KR950004013B1 - 대장균에서 발현된 소 성장 호르몬의 정제 방법 - Google Patents

Abstract

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Description

대장균에서 발현된 소 성장 호르몬의 정제 방법

제1도는 소 성장 호르몬의 아미노산 서열을 나타낸 것이고,

제2도는 소 성장 호르몬이 발현된 대장균 추출액을 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴 아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)한 결과를 나타낸 것이며,

제3도는 소 성장 호르몬 굴절체를 분리, 정제하는 동안 얻어진 중간 생성물을 SDS-PAGE하여 나타낸것 이고,

제4도는 정제된 소 성장 호르몬을 SDS-PAGE하여 나타낸 것이며,

제5도는 정제된 소 성장 호르몬을 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 분석한 결과이다.

본 발명은 유전공학적인 방법으로 유전자 재조합된 대장균(E. coli)에서 발현된 소 성장 호르몬을 정제하는 방법에 관한 것이다.

소 성장 호르몬은 뇌하수체 전엽에서 분비되는 폴리 펩티드 호르몬의 일종으로서 190 또는 191개의 아미노산으로 구성되며 제1도에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다. 소 성장 호르몬은 분자량이 약 22키로달톤(kD) 정도되며, 소마토트로핀(somatotropin)이라고 불리어지기도 하는데 소의 성장을 촉진할 뿐만 아니라 젖소, 양, 염소등의 우유 생산량을 증가시키는 효과가 있음이 잘 알려져 있다(Ian C. Hartet al., Biochemical J.224, 93-100(1984) ; S. S. Adel-Meguid, J. Mol. Bio.192,159-160(1986)).

유전자 재조합 기술의 개발 및 이용은 극미량밖에 얻을 수 없는 천연 단백질을 대량으로 생산할 수 있게 함으로써, 동물 성장 호르몬등을 의약품으로서가 아닌 식품 또는 사료첨가제로서도 이용 가능한 정도의 경제적인 가격으로 얻을 수 있게 해주었으며(Seeburget al., DNA 2(1), 37-45(1983)), 이와 아울러 재조합 기술에 의해 생산된 단백질을 고순도로 대량 정제하기 위한 기술이 꾸준히 개발되어 왔다.

특히, 대장균에서 발현된 소 성장 호르몬은 불용성의 굴절체(inclusion body)를 형성하므로 다른 불순 수용성 단백질과의 분리가 용이하며 적당한 세척액등에 대해서 안정하여 정제 공정을 간단히 할 수 있고 대장균에서 유래되는 엔도톡신(endotoxin)등의 제거를 용이하게 할 수 있는 장점이 있기 때문에 대장균을 발현숙주로 사용하는 방법이 소 성장 호르몬을 대량 생산 및 정제하는데 자주 사용되어 왔다.

그런데, 이런 류의 단백질 굴절체를 정제하기 위해서는 적당한 방법에 의하여 단백질 굴절체를 용해시켜야 하며, 그러한 용해방법으로는 요소(Urea), 구아니딘 염(guanidine·HCl) 또는 소디움 도데실 설페이트(SDS)등의 용해제를 사용하는 방법이나 수산화나트륨(NaOH)등의 알칼리를 이용하여 pH를 조절하는 방법등이 알려져 왔다.

용해제로서 요소나 구아니딘 염을 사용하는 방법은 지금까지 가장 널리 알려진 방법이기는 하지만 정제비용이 과다하게 소요되어 실용적이지 못하고, SDS를 사용하는 경우는 정제비용은 비교적 저럼한 편이나 정제후 SDS의 완전한 제거가 곤란하여 활성을 갖는 순수한 단백질만을 분리하는데 많은 제약을 받게 되므로 정제공정이 복잡해지는 단점이 있다. 더우기 이들 용해제 사용에 의한 방법은 사용된 용해제가 단백질등을 변성시키기 때문에 구조적으로 활성이 없거나 활성을 저하시키므로 별도의 활성화 단계가 필요하다.

이에 비하여, 알칼리를 사용하는 방법은 전술한 용해제에 의한 방법에서와 같이 단백질 활성을 저하시키는 등의 문제점은 없으나 정제수율이 매우 저조하다는 또 다른 문제점을 안고 있다.

예컨데, 수산화나트륨(NaOH)등의 알칼리를 이용하여 굴절체를 용해시키는 방법으로서 유립특허공개 제0,365,858호에는 λPL 프로모터를 이용하여 대장균에서 발현된 소 성장 호르몬의 정제방법을 개시하고 있는데, 이 방법의 최종 정제수율은 25% 정도에 불과하며, 특히 한외여과 단계와 이온교환 크로마토그래피단계에서 수율이 매우 낮았다.

본 발명자들은 상기 선행기술들의 문제점을 해결하여 정제수율을 높이고자 연구를 거듭한 결과, 알칼리를 사용하여 굴절체를 용해시키는 방법의 경우 세척과정에서 형성된 굴절체의 불용성 응집체(aggregate)는 알칼리에 난용이며 따라서 용해단계에서 단백질 굴절체가 충분히 활성화되지 못할 것이라고 예상하여 전술한 유립특허공개 제0,365,858호에 개시된 방법의 조건에서 비환원(Non-reducing) 전기영동 실험을 수행한결과 약 30% 만이 산화형 단량체로 전환될 뿐만 아니라 이 단계에서 형성된 이중체(dimer), 삼중체(trimer)등의 다중체는 정제가 완료된 후에도 약 10%정도가 그대로 존재하므로 이들의 제거를 위하여 또다른 과정을 거쳐야 한다는 사실을 확인했으며, 또한 이러한 현상은 트립토판 프로모터를 이용하여 발현시킨 단백질 굴절체인 경우 더욱 심해진다는 사실을 알게 되었다.

이에 본 발명자들은 굴절체를 분쇄 및 회수하고 세척하는 과정 및 용해조건, 즉 pH, 온도, 시간, 농도등을 최적화하고 용해과정에 동반되는 산화조건을 적절히 조절함으로써 산화형 단량체로의 전환율이 95%이상이고 최종 정제수율이 40% 이상에 이르는 본 발명의 정제방법을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 대장균에서 발현된 소 성장 호르몬을 효율적으로 정제하는 방법을 제공하는 것으로서, 소 성장 호르몬이 발현된 대장균을 비이온성 계면활성제가 함유된 세포분쇄용 완충용액 중에서 호모지나이저(homogenizer)로 분쇄하여 불용성 굴절체를 분리한 후 비이온성 계면활성제 및 에틸렌디아민 테트라 아세트산(EDTA)이 함유된 완충용액으로 세척하고 다시 염화나트륨 또는 증류수로 재차 세척하여 각종 불순물들을 게거하고, 이어서 분리된 불용성 굴절체를 알칼리 pH에서 용해시킨 다음 용해된 상등액을 한외여과하여 소 성장 호로몬 부분을 회수한 후 이를 글리신이 함유된 완충용액으로 평형화시킨 음이온 교환수지로 흡착시키고 용출용액으로 용출시킴을 특징으로 하는 일련의 정제공정을 거침으로써 본 발명의 목적을 달성할 수 있다.

전술한 바 있듯이 대장균에서 발현된 소 성장 호르몬의 정제에 있어서는, 발현된 소 성장 호르몬이 환원형 단량체로 응집되어 이루어지는 굴절체가 어느 정도의 순도를 갓느냐 하는 것이 분자내 디설파이드 결합(S-S) 정도를 좌우하고 이것은 즉, 용해수율을 결정하는 중요한 요소중의 하나로 작용한다.

따라서, 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 첫째, 순수한 굴절체를 분리해 내기 위한 분쇄 및 세척방법의 개선이며, 둘째, 분자내 디설파이드 결합도를 극대화할 수 있는 용해 환경을 제공하는 것이며, 아울러 최종 정제과정을 최적화하는 것이다.

상기 본 발명의 방법은 대장균에서 발현된 대부분의 동물 성장 호르몬류의 정제에 효과적으로 적용될 수있으며, 특히 대장균에서 트립토판 프로모터를 이용하여 발현시킨 소 성장 호르몬을 정제하는 방법으로서 매우 바람직하게 이용될 수 있다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

먼저, 배양된 대장균을 수확하여 비이온성 계면활성제를 첨가한 완충용액(pH 7.4)에 현탁시킨 후에 연속세포분쇄기인 호모지나이저(homogenizer)를 사용하여 대장균의 세포막을 분쇄하는데, 이 분쇄방법은 종래세포분쇄용 완충용액에 라이소자임(lysozyme)을 첨가하여 통상의 세포분쇄기를 사용하여 분쇄한 것에 비하여 분쇄효율을 최소한 30% 이상 향상시킬 수 있다. 이때 계면활성제로는 트리톤 엑스-100(triton X-100)또는 트윈 80(tween 80)과 같은 비이온성 계면활성제를 사용하는데 0.05∼1%의 농도로 사용하는 것이 특히 바람직하다.

분쇄가 끝나면 소 성장 호르몬 굴절체가 함유된 침전층을 회수하고 이를 계면활성제와 EDTA의 혼합액이 함유된 완충용액(pH 7.4)으로 1차 세척하고 이를 다시 염화나트륨(NaCl)용액이 함유된 완충용액(pH7.4) 또는 증류수로 재차 세척함으로써 잔류 세포막과 비단백 불순물, 불순 단백질 등을 제거한다. 이 단계에서 사용되는 계면활성제도 전술한 바와 동일한 것으로서 2% 이하의 농도로 사용하는 것이 적당하고 염화나트륨은 100∼500mM의 것을 사용한다.

세척이 끝난 소 성장 호르몬 굴절체를 증류수에 현탁시키고 교반하면서 수산화나트륨 수용액을 서서히 가하여 pH를 11.0 내지 13.0, 특히 바람직하게는 11.8 내지 12.3의 범위로 조절하여 우유빛 현탁액이 황갈색으로 변하기 시작하면 굴절체가 환원형에서 산화형으로 활성화되는 것이며, 이 pH 범위를 그대로 유지하면서 약 1.5 내지 3시간정도 교반하면 활성화가 완료된다.

활성화가 완료되면, 원심분리하여 불용성 불순물을 제거하고 상등액을 회수하여 한외여과막으로 여과한후 여액을 모아 농축하고 pH를 다시 8.0 내지 10.5, 바람직하게는 8.5 내지 9.5의 범위로 조절한 다음 음이온 교환 수지에 흡착시키고 100∼200mM 염화나트륨이 함유된 완충용액으로 용출시키면 순도 95% 이상, 엔도톡신 10유니트(EU)/mg 이하인 고순도의 소 성장 호르몬이 얻어진다. 이때 한외여과막은 분자량 10만 또는 30만 이하의 분자량을 통과시키는 것이 사용되며, 음이온 교환 수지는 디에틸아미노에틸(DEAE) 또는 디에틸(2-히드록시-프로필)아미노에틸(QAE)을 기능기로 하는 것을 사용하는데 완충용액으로 가장 바람직한 것은 글리신 완충용액이다.

이와 같은 본 발명이 적용될 수 있는 소 성장 호르몬을 발현시키는 대장균은 어떤 것이어도 좋으며, 특히 종래 기술에서 정제하기 어려웠던, 트립토판 프로모터를 이용하여 소 성장 호로몬을 발현시키는 대장균에서도 매우 바람직한 결과를 얻을 수 있다. 본 발명의 하기 실험에서는 본 출원인((주)럭키)에 의해 재단법인 한국종균협회에 1990년 5월 25일 기탁번호 KFCC-10693으로 기탁된 바 있는 대장균 LUCK-BST-1E를 사용하였다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

(실시예 1:)

대장균에서 소 성장 흐로몬 굴절체의 회수

300발효조에서 배양한 대장균(KFCC-10693)을 연속 원심분리기(BTPX2150, 알파-라발사)로 수확한 후에 이를 완충용액(50mM 트리스, 50mM EDTA, 0.1% 트리톤 엑스-100, pH 7.4) 200에 현탁시킨 후에 호모지나이저(homogenizer, 알파-라발사)를 이용하여 600기압으로 200시간의 유속으로 2회 통과 시키어 대장균의 세포막을 분쇄하고 연속 원심 분리기로 소 성장 호르몬 굴절체가 포함되어 있는 침전층을 회수하였다.

이 침전물을 1% 트리톤 엑스-100, 50mM EDTA, 20mM 트리스가 함유된 완충용액(pH 7.4) 30에 현탁시키고 폴리트론(polytron)으로 약 30분간 격렬하게 교반한 다음, 증류수로 100가 되도록 희석한 후 연속 원심분리기로 침전층을 회수하였다. 이를 10mM 염화나트륨, 50mM 트리스가 함유된 완충용액(pH7.4) 50로 세척한 후 연속 원심 분리기로 침전물을 회수하였다. 그런 다음, 이 침전물을 50의 증류수로 세척하고 연속 원심 분리기로 침전물을 회수하였다.

(실시예 2:)

실시예 1의 개선된 방법

상기 실시예 1에서의 세포 분쇄를 효율적으로 수행하기 위하여 세포 분쇄기의 사용횟수를 1회,2회,3회 등으로 나누어 비교한 결과 3회 이상의 경우에 99% 이상의 분쇄가 이루어지며, 특히 1회 얼렸던 경우에는 분쇄 효과보다는 분산효과가 컸었다. 따라서 세포의 분산 효과를 높일 수 있도록 위의 완충용액에 0.1-0.5%의 트리톤 엑스-100을 첨가한 결과, 1∼2회의 경우에 99% 이상의 분쇄 효과를 가져왔으며, 분쇄후의 세척효과도 컸다.

한편 실시예 1에서의 1% 트리톤 엑스-100, 50mM EDTA, 20mM 트리스가 함유된 완충용액으로 세척한 후에 염화나트륨 용액으로 희석하여 최종 염화나트륨 용액의 농도가 100mM이 되게 100로 희석하고 원심 분리하여 침전층을 증류수로 세척하고 용해시켜 분쇄를 실시하였다. 이 경우에 소 성장 호르몬의 응집체의 순도는 실시예 1보다 약간 높으나 용해 후의 잔류물의 양이 적고 색소의 함량이 크게 줄어들었다.

(실시예 3:)

소 성장 호르몬 굴절체의 용해

상기 실시예 1과 2의 방법으로 얻어진 소 성장 호르몬 굴절체를 약 2 내지 5g/농도가 되도록 증류수에 현탁시키고 5N 수산화나트륨 용액을 소량씩 가하며 교반해 주었다. pH가 약 11.8 내지 12정도되었을때 우유빛의 현탁액이 황갈색으로 변하기 시작하면서 용해가 시작되고 2시간이 지나면 용해가 완료되며 산화형으로 전환이 일어났다. 이는 역가를 갖는 형태로 되기 위한 활성화가 진행됨을 나타낸다. 용해된 용액을 원심 분리기로 원심분리하여 불용성 불순물을 제거하였다.

(실시예 4:)

한외여과 및 이온 교환 수지에 의한 소 성장 호르몬의 정제

상기 실시예 3에서 얻어진 용해된 상등액을 한외여과하여 분자량 30만(또는 10만) 이하의 여액을 회수하고 잔류액을 처음 부피의 증류수로 반복하여 희석하면서 여과하여 90% 이상의 수율이 되도록하며 여과된 여액은 분자량 1만 이상의 부분을 농축하면서 이온 교환 수지에 흡착시키기 위하여 전도도(conductivity)가 1000μ 이하가 되도록한 후에 pH를 9.0으로 조절하고 10mM 글리신 완충용액으로 평형시킨 DEAE-세파로즈(sepharose)컬럼(8)에 약 20/시간의 유속으로 흡착시키고 10mM 글리신 완충용액과 100mM의 염화나트륨이 함유된 용출 용액으로 용출시켜 순도 95% 이상의 소 성장 호르몬이 용출됨을 확인하였다. 이를 농축하여 약 50g의 소 성장 호르몬을 얻었다.

(실시예 5:)

음이온 교환 수지의 선택을 위한 실험

일반적으로 널리 사용되고 있는 음이온 수지중에서 DEAE 계열과 QAE 계열을 기능기로 하는 음이온 수지에 대해 pH, 용출경향, 용출된 소 성장 호르몬의 순도, 수율등에 관한 실험을 수행하였다. 실험에 사용된 pH중에서 8.5∼10.5에서는 그다지 큰 차이를 보이지 않았으나 Q-세파로즈의 경우에 100mM의 염화나트륨 농도에서는 일부만 용출되고 200mM의 염화나트륨 농도에서 완전히 용출되었다. 한편 DEAE-세파로즈의 경우에 유속, 흡착 능력, 재 사용의 편이성등에서 뛰어난 결과를 얻었으며 이 경우에 100mM 이상의 염화나트륨의 농도에서는 불순 단백질과 색소등이 용출되었다.

상기 실시예에 따라 소 성장 호로몬을 정제하는 동안 얻어진 중간 생성물들을 SDS-PAGE한 결과를 제2도 내지 제4도에 나타내었다.

제2도는 대장균 전체 추출물을 SDS-PAGE한 것으로 제1열은 소 성장 호르몬이 발현된 대장균의 총단백질이고, 제2연은 소 성장 호르몬이 발현되지 않은 대장균의 총 단백질이며, 제3열은 표준 분자량 표식 단백질이다. 제2도에서 소 성장 호르몬은 약 22키로달톤 정도에서 뚜렷한 밴드를 보였다.

제 3도는 분리 및 정제 과정 동안의 SDS-PAGE 결과로서, 제1열은 소 성장 호르몬이 발현된 대장균의 총 단백질이고, 제2열은 세포 분쇄후에 원심분리하여 얻은 상등액이며, 제3열은 세포 분쇄후에 원심분리하여 얻은 침전층이고, 제4열은 세척이 끝난 소 성장 호르몬의 굴절체이며, 제5열은 pH를 알카리로 하여 용해시킨 상등액이고, 제6열은 pH를 알카리로 하여 용해시킨 침전층이며, 제7열은 한외여과된 여액을 농축한 용액이다.

제4도는 본 발명에 따라 정제된 소 성장 호르몬의 SDS-PAGE 결과로서, 제1연은 환원제가 첨가 되지 않은 상태의 소 성장 호르몬이고, 제2열은 표준 분자량 표식 단백질이며, 제4열은 환원제로서 2-머켑토에탄올 존재하에서의 소 성장 호르몬이다. 제4도에 의해 본 발명에 따라 정제한 소 성장 호르몬은 95% 이상의 활성 산화형 형태로 정제되었음을 알 수 있다.

제5도는 본 발명에 따라 정제된 소 성장 호르몬을 고성능 액체 크로마토그래피한 결과로 순도가 98.73%의 매우 높은 수치를 나타내었다.

Claims (5)

1. 유전자 재조합된 대장균에서 발현된 소 성장 호르몬을 정제하는 방법에 있어서, (가) 소 성장 호르몬이 발현된 대장균을 계면활성제가 함유된 완충용액중에서 호모지나이저로 분쇄하여 불용성의 소 성장 호르몬 굴절체를 분리하고 ; (나) 분리된 불용성 굴절체를 계면활성제 및 에틸렌디아민테트라 아세트산이 함유된 용액으로 세척한 다음 다시 100 내지 500mM 염화나트륨 또는 증류수로 세척하고 ; (다) 불용성 굴절체를 수산화나트륨을 사용하여 pH 11.5 내지 13.0에서 용해시킨 후 ; (라) 원심분리 및 한외여과법에 의해 용해되지 않은 침전물을 제거하고 ; (마) 음이온 교환 수지 컬럼 크로마토그래피로 분리하는 단계를 포함하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 소 성장 호르몬이 발현된 대장균은 트립토판 프로모터를 이용하여 소 성장 호르몬을 발현시키는 대장균인 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 (가)단계 또는 (나)단계의 계면활성제가 0.05 내지 1% 농도의 트리톤 엑스-100(Triton X-100) 또는 트윈 80(Tween 80)인 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 (라)단계의 한외여과는 분자량 10만 이하 또는 30만 이하의 물질만을 통과시키는 한외여과막을 사용하는 것인 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 (마)단계의 음이온 교환 수지가 디에틸아미노에틸 또는 디에틸-(2-하이드록시-프로필)아미노에틸을 기능기로 하며 글리신 완충용액으로 평형화시킨 것임이 특징인 제1항의 방법.