温度的状态下添加通式(1)所表示的化合物(A)的水溶液，在主培养开始后继续20～1000小时的培养等而实施培养工序。

培养中的培养液优选使用公知的搅拌装置(搅拌叶片和磁力搅拌器等)进行搅拌。作为培养工序中使用的装置，可以使用公知的培养装置，可以举出试管、深孔板(BMEquipment Co.,Ltd.产品等)和微生物培养装置(Able公司制造等)等。

需要说明的是，在使用重组酵母作为培养工序中使用的进行了预培养的酵母的情况下，预培养中利用表达载体对酵母进行转化而制作重组酵母，对重组酵母进行预培养。预培养优选在琼脂培养基上在15～32℃进行3～72小时。

纯化工序是对分泌到培养液中的有用物质(蛋白质等)进行分离的工序，可以通过离心分离、中空纤维分离、过滤、利用溶剂的沉淀处理和柱处理(离子交换柱、凝胶过滤柱、疏水柱、亲和柱和超滤柱等)等公知的分离方法与微生物和微生物残渣分离来进行。

作为利用溶剂的沉淀处理，可以举出乙醇沉淀、硫酸铵沉淀和聚乙二醇沉淀等沉淀处理。

在纯化工序中进行柱处理的情况下，作为柱色谱法中使用的填充剂，可以举出二氧化硅、葡聚糖、琼脂糖、纤维素、丙烯酰胺和乙烯基聚合物等，市售品可以举出Sephadex系列、Sephacryl系列、Sepharose系列(以上为Pharmacia公司)、Bio-Gel系列(Bio-Rad公司)等。

对于纯化工序中所分离的酵母，之后可以通过供给新的培养液而进一步进行培养。将其培养液等进一步供给到纯化工序中，反复进行纯化、培养，由此能够进行有用物质的连续生产。

实施例

通过以下的实施例和比较例对本发明进行进一步的说明，但本发明并不限定于此。以下，只要没有特别规定，份表示重量份。

需要说明的是，作为实施例和比较例中使用的通式(1)所表示的化合物(A)，按照以下的制造方法制造出化合物(A-1)～(A-11)。

另外，将所制造的化合物(A-1)～(A-11)的数均分子量和HLB值示于表1。

<制造例1>

向不锈钢制加压反应装置中投入1,2-丙二醇19份和氢氧化钠0.05份，在氮气置换后于110～130℃用时4小时缓慢地滴加1,2-环氧丙烷420份，使高压釜内压不达到0.3MPa以上。在该温度下进一步反应10小时。

之后，在该温度下用时4小时缓慢地滴加环氧乙烷66份，使高压釜内压不达到0.3MPa以上，之后在该温度下进一步反应10小时，得到化合物(A-1)。

<制造例2>

在制造例1中，将1,2-丙二醇的投料量由19份变更为15.8份，将1,2-环氧丙烷的滴加量由420份变更为350份，将环氧乙烷的滴加量由66份变更为138份，除此以外进行同样的操作，得到化合物(A-2)。

<制造例3>

在制造例1中，将1,2-丙二醇的投料量由19份变更为12.2份，将1,2-环氧丙烷的滴加量由420份变更为270份，将环氧乙烷的滴加量由66份变更为220份，除此以外进行同样的操作，得到化合物(A-3)。

<制造例4>

在制造例1中，将1,2-丙二醇的投料量由19份变更为4.8份，将1,2-环氧丙烷的滴加量由420份变更为106份，将环氧乙烷的滴加量由66份变更为394份，除此以外进行同样的操作，得到化合物(A-4)。

<制造例5>

向不锈钢制加压反应装置中投入Sannix PP-2000[三洋化成工业株式会社制造；以1,2-氧化亚丙基作为构成单元的聚氧化亚丙基二醇(数均分子量：2000)]450份和氢氧化钠0.05份，在氮气置换后于110～130℃用时4小时缓慢地滴加环氧乙烷50份，使高压釜内压不达到0.3MPa以上，之后在该温度下进一步反应10小时，得到化合物(A-5)。

<制造例6>

在制造例5中，将Sannix PP-2000的投料量由450份变更为323份，将环氧乙烷的滴加量由50份变更为178份，除此以外进行同样的操作，得到化合物(A-6)。

<制造例7>

在制造例5中，将Sannix PP-2000的投料量由450份变更为106份，将环氧乙烷的滴加量由50份变更为392份，除此以外进行同样的操作，得到化合物(A-7)。

<制造例8>

在制造例5中，代替Sannix PP-2000 450份而使用Sannix PP-3000[三洋化成工业株式会社制造；以1,2-氧化亚丙基作为构成单元的聚氧化亚丙基二醇(数均分子量：3200)]101份，将环氧乙烷的滴加量由50份变更为402份，除此以外进行同样的操作，得到化合物(A-8)。

<制造例9>

在制造例1中，将1,2-环氧丙烷的滴加量由420份变更为290份，将环氧乙烷的滴加量由66份变更为250份，除此以外进行同样的操作，得到化合物(A-9)。

<制造例10>

向不锈钢制加压反应装置中投入乙二醇10份和氢氧化钠0.05份，在氮气置换后于110～130℃用时4小时缓慢地滴加环氧乙烷35份，使高压釜内压不达到0.3MPa以上。在该温度下进一步反应10小时。

之后，在该温度下用时4小时缓慢地滴加1,2-环氧丙烷402份，使高压釜内压不达到0.3MPa以上。在该温度下进一步反应10小时，得到化合物(A-10)。

<制造例11>

在制造例10中，将环氧乙烷的滴加量由35份变更为92份，除此以外进行同样的操作，得到化合物(A-11)。

实施例和比较例中使用的通式(1)所表示的化合物(A)的数均分子量可以利用下述方法进行测定。

关于数均分子量，利用GPC(凝胶渗透色谱法)在下述条件下对四氢呋喃(以下简记为THF)中的可溶成分进行测定。

测定装置：东曹株式会社制造的“HLC-8120”

试样溶液：0.25质量％的THF溶液

柱中的试样溶液的注入量：100μl

流速：1ml/分钟

测定温度：40℃

检测装置：折射率检测器

<制造例12：酵母的制作>

关于来自Gaussia princeps的荧光素酶(GLuc)的氨基酸序列，公开于Uniprot中的AAG54095中。

基于该氨基酸序列，设计与芽殖酵母的密码子使用相符的基因序列，进行编码来自Gaussia princeps的荧光素酶蛋白的基因(下述序列号1)的合成。

所得到的合成基因用市售的EcoRI和SalI进行切割，YEp352GAPII载体用市售的EcoRI和SalI进行切割，之后分别进行琼脂糖凝胶电泳，从凝胶切出与各片段相当的条带。使用Promega公司的Wizard SV DNA及PCR纯化系统，从切出的凝胶中提取DNA片段并进行纯化。利用NanoDrop Lite(Thermo Fisher Scientific公司)测定DNA浓度后，将50ng各片段混合，用H₂O调节为7.5μL，加入3.75μL的Ligation High Ver.2(TOYOBO公司)，在16℃反应30分钟。使用其中的2μL，对大肠杆菌ECOS^TM大肠杆菌DH5α感受态细胞(Nippon Gene公司)进行转化。用包含50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂培养基在37℃培养16小时，得到转化体。

将所得到的菌落用包含50ug/mL氨苄青霉素的LB液体培养基于37℃进行16小时培养。使用Promega公司的Wizard Plus SV DNA少量制备纯化系统，由菌体进行YEp352GAPII-GLuc载体的纯化。进行序列分析，确认碱基序列没有错误，将其作为YEp352GAPII-GLuc载体。

使用BamHI与上述同样地从所得到的YEp352GAPII-GLuc载体中回收包含GAPDH启动子和终止子的区域，并同样地插入到酵母整合型质粒pRS305的BamHI位点，进行转化。对所得到的菌落进行培养后，回收质粒，由此制作出图1所示的载体(pRS305-GLuc)。将该载体(pRS305-GLuc)用EcoRV切割而线性化后，根据常规方法进行芽殖酵母(Saccharomycescerevisiae)W303-1B株的转化。

将转化后的菌液涂布至SD-Leu琼脂培养基(2.67％最小SD基础培养基、0.069％DOSupplement-Leu(TaKaRa Bio公司)、2％琼脂)上，在30℃培养2天，由此得到转化体的菌落。从平板上刮取菌落，通过悬浮于PCR反应液中的简易PCR法确认在染色体上的导入，将该酵母属株的酵母作为GLuc表达芽殖酵母。

<实施例1～10>

利用铂金接种环将制造例12中制造的GLuc表达芽殖酵母接种至酪蛋白氨基酸培养基5ml[0.5重量％酪蛋白氨基酸[Casamino Acid,technical Difco^TM、Becton,Dickinsonand Company公司(以下称为BD公司)制造]、0.67重量％酵母氮源(Yeast Extract Difco^TM、BD公司制造)、2重量％葡萄糖[D(+)葡萄糖、和光纯药工业公司制造]]中，在30℃以200rpm振荡培养6小时，将所制作的培养液15μl重悬浮于2ml YPAD培养基[2重量％蛋白胨(BactoPeptone Difco^TM、BD公司制造)、1重量％酵母提取物(Yeast Extract Difco^TM、BD公司制造)、2重量％葡萄糖[D(+)-葡萄糖、和光纯药工业公司制造]、腺嘌呤(腺嘌呤硫酸盐、和光纯药工业公司制造)(40mg/l)]中。

将重悬浮而得到的培养液在30℃以1100rpm继续振荡培养2小时后，以培养液的重量为基准，按照达到0.3重量％的方式添加表2中记载的化合物(A)。

之后，进一步在30℃以1100rpm继续振荡培养24小时。

之后，进行培养液的采样，利用离心分离机从包含酵母的培养液中分离菌体和培养上清，之后回收培养上清。

<比较例1>

不添加化合物(A)，除此以外与实施例1同样地实施，得到培养上清。

<实施例11～14>

在实施例8中，以培养液的重量为基准，按照达到表3中记载的重量％的方式加入所添加的化合物(A-8)的添加量，除此以外与实施例8同样地得到培养上清。

<培养液的浊度的评价>

将各培养上清加入到1ml(光程长：10mm)的石英池中，利用浊度计[UV-1700、株式会社岛津制作所制造]进行浊度的测定。

需要说明的是，培养上清用生理盐水稀释成适当的吸光度而进行测定。

另外，对于实施例1～14中得到的培养上清，使用YPAD培养基2ml作为空白。培养液的浊度通过下述数学式(1)算出。

培养液的浊度＝[(稀释后的培养液的浊度测定值)－(空白的浊度测定值)]×培养液的稀释倍率[数学式(1)]

在实施例1～14和比较例1的情况下，将实施例1～14和比较例1各自的“培养液的浊度”除以比较例1的培养液的浊度，将该值作为实施例1～14和比较例1各自的培养液的浊度比。将评价结果示于表2和表3中。

培养液的浊度比越高，表示酵母浓度越高。

另外，单位酵母浓度的蛋白质的活性值越高，表示越能够有效地生产维持了活性的蛋白质。

<荧光素酶活性的评价>

关于荧光素酶活性评价，可以在荧光素酶表达酵母的培养上清20μl中添加荧光素溶液60μl，对于所得到的混合液，使用发光检测仪在下述条件下进行测定。

发光检测仪：ATTO株式会社制造的“AB-2350PHELIOS”

荧光素溶液：New England Biolabs Japan株式会社产品或ATTO株式会社产品

试样溶液：如制造例中记载的那样，对荧光素酶表达酵母进行规定时间的培养而得到的培养上清

测定温度：25℃

检测装置：发光检测器

检测波长：460nm

在实施例1～14和比较例1的情况下，将实施例1～14和比较例1各自所测定的发光强度除以比较例1的发光强度，将该值作为实施例1～14和比较例1各自的荧光素酶活性值比。将评价结果示于表2和表3中。

荧光素酶活性值比越高，表示培养液上清的每单位体积的蛋白质的活性值越高。

另外，将各实施例或各比较例的荧光素酶活性比除以各实施例和各比较例的培养液的浊度比，由此可以求出单位酵母浓度的荧光素酶活性值比。

该单位酵母浓度的荧光素酶活性值比越高，表示越能够有效地生产维持了荧光素酶活性的蛋白质。

<荧光素酶的表达量的评价>

荧光素酶表达量的评价通过以下详细说明的蛋白质印迹法(包括电泳、转印和显色)来进行评价。

(1)电泳

使用在重组酵母的培养上清10μl中添加样品缓冲溶液10μl而成的混合液，在下述条件下实施电泳。

试样溶液：各实施例或各比较例中得到的培养上清

聚丙烯酰胺凝胶：E-R15L e-PAGEL[ATTO株式会社制造]

电泳槽：WSE-1100P PageRun-R[ATTO株式会社制造]

电泳时间：90分钟

样品缓冲溶液：4X Laemmli样品缓冲液[Bio-Rad株式会社产品]900μl与2-巯基乙醇100μl的混合液

(2)转印

以上述条件进行电泳后，可以使用转印膜在以下条件下实施转印。

转印膜：Amersham Hybond P0.45 PVDF[GE Healthcare株式会社制造]

转印液：将AE-1465EzFastBlot[ATTO株式会社制造]用蒸馏水稀释10倍而成的液体

电压/电流：12V/400mA

转印时间：30分钟

(3)显色

在上述条件下进行转印后，将该转印膜封闭，接着利用一次抗体和二次抗体进行抗原抗体反应。本试验中，使用抗Gluc抗体(BioLabs公司制造)作为一次抗体，使用辣根过氧化物酶HRP标记二次抗体作为二次抗体，利用ImageQuant LAS4000在下述条件下使其显色。

检测器：ImageQuant LAS4000(富士胶片株式会社产品)

封闭时间：45分钟

一次抗体反应时间：120分钟

二次抗体反应时间：60分钟

(4)表达量的分析方法

在(1)～(3)的操作后，在转印膜上检测到荧光素酶的条带后，利用Image J(美国国立卫生研究院)对该条带的浓度进行定量。

在实施例1～14和比较例1的情况下，将实施例1～14和比较例1各自定量出的条带的浓度除以比较例1的条带的浓度，将该值作为实施例1～14和比较例1各自的荧光素酶表达量比。将评价结果示于表2和表3中。

荧光素酶表达量比越高，表示培养液上清的每单位体积的荧光素酶的表达量越高。

另外，将各实施例或各比较例的荧光素酶表达量比除以各实施例和各比较例的培养液的浊度比，由此可以求出单位酵母浓度的荧光素酶表达量比。

该单位酵母浓度的荧光素酶表达量比越高，表示越能够有效地生产维持了荧光素酶活性的蛋白质。

可知，含有通式(1)所表示的化合物(A)的实施例1～14与不含有化合物(A)的比较例1相比，作为有用物质蛋白质的酶(荧光素酶)的生产量优异。

工业实用性

本发明的有用物质的生产方法在高效地用于生物医药品制造方面有用。

符号说明

Amp^r：氨苄青霉素抗性基因

LEU2：亮氨酸合成酶

GAPp：GAP启动子

GAPt：GAP终止子

GLuc：来自Gaussia princeps的荧光素酶

序列表

<110> 三洋化成工业株式会社(SANYO CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.)

<120> 有用物质的生产方法(Method for producing a useful substance)

<130> 566-PCT

<150> JP2017-38078

<151> 2017-03-01

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 783

<212> DNA

<213> gaussia princeps

<400> 1

gaattcatga gatttccatc cattttcaca gcagtgctat ttgcggcatc atcagcttta 60

gcagccccag ttaataccac tacagaagat gaaactgctc aaattcctgc agaagcggtg 120

attggttact tggacttaga aggcgatttt gatgttgctg ttttgccgtt ctctaatagc 180

actaataatg ggctgttgtt cataaacact acaatcgcct ctatagcagc caaagaagaa 240

ggtgtatcct tggataaacg tgaggctgag aaaccaaccg aaaacaacga ggactttaac 300

attgtagcag ttgctagtaa ctttgcaacg accgatttgg acgcagatag aggcaaactt 360

cctggtaaga agttaccctt ggaagtccta aaagagatgg aggctaatgc gagaaaagct 420

ggctgtacta ggggatgctt gatttgcctt tcacacatca aatgtacgcc gaaaatgaag 480

aaattcatac caggtagatg ccatacctat gaaggtgaca aggaaagtgc tcaaggtgga 540

attggggaag ccatagtcga tattcccgaa atacctggtt ttaaggatct ggaacctatg 600

gagcagttca ttgctcaagt cgatctttgc gttgattgta ctacaggctg tttaaagggt 660

ttagccaatg tacagtgttc ggacctattg aagaaatggt taccacaaag atgtgccaca 720

tttgcttcta agatccaagg tcaagtggac aaaatcaaag gtgctggagg agattaagtc 780

gac 783

Claims

1.一种有用物质的生产方法，其为利用培养液中含有的酵母将有用物质分泌生产到培养液中的有用物质的生产方法，所述酵母为酵母属株，所述培养液含有通式(1)所表示的化合物(A)，所述化合物(A)的HLB值为0.1～16且数均分子量为200～30000，以所述培养液的重量为基准，所述化合物(A)的重量比例为0.0001重量％～10重量％，

HO-(A¹O)m¹-(A²O)m²-(A³O)m³-H(1)

通式(1)中，A¹O、A²O和A³O各自独立地表示碳原子数为2～4的氧化亚烷基，A¹O与A²O的结构式不同，A²O与A³O的结构式不同，m¹、m²和m³表示A¹O、A²O和A³O的平均加成摩尔数，各自独立地为1～600的数。

2.如权利要求1所述的有用物质的生产方法，其中，所述有用物质为蛋白质。

3.如权利要求1或2所述的有用物质的生产方法，其中，所述通式(1)所表示的化合物(A)中的A¹O、A²O和A³O各自独立地为氧化亚乙基或1,2-氧化亚丙基。

4.如权利要求1～3中任一项所述的有用物质的生产方法，其中，所述通式(1)所表示的化合物(A)中的A¹O和A³O为氧化亚乙基，A²O为1,2-氧化亚丙基。

5.如权利要求1～4中任一项所述的有用物质的生产方法，其中，所述通式(1)所表示的化合物(A)的数均分子量为1000～20000，A²O为1,2-氧化亚丙基，m²为10～70的数。