JPH0195791A - 新規なポリペプチド、その製法、そのためのベクター及びそれを含有する医薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、インターフェロン−γ活性又はインターフェ
ロン−γ様活性を有する新規なポリペプチド、その製法
、そのためのベクター及びこのポリペプチドを含有する
医薬に関する。

インターフェロン−γ（以前は免疫インターフェロン又
は■型インターフェロント呼ハレタ）は、１９６５年に
Ｆ、　Ｗｈｅｅｌｏｃｋにより発見され（サイエンス１
４９．６１０．１９６５）インターフェロン−γは特定
の細胞をウィルス感染から保護じうることを示した。

最初に発表されたヒトインターフェロン−γのアミノ酸
配列は、１４６個のアミノ酸を有するにュークレイック
・アシッズ・リサーチ１ｏ、２４８７．１９８２）。し
かしのちの文献（ジャーナル・オプ・ザ・バイオロジカ
ル・ケミストリイ２５９．６７９０．１９８４）によれ
ば、「成熟」インターフェロン−γでは最初に発表され
た配列から初めの６個のアミノ酸が欠けている。従って
以下では、アミノ酸ＡＩ（グルタミン）からアミノ酸Ａ
１４３（グルタミン）までのアミノ酸配列が、成熟ヒト
インターフェロン−γと呼ばれる。この分子のアミノ酸
配列は、第１図に示される。

ヒトインターンエｏ　ンー７　（Ｗ、Ｂ、Ｓｔｅｗａｒ
ｔ著、ＩＩ、ｆ・インターフェロン争システム、スプリ
ンガー出版社、第２版、１９８１）は、本質的にはグリ
コジル化されているポリペプチドである（ネイチャー２
９５．５０６．１９８２　）。このグリコ蛋白は約６３
０００〜７３０　Ｄ　Ｏｄａ（ダルトン）の分子量を有
しくジャーナル・オプ・ザ・バイオロジカル・ケミスト
リイ２５８．９７０６．１９８３）、その機能的な形に
おいてはおそらく２量体として存在する。インターフェ
ロン−γのグリコジル化はその作用にとって必要でない
。すなわちインターフェロン−γをグリコシダーゼによ
り処理しても、ヒト繊維芽細胞−細胞培養においてその
抗ウィルス活性は低下しない（ジャーナル・オプ・ザ・
バイオロジカル・ケミストリイ２５８．８０１０．１９
８３）。

欧州行間１４６９４４号明細書によれば、インターフェ
ロン−γの誘導体の遺伝子工学的製法が知られており、
この方法では６位のリジンをグルタミンにより置き換え
、そして追加の他の修飾を行う。この修飾には１個又は
４個のアミノ酸のＮ−末端短縮も含まれ、これはＤＮＡ
をＢａ１３１で消化し、そして発現させることにより得
られた。インターフェロン−γのこの誘導体は、天然の
インターフェロン−γと同等又はより高い活性を有する
といわれている。

インターフェロン−γの生物学的活性に認めうるほどの
妨害を与えることなしに、天然配列の第１のアミノ酸及
び／又はアミノ酸１２４（アラニン）の後に続くアミノ
酸を省略することにより、インター７エロンーγの誘導
体を製造することも提案された（西独時開３４１４８３
１号明細書）。

本発明者らは、７．８．９．１０又は１１個のＣ−末端
アミノ酸を脱離する場合に、著しく高い生物学的活性を
有するポリペプチドが得られることを見出した。

従って本発明は、次式 ％式％ （式中ＸはＭｅｔ−Ｇｉｎ又はＧｉｎ　。

ＹはＳｅｒ　。

５ｅｒ−Ｇｌｎ　。

Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ　。

Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ又は Ｓｅｒ−Ｇｉｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅを意味する）
で表わされるポリペプチド又はその他磁性誘導体である
。

本発明はさらに、このポリペプチドの微生物中での製法
、ならびにそのために用いられるベクター及びＤＮＡ配
列に関する。

大腸菌中での遺伝子工学的製造において、この新規なポ
リペプチドはそのＮ−末端がメチオニン化されていても
よく、又は他のペプチド配列ヲ有していてもよい。この
ペプチド配列は、分泌を生じさせる信号配列を含有して
いてよく、あるいは例えばフィブリン又は他の細胞表面
構造に対する特異的な識別配列を含有していてもよい。

新規なペプチドは、 （ａ）インターフェロン−γ遺伝子をＭ１３−ベクター
に挿入し、 （ｂ）これから１本鎖ＤＮＡを分離し、このＤＮＡを突
然変異誘発混合物中でオリゴヌクレオチドにより雑種化
し、これによりインターフェロン−γ遺伝子のコード化
領域中で停止コドンを造る位置特異的な塩基交換を生じ
させ、（ｃ）この修飾されたインターフェロン−γ遺伝
子を分離し、 （、ｉ）この遺伝子を適当な大腸菌発現ベクターに挿入
し、そして （ｅ）この発現ベクターを用いてポリペプチドを発現さ
せ、そして分離する ことによって製造できる。

本発明のポリペプチドの製造において、インターフェロ
ン−γ遺伝子の調整された突然変異誘発により得られる
ＤＮＡを用いることが特に有利である。本方法のための
出発材料としては、第１図に示す１位ないし１４６位の
インターフェロン−γ−アミノ酸配列のためにコード化
するインターフェロン−γ−〇ＤＮＡ　（相補ＤＮＡ　
）（第２図参照）が用いられる。

しかし遺伝子コードの縮重により、他のＤＮＡ配列例え
ば異なるＤＮＡ配列を有する新規なポリペプチドを発現
するだめの化学合成された遺伝子を用いることも可能で
ある。

本発明により得られるポリペプチドは、インターフェロ
ン−γ活性又はインターフェロン−γ様活性を有し、腫
瘍性疾患、免疫性疾患又は炎症性疾患例えばりウマテ又
は多発性関節炎に使用できる。このポリペプチドは体表
面積１Ｃｒｎ２及び１日当たり５〜５００μｇの量で用
いられる。

従って本発明はさらに、前記の新規ポリペプチドの少な
くとも１種を含有する医薬であって、この医薬は所望に
より薬理学的に容認される賦形剤又は結合剤、特にヒト
血清アルブミンを含有しうる。この医薬は、新規な蛋白
質を既知のリンホカイン（例えばＴＮＦ　、　　リンホ
トキシン）又はリンホカイン変異体（西独時開２５００
００号明細書、特に△２４−リンホトキシン）と組合せ
て含有することもできる。

本発明の他の態様を下記例により詳細に説明する。比較
物質として役立つインターフェロン−γは、公知方法に
より大腸菌中でクローニングし、発現させ、そして文献
記載の方法により精製した（メソツズ・イン・エンザイ
モロジイ、１１９．３６６〜３８６．１９８６）。

例１ 比較物質としてのインターフェロン−γのための遺伝子
を有する雑種プラスミドの製造：出発点はプラスミドｐ
ＵＣ１８ＩＦＮ−γであった。このものは、Ｓａｕ　ｌ
１ｌａで切断されたインターフェロン−γ−ＣＤＮＡ　
（第２図）をｐＵＣ１８のＢａｍ　ＨＩ識別部位に挿入
することにより製造された。次いでこのプラスミドｐＵ
Ｃ１８工ＦＮ−γを、公知方法により制限エンドヌクレ
アーゼＢｓｔ　ＮＩ／Ｓａｕ　ｌ１ｌａを用いてその製
造業者の指示に従って切断しく第６図）、断片を５％ポ
リアクリルアミドゲル上で電気泳動により分離し、そし
て臭化エチジウムで染色して可視にした。

次いで必要なインターフェロン−γ遺伝子（ＢｓｔＮＩ
／　Ｓａｕ　Ｉ［１ａ−７１５ｂｐ　）をアクリルアミ
ドゲルから切り出し、電気泳動によりマトリックスから
分離した（シュライヘル・ラント・シュル社製Ｂｉｏ−
Ｔｒａｐ　）　。この断片０．１ｐｍｏｌをベクタ結合
させた。

ＫＳ　　９　５’　　ＡＡＴＴＣＡＴＧＣ３’ＫＳ　　
ＩＱ　　３’　　　　ＧＴＡＣＧＴ　　５’第３図に示
す雑種プラスミドｐＫＳ　１３１が得られた。この雑種
プラスミドは、そのＥｃｏ　ＲＩ切断部位に合成で製造
された翻訳信号配列を有し、そしてＩＦＮ−γ遺伝子を
適当な大腸菌株において温度感受性λ−リプレッサー（
ｃＩ８５７）により４２℃で発現させた。。

こうして製造されそして第１図に示すアミノ酸配列（＋
Ｎ−末端メチオニン）を有するインターフェロン−γは
、比較物質として役立つ。

例２ 工ＦＮ−γ比較物質の蛋白化学的精製：第１段階：　Ｉ
ＦＮ−γ−封入体の収得及び精製は、例４の第１段階と
同様に行った。

第２段階：再生は、例４の第２段階と同様に行った。

第３段階：再生物の希釈 再生物を、２０ｍＭ酢酸アンモニウムｐＨ７，５により
１：１゜７に希釈したのち、８ｏｏｏｇで３０分間遠心
分離した。

第４段階：イオン交換クロマトグラフィ例４の第４段階
と同様にして、ただし下記の異なる緩衝液を用いて行っ
た。

平衡化緩衝液：０．４Ｍアルギニン塩酸塩／３％蔗糖／
２０ｍＭ酢酸アンモニウムｐＨ７，５溶離緩衝液：０．
４Ｍアルギニン塩酸塩／３％蔗糖／　２０　ｍＭ　　Ｎ
ａＨ２ＰＯ４ｐＨ７，５、ＮａＣ１含量増加（０〜０．
１５Ｍ） 前記の条件下で、インターフェロン−γは０゜０７〜０
．１５　Ｍ　　ＮａＣ１において溶離した。

第５段階：疎水性クロマトグラフィは、例４の第５段階
と同様に行った。

例３ 新規なポリペプチドの製造ニ プラスミドｐＫｓ１３１を制限ヌクレアーゼＥｃ。

ＲＩ／５ａｌＩにより切断し、１ＦＮ−γ遺伝子を有す
るこのＤＮＡ断片を、Ｅｃｏ　ＲＩ　　及びＳａｌ　　
Ｉにより切断されたＭ１３−ベクターｍｐ１１に挿入し
た。この新規なプラスミドを、大腸菌ＢＭＨ７１−１８
中で形質転換し、次いでこれから生成したＭ１３−１本
鎖を分離した。この１本鎖のほかに、Ｍ１３ｍｐ１９の
Ｅｃｏ　Ｒ工／　Ｓａｌ　エベクター断片も分離して、
１本鎖と一緒に１間隙重複」混合物に用いられる。

Ｍ１３突然変異誘発における操作は、ニュークレイツク
・アシツズ・リサーチ１２．９４４１．１９８４及びモ
レキュラー・クローニング・ラボラトリイ・マニュアル
、コールド・スフリング・ハーバ−社１９８２に記載さ
れている。すべての操作は、ベーリンガー社製のＭ１３
一部位に調整された突然変異誘発キラ）　（Ａ　１０２
７４９２　）を用いて行われた。

突然変異を導入するために、下記のオリゴヌクレオチド
を利用した。

ＫＳ　　６　　ＧＧＡＧＴＴＡＧＡＴＧＣＴＧＴＴＴＣ
ＧＫＳ　　７　　ＧＧＡＧＴＣＡＧＴＡＧＣＴＧＴＴＴ
ＣＧＫＳ　　８　　ＧＴＣＡＧＡＴＧＴＡＧＴＴＴＣＧ
ＡＧＧＫＳ　　９　　ＧＡＴＧＣＴＧＴＡＡＣＧＡＧＣ
）ＴＣＧＫＳ　１０　　ＧＡＴＧＣＴ（）ＴＴＴＴＧＡ
ＧＧＴＣＧこれらのオリゴヌクレオチドにより、ＩＦＮ
−γのためのＤＮＡ配列中に点突然変異が導入された。

この点突然変異は読取りフレーム中で未成熟の停止を生
じさせるので、Ｃ−末端で短縮されたＩＦＮ−γ分子の
ための遺伝子が生成する。

突然変異を誘発させ、そしてザンガーの配列び切断し、
そしてＥｃｏ　Ｒ工／Ｓａｌ　Ｉで切断されたベクター
ｐｋｓ２０１に挿入した（第６図参照）。

例１の記載と同様にして、個々のＥｃｏ　Ｒニー切断部
位に発現のための信号配列を挿入し、そして新規なペプ
チドを発現させ、精製し、特性決定した。突然変異誘発
に用いたオリゴヌクレオチドにより、下記の生成物が得
られた。

ＫＳ　６：　ＡＳ　１−１３２−デルタ１１　　ＩＦＮ
−γＫＳ　７：　ＡＳ　１−１３３−デルタ１０　工Ｆ
Ｎ−γＫＳ　８：　Ａｓ　１−１３４−デルタ　９　Ｉ
Ｆ’Ｎ−γＫＳ　９：　ＡＳ　１−１３５−デルタ　８
　ＩＦＮ−γＫＳ１０　：　Ａｓ　１−１６６　＝デル
タ　７　工ＦＮ−γこれらの新規なポリペプチドはいず
れも、アミン末端になおメチオニンを含有していた。

例４ 新規なポリペプチドの蛋白化学的精製：すべてのＩＦＮ
−γ−−異体を蛋白化学的に精製するために、それぞれ
下記の精製段階を行った。

第１段階：　ＩＦＮ−γ−変変異体−大人体収得及び精
製 それぞれの産生株からインターフェロン−γ−変変異体
−大人体収得して精製するために、発酵液から遠心分離
（６０００〜８０００５＋、３０分）により大腸菌細胞
を採取し、次いで超音波ゾンデ（５×２分、１５０Ｗ、
ミクロチップ）を用いて破壊した。封入体を、２０ｍＭ
燐酸塩緩衝液ｐＨ７，５，２０ｍＭ　ＥＤＴＡ　（５ｍ
ｌ／　ｇ大腸ギニン／　２　Ｄ　ｍＭ　酢酸アンモニウ
ムｐｎ７．５／大腸菌１ｇにつき’ｌ、　５　ｍｌ　）
の中で４℃で４８時間攪拌すると、封入体は溶解した。

夾雑するＤＮＡはＭｎＣｌ２−沈殿により除去した（Ｍ
ｎＣ１−最終濃度４　Ｑ　ｍＭ　）。この方法における
インターフェロン−γ−変異体の収率ば６０〜７０％で
、蛋白化学的純度は約５０％であった。

第２段階：再生 グアニジン塩酸塩に溶解され大まかに精製されたインタ
ーフェロン−γ−変異体を再生させ、この場合第１段階
から得られた物質を、絶えず攪拌しながら再生用緩衝液
（０，４Ｍアルギニン／１０％蔗糖７２０　ｍＭ酢酸ア
ンモニウムｐＨ７、５）に１時間かけてポンプ導入した
。インターフェロン−γ−変異体の最終濃度が０．４〜
０゜８■／　ｍｌになる量の再生用緩衝液を装入した。

最終濃度に達したのち、混合物を４℃でさらに１夜攪拌
した。

第３段階：再生物の希釈 再生物を水で１：２に希釈したのち、８０００ｇで６０
分間遠心分離した。

第４段階：イオン交換クロマトグラフィ希釈され遠心分
離された再生混合物を、Ｓ　−セファロースカラム上の
アニオン交換Ｑ−セファロースにポンプ導通した。アニ
オン交換体上ではＤＮＡ及び脂質含有断片の富化が行わ
れたが、インターフェロン−γはこれを通過し、そして
カチオン交換体Ｓ−セファロースに結合した。

この組合せカラムを平衡化緩衝液（２０ｍＭ酢酸アンモ
ニウム、０．２５Ｍアルギニン塩酸塩、６％蔗糖、ｐＨ
７，５）で洗浄し、次いでＳ−セファロースカラムを取
りはずし、そしてＱ−セファロースなしで下記のように
展開した。

カラム容積の３倍量の平衡化緩衝液で洗浄し、 アルギニン塩酸塩含量が増大する（０．２５〜０．４Ｍ
）２０ｍＭ酢酸アンモニウム／６％蔗糖ｐＨ７，５でＩ
ＮＦ−γを溶離させた。

第５段階：疎水性クロマトグラフィ Ｓ−セファロースカラムから溶離された求められた活性
を有する分画を、固形硫酸アンモニウムを添加して０．
３Ｍの最終濃度となし、そしテ［１，５Ｍ　硫酸アンモ
ニウム／　［１，２Ｍアルギニフッ３％蔗糖／　５　Ｔ
ＩＩＭ燐酸塩緩衝液ｐＨ７，０で平衡化されたフェニル
−セファロース（ファルマシア製）上に加えた。選ばれ
た条件下で新規な各ポリペプチドはとのカラムを通過し
たが、大腸菌蛋白は大部分がマトリックスに結合した。

この蛋白含有溶離液を、１０　ｋＤａ−膜（アミコン社
製）により１０〜２０倍に濃縮した。

こうして得られた濃厚物は、新規なポリペプチドを１．
０〜１．６　ｍ９／　＋＋＋ｌの量で含有していた。

例５ 抗ウィルス活性の測定： このために２　Ｘ　１０重個のＨＥｐ−２細胞を含有す
る培地１００μｌを、９６個の平底穴を有する板の穴に
入れ、６７℃及び５％（Ｖ／Ｖ）二酸化炭素で１夜保温
した。翌日、１０ｎ、９蛋白／罰にしたＩＦＮ−γ−含
有試料液１００μｌを、コンフルエントな細胞培養に加
え、そして一連で２重の滴定を行った。

国際的に決定されたＩＦＮ−γ−標準溶液（Ｇｇ２３−
９０１−５３０、ＮＩＨ、ビセーダ社製、米国）１００
μｌについても、同様に操作した。

−２〇　− そのほか細胞対照（ウィルスに感染していない未処理の
細胞）及びウィルス対照（ウィルスに感染した未処理の
細胞）についても、同様に操作した。３７℃及び５％（
ｖ／ｖ　）　ＣＯ２でさらに２４時間保温したのち、培
養物を培地中のＶＳＶ−懸濁液５０μｌに感染させ、３
７℃及び５％（■／■）ＣＯ２で保温した。２日後に、
保護されない培養物（ウィルス対照）中でウィルスによ
る細胞損傷（ｃＰＥ）を進行させた。試験物質により処
理し次いでＶＳＶに感染させた培養物中で保護された細
胞の％を、クリスタルバイオレット染色により測定した
。

次いで０％及び１００％保護に対する５０％保護を定め
、そして５０％保護を生じさせる試料の希釈率の逆数を
、未処理の試料の抗ウィルス活性の濃度として単位／ｍ
９として示す。国際標準の単位は同様にして測定された
。標準について認められた値から偏差がある場合には、
相当する補正係数を求め、そして測定値を補正した。

新規なポリペプチドの抗ウィルス活性を次表に示す。こ
の表から明らかなように、新規なポリペプチドはＩＦＮ
−γよりも約６倍高い抗ウィルス活性を有する。

ポリペプチド　　　抗ウィルス活性　　　　相対的活性
（国際単位／ｍｇ） ＩＦＮ−γ　　　　　　　　９．４ＸｉＯ’　　　　　
　　１△　７　ＩＦＮ−γ　　　　　５２．５　Ｘ　１
０６５．６△ｌ０ＩＦＮ−γ　　　　　５７．４Ｘ１０
’　　　　　　６．１△１１１ＦＮ−γ　　　　　５Ｂ
、４　Ｘ　１０’　　　　　　　６．２

【図面の簡単な説明】

第１図は成熟ヒトインターフェロン−γ分子のアミノ酸
配列を示し、第２図は第１図の第１〜第１４３のインタ
ーフェロン−γ−アミノ酸配列のためにコード化するイ
ンターフェロン−γ−ｃＤＮＡを示し、そして第３図は
本発明の新規なポリペプチドを製造するための工程図の
一例を示す。 Ｇｉｎ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇ
ｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ　　　　　　　　　　　
　　　　　　１０Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐ
ｈｅ−Ａｓｎ−＾１ａ−ＧｌｙＪＩｉｓ−５ｅｒ　　　
　　　　　　２０Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−＾
５ｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ　　　
　　　　　　　　　　　　　３０Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｌｅ
ｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ
−Ｓｅｒ　　　　　　　　　　　　　　　　４０Ａｓｐ
−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−１１ｅ−Ｍｅｔ−Ｇｉｎ−Ｓｅｔ−
Ｇｉｎ−１１ｅ−Ｖａｌ　　　　　　　　　　　５０Ｓ
ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈ
ｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ　　　　　　　　　　　６
０Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｇｉｎ−５ｅｒ−１ｉｅ−
Ｇｉｎ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ｖａｔ　　　　　　　　　　
ＴＯＧｌｕ−Ｔｈｒ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−＾ｓｐ
−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ　　　　　　　　　
　８０Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−５ｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｙ
ｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ　　　　　　　　
　　９０Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔ
ｈｒ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｖｉｌ　　　　　　　
　　１００Ｔｈｒ１００Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓ
ｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｒ＾１ａ−１１ｅ　　　　　　
　　　　　　　　　　１１０Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−
Ｚｌｅ−Ｇｉｎ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌ
ｅｕ　　　　　　　　　ｌ　２０Ｓｅｔ−Ｐｒｏ−Ａｌ
ａ−＾１ａ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−＾ｒｇ
−Ｌｙｓ　　　　　　　　　Ｄ。 Ｄ２　　　　　　　　　　１’１Ｇ Ａｒｇ−５ｓｒ−Ｇｉｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−＾
ｒ９−ＧＬｙ−Ａｒ９−Ａｒ９　　　　　　　　　　　
　　　１４０Ａｈａ−Ｓｅｒ−Ｇｉｎ　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　１４３Ｉ　　ＧＡＴＣ
ＡＧＣＴＴＧ　ＡＴＡＣＡＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＡＴＴ
ＴＣＡＡＣＴＴＣＴＴＴＧ　ＧＣＴＴＡＡＴＴＣＴ５１
　　　　ＣＴＣＧＧＡＡＡＣＧ　　ＡＴＧＡＡＡＴ＾■
人　ＣＡＡＧＴＴＡＴＡＴ　　ＣＴＴＧＧＣＴＴＴＴ　
　ＣＡＧＣＴＣＴＧＣＡＢｓｔ　　Ｎ＋ ＋０１　　　　ＴＣＧＴＴＴＴＧＧＧ　　ＴＴＣＴＣＴ
ＴＧＧＣＴＧＴＴ＾ＣＴＧＣＣＡＧＧＡＣＣＣＡＴＡ　
　ＴＧＴＡＡＡＡＧＡ人１５１　　ＧＣＡＧＡＡＡＡＣ
ＣＴＴＡＡＧＡＡ＾■＾ＴＴＴＴ＾ＡＴＧＣＡ　ＧＧＴ
ＣＡＴＴＣＡＧ　ＡＴＧＴＡＧＣＧＧＡ２０１■＾ＡＴ
ＧＧＡＡＣＴ　ＣＴＴＴＴＣＴＴＡＧ　ＧＣＡＴＴＴＴ
ＧＡＡ　ＧＡＡＴＴＧＧＡＡＡ　ＧＡＧＧＡＧＡＧＴＧ
２５１　　＾ＣＡＧＡＡＡＡＡＴ　Ａ＾ＴＧＣＡＧＡＧ
ＣＣＡＡＡＴＴＧＴＣＴ　ＣＣＴＴＴＴＡＣＴＴ　ＣＡ
ＡＡＣＴＴＴＴＴ３０１　　　＾ＡＡ＾＾ＣＴＴＴＡ　
　ＡＡＧＡＴＧＡＣＣＡ　　ＧＡＧＣＡＴＣＣＡＡ　　
ＡＡＧＡＧＴＧＴＧＧ　　ＡＧＡＣＣＡＴＣＡ人’１５
１　　ＧＧＡＡＧＡＣ＾ＴＧ　ＡＡＴＧＴＣＡＡＧＴ　
ＴＴＴＴＣＡＡＴＡＧ　ＣＡＡＣＡ＾＾ＡＡＧ＾＾ＡＣ
ＧＡＧＡＴＧ４０４　　ＡＣＴＴＣＧ＾＾ＡＡ　ＧＣＴ
ＧＡＣＴＡ＾Ｔ　ＴＡＴＴＣＧＧＴＡＡ　ＣＴＧＡＣＴ
ＴＧＡＡ　ＴＧＴＣＣＡＡＣＧＣ４５１＾ＡＡＧＣＡＡ
ＴＡＣＡＴＧＡＡＣＴＣＡＴ　ＣＣＡＡＧＴＧＡＴＧ　
ＧＣＴＧＡＡＣＴＧＴ　ＣＧＣＣＡＧＣ＾６Ｃ５０１Ｔ
ＡＡＡＡＣＡＧＧＧ　ＡＡＧＣＧＡＡＡＡＡ　ＧＧＡＧ
ＴＩＪＧＡＴ　ＧＣＴＧＴＴＴＣＧＡ　ＧＧＴＣＧ＾＾
ＧＡＧ５５１　　ＣＡＴＣＣＣＡＧＴＡ　ＡＴＧＧＴＴ
ＧＴＣＣＴＧＣＣＴＧＣ＆＾■＾ＴＴＴＧＡＡＴＴＴ　
Ｔ＾＾人ＴＣＴＡＡＡＳｏｌ　　ＴＣＴＡＴＴＴＡＴＴ
　ＡＡＴ＾ＴＴＴ＾＾ＣＡＴＴＡＴＴＴ＾τｋ　ＴＧＧ
ＧＧＡＡＴＡＴ　ＡＴＴＴＴＴＡＧＡＣ６５１ＴＣＡＴ
ＣＡＡＴＣＡ　ＡＡＴＡＡＧＴ＾τＴＴ＾ＴＡ＾ｖＡＧ
ｃｉ　ＡＣＴＴＴＴＧＴＧＴ＾＾ＴＧＡ＾＾＾Ｔ６７０
１　　＾ＡＴＡＴＣＴＡＴＴ　ＡＡＴＡＴＡＴＧＴ＾Ｔ
ＴＡＴＴＴ＾ＴＡＡ　ＴＴＣＣＴＡＴ＾ＴＣＣＴＧＴＧ
ＡＣＴＧＴ７５１　　ＣＴＣＡＣＴＴ＾ＡＴ　ＣＣＴＴ
ＴＧＴＴＴＴ　ＣＴＧＡＣＴＡＡＴＴ　ＡＧＧＣＡＡＧ
ＧＣＴ　ＡＴＧＴＧＡＴＴＩｋＣＳａｕ　　３ａ ８０１　　＾＾ＧＧＣＴＴＴＡＴ　ＣＴＣＡＧＧＧＧＣ
ＣＡＡＣＴＡＧＧＣ＾Ｇ　ＣＣＡＡＣＣＴＡＡＧ　Ｃ＾
ＡＧＡＴＣｊＧ２ ＳＯＵＩ［ＩＱ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次式 【遺伝子配列があります】 （式中ＸはＭｅｔ−Ｇｌｎ又はＧｌｎ、 ＹはＳｅｒ、 Ｓｅｒ−Ｇｌｎ、 Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ、 Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ又は Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ を意味する）で表わされるポリペプチド又はその他感性
   誘導体。 ２、Ｎ末端において免疫原性作用を有するペプチド配列
   を追加含有する、第１請求項に記載のポリペプチド。 ３、（ａ）インターフェロン−γ遺伝子をＭ１３−ベク
   ターに挿入し、（ｂ）これから１本鎖ＤＮＡを分離し、
   このＤＮＡを突然変異誘発混合物中でオリゴヌクレオチ
   ドにより雑種化し、これによりインターフェロン−γ遺
   伝子のコード化領域中で停止コドンを造る位置特異的な
   塩基交換を生じさせ、（ｃ）この修飾されたインターフ
   ェロン−γ遺伝子を分離し、（ｄ）この遺伝子を適当な
   大腸菌発現ベクターに挿入し、そして（ｅ）この発現ベ
   クターを用いてポリペプチドを発現させ、そして分離す
   ることを特徴とする、第１又は第２請求項に記載のポリ
   ペプチドの製法。 ４、第１又は第２請求項に記載のポリペプチドのために
   コード化する遺伝子配列を含有するベクター。 ５、次式 【遺伝子配列があります】 （式中ＸはＡＴＧ又はＡＴＧ　ＣＡＧ、 ＹはＡＧＴ　ＴＡＧ ＡＧＴ　ＣＡＧ　ＴＡＧ ＡＧＴ　ＣＡＧ　ＡＴＧ　ＴＡＧ ＡＧＴ　ＣＡＧ　ＡＴＧ　ＣＴＧ　ＴＡＡ又は ＡＧＴ　ＣＡＧ　ＡＴＧ　ＣＴＧ　ＴＴＴ　ＴＧＡ を意味する）で表わされる遺伝子配列を有する、第４請
   求項に記載のベクター。６、第１請求項に記載のポリペ
   プチドのためにコード化するＤＮＡ配列。 ７、第２請求項に記載のポリペプチドのためにコード化
   するＤＮＡ配列。 ８、第１又は第２請求項に記載のポリペプチドを含有す
   る医薬。 ９、第１又は第２請求項に記載のポリペプチド及びリン
   ホカインを含有する、第８請求項に記載の医薬。 １０、リンホカインとしてＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β又は
   その変異体を含有する第９請求項に記載の医薬。