JPS62278986A - ハイブリツドポリペプチド - Google Patents

ハイブリツドポリペプチド

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JPS62278986A
JPS62278986A JP62119965A JP11996587A JPS62278986A JP S62278986 A JPS62278986 A JP S62278986A JP 62119965 A JP62119965 A JP 62119965A JP 11996587 A JP11996587 A JP 11996587A JP S62278986 A JPS62278986 A JP S62278986A
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JP
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amino acid
item
hat
dna molecule
hybrid polypeptide
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JP62119965A
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アレックス・ジョセフ・ボレン
ポール・ヤコブス
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SmithKline RIT
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SmithKline RIT
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Publication date
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    • C07K14/8107Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/811Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • C07K14/8121Serpins
    • C07K14/8125Alpha-1-antitrypsin
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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    • C07K14/60Growth hormone-releasing factor [GH-RF], i.e. somatoliberin
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    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K2319/70Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 3、発明の詳細な説明 発明の分野 本発明は、ソマトクリニン(somatocrinin
e)およびα1−抗トリプシンからなることを特徴とす
るハイブリッドポリペプチド、細菌クローンからのその
産生法およびソマトクリニンの産生のためのその使用に
関する。
さらに詳しくは、本発明の方法および使用は、1nvi
troにて開裂可能なアミノ酸配列をコードする合成り
NAアダプターを介してフレームにてソマトクリニン、
ずなイつち、成熟ヒト成長ホルモン放出因子またはその
活性フラグメントらしくは誘導体に相当するヌクレオチ
ド配列および最適方法においてイー・コリにてそれ自身
を発現するヒトα1−抗トリプシンをコードする配列の
少なくとらフラグメントを連結し、該連結配列を強力な
細菌性発現ベクター中に導入し、その中で該ハイブリッ
ドポリペプチドを産生じ、in vitroにて該ハイ
ブリッドポリペプチドを開裂してソマトクリニンを得る
ことからなる一連の工程からなる。
発明の背景 ヒト成長ホルモンの放出因子、いわゆるソマトクリニン
(以下、rhGRFJと略す)もまた、線上垂体による
成長ホルモン(以下、rGI−TJと略す)の分泌の正
の調節器である。hGRFは、先端巨大症を起こすヒト
膵臓腫瘍から単離された乙のであり、配列された44個
のアミノ酸のポリペプチドである(ギレミンら、サイエ
ンス(Guillemin eLal、 、 5cie
nce)、2+8.585〜587(1982))。こ
のペプチドに対する抗体は、種々の霊長類の視床下部に
おける免疫反応性物質の同定を可能とし、明らかに同一
のポリペプチドか、また、ヒト視床下部から単離されて
いる。結局、“ザザンプロット“タイプの実験は、hG
rえFをコードずろただ1つの遺伝子が存在ずろという
ことを示している。したがって、これは、腫瘍性膵臓因
子が生理的な視床下部因子と同様のm11NAによって
コードされているということを示唆している。実質的な
爪のヒl−G fl Fを産生することか可能であるこ
との有用性は、特に、その遺伝的または生理的欠損が小
人症の原因であるということ、成長ホルモン(G[−1
)の合成に対するこの刺激作用がGH代謝の欠損または
疾病の診断におけるその有用性な火傷患者の治療におけ
るような組織の再生を促進させうるということおよびヒ
トGRF’の動物への投与がその成長を刺激するという
ことが示されているという事実に基づく。
40個のアミノ酸残基しか有しないhGRI”の形態ら
報告されており、約27個位のアミノ酸残基を有ずろG
RFのフラグメントか生理的に活性であることが判明し
ている。完全な449]のアミノ酸残基の膵臓hGRF
ベプヂドは、化学的に合成されており、合成h(、RF
、合成hGflF’フラグメントおよびその合成同族体
は、非常に強力な調節物質のlB存在供給源であるか、
そのような長いペプチド鎖の化学的合成は非常に高価で
ある。
hC;flPDNAを細胞内に導入し、hGRPを発現
する組換え型DNA法ら開発されている。
しかし、これらの方法では、どちらかというと僅かなm
のM;RFLか得られない。
ヘルギー特許第898666号は、化学的に合成した1
)NAフラグメノトを天然源から単離したh \1 Δ
 −74々′ ノ ・ノ 1.7−f4:/トー1−7
、ト、(ブ、C;メーt■名= 11−ζ亀本発明の方
法は、融合またはハイブリッドタンパク質を産生じ、つ
いで、それから所望のタンパク質自体を最終的に再生す
ることからなる方法から想起したらのである。
そのような方法の例としては、特定のテトラペプチド配
列のN−末端を用いる融合タンパク質からのC−末端の
選択的酵素的開裂によるタンパク質の産生を記載したヨ
ーロッパ特許出願第0020290号およびドイツ特許
出願第2922496号、遺伝子工学によるグリノンペ
プチドの産生および該C−末末端グリノン酵素的除去に
よる成長ホルモン放出因子のようなポリベプヂドアミド
の産生を記載したヨーロッパ特許出願第0133282
号、それぞれのタンパク質の遺伝情報を得、これを切断
し、連結して該ハイブリッドタンパク質をコードするD
NA配列を構成し、このDNAを原核生物または真核生
物宿主にて発現し、ついで穏和な還元にて鎖間ノスルフ
ィド架橋を開裂した後アフィニティクロマトグラフィー
に付すことにより最終的に別々の鎖を産生ずることから
なる方法を含む種々の方法によるフィブリン溶解性活性
ハイブリッドタンパク質の産生を記載したオーストラリ
ア特許出願第84/3707.1号、全hpGflFタ
ンパク質配列をコードするヌクレオチド配列、該hpc
 fl Fペプチドのアミノ末端に連結したペプチドセ
グメントおよび該hpGRF’ベプヂドのカルボキン末
端に連結したペプチドセグメントを用い、適当なプロセ
ッンング酵素が該形質転換細胞に存在する場合に該前駆
体をGRFに変換する組換え型DNA法によるプレプロ
−ヒト膵臓成長ホルモン放出因子(hpGnF”)の産
生を記載したヨーロッパ特許出願第0134085号、
成長ホルモン放出因子活性を有するペプチドが、成長ホ
ルモン放出因子をコードするコーディング配列を含有し
、かっ、融合タンパク質を発現する11JA構成体にて
形質転換した酵母の培養によって産生される方法を記載
したヨーロッパ特許出願第0129073号が挙げられ
る。
発明の要約 本発明によれば、hGRFは、hGRr;’をコードす
るDNA配列およびヒトα1−抗トリプシン(hA T
 )または少なくとも2番目付近のアミノ酸または15
番目付近のアミノ酸から363番目付近のアミノ酸まで
のコドンを包含するそのフラグメントをコードするDN
A配列からなり、両方の配列がアミノ酸配列(Asp)
4LYSに対応する情報を保持している合成り N A
アダプターを介してフレームにて融合していることを特
徴とする組換え型プラスミドベクターにて形質転換し・
た細菌性クローンにより産生される。
本発明の方法は、以下の一連の工程・ (1)完全な化学合成らしくは逆転写らしくはその組合
せ、好ましくは完全な化学合成により、好ましくは該ペ
プチドの1番目のアミノ酸のコドンから出発して産生じ
たhC,HPをコードするDNA配列またはその活性フ
ラグメントらしくは誘導体の産生 (2)完全な化学合成または逆転写またはその組合せ、
好ましくは逆転写により産生じたヒトα1−抗トリプシ
ンをコードし、かつ、2番目付近のアミノ酸または15
番目付近のアミノ酸から363番目付近のアミノ酸まで
のコドンを包含するDNAフラグメントの単離 (3)酵素エンテロキナーゼにより in viLro
にて開裂可能なアミノ酸配列(A 5p)4L ysに
対応する情報ならびにhATおよびhGRF配列のフレ
ームにおけろ融合のための適当な制限部位を保持してい
る合成り N Aアダプターの調製、(4)hATコー
ディング配列、in  viLroにて開裂可能なアミ
ノ酸配列をコードする合成り N Aアダプターおよび
hGRF遺伝子、すなわち、hA′1゛−開裂可能な配
列−hGrlFの順序の該5°末端から3°宋端までの
フレームにおけろ融合45よび解二売、 (5)該融合配列の強力な細菌発現ベクター中への挿入
、 (6)組換え型プラスミドヘクターをIllいた店主イ
ー・コリ細菌の形質転換、 (7)組換え型プラスミドを保持する形質転換冊菌の選
択 (8)形質転換イー・コリ細菌における対応するハイブ
リッドポリペプチドの産生 (9)イー・コリ細胞にて産生された該ハイブリッドポ
リペプチドの酵素エンテロキナーゼによる1nvitr
oにおける開裂、 (10)成熟hGrtFの獲得および免疫学的方法によ
るその特性付け により概略することができろ。
さらに詳しくは、例えば、この一連の工程は、(1)酵
素Rsa[および5af21を用いた適当なプラスミド
のDNA(例えば、ベルイー特許第898666号に記
載されているput、Bl l 13)の消化によるh
GRF’をコードする135bpフラグメントの獲得、 (2)酵素BamH1またはB+41およびAvalを
用いた適当なプラスミドのDNA(例えば、ベルイー特
許第895961号に記載されているpuLB+523
)の消化によるhATの全てまたは一部、すなわち2番
目のアミノ酸または15番目Cアミノ酸から363番口
のアミノ酸までをコードする1081またはl044D
NAフラグメントの獲得、 (3)アニーリングによる in vitroにて酵素
エンテロキナーゼにより開裂可能な(A S+))4 
L ysアミノ酸配列をコードし、かつ、適当な制限部
位を保持する合成りNAアゲブタ−を構成する27塩基
長オリゴマーおよび23相補対の合成、(4)フレーム
における融合を得るためのT4[’)NAリガーゼを用
いるhGRF’およびhATに対応するDNAフラグメ
ントの合成アダプターへの連結、 (5)熱誘発プロモーターを保持する強力な細菌性発現
ベクターのDNA(例えば、ブラスミt”pASlのD
NA)中への該連結DNA配列の挿入、(6)工程(5
)のプラスミドを用いた溶原菌(さらに詳しくは、溶原
性イー・コリ株、例えば、AR58株)の形質転換、 (7)抗生物質耐性に基づく該プラスミドを保持する細
菌性クローンの選択、 (8)該組換え型プラスミドにより保持されているプロ
モーターを誘発することによる形質転換細菌における該
ハイブリッドポリペプチドの産生、(9)エンテロキナ
ーゼを用いた該ハイブリッドポリペプチドの開裂、 (10)hG RFに対する抗体との反応による該ハイ
ブリッドポリペプチドの開裂から得られた成熟hGRF
の特性付け からなることを特徴とする。
発明の詳説 細菌におけろhC;RFの発現が、hGRFに対するコ
ーディング配列を細菌において最適方法にてそれ自身を
発現するhATまたはそのフラグメントに対応するコー
ディング配列に転写の方向がhATからhGRr;’で
あるように融合することによって顕著にかつ予期できな
いほど改善されうるということを見出した。ついで、本
発明の組換え型DNA分子を用いた場合、hGRFは細
菌中に多量に産生されるが、その対応するDNA配列が
それ自体で細菌性発現ベクター中にクローンされている
場合、h(1;RFは検出されない(クラバドールら、
バイオヒミー(Cravador  et  al、、
 I3iochimie)、67.829(+985)
)。
さらに詳しくは、本発明の組換え型分子内のコーディン
グ配列は、(I)2番目付近のアミノ酸または15番目
付近のアミノ酸のコドンから363番目付近のアミノ酸
のコドンまで伸長したhATをコードする配列のフラグ
メント、(2)標q的酵素法を用いてエンテロキナーゼ
により in vijr。
にて開裂可能な(Asp)+Lysペプチドをコードず
ろ合成ヌクレオチドおよび(3)該成熟分子の1番目の
アミノ酸を特定するコドンから出発するhGrtl?に
対するDI”JA配列からなることを特徴とする。この
配列は、クラバドールら(Cravador eLa 
l 、 ) (Iii記文献参照)およびベルイー特許
第898666号に記載されているような標孕的化学合
成により得られている。本発明に用いろプラスミド発現
ベクターには、ラトダの左方プロモーター(r’L)お
よびc[リポソーム結合部位が用いられろ。
組換え型プラスミドの組立ては、該発現データを熱誘発
(メソソズ・イン・エンザイモロジ−(Meth。
Enzym、 )、工A±、+23([983))によ
り得た以下の実施例に記載されている。したがって、得
られたハイブリッドポリペプチドは、N−hAT酵素開
裂部位−hGRF−Cからなることを特徴とする。
明らかなように、この明細書に記載されている組換え型
DNA分子は単なる例示であり、本発明を限定ずろらの
ではない。分子遺伝学の分野における公知の方法により
別の組立てを行なうことらできる。細菌における発現水
準に及ぼすこれらの別の組立ての効果は、例えば、ホル
ンら(Bollenet  al、XDNA、2.25
5(+983))により開示されているようなELIS
Aのような公知の方法により容易に測定できろ。本発明
の他の実例となるDNA分子は、hGRFに融合したh
ATコーディング配列の大きさが以下の実施例に記載さ
れているものより小さいか、または、hG RFヌクレ
オチド配列が、該アミノ酸配列を変化させることなく修
飾されたものである。
本発明のベクターを1fflするためhATおよびhG
RFをコードする融合DNA配列を挿入する発現ベクタ
ーは、当該分野において公知かつ人手可能な多数の細菌
性発現ベクターのいずれかとすることができる。調節可
能な発現ベクターが好ましい。未明細四において、「調
節可能」なる語は、挿入したコーディング配列の転写が
構成要素ではないが、例えば、培地への秀発剤の添加に
よりまたは加熱により誘発されうるということを意味す
る。
典型的なイー・コリ発現ベクターとしては、特に、ノー
・クイー7(Q ueen、 C)(ツヤ−ナル・オブ
・モレキュラー・アンド・アプライド・フエネテイツク
ス(J、 Mo1. Appl、 GeneL、)、2
.1〜10(1983))tこより3己載されているp
CQV2およびエムーo−ゼンベルグら(M 、 Ro
senberg ejal、Xメソブズ・イン・エンザ
イモロノー(MeshEnzym、 )、↓立上、12
3〜+38(+983))により記載されているpAs
lが挙げられる。I)ASIは、pBf1322?ll
開始点、アンビンリン低流性マーカーならびに調節領域
、すなわち、ラムダの左方プロモーター(Pl)、N−
抗終止機能認識部位(Nut  LおよびNut  R
)、rho−依存転写終止信号(tRI)およびそのG
残基が以下の 5″・・・・CATATG * GATC・・・・・・
3′[式中、*印はBam1(f  に対する開裂部位
を意味ずろ]のBam[−1f開裂部位によって直接生
じるall翻訳開始部位を含むc[Iリポソーム結合部
位からなるラムダからの一連のフラグメントを保有する
1)ASIは、pKc30c11のall−p1313
22結合においてBamall部位からヌクレオチドを
欠失させてclTATGとし、かつ、該分子を再結合し
てATGの直ぐ下流のBam1−11部位を再生するこ
とよりpKc30c[から誘導できる。1)KC30c
Hは、該clT遺伝子を保持するラムダからの13kb
HaeIrlフラグメントをpKC30の[Ipa1部
位に挿入することによって組立てろ(シャクツマンら、
エクスベリメンタル・マニピュレ−7ヨノ・オブ・ノー
ン・エクスブレッンヨノ、エム・イノウニ編、アカデミ
ツクプレス、ニューヨーク(Shatzman et 
at、、  Experimental  Manip
ulationof  Gene  Expressi
on、  Edit、  by  M、  Inouy
e。
Academic  Press、 !lew  Yo
rk)、1983およびエム・a−ゼンヘルグら(M、
llosenbcrget al、)、前記文献)。p
Kc30はンミタケら(S himitakeet  
al、Xネイチ+  (N ature)、292、+
28(1981))により記載されている。それは、p
BR322のLet R遺伝子内のll1nd[11お
よびBam1−11部位の間に挿入されたラムダの2 
、4 kbHind ■−B amHrフラグメントを
有するp13f1322誘導体である。MSIに類似し
たF114造が、カー1・ニーら(Coutrncy 
et al)(ネイチ+  (N ajure)、31
3.149(+98!’)))およびフチウィンクツら
(Kotewicz  et  al、)(ノーン(G
ene)、1工、249(1985))iこよ°リシ己
載されている。該コーディング配列は、標準的方法によ
り機能的に、すなわら、調節要素に対して正確な配置お
よび適正な解読フレームにてその中に挿入される。
他のクローニングおよび発現系は公知であり、他の細菌
、例えば、ハヂルス+J3 aci flus)、スト
レプトミセス(S treptomyces)、コリネ
バクテリウム(Corynebacterium)など
において本発明ノコ−ディング配列を発現するために利
用できる。
本発明に用いられろDNAフラグメントを誘導する成熟
hATに対するコーディング配列は、揉部的方法により
、例えば、ボレンら(13o11en etat、)、
(ベルイー特許第895961号)、ボレンら(Bol
len  et  al、XDNAX2. 255(1
983))、カートニーら(Courtney  et
  al、)(ヨーロッパ特許出願第01171777
号)、カワサキら(Kawasaki  et  al
、)(ザ・モレキュラー・バイオロジー・才ブ・イース
ト、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−(
The MolecularBiology or Y
east、 Co1d Spring l−1arbo
urL aboraLory)、1983年8月16〜
21日)、ロングら(Long  eL  al、)(
ストラクヂャー・アンド・オーガニゼーンヨン・オブ・
ジーンズ■、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラ
トリ−、アブストラクト(S tructure an
d Organizationoi’  Genes 
 1. Co1d  Spring  1(arbou
rLaboratory、 AbsLract) No
、 25.1983年)、ウーら(Woo  et  
al、)(フロム・ノーン・ツー・プロティン、トラン
スレーション・インツー・バイオチクノロノー、アーマ
ドら編、アカデミツクプレス、ニューヨーク(From
 Gene to Protein:   Trans
laLion    1nto    Biotech
nology、  edij。
by Ahmed  eL  al、、 Academ
icPress、 NewY ork)、+982)、
 クラチら(Kurachi  et  al、)(プ
ロシーディンゲス・オブ・ザ・ナンヨナル・アカデミ−
・才ブ・サイエンノーズ・才ブ・ザ・ユナイテッド・ス
テーブ・オブ・ アメリカ(Proc、 Natl、 
Acad、 Sci、 USA)、78゜6826(+
981))、パーカーら(Parker etal、)
(オーストラリア特許出願第31801/84号)およ
びコスクンツォーら(Costanzo)(イー・エム
・ヒー・オー・ジャーナル(EMBOJ)、■、57(
1983))より記載されているような肝臓細胞から選
択したメツセンジャーRNA集団の逆転写により得られ
る。
hGRFをコードする全合成り N Aは、例えば、ク
ラバドールら(Cravador  et  at、)
(ベルイー特許第898666号)およびクラバドール
ら(Cravador  eL  al、Xバイオヒミ
−(B iochimie)、67.829(1985
))またはバーら(I3arr  et  al、Xヨ
ーo−)パ特許出願第0129073号)により開示さ
れているような当該分野で公知の標賭的方法により得る
ことができろ。本発明のハイブリッドポリペプチドは架
橋hAT/hGRI;”ポリペプチドであり、それらは
、許容条件下に本発明の発現ヘクターにて形質転換した
微生物または細胞を培養ずろことにより産生されろ。「
許容条件」なる語は、該ハイブリッドタンパク質の発現
が誘発される培養条件、例えば、分析物、代謝物、他の
培地成分および温度を依味する。代表的には、形質転換
したイー・コリは、誘発以前の対数増殖期(八〇、。約
0.4〜0.6)まで、ついで該ポリペプチドの回収可
能量が発現されるまで誘発後さらに1.5〜5時間、通
気しながら選択圧力下、同化できる炭素および窒素源含
a栄養ブロス中で培養する。
イー・コリまたは他の微生物において発現された、本発
明のハイブリッドポリペプチドは、標阜的タンパク質単
離法により産生培養から単離される。
代表的には、精製法は、(1)細胞の分解、(2)該細
胞抽出物の61F澄化、(3)該ハイブリッドhAT/
hGRF’ポリペプチドの分離、13よび(11)不純
物を除去するための最終精製からなる。第1工程は、例
えば、リゾデームまたは池の溶解剤らしくは浸透剤の添
加または閥械的分解らしくは超音波分解により行なうこ
とかできろ。該ポリペプチドを外面化ずろための他の手
段としては、アウアーバッハおよびローゼンベルグ(A
 uerbach  andRosenbergXヨー
ロッパ特許出願第014086・1号)により記載され
ているような温度感受性溶原閑の使用か挙げられる。該
ハイブリッドポリペプチドが細胞抽出物中に沈澱する場
合、変性剤の添加により再溶解ずろことがて4きる。そ
のような方法は公知である。これらのいくつかは、ヒル
グーら(Builder  at  at、)(ヨーロ
ッパ特許出願第0114506号)により報告されてい
る。本明細書に特に示したハイブリッドhAT/hc;
R1?’分子は、標準イー・コリ抽出物に可溶である。
本発明の可溶性架橋hAT/hGRF分子は、標準的方
法により分離できる。
本発明の架橋hAT/hGRF分子の開裂は、マロウク
スら(Maroux  et  al、)(ジャーナル
・才ブ・バイオケミストリー(J 、 B ioche
mistry)、点上l、5031(1971))によ
り記載されているような標帛条件下酵素エンテロキナー
ゼにて酵素的消化により行なうことができる。ついで、
該開裂により生じた成熟hGRFは、モレキュラーノー
ブを含むような標錦的クロマトグラフィー法により分離
できろ。好ましい精製法は、hAT分子から開裂hGR
Fを分離する担持hGRF’ポリクローナルまたはモノ
クローナル抗体を用いたアフィニティークロマトグラフ
ィーからなる。
医薬上または獣医薬上許容される担体と合して医薬組成
物を形成するそのようにして得られたポリペプチドまた
はその非毒性塩は、ヒトまたは動物に対して、当該分野
において公知の静脈内、皮下、筋肉内、経皮、例えば、
経鼻腔、さらには経口のいずれかで投与できる。該投与
は、処置を受ける宿主かそのような治療的処置を必要と
するGH(成長ホルモン)の放出を刺激するために用い
ることができる。必要な用量は、治療される特定の条件
、症状の強度および所望の治療期間により変化する。
そのようなペプチドは、通常、酸付加塩または金属複合
体、例えば、亜鉛、鉄など(本明細書の趣旨から塩と考
えられる)の非毒性塩の形態にて投与される。そのよう
な酸付加塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸
塩、リン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安
息香酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩
、酒石酸塩などが挙げられる。該活性成分が錠剤形態に
て経口投与される場合、該錠剤は、トラガカント、コー
ンスターヂまたはゼラチンのような結合剤、アルギン酸
のような崩壊剤およびステアリン酸マグネンウムのよう
な滑沢剤を含有してもよい。液体形態の投与を所望する
場合、け味剤および/またはフレーバーを用いてもよく
、等張生理食塩水、リン酸塩緩衝液などにて静脈内投与
を行なうことができる。
該ペプチドは、医師の指示のらとにヒトに投与すべきで
あり、医薬組成物は、通常、該ペプチドと共に通常の固
体または液体の医薬上許容される担体を含有するっ通常
、非経口用爪は、宿主の体重1kgにつき、該ペプチド
を約0.0I〜約Iμgとする。
実施例 つぎに実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが
、本発明はこれに限定されるものではない。全ての制限
エンドヌクレアーゼは商業源から人手され、実質的に添
付の能書に従って用いられる。
工程l ヒトhAT遺伝子は、cDNAクローンpULB152
3(ベルギー特許第895961号に記載)か二ffl
鮒六メ1乙−電タ清イ乎半を寸−仝r4’l〜八グロー
ンへ包含するPsjlフラグメント上に得られる。
該フラグメントは、制限エンドヌクレアーゼBamHI
およびAvalにて消化され、それは、hATの2番目
のアミノ酸から363番目のアミノ酸に対するコーディ
ング配列を保持している。
工程2 制限酵素RsalおよびSa(!Iを用いた消化により
クローンpULB11+3(ベルギー特許第89866
6号に記載)から全合成ヒトhGRPを単離する。得ら
れたDNAフラグメントは、1番目のアミノ酸から出発
する成熟hGRFをコードずろ。
工程3 第1図に示した合成りNAアダプターは、クラバドール
ら(Cravador  et  al、 )(バイオ
ヒミ−(I3 iochimie)、67.829(1
985))により記載された方法により得られる。クラ
バドールら(前記文献参照)により記載されているよう
にアニーリングを行なった場合、それぞれ27bpおよ
び23bpの2つの単一らU・んフラグメントは、5゜
Ava[付着端および3°5cal付若端を保持する2
重ら仕んDNAフラグメントを生じる。それらの付着端
は、Bam1−11−AvalhA’rフラグメントか
らRsal−9a&1hGRF’フラグメントまでのフ
レームにおける融合に適している。さらに、該合成アダ
プターは、マロウクスら(Maroux ejal、 
X前記文献参照)により示されているような酵素エンテ
ロキナーゼにより in vitroにて開裂可能な(
A 5p)4L ysアミノ酸配列をコードする。
至栗ニ プラスミド発現ベクターからのDNA(例えば、メソッ
ズ・イン・エンザイモロジ−(Methods inE
 nzymology)、101,123〜+38(1
983)にてローゼンヘルグら(Rosenberg 
 et  at、 )により記載されたpAsI)は、
酵素[3dml−1NおよびSa(!Iにて開裂される
。該消化から得られた大きなフラグメントを保持し、そ
れは、強力なPL(ラムダ)プロモーターおよびATG
開姶コドンを保持する。
標亭的方法(マニアナイスら、モレキュラー・クローニ
ングニア・ラボラトリ−・マニュアル、コールド・スプ
リング・ハーバ−・ラボラトリ−、ニューヨーク(Ma
niajis et  al、、 Molecular
cloning: a 1aboratory man
ual、 Co1d SpringHarbour  
LaboraLory、New  York)、+98
2)を用いて連結により、工程1〜4がらのDNAフラ
グメントを組み立てる。得られた構成体(pULB13
23)は、hGRF遺伝子に対し合成アダプターを介し
てフレームにて融合したhAT遺伝子フラグメントを含
有する発現ヘクターてあろ(第1図)。第1図の上部は
、hATをコードずろ融合配列、合成アダプターおよび
hGRFを保持する組換え型プラスミドpULI313
23を表わしている。第1図の下部は、合成アダプター
のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を表わしている。
イー・コリの溶原株(例えば、モソトら(Mottet
  al、 Xプロンシーディンゲス・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミ−・才ブ・ザイエンシーズ・オプ・ザ
・ユナイテッド・ステーブ・オブ・アメリカ(Proc
、 Na11. Acad、 Sci、 USA)、1
影、88〜92(1985))に記載されたAf158
株)を標皇的方法(マニアナイスら(Maniatis
ejal、)、前記文献参照)を用いたpULB132
3にて形質転換し、形質転換体を熱誘発前に対数期まで
成長さける(エム・ローゼンベルグら、メソッズ・イン
・エンザイモロジ−(M、 Rosenberg  e
L  al、、〜1ejh、 Enzymol、 )、
+01、I23(+983))。
誘導期間後、遠心分離により細胞を集め、50mM1−
リス(pH8)、O,ImMエチレノンアミン四酢酸ナ
トリウム(EDTA)、O,lIQMジチオスL/イ)
−ル(DTT)、O,I %トリI−ンx I 00.
25%ンヨ糖および0.5pg/l!(lのリゾデーム
からなるリゾデーム溶液(1g細胞/l0x(溶液)の
添加により溶解さUoる。ついで、20分間該懸濁液を
通常速度の遠心分離(20000g)により分離ずろ。
該ハイブリットhAT/hlFポリベブヂドの試料をド
ブノル硫酸ポリアクリルアミドゲル(ラエムリー、ネイ
ヂャ−(L aemly、 N alure)、227
.680(1970))にて分析し、ウェスタン・プロ
ッティングおよび免疫検出(ホルンら(Bolfan 
 eL  al、 )、DNA、2.255(+983
))により同定した。
第2図において見られるようになり、I)Ul、131
323によりコードされたハイブリットポリペプチドh
AT/hGrlFは、hAT(パネルa)またはhGR
F(パネルb)のいずれかに対して生ずる抗体にて検出
でき(第ル−ン)、これは検出濃度を認めることができ
ないそのようなイー・コリにおける成熟hGRFの発現
を目的とした実験(タラバトール(Cravador)
、前記文献参照)と峰めて対照的である。さらに、該ハ
イブリットポリペプチドは、hA’r(aa2からaa
:+03)、エンテロキナーゼにより認識されるアミノ
酸配列おにび成、?AhcnF間の融合に対して予想さ
れろ分子mをCrシている。未誘発p[JLI3132
3試料(第2レーン)、誘発組換え型h A ’L” 
(第3レーン)、未次発組換え型hAT(第・・ル−ン
)、I)ASI負の調節(第5および第6レーン)、標
1hG fl P (第7レーン)および分子量基孕(
第8レーン)のような適当な対jIQが実験に用いられ
ている。
該ハイブリッドhA′r/hGRF’ポリペプヂドの試
料をin vitroにてエンテロキナーゼで消化して
該hAT、/hGflF融合を開裂し、該成熟hGRF
を遊離した。第3図は、この開裂を示している。
該検定は、EL I SAからなり、それは、そのRA
T残基を介して抗hAT抗体にて被覆されたマイクロウ
ェルプレートに結合した該ハイブリットボリベプヂドか
らhGRFがa離されることを示している(・・・・・
・)。該図は、また、結合hATが該方法の間該被覆マ
イクロウェルから遊離されないことを示している(・−
・)。
所望により、ついで該開裂hGnFを当該分野または池
のタンパク質担離方法にて公知の条件にてアフィニティ
クロマトグラフィーによりさらに精製することができる
【図面の簡単な説明】
第1図の上部はhATをコードする融合配列、合成アダ
プターおよびhGRFを保持する組換え型プラスミドp
ULBI323を表わした図、第1図の下部は合成アダ
プターのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を表わした図
、第2図は本発明のハイブリッドhAT/hGflFポ
リペプヂドのウェスタン法による解析を表わした図、第
3図は本発明のハイブリッドhAT/hC;RFボリペ
ブヂドの酵素エンテロキナーゼによる開裂を示すグラフ
である。 特許出願人 スミス・クライン−アール・アイ・ティ 代 理 人 弁理士前出  葆ほか2名第2 )〆?

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)hATコーディング配列、in vitroにて
    開裂可能なアミノ酸配列をコードする合成アダプターお
    よびhGRF遺伝子またはその活性フラグメントもしく
    は誘導体の該5′末端から3′末端までのフレームにお
    ける融合および解読からなることを特徴とするDNA分
    子。
  2. (2)該hATコーディング配列が、2番目付近のアミ
    ノ酸または15番目付近のアミノ酸から363番目付近
    のアミノ酸のコドンへ伸長したhATをコードする配列
    のフラグメントである前記第(1)項のDNA分子。
  3. (3)該hGRF遺伝子またはその活性フラグメントら
    しくは誘導体が全合成品である前記第(1)項のDNA
    分子。
  4. (4)該合成アダプターが(Asp)_4Lysアミノ
    酸配列をコードする前記第(1)項のDNA分子。
  5. (5)その中に機能的に挿入した該融合を有する細菌性
    発現ベクターである前記第(1)〜(4)項のいずれか
    のDNA分子。
  6. (6)イー・コリ発現ベクターである前記第(5)項の
    DNA分子。
  7. (7)該発現ベクターがpAS1の調節領域からなる前
    記第(6)項のDNA分子。
  8. (8)in vitroにて開裂可能な(Asp)_4
    Lysアミノ酸配列によって架橋したhATおよびhG
    RFまたはその活性フラグメントもしくは誘導体からな
    ることを特徴とするハイブリッドポリペプチド。
  9. (9)hATが、2番目付近のアミノ酸または15番目
    付近のアミノ酸から363番目付近のアミノ酸まで伸長
    したhATのフラグメントである前記第(8)項のハイ
    ブリッドポリペプチド。
  10. (10)hATが2番目のアミノ酸または15番目のア
    ミノ酸から363番目のアミノ酸まで伸長したhATの
    フラグメントである前記第(8)項のハイブリッドポリ
    ペプチド。
  11. (11)前記第(1)〜(4)項のいずれかのDNA分
    子にて形質転換した細菌。
  12. (12)イー・コリである前記第(11)項の細菌。
  13. (13)前記第(5)項のDNA分子にて形質転換した
    細菌。
  14. (14)イー・コリである前記第(13)項の細菌。
  15. (15)前記第(6)項のDNA分子にて形質転換した
    イー・コリ。
  16. (16)前記第(7)項のDNA分子にて形質転換した
    イー・コリ。
  17. (17)前記第(11)〜(16)項のいずれかの細菌
    を許容条件下に培養し、該培養からハイブリッドポリペ
    プチドを単離することを特徴とするハイブリッドポリペ
    プチドの産生法。
  18. (18)前記第(8)〜(10)項のいずれかのハイブ
    リッドポリペプチドを酵素エンテロキナーゼにより開裂
    することを特徴とするhGRFの産生法。
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