CN107267547A - 新型抗菌肽dlp2的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供新型抗菌肽DLP2的制备方法，利用基因工程技术，通过对编码抗菌肽DLP2基因的优化，实现其在毕赤酵母中的重组表达。本发明首次实现抗菌肽DLP2在毕赤酵母基因工程菌中的表达，经测定发酵纯化产物对金黄色葡萄球菌ATCC 25923，ATCC 43300和ATCC 6538以及猪链球菌CVCC 606具有显著抑菌活性，MIC介于0.031‑2μg/ml。采用本发明方法制备的抗菌肽DLP2可应用于抗菌药物、食品添加剂、化妆品、饲料添加剂等领域，具有广阔的应用价值和市场前景。

Description

新型抗菌肽DLP2的制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种新型抗菌肽DLP2的制备方法。
背景技术
黑水虻抗菌肽DLP2是Sung Moon Yoe研究组以黑水虻(亮斑扁角水虻，Hermetiaillucens)为原料，通过金黄色葡萄球菌(S.aureus KCCM 40881)进行免疫刺激从而产生的高效抗G+菌活性抗菌肽。抗菌肽DLP2是含有95个氨基酸残基的多肽序列，其中1～24位是信号肽序列，25～40位为前导肽序列，41～81位为成熟肽(DLP2)序列。DLP2理论分子量分别为4277.0Da，分子中具有2个组氨酸(His)和1个赖氨酸(Lys)以及5个精氨酸(Arg)，在不同pH环境中，由于组氨酸解离状态不同，净电荷数在+2到+4之间变化(Soon-Ik Park等，Park SI,Kim J W,Yoe S M.Purification and characterization of a novel antibacterialpeptide from black soldier fly(Hermetia illucens)larvae.[J].Developmental&Comparative Immunology,2015,52(1):98-106.)。
抗菌肽替代传统抗生素应用于由细菌感染所引起的各种疾病一直备受科学界关注，也是人类对抗各种病原菌的有效武器。抗菌肽抗菌谱过宽，稳定性不好，具有细胞毒性，抗菌活性不足，用药多样性，生产成本高(基因克隆表达产量太低和化学合成成本过高)等一直是抗菌肽应用中面临的挑战。目前，尚未见到有关于DLP2在毕赤酵母中进行转基因表达的报道。
发明内容
本发明的目的是提供新型抗菌肽DLP2的制备方法。
本发明的另一目的是提供一种可高效分泌表达抗菌肽DLP2的重组酵母菌。
为了实现本发明目的，本发明提供的新型抗菌肽DLP2的制备方法，包括以下步骤：
1)基因表达框的设计：对抗菌肽DLP2的编码基因进行酵母偏爱密码子优化，在优化后的基因序列的5’端添加XhoI酶切位点和Kex2切割位点，在3’端添加TAA和TAG终止子序列以及XbaI酶切位点，所得基因表达框的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示；
2)重组酵母表达载体的构建：将SEQ ID No:3所示的基因经XhoI和XbaI双酶切后，与经过同样双酶切的pPICZαA载体连接，得到的重组酵母表达载体pPICDLP2；
3)重组酵母菌的制备：载体pPICDLP2经线性化后转化感受态毕赤酵母X-33，筛选出高水平表达抗菌肽DLP2的重组酵母菌；
4)抗菌肽DLP2的制备：对步骤3)中获得的重组酵母菌进行发酵培养，通过补加葡萄糖和甲醇诱导，获得发酵液，离心收集上清，上清经纯化后即得抗菌肽DLP2。
前述的方法，步骤4)具体为：
①种子液制备：
挑取单菌落接种于YPD培养基中，28～30℃，250rpm振荡培养18～24h；然后按1％的接种量，转接至YPD培养基中，28～30℃，250rpm振荡培养16～18h，OD600达到4～6；然后，按10％接种量接到上罐培养基(含4.8‰PMT1)中，即200ml菌液+200ml 45％葡萄糖+9.6mlPMT1，装液量为2L/5L，于29℃，800rpm，pH 5.0，pO2>35％的条件下培养16-18h；
②添加葡萄糖生长阶段：
观测发酵液的溶氧值开始缓慢下降后突然上升，开始补加含12‰PMT1的50％葡萄糖溶液，添加时间6-8h，流速为30ml/L/h；
③甲醇过渡诱导：
添加葡萄糖6h后，饥饿1h，待葡萄糖耗尽后，开始补加含12‰PMT1的无水甲醇，补加过程中，流速由第1小时1ml/L/h逐渐增加到第6小时6ml/L/h，直至发酵结束；
④100％甲醇诱导阶段：
甲醇过渡诱导6h后，开始100％甲醇连续诱导，流速为6ml/L/h；甲醇诱导开始后，每12h取样，测定重组酵母菌分泌表达抗菌肽DLP2的水平。
前述的方法，步骤4)中采用阳离子交换层析对上清进行纯化。具体操作如下：
发酵液于4℃，12000rpm离心10min后取上清，将长度16mm、内径10mm的HiPrep SPFF阳离子交换柱(GE Healthcare)用A液平衡5-10个柱体积后上样；进样完毕后，先用A液进行洗脱，待穿透峰洗脱完后，用B液进行洗脱，收集洗脱峰。
洗脱步骤为：100％A液，洗脱5个柱体积，为穿透峰；40％A，60％B液，洗脱5个柱体积，为洗脱峰；利用UV215nm监测洗脱情况，Tricine-SDS-PAGE和检测目标产物纯化情况。其中，所述A液为20mM，pH7.0的磷酸盐洗脱缓冲液，所述B液为含有1M NaCl的20mM，pH7.0的磷酸盐洗脱缓冲液。
收集到的洗脱峰，经1KDa截留分子量透析袋4℃透析，每2h换水一次，换水6次；收集透析后的透析液，于-54℃，0.016MPa条件下进行真空冷冻干燥，通过Tricine-SDS PAGE凝胶电泳检测纯化后的抗菌肽DLP2。
本发明还提供一种分泌表达抗菌肽DLP2的重组酵母菌，其构建方法包括以下步骤：
1)对抗菌肽DLP2的编码基因进行酵母偏爱密码子优化，在优化后的基因序列的5’端添加XhoI酶切位点和Kex2切割位点，在3’端添加TAA和TAG终止子序列以及XbaI酶切位点，所得基因表达框的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示；
2)将SEQ ID No:3所示的基因经XhoI和XbaI双酶切后，与经过同样双酶切的pPICZαA载体连接，得到的重组酵母表达载体pPICDLP2；
3)载体pPICDLP2经线性化后转化感受态毕赤酵母X-33，即得分泌表达抗菌肽DLP2的重组酵母菌。
本发明通过实验证实了利用构建的重组酵母菌所分泌表达的抗菌肽DLP2，其对革兰氏阳性细菌具有强烈杀伤作用。检测了抗菌肽DLP2对不同来源金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抑制作用，发现对于青霉素敏感或抗性菌株，最小杀菌浓度(MIC)在0.015-0.236μm之间，明显优于氨苄西林(Ampicillin)(2.69-6.73μm)。另外，DLP2对猪链球菌(Streptococcus suis)的MIC值介于0.015和0.118μM之间，同样优于氨苄西林5倍左右。
本发明通过对编码抗菌肽DLP2的基因进行酵母偏爱密码子优化，构建至pPICZαA载体上，首次实现其在毕赤酵母X-33中分泌表达。通过对酵母重组菌株进行高密度诱导发酵，120h发酵后抗菌肽DLP2产量高达1860mg/L左右，可获得纯度高于90％的抗菌肽DLP2产品。采用本发明方法制备的抗菌肽DLP2可应用于抗菌药物、食品添加剂、化妆品、饲料添加剂等领域，具有广阔的应用价值和市场前景。
附图说明
图1为本发明实施例2中DLP2的PCR扩增产物及质粒载体pPICZαA提取电泳图；其中，M1：DNA分子量Marker；M2：Trans 5KMarker；2：DLP2；3：pPICZαA。
图2为本发明实施例3中线性化重组载体电泳图；其中，M:Trans5K Marker；2：pPICDLP2线性化产物；3：阴性对照。
图3为本发明实施例4中DLP2发酵上清Tricine-SDS-PAGE电泳图；M：超低分子量蛋白Marker；24-120h为5L发酵罐发酵上清。
图4为本发明实施例5中纯化后DLP2的Tricine-SDS-PAGE电泳图；M：超低分子量蛋白Marker；1：纯化后的DLP2。
图5为本发明实施例6中测到的DLP2在24-120h发酵上清对Staphylococcusaureus ATCC25923以及ATCC43300的抑菌圈。
图6为本发明实施例5中DLP2纯化后的MALDI-TOF MS分析结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
本发明中抗菌肽DLP2的氨基酸序列及其编码基因的序列分别如SEQ ID No:1和2所示。
以下实施例中使用的酶和试剂：限制性内切酶、pfuDNA聚合酶、T4DNA连接酶等分别购自Biolabs、Invitrogen和Promega公司。四种dNTP购自Promega公司。DNA和蛋白质分子量标准为Biolabs产品。其它常规试剂采用进口分装或国产分析纯。
以下实施例中涉及的培养基和缓冲液配方：
LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母浸提取物5g/L，NaCl 10g/L；固体LB培养基则加入2％的琼脂糖。
低盐LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母浸提取物5g/L，NaCl 5g/L；固体低盐LB培养基则加入2％的琼脂粉。
MH培养基：酪蛋白水解物17.5g/L，牛肉浸粉5g/L，淀粉1.5g/L。
MHA培养基：固体MH培养基则加入2％的琼脂粉。
YPD培养基：蛋白胨20g/L，酵母浸提取物10g/L，葡萄糖20g/L；固体YPD培养基则加入2％琼脂粉。
YPDS培养基：蛋白胨20g/L，酵母浸提取物10g/L，山梨醇182.2g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L。
有关LB培养基、低盐LB、MH、YPD、YPDS等培养基的使用参照Invitrogen毕赤酵母操作手册。
20mM磷酸盐缓冲液(A液)：3.1146g Na2HPO4，1.7628gNaH2PO4，加去离子水至950mL，置于磁力搅拌器至完全溶解后调pH 6.7，定容至1000mL。
1M NaCl 20mM磷酸盐缓冲液(B液)：3.1146g Na2HPO4，1.7628g NaH2PO4，58.44gNaCl，加去离子水至950mL，置于磁力搅拌器至完全溶解后调pH 6.7，定容至1000mL。
以下实施例中涉及的基因扩增及转化子鉴定方法为PCR法及DNA测序法。
以下实施例中涉及的蛋白检测方法为Tricine-SDS-PAGE，参照(H.Tricine–SDS-PAGE.Nat protoc,2006,1(1):16-22)。
以下实施例中涉及的蛋白质浓度测定方法为考马斯亮蓝法。
以下实施例中涉及的蛋白分子量的确定方法为MALDI-TOF MS法。
以下实施例中涉及的蛋白纯化的方法为基于离子层析法。
以下实施例中涉及的发酵方法为高密度发酵法。
以下实施例中涉及的菌种和质粒见表1：
表1供试菌种和质粒
实施例1 DLP2表达序列的设计与基因合成
对抗菌肽DLP2的编码基因进行酵母偏爱密码子优化，在优化后的基因序列的5’端添加XhoI酶切位点和Kex2切割位点，在3’端添加TAA和TAG终止子序列以及XbaI酶切位点，所得基因表达框的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。以上序列由上海生工生物工程股份有限公司完成。
实施例2毕赤酵母AOX启动子诱导型表达载体pPICDLP2的构建
用限制性内切酶XhoI和XbaI分别对合成的基因片段和载体pPICZaA进行双酶切，回收pPICZaA载体片段和突变体基因片段，连接，得到载体pPICDLP2。
载体pPICDLP2详细构建过程：利用限制性内切酶XhoI和XbaI分别对合成的基因片段和pPICZaA进行双酶切，酶切体系和条件如下：
以上酶切体系加样完毕后于37℃反应3小时，2％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳条件：120V，30min。电泳完毕在紫外灯下利用手术刀分别切割载体片段与基因片段对应电泳条带并利用天根生物技术有限公司胶回收试剂盒进行DNA片段回收，按试剂盒提供说明书的相关细节进行操作。
利用琼脂糖凝胶电泳检测回收片段并使用定量软件(GeneTools)进行初步定量，按照片段/载体(3:1)的摩尔比例使用T4DNA连接酶进行连接，体系和条件如下：
以上连接体系加样完毕后于金属浴22℃反应2小时，转化E.coliDH5α。转化操作细节如下：
1)连接产物加入100μL E.coli DH5α感受态细胞，冰浴30min；
2)42℃热激90s，立即冰浴2～3min；
3)加入900μL 37℃预热的LB低盐培养基，37℃，80-100rpm恢复培养1h；
4)4000rpm离心5min，吸去700μL上清；
5)重悬菌体后取100-200μL涂布含有25μg/mL Zeocin的LB低盐固体培养基；
6)37℃倒置培养12-16h。
挑取阳性转化子，根据基因序列设计引物，进行菌液PCR验证转化子正确性，PCR体系及条件如下：
PCR体系：
PCR条件：
2％琼脂糖凝胶电泳检测阳性转化子菌液PCR产物，电泳条件：120V，30min。15％甘油管保存含有重组表达载体的E.coli并提取质粒，为线性化电转P.pastoris准备，相关实验细节按照质粒提取试剂盒(天根生物科技有限公司)说明书操作。(图1)
实施例3含pPICDLP2重组酵母菌的构建
1、重组载体pPICDLP2的线性化
利用PmeI对组成型重组表达载体pPICDLP2进行酶切，酶切体系和反应条件如下：
上述酶切体系加样完毕后，于37℃反应3小时，2％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳条件：120V，30min。电泳完毕检测重组表达载体正确线性化后利用DNA回收试剂盒回收线性化的重组表达载体(图2)。
2、线性化载体的毕赤酵母电转化与鉴定
1)挑取YPD平板上的X-33单菌落，接种至10mL YPD液体培养基，30℃，250rpm，过夜培养；
2)取50μL过夜培养液接种至100mL YPD液体培养基，30℃，250rpm，培养至OD600吸光值为1.2；
3)50mL培养物，4℃，4000rpm，5min离心后加入50mL无菌水重悬；
4)4℃，4000rpm，5min离心后加入25mL无菌水重悬；
5)4℃，4000rpm，5min离心后加入2mL 1M山梨醇重悬；
6)4℃，4000rpm，5min离心后加入100μL 1M山梨醇重悬后即为X-33感受态细胞(以上6步操作必须在冰上操作，动作轻柔)；
7)预混80μL X-33感受态细胞和5-10μg线性化载体，转移至冰上预冷的0.2cm电转杯中，冰上放置5min后电转仪操作(1200V，25μF，400Ω)；
8)立即加入1mL 1M山梨醇，混匀；
9)30℃温育1-2h；
10)取100μL温育后的X-33细胞涂布含有100μg/mL Zeocin的YPDS平板，30℃倒置培养2-4天。
挑取YPDS平板上的单菌落接种至100μg/mL Zeocin的YPD液体培养基中，30℃，250rpm，过夜培养。取1mL过夜培养物4℃，12000rpm，5min离心后PBS重悬，沸水浴10min，快速放置于-70℃30min，立即再次沸水浴10min，4℃，12000rpm，5min离心后取上清作为模板进行PCR验证阳性转化子，PCR体系与条件如下：
PCR体系：
PCR条件：
2％琼脂糖凝胶电泳检测阳性转化子菌液PCR产物，电泳条件：120V，30min。将大小正确的阳性转化子一一对应转移至含有100μg/mL Zeocin的YPD平板上以备进一步表达。
实施例4抗菌肽DLP2的分泌表达
1、转化子的表达
挑取阳性转化子，接种至YPD液体培养基，30℃，250rpm振荡培养18-20h；0.5-1％接种量转接至100mL YPD液体培养基，30℃，250rpm振荡培养1天后接种至5L发酵罐，设置温度30℃，250rpm振荡培养5天至发酵结束。具体操作步骤如下：
(1)种子液准备：
甘油管活化，划平板，挑取单菌落，YPD培养基，28-30℃，250rpm，18～24h。
按1％的接种量转接至YPD培养基中，培养16～18h，OD600约为4～6。
按10％接种量接到上罐培养基中(含4.8‰PMT1)(即200ml菌液+200ml 45％葡萄糖+9.6ml PMT1)，装液量为2L/5L。
(2)菌体生长阶段：
在800rpm，pH 5.0，pO2>35％，29℃条件下培养约16-18h。
(3)添加葡萄糖生长阶段：
观测溶氧值开始缓慢下降后突然上升，开始补加50％葡萄糖(12‰PMT1,2.4ml)添加时间6-8h。流速为30ml/L/h。
(4)甲醇过渡诱导：
添加葡萄糖6h后，饥饿1h，待葡萄糖耗尽后，开始补加甲醇(含12‰PMT1,6ml)，补加过程中，流速由第1小时1ml/L/h逐渐增加到第6小时6ml/L/h，直至发酵结束。
(5)100％甲醇诱导阶段
甲醇过渡诱导6h后，开始100％甲醇连续诱导(6ml/L/h)。甲醇诱导开始后，每12h取样。
2、重组酵母发酵液抗菌活性检测
抑菌圈实验分析：挑取S.aureusATCC 25923单菌落接种于10mLMH培养基中，37℃，250rpm培养至OD600nm≈0.4，1％接种量转移至50mL MH固体培养基中，混匀，迅速倒入19cm×19cm的方形培养皿中，待凝固后，在培养基表面小心放置牛津杯，加入50μL发酵液上清。
3、重组酵母分泌蛋白水平Tricine-SDS-PAGE检测
对所获得的高活性重组酵母菌株进一步采用Tricine-SDS-PAGE分析重组突变体表达水平，电泳方法参照2006。(图3)
实施例5抗菌肽DLP2的纯化
1、阳离子交换层析纯化
Bradford法测定蛋白浓度，4℃，12000rpm离心10min后取上清。将HiPrep SP FF阳离子交换柱(长度16mm，内径10mm，GE Healthcare)利用A液平衡5-10个柱体积后上样。进样完毕后，先用含有20mM，pH7.0的磷酸盐洗脱缓冲液(A液)进行洗脱，待穿透峰洗脱完后，用含有1M NaCl的20mM，pH7.0的磷酸盐洗脱缓冲液(B液)进行洗脱，收集洗脱峰。洗脱步骤为：100％A液，洗脱5个柱体积，为穿透峰；40％A，60％B液，洗脱5个柱体积，为洗脱峰。利用UV215nm监测洗脱情况，Tricine-SDS-PAGE和检测目标产物纯化情况。
2、1KDa透析袋除盐
收集到的洗脱峰，经1KDa截留分子量透析袋4℃透析，每2h换水一次，换水6次。收集透析后的透析液，低温真空冷冻干燥机(-54℃，0.016MPa)冻干，通过Tricine-SDS PAGE凝胶电泳检测。(图4)
图6为抗菌肽DLP2纯化后的MALDI-TOF MS分析结果。
通过对酵母重组菌株进行高密度诱导发酵，120h发酵后抗菌肽DLP2产量高达1860mg/L左右，可获得纯度高于90％的抗菌肽DLP2产品。
实施例6抗菌肽DLP2抗金黄色葡萄球菌活性检测
抗菌肽DLP2对病原菌的最小抑菌浓度(MIC)参照Tian等(Tian等，Expression ofantimicrobial peptide LH multimers in Escherichia coli C43(DE3).AppliedMicrobiology and Biotechnology,2009,83(1):143-149)建立的微量肉汤稀释法，根据具体情况略有改动，操作细节如下：
1)挑取供试菌株单克隆至MH培养基，37℃，250rpm，振荡过夜培养；
2)将抗菌药物按2倍梯度系列稀释至1.5mL无菌离心管中，浓度分别是终浓度的10倍；
3)以1％的接种量分别将供试菌株转接至MH液体培养基中37℃，250rpm振荡培养至0.5个麦氏标准比浊；
4)稀释供试菌培养液1000倍(最终菌体浓度为105CFU/mL左右)，转移至无菌细胞培养板中，每孔含稀释后菌液90μL；
5)加入稀释后的药物10μL，每个浓度3个平行样，并预留无药物阴性对照孔。加无菌培养板板盖，封口膜封闭后37℃静止培养至阴性对照空出现肉眼可见的明显浑浊菌液。将细胞培养板取出，观测结果，MIC值是能够明显抑制受试菌株生长的最小浓度。如出现跳孔或平行样间结果不一致情况，则重新测试。
取DLP2进行抗菌活性测定，结果如表2所示。
表2抗菌肽DLP2的抗菌活性
由表2可知，DLP2对金黄色葡萄球菌有较强抑制作用：对金黄色葡萄球菌ATCC25923的MIC为0.031μg/ml；对ATCC6538的MIC为0.5μg/ml；对ATCC43300的MIC为0.5μg/ml。可见，DLP2对链球菌有较强抑制作用，对猪链球菌CVCC606的MIC为0.0625μg/ml。
实施例7抗菌肽DLP2的抑菌圈实验
通过抑菌圈实验来检测DLP2抗菌谱(Zhang,et.,2011)。挑取金黄色葡萄球菌ATCC25923以及ATCC43300受试菌单菌落接种于液体MH培养基中，37℃振荡培养至OD600nm为0.4，分别向20mL相应的固体培养基(42℃)加入200μl上述菌液，快速混匀，倒入培养皿中，待培养基完全凝固后，在其表面放置牛津杯，加入12μl由实施例4中发酵得到的24-120h发酵上清，37℃静置培养16-18h，放入凝胶成像系统中拍照。(图5)
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 北京生泰云科技有限公司
<120> 新型抗菌肽DLP2的制备方法
<130> KHP171112323.1
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 40
<212> PRT
<213> 抗菌肽DLP2
<400> 1
Ala Thr Cys Asp Leu Leu Ser Pro Phe Lys Val Gly His Ala Ala Cys
1 5 10 15
Ala Leu His Cys Ile Ala Met Gly Arg Arg Gly Gly Trp Cys Asp Gly
20 25 30
Arg Ala Val Cys Asn Cys Arg Arg
35 40
<210> 2
<211> 120
<212> DNA
<213> 抗菌肽DLP2
<400> 2
gcaacctgtg acctcttgag tcccttcaaa gtgggtcatg ctgcctgcgc acttcattgt 60
attgccatgg gacgacgagg aggctggtgc gatggtcgag ccgtttgtaa ttgcagacgc 120
<210> 3
<211> 149
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tctctcgaga aaagagctac ttgtgatttg ttgtctccat ttaaggttgg tcatgctgct 60
tgtgctttgc attgtattgc tatgggtaga agaggtggtt ggtgtgatgg tagagctgtt 120
tgtaactgta gaagataatg atctagagc 149

Claims (5)

1.新型抗菌肽DLP2的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)基因表达框的设计：对抗菌肽DLP2的编码基因进行酵母偏爱密码子优化，在优化后的基因序列的5’端添加XhoI酶切位点和Kex2切割位点，在3’端添加TAA和TAG终止子序列以及XbaI酶切位点，所得基因表达框的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示；
2)重组酵母表达载体的构建：将SEQ ID No:3所示的基因经XhoI和XbaI双酶切后，与经过同样双酶切的pPICZαA载体连接，得到的重组酵母表达载体pPICDLP2；
3)重组酵母菌的制备：载体pPICDLP2经线性化后转化感受态毕赤酵母X-33，筛选出高水平表达抗菌肽DLP2的重组酵母菌；
4)抗菌肽DLP2的制备：对步骤3)中获得的重组酵母菌进行发酵培养，通过补加葡萄糖和甲醇诱导，获得发酵液，离心收集上清，上清经纯化后即得抗菌肽DLP2。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)具体为：
①种子液制备：
挑取单菌落接种于YPD培养基中，28～30℃，250rpm振荡培养18～24h；然后按1％的接种量，转接至YPD培养基中，28～30℃，250rpm振荡培养16～18h，OD600达到4～6；然后，按10％接种量接到上罐培养基中，即200ml菌液+200ml 45％葡萄糖+9.6ml PMT1，装液量为2L/5L，于29℃，800rpm，pH 5.0，pO2>35％的条件下培养16-18h；
②添加葡萄糖生长阶段：
观测发酵液的溶氧值开始缓慢下降后突然上升，开始补加含12‰PMT1的50％葡萄糖溶液，添加时间6-8h，流速为30ml/L/h；
③甲醇过渡诱导：
添加葡萄糖6h后，饥饿1h，待葡萄糖耗尽后，开始补加含12‰PMT1的无水甲醇，补加过程中，流速由第1小时1ml/L/h逐渐增加到第6小时6ml/L/h，直至发酵结束；
④100％甲醇诱导阶段：
甲醇过渡诱导6h后，开始100％甲醇连续诱导，流速为6ml/L/h；甲醇诱导开始后，每12h取样，测定重组酵母菌分泌表达抗菌肽DLP2的水平。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中采用阳离子交换层析对上清进行纯化。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，阳离子交换层析纯化的具体操作如下：
发酵液于4℃，12000rpm离心10min后取上清，将长度16mm、内径10mm的HiPrep SP FF阳离子交换柱用A液平衡5-10个柱体积后上样；进样完毕后，先用A液进行洗脱，待穿透峰洗脱完后，用B液进行洗脱，收集洗脱峰；
洗脱步骤为：100％A液，洗脱5个柱体积，为穿透峰；40％A，60％B液，洗脱5个柱体积，为洗脱峰；利用UV215nm监测洗脱情况，Tricine-SDS-PAGE和检测目标产物纯化情况；其中，所述A液为20mM，pH7.0的磷酸盐洗脱缓冲液，所述B液为含有1M NaCl的20mM，pH7.0的磷酸盐洗脱缓冲液；
收集到的洗脱峰，经1KDa截留分子量透析袋4℃透析，每2h换水一次，换水6次；收集透析后的透析液，于-54℃，0.016MPa条件下进行真空冷冻干燥，通过Tricine-SDS PAGE凝胶电泳检测纯化后的抗菌肽DLP2。
5.一种分泌表达抗菌肽DLP2的重组酵母菌，其构建方法包括以下步骤：
1)对抗菌肽DLP2的编码基因进行酵母偏爱密码子优化，在优化后的基因序列的5’端添加XhoI酶切位点和Kex2切割位点，在3’端添加TAA和TAG终止子序列以及XbaI酶切位点，所得基因表达框的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示；
2)将SEQ ID No:3所示的基因经XhoI和XbaI双酶切后，与经过同样双酶切的pPICZαA载体连接，得到的重组酵母表达载体pPICDLP2；
3)载体pPICDLP2经线性化后转化感受态毕赤酵母X-33，即得分泌表达抗菌肽DLP2的重组酵母菌。
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