KR960013572B1 - 인간 성장 호르몬의 정제방법 - Google Patents

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내용 없음.

Description

인간 성장 호르몬의 정제방법

제1도는 인간 성장 호르몬 침전물을 1차 DEAE-세파로즈 크로마토그래피한 결과를 나타낸 크로마토그램이고,

제2도는 1차 DEAE-세파로즈 크로마토그래피한 인간성장호르몬을 세파크릴 S-200 크로마토그래피한 결과를 나타낸 크로마토그램이고,

제3도는 세파크릴 S-200 크로마토그래피한 인간 성장 호르몬을 2차 DEAE-세파로즈 크로마토그래피한 결과를 나타낸 크로마토그램이고,

제4도는 본 발명의 정제 방법에 따라 얻어진 중간 생성물 및 최종 생성물을 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴 아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)한 결과를 나타낸 것이고,

제5도는 에탄올 침전물을 요소를 포함한 완충용액과 요소를 포함하지 않은 완충용액을 사용하여 용해시킨 후 1차 DEAE-세파로즈 크로마토그래피한 결과를 SDS-PAGE하여 나타낸 것이다.

본 발명은 유전공학적인 방법에 의해 제조된 인간 성장 호르몬의 정제 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 유전자 재조합 미생물(이하 재조합 미생물이라 함)에서 발현되어 세포 밖으로 분비된 인간 성장 호르몬을 고순도로 분리 정제하는 방법에 관한 것이다.

인간 성장 호르몬(human growth hormone, HGH)은 사람의 뇌하수체에서 생성되는 191개의 아미노산으로 구성된 분자량 약21,500 팹타이드 호르몬으로 주로 왜소증 치료에 이용되어 왔다(Raben, M. S., J. Clin. Endocr. 18, 901(1958).

종래에는 죽은 사람의 뇌하수체에서 인간 성장 호르몬을 추출 및 정제하여 사용하여 왔으나 그 양이 크게 제한되어 모든 환자에게 공급되지 못하였다. 또한 죽은 사람의 뇌하수체에서 추출 정제한 인간 성장 호르몬에 바이러스가 감염되어 4명의 어린이가 사망하자 미국 식품 의약국에서는 죽은 사람의 뇌하수체에서 추출한 인간 성장 호르몬의 사용을 금지하였다.(Science 234, (1986)).

따라서 최근에는 유전 공학 기술을 이용하여 대장균 및 효모에서 인간 성장 호르몬을 발현 및 분리 정체하여 임상에 이용하고 있다(대장균에서 인간 성장 호르몬의 발현 ; 대한민국 특허 공고 제87-701호 및 제89-1244호와 공개특허 공보 제87-2258호 및 84-8695호 및 효모에서 인간 성장 호르몬의 발현 ; 대한민국 특허공고 제92-99호와 공개특허 공보 제90-9973호 및 90-9976호 참조).

그러나 상기 방법으로 인간 성장 호르몬을 생산할 경우, 천연 인간 성장 호르몬을 구성하는 191개의 아미노산 이외의 인간 성장 호르몬 N-말단에 아미노산 합성 시작코돈(codon)인 메티오닌이 하나 더 첨가된 192개의 아미노산기로 이루어진 메티오닌-인간 성장 호르몬(met-HGH)으로 생산된다.

메티오닌 인간 성장 호르몬은 생물학적 역가면에서 천연형 인간 성장 호르몬과 동일한 성질을 나타내었으며(Moore, J. A., Endocrinology 122, 2920-2926(1988)), 또한 메티오닌이 첨가되므로써 일어나는 부작용 등은 보고된 바 없다. 그러나 첨가된 메티오닌으로 인하여 간혹 항체가 생성될 수 있으며 체내에서의 항체 생설율이 천연형보다 약간 높다는 보고가 있다(Lancet, March 29, 697(1986)).

따라서 재조합 인간 성장 호르몬의 제조시 N-말단의 메티오닌이 없는 천연형 인간 성장 호르몬을 제조하고자 하는 많은 시도가 있었다.

인간 성장 호르몬 N-말단에 존재하는 메티오닌을 제거하는 방법으로 특수한 아미노펩티다제를 이용하여 메티오닌만을 선택적으로 제거하는 방법(PCT 공개번호 WO 86/04609, WO 86/204527 Al, WO 86/01229), 인간 성장 호르몬의 N-말단과 다른 단백질의 C-말단을 융합시켜 발현시킨 후 특수한 프로테아제를 이용하여 절단하는 방법 (PCT 공개번호 WO 89/12678 유럽특허 20290, 유럽 특허 321940)등이 있으나, 이들의 방법은 반응 후 효소와 인간 성장 호르몬을 별도로 분리하는 정제과정이 필요하다는 단점이 있다.

이와 같은 문제점을 해결한 것이 인간 성장 호르몬을 세포밖으로 분비하는 방법이다.(EP 0088632 A2, US 4755465, JP 01273591, EP 306, 673).

이러한 시도의 하나로 본 출원인도 효모의 분비 체계를 이용하여 천연형 인간 성장 호르몬을 배지로 분비 할 수 있는 효모용 인간 성장 호르몬 발현벡터(pYLBC-A/G-α F-HGH)를 개발하여 특허출원하였고, 상기 발현 벡터에 의해 형질 전환된 효모(Saccharomyces cerevisiae)를 한국 유전자 은행에 1992년 6월 3일자로 기탁번호 KCTC 0048BP 로 기탁하였다(대한민국 특허출원 제92-10932호 참조).

본 발명자들은 상기 벡터를 함유하는 효모 균주로부터 인간 성장 호르몬을 정제하기 위하여 우선 발효 배지로부터 인간 성장 호르몬을 조정제한 후 본 출원인에 의해 출원된 대한민국 특허 공고 제92-99호에 기재된 정제 방법을 응용하고자 조정제액으로 음이온 교환 크로마토그래피를 실시하였다.

일반적으로 인간 성장 호르몬은 컬럼에 흡착되어 후속의 염화나트륨 용출에 의해 보다 정제된 상태로 얻어질 수 있으나, 음이온 교환 크로마토그래피를실시한 결과 인간 성장 호르몬이 컬럼에 흡착되지 않아서 더 이상의 정제과정을 진행할 수 없었다. 이 현상은 조정제시 완전히 제거되지 않은 색소가 일종의 차단 효과를 보여 인간 성장 호르몬의 컬럼 흡착을 방해하여 일어나는 것으로 예상되었다.

이에 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하고자 예의 연구한 결과, 조정제 과정중 에탄올 침전물을 용해하는 완충용액에 요소를 포함시킴으로써 인간 성장 호르몬의 음이온 교환 컬럼에 흡착될 수 있으며, 또한 이과정의 처리로 마지막 정제 단계를 생략할 수 있음을 발견하게 되었다.

본 발명의 목적은 효모에서 발현되어 발효 배지로 분비된 인간 성장 호르몬을 높은 생리활성을 가지며 임상에 적용 가능하도록 고순도로 대량 정제하는 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 재조합 효모로부터 분비된 인간 성장 호르몬을 분리 정제하는 방법에 있어서, (가)발효배지를 원심 분리하여 효모세포를 제거하고 상등액을 한외여과막을 이용하여 농축한 후 다이아필트레이션 (diafiltration)하고, (나)인간 성장 호르몬을 에탄올 침전시키고, (다) 침전물을 요소가 함유된 완충용액으로 용해시킨 후, (라)1차 음이온 교환 크로마토그래피하고, (마)겔 여과 크로마토그래피한 후, (바) 음이온 교환 크로마토그래피함을 포함하는 인간 성장 호르몬의 정제 방법을 제공한다.

인간 성장 호르몬이 발현되어 세포 밖으로 분비된 발효배지를 원심분리하여 효모 세포를 제거한 후 상등액을 분자량 10,000정도의 절단점(molecular weight cut off)을 가진 한외여과막으로 농축한 후 완충용액으로 충분히 다이아필트레이션하여 발효배지에 존재하는 색소와 염을 제거한다.

이렇게 하여 얻어진 상등액에 초산을 넣어 pH 4.0 내지 6.0으로 조정하고, 염화나트륨을 100 내지 1000mM의 농도가 되도록 첨가한 후 에탄올을 최종 농도 50%가 되도록 첨가하여 인간 성장 호르몬을 침전시키고 원심분리하여 회수한다.

이 침전물을 요소가 포함된 완충용액으로 녹인 후 음이온 교환 크로마토그래피를 실시한다. 이때 요소의 농도는 3M 내지 8M이 바람직하며, 컬럼은 DEAE-세파로스 컬럼 또는 DEAE-셀룰로즈를 이용할 수 있다.

상기에서 얻어진 인간 성장 호르몬 분획에 적당한 농도의 요소를 넣은 후 농축하여 겔 여과 크로마토그래피를 실시하는데, 이때 컬럼은 세파크릴 S-200 또는 S-300을 사용할 수 있다. 여기에서 용출된 다분획을 전기영동하여 인간 성장 호르몬의 순도가 90% 이상되는 분획을 수집한다.

이렇게 하여 90% 이상의 순도로 정제된 인간 성장 호르몬을 다시 음이온 교환 크로마토그래피하여 더욱 정제한다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 그러나 본 발명의 실시예는 예시하기 위한 것이지 본 발명이 실시예에 의해 한정되지 않는다.

본 발명에서 이용된 인간 성장 호르몬 발현벡터를 함유하는 미생물 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)는 앞에서 언급한 바 있는 본 출원인에 의해 기탁된 KCTC 0048BP이다.

실시예

인간 성장 호르몬 발현 벡터를 함유하는 효모를 발효기에서 20 내지 40시간 배양하여 인간 성장 호르몬을 발현시켜 세포밖으로 분비시켰다. 이의 발효배지 30리터를 연속 원심분리기(α-Laval사 제품)으로 원심분리하여 효모세포를 제거한 후 상등액을 한외여과막(Amicon)으로 1리터까지 농축한 후 5리터의 완충용액(10mM Tris, lmM EDTA, pH 8.0)으로 다이아필트레이션하였다.

상기 1리터의 상등액에 10% 초산을 첨가하여 pH 5.0으로 조정하고 염화나트륨을 500mM의 농도가 되도록 첨가한 후 1리터의 차가운 에탄올을 넣고 잘 섞은 후 30분 동안 방치하였다. 상등액을 경사분리하고 원심분리기를 이용하여 10,000g에서 20분간 원심분리하여 침전물을 취하였다.

상기 침전물을 200ml의 완충용액(10mM Tris, 6M 요소, pH 8.0)으로 녹여 완충용액(10mM Tris, pH 8.0)으로 미리 평형화시킨 DEAE-세파로스 컬럼 (5×10㎝)에 흡착시킨 후 1리터의 완충용액(10mM Tris, 100mM NaCl, pH 8.0)으로 세척하고 완충용액(10mM Tris, 200mM NaCl, pH 8.0)으로 용출시켰다. 이때의 크로마토그램을 제 1 도에 나타내었다.

용출된 용액에 요소를 최종 농도 2M이 되도록 가한 후 100ml까지 농축시키고 완충용액(10mM Tris, 2M 요소, pH 7.5)으로 미리 평형화시킨 세파크릴 S-200 컬럼(10×100㎝)에 적용시켰다. 여기에서 용출된 다분획을 전기영동하여 인간 성장 호르몬의 순도가 90% 이상되는 분획을 수집하였다. 이때의 크로마토그램을 제 2 도에 나타내었다.

상기에 의해 90% 이상의 순도로 정제된 인간 성장 호르몬을 다시 완충용액(10mM Tris, pH 7.5)으로 미리 평형화시킨 DEAE-세파로스 컬럼 (5×10㎝)에 흡착시킨 후 600ml 완충용액(10mM Tris, pH 7.5)과 60ml 완충용액(10mM Tris, 500M NaCl, pH 7.5)을 이용하여 0 내지 500mM 염화나트륨 직선 농도 구배로 컬럼에 흡착된 인간 성장 호르몬을 용출시켜 인간 성장 호르몬 500㎎(역가 2.5IU/㎎)을 정제하였다. 이때의 크람토그램을 제 3 도에 나타내었다.

정제한 인간 성장 호르몬의 N- 말단을 확인한 결과 사람의 뇌하수체에서 정제한 인간 성장 호르몬가 동일하였다.

상기 실시예를 거치면서 인간 성장 호르몬이 정제되는 과정을 SDS-PAGE하여 그 결과를 제 4 도에 나타내었다. 제 4 도에서 1레인은 표준 분자량 단백질이고, 2레인은 에탄올침전물을 용해시킨 것이고, 3레인은 1차 DEAE-세파로스 크로마토그래피 된 것이고, 4레인은 S-200 크로마토그래피된 것이고, 5레인은 2차 DEAE-세파로스 크로마토그래피한 것을 나타낸다.

참조예

에탄올 침전물을 요소를 포함한 완충용액과 요소를 포함하지 않은 완충용액으로의 용해 비교

상시 실시예에서와 같이 에탄올 침전물을 얻은 후 1) 요소를 포함한 완충용액(10mM Tris, 6M 요소, pH 8.0) 50ml와 2) 요소를 포함하지 않은 완충용액(10mM Tris, pH 8.0)50ml)로 각각 용해시키고 DEAE-세파로스 컬럼 (2.5×10㎝)에 적용시킨 후, 100ml의 완충용액(10mM Tris, pH 8.0)으로 세척하고(10mM Tris, 1MNaCl, pH 8.0)으로 용출시켰다.

이 결과를 SDS-PAGE하여 제 5 도에 나타내었다. 제5 도에서 제1레인은 표준 분자량 단백질이고, 제2, 3, 4레인은 요소를 포함하지 않은 완충용액을 사용한 경우이고, 제 5, 6, 7레인은 요소를 포함한 완충용액을 사용한 경우이다. 제2, 5 레인은 에탄올 침전물을 용해시켜 컬럼에 적용하기 전의 시료이고, 제 3, 6레인은 DEAE-세파로스 컬럼에 적용시켰을 때 흡착되지 않은 것이고, 제 4, 7레인은 컬럼 흡착물을 1M 염화나트륨으로 용출시킨 것을 나타낸 것이다.

도면으로부터 알 수 있는 바와 같이 완충용액에 요소가 포함되지 않을때는 인간 성장 호르몬이 컬럼에 흡착되지 않고, 완충용액에 요소가 포함되어야만 인간 성장 호르몬이 컬럼에 흡착될 수 있음을 알 수 있다.

Claims (5)

1. 재조합 미생물로부터 세포 밖으로 분비된 인간 성장 호르몬을 분리 정제하는 방법에 있어서, 발효배지에서 조정제된 인간 성장 호르몬의 수용액을 에탄올 침전시키고, 침전물을 요소가 포함된 완충용액으로 용해시킨 후, 크로마토그래피를 수행함을 포함하는 인간 성장 호르몬의 정제 방법.
2. 제1항에 있어서, 크로마토그래피는 DEAE-세파로스(Sepharose)컬럼, 세파크릴(Sephacryl) S-200 또는 S-300 컬럼 및 DEAE-세파로스 컬럼 상에서 순차적으로 실시함을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 에탄올 침전시의 pH는 4.0 내지 6.0임을 특징으로 하는 방법.
4. 제3항에 있어서, 에탄올 침전시의 염화 나트륨의 농도가 100mM 내지100mM임을 특징으로 하는 방법.
5. 제1항에 있어서, 요소의 농도가 3M 내지 8M임을 특징으로 하는 방법.