JPH0655154B2 - 遺伝子工学で処理した微生物から精製成長ホルモンを回収する方法 - Google Patents
遺伝子工学で処理した微生物から精製成長ホルモンを回収する方法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 遺伝子工学の研究の１つのゴールは天然には高等生物内
でしか産生されないタンパク質を微生物内で産生する方
法の開発であつた。このゴールはいくつかの真核生物の
成長ホルモンまたはそれらのアナログ（類似体）につい
ては達成されている。増殖および誘導（induction）に
よつて種々の成長ホルモンまたはアナログを産生し得る
遺伝的に変容した細菌、たとえば大腸菌（Escherichia
coli）菌株が、米国メリーランド州ロツクビル（Rock-v
ille）のアメリカンタイプカルチヤーコレクシヨンAmer
ican Type Culture Collection,ATCCに寄託されてい
る。これらのホルモンは、農業分野でたとえば畜産にお
けるミルクや肉の生産量を増大するために、また医療分
野でたとえば小人症に罹患している人の治療に大きな潜
在的価値を有している。
でしか産生されないタンパク質を微生物内で産生する方
法の開発であつた。このゴールはいくつかの真核生物の
成長ホルモンまたはそれらのアナログ（類似体）につい
ては達成されている。増殖および誘導（induction）に
よつて種々の成長ホルモンまたはアナログを産生し得る
遺伝的に変容した細菌、たとえば大腸菌（Escherichia
coli）菌株が、米国メリーランド州ロツクビル（Rock-v
ille）のアメリカンタイプカルチヤーコレクシヨンAmer
ican Type Culture Collection,ATCCに寄託されてい
る。これらのホルモンは、農業分野でたとえば畜産にお
けるミルクや肉の生産量を増大するために、また医療分
野でたとえば小人症に罹患している人の治療に大きな潜
在的価値を有している。
微生物による成長ホルモンの産生には次の一般的なステ
ツプが含まれる。
ツプが含まれる。
(1)所望のホルモンの産生に関する遺伝情報をコードし
ている外来ＤＮＡを大腸菌（Escherichia coli）のよう
な適当な微生物中に挿入する。
ている外来ＤＮＡを大腸菌（Escherichia coli）のよう
な適当な微生物中に挿入する。
(2)この微生物を適切な条件で培養し、ホルモンを多量
に産生させ蓄積させる。
に産生させ蓄積させる。
(3)ホルモンを微生物から回収し、精製する。
このホルモンの回収精製には一般に、細胞を破砕し、成
長ホルモンを他の細胞成分から分離し、回収したホルモ
ンをさらに精製することが含まれる。所望でない細胞構
成成分は、酵素で消化し、界面活性剤で可溶化し、遠心
によつてホルモンから分離し得る。最後に、一般的なタ
ンパク質の精製用に開発された各種の技術によつて種々
の程度まで成長ホルモンを精製することができる。その
ような技術には次のうちの１つ以上がある。すなわち、
透析、ゾーン遠心法（zonal centrifugation）、分子排
除クロマトグラフィー（molecular exclusion chromato
graphy）、等電点沈殿法（isoelectricprecipitatio
n）、塩溶塩析分画法（salting-in and salting-ou
t）、溶媒分別法（solvent-fractionation）、電気泳動
法、イオン交換クロマトグラフイーおよびアフイニテイ
クロマトグラフイーである。これらの方法の間では、経
済性と達成可能な精製度との両者に関して変動がある。
長ホルモンを他の細胞成分から分離し、回収したホルモ
ンをさらに精製することが含まれる。所望でない細胞構
成成分は、酵素で消化し、界面活性剤で可溶化し、遠心
によつてホルモンから分離し得る。最後に、一般的なタ
ンパク質の精製用に開発された各種の技術によつて種々
の程度まで成長ホルモンを精製することができる。その
ような技術には次のうちの１つ以上がある。すなわち、
透析、ゾーン遠心法（zonal centrifugation）、分子排
除クロマトグラフィー（molecular exclusion chromato
graphy）、等電点沈殿法（isoelectricprecipitatio
n）、塩溶塩析分画法（salting-in and salting-ou
t）、溶媒分別法（solvent-fractionation）、電気泳動
法、イオン交換クロマトグラフイーおよびアフイニテイ
クロマトグラフイーである。これらの方法の間では、経
済性と達成可能な精製度との両者に関して変動がある。
ウシ成長ホルモンの回収精製法が本発明と同じく譲渡さ
れている係属中の米国特許出願第514,188号（１９８３
年７月１５日出願）に記載されている。この方法には、
混合細胞懸濁液を機械的に破砕し、沈殿をリゾチーム
と、次にデオキシリボヌクレアーゼとインキユベートす
ることによるホルモンの回収が含まれる。次に、可溶化
したホルモンを音波処理し、溶液を遠心によつて精澄に
し、ホルモンを含有する溶液をゲルクロマトグラフイ
ー、イオン交換クロマトグラフイー、透析および凍結乾
燥にかけることによつてホルモンを精製する。
れている係属中の米国特許出願第514,188号（１９８３
年７月１５日出願）に記載されている。この方法には、
混合細胞懸濁液を機械的に破砕し、沈殿をリゾチーム
と、次にデオキシリボヌクレアーゼとインキユベートす
ることによるホルモンの回収が含まれる。次に、可溶化
したホルモンを音波処理し、溶液を遠心によつて精澄に
し、ホルモンを含有する溶液をゲルクロマトグラフイ
ー、イオン交換クロマトグラフイー、透析および凍結乾
燥にかけることによつてホルモンを精製する。
上記の方法にはかなり大量のリゾチームが必要であり、
精製ホルモンを得るためには時間のかかる洗浄を繰り返
す必要があり、しかも収率はかなり低い（発酵終了時の
細胞内ホルモンの重量に対して約１０〜１５％）。ま
た、この方法にはデオキシリボヌクレアーゼ消化を必要
とすることに基づく別の欠点がある。デオキシリボヌク
レアーゼはホルモン回収プロセス中に細胞ＤＮＡを消化
するのに使用されている高価な酵素である。デオキシリ
ボヌクレアーゼ製剤は、回収中に所望の生成物を分解す
るプロテアーゼを夾雑物として含んでいることが判明し
ている。したがつて、上記の方法のようにデオキシリボ
ヌクレアーゼを使用すると、あらゆる存在するプロテア
ーゼを阻害するための予防ステツプを別に設けない限り
ホルモンの回収収率は減少するであろう。しかもプロテ
アーゼの完全な阻害は不可能かもしれない。デオキシリ
ボヌクレアーゼを使用すると、生成物収率が低下するこ
とに加えて、夾雑するプロテアーゼのために生成物の安
定性が望ましい程度にならないであろう。
精製ホルモンを得るためには時間のかかる洗浄を繰り返
す必要があり、しかも収率はかなり低い（発酵終了時の
細胞内ホルモンの重量に対して約１０〜１５％）。ま
た、この方法にはデオキシリボヌクレアーゼ消化を必要
とすることに基づく別の欠点がある。デオキシリボヌク
レアーゼはホルモン回収プロセス中に細胞ＤＮＡを消化
するのに使用されている高価な酵素である。デオキシリ
ボヌクレアーゼ製剤は、回収中に所望の生成物を分解す
るプロテアーゼを夾雑物として含んでいることが判明し
ている。したがつて、上記の方法のようにデオキシリボ
ヌクレアーゼを使用すると、あらゆる存在するプロテア
ーゼを阻害するための予防ステツプを別に設けない限り
ホルモンの回収収率は減少するであろう。しかもプロテ
アーゼの完全な阻害は不可能かもしれない。デオキシリ
ボヌクレアーゼを使用すると、生成物収率が低下するこ
とに加えて、夾雑するプロテアーゼのために生成物の安
定性が望ましい程度にならないであろう。
本発明者らは、従来の方法より実施が容易で、調整しや
すく、しかも安価である、精製された真核生物成長ホル
モンまたはそのアナログの回収方法を開発した。本発明
の方法によると、所望の生成物が従来得ることができた
よりも高い収率でしかも安定な形態で得られる。この方
法には従来の方法で使用されたリゾチームの量の2.5〜
５％しか必要とせず、そのため精製が容易になると共に
回収コストが低下する。さらにこの方法ではデオキシリ
ボヌクレアーゼを使用する必要が全くない。さらに回収
コストが低下することに加えて、デオキシリボヌクレア
ーゼを必要としなくすることで生成物の収率が２倍以上
になり、しかもずつと安定な形態の生成物が得られる。
また、この方法では必要な洗浄回数が減少するために、
精製された成長ホルモンまたはそのアナログのより便利
で時間効率のよいプロセスが可能となる。たとえば従来
法の時間の１０〜２０％だけとなる。限外過を用いる
ことによつてこの方法ではコストが大幅に低減すると共
に生成物の純度が改良される。
すく、しかも安価である、精製された真核生物成長ホル
モンまたはそのアナログの回収方法を開発した。本発明
の方法によると、所望の生成物が従来得ることができた
よりも高い収率でしかも安定な形態で得られる。この方
法には従来の方法で使用されたリゾチームの量の2.5〜
５％しか必要とせず、そのため精製が容易になると共に
回収コストが低下する。さらにこの方法ではデオキシリ
ボヌクレアーゼを使用する必要が全くない。さらに回収
コストが低下することに加えて、デオキシリボヌクレア
ーゼを必要としなくすることで生成物の収率が２倍以上
になり、しかもずつと安定な形態の生成物が得られる。
また、この方法では必要な洗浄回数が減少するために、
精製された成長ホルモンまたはそのアナログのより便利
で時間効率のよいプロセスが可能となる。たとえば従来
法の時間の１０〜２０％だけとなる。限外過を用いる
ことによつてこの方法ではコストが大幅に低減すると共
に生成物の純度が改良される。
発明の概要 本発明は、動物の成長ホルモンまたはそのアナログをコ
ードしているＤＮＡ配列の発現によつてこのホルモンま
たはアナログを産生している細菌細胞から精製された動
物成長ホルモンまたはそのアナログを回収する方法に係
り、この方法は次のステツプを含んでいる。
ードしているＤＮＡ配列の発現によつてこのホルモンま
たはアナログを産生している細菌細胞から精製された動
物成長ホルモンまたはそのアナログを回収する方法に係
り、この方法は次のステツプを含んでいる。
(a)細菌細胞またはそのフラグメントの細胞壁を破砕し
て溶解物（lysate）を生成する。
て溶解物（lysate）を生成する。
(b)粒子と不溶物を含有する沈殿を溶解物から分離す
る。
る。
(c)分離した沈殿物を適当な緩衝溶液中懸濁液を調製す
る。
る。
(d)この懸濁液を処理して液体と固体を接触させる。
(e)固液接触した懸濁液から沈殿物を部分的または完全
に分離する。
に分離する。
(f)分離した沈殿を充分な量の水に可溶化し、pHを適切
なアルカリ性pHに調整して溶液を形成する。
なアルカリ性pHに調整して溶液を形成する。
(g)可溶化したホルモンまたはアナログを適切な条件で
限外過によつて他の細胞成分から分離してホルモンま
たはアナログを含有する限外過物（限外液，ultraf
iltrate）と保留物（retentate）とを生成する。
限外過によつて他の細胞成分から分離してホルモンま
たはアナログを含有する限外過物（限外液，ultraf
iltrate）と保留物（retentate）とを生成する。
(h)ホルモンまたはアナログをさらに精製濃縮するよう
に可溶化したホルモンまたはアナログをを処理し、こう
して、精製されたホルモンまたはアナログを回収する。
に可溶化したホルモンまたはアナログをを処理し、こう
して、精製されたホルモンまたはアナログを回収する。
ステツプ(d)で、固液接触とその後の沈殿分離の前に、
溶解物から分離した沈殿の懸濁液を処理するためにリゾ
チームを使用することができる。この固液接触とその後
の沈殿分離との２つのステツプおよび限外過は繰り返
し行なうことができる。ステツプ(h)で、ホルモンまた
はアナログをさらに精製および濃縮するためにイオン交
換クロマトグラフイーを用いることができる。また、本
発明の方法のほとんどのステツプは連続流で実施しても
よいし、自動化してもよい。
溶解物から分離した沈殿の懸濁液を処理するためにリゾ
チームを使用することができる。この固液接触とその後
の沈殿分離との２つのステツプおよび限外過は繰り返
し行なうことができる。ステツプ(h)で、ホルモンまた
はアナログをさらに精製および濃縮するためにイオン交
換クロマトグラフイーを用いることができる。また、本
発明の方法のほとんどのステツプは連続流で実施しても
よいし、自動化してもよい。
本発明で使用するのに適したホルモン産生細菌細胞には
大腸菌（Escherichia coli）菌株ATCC No.39806,39785,
39386,393984,39804および39792が包含される。本発明
によつて回収精製することができる成長ホルモンの中に
は、ウシ、ブタ、ニワトリおよびヒト成長ホルモンなら
びにこれらのアナログがある。
大腸菌（Escherichia coli）菌株ATCC No.39806,39785,
39386,393984,39804および39792が包含される。本発明
によつて回収精製することができる成長ホルモンの中に
は、ウシ、ブタ、ニワトリおよびヒト成長ホルモンなら
びにこれらのアナログがある。
発明の詳細な説明 本発明者らは、真核生物たとえば動物もしくはヒトの成
長ホルモンまたはそのアナログをコードしているＤＮＡ
配列の発現によつてこのホルモンまたはアナログを産生
している細菌細胞から、精製された成長ホルモンまたは
アナログを回収するための新規な方法を開発した。
長ホルモンまたはそのアナログをコードしているＤＮＡ
配列の発現によつてこのホルモンまたはアナログを産生
している細菌細胞から、精製された成長ホルモンまたは
アナログを回収するための新規な方法を開発した。
本発明で使用する遺伝的に変容した細菌細胞は公知であ
る。たとえばウシ成長ホルモン（bGH）のアナログを産
生するように遺伝的に変容した大腸菌（Escherichia co
li）の１つの菌株がアメリカンタイプカルチヤーコレク
シヨンAmerican Type Culture Collection（以下ATCCと
略）、ロツクビル（Rockville）、メリーランド州）に
寄託されておりATCCNo.39806とされている。このbGHア
ナログは天然bGHのフェニルアラニン形のＮ−末端に付
加されたアミノ酸配列Met−Asp−Glnをもつている。ATC
Cに寄託されている別の遺伝的に変容した大腸菌（E.col
i）細胞系（cell line）（ATCCNo.39785）は、天然bGH
のフェニルアラニン形のＮ−末端に付加されたメチオニ
ン残基を有するbGHアナログを産生する。さらにATCCに
寄託されている大腸菌（E.coli）の別の菌株（ATCCNo.3
9386）は、アミノ酸１〜１３を欠きMet14で始まる天然b
GHのアミノ酸配列を有するヒト成長ホルモン（hGH）ア
ナログを産生する。大腸菌（E.coli）細胞系（ATCCNo.3
9384）はＮ−末端にメチオニンがついた天然hGHの配列
を有するhGHアナログを産生する。同様に、大腸菌（E.c
oli）細胞系（ATCCNo.39804および39792）はそれぞれブ
タ成長ホルモン（pGH）アナログとニワトリ成長ホルモ
ン（cGH）アナログを産生し、各アナログはそれぞれの
天然ホルモンのフェニルアラニン形のＮ−末端に付加さ
れたメチオニン残基を有している。上記の各ホルモンア
ナログは、適当な細胞を適切な条件で増殖誘導させると
産生され、本発明の方法によつて精製形態で回収するこ
とができる。
る。たとえばウシ成長ホルモン（bGH）のアナログを産
生するように遺伝的に変容した大腸菌（Escherichia co
li）の１つの菌株がアメリカンタイプカルチヤーコレク
シヨンAmerican Type Culture Collection（以下ATCCと
略）、ロツクビル（Rockville）、メリーランド州）に
寄託されておりATCCNo.39806とされている。このbGHア
ナログは天然bGHのフェニルアラニン形のＮ−末端に付
加されたアミノ酸配列Met−Asp−Glnをもつている。ATC
Cに寄託されている別の遺伝的に変容した大腸菌（E.col
i）細胞系（cell line）（ATCCNo.39785）は、天然bGH
のフェニルアラニン形のＮ−末端に付加されたメチオニ
ン残基を有するbGHアナログを産生する。さらにATCCに
寄託されている大腸菌（E.coli）の別の菌株（ATCCNo.3
9386）は、アミノ酸１〜１３を欠きMet14で始まる天然b
GHのアミノ酸配列を有するヒト成長ホルモン（hGH）ア
ナログを産生する。大腸菌（E.coli）細胞系（ATCCNo.3
9384）はＮ−末端にメチオニンがついた天然hGHの配列
を有するhGHアナログを産生する。同様に、大腸菌（E.c
oli）細胞系（ATCCNo.39804および39792）はそれぞれブ
タ成長ホルモン（pGH）アナログとニワトリ成長ホルモ
ン（cGH）アナログを産生し、各アナログはそれぞれの
天然ホルモンのフェニルアラニン形のＮ−末端に付加さ
れたメチオニン残基を有している。上記の各ホルモンア
ナログは、適当な細胞を適切な条件で増殖誘導させると
産生され、本発明の方法によつて精製形態で回収するこ
とができる。
この方法は従来法に比べて、実施がより容易でより良好
に調節でき、より安価であり、所望の生成物をより高い
収率で、しかもより安定な形態で回収できる。このよう
な生成物は、本発明によると発酵終了時の細菌中に存在
するホルモンまたはアナログの重量に基づいて２５重量
％、さらには３０重量％を超える収率で回収し得る。リ
ゾチームは、従来法で必要とされたよりも少ない酵素量
で使用される。また本発明方法では、デオキシリボヌク
レアーゼは一切使用する必要がなく、連続流方式で実施
してもよく、また便利なように自動化してもよい。
に調節でき、より安価であり、所望の生成物をより高い
収率で、しかもより安定な形態で回収できる。このよう
な生成物は、本発明によると発酵終了時の細菌中に存在
するホルモンまたはアナログの重量に基づいて２５重量
％、さらには３０重量％を超える収率で回収し得る。リ
ゾチームは、従来法で必要とされたよりも少ない酵素量
で使用される。また本発明方法では、デオキシリボヌク
レアーゼは一切使用する必要がなく、連続流方式で実施
してもよく、また便利なように自動化してもよい。
本発明方法では、適当な細菌細胞の増殖、誘導および採
取（harvest）後、上澄みをデカントした細菌細胞，こ
れらのフラグメントまたはセルケーキを中性のpH（たと
えば約7.4）の適切な緩衝溶液に懸濁する。この目的に
適した懸濁媒体は、５０mMTris（pH7.4）：５０mMNaC
l，５０mMTris（pH7.4）：５０mMEDTA，５０mMリン酸ナ
トリウム緩衝液（pH7.4）：５０mMNaClまたは５０ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）：５０mMEDTAの水溶
液である。あるいは、発酵マツシユ細菌懸濁液を中性pH
に調節した後直接使用してもよい。
取（harvest）後、上澄みをデカントした細菌細胞，こ
れらのフラグメントまたはセルケーキを中性のpH（たと
えば約7.4）の適切な緩衝溶液に懸濁する。この目的に
適した懸濁媒体は、５０mMTris（pH7.4）：５０mMNaC
l，５０mMTris（pH7.4）：５０mMEDTA，５０mMリン酸ナ
トリウム緩衝液（pH7.4）：５０mMNaClまたは５０ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）：５０mMEDTAの水溶
液である。あるいは、発酵マツシユ細菌懸濁液を中性pH
に調節した後直接使用してもよい。
次に、懸濁した細菌細胞またはそのフラグメントの細胞
壁を破砕して溶解物を生成する。好ましい態様では、ほ
ぼ３５℃未満（たとえばほぼ−10℃〜ほぼ＋８℃）の温
度で細胞を機械的に破砕する。ビーズミルすなわちホモ
ジナイザー、たとえばダイノミル（Dynomill）ＫＤ−５
装置（ウイリーアー・バツハオフエン（Willy A.Bachof
en），バーゼル）がこの目的に適した市販の破砕機であ
る。破砕は、懸濁液をこの破砕機に適当な流速（たとえ
ば約８０Ｌ／時）で連続的に通すことによつて実施する
と好ましい。
壁を破砕して溶解物を生成する。好ましい態様では、ほ
ぼ３５℃未満（たとえばほぼ−10℃〜ほぼ＋８℃）の温
度で細胞を機械的に破砕する。ビーズミルすなわちホモ
ジナイザー、たとえばダイノミル（Dynomill）ＫＤ−５
装置（ウイリーアー・バツハオフエン（Willy A.Bachof
en），バーゼル）がこの目的に適した市販の破砕機であ
る。破砕は、懸濁液をこの破砕機に適当な流速（たとえ
ば約８０Ｌ／時）で連続的に通すことによつて実施する
と好ましい。
次に、ホルモンやアナログとその他の水不溶性タンパク
質を含む粒子および不溶物の他に細胞膜と細胞壁断片お
よび凝集体（aggregates）を含有する沈殿を、水溶性タ
ンパク質，ＤＮＡおよびRNAまたはこれらの断片も含有
する溶解物から分離する。この分離を実施するには、溶
解物を適切な量（たとえばほぼ等容量）の脱イオン水で
希釈し、次いで所望の分離を実施するのに充分な流速
（たとえば約６０〜８０Ｌ／時）で固形ボール型（soli
d bowl）連続流式遠心分離機（たとえばセパ（Cepa）１
０１）中で遠心すると好ましい。次に、適切な量の中性
pH（たとえば約7.4）を有する適当な緩衝溶液に分離し
た沈殿を懸濁させて懸濁液を調製する。この溶液は５０
mMTrisまたはリン酸ナトリウム（pH7.4）：５０mMEDTA
を含有するものが好ましい。懸濁用の緩衝溶液の適当な
量は最初の細菌細胞１kgにつき約0.5〜2.5であり、細
胞１kg当り約1.2が好ましい。
質を含む粒子および不溶物の他に細胞膜と細胞壁断片お
よび凝集体（aggregates）を含有する沈殿を、水溶性タ
ンパク質，ＤＮＡおよびRNAまたはこれらの断片も含有
する溶解物から分離する。この分離を実施するには、溶
解物を適切な量（たとえばほぼ等容量）の脱イオン水で
希釈し、次いで所望の分離を実施するのに充分な流速
（たとえば約６０〜８０Ｌ／時）で固形ボール型（soli
d bowl）連続流式遠心分離機（たとえばセパ（Cepa）１
０１）中で遠心すると好ましい。次に、適切な量の中性
pH（たとえば約7.4）を有する適当な緩衝溶液に分離し
た沈殿を懸濁させて懸濁液を調製する。この溶液は５０
mMTrisまたはリン酸ナトリウム（pH7.4）：５０mMEDTA
を含有するものが好ましい。懸濁用の緩衝溶液の適当な
量は最初の細菌細胞１kgにつき約0.5〜2.5であり、細
胞１kg当り約1.2が好ましい。
次に、懸濁液を、この中に存在するポリサツカライドを
消化することができる適当な酵素、たとえばリゾチーム
（シグマ（Sigma）Ｌ−6876，セントルイス，ミズーリ
州）と共に適切な条件下で適切な時間インキユベートす
ることによつて、細胞壁断片のような望ましくない細胞
物質を消化してもよい。現在のところリゾチームの好ま
しい濃度は溶液１ｍ当たり約５０〜100μｇであり、
従来法で用いていた２mg／ｍより大幅に減少してい
る。リゾチームインキユベーシヨンの適当な時間は約１
〜２０時間である。このインキユベーシヨン期間中の温
度はほぼ３７℃に維持すると好ましい。次に、細胞脂質
のような物質を可溶化するために適切な量の適当な界面
活性剤、たとえばトリトン（Triton ）Ｘ−100（ロー
ムアンドハース社（Rohm＆Haas Co.），フイラデルフイ
ア，ペンシルバニア州）を最終濃度約１％（ｖ／ｖ）で
懸濁液に加えてもよい。次いで懸濁液を適切な時間（た
とえば約３０分）インキユベートする。
消化することができる適当な酵素、たとえばリゾチーム
（シグマ（Sigma）Ｌ−6876，セントルイス，ミズーリ
州）と共に適切な条件下で適切な時間インキユベートす
ることによつて、細胞壁断片のような望ましくない細胞
物質を消化してもよい。現在のところリゾチームの好ま
しい濃度は溶液１ｍ当たり約５０〜100μｇであり、
従来法で用いていた２mg／ｍより大幅に減少してい
る。リゾチームインキユベーシヨンの適当な時間は約１
〜２０時間である。このインキユベーシヨン期間中の温
度はほぼ３７℃に維持すると好ましい。次に、細胞脂質
のような物質を可溶化するために適切な量の適当な界面
活性剤、たとえばトリトン（Triton ）Ｘ−100（ロー
ムアンドハース社（Rohm＆Haas Co.），フイラデルフイ
ア，ペンシルバニア州）を最終濃度約１％（ｖ／ｖ）で
懸濁液に加えてもよい。次いで懸濁液を適切な時間（た
とえば約３０分）インキユベートする。
次に、懸濁液に含まれている液体と固体を、たとえば、
最大動力の６５％に設定した流速が約18Ｌ／時〜25Ｌ／
時の370Ｗ連続流式音波処理装置（ヒートシステムズウ
ルトラソニツク（Heat Systems Ultrasonics），プレイ
ンビユー（Plain-view），ニユーヨーク州）のような適
切な条件での音波処理によつて、固液が緊密に接触する
ように処理する。次いで、固液接触した懸濁液から沈殿
物を分離する。これは固液接触した懸濁液を適当な流速
（たとえば約３０Ｌ／時）の固形ボール型連続流式遠心
機（たとえばセパ（Cepa）１０１）で遠心分離すること
によつて好ましく行なわれる。別の態様では、このステ
ツプとその後のステツプにおける分離は、遠心分離の代
わりに適当な膜、たとえばミリポアデユラポア（Millip
ore Durapore）0.45μメンブランを用いるミクロ過
（microfiltration）によつて行なつてもよい。分離
後、固液接触たとえば音波処理した懸濁液から分離し沈
殿物を、洗浄（５０mMTrisまたはリン酸塩（pH7.4）：1
00mMNaClが適切である）し、適切な量の適当な媒体（た
とえば緩衝したかまたはしていない水溶液）に再懸濁し
てもよい。こうして調製した懸濁液を次に、適切な条件
下で音波処理等によつて固液接触せしめ、得られた沈殿
物をたとえば上述のような遠心分離または限外過によ
つて固液接触（たとえば音波処理）した懸濁液から部分
的にまたは完全に分離する。これらの再懸濁，固液接触
（たとえば音波処理）および分離は少なくとも１回繰り
返して行なうのが好ましい。特に好ましい態様ではこれ
らのステツプを次のように４回実施する。すなわち、ま
ず得られた沈殿を２０mMTris（pH7.4）または５０ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）に再懸濁し、この懸
濁液を上記のように固液接触させる（たとえば音波処理
する）。次に、懸濁液を上記のように遠心分離し、回収
した沈殿を５０mMTris（pH7.4）：100mMNaClまたは２０
ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）：１０mMEDTA：1
00mMNaClに再懸濁する。次いで、この懸濁液を音波処理
等によつて固液接触せしめ、上記のように遠心分離し、
回収した沈殿を脱イオン水中に再度懸濁する。水懸濁液
を固液接触させ（たとえば音波処理し）、上記のように
再度遠心分離し、回収した沈殿を再度脱イオン水中に懸
濁する。この２番目の水懸濁液を固液接触（たとえば音
波処理）せしめ、上記のように遠心して所望のホルモン
またはアナログに富む沈殿を得る。
最大動力の６５％に設定した流速が約18Ｌ／時〜25Ｌ／
時の370Ｗ連続流式音波処理装置（ヒートシステムズウ
ルトラソニツク（Heat Systems Ultrasonics），プレイ
ンビユー（Plain-view），ニユーヨーク州）のような適
切な条件での音波処理によつて、固液が緊密に接触する
ように処理する。次いで、固液接触した懸濁液から沈殿
物を分離する。これは固液接触した懸濁液を適当な流速
（たとえば約３０Ｌ／時）の固形ボール型連続流式遠心
機（たとえばセパ（Cepa）１０１）で遠心分離すること
によつて好ましく行なわれる。別の態様では、このステ
ツプとその後のステツプにおける分離は、遠心分離の代
わりに適当な膜、たとえばミリポアデユラポア（Millip
ore Durapore）0.45μメンブランを用いるミクロ過
（microfiltration）によつて行なつてもよい。分離
後、固液接触たとえば音波処理した懸濁液から分離し沈
殿物を、洗浄（５０mMTrisまたはリン酸塩（pH7.4）：1
00mMNaClが適切である）し、適切な量の適当な媒体（た
とえば緩衝したかまたはしていない水溶液）に再懸濁し
てもよい。こうして調製した懸濁液を次に、適切な条件
下で音波処理等によつて固液接触せしめ、得られた沈殿
物をたとえば上述のような遠心分離または限外過によ
つて固液接触（たとえば音波処理）した懸濁液から部分
的にまたは完全に分離する。これらの再懸濁，固液接触
（たとえば音波処理）および分離は少なくとも１回繰り
返して行なうのが好ましい。特に好ましい態様ではこれ
らのステツプを次のように４回実施する。すなわち、ま
ず得られた沈殿を２０mMTris（pH7.4）または５０ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）に再懸濁し、この懸
濁液を上記のように固液接触させる（たとえば音波処理
する）。次に、懸濁液を上記のように遠心分離し、回収
した沈殿を５０mMTris（pH7.4）：100mMNaClまたは２０
ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）：１０mMEDTA：1
00mMNaClに再懸濁する。次いで、この懸濁液を音波処理
等によつて固液接触せしめ、上記のように遠心分離し、
回収した沈殿を脱イオン水中に再度懸濁する。水懸濁液
を固液接触させ（たとえば音波処理し）、上記のように
再度遠心分離し、回収した沈殿を再度脱イオン水中に懸
濁する。この２番目の水懸濁液を固液接触（たとえば音
波処理）せしめ、上記のように遠心して所望のホルモン
またはアナログに富む沈殿を得る。
その後、分離した沈殿を、たとえばこれを適当な温度
（たとえば４〜４０℃）で充分な量（約25倍容が好まし
い）に水に再懸濁することによつて可溶化し、pHを適切
なアルカリ性pH（たとえば約9.0〜12.0）に調整してホ
ルモンまたはアナログを含有する溶液を形成する。溶解
を容易にするために高剪断攪拌（たとえばポリトロン
（Poly-tron）〔キネマチカ（Kinematica）〕ブレンダ
ー）を用いてもよい。最初の懸濁液のpHは、NaOH（たと
えば１〜１０NaOH）をpHが約9.0〜12.0（約11.8〜12.0
が好ましい）になるまで懸濁液に加えることによつて適
切に調整できる。NaOHは溶液を激しく攪拌しながら加え
るのが好ましい。次にこの溶液を約１時間攪拌インキユ
ベートすると、pHは約10.5に低下するであろう。
（たとえば４〜４０℃）で充分な量（約25倍容が好まし
い）に水に再懸濁することによつて可溶化し、pHを適切
なアルカリ性pH（たとえば約9.0〜12.0）に調整してホ
ルモンまたはアナログを含有する溶液を形成する。溶解
を容易にするために高剪断攪拌（たとえばポリトロン
（Poly-tron）〔キネマチカ（Kinematica）〕ブレンダ
ー）を用いてもよい。最初の懸濁液のpHは、NaOH（たと
えば１〜１０NaOH）をpHが約9.0〜12.0（約11.8〜12.0
が好ましい）になるまで懸濁液に加えることによつて適
切に調整できる。NaOHは溶液を激しく攪拌しながら加え
るのが好ましい。次にこの溶液を約１時間攪拌インキユ
ベートすると、pHは約10.5に低下するであろう。
次にこの溶液に、適切に濃縮した、たとえば約１Ｍ（適
当なpH，たとえば11.5〜12.0）のホウ酸ナトリウム水溶
液を適当な量加えて、最終ホウ酸塩濃度を好ましい約１
０mMにする。ついでタンパク質溶液を、２〜１０倍溶の
１０mMホウ酸ナトリウム緩衝液（pH10.2）で希釈するか
または濃塩酸すなわち１ＮHClで滴定することによつてp
H10.5に滴定する。その後この溶液を攪拌しながらさら
に１〜１２時間インキユベートする。所望により、こう
して得られた溶液を精澄（透明）にしてもよい。すなわ
ち、たとえば約10Ｌ／時の流速で連続流式ヒートシステ
ムソニケーター（Heat System Sonicator）モデル370を
用いて、適当な条件下で溶液を音波処理し、この音波処
理した溶液を、たとえば約３０Ｌ／時の流速で固形ボー
ル型連続流式遠心機（たとえばセパ（Cepa）１０１）に
よつて適切な条件下で遠心分離し、上清液を分離し、た
とえばブフナー（Buchner）真空フイルター上のワツト
マン（Whatman）No.２紙を通して液体を真空過し
て、可溶化したホルモンまたはアナログを含有する透明
溶液を生成する。あるいはもつぱら遠心分離を用いても
よい。
当なpH，たとえば11.5〜12.0）のホウ酸ナトリウム水溶
液を適当な量加えて、最終ホウ酸塩濃度を好ましい約１
０mMにする。ついでタンパク質溶液を、２〜１０倍溶の
１０mMホウ酸ナトリウム緩衝液（pH10.2）で希釈するか
または濃塩酸すなわち１ＮHClで滴定することによつてp
H10.5に滴定する。その後この溶液を攪拌しながらさら
に１〜１２時間インキユベートする。所望により、こう
して得られた溶液を精澄（透明）にしてもよい。すなわ
ち、たとえば約10Ｌ／時の流速で連続流式ヒートシステ
ムソニケーター（Heat System Sonicator）モデル370を
用いて、適当な条件下で溶液を音波処理し、この音波処
理した溶液を、たとえば約３０Ｌ／時の流速で固形ボー
ル型連続流式遠心機（たとえばセパ（Cepa）１０１）に
よつて適切な条件下で遠心分離し、上清液を分離し、た
とえばブフナー（Buchner）真空フイルター上のワツト
マン（Whatman）No.２紙を通して液体を真空過し
て、可溶化したホルモンまたはアナログを含有する透明
溶液を生成する。あるいはもつぱら遠心分離を用いても
よい。
その後、可溶化したホルモンまたはアナログをタンパク
質、脂質およびその他の粒子等の他の細胞成分から分離
し、適切な条件の限外過によつて凝集体をばらばらに
する。得られた保留物（retentate）を再度少なくとも
１回限外過にかける。この手順中に保留物の容量は約
９５％、たとえば約１０から約0.5に減少させるべ
きであり、液を集める。カツトオフが100KM.W.のペリ
コンカセツト（Pellicon Cassette）またはPUF-100螺
線（ミリポア社（Millipore Corp.,ベツドフオード（Be
dford），マサチユーセツツ州）が限外過工程での使
用に適している。保留物を適当なアルカリ性pH（たとえ
ば約９〜１２）適当な緩衝液でさらに希釈し、さらに限
外過にかけると好ましい。現在のところ好ましい態様
では１０mMホウ酸塩緩衝液（pH10.5〜12.0）を使用す
る。再希釈および限外過による再濃縮は少なくとも１
回繰り返すのが好ましい。あるいは、保留物の容量を実
質的に一定にして限外過を１回以上実施してもよい。
特に好ましい態様では保留物の280nm吸光度が約0.1の光
学密度単位未満になるまで限外過を繰り返す。ホルモ
ンは従来ゲルクロマトグラフイーで得られたよりも高い
レベルの純度と生物学的活性で限外液から都合よく得
ることができる。
質、脂質およびその他の粒子等の他の細胞成分から分離
し、適切な条件の限外過によつて凝集体をばらばらに
する。得られた保留物（retentate）を再度少なくとも
１回限外過にかける。この手順中に保留物の容量は約
９５％、たとえば約１０から約0.5に減少させるべ
きであり、液を集める。カツトオフが100KM.W.のペリ
コンカセツト（Pellicon Cassette）またはPUF-100螺
線（ミリポア社（Millipore Corp.,ベツドフオード（Be
dford），マサチユーセツツ州）が限外過工程での使
用に適している。保留物を適当なアルカリ性pH（たとえ
ば約９〜１２）適当な緩衝液でさらに希釈し、さらに限
外過にかけると好ましい。現在のところ好ましい態様
では１０mMホウ酸塩緩衝液（pH10.5〜12.0）を使用す
る。再希釈および限外過による再濃縮は少なくとも１
回繰り返すのが好ましい。あるいは、保留物の容量を実
質的に一定にして限外過を１回以上実施してもよい。
特に好ましい態様では保留物の280nm吸光度が約0.1の光
学密度単位未満になるまで限外過を繰り返す。ホルモ
ンは従来ゲルクロマトグラフイーで得られたよりも高い
レベルの純度と生物学的活性で限外液から都合よく得
ることができる。
次に、ホルモンまたはアナログをさらに精製濃縮し、精
製ホルモンまたはアナログを回収するように、たとえ
ば、ジメチルアミノエチルのようなアミン含有イオン交
換樹脂を用いるイオン交換クロマトグラフイー等によつ
て、限外液中に得られた精製ホルモンまたはアナログ
を処理する。イオン交換クロマトグラフイーに先立つ
て、１０ＫK.W.メンブランを用いる限外過で水を除去
して濃縮することは随意である。イオン交換クロマトグ
ラフイーステツプ中に、残留していたDNA、（存在する
場合には）リゾチーム、および多量体（multimers）が
ホルモンまたはアナログから分離される。このステツプ
で限外液のpHはまず塩酸で滴定することによつて適切
なpH（たとえば9.0）に調整し、適切なイオン交換カラ
ム、たとえばＤＥＡＥ−セフアローズ（Sepharose ）
ＣＬ−６Ｂ（高速）ＫＳ−370区分カラム（フアルマシ
アフアインケミカルズ（Pharmacia Fine Chemicals），
ピスカタウエイ（Piscataway），ニユージヤージー州）
に載せる。次に系を適切な緩衝液（たとえば１０ｍＭホ
ウ酸塩緩衝液）で洗浄し、適当な溶出液、たとえば100m
MNaClを含有する１０mMホウ酸塩緩衝液（pH9.0）、を用
いて適切な速度でサンプルを溶出する。ホルモンまたは
アナログを含有する画分を、ペリコンカセツト（Pellic
on Cassette）すなわちカツトオフが１０ＫK.W.のPUF-
100スパイラルを用いる限外過によつて濃縮すること
ができ、次いで適切な濃度の適当な塩（たとえば３mM水
酸化アンモニウムまたは重炭酸アンモニウム）を含有す
る溶液に対して再び１０ＫK.W.のカツトオフのペリコン
カセツト（Pellicon Cassette）を用いて透析してもよ
い。次に、透析した物質を適当な条件での凍結乾燥また
はスプレー乾燥によつて乾燥してもよい。スプレー乾燥
の方が経済的な工程であり、人口温度がほぼ200℃、出
口温度がほぼ５０℃、流速が約2.5Ｌ／時の小さいスプ
レードライヤー（ニロアトマイザー（Niro Atomyze
r））で便利に行なうことができる。こうして、以上の
ように処理した動物成長ホルモンまたはアナログは白色
微粉末状で得ることができる。
製ホルモンまたはアナログを回収するように、たとえ
ば、ジメチルアミノエチルのようなアミン含有イオン交
換樹脂を用いるイオン交換クロマトグラフイー等によつ
て、限外液中に得られた精製ホルモンまたはアナログ
を処理する。イオン交換クロマトグラフイーに先立つ
て、１０ＫK.W.メンブランを用いる限外過で水を除去
して濃縮することは随意である。イオン交換クロマトグ
ラフイーステツプ中に、残留していたDNA、（存在する
場合には）リゾチーム、および多量体（multimers）が
ホルモンまたはアナログから分離される。このステツプ
で限外液のpHはまず塩酸で滴定することによつて適切
なpH（たとえば9.0）に調整し、適切なイオン交換カラ
ム、たとえばＤＥＡＥ−セフアローズ（Sepharose ）
ＣＬ−６Ｂ（高速）ＫＳ−370区分カラム（フアルマシ
アフアインケミカルズ（Pharmacia Fine Chemicals），
ピスカタウエイ（Piscataway），ニユージヤージー州）
に載せる。次に系を適切な緩衝液（たとえば１０ｍＭホ
ウ酸塩緩衝液）で洗浄し、適当な溶出液、たとえば100m
MNaClを含有する１０mMホウ酸塩緩衝液（pH9.0）、を用
いて適切な速度でサンプルを溶出する。ホルモンまたは
アナログを含有する画分を、ペリコンカセツト（Pellic
on Cassette）すなわちカツトオフが１０ＫK.W.のPUF-
100スパイラルを用いる限外過によつて濃縮すること
ができ、次いで適切な濃度の適当な塩（たとえば３mM水
酸化アンモニウムまたは重炭酸アンモニウム）を含有す
る溶液に対して再び１０ＫK.W.のカツトオフのペリコン
カセツト（Pellicon Cassette）を用いて透析してもよ
い。次に、透析した物質を適当な条件での凍結乾燥また
はスプレー乾燥によつて乾燥してもよい。スプレー乾燥
の方が経済的な工程であり、人口温度がほぼ200℃、出
口温度がほぼ５０℃、流速が約2.5Ｌ／時の小さいスプ
レードライヤー（ニロアトマイザー（Niro Atomyze
r））で便利に行なうことができる。こうして、以上の
ように処理した動物成長ホルモンまたはアナログは白色
微粉末状で得ることができる。
本発明方法によつて、発酵終了時の細菌中に存在するホ
ルモンまたはアナログの重量に対して約３０％以上の収
率で精製動物成長ホルモンまたはアナログを回収するこ
とができる。このようにして得られたホルモンまたはア
ナログは、低分子量のサイズマーカー（フアルマシア
（Pharmacia））を標準として１５％ポリアクリルアミ
ド−ＳＤＳゲル上で展開すると１つのスポツトとなつて
現われる。
ルモンまたはアナログの重量に対して約３０％以上の収
率で精製動物成長ホルモンまたはアナログを回収するこ
とができる。このようにして得られたホルモンまたはア
ナログは、低分子量のサイズマーカー（フアルマシア
（Pharmacia））を標準として１５％ポリアクリルアミ
ド−ＳＤＳゲル上で展開すると１つのスポツトとなつて
現われる。
本発明によつて限外過およびイオン交換クロマトグラ
フイー後に得られたペプチドは、限外過の代わりにゲ
ルクロマトグラフイーを用いたとき、またはイオン交換
クロマトグラフイーの代わりに１０ＫK.W.限外過によ
つてペプチド濃縮をしたときよりも純度が高くしかも安
定性も高かつた。
フイー後に得られたペプチドは、限外過の代わりにゲ
ルクロマトグラフイーを用いたとき、またはイオン交換
クロマトグラフイーの代わりに１０ＫK.W.限外過によ
つてペプチド濃縮をしたときよりも純度が高くしかも安
定性も高かつた。
回収されたホルモンとアナログの生物活性に関しては、
ラジオイム アツセイの結果が示しているように、天然
のホルモンに対する抗体は適当な微生物によつて産生さ
れ本発明に従つて回収されたホルモンまたはアナログに
対してほぼ等しい親和性を有していた。同様に、ラジオ
レセプター結合アツセイは、適当な膜の本発明によつて
精製されたホルモンまたはアナログに対する結合活性が
天然ホルモンの真正サンプルに対する活性と同等である
ことを示している。さらに、このホルモンまたはアナロ
グを適当な動物に一次または二次（ブースター）注射し
た後このペプチドに対する抗体は全く検出されなかつ
た。また、本発明で得られたウシ成長ホルモンアナログ
を授乳期のウシに投与すると乳汁分泌が促進されること
が判明した。
ラジオイム アツセイの結果が示しているように、天然
のホルモンに対する抗体は適当な微生物によつて産生さ
れ本発明に従つて回収されたホルモンまたはアナログに
対してほぼ等しい親和性を有していた。同様に、ラジオ
レセプター結合アツセイは、適当な膜の本発明によつて
精製されたホルモンまたはアナログに対する結合活性が
天然ホルモンの真正サンプルに対する活性と同等である
ことを示している。さらに、このホルモンまたはアナロ
グを適当な動物に一次または二次（ブースター）注射し
た後このペプチドに対する抗体は全く検出されなかつ
た。また、本発明で得られたウシ成長ホルモンアナログ
を授乳期のウシに投与すると乳汁分泌が促進されること
が判明した。
以下の実施例は本発明を理解する手助けをするためのも
のであり、いかなる意味でも本発明の範囲を限定するも
のではないと理解されたい。当業者に周知の常法につい
ては詳しい説明はしない。
のであり、いかなる意味でも本発明の範囲を限定するも
のではないと理解されたい。当業者に周知の常法につい
ては詳しい説明はしない。
実施例１ 大腸菌（E.coli）の増殖とbGHアナログの産生 Ｉ．培養株（Stock culture） 増殖誘導によつてbGHアナログ（Met-Asp-Gln-bGH）を産
生する大腸菌（E.coli）株ATCCNo.39806の培養株をカゼ
イン培地（下記接種参照）上で増殖させ、凍結用培地で
２倍に希釈し、−８０℃に貯蔵した。凍結用培地には50
0ｍ当りに次の成分が含まれている。
生する大腸菌（E.coli）株ATCCNo.39806の培養株をカゼ
イン培地（下記接種参照）上で増殖させ、凍結用培地で
２倍に希釈し、−８０℃に貯蔵した。凍結用培地には50
0ｍ当りに次の成分が含まれている。
K2HPO4 6.3ｇ KH2PO4 1.8ｇ クエン酸ナトリウム 0.45ｇ MgSO4・7H2O 0.09ｇ (NH4)2SO 0.9ｇ グリセロール 44.0ｇ II.接種 カゼイン水解物20ｇ／、酵母エキス10ｇ／およびNa
Cl２ｇ／中で接種材料を増殖した。震盪フラスコ内の
無菌培地に貯蔵培養株（stock culture）から接種し、
３０℃、約200r.p.m.のシエーカー上で１５時間インキ
ユベートした。必要とされるように、接種物増殖におけ
る以後の段階は攪拌通気発酵槽中で行なつた。無菌培地
に接種培養物を２〜１０％接種し、攪拌および通気しな
がら３０℃、pH７±0.5で１５時間インキユベートして
溶存酸素濃度を空気飽和の約２０％のレベルに維持し
た。
Cl２ｇ／中で接種材料を増殖した。震盪フラスコ内の
無菌培地に貯蔵培養株（stock culture）から接種し、
３０℃、約200r.p.m.のシエーカー上で１５時間インキ
ユベートした。必要とされるように、接種物増殖におけ
る以後の段階は攪拌通気発酵槽中で行なつた。無菌培地
に接種培養物を２〜１０％接種し、攪拌および通気しな
がら３０℃、pH７±0.5で１５時間インキユベートして
溶存酸素濃度を空気飽和の約２０％のレベルに維持し
た。
III.産生 産生培地には次の成分が含まれている。
カゼイン水解物 ２０ｇ／ 酵母エキス １０ｇ／ K2HPO4 2.5ｇ MgSO4・7H2O １ｇ／ NaCl ５ｇ／ ビオチン 0.1mg／ チアミン １mg／ 微量元素溶液 ３ｍ／ この培地にはアンピシリンも１００mg／含まれてい
る。アンピシリンは産生にとつては任意成分であるが接
種物の増殖に用いる培地には常に含まれている。
る。アンピシリンは産生にとつては任意成分であるが接
種物の増殖に用いる培地には常に含まれている。
ビオチン、チアミンおよびアンピシリンの濃縮溶液は別
にフイルター滅菌し、接種前に無菌産生培地に添加し
た。無菌グルコース溶液は１０ｇ／になるように最初
に添加した。誘導期にさらに１０ｇ／のグルコースを
加えた。
にフイルター滅菌し、接種前に無菌産生培地に添加し
た。無菌グルコース溶液は１０ｇ／になるように最初
に添加した。誘導期にさらに１０ｇ／のグルコースを
加えた。
微量元素溶液には次の成分が含まれている。
ＦｅＣｌ 3 １６ｇ／ ZnCl2・4H2O ２ｇ／ CoCl2・6H2O ２ｇ／ Na2M0O4・2H2O ２ｇ／ CaCl2・2H2O １ｇ／ CuCl 2 １ｇ／ H 3BO3 0.5ｇ／ 濃ＨＣｌ １００ｍ／ この培地に接種培養物を0.5〜１０％接種し、30℃でイ
ンキユベートする。溶存酸素濃度が空気飽和の約２０％
より高いレベルに維持されるように攪拌通気速度を設定
する。pHはＮＨ3で7.0〜7.5±0.2に維持する。細胞濃度
が約3.5ｇ／（ＯＤ660＝１０）に達した時点で温度を
４２℃に上げて誘導を開始する。次に温度を１〜５時間
４２℃に保ち、その後細胞懸濁液から細胞を採取し得
る。
ンキユベートする。溶存酸素濃度が空気飽和の約２０％
より高いレベルに維持されるように攪拌通気速度を設定
する。pHはＮＨ3で7.0〜7.5±0.2に維持する。細胞濃度
が約3.5ｇ／（ＯＤ660＝１０）に達した時点で温度を
４２℃に上げて誘導を開始する。次に温度を１〜５時間
４２℃に保ち、その後細胞懸濁液から細胞を採取し得
る。
実施例２ 細胞採取 実施例１と同様にして得た細胞懸濁液（6.15ＤＣＷ／Ｌ
および４９０mgbGH/L含有）500を室温に冷やし、保有
タンク（holding tank）に移した。供給速度250／時
のCEPA 101管状ボール形（tubular bowl）遠心機で細胞
懸濁液を遠心した（１４，０００ＲＰＭ，１６，０００
×ｇ）。このCEPA 101遠心機は、管長73.7cm、放電ダム
（discharge dam）までの半径3.25cm、ボール壁までの
半径7.35cmであり、加速ひれ（accelerationfins）を備
えており、外部ジヤケツト上に冷却器がある。
および４９０mgbGH/L含有）500を室温に冷やし、保有
タンク（holding tank）に移した。供給速度250／時
のCEPA 101管状ボール形（tubular bowl）遠心機で細胞
懸濁液を遠心した（１４，０００ＲＰＭ，１６，０００
×ｇ）。このCEPA 101遠心機は、管長73.7cm、放電ダム
（discharge dam）までの半径3.25cm、ボール壁までの
半径7.35cmであり、加速ひれ（accelerationfins）を備
えており、外部ジヤケツト上に冷却器がある。
透明な上精が密度が1.0ｇ／ｍで検出可能なbGHを含ん
でいないので捨てた。重量が11.4Kg（７５％湿潤状態）
のケーキには凝集したびbGHが含まれており、これを貯
蔵した。このケーキは通常厚みが約２cmで密度が1.1ｇ
／ｍであつた。別の手順は、一晩細胞を静置沈降さ
せ、透明上精をサイホンで除去することである。
でいないので捨てた。重量が11.4Kg（７５％湿潤状態）
のケーキには凝集したびbGHが含まれており、これを貯
蔵した。このケーキは通常厚みが約２cmで密度が1.1ｇ
／ｍであつた。別の手順は、一晩細胞を静置沈降さ
せ、透明上精をサイホンで除去することである。
アツセイ法：細胞懸濁液、上精およびケーキに対する定
量ゲル走査（Quantitated gel scan） ステツプ収率（注）：１００％ 総合収率：１００％ ステツプ最終（output）容量：初期細胞懸濁液容量の2.
3％計算アツセイ（calc′d assay）：ケーキ１Kg当り2
1.5ｇbGH濃縮率（enrichment factor）：４４（最終bGH
濃度／供給（inout）bGH濃度） （注）収率はＯＤ単位を測定して決定した。この単位は
２８０ｎｍでの溶液の吸光度（セル１cm）×溶液の容量
（ｍＬ）で定義される。たとえば、ＯＤ値が9.1で溶液
容量が３２，６００ｍＬであればＯＤ単位の値は２９
７，０００ＯＤである。吸光度をpH９で測定すれば、Ｏ
Ｄ値に変換率0.00157を掛けるとｇ bGHに変換される。
すなわち14.3ｇ bGH／Ｌとなる。
量ゲル走査（Quantitated gel scan） ステツプ収率（注）：１００％ 総合収率：１００％ ステツプ最終（output）容量：初期細胞懸濁液容量の2.
3％計算アツセイ（calc′d assay）：ケーキ１Kg当り2
1.5ｇbGH濃縮率（enrichment factor）：４４（最終bGH
濃度／供給（inout）bGH濃度） （注）収率はＯＤ単位を測定して決定した。この単位は
２８０ｎｍでの溶液の吸光度（セル１cm）×溶液の容量
（ｍＬ）で定義される。たとえば、ＯＤ値が9.1で溶液
容量が３２，６００ｍＬであればＯＤ単位の値は２９
７，０００ＯＤである。吸光度をpH９で測定すれば、Ｏ
Ｄ値に変換率0.00157を掛けるとｇ bGHに変換される。
すなわち14.3ｇ bGH／Ｌとなる。
実施例３ 細胞破砕 細胞採取ステツプ（実施例２）で得た湿潤細胞（11.4k
g）を湿潤細胞１Kgにつき４（全体で45.6）の５０m
M Tris：５０mM NaCl緩衝液（pH7.4）に懸濁した。この
ケーキを分散するにはポリトロン（Polytron）高剪断ミ
キサー（キネマチカ、Kinematica）が役に立つ。懸濁し
た細胞をダイノミル（Dynomill）ＫＤ−５型ビーズミル
破砕機（ウイリー アー．バツハオフエン（Willey A.B
achofen）、バーゼル）注に８０Ｌ／時で供給した。ビ
ーズミルは冷凍によつて−１０℃〜＋８℃に維持した。
この破砕した細胞を次に等容量の脱イオン水で希釈して
からCEPA 101管状ボール形遠心機で遠心分離した。遠心
機への供給速度は３０〜６０Ｌ／時であつた。供給速度
以外の遠心条件は全て細胞採取の場合と同じであつた。
供給bGHの約１０％を含有する上精は捨てた。重量5.28K
g（７５％湿潤状態）のケーキは凝集したbGHを含んでお
り、これを貯蔵した。
g）を湿潤細胞１Kgにつき４（全体で45.6）の５０m
M Tris：５０mM NaCl緩衝液（pH7.4）に懸濁した。この
ケーキを分散するにはポリトロン（Polytron）高剪断ミ
キサー（キネマチカ、Kinematica）が役に立つ。懸濁し
た細胞をダイノミル（Dynomill）ＫＤ−５型ビーズミル
破砕機（ウイリー アー．バツハオフエン（Willey A.B
achofen）、バーゼル）注に８０Ｌ／時で供給した。ビ
ーズミルは冷凍によつて−１０℃〜＋８℃に維持した。
この破砕した細胞を次に等容量の脱イオン水で希釈して
からCEPA 101管状ボール形遠心機で遠心分離した。遠心
機への供給速度は３０〜６０Ｌ／時であつた。供給速度
以外の遠心条件は全て細胞採取の場合と同じであつた。
供給bGHの約１０％を含有する上精は捨てた。重量5.28K
g（７５％湿潤状態）のケーキは凝集したbGHを含んでお
り、これを貯蔵した。
破砕用緩衝液（５０mM Tris：５０mM NaCl,pH7.4）：脱
イオン水７５０ｍＬ中のTris 6.06ｇとNaCl2.97ｇのpH
を濃ＨＣｌで7.4に調整し、脱イオン水で１Ｌに希釈
し、必要ならばpH7.4に再調整した。
イオン水７５０ｍＬ中のTris 6.06ｇとNaCl2.97ｇのpH
を濃ＨＣｌで7.4に調整し、脱イオン水で１Ｌに希釈
し、必要ならばpH7.4に再調整した。
アツセイ法：細胞、上精およびケーキに対する定量ゲル
走査 ステツプ収率（注）：９０％ 総合収率：９０％ 最終容量：初期細胞懸濁液容量の10.5％ 計算アツセイ：ケーキ１Kg当たり37.1ｇbGH 濃縮率：1.7 実施例４ リゾチーム処理 破砕ステツプ（実施例３）で得た湿潤ケーキ（5.28kg）
を採取した最初の湿潤細胞１Kgにつき1.2（全体で13.
7）の５０mM Tris：５０mM EDTA緩衝液（pH7.4）に懸
濁した。このケーキを分散させるにはポリトロン（Poly
tron）高剪断ミキサーが役立つ。リゾチーム（シグマ
（Sigma）グレードII）を加え（0.55ｇ／スラリ
ー）、このスラリーを３７℃で１時間混合した。トリト
ン（Triton ）×−１００（ローム アンド ハース社
（Rohm＆Haas Co.），フイラデルフイア、ペンシルバニ
ア州）を加え（１当たり10v/v％緩衝溶液（pH7.4）１
００ｍ、トリトン（Triton）×−１００の最終濃度１
％）、混合物をさらに３０分間インキユベートした。流
れセル（flow cell）を備えた６５％動力（power）のヒ
ートシステムズ（Heat Systems）３７０Ｗ音波処理機中
でスラリーを音波処理した。処理機中の流速は１８Ｌ／
時であつた。音波処理したスラリーを３０Ｌ／時のCEPA
101で遠心した。供給速度以外の遠心条件は全て細胞採
取時の条件と同じであつた。供給bGHの約３％を含む上
清は捨てた。3.07Kg（７５％湿潤状態）の重量のケーキ
が凝集したbGHを含有しており、これを貯蔵した。
走査 ステツプ収率（注）：９０％ 総合収率：９０％ 最終容量：初期細胞懸濁液容量の10.5％ 計算アツセイ：ケーキ１Kg当たり37.1ｇbGH 濃縮率：1.7 実施例４ リゾチーム処理 破砕ステツプ（実施例３）で得た湿潤ケーキ（5.28kg）
を採取した最初の湿潤細胞１Kgにつき1.2（全体で13.
7）の５０mM Tris：５０mM EDTA緩衝液（pH7.4）に懸
濁した。このケーキを分散させるにはポリトロン（Poly
tron）高剪断ミキサーが役立つ。リゾチーム（シグマ
（Sigma）グレードII）を加え（0.55ｇ／スラリ
ー）、このスラリーを３７℃で１時間混合した。トリト
ン（Triton ）×−１００（ローム アンド ハース社
（Rohm＆Haas Co.），フイラデルフイア、ペンシルバニ
ア州）を加え（１当たり10v/v％緩衝溶液（pH7.4）１
００ｍ、トリトン（Triton）×−１００の最終濃度１
％）、混合物をさらに３０分間インキユベートした。流
れセル（flow cell）を備えた６５％動力（power）のヒ
ートシステムズ（Heat Systems）３７０Ｗ音波処理機中
でスラリーを音波処理した。処理機中の流速は１８Ｌ／
時であつた。音波処理したスラリーを３０Ｌ／時のCEPA
101で遠心した。供給速度以外の遠心条件は全て細胞採
取時の条件と同じであつた。供給bGHの約３％を含む上
清は捨てた。3.07Kg（７５％湿潤状態）の重量のケーキ
が凝集したbGHを含有しており、これを貯蔵した。
リゾチーム用緩衝液（５０mM Tris：５０mM EDTA,pH7.
4）： 脱イオン水７５０ｍＬ中のTris 6.06ｇとEDTA 14.6ｇの
pHを濃ＨＣｌまたは５０％NaOHで7.4に調整し、脱イオ
ン水で１Ｌに希釈し、必要があれば再度pH7.4に調整し
た。
4）： 脱イオン水７５０ｍＬ中のTris 6.06ｇとEDTA 14.6ｇの
pHを濃ＨＣｌまたは５０％NaOHで7.4に調整し、脱イオ
ン水で１Ｌに希釈し、必要があれば再度pH7.4に調整し
た。
アツセイ法：上清とケーキに対する定量ゲル走査 ステツプ収率：９７％ 総合収率：87.3％ 最終容量：初期細胞懸濁液容量の0.61％ 計算アツセイ：ケーキ１Kg当たり61.9ｇbGH 濃縮率：1.7 実施例５ 第１洗浄 リゾチームステツプ（実施例４）で得た湿潤ケーキ（3.
07kg）を最初の採取湿潤細胞１Kg当たり0.6（全体で
6.8）の２０mM Tris緩衝液（pH7.4）に懸濁した。こ
のケーキを分散させるのにはポリトロン（Polytron）高
剪断ミキサーが用いられる。６５％動力のヒートシステ
ムズ（Heat Systems）３７０ワツトモデル中を１８Ｌ／
時の流速で通してスラリーを音波処理した。音波処理し
たスラリーをCEPA 101（３０Ｌ／時）で遠心分離した。
供給速度以外の遠心条件は全て細胞採取時のものと同じ
であつた。上清を捨てた。重量2.46Kg（７５％湿潤状
態）のケーキが凝集したbGHを含有しており、これを貯
蔵した。
07kg）を最初の採取湿潤細胞１Kg当たり0.6（全体で
6.8）の２０mM Tris緩衝液（pH7.4）に懸濁した。こ
のケーキを分散させるのにはポリトロン（Polytron）高
剪断ミキサーが用いられる。６５％動力のヒートシステ
ムズ（Heat Systems）３７０ワツトモデル中を１８Ｌ／
時の流速で通してスラリーを音波処理した。音波処理し
たスラリーをCEPA 101（３０Ｌ／時）で遠心分離した。
供給速度以外の遠心条件は全て細胞採取時のものと同じ
であつた。上清を捨てた。重量2.46Kg（７５％湿潤状
態）のケーキが凝集したbGHを含有しており、これを貯
蔵した。
第１洗浄用緩衝液（２０mM Tris，pH7.4）： 脱イオン水７５０ｍＬ中のTris2.42ｇのpHを濃ＨＣｌで
7.4に調整し、脱イオン水で１Ｌに希釈し、必要に応じ
て再度pH7.4に調整した。
7.4に調整し、脱イオン水で１Ｌに希釈し、必要に応じ
て再度pH7.4に調整した。
アツセイ法：上清とケーキに対する定量ゲル走査 ステツプ収率：１００％ 総合収率：87.3％ 最終容量：初期細胞懸濁液容量の0.49％ 計算アツセイ：湿潤ケーキ１Kg当たり77.3ｇbGH 濃縮率：1.2 実施例６ 塩洗浄 第１洗浄ステツプ（実施例５）で得た湿潤ケーキ（2.46
kg）を最初の湿潤採取細胞１Kgに対して0.6（全体で
6.8）の５０mM Tris:100mM NaCl緩衝液（pH7.4）に懸
濁した。このケーキを分散させるにはポリトロン（Poly
tron）高剪断ミキサーが使える。スラリーを１８Ｌ／時
の流速で６５％動力のヒートシステムズ（Heat System
s）３７０Ｗモデルに通して音波処理した。音波処理し
たスラリーをCEPA 101（３０Ｌ／時）で遠心した。供給
速度以外の遠心条件は全て細胞採取のものと同じであつ
た。上清を捨てた。2.15Kg（７５％湿潤状態）の重量の
ケーキが凝集したbGHを含んでおり、これを貯蔵した。
kg）を最初の湿潤採取細胞１Kgに対して0.6（全体で
6.8）の５０mM Tris:100mM NaCl緩衝液（pH7.4）に懸
濁した。このケーキを分散させるにはポリトロン（Poly
tron）高剪断ミキサーが使える。スラリーを１８Ｌ／時
の流速で６５％動力のヒートシステムズ（Heat System
s）３７０Ｗモデルに通して音波処理した。音波処理し
たスラリーをCEPA 101（３０Ｌ／時）で遠心した。供給
速度以外の遠心条件は全て細胞採取のものと同じであつ
た。上清を捨てた。2.15Kg（７５％湿潤状態）の重量の
ケーキが凝集したbGHを含んでおり、これを貯蔵した。
塩洗浄用緩衝液（５０mM Tris:100mM NaCl,pH7.4） 脱イオン水７５０ｍＬ中のTris 6.06ｇを塩化ナトリウ
ム5.85ｇのpHを濃ＨＣｌで7.4に調整し、脱イオン水で
１Ｌに希釈し、必要に応じてpHを7.4に再調整した。
ム5.85ｇのpHを濃ＨＣｌで7.4に調整し、脱イオン水で
１Ｌに希釈し、必要に応じてpHを7.4に再調整した。
アツセイ法：上清とケーキに対する定量ゲル走査 ステツプ収率：１００％ 総合収率：87.3％ 最終容量：初期細胞懸濁液容量の0.43％ 計算アツセイ：湿潤ケーキ１Kg当たり88.4ｇbGH 濃縮率：1.14 実施例７ 第１水洗 塩洗浄ステツプ（実施例６）で得た湿潤ケーキ（2.15k
g）を最初に採取した湿潤細胞１Kg当り1.2（全体で1
3.7）の発熱物質を含有しない脱イオン水に懸濁し
た。このケーキを分散するにはポリトロン（Polytron）
高剪断ミキサーが使用できる。スラリーを１８Ｌ／時の
流速で６５％動力のヒートシステムズ（Heat Systems）
３７０Ｗモデルに通して音波処理した。このスラリーの
pHは最初の水のpH（約6.2）からpH約7.8〜8.0に上昇し
た。音波処理したスラリーを次にをCEPA 101（３０Ｌ／
時）で遠心分離した。供給速度以外の遠心条件は全て細
胞採取のものと同じであつた。上清は捨てた。重量1.90
Kg（７５％湿潤状態）のケーキが凝集bGHを含有してお
り、これを貯蔵した。
g）を最初に採取した湿潤細胞１Kg当り1.2（全体で1
3.7）の発熱物質を含有しない脱イオン水に懸濁し
た。このケーキを分散するにはポリトロン（Polytron）
高剪断ミキサーが使用できる。スラリーを１８Ｌ／時の
流速で６５％動力のヒートシステムズ（Heat Systems）
３７０Ｗモデルに通して音波処理した。このスラリーの
pHは最初の水のpH（約6.2）からpH約7.8〜8.0に上昇し
た。音波処理したスラリーを次にをCEPA 101（３０Ｌ／
時）で遠心分離した。供給速度以外の遠心条件は全て細
胞採取のものと同じであつた。上清は捨てた。重量1.90
Kg（７５％湿潤状態）のケーキが凝集bGHを含有してお
り、これを貯蔵した。
アツセイ法：上清とケーキに対する定量ゲル走査 ステツプ収率：９９％ 総合収率：86.4％ 最終容量：初期細胞懸濁液容量の0.38％ 計算アツセイ：湿潤ケーキ１Kg当たり99.0ｇbGH 濃縮率：1.12 実施例８ 第２水洗 第１洗浄ステツプ（実施例７）で得た湿潤ケーキ（1.90
kg）を最初に採取した湿潤細胞１Kg当り1.2（全体で1
3.7）の発熱物質を含有しない脱イオン水に懸濁し
た。このケーキを分散するにはポリトロン（Polytron）
高剪断ミキサーが使用できる。スラリーのpHは約8.4で
あつた。このスラリーを１８Ｌ／時の流速で６５％動力
のヒートシステムズ（Heat Systems）３７０Ｗモデルに
通して音波処理した。音波処理したスラリーを次にをCE
PA 101（３０Ｌ／時）で遠心分離した。供給速度以外の
遠心条件は全て細胞採取のものと同じであつた。上清は
捨てた。重量1.31Kg（７５％湿潤状態）のケーキが凝集
bGHを含有しており、これを貯蔵した。
kg）を最初に採取した湿潤細胞１Kg当り1.2（全体で1
3.7）の発熱物質を含有しない脱イオン水に懸濁し
た。このケーキを分散するにはポリトロン（Polytron）
高剪断ミキサーが使用できる。スラリーのpHは約8.4で
あつた。このスラリーを１８Ｌ／時の流速で６５％動力
のヒートシステムズ（Heat Systems）３７０Ｗモデルに
通して音波処理した。音波処理したスラリーを次にをCE
PA 101（３０Ｌ／時）で遠心分離した。供給速度以外の
遠心条件は全て細胞採取のものと同じであつた。上清は
捨てた。重量1.31Kg（７５％湿潤状態）のケーキが凝集
bGHを含有しており、これを貯蔵した。
アツセイ法：上清とケーキに対する定量ゲル走査 ステツプ収率：９９％ 総合収率：85.6％ 最終容量：初期細胞懸濁液容量の0.26％ 計算アツセイ：ケーキ１Kg当たり１６０ｇbGH 濃縮率：1.62 実施例９ 溶解ステツプ 第２水洗（実施例８）で得た湿潤ケーキ（1.31kg）を洗
浄ケーキ１Kg当たり２５（全体で32.6）の発熱物質
を含有しない脱イオン水に懸濁した。このケーキを分散
させるにはポリトロン（Polytron）高剪断ミキサーが役
に立つ。１０Ｎ NaOHを加えてぺゆつくり11.8に調整し
た。凝集bGHは１時間かかつてゆつくりと溶解した。１
時間インキユベートした後、溶液に１Ｍホウ酸ナトリウ
ム（pH11.8）を加えてホウ酸ナトリウム１０mMの最終溶
液にした。この溶液を３０分間保持し、その後６５％動
力でヒートシステム（Heat System）３７０Ｗモデルを
通して音波処理した。音波処理機への供給速度は１８Ｌ
／時であつた。溶液が非常に濁つている場合には、CEPA
101を通して３０Ｌ／時で遠心した。そうでない場合に
は単一のブフナー（Buchner）フイルター中で３枚の直
径２４cmのワツトマン（Whatman）No.２ペーパーを通し
て５−Ｌ部に濾過した。濾過中泡立ちを防ぐために真空
度を調節した。不溶物は微量だけだつた。濾過物（32.6
L）は溶液中にbGHを含有している。
浄ケーキ１Kg当たり２５（全体で32.6）の発熱物質
を含有しない脱イオン水に懸濁した。このケーキを分散
させるにはポリトロン（Polytron）高剪断ミキサーが役
に立つ。１０Ｎ NaOHを加えてぺゆつくり11.8に調整し
た。凝集bGHは１時間かかつてゆつくりと溶解した。１
時間インキユベートした後、溶液に１Ｍホウ酸ナトリウ
ム（pH11.8）を加えてホウ酸ナトリウム１０mMの最終溶
液にした。この溶液を３０分間保持し、その後６５％動
力でヒートシステム（Heat System）３７０Ｗモデルを
通して音波処理した。音波処理機への供給速度は１８Ｌ
／時であつた。溶液が非常に濁つている場合には、CEPA
101を通して３０Ｌ／時で遠心した。そうでない場合に
は単一のブフナー（Buchner）フイルター中で３枚の直
径２４cmのワツトマン（Whatman）No.２ペーパーを通し
て５−Ｌ部に濾過した。濾過中泡立ちを防ぐために真空
度を調節した。不溶物は微量だけだつた。濾過物（32.6
L）は溶液中にbGHを含有している。
透明溶液の吸光度は２８０nm（セル１cm）で9.1O.D.で
あつた。この吸光度が全てbGHに起因する（そうではな
いが）のであれば、これは14.3ｇbGH／Ｌに相当するで
あろう。実際のbGH含有量はこの値の半分未満である。
ＵＶを吸収する不純物がこの相違の原因である。２８０
nm（セル１cm）で1.0の吸光度はpH９の純粋なbGHの1.57
ｇ／溶液に相当する。（bGHの吸光度はpHによつて変
化する。） 溶解用緩衝液（１Ｍホウ酸ナトリウム、pH11.8）： ホウ酸61.8ｇを脱イオン水750ｍに溶解し、５０％NaO
HでpHを11.8に調整する。脱イオン水で最終容量１に
希釈する。
あつた。この吸光度が全てbGHに起因する（そうではな
いが）のであれば、これは14.3ｇbGH／Ｌに相当するで
あろう。実際のbGH含有量はこの値の半分未満である。
ＵＶを吸収する不純物がこの相違の原因である。２８０
nm（セル１cm）で1.0の吸光度はpH９の純粋なbGHの1.57
ｇ／溶液に相当する。（bGHの吸光度はpHによつて変
化する。） 溶解用緩衝液（１Ｍホウ酸ナトリウム、pH11.8）： ホウ酸61.8ｇを脱イオン水750ｍに溶解し、５０％NaO
HでpHを11.8に調整する。脱イオン水で最終容量１に
希釈する。
アツセイ法：洗浄ケーキと溶解bGHに対する定量ゲル走
査 ステツプ収率：１００％ 総合収率：85.6％ 最終容量：初期細胞懸濁液容量の6.8％ 計算アツセイ：6.2ｇbGH／ 濃縮率：0.039 実施例１０ １００Ｋ限外濾過 透明なタンパク質溶液（32.6、297,000ＯＤ）（実施
例９）を別の部分（６×5.4）に分割した。これらは
各々50,000〜60,000ＯＤの吸光度を有していた。面積が
５ｆｔ2の100,000の分子量カツトオフカセツト（タイプ
PTHK）を３個備えたペリコンカセツト システム（Pell
icon CassetteSystem）限外濾過器（ミリポア（Millip
ore）、ベツドフオード（Bedford）、マサチユーセツツ
州）を通して各部を別々に限外濾過した。第１の部分を
１Ｌの保留物（すなわち濾過されずに残る残留物、rete
ntate）容量に濃縮した。限外濾液を集め、UVでアツセ
イし、貯蔵した。保留物を新たな10mMホウ酸ナトリウム
緩衝液（pH11.8）で元の容量に希釈しよく混和した。こ
のバツチを再び濃縮して１Ｌ保留物容量にした。限外濾
液を集め、最初の限外濾液と合わせた。限外濾液中の総
流量のＯＤ吸光が限外濾過器に入れた最初の量のＯＤ吸
光の２０％に等しくなつたとき、次の濃縮の際の保留物
容量は１Ｌの代わりに0.5Ｌにした。濃縮と10mMホウ酸
ナトリウム緩衝液希釈のサイクルは、0.5Ｌの保留物容
量からの限外濾液の２８０nm（セル１cm）の吸光度が0.
1未満になるまで続けた。これには通常限外濾過と希釈
が９〜１２サイクル必要である。最後の保留物は捨て
た。限外濾過の流速は表１に示す。
査 ステツプ収率：１００％ 総合収率：85.6％ 最終容量：初期細胞懸濁液容量の6.8％ 計算アツセイ：6.2ｇbGH／ 濃縮率：0.039 実施例１０ １００Ｋ限外濾過 透明なタンパク質溶液（32.6、297,000ＯＤ）（実施
例９）を別の部分（６×5.4）に分割した。これらは
各々50,000〜60,000ＯＤの吸光度を有していた。面積が
５ｆｔ2の100,000の分子量カツトオフカセツト（タイプ
PTHK）を３個備えたペリコンカセツト システム（Pell
icon CassetteSystem）限外濾過器（ミリポア（Millip
ore）、ベツドフオード（Bedford）、マサチユーセツツ
州）を通して各部を別々に限外濾過した。第１の部分を
１Ｌの保留物（すなわち濾過されずに残る残留物、rete
ntate）容量に濃縮した。限外濾液を集め、UVでアツセ
イし、貯蔵した。保留物を新たな10mMホウ酸ナトリウム
緩衝液（pH11.8）で元の容量に希釈しよく混和した。こ
のバツチを再び濃縮して１Ｌ保留物容量にした。限外濾
液を集め、最初の限外濾液と合わせた。限外濾液中の総
流量のＯＤ吸光が限外濾過器に入れた最初の量のＯＤ吸
光の２０％に等しくなつたとき、次の濃縮の際の保留物
容量は１Ｌの代わりに0.5Ｌにした。濃縮と10mMホウ酸
ナトリウム緩衝液希釈のサイクルは、0.5Ｌの保留物容
量からの限外濾液の２８０nm（セル１cm）の吸光度が0.
1未満になるまで続けた。これには通常限外濾過と希釈
が９〜１２サイクル必要である。最後の保留物は捨て
た。限外濾過の流速は表１に示す。
その後限外濾液を全部合わせ、6N HClでpHを9.0に調整
した。別の5.4−Ｌ部を同様にペリコンシステム（Pelli
con System）を通して処理し、pH調整した限外濾液を
全部合わせた。典型例では、吸光度が0.26OD／ｍの限
外濾液が全部で380得られ（これは100,000（pH１２）
の全ＯＤ値に等しい）、完了までに２４〜４０時間を要
した。
した。別の5.4−Ｌ部を同様にペリコンシステム（Pelli
con System）を通して処理し、pH調整した限外濾液を
全部合わせた。典型例では、吸光度が0.26OD／ｍの限
外濾液が全部で380得られ（これは100,000（pH１２）
の全ＯＤ値に等しい）、完了までに２４〜４０時間を要
した。
アツセイ法：入口供給物に対する定量ゲル走査と出口産
物に対する２８０nm（セル１cm）吸光度；定性ゲルクロ
マトグラフイーステツプ収率：75.5％ 総合収率：64.6
％ 最終容量：初期細胞懸濁液容量の７６％ 計算アツセイ：0.4ｇbGH／ 濃縮率：0.065 供給物、保留物および限外濾液は各々、分離の程度と質
を決定するためにセフアローズ（Sepharose ）ＣＬ−
６Ｂ（フアルマシア フアイン ケミカルズ（Pharmaci
a Fine Chemicals），ピスカタウエイ（Piscataway），
ニユージヤージー州）ゲルクロマトグラフイーで検査し
た。
物に対する２８０nm（セル１cm）吸光度；定性ゲルクロ
マトグラフイーステツプ収率：75.5％ 総合収率：64.6
％ 最終容量：初期細胞懸濁液容量の７６％ 計算アツセイ：0.4ｇbGH／ 濃縮率：0.065 供給物、保留物および限外濾液は各々、分離の程度と質
を決定するためにセフアローズ（Sepharose ）ＣＬ−
６Ｂ（フアルマシア フアイン ケミカルズ（Pharmaci
a Fine Chemicals），ピスカタウエイ（Piscataway），
ニユージヤージー州）ゲルクロマトグラフイーで検査し
た。
ゲルカラム条件は次の通り。
直径2.6cm×長さ100cm 全容量：500mL 空隙容量（void volume）：150mL 流量：４０〜６０mL／時 負荷：５mL 中 ５０ＯＤ 溶出液：10mMホウ酸ナトリウム、pH１２ 通常流出時間：５時間 検出：２８０nmUV ゲルクロマトグラフイー用緩衝液（10mMホウ酸ナトリウ
ム、pH１２）： 実施例９に記載のようにして調製。
ム、pH１２）： 実施例９に記載のようにして調製。
実施例１１ イオン交換クロマトグラフイー 実施例１０の100K限外濾過で得た限外濾液全量（３８０
、吸光度100,000ＯＤ）を線流速93cm／時（１００Ｌ
／時）のセフアローズ（Sepharose ）ＣＬ−６ＢＤＥ
ＡＥイオン交換カラム（フアルマシア フアイン ケミ
カルズ（Pharmacia Fine Chemicals），ピスカタウエイ
（Piscataway），ニユージヤージー州）に載せた。直径
３７cm、高さ１５cmのカラムを固定床容量（bed volum
e）の２倍量（32L）の10mMホウ酸ナトリウム緩衝液（pH
9.0）で洗浄し、充填（loading）ステツプと洗浄ステツ
プの溶出液を捨てた。溶出液を10mMホウ酸ナトリウム：
100mM塩化ナトリウム（pH９）に段階的に変えてbGHをカ
ラムから溶出した。溶出流速は93cm／時であつた。溶出
の進行は溶出液の２８０nm吸光度を測つてモニターし
た。bGHのピークは４〜５固定床容量で集め（84、全
吸光度43,000ＯＤ）、貯蔵した。bGH画分の平均濃度は
0.8ｇbGH／であつた。
、吸光度100,000ＯＤ）を線流速93cm／時（１００Ｌ
／時）のセフアローズ（Sepharose ）ＣＬ−６ＢＤＥ
ＡＥイオン交換カラム（フアルマシア フアイン ケミ
カルズ（Pharmacia Fine Chemicals），ピスカタウエイ
（Piscataway），ニユージヤージー州）に載せた。直径
３７cm、高さ１５cmのカラムを固定床容量（bed volum
e）の２倍量（32L）の10mMホウ酸ナトリウム緩衝液（pH
9.0）で洗浄し、充填（loading）ステツプと洗浄ステツ
プの溶出液を捨てた。溶出液を10mMホウ酸ナトリウム：
100mM塩化ナトリウム（pH９）に段階的に変えてbGHをカ
ラムから溶出した。溶出流速は93cm／時であつた。溶出
の進行は溶出液の２８０nm吸光度を測つてモニターし
た。bGHのピークは４〜５固定床容量で集め（84、全
吸光度43,000ＯＤ）、貯蔵した。bGH画分の平均濃度は
0.8ｇbGH／であつた。
固定床を93cm／時の速度で次のように洗浄してカラムを
再生した。すなわち、ＨＣｌでpH3.0に調整した１固定
床容量の１Ｍ酢酸ナトリウムをカラムに流し、次いで1.
5倍固定床容量の0.5ＮNaOHを流した。NaOHで処理した
後、カラムを２時間放置し、その後HClでpH3.0に調整し
た1.5倍固定床容量の１Ｍ酢酸ナトリウムでカラムを洗
浄した。次にイオン交換固定床に少なくとも３倍固定床
容量の10mMホウ酸ナトリウム（pH９）を流して固定床を
平衡化した。溶出液の伝導度とpHは新来の溶液にチエツ
クすべきである。
再生した。すなわち、ＨＣｌでpH3.0に調整した１固定
床容量の１Ｍ酢酸ナトリウムをカラムに流し、次いで1.
5倍固定床容量の0.5ＮNaOHを流した。NaOHで処理した
後、カラムを２時間放置し、その後HClでpH3.0に調整し
た1.5倍固定床容量の１Ｍ酢酸ナトリウムでカラムを洗
浄した。次にイオン交換固定床に少なくとも３倍固定床
容量の10mMホウ酸ナトリウム（pH９）を流して固定床を
平衡化した。溶出液の伝導度とpHは新来の溶液にチエツ
クすべきである。
アツセイ法：２８０nm吸収（セル１cm） ステツプ収率：４３％ 総合収率：27.7％ 最終容量：初期細胞懸濁液容量の16.8％ 計算アツセイ：0.8ｇbGH／Ｌ 濃縮率：２ カラム洗浄用緩衝液（10mMホウ酸ナトリウム、pH９） 脱イオン水750mL中のホウ酸0.62ｇのpHを濃HClで１０に
調整し、脱イオン水で１Ｌに希釈し、必要に応じてpH9.
0に再調整した。
調整し、脱イオン水で１Ｌに希釈し、必要に応じてpH9.
0に再調整した。
溶出用緩衝液（10mMホウ酸ナトリウム、100mM塩化ナト
リウム、pH９）： 脱イオン水750mL中のホウ酸ナトリウム＋水和物3.81ｇ
と塩化ナトリウム5.85ｇのpHを濃HClで9.0に調整し、脱
イオン水で１Ｌに希釈し、必要に応じてpH9.0に再調整
した。
リウム、pH９）： 脱イオン水750mL中のホウ酸ナトリウム＋水和物3.81ｇ
と塩化ナトリウム5.85ｇのpHを濃HClで9.0に調整し、脱
イオン水で１Ｌに希釈し、必要に応じてpH9.0に再調整
した。
再生用緩衝液（１Ｍ酢酸ナトリウムト、pH3.0） 脱イオン水750m中の酢酸ナトリウム３Ｈ2Ｏ136.09ｇ
のpHを濃HClで3.0に調整し、脱イオン水で１Ｌに希釈
し、必要に応じてpH3.0に再調整した。
のpHを濃HClで3.0に調整し、脱イオン水で１Ｌに希釈
し、必要に応じてpH3.0に再調整した。
実施例１２ 濃縮と透析 イオン交換ステツプ（実施例１１）で得たbGH画分（84
、43,000ＯＤ）のpHを１Ｎ NaOHで10.5に調整した。
調整溶液を、５ft2の10,000分子量カツトオフカセツト
（タイプPTGC）を３個有するミリポア（Millpore）ペリ
コン（Pellicon ）限外濾過器を通す限外濾過によつ
て、保留物の２８０nm吸収（セル１cm）の計算吸光度が
１０になるまで濃縮した。限外濾液はbGHを含んでおら
ず、捨てた。保留物の濃縮率は通常約２０であつた（保
留物4.2）。流量は表２に示す。
、43,000ＯＤ）のpHを１Ｎ NaOHで10.5に調整した。
調整溶液を、５ft2の10,000分子量カツトオフカセツト
（タイプPTGC）を３個有するミリポア（Millpore）ペリ
コン（Pellicon ）限外濾過器を通す限外濾過によつ
て、保留物の２８０nm吸収（セル１cm）の計算吸光度が
１０になるまで濃縮した。限外濾液はbGHを含んでおら
ず、捨てた。保留物の濃縮率は通常約２０であつた（保
留物4.2）。流量は表２に示す。
bGHを濃縮した後、10KK.W.カツトオフカセツトを有する
ペリコン システム（Pellicon System）を用いてNH4
OHに対して溶液を透析することで脱塩した（透析濾過、
diafiltration）。3mM NH4OH溶液（保留物容量に対して
２５倍容量、すなわちこの場合は3mM NH4OH 105）を
透析濾過による容量損失を償うに丁度充分な割合で連続
的に保留物に加えた。次いで透析濾過物を捨てた。これ
には塩と供給bGHの１０％（吸光測定）が含まれてい
る。脱塩したbGHを含有する保留物をペリコン システ
ム（Pellicon System）から取り、限外フイルターを
少量の3mM NH4OHで洗つてこれを保留物と合わせた。こ
の洗液を加える前の保留物容量は14.6ｇbGH／Ｌの濃度
で4.2（39,000ＯＤ）であつた。流量を表３に示す。
ペリコン システム（Pellicon System）を用いてNH4
OHに対して溶液を透析することで脱塩した（透析濾過、
diafiltration）。3mM NH4OH溶液（保留物容量に対して
２５倍容量、すなわちこの場合は3mM NH4OH 105）を
透析濾過による容量損失を償うに丁度充分な割合で連続
的に保留物に加えた。次いで透析濾過物を捨てた。これ
には塩と供給bGHの１０％（吸光測定）が含まれてい
る。脱塩したbGHを含有する保留物をペリコン システ
ム（Pellicon System）から取り、限外フイルターを
少量の3mM NH4OHで洗つてこれを保留物と合わせた。こ
の洗液を加える前の保留物容量は14.6ｇbGH／Ｌの濃度
で4.2（39,000ＯＤ）であつた。流量を表３に示す。
アツセイ法：２８０nm吸収（セル１cm） ステツプ収率：９０％ 総合収率：２５％ 最終容量：初期細胞懸濁液容量の0.84％ 計算アツセイ：14.6ｇbGH／Ｌ 濃縮率：18.3 実施例１３ 凍結乾燥 透析ステツプで得た保留物と洗液（4.2、濃度14.6ｇb
GH／Ｌの濃度で39,000 OD）を背の高いガラスジヤー中
でシエル凍結した。このジヤーは、内容物が凍結乾固さ
れるまで２４〜４８時間実験室用（lab）凍結乾燥器に
連結した。ジヤーの外面は乾燥サイクル中室温にさらし
ておいた。検出できるほどのbGH損失はなかつた。bGH
（61.3ｇ）をふわふわした綿毛状の白色粉末として得
た。
GH／Ｌの濃度で39,000 OD）を背の高いガラスジヤー中
でシエル凍結した。このジヤーは、内容物が凍結乾固さ
れるまで２４〜４８時間実験室用（lab）凍結乾燥器に
連結した。ジヤーの外面は乾燥サイクル中室温にさらし
ておいた。検出できるほどのbGH損失はなかつた。bGH
（61.3ｇ）をふわふわした綿毛状の白色粉末として得
た。
アツセイ法：供給物に対する吸光度と乾燥bGHに対する
放出アツセイ（release assay） ステツプ収率：１００％ 総合収率：２５％ 最終容量：初期細胞懸濁液容量の0.012％ 計算アツセイ：１００％マツシユ容量 濃縮率：６８
放出アツセイ（release assay） ステツプ収率：１００％ 総合収率：２５％ 最終容量：初期細胞懸濁液容量の0.012％ 計算アツセイ：１００％マツシユ容量 濃縮率：６８
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ３９７９２ (72)発明者 マリアン・ゴレツキ イスラエル国、レホヴオツト、ハナシ・ハ リシヨン・ストリート・５ (72)発明者 ダン・ハダリー イスラエル国、リシヨン・レズイオン、ド ロール・ストリート・58 (72)発明者 メナヘム・ゼエヴイ イスラエル国、ラマト・ガン、ハギルガ ル・ストリート・73 (56)参考文献 欧州特許114506（ＥＰ，Ａ)
Claims (41)
- 【請求項１】真核生物の成長ホルモンまたはそのアナロ
グをコードしているＤＮＡ配列の発現によってこのホル
モンまたはアナログを産生している細菌細胞から精製さ
れた真核生物成長ホルモンまたはそのアナログを回収す
る方法であって、次のステップ： ａ．細菌細胞またはそのフラグメントの細胞壁を破砕し
て溶解物を生成する； ｂ．粒子と不溶物を含有する沈殿を溶解物から分離す
る； ｃ．分離した沈殿を適当な緩衝溶液に懸濁して懸濁液を
調製する； ｄ．ＤＮａｓｅの不存在下で１００μｇ／ｍ以下のリ
ゾチーム溶液に懸濁液を適切な時間接触させ、液体と固
体の接触が起こるように懸濁液を処理する； ｅ．固液接触した懸濁液から沈殿物を部分的または完全
に分離する； ｆ．分離した沈殿を充分な量の水溶液に懸濁することに
より可溶化し、pHを9.0〜12.0に調整して溶液を形成す
る； ｇ．可溶化したホルモンまたはアナログを適切な条件で
カットオフ点が約１００ｋの分子量である膜を使用する
限外濾過によって他の細胞成分から分離してホルモンま
たはアナログを含有する限外濾液と保留物とを生成す
る； ｈ．ホルモンまたはアナログをさらに精製濃縮するよう
に可溶化ホルモンまたはアナログを処理し、こうして精
製されたホルモンまたはアナログを回収する； からなる方法。 - 【請求項２】ホルモンまたはアナログが動物の成長ホル
モンまたはそのアナログであることを特徴とする特許請
求の範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項３】ホルモンまたはアナログがウシ成長ホルモ
ンまたはそのアナログであることを特徴とする特許請求
の範囲第２項に記載の方法。 - 【請求項４】アナログが天然のウシ成長ホルモンのフェ
ニルアラニン形のＮ−末端に付加されたアミノ酸配列Me
t−Asp−Glnを含み、細菌細胞が大腸菌（Escherichia c
oli）菌株ATCC No.39806であることを特徴とする特許請
求の範囲第３項に記載の方法。 - 【請求項５】アナログが天然のウシ成長ホルモンのフェ
ニルアラニン形のＮ−末端に付加されたメチオニン残基
を含み、細菌細胞が大腸菌（Escherichia coli）菌株AT
CC No.39785であることを特徴とする特許請求の範囲第
３項に記載の方法。 - 【請求項６】ホルモンまたはアナログがヒト成長ホルモ
ンまたはそのアナログであることを特徴とする特許請求
の範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項７】アナログがMet14で始まる天然のヒト成長
ホルモンのアミノ酸配列からなり、細菌細胞が大腸菌
（Escherichia coli）菌株ATCC No.39386であることを
特徴とする特許請求の範囲第６項に記載の方法。 - 【請求項８】アナログが、Ｎ−末端にメチオニンが付い
た天然のヒト成長ホルモンのアミノ酸配列からなり、細
菌細胞が大腸菌（Escherichia coli）菌株ATCC No.3938
4であることを特徴とする特許請求の範囲第６項に記載
の方法。 - 【請求項９】ホルモンがブタ成長ホルモンまたはそのア
ナログであることを特徴とする特許請求の範囲第２項に
記載の方法。 - 【請求項１０】アナログが天然のブタ成長ホルモンのフ
ェニルアラニン形のＮ−末端に付加されたメチオニン残
基を含み、細菌細胞が大腸菌（Escherichia coli）菌株
ATCC No.39804であることを特徴とする特許請求の範囲
第９項に記載の方法。 - 【請求項１１】ホルモンまたはアナログがニワトリ成長
ホルモンまたはそのアナログであることを特徴とする特
許請求の範囲第２項に記載の方法。 - 【請求項１２】アナログが天然のニワトリ成長ホルモン
のフェニルアラニン形のＮ−末端に付加されたメチオニ
ン残基を含み、細菌細胞が大腸菌（Escherichia coli）
菌株ATCC No.39792であることを特徴とする特許請求の
範囲第１１項に記載の方法。 - 【請求項１３】ステップ(a)の前に細菌細胞またはその
フラグメントを発酵マッシュ中に懸濁維持するかまたは
中性pHの適切な緩衝溶液中に懸濁することを特徴とする
特許請求の範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項１４】中性pHが約７．４であることを特徴とす
る特許請求の範囲第１３項に記載の方法。 - 【請求項１５】ステップ(a)において細胞を機械的に破
砕することを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の
方法。 - 【請求項１６】粒状物を分離する前に溶解物を適切な量
の脱イオン水で希釈することを特徴とする特許請求の範
囲第１項に記載の方法。 - 【請求項１７】ステップ(b)またはステップ(e)における
分離が遠心からなることを特徴とする特許請求の範囲第
１項に記載の方法。 - 【請求項１８】ステップ(b)またはステップ(e)における
分離が限外濾過からなることを特徴とする特許請求の範
囲第１項に記載の方法。 - 【請求項１９】ステップ(d)における液体と固体間の接
触を生起させる処理が音波処理からなることを特徴とす
る特許請求の範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項２０】さらに、ステップ(d)の懸濁液の固液接
触処理の前に、適当な界面活性剤を適切な量で懸濁液に
加え、さらに適切な時間懸濁液をインキュベートするス
テップをも含むことを特徴とする特許請求の範囲第１項
に記載の方法。 - 【請求項２１】ステップ(e)において固液接触した懸濁
液から部分的または完全に分離した沈殿物を適切な量の
適当な媒体に再懸濁し、こうして調製した懸濁液を適切
な条件で固液接触させ、得られた沈殿物をステップ(f)
で可溶化する前に固液接触した懸濁液から分離すること
を特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項２２】適当な媒体が緩衝されたかまたはされて
いない水溶液であることを特徴とする特許請求の範囲第
２１項に記載の方法。 - 【請求項２３】さらに少なくとも１回得られた沈殿を再
懸濁し、固液接触させ、分離することを特徴とする特許
請求の範囲第２１項に記載の方法。 - 【請求項２４】約9.0〜12.0のpHで沈殿を可溶化した後
にpHを約10.5まで下げることを特徴とする特許請求の範
囲第１項に記載の方法。 - 【請求項２５】ステップ(f)で得られた溶液に適切に濃
縮されたホウ酸ナトリウム水溶液を適当な量加えること
を特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項２６】さらに、ステップ(f)で得られた溶液を
適当な条件で固液接触させ、固液接触した溶液を適切な
条件で遠心し、上澄液を分離し、この液を濾過すること
によって溶液を静澄にしてホルモンまたはアナログを含
有する透明溶液を生成することを含むことを特徴とする
特許請求の範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項２７】ステップ(g)で得られた保留物をステッ
プ(h)の処理前またはその後少なくとも１回の限外濾過
に再度付すことを特徴とする特許請求の範囲第１項に記
載の方法。 - 【請求項２８】限外濾過に再度付す前に適当なアルカリ
性pHの適切な緩衝液で保留物を希釈することを特徴とす
る特許請求の範囲第２７項に記載の方法。 - 【請求項２９】適当なアルカリ性pHが約9.0〜12.0であ
ることを特徴とする特許請求の範囲第２８項に記載の方
法。 - 【請求項３０】希釈と限外濾過を少なくとも１回繰り返
すことを特徴とする特許請求の範囲第２８項に記載の方
法。 - 【請求項３１】保留物を限外濾過の間実質的に一定の容
量に維持することを特徴とする特許請求の範囲第２７項
に記載の方法。 - 【請求項３２】実質的に一定の保留物容量での限外濾過
を少なくとも１回繰り返すことを特徴とする特許請求の
範囲第３１項に記載の方法。 - 【請求項３３】ステップ(h)における可溶化ホルモンの
処理がイオン交換クロマトグラフィーからなることを特
徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項３４】イオン交換クロマトグラフィーを、アミ
ン含有イオン交換樹脂を用いて実施することを特徴とす
る特許請求の範囲第３３項に記載の方法。 - 【請求項３５】アミン含有イオン交換樹脂がジエチルア
ミノエチル−デキストランまたはセファロースであるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第３４項に記載の方法。 - 【請求項３６】精製されたホルモンまたはアナログを限
外濾過によって濃縮することを特徴とする特許請求の範
囲第１項に記載の方法。 - 【請求項３７】精製されたホルモンまたはアナログを透
析とそれに続く乾燥によってさらに精製することを特徴
とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項３８】透析が適当な塩を適切な濃度で含有する
溶液に対するものであることを特徴とする特許請求の範
囲第３７項に記載の方法。 - 【請求項３９】適当な塩が水酸化アンモニウムまたは重
炭酸アンモニウムであることを特徴とする特許請求の範
囲第３８項に記載の方法。 - 【請求項４０】乾燥を凍結乾燥によって行なうことを特
徴とする特許請求の範囲第３７項に記載の方法。 - 【請求項４１】乾燥を適当な条件でのスプレー乾燥によ
って行なうことを特徴とする特許請求の範囲第３７項に
記載の方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US64443584A | 1984-08-27 | 1984-08-27 | |
| US73445085A | 1985-05-15 | 1985-05-15 | |
| US644435 | 1996-05-13 | ||
| US734450 | 2003-12-12 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6193128A JPS6193128A (ja) | 1986-05-12 |
| JPH0655154B2 true JPH0655154B2 (ja) | 1994-07-27 |
Family
ID=27094481
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60184984A Expired - Fee Related JPH0655154B2 (ja) | 1984-08-27 | 1985-08-22 | 遺伝子工学で処理した微生物から精製成長ホルモンを回収する方法 |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0173215B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0655154B2 (ja) |
| KR (1) | KR930009336B1 (ja) |
| AT (1) | ATE90389T1 (ja) |
| AU (1) | AU589569B2 (ja) |
| CA (1) | CA1267615A (ja) |
| DE (1) | DE3587391T2 (ja) |
| DK (1) | DK174889B1 (ja) |
| ES (1) | ES8606496A1 (ja) |
| GR (1) | GR852031B (ja) |
| HK (1) | HK147695A (ja) |
| HU (1) | HU201806B (ja) |
| IE (1) | IE58860B1 (ja) |
| IL (1) | IL76191A (ja) |
| NZ (1) | NZ213153A (ja) |
| PT (1) | PT81012B (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| US4342832A (en) * | 1979-07-05 | 1982-08-03 | Genentech, Inc. | Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes |
| CA1272144A (en) * | 1984-06-29 | 1990-07-31 | Tamio Mizukami | Fish growth hormone polypeptide |
| US4748234A (en) * | 1985-06-26 | 1988-05-31 | Cetus Corporation | Process for recovering refractile bodies containing heterologous proteins from microbial hosts |
| US5064943A (en) * | 1988-12-16 | 1991-11-12 | American Cyanamid Company | Method for solubilization and naturation of somatotropin |
| US4975529A (en) * | 1989-08-18 | 1990-12-04 | Monsanto Company | Method of folding somatotropins |
| DE69013475T2 (de) * | 1989-12-05 | 1995-05-04 | American Cyanamid Co | Methode zur Auflösung und Naturation von Somatotropin unter Verwendung von einer niedrigen Harnstoffkonzentration. |
| KR940005594B1 (ko) * | 1991-12-24 | 1994-06-21 | 주식회사 럭키 | 양 성장 호르몬의 정제방법 |
| KR100229420B1 (ko) * | 1992-05-09 | 1999-11-01 | 성재갑 | 대장균에서 발현된 닭 성장 호르몬의 정제 방법 |
| US5437986A (en) * | 1994-06-22 | 1995-08-01 | Schering Corporation | Extraction of heterologous insoluble proteins from bacteria |
| KR970061918A (ko) * | 1996-02-22 | 1997-09-12 | 성재갑 | 대장균에서 발현된 유전자 재조합 닭 성장 호르몬의 정제방법 |
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