CN116478893B - 一种产丙酸的工程益生菌的构建与应用 - Google Patents
一种产丙酸的工程益生菌的构建与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种合成胞外丙酸的工程益生菌、构建方法，及其在医药、农药、食品等领域中的应用。所述益生菌包括导入四种基因构成的丙酸人工合成途径，所述四种基因包括第一种编码乳酸脱氢酶的基因ldhA，第二种编码丙酸辅酶A‑转移酶的基因pct，第三种编码乳糖辅酶A脱水酶的基因lcdA，第四种编码丙烯酰辅酶A还原酶的基因acuI。所述工程益生菌还可以包括第五种基因修饰，所述修饰包括基于丙酮酸合成乙酸的天然合成途径中的酶的活性降低或者表达被抑制。本发明的工程益生菌能稳定，持续，高效表达丙酸。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和微生物发酵技术领域，具体涉及一种产丙酸的工程益生菌、构建方法、发酵工艺及其在医药，畜牧业，食品，保健或化工领域中的应用。
背景技术
丙酸(Propanoic Acid，PA)是肠道菌群代谢产生的短链脂肪酸(short-chainfatty acids，SCFA)之一，主要以游离的形式存在。已有研究证实丙酸具有许多重要的生理功能，参与物质代谢、促进肠道组织发育、增强机体免疫等生理活动。已有研究表明丙酸对于炎症性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)有良好的治疗效果，能够改善肠道屏障功能。
然而直接补充丙酸存在生物利用度低、持续作用效果差等弊端；使用一些产丙酸的天然细菌，例如丙酸梭菌，韦荣氏球菌，嗜黏蛋白阿克曼菌等等，也能改善肠道炎症，但是大多数天然产丙酸细菌都是非益生菌，可能存在一定的毒力因子，因而导致肠道菌群紊乱。
发明内容
本发明的目的是克服上述现有技术的不足，通过合成生物学手段对天然益生菌进行合理设计，添加丙酸合成、表达通路上的基因，使得天然益生菌从无到有产生丙酸，并实现机体肠道屏障功能的修复。具体地，
本发明第一方面，提供了一种产丙酸的工程益生菌，所述工程益生菌包括导入丙酸合成途径中的四种基因的修饰，所述四种基因包括：第一种包括编码乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)的基因ldhA，第二种包括编码丙酸辅酶A-转移酶(Propionate CoA-transferase,PCT)的基因pct，第三种包括编码乳糖辅酶A脱水酶(Lactoyl-CoA dehydratase,LCD)的基因lcdA，第四种包括编码丙烯酰辅酶a还原酶(Acryloyl CoAreductase,ACU)的基因acuI。
所述工程益生菌经过四种基因的修饰，可以合成终产物丙酸。其中，
通过第一种基因，使得益生菌可以在丙酮酸基础上合成L-乳酸，这是丙酸合成的第一步；
通过第二种基因，使得益生菌能够合成乳酰辅酶A，这是丙酸合成的第二步；
通过第三种基因，使得益生菌进一步可以合成丙烯酰辅酶A，这是丙酸合成的第三步；
通过第四种基因，使得益生菌可以合成丙酰基辅酶A，同时在第二种基因作用下合成终产物丙酸。
优选的，所述第一种基因包括但不限于来源于肠道细菌粪肠球菌属Enterococcusfaecalis的乳酸脱氢酶编码基因ldhA。
更优选的，所述ldhA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
ldhA的核苷酸序列也可以是上述序列的互补、或者简并序列，更适合工程益生菌中表达的密码子优化序列，或者SEQ ID NO:1的突变序列，上述核苷酸序列具有编码LDH蛋白的功能。
优选的，所述突变序列包括：1)与SEQ ID NO:1具有至少90％的同一性，优选的，与SEQ ID NO:1具有至少95％、96％、97％、98％、99％的同一性等等；2)相对于SEQ ID NO:1具有一个或多个核苷酸的缺失、插入或者替换；3)在严格杂交条件下与SEQ ID NO:1能够杂交，以上核苷酸序列均具有编码LDH蛋白的功能。
优选的，所述ldhA的核苷酸序列编码的LDH蛋白的序列如SEQ ID NO:2所示。或者如SEQ ID NO:2的突变序列，更优选地，所述突变序列包括：1)与SEQ ID NO:2具有至少90％的同一性，优选的，具有例如，至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性等等；2)相对于SEQ ID NO:2具有一个或多个氨基酸的缺失、插入或者替换；以上氨基酸序列均具有LDH蛋白的功能。
所述第二种基因包括但不限于来源于肠道细菌嗜热产乙酸菌属Moorellathermoacetica的丙酸辅酶A-转移酶编码基因pct。
更优选的，所述pct的核苷酸序列可以如SEQ ID NO:3所示。
pct的核苷酸序列也可以是上述序列的互补、或者简并序列，更适合工程益生菌中表达的密码子优化序列。或者SEQ ID NO:3的突变序列，上述核苷酸序列具有编码PCT蛋白的功能。
优选的，所述突变序列包括：1)与SEQ ID NO:3具有至少90％的同一性，优选的，与SEQ ID NO:3具有至少95％、96％、97％、98％、99％的同一性等等；2)相对于SEQ ID NO:3具有一个或多个核苷酸的缺失、插入或者替换；3)在严格杂交条件下与SEQ ID NO:3能够杂交，以上核苷酸序列均具有编码PCT蛋白的功能。
优选的，所述pct的核苷酸序列编码的PCT蛋白的序列如SEQ ID NO:4所示。或者如SEQ ID NO:4的突变序列，更优选地，所述突变序列包括：1)与SEQ ID NO:4具有至少90％的同一性，优选的，具有例如，至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性等等；2)相对于SEQ ID NO:4具有一个或多个氨基酸的缺失、插入或者替换；以上氨基酸序列均具有PCT蛋白的功能。
所述第三种基因来源于丙酸梭菌属Clostridium propionicum的乳糖辅酶A脱水酶的编码基因lcdA。
更优选的，lcdA的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
lcdA的核苷酸序列也可以是上述序列的互补、或者简并序列，更适合工程益生菌中表达的密码子优化序列。或者SEQ ID NO:5的突变序列，上述核苷酸序列具有编码LCD蛋白的功能。
优选的，所述突变序列包括：1)与SEQ ID NO:5具有至少90％的同一性，优选的，具有例如，至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性等等；2)相对于SEQ IDNO:5具有一个或多个核苷酸的缺失、插入或者替换；3)在严格杂交条件下与SEQ ID NO:5能够杂交；以上核苷酸序列均具有编码LCD蛋白的功能。
优选的，所述lcdA的核苷酸序列编码的LCD蛋白的序列如SEQ ID NO:6所示。或者如SEQ ID NO:6的突变序列，更优选地，所述突变序列包括：1)与SEQ ID NO:6具有至少90％的同一性，优选的，具有例如，至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性等等；2)相对于SEQ ID NO:6具有一个或多个氨基酸的缺失、插入或者替换；以上氨基酸序列均具有LCD蛋白的功能。
所述第四种基因来源于丙酸梭菌属Clostridium propionicum的丙烯酰辅酶a还原酶的编码基因acuI。
更优选的，acuI的核苷酸序列如SEQ ID NO:7。
acuI的核苷酸序列也可以是上述序列的互补、或者简并序列，更适合工程益生菌中表达的密码子优化序列。或者SEQ ID NO:7的突变序列，上述核苷酸序列具有编码ACU蛋白的功能。
优选的，所述突变序列包括：1)与SEQ ID NO:7具有至少90％的同一性，优选的，具有例如，至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性等等；2)相对于SEQ IDNO:7具有一个或多个核苷酸的缺失、插入或者替换；3)在严格杂交条件下与SEQ ID NO:7能够杂交；以上核苷酸序列均具有编码ACU蛋白的功能。
优选的，所述acuI的核苷酸序列编码的ACU蛋白的序列如SEQ ID NO:8所示。或者如SEQ ID NO:8的突变序列，更优选地，所述突变序列包括：1)与SEQ ID NO:8具有至少90％的同一性，优选的，具有例如，至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性等等；2)相对于SEQ ID NO:8具有一个或多个氨基酸的缺失、插入或者替换；以上氨基酸序列均具有ACU蛋白的功能。
优选的，经过上述丙酸合成酶的四种基因的修饰，改造后的工程益生菌相比于未经基因修饰的工程益生菌，获得生产丙酸的能力，丙酸初步产量48h可达至少25mg/L，例如28、30、33、35、38、40、45、50mg/L等等。
优选的，上述四种基因的修饰使得编码的酶的活性提高或过表达，更优选的，所述使得编码的酶的活性提高或过表达的基因修饰方式包括点突变，连接强启动子，连接增强子，提高拷贝数、外源导入或者融合共表达。等等。
优选的，基于工程益生菌内源基因的不同，上述四种基因可以部分或者全部外源导入，或以其他方式进行基因修饰，从而在工程益生菌中建立以丙酮酸为底物合成丙酸的途径。
例如，在工程益生菌中不存在上述第一、第二、第三、第四种基因时，外源导入上述四种基因；又如，在工程益生菌中内源存在第一种基因时，外源导入第二、第三、第四种基因，优选的，可进一步对第一种内源基因进行修饰使得编码的酶的活性提高或过表达。或者在工程益生菌中内源存在第二和第三种基因时，外源导入第一、第四种基因，优选的，可进一步对第二和第三种内源基因进行修饰使得编码的酶的活性提高或过表达，以此类推。
优选的，上述工程益生菌还包括第五种基因修饰，所述修饰包括基于丙酮酸合成乙酸途径中的酶的活性降低或者表达被抑制。
更优选的，所述第五种基因修饰后降低乙酸(Acetic acid，AA)的合成。
更优选的，所述第五种基因包括编码丙酮酸甲酸裂解酶(Pyruvate formatelyase,PFL)的基因pflB、编码丙酮酸脱氢酶(Pyruvate dehydrogenase，PDH)的基因poxB和/或编码乙酸激酶(Acetate kinase，AK)的基因ackA。
更优选的，所述修饰包括但不限于点突变，缺失，插入，反义polynucleotides，siRNA，microRNA，CRISPR，更为优选的，所述修饰方式包括点突变，缺失或插入一个或者多个核苷酸，点突变如单核苷酸的转换(嘌呤到嘌呤或嘧啶到嘧啶)或者颠换(嘌呤到嘧啶或嘧啶到嘌呤)。核苷酸的突变可以导致在其表达的多肽中一个或者多个保守的或者非保守的氨基酸的置换，这种置换可能会导致多肽的构象发生变化，也可能失去部分或者全部功能，可能发生移码突变将导致整个多肽链从该点处开始编码一个完全不同的多肽，也可能提前形成一个终止密码子使得多肽链残缺，甚至使基因沉默。
缺失或插入用核苷酸序列可以用PCR或者化学合成的方法得到，也可以利用细胞复制扩增得到。使基因酶活性或表达被完全抑制的基因修饰还可以通过提供或表达反义寡核苷酸antisense polynucleotides，siRNA，microRNA或其他可以阻止待修饰基因的mRNA翻译为蛋白质的核苷酸的方法来实现。近年来发展的类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)和CRISPR技术——规律成簇的间隔短回文重复(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)也可以用来失活基因。
本发明中提到的使基因酶活性降低或表达被抑制的基因修饰指的是能够使得这种酶/多肽的活性降低(与未经基因修饰的益生菌或野生型益生菌比较)至少95％(例如至少96％，97％，98％，99％，或者100％)。
在一个具体的实施方式中，所述编码丙酮酸甲酸裂解酶(Pyruvate formatelyase，PFL)的基因pflB、丙酮酸脱氢酶(Pyruvate dehydrogenase，PDH)的基因poxB和/或乙酸激酶(Acetate kinase，AK)的基因ackA的核苷酸序列部分或者全部缺失。
上述第五种基因修饰，改造后的工程益生菌相对于野生型或者上述四种基因修饰的工程益生菌，丙酸合成能力进一步得到增强，产率提高至少50％、例如50％、75％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％，甚至更高。
进一步的，所述基因的修饰方式包含使用选择标记基因。优选的，所述选择标记基因包括但不限于URA3，LEU2，HIS3，TRP1。更优选使用URA3选择标记基因。更进一步优选的，所述基因的修饰方式是循环使用选择标记基因而不保留选择标记基因。
本发明所描述的工程益生菌，较未经基因修饰的大肠杆菌获得一定水平的丙酸合成能力，且合成水平得到了显著的增强。最优的方案中，本文描述的工程益生菌的丙酸产量可达113mg/L。
优选的，所述的工程益生菌包括益生大肠杆菌、酵母菌、益生芽孢菌、丙酸梭菌、乳杆菌、双歧杆菌、放线菌等等，更优选的，所述益生大肠杆菌包括Escherichia coli nissle1917(EcN)，酵母菌包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)，树干毕赤酵母(Pichiastipitis)，SaccharomycesBayanus和休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)中的任意一种。
本发明的第二方面，提供一种上述工程益生菌的构建方法，所述构建方法包括：
1)在工程益生菌中导入丙酸合成的四种基因中的一种或者多种，使得工程益生菌以丙酮酸为底物的基础上合成丙酸。
优选的，所述构建方法中还包括2)对工程益生菌引入第五种基因修饰，所述修饰包括基于丙酮酸合成乙酸天然途径中的酶的活性降低或者表达被抑制。
更优选的，所述第五种基因修饰后降低乙酸(Acetic acid，AA)的合成。
更优选的，第五种基因修饰使修饰后基因编码酶的活性降低或表达被抑制，上述第五种基因的修饰方式包括但不限于点突变，缺失，插入，反义polynucleotides，siRNA，microRNA，CRISPR，更为优选的，所述修饰方式包括点突变，缺失或插入一个或者多个核苷酸，点突变如单核苷酸的转换(嘌呤到嘌呤或嘧啶到嘧啶)或者颠换(嘌呤到嘧啶或嘧啶到嘌呤)。核苷酸的突变可以导致在其表达的多肽中一个或者多个保守的或者非保守的氨基酸的置换，这种置换可能会导致多肽的构象发生变化，也可能失去部分或者全部功能，可能发生移码突变将导致整个多肽链从该点处开始编码一个完全不同的多肽，也可能提前形成一个终止密码子使得多肽链残缺，甚至使基因沉默。
缺失或插入用核苷酸序列可以用PCR或者化学合成的方法得到，也可以利用细胞复制扩增得到。使基因酶活性或表达被完全抑制的基因修饰还可以通过提供或表达反义寡核苷酸antisense polynucleotides，siRNA，microRNA或其他可以阻止待修饰基因的mRNA翻译为蛋白质的核苷酸的方法来实现。近年来发展的类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)和CRISPR技术--规律成簇的间隔短回文重复(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)也可以用来失活基因。
在一个具体的实施方式中，所述编码丙酮酸甲酸裂解酶(Pyruvate formatelyase，PFL)的基因pflB、丙酮酸脱氢酶(Pyruvate dehydrogenase，PDH)的基因poxB和/或乙酸激酶(Acetate kinase，AK)的基因ackA的核苷酸序列部分或者全部缺失。
更优选的，所述第五种基因修饰方式包括利用CRISPR技术使得基因全部缺失。
进一步优选的，所述CRISPR技术包括使用sgRNA缺失(敲除)第五种基因。
在一个具体的实施方式中，所述sgRNA的pflB靶向序列包括SEQ ID NO:27。
在一个具体的实施方式中，所述sgRNA的poxB靶向序列包括SEQ ID NO:28。
在一个具体的实施方式中，所述sgRNA的ackA靶向序列包括SEQ ID NO:29。
进一步优选的，所述步骤1)包括：(1-1)构建包含第一种和/或第二种基因的载体；(1-2)将步骤(1-1)的载体导入到工程益生菌，获得包含第一种和/或第二种基因的工程益生菌；(1-3)构建包含第三种和/或第四种的载体；(1-4)将步骤(1-3)的载体导入到步骤(1-2)的工程益生菌，获得包含第一种、第二种、第三种和第四种基因的工程益生菌。
所述步骤2)包括：(2-1)构建包含靶向第五种基因的载体；(2-2)将步骤(2-1)的载体导入到步骤1)获得的第五种基因缺失的工程益生菌。
优选的，所述载体包含调控元件，进一步优选的，所述调控元件包括启动子，终止子等等。
进一步的，所述载体还包括左同源臂序列和右同源臂序列。优选的，所述导入包括利用CRISPR/Cas9进行基因编辑。更优选的，使用gRNA和上述载体一起进行导入。
在一个具体的实施方式中，
所述步骤1)包括：
(1-1)构建包含第一种和第二种基因的质粒载体pCDFDuet-ldhA-pct；
(1-2)将步骤(1-1)的载体导入到工程益生菌，获得包含第一种和第二种基因的工程益生菌；
(1-3)构建包含第三种和第四种基因的质粒载体pETDuet-lcdA-acuI；
(1-4)将步骤(1-3)的载体导入到步骤(1-2)的工程益生菌，获得包含第一种、第二种、第三种和第四种基因的工程益生菌。
所述步骤2)包括：
(2-1)构建包含靶向第五种基因的sgRNA序列的载体；
(2-2)将步骤(2-1)的载体导入到步骤1)获得的工程益生菌以缺失(敲除)第五种基因，获得包含多种基因修饰的工程益生菌。
在工程益生菌中基因修饰的顺序可以不分先后，任一组合的被修饰。所述第一、二、三、四、五种基因仅仅是为了区分彼此而进行的基因命名，并不表明时间的先后顺序，例如，可以在第四种基因修饰后进行第一种基因修饰，也可以在第一种基因修饰后，进行第五种基因的修饰，然后进行第三种基因的修饰，又例如可以在第五种基因修饰后，进行第四种基因的修饰，然后进行第一种基因修饰，等等，修饰后，在工程益生菌中至少包括第一、二、三、四种基因的修饰。
进一步优选的，核苷酸序列(如表达载体)可以通过多种方法导入到益生菌细胞或者其他宿主细胞中。这些方法包括(不局限于此)电穿孔法，磷酸钙沉淀法，热激法，脂质转染法，显微注射法，氯化锂法，醋酸锂法和病毒介导基因转移法。
除了益生菌细胞，宿主细胞还可以是任何可以用于标准分子生物学操作并产生核苷酸和多肽的细胞。包括但不仅限于细菌细胞(如E.coli)，昆虫细胞，植物细胞和哺乳动物细胞(如CHO或COS细胞)。益生菌细胞包括本文中描述的工程益生菌细胞。本文所指的宿主细胞不仅包括对其进行核苷酸转导的母细胞，还包括其子细胞。
在本发明的基因修饰过程中，供转入益生菌细胞筛选使用的选择标记基因包括但不仅限于益生菌可用的任何营养缺陷型基因，如URA3、LEU2、HIS3、TRP1、LYS2。为了能进行尽可能多的基因修饰，同时避免营养缺陷型基因表达本身带来的可能干扰，优选能方便地被反复、循环使用的URA3基因。更进一步优选的，URA3等选择标记基因被循环使用而不保留在被基因修饰的菌株中。
虽然本发明实施例所应用的策略针对益生大肠杆菌，例如Escherichia colinissle 1917(EcN)菌株的基因和多肽，但是相同的策略同样适用于其他益生菌，例如酵母菌、益生芽孢菌、丙酸梭菌、乳杆菌、双歧杆菌、放线菌等，可以根据这些益生菌中内源基因的不同，而导入丙酸合成的其他外源基因，包括上述第一至第四基因的一种或者多种基因，并可根据益生菌的不同而对密码子进行优化。在这些菌株中通路或者基因名称或许稍有不同，但是可以应用同样的策略和技术来修饰相应的通路和同源基因。此处描述的基因工程工程益生菌是本领域的研究人员所熟知的。
本发明第三方面，提供一种利用上述的工程益生菌生产丙酸的方法，所述方法包括在培养基中培养上述工程益生菌。
优选的，所述方法中培养基包括碳源，氮源，微量元素。
更优选的，所述方法中，培养基包括葡萄糖浓度为16-25g/L，酵母提取物为8-12g/L，蛋白胨为15-25g/L。
本发明第四方面，提供一种利用上述的工程益生菌发酵生产的发酵产物。
优选的，所述发酵产物包括上述工程益生菌和分泌的丙酸。
更优选的，所述丙酸含量至少25mg/L，例如30、35、40、45、50、55、58、60、67、72、80、90、101、113、150mg/L以上，甚至更高。
本发明第五方面，提供上述任一的工程益生菌或者发酵产物在生产丙酸中的用途。
本发明第六方面，提供上述任一的工程益生菌或者发酵产物在医药，农药，食品，制酒等领域的应用。
优选的，所述应用包括：
作为医药领域中药物组合物，所述药物组合物促进肠道组织发育、增强机体免疫、改善肠道屏障功能、改善炎症细胞受损、治疗炎症性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)；
作为农药领域中的除草剂；
作为食品领域中的防腐剂、防霉剂和/或香料等等；
作为制酒领域中啤酒制备中黏性物质抑制剂。
本发明第七方面，提供一种制备医药，农药，食品，制酒等领域的产品的方法，所述方法包括利用上述任一的工程益生菌或者所述任一的发酵产物制备上述产品。
优选的，所述方法包括将所述工程益生菌或者发酵产物进一步加工成任何其他剂型，更优选的，所述剂型包括可食用的剂型，进一步优选的，所述剂型为粉剂，颗粒剂，片剂，胶囊，或液体形式。更优选的，为低温干燥或喷雾干燥方法制备粉剂。
本发明第八方面，提供一种制剂，所述制剂包含上述任意的工程益生菌或上述任意的发酵产物。
优选的，所述制剂包括任意的剂型，更优选的，所述剂型包括可食用的剂型，进一步优选的，所述剂型为粉剂，颗粒剂，片剂，胶囊，或液体形式。更优选的，为低温干燥或喷雾干燥方法制备粉剂。
本发明的第九方面，提供一种药物组合物，所述药物组合包含上述任一所述的工程益生菌或者发酵产物。
优选的，所述药物组合物促进肠道组织发育、增强机体免疫、改善肠道屏障功能、改善炎症细胞受损、治疗炎症性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)。
若非特殊说明，本文涉及的所有专业术语、技术概念都是本领域技术人员所熟知的。尽管有多种类似或等效的方法可以用来构建和测定本发明中涉及的工程益生菌，下文中将描述一种合适的方法和材料。这些材料、方法和例子只是作为举证，它不在任何程度上限制本发明。本文中提到的所有文献、专利和其他参考资料均尊重其完整性。本发明涉及的方法和材料将在下文中与详细说明和图表一同给出。
本发明的优点和益处：
1.本发明首次将产丙酸途径引入到工程益生菌，所得重组工程益生菌具有低营养需求、容易培养、适合大规模发酵生产丙酸并易于实现产业化的性能；
2.通过基因工程手段进行相关基因修饰，在引入丙酮酸途径中4种关键丙酸合成基因时，赋予工程益生菌初步合成丙酸的能力，在减少乙酸合成旁路代谢分流通量的同时，提高丙酸前体物质的胞内外运输和积累，使所得重组工程益生菌能稳定，持续，高效生产丙酸，产量可达113mg/L。
3.优选的方案中，本发明利用sgRNA对第五基因进行敲除，敲除效率高。
4.本发明克服了原非益生菌合成丙酸的缺陷，对机体无毒副作用，结合益生菌的作用，包括改善肠道屏障功能、促进营养物质的消化吸收、提高机体免疫力等功能，将推动高值医药和生化产品的绿色清洁生产，能广泛应用于医药、食品等领域，具有重要的经济价值和社会意义。
附图说明
图1为丙烯酸途径相关基因载体图谱以及表达情况。
图2为pflB、ackA、poxB基因敲除结果，M:5K DNAMarker；A:阳性对照(同源臂)；B:正确转化子；C:阴性对照(EcN)。
图3为工程菌EcNP1生长情况以及丙酸产量，A：EcNP1发酵液气相色谱图；B：EcN和EcNP1生长曲线；C：PA标品气相色谱图；D：EcNP1发酵过程PA产量。
图4为工程菌发酵过程中8-32h的AA和PA产量。
图5为野生型益生菌和工程菌发酵48h后的PA产量。
图6为工程菌对结肠上皮细胞屏障功能的影响，其中，对照：不给药对照组；EcN：EcN发酵上清液干预组；EcN-2：EcN发酵上清液稀释两倍；EcN-5：EcN发酵上清液稀释5倍，同理稀释10、20倍，EcNP3组命名规则相同。
图7为工程菌对结肠上皮细胞屏障功能的影响，A:野生型益生菌EcN、工程菌EcNP3和PA标品对共培养炎症模型干预后的跨膜电阻值；B:野生型益生菌EcN、工程菌EcNP3和PA标品对共培养炎症模型干预后的荧光黄表观透过系数。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。可以理解的是，在此描述的特定实施方式通过举例的方式来表示,其并不作为对本发明的限制。若非特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。在不偏离于本发明范围的情况下,本发明的主要特征可以用于各种实施方式。本领域的技术人员将会意识到或能够确认，仅仅使用常规实验，许多等同物都能应用于本文所描述的特定步骤中。这些等同物被认为处在本发明的范围之内，并且被权利要求所覆盖。
实施例中所涉及的几种培养基如下：
LB(Luria Bertani)
液体：葡萄糖浓度为16-25g/L，酵母提取物为8-12g/L，蛋白胨为15-25g/L。于121℃灭菌15min。
固体：在液体LB培养基中加入终浓度1.5％(w/v)的琼脂粉，灭菌后稍微冷却即可倒平板。
实施例1：EcN中丙酸合成相关基因ldhA、pct、lcdA、acuI的移植表达
选取肠道细菌乳酸菌属Moorella thermoacetica和丙酸梭菌属Clostridiumpropionicum中相关基因ldhA、pct、lcdA、acuI，其中，
ldhA基因序列如SEQ ID NO:1；
pct基因序列如SEQ ID NO:3；
lcdA基因序列如SEQ ID NO:5；
acuI基因序列如SEQ ID NO:7；
提取足量的构建好的质粒载体pCDFDuet-ldhA-pct(参见图1A)和pETDuet-lcdA-acuI(参见图1B)，将其引入底盘益生菌EcN中，在含50mg/mL硫酸链霉素和50mg/mL氨苄青霉素双抗平板上挑取单菌落，通过PCR筛选阳性转化子EcNP1。
表1丙酸合成相关基因ldhA、pct、lcdA、acuI所用引物
实施例2：RT-PCR检测EcNP1中丙酸合成相关基因ldhA、pct、lcdA、acuI的表达
检测工程菌中丙烯酸合成途径相关外源基因是否成功引入，需要通过RT-PCR检测相关基因表达情况，采用北京全式金生物技术有限公司的RNAprep Pure培养细胞/细菌总的RNA提取试剂盒进行总RNA的提取，具体的操作步骤如下。
1.将菌株在装有50mL含10％葡萄糖的LB培养基的培养至对数期中期，培养条件为37℃，220rpm培养至对数生长期，细菌密度不超过109CFU/mL。取1mL发酵液，12,000rpm，4℃，离心2min收集菌体，去除上清液。
2.配置10mg/mL溶菌酶的TE缓冲溶液，用100μL溶液重悬上一步得到的菌体沉淀。
3.向上一步体系中加入350μLBB4溶液，使用涡旋充分振荡混匀，室温孵育5min。
4.用纯净的RNase-free枪头反复吹吸5-10次，使溶液均质化。
5.12,000rpm离心2min，吸取上清到RNase-free的离心管中。
6.向上清中加入250μL 100％乙醇，涡旋彻底混匀，将溶液加入离心柱中，12,000rpm离心30s，弃置流出液。
7.向离心柱中加入500μL CB4，12,000rpm离心30s，弃置流出液。
8.配置DNase I工作液去除基因组，取70μL Reaction Buffer放入RNase-free的管中，再加入10μL(30U)的DNase I，混匀，取80μL配置好的工作液加入离心柱中部，室温放置15min，然后重复步骤7一次。
9.向上一步的离心柱中加入500μL WB4，12,000rpm离心30s，弃置流出液，此操作重复一次。
10.12,000rpm离心2min，将残留的乙醇彻底去除。
11.将离心柱转入一个新的RNase-free离心管中，向离心柱中央加入30-100μLRNase-free Water，室温静置1min，12,000rpm离心2min，洗脱RNA。将得到的RNA用于后续实验或者置于-80℃保存。
对于提取的工程菌总RNA，需要针对检测的特定基因设计引物(见表3)，对其发转录合成cDNA和qPCR扩增，本实验采用全式金TransScript Green One-Step qRT-PCRSuperMix试剂盒，在同一体系中一步完成反转录到qPCR的全部反应，反应体系和程序如下表1，表2。
通过RT-PCR检测外源基因的表达情况如附图C，丙烯酸途径的相关基因在EcNP1得到正常表达。
表2qRT-PCR的反应体系
表3qRT-PCR反应条件
RT-PCR所用引物：
表4RT-PCR所用引物
实施例3：构建敲除pflB、ackA、poxB基因的工程菌菌株
根据SCFA主要代谢通路可知，PA的合成与乙酸(Acetic acid,AA)的合成和代谢有关，pflB、poxB、ackA等基因参与AA代谢合成过程，能竞争丙烯酸途径前体丙酮酸，因此本发明对AA合成代谢相关基因pflB、ackA、poxB进行敲除，是提高PA合成能力的策略之一。
针对基因pflB、ackA、poxB的敲除，本研究采用双质粒CRISPR/Cas9基因编辑系统对EcN基因组进行编辑，该系统主要包括含有限制性内切酶的Cas9的pCas质粒和提供引导RNA(guide RNA，sgRNA)的pTargetF质粒。编辑过程主要步骤如下：
1.pTargetF编辑质粒的重构
通过检索EcN基因组上基因pflB、ackA、poxB关键基因序列，在sgRNA设计平台(http://www.rgenome.net/cas-designer)在线设计sgRNA序列中靶向序列N20序列，然后根据sgRNA序列重构相应的pTargetF质粒。参考在线设计的得分，并结合本发明的需求，最终设计的N20序列如下表5：
表5重组pTargetF编辑质粒的N20序列
2.双质粒CRISPR/Cas9基因编辑步骤
1).制备EcNP1感受态，将pCas质粒和pTargetF质粒导入EcNP1中。将含有50mg/L卡那霉素溶液和50mg/L壮观霉素溶液的双抗平板置于恒温培养箱中，于30℃下培养36h。
2).挑取单菌落，进行菌落PCR，挑起阳性株加入含有5mL LB培养基的试管中，并加入0.1％卡那霉素溶液(50mg/mL)和壮观霉素溶液(50mg/mL)和1％ L-Arb溶液(0.5M)进行诱导，8～12h后挑取菌液在双抗平板上划线。于30℃下培养36h。
3).挑取单菌落，进行菌落PCR、提取基因组测序验证基因是否成功编辑，若成功编辑进入下一步。
4).挑取编辑成功的单菌落加入含有5mL LB培养基的试管中，加入0.1％卡那霉素溶液(50mg/mL)和2％ IPTG溶液(0.5M)进行诱导，对pTargetF质粒进行消除，8～12h后蘸取菌液在只含50mg/L卡那霉素溶液的单抗平板上划线。于30℃下培养36h。
5).挑取单菌落，蘸到双抗平板上，不能正常生长表明pTargetF质粒成功消除，需要进一步编辑则重新设计新的pTargetF质粒，从第1步开始继续操作。无需编辑则进入下一步消除pCas质粒。
6).挑取单菌落，加入含有5mL LB培养基的试管中，于恒温摇床42℃下培养12h，蘸取菌液在没有抗性的平板上换线，置于培养箱42℃培养12h。
7).挑取单菌落，蘸到含50mg/L卡那霉素溶液的单抗平板上不能正常生长表明pCas质粒成功消除。
对转化子采用基因两侧同源臂引物进行验证，敲除基因pflB、用同源臂引物进行初步验证，如图2。
编辑成功的阳性转化子中pflB(2284bp)基因片段缺失，引物(pflB-L和pflB-R)扩增为同源臂大小(1000bp)，然后提取基因组进行测序，以验证基因敲除。测序无误的转化子命名为EcNP2。
然后在工程菌EcNP2基础上按照相同方法敲除基因poxB(1719bp)构建工程菌EcNP3。
在工程菌EcNP2基础上按照相同方法敲除基因ackA(1203bp)构建工程菌EcNP4。
表6基因验证引物
实施例4：各种不同基因修饰工程菌EcNP生产丙酸能力评价
对上述各种不同基因工程菌EcNP修饰进行了发酵生产丙酸评价，操作如下：
将上述实施例1-3所构建的工程菌接种于0.5L的发酵瓶中，其中培养基为200mL含10g/L葡萄糖的LB培养基，起始接种量为1％，即2mL的种子液，在37℃、200rpm条件下摇床培养发酵约48h，发酵过程中采用pH电极监控发酵液pH值。
发酵结束后采用气相色谱测定发酵液中的短链脂肪酸含量，具体方法如下：
预处理，将收集的上清检测样品进行酸化处理。取2mL上清培养液于5mL聚乙烯离心管中，加入0.4mL 50％的硫酸溶液和乙醚，置于摇床中室温、200rpm培养45min，然后3000rpm离心5min，取出上清置于另外一个无菌离心管中，加入无水氯化钙进行脱水处理，之后进一步取上清液用于气相色谱质谱联用分析；
使用色谱柱Agilent 123-7032DB-WAX石英毛细管柱(30m x 320μm x 0.25μm)，不断优化得到GC-MS分析条件；升温程序：柱温的起始温度为60℃，保持2min，10℃/min的速度上升至220℃，保持20min，以氦气作为载气，流速为1mL/min，分流比20：1，进样体积2μL，进样口起始温度为250℃。质谱条件，EI离子源70eV，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，溶剂延迟时间2min，扫描质量范围m/z 20-150。
将工程菌EcNP1进行摇瓶发酵，发酵液在气相色谱下检测到PA的产生如图3，表明丙烯酸途径的引入成功实现了PA在EcN中的从头合成。工程菌EcNP1与EcN生长过程中OD600没有明显差异，导入外源基因对于益生菌EcN的生长没有明显影响。工程菌EcNP1摇瓶发酵48h产量为33.38±4.38mg/L。
如图4pflB敲除的工程菌EcNP2发酵过程中AA代谢流得到一定的削弱，PA合成效率得到进一步的提高。
在EcNP2的基础上进一步敲除poxB构建得到工程菌EcNP3，摇瓶发酵结果如图4所示，8-32h内PA合成效率更高，表明了同时敲除基因pflB、poxB能进一步提高PA合成效率。
总的来说，工程菌EcNP1、EcNP2、EcNP3、EcNP4在摇瓶发酵48h过程中，发酵液中PA产量如图5所示，发酵48h后，PA产量达到最高，具体见表7：
表7野生型益生菌和工程菌发酵48h后的PA产量
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相对于EcNP1来说，单独敲除pflB或者同时敲除pflB和poxB都减少了PA合成的旁路代谢，有效增加的PA的产量，可提高至大约3倍或者3.5倍。最终构建的工程菌EcNP3的PA产量最高为113.23±5.17mg/L。
实施例5：肠道炎症细胞模型的构建和屏障功能的测定
1.Caco-2与THP-1的培养
Caco-2细胞的复苏：将冻存的Caco-2细胞置于37℃水浴锅中，充分振荡摇晃，确保短时间内化冻，然后在1000rpm下离心5min，弃置上清液后用DMEM培养液(添加20％胎牛血清，1％双抗，1％ HEPES缓冲液，1％ L-谷氨酰胺)重悬细胞，然后将细胞转移至培养瓶中，于37℃、5％ CO2细胞培养箱中，定期观察并更换培养液。
Caco-2细胞的传代：当Caco-2细胞生长到一定密度时，除去培养基，用PBS溶液清洗细胞2-3次，然后加入消化液(含0.2％ EDTA的胰酶溶液)至没过细胞，在37℃下进行消化7-8min。当在显微镜下观察到细胞间隙变大时，然后加入DMEM培养液，终止消化，轻轻吹吸，使细胞脱离瓶壁。然后在1000rpm下离心5min，弃置上清液后用DMEM培养液重悬细胞，以1:2或1:3比例将细胞接种于新的培养瓶中，于37℃、5％ CO2、90％湿度条件下继续培养。
Caco-2细胞的冻存：将生长至融合率为80-90％的对数生长期细胞取出，除去培养基并用PBS溶液清洗2-3次，加入消化液消化，再加入培养基终止消化，然后1000rpm下离心5min，弃置上清液，用冻存液重悬细胞，将其分装在冻存管中，然后于-80℃冰箱过夜放置，最后放入液氮中长期保存。
THP-1细胞的复苏、传代和冻存操作与Caco-2细胞操作类似，采用RPMI 1640培养基(含10％胎牛血清，1％双抗，1％2-巯基乙醇)进行培养。
THP-1细胞诱导成巨噬细胞：通过细胞计数板将THP-1细胞密度调至1×106个/mL，然后取10mL细胞悬液于培养瓶中，加入100μg/L的PMA(佛波酯)诱导，于37℃、5％ CO2、90％湿度条件下培养三天后换液再培养两天，诱导完成。
2.CCK-8细胞毒性测定
考虑到干预药物可能对Caco-2细胞存在一定的毒性，故需要确定药物的干预浓度。本发明采用CCK-8法测定细胞存活率，具体步骤如下所示：
1).将100μL Caco-2细胞悬液接种于96孔板中，细胞密度调整为104个/mL。
2).24h后弃去培养基，加入含不同浓度药物的培养基100μL继续培养24h。
3).培养结束前每孔加入10μL CCK-8溶液，然后在37℃孵育2h，在450nm处测量吸光度A。
细胞存活率通过以下等式进行计算：
Y＝[(AD-ABD)/(AC-ABC)]×100％
其中ABD和ABC为相应的空白组吸光度值，AC为培养基对照组吸光度值，AD为药物治疗组吸光度值。
3.Caco-2/THP-1共培养细胞模型的建立
Caco-2细胞培养至对数生长期后，经胰酶消化后，细胞计数板下计数，调节细胞密度为2.5×105个/mL。然后取200μL细胞悬液贴壁加入Transwell小室肠腔侧(AP侧)，使其终密度为5×104个/小室，轻轻振荡，于37℃、5％ CO2条件下继续培养，每两天更换一次新鲜培养基，培养至14天后进行共培养。其中，换液时，AP侧，即小室侧，更换为200μL新鲜DMEM培养基，BL侧，即孔板侧，更换为700μL DMEM培养基/1640培养基，并且逐步提高1640培养基的比例，第14天完全更换为1640培养基。
第14天后，将下层培养基换成1640培养基，然后将诱导完成的THP-1细胞铺在基底侧(BL侧)，使其细胞密度为3-5×105个/mL，静置30min，开始共培养，并且进行药物诱导以及干预。
对照组如下：向AP侧Caco-2细胞加入DMEM培养基，向BL侧THP-1细胞加入1640培养基。
诱导组如下：向AP侧Caco-2细胞加入50ng/mL的INF-γ，向BL侧THP-1细胞加入50ng/mL的INF-γ、50ng/mL的IL-1β、1mg/L的LPS进行诱导，24h后停止诱导进行后续实验测定。
干预组如下：向AP侧Caco-2细胞加入50ng/mL的INF-γ以及体外厌氧结肠模拟发酵液，向BL侧THP-1细胞加入50ng/mL的INF-γ、50ng/mL的IL-1β、1mg/L的LPS进行诱导，24h后停止诱导进行后续实验测定。
4.细胞屏障功能的测定跨膜电阻值、荧光黄透过率是评价细胞模型构建是否成功的关键指标，能够判断细胞间的紧密连接程度以及屏障功能，同时也是药物对共培养细胞模型干预作用的评价指标，主要操作步骤如下。
跨膜电阻测定：利用Millicell-ERS电阻仪测定模型组及空白孔电阻值，并按公式计算培养期间的跨膜电阻(transepithelial electrical resistance，TEER)值。
TEER/(Ω·cm2)＝(Rt－R0)×S
公式中：Rt为实测模型电阻值/Ω；R0为测定空白孔(未接种细胞)电阻值/Ω；S为膜面积/cm2。
荧光黄跨膜通量的测定：在AP侧加入0.2mL荧光黄(20μg/mL)，BL侧加入0.7mLHBSS缓冲液，在培养箱中培养4h，取下室的转运液，在酶标仪发射波长427nm、吸收波长536nm条件下检测荧光强度，根据已测得的标准曲线，计算荧光黄在下室转运液的质量浓度，并根据以下公式计算荧光黄在各孔的表观透过系数(apparent permeabilitycoefficient，Papp)。
Papp＝(V/Sρ)×(dρ/dt)
公式中：Papp为荧光黄的表观透过系数(cm/s)；V为BL侧下室溶液体积(mL)；S为膜面积/cm2；ρ为物质起始质量浓度(g/mL)；dρ/dt表示BL侧下室在单位时间获得的物质质量浓度(g/mL)，即接收池中物质最终质量浓度除以转运时间(s)
实施例6：工程益生菌对肠道屏障功能的影响
已有研究表明PA能够通过增加结肠上皮细胞间相关紧密连接蛋白的表达、有效提高细胞间跨膜电阻值，维持肠道屏障功能。
因此需要进一步在细胞水平验证工程菌对肠道屏障的作用，取结肠发酵模型得到的发酵液，离心取上清液，按照实施例5中建模和细胞毒性检测方法确定上清液干预浓度，实验菌株采用EcN和EcNP3，分别稀释2、5、10和20倍。
结果如图6所示，将发酵液稀释5倍之后对细胞没有明显毒性，其细胞存活率甚至高于对照组(图中各组后的数字表示稀释倍数)。依据此浓度用于后续实验，PA标品取同水平有效干预浓度20mM。
通过TEER跨膜电阻和荧光评价细胞间的通透性，如图7，从A图可见，EcN和EcNP3发酵上清液相对于PA标品来说，对于细胞间的TEER电阻值提升更大，细胞间TEER阻值越大，表明结肠上皮细胞之间连接较为紧密，进一步说明野生型益生菌和工程菌都能在一定程度提高细胞间的紧密连接。从图B可见，EcNP3上清液组干预后Papp值相对较低，数值可降低到89.34％；与野生型益生菌EcN和PA标品组都有显著差异。Papp值表示荧光黄从AP侧向BL侧被动扩散的表观渗透系数，可以反映整个细胞单层的通透情况，数值越大表明炎症模型细胞受损越严重，两个数据结合分析表明，野生型益生菌EcN和工程菌EcNP3相对于PA标品，对于炎症细胞受损的改善作用更强，且工程菌的效果在一定程度上优于野生型益生菌EcN。
整体上来说，工程菌EcNP3发酵上清液对于Caco-2/THP-1共培养炎症模型肠道间的屏障功能有一定的保护作用，并且效果优于野生型益生菌EcN和PA标品。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (14)
1.一种工程益生菌，其特征在于，所述工程益生菌包括丙酸合成途径中的四种基因的修饰，所述四种基因包括：第一种为编码粪肠球菌属Enterococcus faecalis的乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase, LDH）的基因ldhA，第二种为编码嗜热产乙酸菌属Moorella thermoacetica的丙酸辅酶A-转移酶（Propionate CoA-transferase, PCT）的基因pct，第三种为编码丙酸梭菌属Clostridium propionicum的乳糖辅酶A脱水酶（Lactoyl-CoAdehydratase, LCD）的基因lcdA，第四种为编码丙酸梭菌属Clostridium propionicum的丙烯酰辅酶a还原酶（Acryloyl-CoA reductase, ACU）的基因acuI，所述第一种至第四种基因修饰使得基因过表达，
所述工程益生菌还包括其他基因修饰，其中，所述其他基因修饰包括基于丙酮酸合成乙酸天然途径中的酶的活性降低或者表达被抑制，所述其他基因为：
（1）编码丙酮酸甲酸裂解酶（Pyruvate formate lyase, PFL）的基因pflB；
（2）编码丙酮酸甲酸裂解酶（Pyruvate formate lyase, PFL）的基因pflB和编码丙酮酸脱氢酶（Pyruvate dehydrogenase, PDH）的基因poxB，或者；
（3）编码丙酮酸甲酸裂解酶（Pyruvate formate lyase, PFL）的基因pflB和编码乙酸激酶（Acetate kinase, AK）的基因ackA；
通过第一种基因，使得底盘益生菌可以在丙酮酸基础上合成L-乳酸，
其中，所述的底盘益生菌为Escherichia coli nissle 1917。
2.根据权利要求1所述的工程益生菌，其特征在于，所述使得基因过表达的基因修饰方式包括连接强启动子，连接增强子，提高拷贝数或外源导入。
3.根据权利要求1所述的工程益生菌，其特征在于，所述使得编码的酶的活性降低或表达被抑制的基因修饰方式包括缺失，反义polynucleotides，siRNA，microRNA或CRISPR。
4.一种权利要求1-3任一所述的工程益生菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：1）在底盘益生菌中导入丙酸人工合成途径中第一种至第四种的四种基因，使得底盘益生菌以丙酮酸为底物的基础上合成丙酸；
2）在底盘益生菌中引入其他基因修饰，所述修饰包括基于丙酮酸合成乙酸天然途径中的酶的活性降低或者表达被抑制，所述其他基因为权利要求1所述的其他基因。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括使用sgRNA缺失其他基因，其中，所述sgRNA的pflB靶向序列包括SEQ ID NO: 27，
所述sgRNA的poxB靶向序列包括SEQ ID NO: 28，和/或，
所述sgRNA的ackA靶向序列包括SEQ ID NO: 29。
6.一种利用权利要求1-3任一所述的工程益生菌生产丙酸的方法，其特征在于，所述方法包括在培养基中培养所述工程益生菌。
7.一种利用权利要求1-3任一所述的工程益生菌发酵生产的发酵产物。
8.根据权利要求7所述的发酵产物，其特征在于，所述发酵产物包括权利要求1-3任一所述的工程益生菌和分泌的丙酸。
9.权利要求1-3任一所述的工程益生菌或者权利要求7或8所述的发酵产物在生产丙酸中的用途。
10.权利要求1-3任一所述的工程益生菌或者权利要求7或8所述的发酵产物在医药领域的应用，所述医药领域的应用为制备药物组合物，所述药物组合物改善肠道屏障功能、改善炎症细胞受损。
11.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1-3任一所述的工程益生菌或者权利要求7或8所述的发酵产物。
12.根据权利要求11所述的药物组合物，其特征在于，所述工程益生菌或者发酵产物进一步加工成任一剂型。
13.根据权利要求12所述的药物组合物，其特征在于，所述剂型为可食用的剂型。
14.根据权利要求13所述的药物组合物，其特征在于，所述剂型为粉剂，颗粒剂，片剂，胶囊，或液体形式。
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