JPS62278986A - ハイブリツドポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 発明の分野 本発明は、ソマトクリニン（ｓｏｍａｔｏｃｒｉｎｉｎ
ｅ）およびα１−抗トリプシンからなることを特徴とす
るハイブリッドポリペプチド、細菌クローンからのその
産生法およびソマトクリニンの産生のためのその使用に
関する。

さらに詳しくは、本発明の方法および使用は、１ｎｖｉ
ｔｒｏにて開裂可能なアミノ酸配列をコードする合成り
ＮＡアダプターを介してフレームにてソマトクリニン、
ずなイつち、成熟ヒト成長ホルモン放出因子またはその
活性フラグメントらしくは誘導体に相当するヌクレオチ
ド配列および最適方法においてイー・コリにてそれ自身
を発現するヒトα１−抗トリプシンをコードする配列の
少なくとらフラグメントを連結し、該連結配列を強力な
細菌性発現ベクター中に導入し、その中で該ハイブリッ
ドポリペプチドを産生じ、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにて該ハイ
ブリッドポリペプチドを開裂してソマトクリニンを得る
ことからなる一連の工程からなる。

発明の背景 ヒト成長ホルモンの放出因子、いわゆるソマトクリニン
（以下、ｒｈＧＲＦＪと略す）もまた、線上垂体による
成長ホルモン（以下、ｒＧＩ−ＴＪと略す）の分泌の正
の調節器である。ｈＧＲＦは、先端巨大症を起こすヒト
膵臓腫瘍から単離された乙のであり、配列された４４個
のアミノ酸のポリペプチドである（ギレミンら、サイエ
ンス（Ｇｕｉｌｌｅｍｉｎ　ｅＬａｌ、　、　５ｃｉｅ
ｎｃｅ）、２＋８．５８５〜５８７（１９８２））。こ
のペプチドに対する抗体は、種々の霊長類の視床下部に
おける免疫反応性物質の同定を可能とし、明らかに同一
のポリペプチドか、また、ヒト視床下部から単離されて
いる。結局、“ザザンプロット“タイプの実験は、ｈＧ
ｒえＦをコードずろただ１つの遺伝子が存在ずろという
ことを示している。したがって、これは、腫瘍性膵臓因
子が生理的な視床下部因子と同様のｍ１１ＮＡによって
コードされているということを示唆している。実質的な
爪のヒｌ−Ｇ　ｆｌ　Ｆを産生することか可能であるこ
との有用性は、特に、その遺伝的または生理的欠損が小
人症の原因であるということ、成長ホルモン（Ｇ［−１
）の合成に対するこの刺激作用がＧＨ代謝の欠損または
疾病の診断におけるその有用性な火傷患者の治療におけ
るような組織の再生を促進させうるということおよびヒ
トＧＲＦ’の動物への投与がその成長を刺激するという
ことが示されているという事実に基づく。

４０個のアミノ酸残基しか有しないｈＧＲＩ”の形態ら
報告されており、約２７個位のアミノ酸残基を有ずろＧ
ＲＦのフラグメントか生理的に活性であることが判明し
ている。完全な４４９］のアミノ酸残基の膵臓ｈＧＲＦ
ベプヂドは、化学的に合成されており、合成ｈ（、ＲＦ
、合成ｈＧｆｌＦ’フラグメントおよびその合成同族体
は、非常に強力な調節物質のｌＢ存在供給源であるか、
そのような長いペプチド鎖の化学的合成は非常に高価で
ある。

ｈＣ；ｆｌＰＤＮＡを細胞内に導入し、ｈＧＲＰを発現
する組換え型ＤＮＡ法ら開発されている。

しかし、これらの方法では、どちらかというと僅かなｍ
のＭ；ＲＦＬか得られない。

ヘルギー特許第８９８６６６号は、化学的に合成した１
）ＮＡフラグメノトを天然源から単離したｈ　＼１　Δ
　−７４々′　ノ　・ノ　１．７−ｆ４：／トー１−７
、ト、（ブ、Ｃ；メーｔ■名＝　１１−ζ亀本発明の方
法は、融合またはハイブリッドタンパク質を産生じ、つ
いで、それから所望のタンパク質自体を最終的に再生す
ることからなる方法から想起したらのである。

そのような方法の例としては、特定のテトラペプチド配
列のＮ−末端を用いる融合タンパク質からのＣ−末端の
選択的酵素的開裂によるタンパク質の産生を記載したヨ
ーロッパ特許出願第００２０２９０号およびドイツ特許
出願第２９２２４９６号、遺伝子工学によるグリノンペ
プチドの産生および該Ｃ−末末端グリノン酵素的除去に
よる成長ホルモン放出因子のようなポリベプヂドアミド
の産生を記載したヨーロッパ特許出願第０１３３２８２
号、それぞれのタンパク質の遺伝情報を得、これを切断
し、連結して該ハイブリッドタンパク質をコードするＤ
ＮＡ配列を構成し、このＤＮＡを原核生物または真核生
物宿主にて発現し、ついで穏和な還元にて鎖間ノスルフ
ィド架橋を開裂した後アフィニティクロマトグラフィー
に付すことにより最終的に別々の鎖を産生ずることから
なる方法を含む種々の方法によるフィブリン溶解性活性
ハイブリッドタンパク質の産生を記載したオーストラリ
ア特許出願第８４／３７０７．１号、全ｈｐＧｆｌＦタ
ンパク質配列をコードするヌクレオチド配列、該ｈｐｃ
　ｆｌ　Ｆペプチドのアミノ末端に連結したペプチドセ
グメントおよび該ｈｐＧＲＦ’ベプヂドのカルボキン末
端に連結したペプチドセグメントを用い、適当なプロセ
ッンング酵素が該形質転換細胞に存在する場合に該前駆
体をＧＲＦに変換する組換え型ＤＮＡ法によるプレプロ
−ヒト膵臓成長ホルモン放出因子（ｈｐＧｎＦ”）の産
生を記載したヨーロッパ特許出願第０１３４０８５号、
成長ホルモン放出因子活性を有するペプチドが、成長ホ
ルモン放出因子をコードするコーディング配列を含有し
、かっ、融合タンパク質を発現する１１ＪＡ構成体にて
形質転換した酵母の培養によって産生される方法を記載
したヨーロッパ特許出願第０１２９０７３号が挙げられ
る。

発明の要約 本発明によれば、ｈＧＲＦは、ｈＧＲｒ；’をコードす
るＤＮＡ配列およびヒトα１−抗トリプシン（ｈＡ　Ｔ
　）または少なくとも２番目付近のアミノ酸または１５
番目付近のアミノ酸から３６３番目付近のアミノ酸まで
のコドンを包含するそのフラグメントをコードするＤＮ
Ａ配列からなり、両方の配列がアミノ酸配列（Ａｓｐ）
４ＬＹＳに対応する情報を保持している合成り　Ｎ　Ａ
アダプターを介してフレームにて融合していることを特
徴とする組換え型プラスミドベクターにて形質転換し・
た細菌性クローンにより産生される。

本発明の方法は、以下の一連の工程・ （１）完全な化学合成らしくは逆転写らしくはその組合
せ、好ましくは完全な化学合成により、好ましくは該ペ
プチドの１番目のアミノ酸のコドンから出発して産生じ
たｈＣ，ＨＰをコードするＤＮＡ配列またはその活性フ
ラグメントらしくは誘導体の産生 （２）完全な化学合成または逆転写またはその組合せ、
好ましくは逆転写により産生じたヒトα１−抗トリプシ
ンをコードし、かつ、２番目付近のアミノ酸または１５
番目付近のアミノ酸から３６３番目付近のアミノ酸まで
のコドンを包含するＤＮＡフラグメントの単離 （３）酵素エンテロキナーゼにより　ｉｎ　ｖｉＬｒｏ
にて開裂可能なアミノ酸配列（Ａ　５ｐ）４Ｌ　ｙｓに
対応する情報ならびにｈＡＴおよびｈＧＲＦ配列のフレ
ームにおけろ融合のための適当な制限部位を保持してい
る合成り　Ｎ　Ａアダプターの調製、（４）ｈＡＴコー
ディング配列、ｉｎ　　ｖｉＬｒｏにて開裂可能なアミ
ノ酸配列をコードする合成り　Ｎ　Ａアダプターおよび
ｈＧＲＦ遺伝子、すなわち、ｈＡ′１゛−開裂可能な配
列−ｈＧｒｌＦの順序の該５°末端から３°宋端までの
フレームにおけろ融合４５よび解二売、 （５）該融合配列の強力な細菌発現ベクター中への挿入
、 （６）組換え型プラスミドヘクターをＩｌｌいた店主イ
ー・コリ細菌の形質転換、 （７）組換え型プラスミドを保持する形質転換冊菌の選
択 （８）形質転換イー・コリ細菌における対応するハイブ
リッドポリペプチドの産生 （９）イー・コリ細胞にて産生された該ハイブリッドポ
リペプチドの酵素エンテロキナーゼによる１ｎｖｉｔｒ
ｏにおける開裂、 （１０）成熟ｈＧｒｔＦの獲得および免疫学的方法によ
るその特性付け により概略することができろ。

さらに詳しくは、例えば、この一連の工程は、（１）酵
素Ｒｓａ［および５ａｆ２１を用いた適当なプラスミド
のＤＮＡ（例えば、ベルイー特許第８９８６６６号に記
載されているｐｕｔ、Ｂｌ　ｌ　１３）の消化によるｈ
ＧＲＦ’をコードする１３５ｂｐフラグメントの獲得、 （２）酵素ＢａｍＨ１またはＢ＋４１およびＡｖａｌを
用いた適当なプラスミドのＤＮＡ（例えば、ベルイー特
許第８９５９６１号に記載されているｐｕＬＢ＋５２３
）の消化によるｈＡＴの全てまたは一部、すなわち２番
目のアミノ酸または１５番目Ｃアミノ酸から３６３番口
のアミノ酸までをコードする１０８１またはｌ０４４Ｄ
ＮＡフラグメントの獲得、 （３）アニーリングによる　ｉｎ　ｖｉｔｒｏにて酵素
エンテロキナーゼにより開裂可能な（Ａ　Ｓ＋））４　
Ｌ　ｙｓアミノ酸配列をコードし、かつ、適当な制限部
位を保持する合成りＮＡアゲブタ−を構成する２７塩基
長オリゴマーおよび２３相補対の合成、（４）フレーム
における融合を得るためのＴ４［’）ＮＡリガーゼを用
いるｈＧＲＦ’およびｈＡＴに対応するＤＮＡフラグメ
ントの合成アダプターへの連結、 （５）熱誘発プロモーターを保持する強力な細菌性発現
ベクターのＤＮＡ（例えば、ブラスミｔ”ｐＡＳｌのＤ
ＮＡ）中への該連結ＤＮＡ配列の挿入、（６）工程（５
）のプラスミドを用いた溶原菌（さらに詳しくは、溶原
性イー・コリ株、例えば、ＡＲ５８株）の形質転換、 （７）抗生物質耐性に基づく該プラスミドを保持する細
菌性クローンの選択、 （８）該組換え型プラスミドにより保持されているプロ
モーターを誘発することによる形質転換細菌における該
ハイブリッドポリペプチドの産生、（９）エンテロキナ
ーゼを用いた該ハイブリッドポリペプチドの開裂、 （１０）ｈＧ　ＲＦに対する抗体との反応による該ハイ
ブリッドポリペプチドの開裂から得られた成熟ｈＧＲＦ
の特性付け からなることを特徴とする。

発明の詳説 細菌におけろｈＣ；ＲＦの発現が、ｈＧＲＦに対するコ
ーディング配列を細菌において最適方法にてそれ自身を
発現するｈＡＴまたはそのフラグメントに対応するコー
ディング配列に転写の方向がｈＡＴからｈＧＲｒ；’で
あるように融合することによって顕著にかつ予期できな
いほど改善されうるということを見出した。ついで、本
発明の組換え型ＤＮＡ分子を用いた場合、ｈＧＲＦは細
菌中に多量に産生されるが、その対応するＤＮＡ配列が
それ自体で細菌性発現ベクター中にクローンされている
場合、ｈ（１；ＲＦは検出されない（クラバドールら、
バイオヒミー（Ｃｒａｖａｄｏｒ　　ｅｔ　　ａｌ、、
　Ｉ３ｉｏｃｈｉｍｉｅ）、６７．８２９（＋９８５）
）。

さらに詳しくは、本発明の組換え型分子内のコーディン
グ配列は、（Ｉ）２番目付近のアミノ酸または１５番目
付近のアミノ酸のコドンから３６３番目付近のアミノ酸
のコドンまで伸長したｈＡＴをコードする配列のフラグ
メント、（２）標ｑ的酵素法を用いてエンテロキナーゼ
により　ｉｎ　ｖｉｊｒ。

にて開裂可能な（Ａｓｐ）＋Ｌｙｓペプチドをコードず
ろ合成ヌクレオチドおよび（３）該成熟分子の１番目の
アミノ酸を特定するコドンから出発するｈＧｒｔｌ？に
対するＤＩ”ＪＡ配列からなることを特徴とする。この
配列は、クラバドールら（Ｃｒａｖａｄｏｒ　ｅＬａ　
ｌ　、　）　（Ｉｉｉ記文献参照）およびベルイー特許
第８９８６６６号に記載されているような標孕的化学合
成により得られている。本発明に用いろプラスミド発現
ベクターには、ラトダの左方プロモーター（ｒ’Ｌ）お
よびｃ［リポソーム結合部位が用いられろ。

組換え型プラスミドの組立ては、該発現データを熱誘発
（メソソズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈ。

Ｅｎｚｙｍ、　）、工Ａ±、＋２３（［９８３））によ
り得た以下の実施例に記載されている。したがって、得
られたハイブリッドポリペプチドは、Ｎ−ｈＡＴ酵素開
裂部位−ｈＧＲＦ−Ｃからなることを特徴とする。

明らかなように、この明細書に記載されている組換え型
ＤＮＡ分子は単なる例示であり、本発明を限定ずろらの
ではない。分子遺伝学の分野における公知の方法により
別の組立てを行なうことらできる。細菌における発現水
準に及ぼすこれらの別の組立ての効果は、例えば、ホル
ンら（Ｂｏｌｌｅｎｅｔ　　ａｌ、ＸＤＮＡ、２．２５
５（＋９８３））により開示されているようなＥＬＩＳ
Ａのような公知の方法により容易に測定できろ。本発明
の他の実例となるＤＮＡ分子は、ｈＧＲＦに融合したｈ
ＡＴコーディング配列の大きさが以下の実施例に記載さ
れているものより小さいか、または、ｈＧ　ＲＦヌクレ
オチド配列が、該アミノ酸配列を変化させることなく修
飾されたものである。

本発明のベクターを１ｆｆｌするためｈＡＴおよびｈＧ
ＲＦをコードする融合ＤＮＡ配列を挿入する発現ベクタ
ーは、当該分野において公知かつ人手可能な多数の細菌
性発現ベクターのいずれかとすることができる。調節可
能な発現ベクターが好ましい。未明細四において、「調
節可能」なる語は、挿入したコーディング配列の転写が
構成要素ではないが、例えば、培地への秀発剤の添加に
よりまたは加熱により誘発されうるということを意味す
る。

典型的なイー・コリ発現ベクターとしては、特に、ノー
・クイー７（Ｑ　ｕｅｅｎ、　Ｃ）（ツヤ−ナル・オブ
・モレキュラー・アンド・アプライド・フエネテイツク
ス（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　ＧｅｎｅＬ、）、２
．１〜１０（１９８３））ｔこより３己載されているｐ
ＣＱＶ２およびエムーｏ−ゼンベルグら（Ｍ　、　Ｒｏ
ｓｅｎｂｅｒｇ　ｅｊａｌ、Ｘメソブズ・イン・エンザ
イモロノー（ＭｅｓｈＥｎｚｙｍ、　）、↓立上、１２
３〜＋３８（＋９８３））により記載されているｐＡｓ
ｌが挙げられる。Ｉ）ＡＳＩは、ｐＢｆ１３２２？ｌｌ
開始点、アンビンリン低流性マーカーならびに調節領域
、すなわち、ラムダの左方プロモーター（Ｐｌ）、Ｎ−
抗終止機能認識部位（Ｎｕｔ　　ＬおよびＮｕｔ　　Ｒ
）、ｒｈｏ−依存転写終止信号（ｔＲＩ）およびそのＧ
残基が以下の ５″・・・・ＣＡＴＡＴＧ　＊　ＧＡＴＣ・・・・・・
３′［式中、＊印はＢａｍ１（ｆ　　に対する開裂部位
を意味ずろ］のＢａｍ［−１ｆ開裂部位によって直接生
じるａｌｌ翻訳開始部位を含むｃ［Ｉリポソーム結合部
位からなるラムダからの一連のフラグメントを保有する
。

１）ＡＳＩは、ｐＫｃ３０ｃ１１のａｌｌ−ｐ１３１３
２２結合においてＢａｍａｌｌ部位からヌクレオチドを
欠失させてｃｌＴＡＴＧとし、かつ、該分子を再結合し
てＡＴＧの直ぐ下流のＢａｍ１−１１部位を再生するこ
とよりｐＫｃ３０ｃ［から誘導できる。１）ＫＣ３０ｃ
Ｈは、該ｃｌＴ遺伝子を保持するラムダからの１３ｋｂ
ＨａｅＩｒｌフラグメントをｐＫＣ３０の［Ｉｐａ１部
位に挿入することによって組立てろ（シャクツマンら、
エクスベリメンタル・マニピュレ−７ヨノ・オブ・ノー
ン・エクスブレッンヨノ、エム・イノウニ編、アカデミ
ツクプレス、ニューヨーク（Ｓｈａｔｚｍａｎ　ｅｔ　
ａｔ、、　　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　　Ｍａｎｉｐ
ｕｌａｔｉｏｎｏｆ　　Ｇｅｎｅ　　Ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ、　　Ｅｄｉｔ、　　ｂｙ　　Ｍ、　　Ｉｎｏｕｙ
ｅ。

Ａｃａｄｅｍｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ、　！ｌｅｗ　　Ｙｏ
ｒｋ）、１９８３およびエム・ａ−ゼンヘルグら（Ｍ、
ｌｌｏｓｅｎｂｃｒｇｅｔ　ａｌ、）、前記文献）。ｐ
Ｋｃ３０はンミタケら（Ｓ　ｈｉｍｉｔａｋｅｅｔ　　
ａｌ、Ｘネイチ＋　　（Ｎ　ａｔｕｒｅ）、２９２、＋
２８（１９８１））により記載されている。それは、ｐ
ＢＲ３２２のＬｅｔ　Ｒ遺伝子内のｌｌ１ｎｄ［１１お
よびＢａｍ１−１１部位の間に挿入されたラムダの２　
、４　ｋｂＨｉｎｄ　■−Ｂ　ａｍＨｒフラグメントを
有するｐ１３ｆ１３２２誘導体である。ＭＳＩに類似し
たＦ１１４造が、カー１・ニーら（Ｃｏｕｔｒｎｃｙ　
ｅｔ　ａｌ）（ネイチ＋　　（Ｎ　ａｊｕｒｅ）、３１
３．１４９（＋９８！’）））およびフチウィンクツら
（Ｋｏｔｅｗｉｃｚ　　ｅｔ　　ａｌ、）（ノーン（Ｇ
ｅｎｅ）、１工、２４９（１９８５））ｉこよ°リシ己
載されている。該コーディング配列は、標準的方法によ
り機能的に、すなわら、調節要素に対して正確な配置お
よび適正な解読フレームにてその中に挿入される。

他のクローニングおよび発現系は公知であり、他の細菌
、例えば、ハヂルス＋Ｊ３　ａｃｉ　ｆｌｕｓ）、スト
レプトミセス（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、コリネ
バクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）など
において本発明ノコ−ディング配列を発現するために利
用できる。

本発明に用いられろＤＮＡフラグメントを誘導する成熟
ｈＡＴに対するコーディング配列は、揉部的方法により
、例えば、ボレンら（１３ｏ１１ｅｎ　ｅｔａｔ、）、
（ベルイー特許第８９５９６１号）、ボレンら（Ｂｏｌ
ｌｅｎ　　ｅｔ　　ａｌ、ＸＤＮＡＸ２．　２５５（１
９８３））、カートニーら（Ｃｏｕｒｔｎｅｙ　　ｅｔ
　　ａｌ、）（ヨーロッパ特許出願第０１１７１７７７
号）、カワサキら（Ｋａｗａｓａｋｉ　　ｅｔ　　ａｌ
、）（ザ・モレキュラー・バイオロジー・才ブ・イース
ト、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（
Ｔｈｅ　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ　ｏｒ　Ｙ
ｅａｓｔ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ−１ａｒｂｏ
ｕｒＬ　ａｂｏｒａＬｏｒｙ）、１９８３年８月１６〜
２１日）、ロングら（Ｌｏｎｇ　　ｅＬ　　ａｌ、）（
ストラクヂャー・アンド・オーガニゼーンヨン・オブ・
ジーンズ■、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラ
トリ−、アブストラクト（Ｓ　ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎ
ｄ　Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎｏｉ’　　Ｇｅｎｅｓ　
　１．　Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　１（ａｒｂｏｕ
ｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　ＡｂｓＬｒａｃｔ）　Ｎｏ
、　２５．１９８３年）、ウーら（Ｗｏｏ　　ｅｔ　　
ａｌ、）（フロム・ノーン・ツー・プロティン、トラン
スレーション・インツー・バイオチクノロノー、アーマ
ドら編、アカデミツクプレス、ニューヨーク（Ｆｒｏｍ
　Ｇｅｎｅ　ｔｏ　Ｐｒｏｔｅｉｎ：　　　Ｔｒａｎｓ
ｌａＬｉｏｎ　　　　１ｎｔｏ　　　　Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ、　　ｅｄｉｊ。

ｂｙ　Ａｈｍｅｄ　　ｅＬ　　ａｌ、、　Ａｃａｄｅｍ
ｉｃＰｒｅｓｓ、　ＮｅｗＹ　ｏｒｋ）、＋９８２）、
　クラチら（Ｋｕｒａｃｈｉ　　ｅｔ　　ａｌ、）（プ
ロシーディンゲス・オブ・ザ・ナンヨナル・アカデミ−
・才ブ・サイエンノーズ・才ブ・ザ・ユナイテッド・ス
テーブ・オブ・　アメリカ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）、７８゜６８２６（＋
９８１））、パーカーら（Ｐａｒｋｅｒ　ｅｔａｌ、）
（オーストラリア特許出願第３１８０１／８４号）およ
びコスクンツォーら（Ｃｏｓｔａｎｚｏ）（イー・エム
・ヒー・オー・ジャーナル（ＥＭＢＯＪ）、■、５７（
１９８３））より記載されているような肝臓細胞から選
択したメツセンジャーＲＮＡ集団の逆転写により得られ
る。

ｈＧＲＦをコードする全合成り　Ｎ　Ａは、例えば、ク
ラバドールら（Ｃｒａｖａｄｏｒ　　ｅｔ　　ａｔ、）
（ベルイー特許第８９８６６６号）およびクラバドール
ら（Ｃｒａｖａｄｏｒ　　ｅＬ　　ａｌ、Ｘバイオヒミ
−（Ｂ　ｉｏｃｈｉｍｉｅ）、６７．８２９（１９８５
））またはバーら（Ｉ３ａｒｒ　　ｅｔ　　ａｌ、Ｘヨ
ーｏ−）パ特許出願第０１２９０７３号）により開示さ
れているような当該分野で公知の標賭的方法により得る
ことができろ。本発明のハイブリッドポリペプチドは架
橋ｈＡＴ／ｈＧＲＩ；”ポリペプチドであり、それらは
、許容条件下に本発明の発現ヘクターにて形質転換した
微生物または細胞を培養ずろことにより産生されろ。「
許容条件」なる語は、該ハイブリッドタンパク質の発現
が誘発される培養条件、例えば、分析物、代謝物、他の
培地成分および温度を依味する。代表的には、形質転換
したイー・コリは、誘発以前の対数増殖期（八〇、。約
０．４〜０．６）まで、ついで該ポリペプチドの回収可
能量が発現されるまで誘発後さらに１．５〜５時間、通
気しながら選択圧力下、同化できる炭素および窒素源含
ａ栄養ブロス中で培養する。

イー・コリまたは他の微生物において発現された、本発
明のハイブリッドポリペプチドは、標阜的タンパク質単
離法により産生培養から単離される。

代表的には、精製法は、（１）細胞の分解、（２）該細
胞抽出物の６１Ｆ澄化、（３）該ハイブリッドｈＡＴ／
ｈＧＲＦ’ポリペプチドの分離、１３よび（１１）不純
物を除去するための最終精製からなる。第１工程は、例
えば、リゾデームまたは池の溶解剤らしくは浸透剤の添
加または閥械的分解らしくは超音波分解により行なうこ
とかできろ。該ポリペプチドを外面化ずろための他の手
段としては、アウアーバッハおよびローゼンベルグ（Ａ
　ｕｅｒｂａｃｈ　　ａｎｄＲｏｓｅｎｂｅｒｇＸヨー
ロッパ特許出願第０１４０８６・１号）により記載され
ているような温度感受性溶原閑の使用か挙げられる。該
ハイブリッドポリペプチドが細胞抽出物中に沈澱する場
合、変性剤の添加により再溶解ずろことがて４きる。そ
のような方法は公知である。これらのいくつかは、ヒル
グーら（Ｂｕｉｌｄｅｒ　　ａｔ　　ａｔ、）（ヨーロ
ッパ特許出願第０１１４５０６号）により報告されてい
る。本明細書に特に示したハイブリッドｈＡＴ／ｈｃ；
Ｒ１？’分子は、標準イー・コリ抽出物に可溶である。

本発明の可溶性架橋ｈＡＴ／ｈＧＲＦ分子は、標準的方
法により分離できる。

本発明の架橋ｈＡＴ／ｈＧＲＦ分子の開裂は、マロウク
スら（Ｍａｒｏｕｘ　　ｅｔ　　ａｌ、）（ジャーナル
・才ブ・バイオケミストリー（Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ）、点上ｌ、５０３１（１９７１））によ
り記載されているような標帛条件下酵素エンテロキナー
ゼにて酵素的消化により行なうことができる。ついで、
該開裂により生じた成熟ｈＧＲＦは、モレキュラーノー
ブを含むような標錦的クロマトグラフィー法により分離
できろ。好ましい精製法は、ｈＡＴ分子から開裂ｈＧＲ
Ｆを分離する担持ｈＧＲＦ’ポリクローナルまたはモノ
クローナル抗体を用いたアフィニティークロマトグラフ
ィーからなる。

医薬上または獣医薬上許容される担体と合して医薬組成
物を形成するそのようにして得られたポリペプチドまた
はその非毒性塩は、ヒトまたは動物に対して、当該分野
において公知の静脈内、皮下、筋肉内、経皮、例えば、
経鼻腔、さらには経口のいずれかで投与できる。該投与
は、処置を受ける宿主かそのような治療的処置を必要と
するＧＨ（成長ホルモン）の放出を刺激するために用い
ることができる。必要な用量は、治療される特定の条件
、症状の強度および所望の治療期間により変化する。

そのようなペプチドは、通常、酸付加塩または金属複合
体、例えば、亜鉛、鉄など（本明細書の趣旨から塩と考
えられる）の非毒性塩の形態にて投与される。そのよう
な酸付加塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸
塩、リン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安
息香酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩
、酒石酸塩などが挙げられる。該活性成分が錠剤形態に
て経口投与される場合、該錠剤は、トラガカント、コー
ンスターヂまたはゼラチンのような結合剤、アルギン酸
のような崩壊剤およびステアリン酸マグネンウムのよう
な滑沢剤を含有してもよい。液体形態の投与を所望する
場合、け味剤および／またはフレーバーを用いてもよく
、等張生理食塩水、リン酸塩緩衝液などにて静脈内投与
を行なうことができる。

該ペプチドは、医師の指示のらとにヒトに投与すべきで
あり、医薬組成物は、通常、該ペプチドと共に通常の固
体または液体の医薬上許容される担体を含有するっ通常
、非経口用爪は、宿主の体重１ｋｇにつき、該ペプチド
を約０．０Ｉ〜約Ｉμｇとする。

実施例 つぎに実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが
、本発明はこれに限定されるものではない。全ての制限
エンドヌクレアーゼは商業源から人手され、実質的に添
付の能書に従って用いられる。

工程ｌ ヒトｈＡＴ遺伝子は、ｃＤＮＡクローンｐＵＬＢ１５２
３（ベルギー特許第８９５９６１号に記載）か二ｆｆｌ
鮒六メ１乙−電タ清イ乎半を寸−仝ｒ４’ｌ〜八グロー
ンへ包含するＰｓｊｌフラグメント上に得られる。

該フラグメントは、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ
およびＡｖａｌにて消化され、それは、ｈＡＴの２番目
のアミノ酸から３６３番目のアミノ酸に対するコーディ
ング配列を保持している。

工程２ 制限酵素ＲｓａｌおよびＳａ（！Ｉを用いた消化により
クローンｐＵＬＢ１１＋３（ベルギー特許第８９８６６
６号に記載）から全合成ヒトｈＧＲＰを単離する。得ら
れたＤＮＡフラグメントは、１番目のアミノ酸から出発
する成熟ｈＧＲＦをコードずろ。

工程３ 第１図に示した合成りＮＡアダプターは、クラバドール
ら（Ｃｒａｖａｄｏｒ　　ｅｔ　　ａｌ、　）（バイオ
ヒミ−（Ｉ３　ｉｏｃｈｉｍｉｅ）、６７．８２９（１
９８５））により記載された方法により得られる。クラ
バドールら（前記文献参照）により記載されているよう
にアニーリングを行なった場合、それぞれ２７ｂｐおよ
び２３ｂｐの２つの単一らＵ・んフラグメントは、５゜
Ａｖａ［付着端および３°５ｃａｌ付若端を保持する２
重ら仕んＤＮＡフラグメントを生じる。それらの付着端
は、Ｂａｍ１−１１−ＡｖａｌｈＡ’ｒフラグメントか
らＲｓａｌ−９ａ＆１ｈＧＲＦ’フラグメントまでのフ
レームにおける融合に適している。さらに、該合成アダ
プターは、マロウクスら（Ｍａｒｏｕｘ　ｅｊａｌ、　
Ｘ前記文献参照）により示されているような酵素エンテ
ロキナーゼにより　ｉｎ　ｖｉｔｒｏにて開裂可能な（
Ａ　５ｐ）４Ｌ　ｙｓアミノ酸配列をコードする。

至栗ニ プラスミド発現ベクターからのＤＮＡ（例えば、メソッ
ズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥ
　ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、１０１，１２３〜＋３８（１
９８３）にてローゼンヘルグら（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　
　ｅｔ　　ａｔ、　）により記載されたｐＡｓＩ）は、
酵素［３ｄｍｌ−１ＮおよびＳａ（！Ｉにて開裂される
。該消化から得られた大きなフラグメントを保持し、そ
れは、強力なＰＬ（ラムダ）プロモーターおよびＡＴＧ
開姶コドンを保持する。

標亭的方法（マニアナイスら、モレキュラー・クローニ
ングニア・ラボラトリ−・マニュアル、コールド・スプ
リング・ハーバ−・ラボラトリ−、ニューヨーク（Ｍａ
ｎｉａｊｉｓ　ｅｔ　　ａｌ、、　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｃｌｏｎｉｎｇ：　ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎ
ｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒ　　
ＬａｂｏｒａＬｏｒｙ、Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ）、＋９８
２）を用いて連結により、工程１〜４がらのＤＮＡフラ
グメントを組み立てる。得られた構成体（ｐＵＬＢ１３
２３）は、ｈＧＲＦ遺伝子に対し合成アダプターを介し
てフレームにて融合したｈＡＴ遺伝子フラグメントを含
有する発現ヘクターてあろ（第１図）。第１図の上部は
、ｈＡＴをコードずろ融合配列、合成アダプターおよび
ｈＧＲＦを保持する組換え型プラスミドｐＵＬＩ３１３
２３を表わしている。第１図の下部は、合成アダプター
のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を表わしている。

イー・コリの溶原株（例えば、モソトら（Ｍｏｔｔｅｔ
　　ａｌ、　Ｘプロンシーディンゲス・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミ−・才ブ・ザイエンシーズ・オプ・ザ
・ユナイテッド・ステーブ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ
、　Ｎａ１１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）、１
影、８８〜９２（１９８５））に記載されたＡｆ１５８
株）を標皇的方法（マニアナイスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ
ｅｊａｌ、）、前記文献参照）を用いたｐＵＬＢ１３２
３にて形質転換し、形質転換体を熱誘発前に対数期まで
成長さける（エム・ローゼンベルグら、メソッズ・イン
・エンザイモロジ−（Ｍ、　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　　ｅ
Ｌ　　ａｌ、、〜１ｅｊｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　）、
＋０１、Ｉ２３（＋９８３））。

誘導期間後、遠心分離により細胞を集め、５０ｍＭ１−
リス（ｐＨ８）、Ｏ，ＩｍＭエチレノンアミン四酢酸ナ
トリウム（ＥＤＴＡ）、Ｏ，ｌＩＱＭジチオスＬ／イ）
−ル（ＤＴＴ）、Ｏ，Ｉ　％トリＩ−ンｘ　Ｉ　００．
２５％ンヨ糖および０．５ｐｇ／ｌ！（ｌのリゾデーム
からなるリゾデーム溶液（１ｇ細胞／ｌ０ｘ（溶液）の
添加により溶解さＵｏる。ついで、２０分間該懸濁液を
通常速度の遠心分離（２００００ｇ）により分離ずろ。

該ハイブリットｈＡＴ／ｈｌＦポリベブヂドの試料をド
ブノル硫酸ポリアクリルアミドゲル（ラエムリー、ネイ
ヂャ−（Ｌ　ａｅｍｌｙ、　Ｎ　ａｌｕｒｅ）、２２７
．６８０（１９７０））にて分析し、ウェスタン・プロ
ッティングおよび免疫検出（ホルンら（Ｂｏｌｆａｎ　
　ｅＬ　　ａｌ、　）、ＤＮＡ、２．２５５（＋９８３
））により同定した。

第２図において見られるようになり、Ｉ）Ｕｌ、１３１
３２３によりコードされたハイブリットポリペプチドｈ
ＡＴ／ｈＧｒｌＦは、ｈＡＴ（パネルａ）またはｈＧＲ
Ｆ（パネルｂ）のいずれかに対して生ずる抗体にて検出
でき（第ル−ン）、これは検出濃度を認めることができ
ないそのようなイー・コリにおける成熟ｈＧＲＦの発現
を目的とした実験（タラバトール（Ｃｒａｖａｄｏｒ）
、前記文献参照）と峰めて対照的である。さらに、該ハ
イブリットポリペプチドは、ｈＡ’ｒ（ａａ２からａａ
：＋０３）、エンテロキナーゼにより認識されるアミノ
酸配列おにび成、？ＡｈｃｎＦ間の融合に対して予想さ
れろ分子ｍをＣｒシている。未誘発ｐ［ＪＬＩ３１３２
３試料（第２レーン）、誘発組換え型ｈ　Ａ　’Ｌ”　
（第３レーン）、未次発組換え型ｈＡＴ（第・・ル−ン
）、Ｉ）ＡＳＩ負の調節（第５および第６レーン）、標
１ｈＧ　ｆｌ　Ｐ　（第７レーン）および分子量基孕（
第８レーン）のような適当な対ｊＩＱが実験に用いられ
ている。

該ハイブリッドｈＡ′ｒ／ｈＧＲＦ’ポリペプヂドの試
料をｉｎ　ｖｉｔｒｏにてエンテロキナーゼで消化して
該ｈＡＴ、／ｈＧｆｌＦ融合を開裂し、該成熟ｈＧＲＦ
を遊離した。第３図は、この開裂を示している。

該検定は、ＥＬ　Ｉ　ＳＡからなり、それは、そのＲＡ
Ｔ残基を介して抗ｈＡＴ抗体にて被覆されたマイクロウ
ェルプレートに結合した該ハイブリットボリベプヂドか
らｈＧＲＦがａ離されることを示している（・・・・・
・）。該図は、また、結合ｈＡＴが該方法の間該被覆マ
イクロウェルから遊離されないことを示している（・−
・）。

所望により、ついで該開裂ｈＧｎＦを当該分野または池
のタンパク質担離方法にて公知の条件にてアフィニティ
クロマトグラフィーによりさらに精製することができる
。

【図面の簡単な説明】

第１図の上部はｈＡＴをコードする融合配列、合成アダ
プターおよびｈＧＲＦを保持する組換え型プラスミドｐ
ＵＬＢＩ３２３を表わした図、第１図の下部は合成アダ
プターのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を表わした図
、第２図は本発明のハイブリッドｈＡＴ／ｈＧｆｌＦポ
リペプヂドのウェスタン法による解析を表わした図、第
３図は本発明のハイブリッドｈＡＴ／ｈＣ；ＲＦボリペ
ブヂドの酵素エンテロキナーゼによる開裂を示すグラフ
である。 特許出願人　スミス・クライン−アール・アイ・ティ 代　理　人　弁理士前出　　葆ほか２名第２ ）〆？

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. （１）ｈＡＴコーディング配列、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにて
   開裂可能なアミノ酸配列をコードする合成アダプターお
   よびｈＧＲＦ遺伝子またはその活性フラグメントもしく
   は誘導体の該５′末端から３′末端までのフレームにお
   ける融合および解読からなることを特徴とするＤＮＡ分
   子。
2. （２）該ｈＡＴコーディング配列が、２番目付近のアミ
   ノ酸または１５番目付近のアミノ酸から３６３番目付近
   のアミノ酸のコドンへ伸長したｈＡＴをコードする配列
   のフラグメントである前記第（１）項のＤＮＡ分子。
3. （３）該ｈＧＲＦ遺伝子またはその活性フラグメントら
   しくは誘導体が全合成品である前記第（１）項のＤＮＡ
   分子。
4. （４）該合成アダプターが（Ａｓｐ）＿４Ｌｙｓアミノ
   酸配列をコードする前記第（１）項のＤＮＡ分子。
5. （５）その中に機能的に挿入した該融合を有する細菌性
   発現ベクターである前記第（１）〜（４）項のいずれか
   のＤＮＡ分子。
6. （６）イー・コリ発現ベクターである前記第（５）項の
   ＤＮＡ分子。
7. （７）該発現ベクターがｐＡＳ１の調節領域からなる前
   記第（６）項のＤＮＡ分子。
8. （８）ｉｎ　ｖｉｔｒｏにて開裂可能な（Ａｓｐ）＿４
   Ｌｙｓアミノ酸配列によって架橋したｈＡＴおよびｈＧ
   ＲＦまたはその活性フラグメントもしくは誘導体からな
   ることを特徴とするハイブリッドポリペプチド。
9. （９）ｈＡＴが、２番目付近のアミノ酸または１５番目
   付近のアミノ酸から３６３番目付近のアミノ酸まで伸長
   したｈＡＴのフラグメントである前記第（８）項のハイ
   ブリッドポリペプチド。
10. （１０）ｈＡＴが２番目のアミノ酸または１５番目のア
    ミノ酸から３６３番目のアミノ酸まで伸長したｈＡＴの
    フラグメントである前記第（８）項のハイブリッドポリ
    ペプチド。
11. （１１）前記第（１）〜（４）項のいずれかのＤＮＡ分
    子にて形質転換した細菌。
12. （１２）イー・コリである前記第（１１）項の細菌。
13. （１３）前記第（５）項のＤＮＡ分子にて形質転換した
    細菌。
14. （１４）イー・コリである前記第（１３）項の細菌。
15. （１５）前記第（６）項のＤＮＡ分子にて形質転換した
    イー・コリ。
16. （１６）前記第（７）項のＤＮＡ分子にて形質転換した
    イー・コリ。
17. （１７）前記第（１１）〜（１６）項のいずれかの細菌
    を許容条件下に培養し、該培養からハイブリッドポリペ
    プチドを単離することを特徴とするハイブリッドポリペ
    プチドの産生法。
18. （１８）前記第（８）〜（１０）項のいずれかのハイブ
    リッドポリペプチドを酵素エンテロキナーゼにより開裂
    することを特徴とするｈＧＲＦの産生法。