JP2018143238A

JP2018143238A - 有用物質の生産方法

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Publication number: JP2018143238A
Application number: JP2018032733A
Authority: JP
Inventors: 怜恵大洞; Satoe Ohora; 睦中西; Mutsumi Nakanishi; 聡杣本; Satoshi Somamoto
Original assignee: Sanyo Chemical Industries Ltd
Current assignee: Sanyo Chemical Industries Ltd
Priority date: 2017-03-01
Filing date: 2018-02-27
Publication date: 2018-09-20

Abstract

【課題】酵母を用いた有用物質の生産量に優れる生産方法を提供することを目的とする。【解決手段】培養液に含まれる酵母により有用物質を培養液中に分泌生産する有用物質の生産方法であって、前記酵母が、Ｐｉｃｈｉａ株、Ｃａｎｄｉｄａ株、Ｙａｒｒｏｗｉａ株、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ株、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ株及びＰｓｅｕｄｏｚｙｍａ株からなる群より選ばれる少なくとも１種であり、前記培養液が、一般式（１）で表される化合物（Ａ）を含有し、前記化合物（Ａ）のＨＬＢ値が１〜１６であって、かつ数平均分子量が２００〜３００００であり、前記化合物（Ａ）の重量割合が、前記培養液の重量を基準として０．０００１〜１０重量％である有用物質の生産方法。ＨＯ−（Ａ１Ｏ）ａ−（Ａ２Ｏ）ｂ−（Ａ３Ｏ）ｃ−Ｈ（１）【選択図】なし

Description

本発明は、有用物質の生産方法に関する。

酵母は、アミノ酸やタンパク質等の有用物質を生産するために広く利用されている。特に近年は、医薬上・産業上有用なタンパク質の遺伝子を酵母に導入することで形質転換した酵母によってタンパク質を効率的に生産する技術が知られるようになっている。

有用物質生産に用いる細菌として大腸菌を用いる場合は、大腸菌体内には糖鎖合成酵素が存在しないため、糖の付いていないタンパク質の生産に限定される。一方で、有用物質生産に酵母を用いると、酵母が発現するタンパク質は糖鎖合成酵素によって糖鎖付加などの翻訳後修飾を受けた後に菌体外へ分泌されるため、糖の付いたタンパク質生産が可能である。

しかし、酵母によるタンパク質生産方法では、大腸菌と比較し、タンパク質生産量が低いという課題があった。

馬場忠、「構造生物」Ｖｏｌ５．Ｎｏ．１（１９９８）、ｐ．３５〜３９江崎信芳等著、「生化学基礎の基礎」、化学同人、２００２年３月ｐ．２８８−２８９

本発明の目的は、酵母を用いた有用物質の生産量に優れる生産方法を提供することである。

本発明者らは、これらの問題点を解決するべく鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち、本発明は、培養液に含まれる酵母により有用物質を培養液中に分泌生産する有用物質の生産方法であって、前記酵母が、Ｐｉｃｈｉａ株、Ｃａｎｄｉｄａ株、Ｙａｒｒｏｗｉａ株、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ株、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ株及びＰｓｅｕｄｏｚｙｍａ株からなる群より選ばれる少なくとも１種であり、前記培養液が、一般式（１）で表される化合物（Ａ）を含有し、前記化合物（Ａ）のＨＬＢ値が０．１〜１６であって、かつ数平均分子量が２００〜３００００であり、前記化合物（Ａ）の重量割合が、前記培養液の重量を基準として０．０００１〜１０重量％である有用物質の生産方法である。
ＨＯ−（Ａ^１Ｏ）_ａ−（Ａ^２Ｏ）_ｂ−（Ａ^３Ｏ）_ｃ−Ｈ（１）
［式（１）中、Ａ^１Ｏ、Ａ^２Ｏ及びＡ^３Ｏはそれぞれ独立に炭素数２〜４のアルキレンオキシ基を表し、Ａ^２ＯはＡ^１Ｏ及びＡ^３Ｏと異なっており、ａ、ｂ及びｃは、Ａ^１Ｏ、Ａ^２Ｏ及びＡ^３Ｏのそれぞれの平均付加モル数を表し、それぞれ独立に１〜６００の数である。］

本発明の有用物質の生産方法を用いることで、酵母を用いて有用物質を多量に生産させることができる。

本発明の有用物質の生産方法は、培養液中に含まれる酵母により有用物質を培養液中に分泌生産する有用物質の生産方法であって、前記酵母が、Ｐｉｃｈｉａ株、Ｃａｎｄｉｄａ株、Ｙａｒｒｏｗｉａ株、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ株、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ株及びＰｓｅｕｄｏｚｙｍａ株からなる群より選ばれる少なくとも１種であり、前記培養液が、一般式（１）で表される化合物（Ａ）を含有し、前記化合物（Ａ）のＨＬＢ値が０．１〜１６であって、かつ数平均分子量が２００〜３００００であり、前記化合物（Ａ）の重量割合が、前記培養液の重量を基準として０．０００１〜１０重量％である有用物質の生産方法である。
ＨＯ−（Ａ^１Ｏ）_ａ−（Ａ^２Ｏ）_ｂ−（Ａ^３Ｏ）_ｃ−Ｈ（１）
［式（１）中、Ａ^１Ｏ、Ａ^２Ｏ及びＡ^３Ｏはそれぞれ独立に炭素数２〜４のアルキレンオキシ基を表し、Ａ^２ＯはＡ^１Ｏ及びＡ^３Ｏと異なっており、ａ、ｂ及びｃは、Ａ^１Ｏ、Ａ^２Ｏ及びＡ^３Ｏのそれぞれの平均付加モル数を表し、それぞれ独立に１〜６００の数である。］

本発明の生産方法に用いる培養液としては、当技術分野で一般的に用いられる細胞培養用培地あれば特に制限なく用いることができ、炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。

炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール及びプロパノール等のアルコール類が挙げられる。

窒素源としては、無機酸又は有機酸のアンモニウム塩（塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等）、アンモニア、ペプトン、肉エキス及びコーンスチープリカー等が挙げられる。

その他の必須栄養素としては、無機塩類が挙げられ、無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅及び炭酸カルシウム等が用いられる。

本発明の生産方法に用いる培養液に含まれる酵母としては、Ｐｉｃｈｉａ株、Ｃａｎｄｉｄａ株、Ｙａｒｒｏｗｉａ株、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ株、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ株及びＰｓｅｕｄｏｚｙｍａ株からなる群より選ばれる少なくとも１種が用いられる。
このうち、遺伝子操作が可能で産業利用のしやすさの観点から、Ｐｉｃｈｉａ株及び／又はＣａｎｄｉｄａ株が好ましい。

本発明の生産方法に用いる酵母は、目的とする有用物質の種類に応じて遺伝子組み換えを行った酵母を用いてもよい。遺伝子組み換えは、目的タンパク質を発現している細胞からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分離し、該ｍＲＮＡから単鎖のｃＤＮＡを作成し、次に二本鎖ＤＮＡを合成し、合成した二本鎖ＤＮＡをファージＤＮＡ又はプラスミドに組み込み、得られた組み換えファージ又はプラスミドを宿主に形質転換しｃＤＮＡライブラリーを作成する方法等で行うことができる。
目的とするＤＮＡを含有するファージＤＮＡ又はプラスミドをスクリーニングする方法としては、ファージＤＮＡ又はプラスミドと目的タンパク質遺伝子又は相補配列の一部をコードするＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション法が挙げられる。スクリーニング後のファージ又はプラスミドから目的とするクローン化ＤＮＡ又はその一部を切りだし、該クローン化ＤＮＡ又はその一部を発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することによって、目的遺伝子の発現ベクターを作製することができる。内膜を移行させるシグナル配列（ペリプラズムに目的物質を発現させるシグナル配列）をコードするＤＮＡを同時に連結することもできる。

本発明の方法で用いる培養液中は、一般式（１）で表される化合物（Ａ）を含有する。化合物（Ａ）は、１種を単独で用いても、２種以上を併用して用いても良い。
ＨＯ−（Ａ^１Ｏ）_ａ−（Ａ^２Ｏ）_ｂ−（Ａ^３Ｏ）_ｃ−Ｈ（１）
一般式（１）中、Ａ^１Ｏ、Ａ^２Ｏ及びＡ^３Ｏはそれぞれ独立に炭素数２〜４のアルキレンオキシ基を表す。なお、Ａ^２ＯはＡ^１Ｏ及びＡ^３Ｏと異なる。
炭素数２〜４のアルキレンオキシ基としては、エチレンオキシ基（以下ＥＯと略記）、１，２−プロピレンオキシ基（以下ＰＯと略記）、１，３−プロピレンオキシ基、１，２−ブチレンオキシ基（以下ＢＯと略記）、１，３−ブチレンオキシ基、１，４−ブチレンオキシ基及び２，３−ブチレンオキシ基が挙げられる。
このうち、Ａ^１Ｏ、Ａ^２Ｏ及びＡ^３Ｏは、有用物質の生産量の観点から、それぞれ独立にＥＯ又はＰＯであることが好ましく、更に好ましい組み合わせは、Ａ^１Ｏ及びＡ^３Ｏが、ＥＯであって、Ａ^２Ｏが、ＰＯである組み合わせである。

一般式（１）中、ａ、ｂ及びｃは、それぞれ独立にＡ^１Ｏ、Ａ^２ＯとＡ^３Ｏのそれぞれの平均付加モル数を表し、１〜６００の数である。
このうち、ａ、ｂ及びｃは、有用物質の生産量の観点から、ａ及びｃが１〜２００であり、かつ、ｂが１０〜７０であることが好ましい。

本発明の方法で用いる一般式（１）で表される化合物（Ａ）のＨＬＢ値は、１〜１６であり、好ましくは２〜１６である。ＨＬＢ値が１〜１６の範囲内であることで、有用物質の生産量が多くなる。
なお、本発明における「ＨＬＢ値」とは、親水性と親油性のバランスを示す指標であって、例えば「界面活性剤入門」（２００７年三洋化成工業株式会社発行、藤本武彦著）２１２頁に記載されている小田法によって、有機化合物の有機性の値と無機性の値との比率から計算された値である。
ＨＬＢ＝１０×無機性／有機性
ＨＬＢを導き出すための有機性の値及び無機性の値については前記「界面活性剤入門」２１３頁に記載の表の値を用いて算出できる。

本発明の方法において、一般式（１）で表される化合物（Ａ）の数平均分子量は、２００〜３００００であり、有用物質の生産量の観点から、好ましくは１０００〜２００００である。
本発明の方法において、一般式（１）で表される化合物（Ａ）の数平均分子量は下記の方法により算出することができる。
数平均分子量は、テトラヒドロフラン（以下、ＴＨＦと略記）への可溶分に対し、ＧＰＣ（ＧｅｌＰｅｒｍｅａｔｉｏｎＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いて以下の条件で測定することができる。
測定装置：東ソー株式会社製の「ＨＬＣ−８１２０」
カラム：東ソー株式会社製の「ＴＳＫｇｅｌＧＭＨＸＬ」（２本）と東ソー（株）製の「ＴＳＫｇｅｌＭｕｌｔｉｐｏｒｅＨＸＬ−Ｍ」（１本）
試料溶液：０．２５質量％のＴＨＦ溶液
カラムへの試料溶液の注入量：１００μｌ
流速：１ｍｌ／分
測定温度：４０℃
検出装置：屈折率検出器
基準物質：東ソー株式会社製の標準ポリスチレン（ＴＳＫｓｔａｎｄａｒｄＰＯＬＹＳＴＹＲＥＮＥ）１２点（数平均分子量：５００、１０５０、２８００、５９７０、９１００、１８１００、３７９００、９６４００、１９００００、３５５０００、１０９００００、２８９００００）。

本発明の方法は、一般式（１）で表される化合物（Ａ）の水溶液を培地中に含まれていれば良く、培養開始時点の培養液が一般式（１）で表される化合物（Ａ）を含んでいても良いが、有用物質の生産効率等の観点から、培養開始時点の培養液は一般式（１）で表される化合物（Ａ）を含んでいないことが好ましい。

本発明の方法において、使用される一般式（１）で表される化合物（Ａ）の合計使用量（重量％）は、対象となる微生物、生産される有用物質の種類及び抽出方法の種類によって適宜選択されるが、培養液の重量に基づいて、０．０００１〜１０重量％であり、生産したタンパク質の変性を抑制する観点から、好ましくは０．００５〜１０重量％である。
なお、培養液の重量は、培養開始時（植菌）点の培養液の重量を用いる。

本発明の有用物質の製造方法で製造される有用物質としては、タンパク質（酵素、ホルモンタンパク質、抗体及びペプチド等）、多糖、オリゴ糖及び核酸等が挙げられる。

タンパク質としては、酵素｛酸化還元酵素（コレステロールオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼ等）、加水分解酵素（リゾチーム、プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ及びグルコアミラーゼ等）、異性化酵素（グルコースイソメラーゼ等）、転移酵素（アシルトランスフェラーゼ及びスルホトランスフェラーゼ等）、合成酵素（脂肪酸シンターゼ、リン酸シンターゼ及びクエン酸シンターゼ等）及び脱離酵素（ペクチンリアーゼ等）等｝、ホルモンタンパク質｛骨形成因子（ＢＭＰ）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターロイキン１〜１２、成長ホルモン、エリスロポエチン、インスリン、顆粒状コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ナトリウム利尿ペプチド、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、ソマトメジン、グルカゴン、成長ホルモン放出因子、血清アルブミン及びカルシトニン等｝、抗体、抗原タンパク質｛Ｂ型肝炎表面抗原等｝、機能性タンパク質｛プロネクチン（登録商標）｝、不凍ペプチド、抗菌ペプチド等｝、蛍光タンパク質（ＧＦＰ等）、発光タンパク質（ルシェラーゼ等）及びペプチド（特にアミノ酸組成を限定するものではなく、オリゴペプチド、ジペプチド及びトリペプチド等）等が挙げられる。

多糖としては、ヒアルロン酸、コンドロイチン、キサンタン及びセルロース等が挙げられる。

オリゴ糖としては、スクロース、ラクトース、トレハロース、マルトース、ラフィノース、パノース、シクロデキストリン、ガラクトオリゴ糖及びフラクトオリゴ糖等が挙げられる。

核酸としては、イノシン一リン酸、アデノシン一リン酸及びグアノシン一リン酸等が挙げられる。

これらのうち、有用物質の生産効率等の観点からタンパク質が好ましい。

本発明の有用物質の生産方法は、培養工程及び精製工程を有することが好ましい。

培養工程は、以下の有用物質の生産に用いる培養液オートクレーブ滅菌（好ましくは１２０℃、２０分間）を行い、ここに前培養した組み換え酵母を本培養する。
酵母の培養の温度は、好ましくは１５〜３２℃であり、更に好ましくは２５〜３０℃である。
培地のｐＨは、４〜７であることが好ましい。
本培養開始から６〜８００時間後に培養温度を維持したまま一般式（１）で表される化合物（Ａ）の水溶液を添加し、本培養開始から２０〜１０００時間培養を継続する等で培養工程を実施することができる。
培養中の培養液は公知の撹拌装置（撹拌羽根及びマグネティックスターラー等）を用いて撹拌することが好ましい。培養工程にもちいる装置としては、公知の培養装置をもちいることができるが、試験管、ディープウェルプレート（ビーエム機器株式会社製品等）及び微生物培養装置（エイブル社製等）等が挙げられる。

なお、培養工程で用いる前培養した酵母として組み換え酵母を用いる場合、前培養は酵母を発現ベクターで形質転換して組み換え酵母を作製し、組み換え酵母を前培養する。前培養は寒天培地上で好ましくは１５〜３２℃で３〜７２時間行うことで行うことができる。

精製工程は、培養液中に分泌された有用物質（タンパク質等）を分離する工程であり、遠心分離、中空糸分離、ろ過、溶剤による沈殿処理及びカラム処理（イオン交換カラム、ゲルろ過カラム、疎水カラム、アフィニティカラム及び限外カラム等）等の公知の分離方法で微生物及び微生物残さと分離することで行うことができる。
溶剤による沈殿処理としては、エタノール沈殿、硫酸アンモニウム沈殿及びポリエチレングリコール沈殿等の沈殿処理が挙げられる。

精製工程においてカラム処理をおこなう場合、カラムクロマトグラフィーに使用される充填剤としては、シリカ、デキストラン、アガロース、セルロース、アクリルアミド及びビニルポリマー等が挙げられ、市販品ではＳｅｐｈａｄｅｘシリーズ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌシリーズ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅシリーズ（以上、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、Ｂｉｏ−Ｇｅｌシリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）等が挙げられる。

本発明においては、化合物（Ａ）を用いることにより分泌効率が上昇する。したがって、酵母を破砕等しなくても有用物質を効率よく得ることができる。
また、精製工程で分離された酵母は、その後、新たに培養液を供給することにより、更に培養することができる。その培養液等を更に精製工程に供して精製、培養を繰り返すことにより、有用物質の連続生産を行うことができる。したがって、有用物質を効率よく大量に得ることができる。

以下の実施例及び比較例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。以下、特に定めない限り部は重量部を示す。

なお、実施例及び比較例で用いる化合物として、化合物（Ａ−１）〜（Ａ−１３）及び（Ａ’−１）〜（Ａ’−４）を以下の製造方法に従って製造した。
また、製造した一般式（１）で表される化合物（Ａ−１）〜（Ａ−１３）、及び一般式(1)の左側の水酸基の水素原子が炭素数１４のアルキル基である化合物［すなわち、一般式（１）の化合物には該当しない］（Ａ’−１）〜（Ａ’−４）の数平均分子量及びＨＬＢ値を表１に示す。

＜製造例１＞
ステンレス製加圧反応装置にプロピレングリコール１９部と水酸化ナトリウム０．０５部を仕込み、窒素置換後に１１０〜１３０℃でプロピレンオキサイド４１５部を４時間かけて圧入した。同温度でさらに１０時間反応させた。
、その後、同温度でエチレンオキサイド６６部を４時間かけて圧入した後、同温度でさらに１０時間反応させ、化合物（Ａ−１）を得た。

＜製造例２＞
製造例１において、プロピレングリコールの仕込み量を１９部から１５．８部に変更し、プロピレンオキサイドの圧入量４１５部から３４７部に変更し、エチレンオキサイドの圧入量を６６部から１３８部に変更した以外は同様の操作を行い、化合物（Ａ−２）を得た。

＜製造例３＞
製造例１において、プロピレングリコールの仕込み量を１９部から１２．２部に変更し、プロピレンオキサイドの圧入量を４１５部から３６８部に変更し、エチレンオキサイドの圧入量を６６部から２２０部に変更した以外は同様の操作を行い、化合物（Ａ−３）を得た。

＜製造例４＞
製造例１において、プロピレングリコールの仕込み量を１９部から４．８部に変更し、プロピレンオキサイドの圧入量を４１５部から１０４部に変更し、エチレンオキサイドの圧入量を６６部から３９１部に変更した以外は同様の操作を行い、化合物（Ａ−４）を得た。

＜製造例５＞
ステンレス製加圧反応装置にサンニックスＰＰ−２０００［三洋化成（株）製；ポリオキシプロピレングリコール（数平均分子量：２０００）］４５０部と水酸化ナトリウム０．０５部を仕込み、窒素置換後に１１０〜１３０℃でエチレンオキサイド５０部を４時間かけて圧入した後、同温度でさらに１０時間反応させ、化合物（Ａ−５）を得た。

＜製造例６＞
製造例５において、サンニックスＰＰ−２０００の仕込み量を４５０部から３２３部に変更し、エチレンオキサイドの圧入量を５０部から１７７部に変更した以外は同様の操作を行い、化合物（Ａ−６）を得た。

＜製造例７＞
製造例５において、サンニックスＰＰ−２０００の仕込み量を４５０部から３２３部に変更し、エチレンオキサイドの圧入量を５０部から２４５部に変更した以外が同様の操作を行い、化合物（Ａ−７）を得た。

＜製造例８＞
製造例５において、サンニックスＰＰ−２０００の仕込み量を４５０部から１０６部に変更し、エチレンオキサイドの圧入量を５０部から３９３部に変更した以外が同様の操作を行い、化合物（Ａ−８）を得た。

＜製造例９＞
製造例５において、サンニックスＰＰ−２０００４５０部に代えてサンニックスＰＰ−３０００［三洋化成（株）製；ポリオキシプロピレングリコール（数平均分子量：３２００）］を１０１部使用し、エチレンオキサイドの圧入量を５０部から３９９部に変更した以外は同様の操作を行い、化合物（Ａ−９）を得た。

＜製造例１０＞
ステンレス製加圧反応装置にサンニックスＰＰ−１０００［三洋化成（株）製；ポリオキシプロピレングリコール（数平均分子量：１０００）］２５０部と水酸化ナトリウム０．０５部を仕込み、窒素置換後に１１０〜１３０℃でエチレンオキサイド２５０部を４時間かけて圧入した。同温度でさらに１０時間反応させて、化合物（Ａ−１０）を得た。

＜製造例１１＞
ステンレス製加圧反応装置にＰＥＧ−３００［三洋化成（株）製；ポリエチレングリコール（数平均分子量：３００）］５０部と水酸化ナトリウム０．０５部を仕込み、窒素置換後に１１０〜１３０℃でプロピレンオキサイド５００部を４時間かけて圧入した。同温度でさらに１０時間反応させて、化合物（Ａ−１１）を得た。

＜製造例１２＞
製造例１１において、ＰＥＧ−３００５０部に代えて、ＰＥＧ−６００［三洋化成（株）製；ポリエチレングリコール（数平均分子量：６００）］を９９部使用し、プロピレンオキサイドの圧入量を５００部から４０１部に変更した以外は同様の操作を行い、化合物（Ａ−１２）を得た。

＜製造例１３＞
製造例１１において、ＰＥＧ−３００５０部に代えて、ＰＥＧ−６００［三洋化成（株）製；ポリエチレングリコール（数平均分子量：６００）］を９９部使用し、プロピレンオキサイドの圧入量を５００部から２３０部に変更した以外は同様の操作を行い、化合物（Ａ−１３）を得た。

＜比較製造例１＞
ステンレス製加圧反応装置に炭素数１４の合成アルコール４３部と水酸化ナトリウム０．０５部を仕込み、窒素置換後に１１０〜１３０℃でエチレンオキサイド１７６部を４時間かけて圧入した後、同温度でさらに１０時間反応させ、化合物（Ａ’−１）を得た。

＜比較製造例２＞
ガラス製オートクレーブに、炭素数１４の合成アルコール４３部、過塩素酸アルミニウム９水塩０．０６部を投入し、混合系内を窒素で置換した後、減圧下（約２０ｍｍＨｇ）１２０℃にて１時間脱水を行った。次いでＥＯ１８部を９５℃にて、１５時間かけて圧入した。この付加物に水酸化カリウム０．３部を追加し、ＥＯ３２５部を１５０℃にて５時間かけて圧入した後、同温度でさらに１０時間反応させ、化合物（Ａ’−２）を得た。

＜比較製造例３＞
ステンレス製加圧反応装置に炭素数１４の合成アルコールと水酸化ナトリウム０．０５部を仕込み、窒素置換後に１１０℃〜１３０℃でＥＯ１８部を２時間かけて圧入後、同温度でさらに１０時間反応させた。その後、水酸化ナトリウム０．０３部を仕込み、窒素置換後に１１０〜１３０℃でＰＯ２６部を２時間かけて圧入。同温度でさらに６時間反応させた。最後に、再度水酸化ナトリウム０．０３部を仕込み、窒素置換後に１１０〜１３０℃で２回目のＥＯを６１部を４時間かけて圧入し、同温でさらに１０時間反応させ、化合物（Ａ’-３）を得た。
＜比較製造例４＞
比較製造例３において、２回目のエチレンオキサイドの圧入量を１３５部に変更した以外は同様の操作を行い、化合物（Ａ’―４）を得た。

実施例及び比較例で使用した化合物（Ａ）の数平均分子量は下記の方法により測定した。
数平均分子量は、テトラヒドロフラン（以下、ＴＨＦと略記）への可溶分に対し、ＧＰＣ（ＧｅｌＰｅｒｍｅａｔｉｏｎＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いて以下の条件で測定した。
測定装置：東ソー株式会社製の「ＨＬＣ−８１２０」
カラム：東ソー株式会社製の「ＴＳＫｇｅｌＧＭＨＸＬ」（２本）と東ソー（株）製の「ＴＳＫｇｅｌＭｕｌｔｉｐｏｒｅＨＸＬ−Ｍ」（１本）
試料溶液：０．２５質量％のＴＨＦ溶液
カラムへの試料溶液の注入量：１００μｌ
流速：１ｍｌ／分
測定温度：４０℃
検出装置：屈折率検出器
基準物質：東ソー株式会社製の標準ポリスチレン（ＴＳＫｓｔａｎｄａｒｄＰＯＬＹＳＴＹＲＥＮＥ）１２点（数平均分子量：５００、１０５０、２８００、５９７０、９１００、１８１００、３７９００、９６４００、１９００００、３５５０００、１０９００００、２８９００００）。

＜実施例１〜１６と比較例２〜５＞
ルシフェラーゼ発現酵母（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）は、（独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター）より分譲していただいたＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓを用いて形質転換を行った。ｐＰＩＣＺαベクター（Ｔｈｅｒｍｏ社製）をＸｈｏＩとＸｂａＩで切断し、人工合成（Ｔｈｅｒｍｏ社で委託合成）した両端にＸｈｏＩとＸｂａＩ切断部位を持つルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだ。ルシフェラーゼ遺伝子組み込みｐＰＩＣＺαベクターの酵母への形質転換は、ｐＰＩＣＺα２ベクター取り扱い説明書に記載の方法で行った。ルシフェラーゼ発現酵母をＢＭＧＹ培養液に白金耳を用いて植菌して３０℃で１５時間、２００ｒｐｍで振とう培養して作製した培養液を最終ＯＤが０．１ＯＤ／ｍｌとなるように、１２５ｍｌＢＭＧＹ培養液（Ｄｉｆｃｏ社製Ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ１ｗｔ％、Ｄｉｆｃｏ社製Ｂａｃｔｏｐｅｐｔｏｎｅ２ｗｔ％、Ｄｉｆｃｏ社製Ｙｅａｓｔｎｉｔｒｏｇｅｎｂａｓｅｗ／ｏａｍｉｎｏａｃｉｄ１．３４ｗｔ％、グルコース２ｗｔ％、１００ｍＭリン酸水素カリウム、ｐＨ６．０）に再懸濁した。さらに、その再懸濁液を、３０℃で約１７時間、１１００ｒｐｍでＯＤが２０〜３０となるまで攪拌培養を続けた。ＯＤが２０〜３０となった時点で培養液を遠心（１５００ｇ、１０分）し、１２５ｍｌＢＭＭＹ培養液に再懸濁し、３０℃、１１００ｒｐｍで２時間培養した。
２時間経過後、表２に記載の化合物（Ａ−１）〜（Ａ−１３）及び（Ａ’−１）〜（Ａ’−４）を表２に記載の重量％となるように添加し、８時間３０℃、１１００ｒｐｍで培養した。その後、濁度（培養終了時の濁度）測定用にサンプリングし、遠心分離機によって、培養液から菌体と培養上清を分離し、培養上清と菌体を回収した。

＜比較例１＞
実施例１において、化合物（Ａ）の代わりに純水を添加する以外は同様にして実施し、培養上清と菌体を回収した。

＜実施例１７〜３２と比較例７〜１０＞
酸性ホスファターゼ発現酵母（Ｃａｎｄｉｄａｂｏｉｄｉｎｉｉ公知文献（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎａｎｄｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｆｉｖｅｍｅｔｈａｎｏｌ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｐｒｏｍｏｔｅｒｓｉｎｔｈｅｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｙｅａｓｔＣａｎｄｉｄａｂｏｉｄｉｎｉｉ，Ｈ．Ｙｕｒｉｍｏｔｏｅｔａｌ．，ＢｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ，１４９３，２０００，５６−６３）に記載の方法で作製した。）をＢＭＧＹ培地に白金耳を用いて植菌して３０℃で１５時間、２００ｒｐｍで振とう培養して作製した培養液を最終ＯＤが０．１ＯＤ／ｍｌとなるように、１２５ｍｌＢＭＧＹ培地に再懸濁した。さらに、その再懸濁液を、３０℃で約１７時間、１１００ｒｐｍでＯＤが２〜５となるまで攪拌培養を続けた。ＯＤが２〜５となった時点で２ｖ／ｖ％となるようにメタノールを添加し、３０℃、１１００ｒｐｍで２時間培養した。
２時間経過後、表３に記載の化合物（Ａ−１）〜（Ａ−１３）及び（Ａ’−１）〜（Ａ’−４）を表３に記載の重量で添加し、８時間３０℃、１１００ｒｐｍで培養した。８時間後、濁度（培養終了時の濁度）測定用にサンプリングし、遠心分離機によって、培養液から菌体と培養上清を分離し、培養上清と菌体を回収した。
菌体に５０ｍＭ酢酸ＮａＢｆ（ｐＨ４．０）を加え、遠心することで菌体を洗浄した。洗浄した菌体に、５０ｍＭ酢酸ＮａＢｆ（ｐＨ４．０）で再懸濁し、菌体表面の酸性ホスファターゼ活性測定サンプルとした。

＜比較例６＞
実施例１７において、化合物（Ａ）の代わりに純水を添加する以外は同様にして実施し、培養上清と菌体を回収した。

実施例１〜３２及び比較例１〜１０で得た培養上清について、培養液の濁度、有用物質の分泌生産量及び分泌効率等の評価を下記に記載の通り行った。結果を表１に記載する。

＜培養液の濁度の測定方法＞
サンプリングで回収した微生物を含む培養液を用いて、濁度計［（株）島津製作所社製、ＵＶ−１７００］を用いて、光路長１ｃｍの石英セルを用いて濁度の測定を行った。
培養液は、１５００ｒｐｍ、５分、４℃で遠心し、上清を破棄した。沈澱をサンプル液量と同量の生理食塩水で再懸濁し、適切な吸光度（０．１〜０．８）になるように生理食塩水で希釈して６００ｎｍの吸光度を測定した。培養液の濁度は下記数式（１）によって算出した。
培養液の濁度（ＯＤ）＝（希釈した培養液の６００ｎｍの吸光度）×培養液の希釈倍率（数式１）

＜有用物質の分泌生産量の評価：分泌生産した有用物質のルシフェラーゼ活性測定＞
実施例１〜１６及び比較例１で得た各培養上清を０．２ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で１０〜１０００倍希釈したもの２０μｌに、下記のルシフェリン溶液６０μｌ添加した混合液を試料として、ルミノメーターを用いて以下の条件で測定した発光強度を、下記式に当てはめて得られた値を分泌生産した有用物質のルシフェラーゼ活性とした。
ルミノメーター：プロメガ株式会社製の「ＧｌｏｍａｘＮａｖｉｇａｔｏｒ」
ルシフェリン溶液：ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社製品
測定温度：２５℃
検出装置：発光検出器
検出波長：３５０〜７００ｎｍ
〔分泌生産した有用物質のルシフェラーゼ活性〕＝〔発光強度〕×希釈倍率／〔培養終了時の濁度〕
なお、表２及び３中、ルシフェラーゼ活性は、比較例１又は２６を１とした場合の相対値で表した。
分泌生産した有用物質のルシフェラーゼ活性が高い程、有用物質の分泌生産量が多いことを示す。

＜菌体表面に残った有用物質のルシフェラーゼ活性測定＞
実施例１〜１６及び比較例１〜５で得た菌体に、除去した上清と同量の０．２ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）２００μｌを加え、遠心することで菌体を洗浄した。洗浄した菌体に、洗浄した上清と同量の０．２ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）２００μｌで再懸濁し、０．２ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で１０〜１０００倍希釈したものを菌体表面のルシフェラーゼ活性測定用サンプルとした。
この菌体表面のルシフェラーゼ活性測定用サンプル２０μｌに上記のルシフェリン溶液６０μｌ添加した混合液を試料として、「分泌生産した有用物質のルシフェラーゼ活性測定」と同様の条件で発光強度を測定し、測定した発光強度を、下記式に当てはめて得られた値を菌体表面に残った有用物質のルシフェラーゼ活性とした。
〔菌体表面に残った有用物質のルシフェラーゼ活性〕＝〔発光値〕×希釈倍率／〔培養終了時のＯＤ〕

＜分泌効率の評価＞
実施例１〜１６及び比較例１〜５で得た各培養上清と菌体を用いて、各実施例における分泌効率を下記式により算出した。
分泌効率（％）＝１００×「分泌生産した有用物質のルシフェラーゼ活性」／「ルシフェラーゼ活性合計」
なお、ルシフェラーゼ活性合計は、「分泌生産した有用物質のルシフェラーゼ活性」＋「菌体表面に残った有用物質のルシフェラーゼ活性」を意味する。

＜タンパク質量の測定：酸性ホスファターゼ活性測定＞
実施例１７〜３２及び比較例６〜１０で得た各培養上清に１／４０量の２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）５μｌを添加した。緩衝液を添加した培養上清又は実施例１７〜３２で得た各菌体表面測定サンプルに基質溶液（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ０．６４ｍｇ／ｍｌ含有５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．０）を容量比＝１：１で混合し、３５℃で１０分間反応した。
反応後、反応液と等量の１０％トリクロロ酢酸溶液を添加し反応停止をした。反応停止をした溶液に、炭酸ナトリム飽和溶液を反応液全体と等量加え、発色させた。発色させた液は、１５００ｇ、５分で不溶画分を除去し、（Ｂｉｏｔｅｋ社製マイクロプレートリーダーＰｏｗｅｒＷａｖｅ）を用いて４２０ｎｍの吸光度を測定した。参照波長には６３０ｎｍを測定した。
培養上清、菌体表面測定サンプルそれぞれについて、下記の式より算出した値を酸性ホスファターゼ活性とした。得られた培養上清の酸性ホスファターゼ活性の結果において、比較例２の値を１とした場合の相対値を「分泌生産した有用物質の酸性ホスファターゼ活性」とし、菌体表面測定サンプルの酸性ホスファターゼ活性の結果において、比較例２の値を１とした場合の相対値を「菌体表面に残った有用物質の酸性ホスファターゼ活性」として表３に記載した。
酸性ホスファターゼ活性＝｛（Ａｂｓ４２０ｎｍ）−（Ａｂｓ６３０ｎｍ）｝／（培養終了時の濁度）

＜分泌効率の評価＞
実施例１７〜３２及び比較例２で得た「分泌生産した有用物質の酸性ホスファターゼ活性」及び「菌体表面に残った有用物質の酸性ホスファターゼ活性」の値を用いて、下記数式より分泌効率を算出した。結果を表３に示す。
分泌効率（％）＝１００×「分泌生産した有用物質の酸性ホスファターゼ活性」／「酸性ホスファターゼ活性合計」
なお、酸性ホスファターゼ活性合計は、「分泌生産した有用物質の酸性ホスファターゼ活性」＋「菌体表面に残った有用物質の酸性ホスファターゼ活性」を意味する。

表２及び３から、酵母としてＰｉｃｈｉａ株又はＣａｎｄｉｄａ株を用いて、一般式（１）で表される化合物（Ａ−１）〜（Ａ−１３）を含有する培養液中で有用物質を分泌生産することにより、培養液の濁度が大きくなっていることから、酵母の増殖性が増加しやすいことがわかる。
また、実施例及び比較例の酵母数当たりの有用物質量を示すルシフェラーゼ活性合計及び酸性ホスファターゼ活性合計の結果から、酵母当たりの有用物質量が同程度であることがわかる。したがって、本発明の生産方法は有用物質を多量に得られることがわかる。
さらに、本発明の生産方法を用いた実施例においては、分泌効率が５０％よりも大きく、酵母が産生した有用物質が菌体外に分泌されやすく、菌を破砕する等の処理をしなくても有用物質を大量に得られることから、生産効率も高いことがわかる。したがって、酵母を用いた有用物質の生産量に優れ、さらに生産効率も高いことがわかる。

本発明の有用物質の生産方法は、タンパク質などの有用物質を微生物から抽出する際に使用できる。タンパク質としては酵素、ホルモンタンパク質、抗体及びペプチド等が挙げられる。生産されるタンパク質が、酵素（プロテアーゼ、セルラーゼ、リパーゼ及びアミラーゼ等）の場合には、食品加工用、洗浄剤用、繊維処理用、製紙用途、酵素変換用途などとして好適に使用でき、特にバイオ医薬品の製造に用いる上で有用である。

Claims

培養液に含まれる酵母により有用物質を培養液中に分泌生産する有用物質の生産方法であって、前記酵母が、Ｐｉｃｈｉａ株、Ｃａｎｄｉｄａ株、Ｙａｒｒｏｗｉａ株、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ株、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ株及びＰｓｅｕｄｏｚｙｍａ株からなる群より選ばれる少なくとも１種であり、前記培養液が、下記一般式（１）で表される化合物（Ａ）を含有し、前記化合物（Ａ）のＨＬＢ値が１〜１６であって、かつ数平均分子量が２００〜３０，０００であり、前記化合物（Ａ）の重量割合が、培養開始時点の培養液の重量を基準として０．０００１〜１０重量％である有用物質の生産方法。
ＨＯ−（Ａ¹Ｏ）_a−（Ａ²Ｏ）_b−（Ａ³Ｏ）_c−Ｈ（１）
［式（１）中、Ａ¹Ｏ、Ａ²Ｏ及びＡ³Ｏはそれぞれ独立に炭素数２〜４のアルキレンオキ
シ基を表し、Ａ²ＯはＡ¹Ｏ及びＡ³Ｏと異なっており、ａ、ｂ及びｃは、Ａ¹Ｏ、Ａ²Ｏ及
びＡ³Ｏのそれぞれの平均付加モル数を表し、それぞれ独立に１〜６００の数である。］
有用物質が、タンパク質である請求項１に記載の有用物質の生産方法。
前記一般式（１）で表される化合物（Ａ）におけるＡ^１Ｏ、Ａ^２Ｏ及びＡ^３Ｏが、それぞれ独立にエチレンオキシ基又はプロピレンオキシ基である請求項１又は２に記載の有用物質の生産方法。
前記一般式（１）で表される化合物（Ａ）におけるＡ^１Ｏ及びＡ^３Ｏがエチレンオキシ基であって、Ａ^２Ｏがプロピレンオキシ基である請求項１〜３のいずれかに記載の有用物質の生産方法。
前記一般式（１）で表される化合物（Ａ）の数平均分子量が１，０００〜２０，０００であり、Ａ^２Ｏがプロピレンオキシ基であり、ｂが１０〜７０である請求項１〜４のいずれかに記載の有用物質の生産方法。